DE69737969T2

DE69737969T2 - Dns-impfung zur einleitung einer suppressiven t-zell-antwort

Info

Publication number: DE69737969T2
Application number: DE69737969T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Palo Alto STEINMAN; Ari Institute Ge WAISMAN
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2008-04-24
Anticipated expiration: 2017-02-25
Also published as: AU2135697A; CA2247071C; EP0884947B1; CA2247071A1; EP0884947A1; WO1997030587A1; ATE368378T1; US5939400A; JP2000506130A; EP0884947A4; DE69737969D1

Description

Die Komplexität des Immunsystems ist eine gewaltige Barriere für das Verständnis der Fehlfunktion des Immunsystems gewesen. In den vergangenen Jahren haben die Verfahren der Molekularbiologie Einsicht in die Mechanismen und Komponenten bereitgestellt, die Immunität zugrunde liegen. Die Geschichte der Immunität ist weitgehend die Geschichte der Lymphozyten. Lymphozyten besitzen ein extrem komplexes und raffiniertes System zur Wechselwirkung miteinander, mit antigenpräsentierenden Zellen und mit fremden Antigenen und Zeilen.
Modulation der Immunantwort variiert mit den spezifischen produzierten Faktoren und den Rezeptoren, die auf der reagierenden Zelle gegenwärtig sind. Die Wege für Herabregulierungsantworten sind ebenso wichtig wie jene, die für Aktivierung erforderlich sind. T-Zelltoleranz ist ein gut bekannter Mechanismus zur Prävention einer Immunantwort auf ein bestimmtes Antigen. Andere Mechanismen, wie z.B. die Sekretion von unterdrückenden Cytokinen, sind ebenfalls bekannt.
Ein häufiges Kennzeichen einer Vielzahl von Erkrankungen und Entzündungen ist die Involvierung von proentzündlichen CD4⁺-T-Zellen. Diese T-Zellen sind für die Freisetzung von entzündlichen Th-1-Typ-Cytokinen verantwortlich. Cytokine, die als Th-1-Typ charakterisiert werden, umfassen Interleukin-2(IL-2), g-Interferon, TFNa und IL-12. Solche proentzündlichen Cytokine wirken, um die Immunreaktion zu stimulieren, in vielen Fällen resultierend in der Zerstörung von autologem Gewebe. Andere Cytokine sind mit der Unterdrückung von T-Zellreaktion assoziiert. Diese sind vom Th2-Typ und umfassen IL-10, IL-4 und TGF-b. Es ist festgestellt worden, dass Th1- und Th2-Typ-T-Zellen den identischen Antigenrezeptor als Reaktion auf ein Immunogen verwenden können, wobei bei Ersterem eine Stimulationsreaktion und bei Letzterem eine suppressive Reaktion ausgelöst wird.
Viele klinische Symptome, die mit entzündlichen Erkrankungen assoziiert sind, können durch Induktion einer spezifischen suppressiven Reaktion reduziert werden. Immunsuppressiva, wie z.B. Cyclosporin-A, sind in Therapie verwendet worden. Ihr Fehlen von Spezifität ist jedoch ein schwerwiegender Nachteil. Eine Behandlung, die T-Zellaktivierung spezifisch hemmt, wäre von großem medizinischem Vorteil.
Relevante Literatur
Die Injektion von DNA zur Förderung der Impfung gegen Mikroben und Tumoren wird in Pardoll et al., Immunity 3, 165–169 (1995); Davis et al., Hum. Mol. Genet. 2, 1847–1851 (1993); Ulmer et al., Science 259, 1745–1749 (1993), und Tang et al., Nature 356, 152–154 (1992), diskutiert. Genetische Immunisierung hat die Induktion einer spezifischen humoralen aber auch einer umfassender reagierenden zellulären Immunantwort in Tiermodellen von Krebs, Mycoplasma, TB, Malaria und vielen Virusinfektionen gezeigt, einschließlich Influenza und HIV. Siehe zum Beispiel Mor et al., J. Immunol. 155, 2039–46 (1995); Xu und Liew, Immunology 84, 173–6 (1995); und Davis et al., Vaccine 12, 1503–9 (1994).
Bei EAE ist gezeigt worden, dass Th2-Typ-Zellen die Induktion von Erkrankung verhindern. Weiner et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 809–837 (1994). Es ist gezeigt worden, dass Th1-Typ-Zellen in einem Mausmodell schwere Arthritis verursachen, Germann et al., P.N.A.S. 92, 4823–4827 (1995). Sempe et al., Diabetologia 37, 337–343 (1994), stellen Beweise für CD4⁺-regulierende T-Zellen bei der männlichen NOD-Maus bereit. T-zellvermittelte Inhibition des Transfers von Autoimmundiabetes bei NOD-Mäusen ist in Hutchings und Cooke, J. Autoimmun. 3, 175–185 (1990), dargestellt.
Die Verabreichung von monoklonalen Antikörpern, die auf pathogene TCR-V-Genprodukte ausgerichtet sind, und Impfung mit Peptiden aus der zweiten und dritten komplementaritätsbestimmenden Region der pathogenen TCR-V-Region haben sich in der Therapie von EAE, die in Acha-Orbea et al., Cell 54, 263–273 (1988); Sakai et al., P.N.A.S. 85, 8608–8612 (1988), Vandenbark et al., Nature 341, 541–544 (1989), und Howell et al., Science 246, 668–670 (1989), gezeigt wird, als erfolgreich erwiesen.
Empfindlichkeit auf MS ist mit bestimmten MHC-Klasse-II-Genen assoziiert gewesen, Oksenberg und Steinman, Current Opinion in Immunology 2, 619–621 (1990). Auf zellulärer Ebene ist die Oligoklonalität von T-Zellen in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF) von MS-Patienten beschrieben worden. Lee et al., Ann. Neurol. 29, 33–40 (1991). Oksenberg et al., Nature 345, 344–346 (1990), beschreiben die Verwendung von PCR zur Amplifikation von TCR-Va-Sequenzen aus Transkripten, die von MS-Gehirnläsionen abstammen. Wucherpfennig et al., Science 248, 1016–1019 (1990), und Ota et al., Nature 346, 183 (1990), berichten von Studien von T-Zellklonen bei Menschen, die basisches Myelinprotein umfassen.
WO 92/12996 betrifft Impfstoffe, die aus einem T-Zellrezeptor oder einem Fragment davon bestehen. Kuchroo et al., Journal of Experimental Medicine 179, 1659–1664 (1994), betrifft T-Zellrezeptor-(TCR-) Verwendung und wie diese die Erkrankungsempfindlichkeit in experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis bestimmt. Studien mit TCR-vbeta-8.2-transgenen Mäusen sind beschrieben. Mor et al., Journal of Clinical Investigation 92, 2199–2206 (1993), betrifft Verschiebungen in den Epitopen vom basischem Myelinprotein, das von Lewis-Ratten-T-Zellen vor, während und nach der Induktion von Versuchs-Autoimmunenzephalomyelitis erkannt wird. Vallia et al., Journal of Clinical Investigation 91, 616–628 (1993), betrifft die Bindung von basischem Myelinproteinpeptiden an menschliche Histokompatibilitätsleukozytenantigen-Klasse-II-Moleküle und deren Erkennung durch T-Zellen von Multiple-Sklerose-Patienten. Danko et al., Gene Therapy 1, 114–121 (1994), betrifft die pharmakologische Verstärkung von fremder In-vivo-Genexpression im Muskel. Waisman et al., Nature Medicine 2, 899–905 (1996), betrifft die suppressive Impfung mit DNA, die für eine variable Region des T-Zellrezeptors kodiert, zur Vermeidung von Autoimmunenzephalomyelitis und Aktivierung von th2-Immunität.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Induktion einer spezifischen suppressiven T-Zeltantwort. Wie nachstehend beschrieben wird ein Säugetierwirt mit einem DNA-Expressionsvektor geimpft, der für ein lösliches T-Zellrezeptorantigen mit variabler Region kodiert (V_Impfung). Als Reaktion auf die Impfung wird eine suppressive Antwort hervorgerufen, wo T-Zellen, die die variable Region exprimieren (variable Region, auf die abgezielt wird, „V_Target"), Th2-Cytokine produzieren, einschließlich IL-4. Suppressive Impfung vermeidet oder kehrt proentzündliche T-Zell-Antworten in einer spezifischen, zielgerichteten Art um. Die hierin beschriebenen Bedingungen, die von dieser Behandlung profitieren, umfassen Autoimmunerkrankungen, Gewebstransplantation und andere mit Entzündung assoziierte Erkrankungen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine DNA-Expressionskassette, die eine Sequenz umfasst, die für zumindest einen Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors unter der regulierenden Kontrolle eines Promotors kodiert, der in einem Säugetierwirt aktiv ist, wobei die variable Region des T-Zellrezeptors aus der Gruppe bestehend aus Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5, Vα7, Vβ5, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ12 und Vβ14 ausgewählt ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Säugetier, worin die variable Region des T-Zellrezeptors mit der Autoimmunerkrankung assoziiert ist, bereit.
Der Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors kann unter der regulierenden Kontrolle eines Promotors sein, der im Muskelgewebe aktiv ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Plasmid bereit, das diese Expressionskassette umfasst.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer Plasmidexpressionskassette, die eine Sequenz umfasst, die für zumindest einen Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors unter der regulierenden Kontrolle eines Promotors kodiert, der in einem Säugetierwirt aktiv ist, wobei die variable Region des T-Zellrezeptors aus der Gruppe bestehend aus Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5, Vα7, Vβ5, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ12 und Vβ14 ausgewählt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Autoimmunerkrankung, worin die variable Region des T-Zellrezeptors mit der Autoimmunerkrankung assoziiert ist, bereit.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A und 1B sind Diagramme, welche die Wirkung von DNA-Impfung von Mäusen nach aktiver Immunisierung mit MBP Ac1-20-Peptid (1A) oder intaktem MBP (1B) zeigen. Gruppen von 9–15 PL/J-Mäusen wurde s.c. in die Fußpfoten das Peptid oder Protein injiziert. Mäuse wurden mit DNA, die für Vβ5.1, Vβ8.2 kodiert, oder nur mit PBS behandelt. Der mittlere Krankheitswert aller Mäuse in jeder Gruppe ist dargestellt.
2A bis 2D sind Diagramme, die eine Änderung der Cytokinproduktion durch DNA-Impfung zeigen. Die proliferative Antwort ist in 2A für den Entzug von Lymphknotenzellen aus PL/J-Mäusen dargestellt, die mit MBP Ac1-20 nach Vorbehandlung mit DNA, die für Vβ5.1, Vβ8.2 kodiert, oder nur PBS immunisiert wurden. Überstände von INC aus Mäusen, die mit vβ5.1, Vβ8.2 oder mit PBS vorbehandelt wurden, wurden nur mit Concanavalin A (10 μg/ml) oder dem Peptid MBP Ac1-20 auf die Gegenwart von γ-Interferon (2B), IL-2 (2C) und IL-4 (2D) getestet.
3A und 3B zeigen die Erkrankungsinduktion durch T-Zelllinien. T-Zelllinien, die aus Kontroll-PL/j mit EAE oder aus Mäusen isoliert wurden, die mit Vβ8.2-DNA geschützt wurden, 8.2-LN wurden intravenös in weibliche PL/J-Mäuse, 5 Millionen Zellen/Maus, inokuliert. Es ist der mittlere Erkrankungswert aller Mäuse in jeder Gruppe ± Standardabweichung dargestellt. In 3B waren fünf Millionen TH2-Zellen, die auf MBP Ac1-20 gerichtet waren, das von Mäusen abstammte, die mit Vβ8.2-DNA immunisiert wurden, in der Lage, EAE zu unterdrücken, während Mäuse, die MBP Ac1-20 in CFA erhielten, EAE entwickelten.
4 zeigt ein Expressionskonstrukt für suppressive Impfung.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Die hierin beschriebenen Verfahren stellen ein Mittel zur therapeutischen Behandlung und Erforschung von Entzündung durch die Induktion einer spezifischen, suppressiven T-Zellantwort bereit. Eine DNA-Expressionskassette wird in Wirtsgewebe injiziert, zum Beispiel Muskel oder Haut. Der Vektor umfasst eine DNA-Sequenz, die für zumindest einen Abschnitt der variablen Region aus einem T-Zellantigenrezeptor kodiert, der mit einem Phänotyp von Interesse assoziiert ist (V_Impfung). Als Reaktion auf diese Impfung wird eine suppressive Reaktion ausgelöst. Endogene T-Zellen, die eine native Form einer variablen Region, auf die abgezielt wird, exprimieren, „V_Target", produzieren suppressive Th2-Cytokine, einschließlich IL-4.
Suppressive Impfung findet in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen Anwendung, die durch eine Involvierung von proentzündlichen T-Zellen charakterisiert sind, wie z.B. multipler Sklerose, experimenteller Autoimmunenzephalitis, rheumatoider Arthritis und insulinabhängigem Diabetes mellitus. Andere Leiden, die behandelt werden können, umfassen Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung, Transplantatabstoßung, Entzündung des zentralen Nervensystems, verursacht durch Bakterien- und Virusinfektion, z.B. Entzündungsreaktion auf Impfung mit lebenden Mikroorganismen, lokale Entzündung als Reaktion auf Trauma und andere Leiden, die mit unerwünschter, z.B. pathogener, T-Zeltaktivität assoziiert sind. Tiermodelle, insbesondere kleine Säugetiere, z.B. murine, hasenartige etc., sind für experimentelle Forschungsarbeit von Interesse.
Ein häufiges Kennzeichen bei einer Vielzahl von Erkrankungen und Entzündungen ist die Involvierung von proentzündlichen CD4⁺-T-Zellen. Diese T-Zellen sind für die Freisetzung von entzündlichen Th-1-Typ-Cytokinen an der Stelle der Gewebszerstörung verantwortlich. Solche proentzündlichen Cytokine wirken, um die Immunantwort zu stimulieren, in vielen Fällen führt dies zur Zerstörung des autologen Gewebes. Suppressive Impfung dient sowohl der Induktion von spezifischer Suppression aus T-Zellen, die eine spezifische variable Region exprimieren, als auch zur Freisetzung von suppressiven Cytokinen an der Stelle der Entzündung, wodurch der Wirkung von Th1-Typ-Cytokinen entgegengewirkt wird. Die variable(n) Region(en) zur Impfung werden ausgewählt, um diese Wirkungen zu optimieren.
Eine DNA-Expressionskassette, die für zumindest einen Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors kodiert, für gewöhnlich als Teil eines Vektors, wird in das Gewebe des Impfstoffempfängers eingeführt. Das Gen der variablen Region oder eines Abschnitts davon (V_Impfstoff) wird im Gewebe exprimiert, und das kodierte Polypeptid wirkt als Immunogen oder Antigen. Es kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Präsentation der V_Impfstoff-Sequenz durch eine „nicht-professionelle" Zelle, der gemeinsam stimulierende Moleküle fehlen, wie z.B. CD80 und CD86, eine suppressive T-Zellantwort stimuliert.
Die V_Impfstoff-Sequenz kodiert für zumindest einen Abschnitt der variablen Region eines T-Zellantigenrezeptors, ausgewählt aus Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5, Vα7, Vβ5, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ12 und Vβ14. Unter „variabler Region" versteht man beliebige der Gensegmente V, D und/oder J in Keimbahn oder neu angeordneter Form. Die Sequenzen der variablen Regionen des T-Zellantigenrezeptors sind detailliert beschrieben und fachbekannt. Diese variablen Regionen sind durch genetische Neuanordnung während der Reifung von T-Lymphozyten gekennzeichnet, sodass das chromosomale V-Segment an ein „D"- und/oder ein „J"-Segment gebunden ist, wodurch eine Expression einer vollständigen α- oder β-Kette ermöglicht wird. Ein Komplex des α, β- oder γ, δ-Heterodimers und zusätzliche Moleküle erkennen Antigenpeptide, die an MHC-Klasse-I oder -Klasse-II-Moleküle gebunden sind. Im Allgemeinen hat die V_Impfstoff-Sequenz dieselbe Ursprungsspezies wie der Tierwirt, vorzugsweise ist er autolog. Exemplarische Sequenzen sind in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH, Publikation Nr. 91-3242, 1477–1571, zu finden, oder es kann über die Genbank-Datenbank zugegriffen werden. Unter Vα-Familien von Interesse sind menschliche Vα8–10, Vα12 und Vα16. Andere Regionen von Interesse umfassen Vα1, Vα5 und Vα7. Vβ-Familien von Interesse umfassen menschliche Vβ5 und Vβ12, insbesondere V5.1 und Vβ5.2. Es sind Verfahren zur Auswahl von V_Impfstoff-Sequenzen in Beziehung zu einer besonderen Erkrankung bereitgestellt.
Die entsprechende DNA-Expressionskassette umfasst die meisten oder alle Sequenzen, die für eine variable TCR-Region kodieren, wie von Kabat et al., siehe oben, definiert. Die kodierende Sequenz kann am 5'- oder 3'-Terminus trunkiert sein, für gewöhnlich sind zumindest etwa 75 % der V-Segmentsequenz gegenwärtig, noch üblicher zumindest etwa 80 % und vorzugsweise zumindest etwa 95 %. Die Sequenz ist ausreichend, um eine suppressive Antwort durch V_Target-Zellen auf Impfung zu induzieren. Gegebenenfaöös umfasst V_Impfstoff DNA-Sequenzen, die für die T-Zellrezeptor-D-, -J- oder -DJ-Segmente kodieren, wobei das D- oder J-Segment mit der V-Regionsequenz am 3'-Ende zusammenhängend ist.
Der Impfstoff kann mit einer oder einem Cocktail von V_Impfstoff-Sequenzen formuliert werden. Während festgestellt worden ist, dass eine einzelne Sequenz in der Lage ist, eine Antwort auf multiple Epitope zu unterdrücken, kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, multiple V_Impfstoff-Sequenzen zu umfassen, wobei jede ein anderes Epitop oder eine Epitop-MHC-Kombination erkennt.
Die V_Impfstoff-Sequenzen werden in eine geeignete Expressionskassette insertiert. Das Expressionskonstrukt wird auf herkömmliche Art hergestellt. Die Kassette hat die geeigneten Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen zur Expression der V_Impfstoff-Sequenz in den Impfstoffempfängerzellen. Die Kassette ist im Allgemeinen Teil eines Vektors, der einen geeigneten Replikationsstartpunkt enthält, und solche Gene, die für selektierbare Marker kodieren, können für Wachstum, Amplifikation und Manipulation des Vektors vor seiner Einführung in den Empfänger erforderlich sein. Geeignete Vektoren umfassen Plasmide, YACs, BACs, Bakteriophagen, Retrovirus und dergleichen. Herkömmlicherweise ist der Expressionsvektor ein Plasmid. Vor Impfung kann die Kassette aus den Vektorsequenzen durch Spaltung, Amplifikation etc. auf fachbekannte Weise isoliert werden. Zur Injektion kann die DNA supergeknäuelt oder linear, vorzugsweise supergeknäuelt, sein. Die Kassette kann in der Wirtszelle für längere Zeiträume beibehalten werden oder vorübergehend sein, im Allgemeinen vorübergehend. Stabile Aufrechterhaltung wird durch die Einführung von Sequenzen erreicht, die Integration und/oder Aufrechterhaltung bereitstellen, z.B. retrovirale Vektoren, EBV-Vektoren und dergleichen, erreicht.
Die Expressionskassette verwendet im Allgemeinen eine exogene Transkriptionsinitiationsregion, d.h. einen anderen Promotor als jenen, der mit dem T-Zellrezeptor in dem normal auftretenden Chromosom assoziiert ist. Der Promotor ist in Wirtszellen funktional, insbesondere Wirtszellen, auf welche die Kassette abzielt. Der Promotor kann durch Rekombinationsverfahren in vitro oder als Ergebnis von homologer Integration der Sequenz durch eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Der Promotor ist operabel mit einer kodierenden Sequenz von V_Impfstoff verbunden, um ein translatierbares mRNA-Transkript zu produzieren. Expressionsvektoren weisen in geeigneter Weise Restriktionsstellen nahe der Promotorsequenz auf, um die Insertion von B_Impfstoff-Sequenzen zu erleichtern.
Es werden Expressionskassetten hergestellt, die eine Transkriptionsinitiationsregion, die konstitutiv oder induzierbar sein kann, das Gen, das für die V_Impfstoff-Sequenz kodiert, und eine Transkriptionsterminationsregion umfassen. Die Expressionskassetten können in eine Vielzahl von Vektoren eingeführt werden. Promotoren von Interesse können induzierbar oder konstitutiv sein, für gewöhnlich konstitutiv, und stellen hohe Ausmaße von Transkription in den Impfstoff-Empfängerzellen bereit. Der Promotor kann nur im Empfängerzelltyp aktiv sein oder kann in vielen verschiedenen Zelltypen aktiv sein. Es sind viele starke Promotoren für Säugetierzellen fachbekannt, einschließlich β-Actin-Promotor, frühe und späte SV40-Promotoren, Immunglobulinpromotor, menschlicher Cytomegalievirus-Promotor, retrovirale LTRs etc. Die Promotoren können mit Enhancern assoziiert sein oder auch nicht, wobei die Enhancer natürlich mit dem bestimmten Promotor oder mit einem anderen Promotor assoziiert sein können.
Eine Terminationsregion wird 3' zur kodierenden Region bereitgestellt, wobei die Terminationsregion mit der Domäne der variablen Region natürlich assoziiert sein kann oder von einer anderen Quelle abstammen kann. Eine große Vielzahl an Terminationsregionen kann ohne negative Beeinflussung von Expression verwendet werden.
Die verschiedenen Manipulationen können in vitro oder in einem geeigneten Wirt, z.B. E. coli, durchgeführt werden. Nach jeder Manipulation kann das resultierende Konstrukt kloniert, der Vektor isoliert und die DNA gescreent oder sequenziert werden, um die Korrektheit des Konstrukts sicherzustellen. Die Sequenz kann durch Restriktionsanalyse, Sequenzierung oder dergleichen gescreent werden.
Eine geringe Anzahl an Nucleotiden kann am Terminus der V_Impfstoff-Sequenz insertiert werden, üblicherweise nicht mehr als 20, noch üblicher nicht mehr als 15. Die Deletion oder Insertion von Nucleotiden wird üblicherweise eine Folge der Notwendigkeiten der Herstellung sein, wobei herkömmliche Restriktionsstellen bereitgestellt werden, Verarbeitungssignale hinzugefügt werden, die Manipulation erleichtert wird, eine Verbesserung der Expressionsausmaße oder dergleichen erreicht wird. Zusätzlich dazu kann der Wunsch bestehen, eine oder mehrere Aminosäuren aus ähnlichen Gründen durch eine andere Aminosäure zu substituieren, für gewöhnlich werden nicht mehr als etwa fünf Aminosäuren in der Region substituiert.
Der Impfstoff kann mit einer oder einem Cocktail von V_Impfstoff-Sequenzen formuliert werden, die auf demselben oder verschiedenen Vektoren vorliegen können. Die DNA-Vektoren werden in einem physiologisch annehmbaren Puffer suspendiert, im Allgemeinen einer wässrigen Lösung, z.B. normaler Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Wasser etc. Stabilisierungsmittel, Benetzungsmittel und Emulgatoren, Salze zur Variation des osmotischen Drucks oder Puffer zur Sicherstellung eines adäquaten pH-Werts und Hautpenetrationsverstärker können als Hilfsmittel verwendet werden. Die DNA liegt üblicherweise in einer Konzentration von zumindest etwa 1 ng/ml und nicht mehr als etwa 10 mg/ml vor, für gewöhnlich bei etwa 100 μg bis 1 mg/ml, vor. Der Impfstoff kann in zwei oder mehren Dosen von zumindest etwa 1 μg, üblicherweise zumindest etwa 100 μg und vorzugsweise zumindest etwa 1 mg, pro Dosis, verabreicht im Abstand von 4 Tagen bis eine Woche, fraktioniert werden.
Der DNA-Impfstoff wird in den Muskel oder ein anderes Gewebe subkutan, intradermal, intravenös, oral oder direkt in das Spinalfluid injiziert. Von besonderem Interesse ist Injektion in den Skelettmuskel. Ein Beispiel für intramuskuläre Injektion ist in Wolff et al., Science 247, 1465–1468 (1990), zu finden. Einspritzung kann auch zur intramuskulären Verabreichung verwendet werden, wie von Furth et al., Anal. Biochem. 205, 365–368 (1992), beschrieben. Die DNA kann auf Goldmikroteilchen beschichtet werden und intradermal durch ein Teilchenbombardierungsgerät oder eine „Genkanone" verabreicht werden. Mikroteilchen-DNA-Impfung ist in der Literatur beschrieben worden (siehe beispielsweise Tang et al., Nature 356, 152–154 (1992)). Goldmikroprojektile werden mit der Impfstoffkassette beschichtet, dann in Hautzellen bombardiert.
Die Wirksamkeit von DNA-Impfung kann durch Injektion von Cardiotoxin in das Gewebe etwa eine Woche vor der Impfung verbessert werden, wie von Davis et al., FERS Lett. 333, 146–150 (1993), und in den Beispielen beschrieben. Das Cardiotoxin stimuliert Muskeldegeneration und -regeneration. In den Muskel werden etwa 0,1 bis 10 μM Cardiotoxin, das in einem pharmakologisch annehmbaren Vehikel gelöst ist, injiziert.
Das zu behandelnde Leiden bestimmt die Auswahl der V_Impfstoff-Sequenz(en). Identifikation von spezifischen variablen T-Zellrezeptorregionen, die mit Entzündungserkrankung assoziiert sind, ermöglicht die Verwendung von Therapien, welche die proentzündliche Reaktion von T-Zellen mit solchen variablen Regionen (V_Target) hemmen. Variable Regionen, die mit Erkrankung assoziiert sind, werden durch eine Vielzahl verschiedener Verfahren identifiziert. Im Fall von Autoimmunerkrankungen sind T-Zellen identifiziert worden, die spezifisch mit einer Kombination eines Autoantigens, das von autologen MHC-Molekülen präsentiert wird, reagieren.
Zum Beispiel können In-vitro-Studien durchgeführt werden, um die Konfiguration der variablen Region von T-Zellen zu identifizieren, die auf ein Testantigen, z.B. Autoantigen, Transplantathistokompatibilitätsantigen, Virusantigen etc., reagieren. Der Test kann ein gesamtes Antigen nützen oder immundominante Peptide auswählen, unter Verwendung von fachbekannten Verfahren, um Peptide auszuwählen und herzustellen. Die reagierenden T-Zeilen können hinsichtlich des Impfstoffempfängers autolog, syngenetisch oder allogen sein. Die reagierenden Zellen werden ausgewählt und die exprimierten T-Zellrezeptorgene identifiziert, z.B. durch Polymerasekettenreaktionsamplifikation unter Verwendung von Primern, die mit konservierten Sequenzen hybridisieren. Die variable Region des reagierenden T-Zellrezeptors kann dann zur Impfung verwendet werden, um T-Zellreaktivität in vivo gegen das Testantigen zu unterdrücken.
Alternativ dazu kann V_Target-Expression alleine und gemeinsam mit dem J_Target für T-Zellen bestimmt werden, die an der Stelle der Entzündungsläsionen zu finden sind. Zum Beispiel werden die T-Zellen aus der Entzündungsstelle isoliert, und die gesamte mRNA wird gemäß Standardverfahren hergestellt. RT-PCR oder andere fachbekannte Amplifikationsverfahren werden verwendet, um die exprimierte variable Region zu amplifizieren. Im Fall von RT-PCR werden Primer verwendet, welche die bestimmte variable Region identifizieren, die exprimiert wird. Primer werden gemäß bekannter Sequenzen der konservierten Regionen der T-Zell-Rezeptoruntereinheiten ausgewählt. Die bestimmten V-Regionen und J-Regionen, die von T-Zellen exprimiert werden, die in der Läsion vorliegen, werden dann mit dem Wirts-MHC-Antigentyp in Verbindung gebracht.
Genomische DNA kann dann aus solchen T-Zellen isoliert werden und zur Bestimmung der Gegenwart von Neuanordnungen am TCR-Lokus verwendet werden, indem Primer zur Verfügung stehen, die an im Wesentlichen konservierte Regionen der variablen Region hybridisieren. Durch Klonieren kann der Lokus sequenziert werden und die variable Regionidentität geschaffen werden. Eine 100 % Korrelation zwischen der Expression einer variablen Region und der Gegenwart der Erkrankung ist normalerweise nicht zu erwarten bzw. wird nicht notwendigerweise erreicht. Es ist für gewöhnlich zufrieden stellend, dass in zumindest 60 %, vorzugsweise 70 %, der Wirte, die für die Erkrankung positiv sind, der Lokus der variablen Region, der mit der Erkrankung assoziiert ist, in einer Population von Wirts-T-Zellen exprimiert wird. Auf ähnliche Weise fehlt in weniger als etwa 50 %, vorzugsweise in weniger als etwa 30 %, der Wirte, die keine Symptome der Erkrankung aufweisen, die variable Region.
T-Zellen mit einer gemeinsamen variablen Region exprimieren das Gen der variablen Region aus einer einzelnen V-Segmentunterfamilie. Gensegmente, die mehr als 75 % Nucleotidsequenzähnlichkeit über die Länge des V-Gens zeigen, werden als Elmente derselben Unterfamilie angesehen (Crew et al., Cell 25, 59–66 (1981)). Die Sequenzähnlichkeit wird für das V-Exon selbst kalkuliert und umfasst keine Sequenzen, für welche D- und J-Segmente und N-Additionen kodieren.
Abhängig von der speziellen Erkrankung können verschiedene Gewebe zur Identifikation von T-Zellen verwendet werden. Für neurale Erkrankungen, wie z.B. Multiple Sklerose, können Gehirnplaques oder Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit als Quelle der T-Zellen verwendet werden. Auf ähnliche Weise können für Myasthenia gravis Muskel, Thymusgewebe oder T-Zellen verwendet werden, die auf Acetylcholinrezeptor reagieren. Für rheumatoide Arthritis kann das Synovium verwendet werden.
Durch Identifikation eines besonderen Klasse-II-Haplotyps oder molekularen Phänotyps können bestimmte variable Va- und Vb-Regionen identifiziert werden, die mit einer bestimmten Erkrankung assoziiert sind. Sobald der krankheitsassoziierte T-Zellrezeptor oder variable Regionen identifiziert werden, kann suppressive Impfung zur Prophylaxe oder Behandlung verwendet werden.
Die betreffende Therapie wird wünschenswerterweise im präsymptomatischen oder präklinischen Stadium der Erkrankung und in manchen Fällen im symptomatischen Stadium der Erkrankung verabreicht. Frühe Behandlung ist bevorzugt, um den Funktionsverlust zu vermeiden, der mit entzündlichem Gewebsschaden verbunden ist. Das präsymptomatische oder präklinische Stadium wird als jener Zeitraum definiert, der nicht länger ist, als wenn T-Zellinvolvierung an der Erkrankungsstelle vorliegt, z.B. Langerhanssche Inseln, Gewebe der Membrana synovialis, Schilddrüse etc., aber der Funktionsverlust nicht schwerwiegend genug ist, um klinische Symptome zu produzieren, die eine offene Erkrankung anzeigen. T-Zellinvolvierung kann durch Gegenwart erhöhter Anzahlen von T-Zellen an der Erkrankungsstelle, Gegenwart von T-Zellen, die für Autoantigen spezifisch sind, Freisetzung von Perforinen und Granzymen an der Erkrankungsstelle, Reaktion auf Immunsuppressivatherapie etc. nachgewiesen werden.
Degenerative Gelenkserkrankungen können entzündlich sein, wie bei seronegativen Spondyloarthropathien, z.B. Bechterew-Strümpell-Marie-Krankheit und reaktiver Arthritis, rheumatoider Arthritis, Gicht und systemischem Lupus erythematodes. Die degenerativen Gelenkserkrankungen haben eine gemeinsame Eigenschaft, insofern, als dass der Knorpel des Gelenks erodiert ist und letztlich die Knochenoberfläche freiliegt. Zerstörung des Knorpels beginnt mit dem Abbau von Proteoglykan, vermittelt durch Enzyme wie Stromelysin und Collagenase, was zum Verlust der Fähigkeit führt, kompressivem Stress zu widerstehen. Änderungen der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. CD44 (Swissprot P22511), ICAM-1 (Swissprot P05362), und extrazellulärem Matrixprotein, wie z.B. Fibronectin und Tenascin, folgen. Letztlich werden fibröse Kollagene durch Metalloproteasen angegriffen, und wenn das kollagene Mikroskelett verloren geht, ist eine Reparatur durch Regeneration unmöglich. Es besteht eine signifikante immunologische Aktivität innerhalb des Synoviums im Verlauf von entzündlicher Arthritis. Während Behandlung in Frühstadien wünschenswert ist, werden negative Symptome der Erkrankung zumindest teilweise durch Behandlung in späteren Stadien gelindert. Klinische Anzeichen für die Schwere von Arthritis umfassen Schmerz, Schwellung, Müdigkeit und morgendliche Steifheit und können quantitativ durch Pannus-Kriterien überwacht werden. Dem Krankheitsverlauf in Tiermodellen kann durch Messung der betroffenen Gelenksentzündung gefolgt werden. Therapie für entzündliche Arthritis kann die gegenständliche Therapie mit herkömmlicher NSAID-Behandlung kombinieren. Im Allgemeinen wird die gegenständliche Behandlung nicht mit solchen krankheitsmodifizierenden Arzneimitteln wie Cyclosporin A, Methotrexat und dergleichen kombiniert.
Ein quantitativer Anstieg der myelin-autoreaktiven T-Zellen mit der Fähigkeit, IF-gamma zu sekretieren, ist mit der Pathogenese von MS und EAE assoziiert, was vermuten lässt, dass Autoimmuninduktor/Helfer-T-Lymphozyten im peripheren Blut von MS-Patienten das Demyelinierungsverfahren bei Patienten mit MS initiieren und/oder regulieren können. Die offenkundige Erkrankung ist mit Muskelschwäche, Verlust von abdominalen Reflexen, Sehschwächen und Parästhesie verbunden. Im präsymptomatischen Zeitraum kommt es zur Infiltration von Leukozyten in die Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Entzündung und Demyelinisierung. Familienanamnesen und die Gegenwart von HLA-Haplotyp DRB*1501, DQA1*0102, DQB1*0602 zeigen eine Empfindlichkeit für die Erkrankung an. Marker, die während des Krankheitsverlaufs überwacht werden können, sind die Gegenwart von Antikörpern in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit, „evozierte Potenziale", die durch Elektroenzephalographie im visuellen Kortex und Gehirnstamm zu sehen sind, und die Gegenwart von Rückenmarksdefekten durch MRI oder Computertomographie. Behandlung in den frühen Krankheitsstadien verlangsamt oder stoppt den weiteren Verlust neuraler Funktion.
Menschlicher IDDM ist eine zellvermittelte Autoimmunerkrankung, die zur Zerstörung der insulinsekretierenden β-Zellen und offenkundiger Hyperglykämie führt. T-Lymphozyten dringen in die Langerhansschen Inseln ein und zerstören speziell insulinproduzierende β-Zellen. Die Abnahme von β-Zellen resultiert im Unvermögen, Glucosespiegel im Blut zu regulieren. Offenkundiger Diabetes tritt ein, wenn der Glukosespiegel im Blut einen bestimmten Spiegel überschreitet, für gewöhnlich etwa 250 mg/dl. Beim Menschen geht dem Auftreten von Diabetes ein langer präsymptomatischer Zeitraum voran. In diesem Zeitraum kommt es zu einem allmählichen Verlust pankreatischer β-Zellfunktion. Der Krankheitsverlauf kann bei Personen überwacht werden, bei denen durch ihre Familienanamnese und genetische Analyse die Diagnose gestellt wird, dass sie Sensibilität aufweisen. Die wichtigste genetische Wirkung ist bei Genen des Haupthistokompatibilitätslokus zu beobachten (IDDM1), obwohl andere Loki, einschließlich der Insulingenregion (IDDM2), auch eine Verbindung mit der Erkrankung zeigen [siehe Davis et al., siehe oben, und Kennedy et al., Nature Genetics 9, 293–298 (1995)].
Marker, die im präsymptomatischen Stadium evaluiert werden können, sind die Gegenwart von Insulitis im Pankreas, das Ausmaß und die Häufigkeit von Inselzellantikörpern, Inselzelloberflächenantikörpern, anomaler Expression von Klasse-II-MHC-Molekülen auf Pankreas-b-Zellen, Glukosekonzentration im Blut und Plasmakonzentration von Insulin. Ein Anstieg der Anzahl von T-Lymphozyten im Pankreas, Inselzellantikörpern und Blutglukose zeigt die Erkrankung an wie auch ein Rückgang der Insulinkonzentration. Nach dem Auftreten von offenkundigem Diabetes können Patienten mit einer Rest-b-Zellfunktion, die durch Plasmapersistenz von Insulin-C-Peptid nachgewiesen wird, auch von dieser Behandlung profitieren, um weiteren Funktionsverlust zu vermeiden.
Die Antwort des Wirtsimmunsystems auf ein Transplantat oder eines Transplantats gegen den Wirt (GVHD) wird durch Behandlung mit der gegenständlichen suppressiven Impfung reduziert. Transplantate umfassen die Transplantation von Zellen, Geweben und Organen, wie z.B. die Transfusion von Blut oder Blutkomponenten, die Transplantation von Knochen, Haut, Knochenmark etc. und die Transplantation von Geweben des Auges, Pankreas, der Leber, Niere, des Herzens, Gehirns, Darms, der Lunge etc. Transplantation von hämatopoetischen Zellen ist von Interesse, z.B. Knochenmark, mobilisierte hämatopoetische Stammzellen in peripherem Blut etc., Transplantation von Nieren und Transplantation von Herzen. Wie hierin verwendet ist ein Transplantatempfänger eine Person, an welche Gewebe oder Zellen aus einer anderen Person (Spender), häufig derselben Spezies, transferiert worden sind, insbesondere wo eine oder mehrere der Klasse-I-MHC-Antigene im Spender im -Vergleich zum Empfänger unterschiedlich sind. Jedoch sind in einigen Fällen xenogene, z.B. Schwein-, Pavian- etc., Gewebe, Zellen oder Organe involviert. Transplantatempfänger und -spender sind im Allgemeinen Säugetiere, vorzugsweise Menschen. Zur Behandlung von Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung kann es wünschenswert sein, den Transplantatspender vor Transplantation zu impfen, um die Spender-T-Zellen zu unterdrücken.
Entzündungserkrankungen, die durch Bakterien- und Virusinfektion verursacht sind, umfassen Virusmeningitis und bakterielle Meningitis, Herpes encephalitis und virale Meningoenzephalitis, virale Hepatitis, z.B. Hepatitis-A, -B, -C, -D etc. Erkrankungen von Interesse umfassen auch Entzündungsreaktion auf Impfung, insbesondere Tollwutimpfung, Varicella-zoster-Impfung, Masernimpfung etc.
Säugetierspezies, die für Entzündungserkrankungen empfindlich sind, umfassen Hunde und Katzen, Pferde, Rinder, Schafe etc. und Primaten, insbesondere Menschen. Tiermodelle, insbesondere kleine Säugetier, z.B. murine und hasenartige etc., können für experimentelle Nachforschungen verwendet werden. Tiermodelle von Interesse umfassen jene, die in die Produktion von Antikörpern involviert sind, die über Isotypen verfügen, die mit IL-4-Produktion assoziiert sind, z.B. IgE, IgG1 und IgG4. Andere Anwendungen umfassen Forschungen, in welchen es wünschenswert ist, eine bestimmte Wirkung in Abwesenheit der T-zellvermittelten Entzündung zu untersuchen.
Die folgenden Beispiele dienen der Bereitstellung einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung davon, wie die vorliegende Erfindung hergestellt und verwendet werden kann, gegenüber Fachleuten und dienen nicht der Einschränkung des Schutzumfangs dessen, was als Erfindung angesehen wird. Es sind Bemühungen angestellt worden, um die Genauigkeit hinsichtlich der verwendeten Zahlen sicherzustellen (z.B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen etc.), aber gewisse Versuchsfehler und -abweichungen sind möglich. Wenn nicht anders angegeben sind Teile Gewichtsteile, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben und der Druck atmosphärisch bzw. nahezu atmosphärisch.
Experimenteller Teil
Beispiel 1 Schutz vor Autoimmunerkrankung durch DNA-Impfung
Materialien und Verfahren
Plasmidherstellung: RNA wurde aus normalen PL/J-Mausmilzzellen, wie von Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrie ben, isoliert und als Matrize für Umkehrtranskriptase unter Verwendung von Poly(dT) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) als Primer verwendet. Diese cDNA wurde dann für PCR unter Verwendung von Taq-Polymerase verwendet (Stratagene, La Jolla, CA) mit Primern, die spezifisch sind für Vb5.1
5'-CCGGAATTCATGAATTCTGGGGTTGTCCAGTCTCCA,AGA-3' [Seq.-ID Nr. 1] und
5'- TGCTCTAGATTAGCTGGCACAGAAGTACACGGCAGA-3') [Seq.-ID Nr. 2] oder Vb8.2
(5'-CCGGAATTCATGGAGGCTGCAGTCACCCAAAG-3' [Seq.-ID Nr. 3] und
5'- TGCTCTAGATTAGCTGGCACAGAAGTACACTGATGT-3') [Seq.-ID Nr. 4].
Diese Primer decken die vollständige V-Region ab (etwa 310 bp) und umfassen EcoRI- und XbaI-Stellen, die für Klonierung verwendet werden. Die Sequenz des Vb5.1-Amplifikationsprodukts wird in Seq.-ID Nr. 6 gezeigt, das Vb8.2-Amplifikationsprodukt wird in Seq.-ID Nr. 7 gezeigt. Die PCR-Produkte wurden dann in pcDNA3-Plasmid (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert, das dann für Mini-prep (Qiagen, Chatsworth, CA) verwendet wurde. DNA aus Kolonien mit einem Insert der richtigen Länge wurde amplifiziert und sequenziert, um die Insertion des richtigen Gens mit einem geeigneten offenen Leseraster nachzuweisen. Eine Karte des Vektors ist in 4 zu sehen.
DNA-Injektion und -herstellung: Herstellung von DNA in großem Maßstab wurde unter Verwendung von Maxi- oder Mega-prep (Qiagen) durchgeführt. Cardiotoxin (Sigma, St. Louis, MO) wurde, wie in Davis et al., FEBS Lett. 333, 146–150 (1993), beschrieben, hergestellt. Bei Letzterem wurde festgestellt, dass es die Wirksamkeit von DNA-Impfung verstärkte. Fünfzig μl Cardiotoxin wurden in den Musculus tibialis anterior von weiblichen, 6–8 Wochen alten PL/J-Mäusen injiziert [Jackson Laborstory, Bar-Harbor, MA). Eine Woche nach der Injektion wurde Mäusen eine Gesamtheit von 100 μg DNA in PBS injiziert (1 mg/ml), dreimal mit Intervallen von 6–7 Tagen zwischen den Injektionen. Um Expression nachzuweisen, wird der Muskel aus einer injizierten Maus entfernt und RNA hergestellt. Diese RNA wurde als Matrize für cDNA verwendet, die wie beschrieben für PCR verwendet wurde. PCR-Produkte von Vβ5.12 und Vβ8.2 wurden nur in den Mäusen festgestellt, denen geeignete Gene injiziert wurden.
Krankheitsinduktion: pAc1-2Q von basischem Rattenmyelinprotein [Seq.-ID Nr. 5] (Ac-ASQKRPSQRHGSKYLATAST) oder gpMBP (Sakai et al., siehe oben) wurde 1:1 mit inkomplettem Freund-Adjuvans (Difco, Detroit, MI), das mit getötetem Mycobacterium tuberculosis, Stamm H37 RA (Difco), ergänzt war, auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml Antigen und 2 mg/ml Bakterien gemischt. Die vollständige mRNA-Sequenz, die für basisches Rattenmyelinprotein kodierte, hat die Genbank-Zugangsnummer M25889. Dieses Gemisch wurde dann für intradermale Immunisierung der behandelten PL/J-Mäuse verwendet, 50 μl in jeden Fußballen. Danach wurden Mäuse i.v. mit Bordetella-Pertussis-Toxin (200 ng, List Biological Laborstories, Campbell, CA) am Tag der Antigeninokulation und 48 h später immunisiert. Adoptiver Transfer von EAE wurde durch i.v.-Inokulation von 5 × 10⁶ Zellen der T-Zelllinie pro Tier erreicht. Alle Tiere wurden auf klinische Anzeichen für Erkrankung nach dem folgenden klinischen Maßstab verfolgt: 0, keine klinische Erkrankung; 1, Schwanzschwäche; 2, Paraparese; 3, Paraplegie; 4, Paraplegie mit Schwäche oder Paralyse der vorderen Gliedmaßen; 5, moribunde oder tote Tiere.
FACS-Färbung: Zellen (5 × 10⁵ Zellen/Röhrchen) wurden mit F23.2- (Anti-Vβ8.2-) oder als Kontrolle mit KJ23- (Anti-Vβ17a-) Antikörpern inkubiert, gefolgt von Ziegen-Anti-Maus, konjugiert an FITC (Jackson ImmunoResearch Laborstories, West Grove, PE), wie zuvor beschrieben. Die Zellen wurden auch entweder mit Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörpern (Pharmingen), konjugiert an PE, gemeinsam inkubiert. Die Zellen wurden dann auf die Gegenwart von CD3⁺-, CD4⁺- oder CD8⁺-Populationen analysiert, die Vβ5- oder Vβ8.2-TCR exprimieren. Antikörper gegen Vβ8.2-TCR in den Seren der geimpften Mäuse wurden wie oben beschrieben analysiert. Zusätzlich da zu wurden T-Zellen auf ihre Expression von CD3-, CD4-, CD8- und CD44-Oberflächenmarker analysiert, wobei Antikörper verwendet werden, die an FITC konjugiert waren (Pharmingen).
Lymphknotenzellen- (LNC-) Proliferation: INC und Milzzellen von immunisierten Mäusen (2 × 10⁵/Well) wurden in Gegenwart verschiedener Antigene kultiviert. Kulturen wurden in 200 μl RPMI-1640-Medium, das mit 2 mM Glutamin, nichtessentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Fungizon (BioLab, Jerusalem, Israel), 5 × 10^-5 M β-Mercaptoethanol (Fluka AG, Buchs, Schweiz) und 10 mM Hepes-Puffer (Sigma) ergänzt war, das ein angereichertes RPMI genannt wurde, das 1 % syngenetisches normales Mausserum enthält, in runden 96-Well-Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) hergestellt. Nach 5 Tagen Inkubation wurde ³H-Thymidin (0,5 μCi von 5 Ci/mmol, Nuclear research Center, Negev, Israel) hinzugegeben. Sechzehn Stunden später wurden Zellen geerntet und Radioaktivität gemessen.
Cytokine aus Lymphknotenzellen und T-Zelllinien: INC oder Milzzellen (1 × 10⁷) wurden in angereichertem RPMI mit 1 % syngenetischen Seren mit 10 μg der angegebenen Peptide inkubiert. Das Medium wurde 24 Stunden später gewonnen. Die IL-2-Spiegel und γ-Interferon wurde unter Verwendung der Antikörperpaare, die von Pharmingen (La Jolla, CA) erworben wurden, gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die IL-4-, IL-10- und RNF-α-Spiegel wurden unter Verwendung von Sets, die von Genzyme (Cambridge, MA) erworben wurden, gemessen.
Anti-Ac1-20-Antikörper: Mäusen wurde am Höhepunkt der Erkrankung Blut abgenommen, und Antikörper gegen pAc1-20 wurden gemessen. Maxisorb-Mikrotiterplatten wurden mit 50 μl/Well von 10 μg/ml Ac1-20 90 min lang beschichtet. Danach wurden die Platten gewaschen und über Nacht mit 10 % FCS in PBS blockiert. Danach wurden die Seren von Mäusen 90 min lang inkubiert. Platten wurden dann gewaschen und mit Ziegen-Anti-Maus-IgG1 oder -IgG2a (Fc-Fragment-spezifisch), konjugiert an alkalische Phosphatase (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), 75 min lang inkubiert. Nach Waschung wurden Platten mit dem Substrat, ABTS (Kirkegaard and Perry Laborstories, Gaithersburg, MD), inkubiert und bei 405 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts abgelesen.
T-Zelllinien: Lymphknotenzellen (IN) (5 – 10 × 10⁶/ml) wurden in angereichertem RPMI, das mit 1 % syngenetischen Seren und 10 μg/ml Peptid Ac1-20 ergänzt war, 3 Tage lang inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und in restlichem Medium 10 Tage lang resuspendiert (angereichertes RPMI, 10 % FCS und 10 % Überstand von Milzzellen, aktiviert mit conA). Die Zellen wurden dann in Gegenwart von syngenetischen bestrahlten Milzzellen (10⁶/ml) und 10 μg/ml Peptid Ac1-20 3 Tage lang aktiviert, gewaschen und in ruhendem Medium 3 Tage lang inkubiert. Danach wurden die Zellen zur Analyse verwendet.
T-Zelllinienproliferationstest: Proliferationstests wurden wie zuvor beschrieben für INC mit geringfügigen Veränderungen durchgeführt. T-Zelllinien (TCL) (10⁴) wurden in Platten mit rundem Boden (Corning, NY) mit 2 × 10⁵ bestrahlten syngenetischen APC in einem Gesamtvolumen von 250 μl von angereichertem RMPI und 10 % FCS und verschiedenen Konzentrationen des Peptids inkubiert. Nach 24 Stunden wurden 100 μl aus jedem Well zur Cytokinanalyse entfernt. Die verbleibenden Zellen wurden weitere 24 Stunden lang inkubiert, pulsiert und wie im LNC-Proliferationstest beschrieben geerntet.
Statistische Analyse: Bedeutung von Unterschieden wurde unter Verwendung von Student-t-Test auf Proliferation und Cytokinsekretionstests untersucht. Für die Schwere der Erkrankung wurde der Mann-Whitney-Test verwendet. Für die Analyse von GACS-Daten wurde Chi-Quadrat (χ²) verwendet. Ein Wert von p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Ergebnisse

Das Vβ8.2-Gen des T-Zellrezeptors wurde in einen Expressionsvektor kloniert und dreimal in wöchentlichen Intervallen in den Musculus tibialis anterior von weiblichen PL/J-Mäusen injiziert, beginnend eine Woche nach einer einzelnen intramuskulären Injektion von Cardiotoxin. Kontroll-PL/J-Mäuse wurden einmal mit Cardiotoxin und dann in wöchentlichen Intervallen mit der DNA, die für die variable Vβ5.1-Region von TCR kodiert, immunisiert. Diese TCR-V-Region ist auf pathogenen T-Zellklonen in H-2^u-Mäusen nicht festzustellen. Nach diesem Immunisierungsprotokoll wurden alle Mäuse mit komplettem Freund-Adjuvans immunisiert, das entweder das basische Myelinproteinpeptid Ac1-20 oder Meerschweinchen-MBP enthält. Die Mäuse, die mit der Vβ8.2-DNA geimpft wurden, waren gegenüber experimenteller Autoimmunenzephalitis (EAE) resistent, die durch das Ac1-20-Peptid induziert wurde, während EAE in den Gruppen induziert wurde, die mit der Kontroll-Vβ5.1-DNA oder nur mit Cardiotoxin geimpft wurden. Nur eine Maus von 14, die mit Vβ8.2 geimpft wurde, entwickelte milde Paralyse der hinteren Gliedmaßen, während 11/15 und 10/13 Mäusen paralysiert waren oder in den jeweiligen Kontrollgruppen starben (p < 0,0001), nach Immunisierung mit pAc1-20. Die Daten sind in Tabelle 1 und 1A dargestellt. Tabelle 1 Aktive EAE-Induktion nach DNA-Impfung

(a) Krankheitsinduktion mit dem Peptid pAc1-20*
EAE-Inzidenz
DNA	Tag 13	Tag 15	Tag 17	Tag 19	Tag 20	Tag 21	Tag 23	Tag 25
Vb5.1	2/15	7/15	10/15	11/15	10/15	9/15	9/15	8/15
Vb8.2	0/14	1/14	1/14	1/14	1/14	1/14	1/14	1/14
Keine	2/13	4/13	7/13	9/13	10/13	7/13	7/13	7/13

(b) Krankheitsinduktion mit gpMBP*
EAE-Inzidenz
DNA	Tag 13	Tag 15	Tag 17	Tag 19	Tag 20	Tag 21	Tag 23	Tag 25
Vb5.1	2/10	7/10	8/10	9/10	9/10	9/10	8/10	7/10
Vb8.2	0/9	2/9	5/9	5/9	5/9	5/9	4/9	3/9
Keine	2/10	5/10	8/10	9/10	9/10	9/10	8/10	8/10

* An Tag 0 wurde wie in den Beispielen beschrieben eine Erkrankung induziert. Erkrankung wurde wie in den Versuchen beschrieben überwacht. Es sind Mäuse mit klinischen Anzeihen für EAE und die Anzahl der Mäuse in jeder Gruppe dargestellt.

Obwohl perivaskuläre Infiltrate in den Mäusen gegenwärtig waren, die mit Vβ8.2 immunisiert worden waren, waren sie weniger ausgedehnt und häufig als bei Mäusen, die mit Vβ5.1 immunisiert worden waren, wenn sie von einem Beobachter untersucht wurden, der über den Behandlungsplan nicht informiert war. Wenn die entzündlichen Infiltrate beurteilt wurden, wurden signifikante Unterschiede zwischen den Mäusen, die mit Vβ8.2 behandelt worden waren (Werte 3,5 ± 1,2 für Hirnhautinfiltrate, 4,4 ± 2,0 für Hirnparenchyminfiltrate), verglichen mit Mäusen, die mit Vβ5.1 behandelt worden waren (28,2 ± 4,0 für Hirnhautinfiltrate und 13,5 ± 3 für Hirnparenchyminfiltrate), beobachtet (p < 0,02 für Vergleich von Hirnhautinfiltraten, p < 0,03 für Vergleich von Parenchyminfiltraten) (histologische Infiltrate wurden separat für Gehirnparenchym und Meninges in einem Maßstab, basierend auf Infiltratgröße, gemessen durch eine Anzahl von Zellen pro Cuff, bewertet).
Obwohl MBP Ac1-20 das dominante Epitop im basischen Myelinproteinmolekül in PL/J-Mäusen ist, gibt es andere pathogene Epitope innerhalb dieses Moleküls, einschließlich MBP p35-47. T-Zellerkennung von MBP p35-47 verwendet kein Vβ8.2-Genprodukt. Deshalb wird bestimmt, ob DNA-Impfung mit der Vβ28.2-DNA schützt, wenn EAE mit dem gesamten basischen Myelinprotein induziert wurde. In diesem Fall wäre MBP Ac1-20 das dominante, aber nicht ausschließliche pathogene Epitop, und andere Regionen von MBP können in Pathogenese involviert sein. PL/J-Mäuse wurden mit Vβ8.2-DNA geimpft und induzierten dann Erkrankung mit dem gesamten basischen Myelinprotein. PL/J-Mäuse, die mit Vβ8.2-DNA geimpft worden waren, entwickelten EAE, wenn sie mit Meerschweinchen-MBP immunisiert wurden, obwohl Erkrankung bei einer geringeren Häufigkeit auftrat (p < 0,04, von Tag 15 an) verglichen mit den Mäusen, die mit der Kontroll-DNA oder nur Cardiotoxin geimpft wurden, wie in 1B und Tabelle 1 gezeigt wurde.
Mäuse wurden auf Titer von Antikörpern analysiert, die auf Vβ8.2-TCR gerichtet waren. Mäuse, die mit dem DNA-Konstrukt geimpft wurden, das die Vβ8.2-DNA enthielt, produzierten Antikörper gegen Vβ8.2, das auf T-Zellen exprimiert wurde. Seren von Mäusen, die mit der Vβ8.2-DNA geimpft waren, färbten 76,9 ± 12,1 % Zellen einer Vβ8.2⁺-T-Zeltlinie, die mit MBP Ac1-20 reagierte, während nur 4,3 ± 3 % der Zellen mit den Seren von Kontrollmäusen gefärbt wurden, eine Anzahl, die der Hintergrundfärbung mit normalen Maus-Seren (3,8 ± 2,7, p < 0,01) ähnlich ist. Um zu testen, ob jene Anti-Vβ8.2-Antikörper die Vβ8.2-positiven T-Zellen abbauten, wurden Lymphknotenzellen (LNC) und Milzellen der geschützten Mäuse und Kontrollen auf die Gegenwart dieser Zellpopulation gefärbt. Mäuse, die mit Vβ8.2-DNA geimpft wurden, haben ähnliche Spiegel von Vβ8.2-positiven T-Zellen verglichen mit Kontrollgruppen sowie verglichen mit normalen Mäusen.
Es wurde dann bestimmt, ob DNA-Impfung die Antwort der Vβ8.2-T-Zellen änderte, was es ihnen unmöglich machte, eine pathogene Antwort zu geben. Lymphknoten wurden aus geschützten Tieren und aus den Kontrollen entnommen, um zu testen, ob Anergie der Vβ8.2-positiven T-Zellen zu dem immunisierenden Peptid den Schutz erbringt. Es wurde festgestellt, dass Lymphknoten, die aus den PL/J-Mäusen entnommen wurden, in der Lage waren, durch Proliferation auf das immunisierende Peptid zu reagieren, und zwar mit einem kleineren Stimulationsindex als die Zellen, die aus Kontrollmäusen entnommen wurden, die entweder durch Injektion von Vb5.1 oder nur Cardiotoxin behandelt wurden. Daher induzierte DNA-Impfung keine Anergie.
Es wurde festgestellt, dass INC von Mäusen, die mit Vβ8.2-DNA geimpft worden sind, viel geringere Spiegel von γ-Interferon (p < 0,002) und IL-2 (p < 0,0015) nach Aktivierung mit MBP Ac1-20 produzierten, wenn sie mit Kontrollen verglichen wurden (die in den 2A und 2B gezeigt sind). IL-2 und γ-Interferon sind Cytokine, die durch T-Zellen des Th1-Phänotyps produziert wurden. Hingegen produzierten die LNC, die aus den Mäusen entnommen wurden, die mit Vβ8.2-DNA geimpft wurden, erhöhte Spiegel von Th2-Cytokin, IL-4, nach Stimulation mit MBP Ac1-20 (p < 0,04), in 2C dargestellt. Diese Daten zeigen, dass der Phänotyp der Immunantwort bei Vβ8.2-geimpften Mäusen, immunisiert mit einem Antigen, das von T-Zellen erkannt wurde, die Vβ8.2-TCR exprimieren, eine Cytokinverschiebung von Th1 bis Th2 erfahren hatte.
IL-4 induziert eine Klassenänderung von Antikörper vom IgG2a- zum IgG1-Isotyp. Diese Änderung ist ein Kennzeichen von In-vivo-Verschiebung von Th1 zu Th2. Der Isotyp von Antikörpern, die auf das immunisierende Peptid, MBP Ac1-20, gerichtet sind, wurde mit und ohne DNA-Impfung gegen Vβ8.2 analysiert. Mäuse, die mit Vβ8.2-DNA geimpft wurden, produzierten höhere Spiegel von Anti-Ac1-20-Antikörpern des IgG1-Isotyps und geringere Spiegel von Antikörpern des IgG2a-Isotyps im Vergleich zu den Kontrollmäusen (p < 0,01). Diese Daten bestätigen die Vorstellung, dass DNA-Impfung gegen Vβ8.2 zu einer Cytokinverschiebung als Reaktion von T-Zellen auf MBP Ac1-20, einem Antigen, das hauptsächlich von T-Zellen, die Vb8.2 tragen, erkannt wird, führt. Dies könnte für den Schutz gegen die Entwicklung von EAE verantwortlich sein, da von EAE bekannt ist, dass es sich dabei um eine Erkrankung vom Th1-Typ handelt. Weiters schützt die Injektion von IL-4 Mäuse vor der Entwicklung von EAE.
Zur Analyse der Rolle von T-Zellen im Schutzmechanismus wurden kurzfristige T-Zelllinien in Vb8.2-geimpften und Kontrollmäusen gezüchtet. Vier T-Zelllinien, die von Milz und Lymphozyten abstammen, wurden umfassend auf Proliferation und Cytokinantworten getestet, zwei von den Mäusen, die mit Vb8.2-DNA (TCL 8.2-Sp und 8.2-IN) geimpft wurden, und zwei von Kontrollen (TCL-PL-LN und PL-Sp). Alle T- Zelllinien waren 85–90% Vb8.2⁺, 95 % CD44⁺ und CD3⁺, CD4⁺, CD8^-. Alle T-Zelllinien proliferierten in der Gegenwart des Peptids Ac1-20 (p < 0,003 bis p < 0,0001 im Vergleich zum Hintergrund). Im Gegensatz zu ihrer relativ geringen proliferativen Antwort produzierte die Linie PL-Sp hohe Spiegel von g-Interferon bei Stimulation mit Peptid MBP Ac1-20, ähnlich den Spiegeln, die von Linie PL-LN produziert wurden, und höher als Spiegel, die von zwei Linien produziert wurden, die aus Mäusen isoliert wurden, die mit Vb8.2-DNA isoliert wurden (p < 0,015). Die T-Zellen, die aus den Mäusen isoliert wurden, die mit Vb8.2-DNA (p < 0,015) geimpft wurden, produzierten IL-4, während keine Sekretion dieses Cytokins aus der TCL zu beobachten war, die aus Kontrollmäusen isoliert worden war. Die zwei T-Zelllinien, die aus den Kontrollmäusen mit EAE isoliert wurden, produzierten signifikant höhere Spiegel von TNFa im Vergleich zu den Linien, die aus den geschützten Mäusen isoliert wurden (p < 0,02). Letzterer stimmt mit den Ergebnissen überein, dass enzephalitogene T-Zelllinien hohe TNFa-Spiegel produzieren. Diese Ergebnisse dienen alle dazu, anzuzeigen, dass DNA-Impfung auf das TCR-Vβ8.2 eine Verschiebung im Phänotyp von T-Zellen induzierte, die auf das Antigen MBP Ac1-39 reagierten, und zeigten eine Verschiebung von Th1 zu Th2.
Zur Bestimmung, ob T-Zelllinien, die auf MBP Ac1-20 aus geimpften Tieren reagierten, EAE induzieren konnten, wurden TCL aus Mäusen gezüchtet, die mit MBP Ac1-20 immunisiert wurden, aus Mäusen, die mit beiden Vβ8.2 immunisiert wurden, oder Mäusen, denen Vβ5.1 gegeben wurde. Fünf Millionen Zellen wurden intravenös injiziert, und der klinische Krankheitsverlauf wurde beobachtet. Es wurde festgestellt, dass T-Zelllinien, die auf MBP Ac1-20 aus Vβ8.2-immunisierten Mäusen reagierten, nicht in der Lage waren, EAE zu induzieren, während Kontrollmäuse klassische EAE beginnend an Tag 12 entwickelten.
Es wurde weiters bestimmt, ob die Th2-T-Zellinien, die auf MBP Ac1-20 gerichtet waren, das von Mäusen abstammt, die mit Vβ8.2-DNA immunisiert wurden, EAE unterdrücken. Es wurde festgestellt, dass Mäuse, die fünf Millionen TH2-Zellen erhielten, nach Immunisierung am selben Tag mit MBP Ac1-20 in CFA kein EAE bekamen, während Mäuse, die MBP Ac1-20 in CFA erhielten, EAE von Grad 2 entwickelten. Daher waren diese Th2-T-Zellen in der Lage, EAE zu unterdrücken.
Die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass DNA-Impfung mit einem T-Zellrezeptor-V-Gen, das häufig auf pathogenen T-Zellen zu finden ist, in der Lage ist, Autoimmunerkrankung zu vermeiden. Bei Impfung mit einer variablen Region, die ein immundominantes Peptid erkennt, wird auch die Induktion von Erkrankung durch das vollständige Protein reduziert. Die DNA-Impfung induziert eine Verschiebung in der Cytokinproduktion von T-Zellen, die das relevante V-Gensegment verwenden, von Th1 zu Th2, begleitet durch eine Verschiebung im Antikörperisotyp, der gegen das zugehörige Antigen produziert wurde. Diese Th2-Cytokine wirken den Wirkungen von entzündlichen Cytokinen entgegen.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch Erklärung und Beispiele zur Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, ist es Fachleuten angesichts der Lehren dieser Erfindung klar, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Geist oder Schutzumfang der Ansprüche im Anhang abzugehen.

Claims

DNA-Expressionskassette, die eine Sequenz umfasst, die für zumindest einen Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors unter der regulierenden Kontrolle eines Promotors kodiert, der in einem Säugetierwirt aktiv ist, wobei die variable Region des T-Zellrezeptors aus der Gruppe bestehend aus Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5, Vα7, Vβ5, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ12 und Vβ14 ausgewählt ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Säugetier, worin die variable Region des T-Zellrezeptors mit der Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
Expressionskassette nach Anspruch 1, worin der Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors unter der regulierenden Kontrolle eines Promotors ist, der in Muskelgewebe aktiv ist.
DNA-Expressionskassette nach Anspruch 1, worin die Sequenz, für welche kodiert wird, menschliches Vβ5.1 ist.
DNA-Expressionskassette nach Anspruch 1, worin die Sequenz, für welche kodiert wird, menschliches Vβ5.2 ist.
DNA-Expressionskassette nach Anspruch 1, worin die Sequenz, für welche kodiert wird, menschliches Vβ12 oder Vβ14 ist.
DNA-Expressionskassette nach Anspruch 1, worin die Sequenz, für welche kodiert wird, menschliches Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5 oder Vα7 ist.
Plasmid, das eine Expressionskassette nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.
Verwendung einer Plasmidexpressionskassette, die eine Sequenz umfasst, die für zumindest einen Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors unter der regulierenden Kontrolle eines Promotors kodiert, der in einem Säugetierwirt aktiv ist, wobei die variable Region des T-Zellrezeptors aus der Gruppe bestehend aus Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5, Vα7, Vβ5, Vβ5.1, Vβ5.2, Vβ12 und Vβ14 ausgewählt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Autoimmunerkrankung, worin die variable Region des T-Zellrezeptors mit der Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 8, worin die Sequenz, die für zumindest einen Abschnitt einer variablen Region eines T-Zellrezeptors kodiert, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist, DNA ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die DNA, die für die variable Region des T-Zellrezeptors kodiert, für menschliche Vβ5.1 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die DNA, die für die variable Region des T-Zellrezeptors kodiert, für menschliche Vβ5.2 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die DNA, die für die variable Region des T-Zellrezeptors kodiert, für menschliche Vβ12 oder Vβ14 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die DNA, die für die variable Region des T-Zellrezeptors kodiert, für menschliche Vα8–10, Vα12, Vα16, Vα1, Vα5 oder Vα7 kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, worin die Behandlung die Injektion der Expressionskassette in Muskelgewebe eines Säugetierwirts umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, worin die Behandlung weiters die Injektion von Cardiotoxin in das Muskelgewebe vor Injektion der Kassette umfasst.