DE69727558T2

DE69727558T2 - Humanes CYR61, ein Signalmolekül der extrazellularen Matrix

Info

Publication number: DE69727558T2
Application number: DE69727558T
Authority: DE
Inventors: F. Lester LAU
Original assignee: Munin Corp
Current assignee: Munin Corp
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2017-03-15
Also published as: US7064185B2; JP4307552B2; US20060257965A1; CN1222193A; ATE259419T1; AU733382B2; JP2000506732A; US6413735B1; EP0888452B1; WO1997033995A3; US20020150986A1; DE69727558D1; AU2329697A; HK1018707A1; EP0888452A2; CN1263852C; CA2248549A1; DK0888452T3; WO1997033995A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Cyr61-verwandte Polynucleotide, Polypeptide, Zusammensetzungen davon, Verfahren zur Reinigung dieser Polypeptide und Verfahren zur Verwendung dieser Polypeptide.
Hintergrund der Erfindung
Das Wachstum von Säugetierzellen ist durch Polypeptid-Wachstumsfaktoren streng reguliert. Im erwachsenen Tier sind die meisten Zellen metabolisch aktiv, sind jedoch in Bezug auf die Zellteilung ruhend. Unter bestimmten Bedingungen können diese Zellen stimuliert werden, um wieder in den Zellzyklus einzutreten und sich zu teilen. So wie die ruhenden Zellen in die aktiven Wachstums- und Teilungsphasen des Zellzyklus wiedereintreten, werden eine Reihe von spezifischen Genen, die unmittelbar frühen Gene, rasch aktiviert. Der Wiedereintritt in den aktiven Zellzyklus ist notwendigerweise streng reguliert, da ein Zusammenbruch dieser Kontrolle unkontrolliertes, häufig als Krebs erkanntes Wachstum bewirken kann. Der kontrollierte Wiedereintritt bestimmter Zellen in die Wachstumsphase ist für solche Prozesse wie Angiogenese (z. B. Blutgefäß-Wachstum und -Reparatur), Chondrogenese (z. B. Skelettentwicklung und Prothesenintegration), Onkogenese (z. B. Krebszellenmetastase und Tumor-Neovaskularisierung) und andere ein Wachstum erfordernde Prozesse essenziell.
Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus den Endothelzellen bereits bestehender Blutgefäße, ist ein komplexer Vorgang, der ein sich veränderndes Profil der Endothelzellen-Genexpression in Verbindung mit Zellmigration, -vermehrung und -differenzierung umfasst. Angiogenese beginnt mit lokalisiertem Abbau der Basalmembran des Stamm-Gefäßes. In vivo unterstützen die Basalmembranen (in erster Linie aus Laminin, Kollagen Typ IV, Nidogen/Entacin und Proteoglykan zusammengesetzt) die Endothelzellen und sorgen für eine Barriere, die diese Zellen vom darunter liegenden Stroma trennt. Die Basalmembran beeinflusst ferner eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten, einschließlich Zelladhäsion, -migration und -wachstum während Entwicklung und Differenzierung.
Nach dem Abbau der Basalmembran migrieren Endothelzellen vom Stamm-Gefäß weg in die interstitielle extrazelluläre Matrix (ECM), zumindest teilweise aufgrund chemisch anziehend wirkender Gradienten. Die migrierenden Endothelzellen bilden einen Kapillarspross, der sich streckt. Diese Streckung ist das Ergebnis von Migration und Vermehrung von Zellen im Spross. In der führenden Kapillarspitze lokalisierte Zellen migrieren zum angiogenen Stimulus, synthetisieren jedoch keine DNA und teilen sich nicht. Unterdessen unterziehen sich hinter diesen führenden Spitzenzellen andere Endothelzellen einer schnellen Teilung, um eine ausreichende Versorgung von Endothelzellen zur Bildung des neuen Gefäßes sicherzustellen. Kapillarsprossen verzweigen sich dann an ihren Spitzen, die Zweige erfahren Anastomose oder vereinigen sich miteinander, um ein Lumen zu bilden, die Basalmembran wird wiederhergestellt, und es wird eine Gefäßverbindung errichtet, was zum Blutfluss führt.
Veränderungen von zumindest drei Endothelzellen-Funktionen treten während der Angiogenese auf: 1) Modulierungen der Wechselwirkungen mit der ECM, die Änderungen der Zellmatrixkontakte und die Herstellung von Matrix-abbauenden proteolytischen Enzymen erfordern; 2) eine anfängliche Erhöhung und anschließende Verminderung der Endothelzellen-Migration, was eine Zellverlagerung zum angiogenen Stimulus bewirkt; und 3) ein vorübergehender Anstieg der Zellvermehrung, die Zellen für das wachsende und sich streckende Gefäß bereitstellt, mit einer anschließenden Rückkehr zum ruhenden Zellzustand, wenn sich das Gefäß gebildet hat. Diese drei Funktionen werden durch adhäsive, chemotaktische und mitogene Wechselwirkungen bzw. Reaktionen verwirklicht. Daher erfordert die Kontrolle der Angiogenese den Eingriff in drei unterschiedliche Zellaktivitäten: 1) Zelladhäsion, 2) Zellmigration und 3) Zellvermehrung. Ein weiterer biologischer Prozess, der eine ähnlich komplexe Reihe von Zellaktivitäten umfasst, ist die Chondrogenese.
Chondrogenese ist der für die Skelettorganisation verantwortliche Zellprozess, einschließlich der Entwicklung von Knochen und Knorpel. Chondrogenese umfasst wie Angiogenese den kontrollierten Wiedereintritt ruhender Zellen in die Wachstumsphase des Zellzyklus. Der Wachstumsphasenübergang ist mit veränderten Zelladhäsionseigenschaften, veränderten Mustern von Zellmigration und vorübergehend erhöhter Zellvermehrung verbunden. Chondrogenese umfasst die anfängliche Entwicklung chondrogener Fähigkeit (d. h. des protodifferenzierten Stadiums) durch primitive undifferenzierte Mesenchymzellen. Dieses Stadium umfasst die Produktion Chondrozyten-spezifischer Marker ohne die Fähigkeit, eine typische Knorpel-ECM zu bilden. Anschließend entwickeln die Zellen die Fähigkeit, eine Knorpel-spezifische ECM zu produzieren, wenn sie sich zu Chondrozyten entwickeln. Langille, Microscop. Res. & Tech. 28, 455–469 (1994). Chondrozyten-Migration, -Adhäsion und -Vermehrung tragen zur Entwicklung des knöchernen und knorpeligen Skeletts bei. Die abnormale Elaboration der programmierten Entwicklung von Zellen, die am Prozess der Chondrogenese teilnehmen, resultiert in Skelettdefekten, die Probleme aufwirft, die von kosmetischen Belangen bis zu lebensbedrohenden Störungen reichen.
Wie die Angiogenese und Chondrogenese ist die Onkogenese durch Veränderungen der Zelladhäsion, -migration und -vermehrung charakterisiert. Metastasierende Krebszellen zeigen veränderte Adhäsions- und Migrationseigenschaften. Die Etablierung von Tumormassen erfordert eine erhöhte Zellvermehrung und die Elaboration der Zelleigenschaften, die für Angiogenese während der Neovaskularisierung von Tumoren charakteristisch ist.
Die abnormale Progression von Angiogenese oder Chondrogenese sowie die bloße Progression der Onkogenese beeinträchtigt die Lebensqualität für befallene Individuen wesentlich und erhöht die Kosten der modernen medizinischen Versorgung. Die diesen komplexen biologischen Prozessen gemeinsamen Eigenschaften, die veränderte Zelladhäsion, -migration und -vermehrung umfassen, legen nahe, dass Mittel, die zur Beeinflussung aller drei dieser Zellaktivitäten fähig sind, zum Screenen und Modulieren der oben genannten komplexen biologischen Prozesse wirksam sein sollten. Obgleich die Wissenschaft von Mitteln Kenntnis hat, die die einzelnen Zellaktivitäten beeinflussen, z. B. Integrine und Selectine (Zelladhäsion), Chemokine (Zellmigration) und eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen (Zellvermehrung), ist bis vor kurzem kein Mittel identifiziert worden, das einen Einfluss auf alle drei Zellaktivitäten im Menschen ausübt.
Maus-Cyr61 (CYstein-Reiches Protein) ist ein Protein, das in aktiv wachsenden und sich teilenden Zellen exprimiert wird, das möglicherweise alle diese drei Zellaktivitäten beeinflusst. RNase-Schutz-Analysen haben gezeigt, dass das für Maus-Cyr61 kodierende Gen, Maus-cyr61, im sich entwickelnden Mausembryo transkribiert wird. O'Brian et al., Cell Growth & Diff. 3, 645–654 (1992). In-situ-Hybridisierungsanalyse zeigte, dass die Expression von cyr61 während der Maus-Embryogenese eng mit der Differenzierung von aus Ektoderm und Mesoderm hergeleiteten Mesenchymzellen in Chondrozyten korreliert. Zusätzlich wird cyr61 in den Gefäßwänden des sich entwickelnden Kreislaufsystems exprimiert. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass Maus-cyr61 während der Zellvermehrung und -differenzierung exprimiert wird, die Charakteristika der Expression von Genen sind, die an den Regulationskaskaden beteiligt sind, die den Zellwachstumszyklus kontrollieren.
Die weitere Charakterisierung des Cyr61-Polypeptids ist durch das Unvermögen behindert worden, brauchbare Mengen des Proteins zu reinigen. Bemühungen, Cyr61 in größeren Mengen durch Überexpression aus entweder eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen zu reinigen, gelingen typischerweise nicht. Yang, University of Illinois at Chicago, Dissertation (1993). Ein mit dem Versuch, brauchbare Mengen von Cyr61 zu erhalten, verbundenes Problem ist die Reduktion der Säugetierwachstumsraten, die durch die Überexpression von Cyr61 induziert wird. Ein weiteres Problem bei der Cyr61-Reinigung ist, dass sich das Cystein-reiche Polypeptid, wenn es unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken in Bakterienzellen exprimiert wird, häufig in unlöslichen Proteinmassen findet. Trotzdem ist Cyr61 als ein Polypeptid von 349 Aminosäuren charakterisiert worden, das 39 Cysteinreste, eine hydrophobe mutmaßliche N-terminale Signalsequenz und potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen (Asn₂₈ und Asn₂₃₅) enthält. US-Patent Nr. 5.408.040 bei Spalte 3, Zeilen 41–54, Grotendorst et al., hierin durch Verweis aufgenommen (das „040"-Patent).
In jüngster Zeit sind mit Cyr61 verwandte Proteine charakterisiert worden. Beispielsweise ist ein Humanprotein, Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF), identifiziert worden. (Siehe 040-Patent). CTGF wird in aktiv wachsenden Zellen, wie z. B. Fibroblasten und Endothelzellen, exprimiert (040-Patent, in Spalte 5, Zeilen 62–64), ein Expressionsmuster, das von Cyr61 geteilt wird. Bezüglich der Funktion ist CTGF als Proteinwachstumsfaktor beschrieben worden, da seine Mitogenität zu seiner primären biologischen Aktivität erklärt worden ist (040-Patent, Spalte 2, Zeilen 25–27 und 53–55). Zusätzlich zeigt CTGF angeblich chemotaktische Aktivität. 040-Patent, Spalte 2, Zeilen 56–59. Bezüglich ihrer Struktur sind die für CTGF kodierende Polynucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von CTGF publiziert worden. 040-Patent, Seq.-ID Nr. 7 bzw. Seq.-ID Nr. 8.
Ein weiteres, scheinbar verwandtes Protein ist das Mausprotein Fisp12 (Flbroblasten-Sekretiertes Protein). Fisp12 ist einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen worden, was eine an Cystein reiche Primärstruktur offenbarte. Ryseck et al., Cell Growth & Diff. 2, 225–233 (1991), die hierin durch Verweis aufgenommen ist. Das Protein besitzt auch eine hydrophobe N-terminale Sequenz, die eine für sekretierte Proteine charakteristische Signalsequenz andeutet.
Sequenzanalysen, die Cyr61, Fisp12, CTGF und andere Proteine umfassen, haben zur Identifizierung einer Familie Cystein-reicher sekretierter Proteine beigetragen. Elemente der Familie weisen ähnliche Primärstrukturen auf, die von Genen kodiert werden, die ähnliche Sequenzen aufweisen. Jedes der Proteine in dieser aufkommenden Familie ist weiters durch die Gegenwart einer hydrophoben N-terminalen Signalsequenz und 38 Cysteinresten in den sekretierten Formen des Proteins gekenn zeichnet. Elemente der Familie, die bis dato identifiziert sind, umfassen die oben genannten Cyr61 (Human und Maus), Fisp12 (Maus) und CTGF (das Human-Ortholog von Fisp12) sowie CEF10 (Huhn) und Nov (vogelartig).
Eine von mehreren Anwendungen für ein gereinigtes Protein, das zur Beeinflussung der Zelladhäsions-, -migrations- und -vermehrungseigenschaften fähig ist, umfasst die Entwicklung stabiler, hämatopoetischer Langzeit-ex-vivo-Stammzellkulturen. Hoch dosierter Chemotherapie unterzogene Patienten weisen unterdrückte Hämatopoese auf; die Expansion von Stammzellen, ihre Reifung zu verschiedenen hämatopoetischen Linien und Mobilisierung reifer Zellen in den Blutkreislauf dauern für gewöhnlich viele Wochen, bis sie abgeschlossen sind. Für solche Patienten und andere, die eine hämatopoetische Zelltransplantation benötigen, ist die Einführung autologer Stammzellen, die manipuliert und in Kultur vermehrt worden sind, in Patienten vorteilhaft. Solche hämatopoetische Stammzellen (HSC) exprimieren das CD34-Stammzellenantigen, exprimieren jedoch nicht Linienbindungsantigene („lineage commitment antigens"). Diese Zellen können letztlich zu allen Blutzelllinien führen (z. B. Erythrozyten, Lymphozyten und Myelozyten).
Hämatopoetische Vorläufer-Zellen, die Langzeitkulturen initiieren und aufrechterhalten können (d. h. Langzeitkultur-System-initiierende Zellen oder LTC-IC), stellen eine primitive Population von Stammzellen dar. Die Häufigkeit von LTC-IC ist mit nur 1–2 je 10⁴ Zellen im normalen Human-Knochenmark und nur ungefähr 1 je 50–100 Zellen in einer hochgereinigten CD34⁺-Subpopulation geschätzt worden. Folglich wäre es zweckdienlich, über Verfahren und Systeme für Langzeitzellkultur zu verfügen, die primitive, pluripotente Human-HSC aufrechterhalten und vermehren, um sie für die Neupopulation des hämatopoetischen Systems in vivo zu verwenden.
Zellkulturmodelle der Hämatopoese haben eine Vielzahl von Zytokinen offenbart, die eine Rolle im Hämatopoese-Prozess zu spielen scheinen, einschließlich zahlreicher koloniestimulierender Faktoren, Interleukinen, Stammzellenfaktor und des c-kit-Li ganden. In Ex-vivo-Kulturen begünstigen verschiedene Kombinationen dieser Zytokine jedoch die Vermehrung verschiedener Gruppen festgelegter Vorläufer. Beispielsweise verstärkte ein Faktor im Nabelschnurblutplasma die Vermehrung der Vorläufer der Granulozyten-Erythrozyten-Makrophagen-Megakaryozyten-Kolonie-bildenden Einheit (CFU-GEMM), jedoch begünstigte die Vermehrung in diesen Kulturen die reiferen Untergruppen von Zellen. Daher ist es schwierig gewesen, ein Kultursystem zu etablieren, das die In-vivo-Hämatopoese nachahmt.
Ein HSC-Kultursystem sollte eine große Anzahl von multi- oder pluripotenten Stammzellen aufrechterhalten und vermehren, die sowohl zur Langzeit-Neupopulation als auch zur letztlichen Linien-Bindung unter geeigneter Induktion fähig sind. In den meisten Ex-vivo-Kultursystemen sinkt jedoch der Anteil der aus LTC-IC bestehenden Zellpopulation mit fortdauernder Kultivierung stetig ab und fällt nach mehreren Wochen häufig auf 20% ihres Anfangswerts ab, so wie die Kultur von reiferen Untergruppen hämatopoetischer Vorläufer-Zellen besiedelt wird, die nicht mehr pluripotent sind. Darüber hinaus kann die von einzelnen LTC-IC gezeigte Vermehrungsfähigkeit stark variieren. Folglich besteht auf dem Gebiet der Erfindung ein Bedarf an HSC-Kultursystemen, die biologische Mittel umfassen, die das pluripotente Potenzial von Zellen, wie z. B. LTC-IC-Zellen, aufrechterhalten oder fördern. Zusätzlich zu einer Rolle bei der Entwicklung von Ex-vivo-HSC-Kulturen sind biologische Mittel, die die Zelladhäsion, -migration und -vermehrung beeinflussen, in einer Reihe von anderen Zusammenhängen zweckdienlich.
Proteine, die die Aktivität von Mitogenen potenzieren, jedoch selbst keine mitogene Aktivität aufweisen, können wichtige Rollen als Signalmoleküle in solchen Prozessen wie der Hämatopoese spielen. Außerdem könnten diese Signalproteine auch als Sonden bei der Suche nach weiteren Mitogenen dienen, von denen viele nicht identifiziert oder charakterisiert worden sind. Von mehreren biologischen Faktoren ist gezeigt worden, dass sie die mitogene Aktivität anderer Faktoren potenzieren, ohne selbst mitogen zu sein. Manche dieser Potenziatoren sind mit der Zelloberfläche und/oder der extrazellulären Matrix assoziiert. In dieser Gruppe umfasst sind ein sekretiertes basisches Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindendes Protein (bFGF-bindendes Protein), das Basalmembran-Protein Perlecan und das Human-Immundefizienz-Virus-1-TAT-Protein, wobei jedes Protein fähig ist, die bFGF-induzierte Zellvermehrung und Angiogenese zu fördern. Ebenfalls in dieser Gruppe von Mitogen-Potenziatoren umfasst sind Thrombospondin, das zur Aktivierung einer latenten Form des Transformierenden Wachstumsfaktors β fähig ist, und ein nicht identifizierter sekretierter Wachstums-potenzierender Faktor aus vaskulären Glattmuskelzellen (Nakano et al., J. Biol. Chem. 270, 5702–5705 (1995)), wobei der letztere Faktor für die effiziente Aktivierung der Epidermal-Wachstumsfaktor- oder Thrombin-induzierten DNA-Synthese erforderlich ist. Weiters ist der B-Zellen-stimulierende Faktor-1/Interleukin-4, ein T-Zellen-Produkt mit keiner nachweisbaren mitogenen Aktivität, fähig, 1) die Vermehrungsreaktion von Granulozyten-Makrophagen-Vorläufern auf Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor zu verstärken, 2) die Vermehrungsreaktion von Erythrozyten-Vorläufern auf Erythropoietin zu verstärken und 3) gemeinsam mit Erythropoietin die Koloniebildung durch multipotente Vorläuferzellen zu induzieren. Gleichermaßen verstärkte Interleukin-7 die Stammzellenfaktor-induzierte Koloniebildung durch primitive Maus-Knochenmark-Vorläufer, obgleich Interleukin-7 selbst keine proliferative Wirkung aufwies. Außerdem hat sich gezeigt, dass Lymphozyten-Wachstumsverstärkungs-Faktor (LGEF) die Mitogen-stimulierte Vermehrung von Human-Peripherblut-Lymphozyten (PBL) oder gereinigten T-Zellen auf dosisabhängige Weise verstärkte. LGEF alleine stimulierte die PBL- oder T-Zellen-Vermehrung nicht.
Daher besteht weiterhin ein Bedarf an biologischen Mitteln, die fähig sind, einen aufeinander abgestimmten Einfluss auf eine oder mehrere der spezifizierten Funktionen auszuüben, die gemeinsam solche komplexen biologischen Prozesse wie Angiogenese, Chondrogenese und Onkogenese kennzeichnen. Außerdem besteht auf dem Gebiet der Erfindung ein Bedarf an Mitteln, die zur Reproduktion dieser In-vivo-Prozesse in einer Ex-vivo-Umgebung beitragen, z. B. die Entwicklung von HSC-Kulturen.
Weiters besteht weiterhin ein Bedarf an Werkzeugen zur Suche nach den verbleibenden biologischen Komponenten dieser komplexen Prozesse, z. B. an Mitogen-Sonden, deren Fehlen Bemühungen behindert, solche Prozesse vorteilhaft zu modulieren und damit zu kontrollieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ECM- (extrazelluläre Matrix-) Signalmolekül-verwandte Materialien und Verfahren bereit. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die für ECM-Signalmoleküle und Fragmente, Analoga und Derivate davon kodieren, ECM-Signalmolekül-verwandte Polypeptide und Fragmente, Analoga und Fragmente davon, Verfahren zur Produktion von ECM-Signalmolekülen und Verfahren zur Verwendung von ECM-Signalmolekülen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wie beansprucht, ist unter „ECM-Signalmolekül" hierin Cyr61-Polypeptid zu verstehen.
Einer der Aspekte der vorliegenden Erfindung betrifft ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid, das ein ECM-Signalmolekül umfasst. Die Polypeptide gemäß der Erfindung behalten zumindest eine biologische Aktivität eines ECM-Signalmoleküls bei, wie z. B. die Fähigkeit, Zelladhäsion, Zellmigration oder Zellvermehrung zu stimulieren; die Fähigkeit, Angiogenese, Chondrogenese oder Onkogenese zu modulieren; Immunogenität oder die Fähigkeit, eine Immunantwort hervorzurufen; und die Fähigkeit, an Polypeptide zu binden, die spezifische Bindungsstellen für ECM-Signalmoleküle aufweisen, einschließlich Antikörpern und Integrinen. Die Polypeptide können native oder rekombinante Moleküle sein. Weiters umfasst die Erfindung Volllängen-ECM-Signalmoleküle und Fragmente davon. Außerdem können die Polypeptide der Erfindung underivatisiert oder in Übereinstimmung mit einem nativen oder nicht-nativen Derivatisierungsmuster derivatisiert sein. Die Erfindung erstreckt sich weiters auf Polypeptide, die eine native oder natürlich auftretende Aminosäuresequenz aufweisen, und auf Varianten (d. h. Polypeptide, die unterschiedliche Aminosäuresequen zen aufweisen), Analoga (d. h. Polypeptide, die eine Nicht-Standard-Aminosäure oder eine andere strukturelle Abweichung vom herkömmlichen Satz von Aminosäuren aufweisen) und Homologe (d. h. Polypeptide, die einen evolutionären Vorläufer mit einem anderen Polypeptid gemeinsam haben) davon. Polypeptide, die kovalent an andere Verbindungen, wie z. B. Polyethylenglykol oder andere Proteine oder Peptide, d. h. Fusionsproteine, gebunden sind, sind in der Erfindung ebenfalls vorgesehen.
Über ECM-Signalmoleküle hinaus umfasst die Erfindung Polypeptide, die spezifisch an ECM-Signalmoleküle der Erfindung binden, wie z. B. die oben erwähnten Antikörperprodukte. Eine breite Vielfalt von Antikörperprodukten liegt im Schutzumfang der Erfindung, einschließlich polyklonaler und monoklonaler Antikörper, Antikörperfragmenten, chimären Antikörpern, CDR-gepfropften Antikörpern, „humanisierten" Antikörpern und anderen Antikörperformen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Andere Moleküle, wie z. B. Peptide, Kohlenhydrate oder Lipide, die so konstruiert sind, dass sie an eine aktive Stelle des ECM-Moleküls binden und dadurch ihre Aktivitäten hemmen, sind in der Erfindung ebenfalls vorgesehen. Jedoch liegen Verbindungen, wie z. B. Peptide, die die Aktivitäten des ECM-Moleküls verstärken oder potenzieren, ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung. Die Erfindung erstreckt sich weiters auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine biologisch aktive Menge eines Polypeptids und einen) pharmazeutisch annehmbares/n Adjuvans, Verdünner oder Träger gemäß der Erfindung umfasst. Eine „biologisch wirksame Menge" des Biomaterials ist eine Menge, die ausreicht, um eine nachweisbare Reaktion in der biologischen Probe zu bewirken, wenn sie mit einer Kontrolle verglichen wird, der das Biomaterial fehlt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein gereinigtes und isoliertes Polynucleotid, das eine Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Ein Polynucleotid gemäß der Erfindung kann DNA oder RNA sein, einzel- oder doppelsträngig, und kann von einer nativen Quelle gereinigt und isoliert werden oder kann unter An wendung synthetischer oder rekombinanter Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, produziert werden. Die Erfindung erstreckt sich ferner auf Polynucleotide, die für Fragmente, Analoga (d. h. Polynucleotide, die ein Nicht-Standard-Nucleotid aufweisen), Homologe (d. h. Polynucleotide, die einen gemeinsamen evolutionären Vorläufer mit einem anderen Polynucleotid haben), Varianten (d. h. Polynucleotide, die sich in ihrer Nucleotidsequenz unterscheiden) und Derivate (d. h. Polynucleotide, die sich auf eine strukturelle Weise unterscheiden, die nicht die primäre Nucleotidsequenz umfasst) von ECM-Molekülen kodieren. Vektoren, die ein Polynucleotid gemäß der Erfindung umfassen, sind ebenfalls vorgesehen. Außerdem umfasst die Erfindung Wirtszellen, die mit einem Polynucleotid oder Vektor der Erfindung transformiert oder transfiziert sind.
Andere Aspekte der Erfindung betreffen Verfahren zum Herstellen oder Verwenden der Polypeptide und/oder Polynucleotide der Erfindung. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der Erfindung umfasst das Exprimieren eines Polynucleotids, das für ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, in einer geeigneten Wirtszelle und das Reinigen des Polypeptids. Andere Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids der Erfindung verwenden Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. die Isolierung und Reinigung nativer Polypeptide oder die Verwendung synthetischer Techniken zur Polypeptidproduktion. Im Speziellen umfasst ein Verfahren der Reinigung von Human-Cyr61 die Schritte des Identifizierens einer Quelle, die Human-Cyr61 enthält, das Aussetzen der Quelle gegenüber einem Human-Cyr61-spezifischen Biomolekül, das Cyr61 bindet, wie z. B. Anti-Human-Cyr61-Antikörper, und das Eluieren des Human-Cyr61 vom Antikörper oder anderen Biomolekül, wodurch das Human-Cyr61 gereinigt wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Screenen auf einen Modulator der Angiogenese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren einer ersten biologischen Probe, die fähig ist, Angiogenese zu untergehen, mit einer biologisch wirksamen (d. h. angiogenisch wirksamen) Menge eines ECM- Signalmolekül-verwandten Biomaterials und einem mutmaßlichen Modulator (Inhibitor oder Potenziator); (b) davon getrenntes Kontaktieren einer zweiten biologischen Probe mit einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (c) Messen des Ausmaßes an Angiogenese, die aus Schritt (a) und aus Schritt (b) resultiert; und (d) Vergleichen der in Schritt (c) gemessenen Ausmaße an Angiogenese, wodurch ein Modulator der Angiogenese aufgrund seiner Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Angiogenese im Vergleich zum Kontrollschritt (b) zu ändern. Der Modulator kann entweder ein Potenziator oder Inhibitor der Angiogenese sein, und das ECM-Signalmolekül-verwandte Biomaterial umfasst Cyr61 und Fragmente, Varianten, Homologe, Analoga, Derivate und Antikörper davon.
Die Erfindung erstreckt sich weiters auf ein Verfahren des Screenings auf einen Modulator der Angiogenese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen eines ersten Implantats, das Cyr61 umfasst, und eines zweiten Implantats, das Cyr61 und einen mutmaßlichen Modulator der Cyr61-Angiogenese umfasst; (b) Implantieren des ersten Implantats in eine erste Hornhaut eines Testtiers und des zweiten Implantats in eine zweite Hornhaut des Testtiers; (c) Messen der Entwicklung von Blutgefäßen in der ersten und zweiten Hornhaut; und (d) Vergleichen der Ausmaße der in Schritt (c) gemessenen Blutgefäßentwicklung, wodurch ein Modulator der Angiogenese aufgrund seiner Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Blutgefäßentwicklung in der ersten Hornhaut im Vergleich zur Blutgefäßentwicklung in der zweiten Hornhaut zu ändern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Verfahren zum Screenen auf einen Modulator der Chondrogenese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren einer ersten biologischen Probe, die fähig ist, Chondrogense zu erfahren, mit einer biologisch wirksamen (d. h. chondrogenisch wirksamen) Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials und einem mutmaßlichen Modulator; (b) davon getrenntes Kontaktieren einer zweiten biologischen Probe, die fähig ist, Chondrogenese zu erfahren, mit einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (c) Messen des aus Schritt (a) und aus Schritt (b) resultierenden Ausmaßes an Chondrogenese; und (d) Vergleichen der in Schritt (c) gemessenen Ausmaße an Chondrogenese, wodurch ein Modulator der Chondrogenese durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Chondrogenese im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (b) zu ändern. Der Modulator kann entweder ein Promotor oder Inhibitor der Chondrogenese sein; die ECM-Signalmoleküle umfassen jene, die oben definiert sind, und Verbindungen, wie z. B. Mannose-6-phosphat, Heparin und Tenascin.
Die Erfindung betrifft ferner ein In-vitro-Verfahren zum Screenen auf einen Modulator der Onkogenese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Induzieren eines ersten Tumors und eines zweiten Tumors; (b) Verabreichen einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials und eines mutmaßlichen Modulators an den ersten Tumor; (c) davon getrenntes Verabreichen einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials an den zweiten Tumor, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (d) Messen des aus Schritt (b) und aus Schritt (c) resultierenden Ausmaßes an Onkogenese; und (e) Vergleich der in Schritt (d) gemessenen Ausmaße an Onkogenese, wodurch ein Modulator der Onkogenese durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Onkogenese im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (c) zu ändern. Modulatoren der Onkogenese, die in der Erfindung vorgesehen sind, umfassen Inhibitoren der Onkogenese. Tumoren können durch eine Vielzahl von Techniken induziert werden, einschließlich der Verabreichung von Chemikalien, z. B. Karzinogenen, und der Implantation von Krebszellen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Erfindung ermöglicht ferner die Behandlung eines massiven Tumors, die den Schritt der Zufuhr einer therapeutisch wirksamen Menge eines Cyr61-Inhibitors an ein Individuum umfasst, wodurch die Neovaskularisierung des Tumors gehemmt wird. Inhibitoren umfassen, sich jedoch nicht eingeschränkt auf, Inhibitorpeptide, wie z. B. Peptide, die ein „RGD"-Motiv aufweisen, und Zytotoxine, die frei oder an Moleküle, wie z. B. Cyr61, gebunden sein können.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren des Screenings auf einen Modulator der Zelladhäsion, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen einer Oberfläche, die mit Zellhaftung kompatibel ist; (b) davon getrenntes Aufbringen erster und zweiter biologischer Proben, die fähig sind, Zelladhäsion auf der Oberfläche zu erfahren; (c) Kontaktieren einer ersten biologischen Probe mit einem mutmaßlichen Modulator und einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, das aus der aus einem Human-Cyr61, einem Human-Cyr61-Fragment, einem Human-Cyr61-Analogon und einem Human-Cyr61-Derivat bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (d) davon getrenntes Kontaktieren einer zweiten biologischen Probe mit einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, das aus der aus einem Human-Cyr61, einem Human-Cyr61-Fragment, einem Human-Cyr61-Analogon und einem Human-Cyr61-Derivat bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (e) Messen des aus Schritt (c) und aus Schritt (d) resultierenden Ausmaßes an Zelladhäsion; und (f) Vergleichen der in Schritt (e) gemessenen Ausmaße an Zelladhäsion, wodurch ein Modulator der Zelladhäsion aufgrund seiner Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Zelladhäsion im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (d) zu ändern.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren des Screenings auf einen Modulator der Zellmigration, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausbilden einer Gelmatrix, die Cyr61 und einen mutmaßlichen Modulator der Zellmigration umfasst; (b) Herstellen einer Kontroll-Gelmatrix, die Cyr61 umfasst; (c) Säen von Endothelzellen, die fähig sind, Zellmigration zu erfahren, auf die Gelmatrix von Schritt (a) und auf die Kontroll-Gelmatrix von Schritt (b); (d) Inkubieren der Endothelzellen; (e) Messen der Ausmaße an Zellmigration durch Untersuchen des Inneren der Gelmatrix und der Kontroll-Gelmatrix auf Zellen; (f) Vergleichen der in Schritt (e) gemessenen Ausmaße an Zellmigration, wodurch ein Modulator der Zellmigration durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Zellmigration in der Gelmatrix im Vergleich zum Ausmaß an Zellmigration in der Kontroll-Gelmatrix zu ändern. Die Endothelzellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Humanzellen, z. B. Human-Mikrogefäß-Endothelzellen. Die Matrix kann aus gelierenden Materialien, wie z. B. Matrigel, Collagen oder Fibrin oder Kombinationen davon, ausgebildet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein In-vitro-Verfahren des Screenings auf Zellmigration, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausbilden eines ersten gelatinierten Filters und eines zweiten gelatinierten Filters, wobei jedes Filter zwei Seiten aufweist; (b) Kontaktieren einer ersten Seite jedes Filters mit Endothelzellen, wodurch die Zellen an jedes der Filter anhaften; (c) Aufbringen eines ECM-Signalmoleküls und eines mutmaßlichen Modulators der Zellmigration auf eine zweite Seite des ersten gelatinierten Filters und eines ECM-Signalmoleküls auf eine zweite Seite des zweiten gelatinierten Filters; (d) Inkubieren jedes Filters; (e) Detektieren von Zellen auf der zweiten Seite jedes Filters; und (f) Vergleichen der Anwesenheit von Zellen auf der zweiten Seite des ersten gelatinierten Filters mit der Anwesenheit von Zellen auf der zweiten Seite des zweiten gelatinierten Filters, wodurch ein Modulator der Zellmigration durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß der am ersten gelatinierten Filter gemessenen Zellmigration im Vergleich zum Ausmaß der am zweiten gelatinierten Filter gemessenen Zellmigration zu verändern. Die Endothelzellen sind oben definiert. Die ECM-Signalmoleküle erstrecken sich auf Human-Cyr61, und jedes der Filter kann in ein Gerät, wie z. B. in eine Boyden-Kammer, einschließlich modifizierter Boyden-Kammern, gegeben werden.
Die Erfindung umfasst ferner ein In-vivo-Verfahren des Screenings auf einen Modulator der Zellmigration, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Entfernen eines ersten zentralen Teils eines ersten biokompatiblen Schwamms und eines zweites zentralen Teils eines zweiten biokompatiblen Schwamms; (b) Aufbringen eines ECM-Signalmoleküls und eines mutmaßlichen Modulators auf den ersten zen tralen Teil und eines ECM-Signalmoleküls auf den zweiten zentralen Teil; (c) Wiedervereinigen des ersten zentralen Teils mit dem ersten biokompatiblen Schwamm und des zweiten zentralen Teils mit dem zweiten biokompatiblen Schwamm; (d) Anbringen eines ersten Filters an einer ersten Seite des ersten biokompatiblem Schwamms und eines zweiten Filters an eine zweite Seite des ersten biokompatiblen Schwamms; (e) Anbringen eines dritten Filters an eine erste Seite des zweiten biokompatiblen Schwamms und eines vierten Filters an einer zweiten Seite des zweiten biokompatiblen Schwamms; (f) Implantieren jedes der biokompatiblen Schwämme in ein Testtier, wobei jeder biokompatible Schwamm den zentralen Teil und die Filter umfasst; (e) Entfernen jedes Schwamms nach einem Inkubationszeitraum; (f) Messen der sich innerhalb jedes der biokompatiblen Schwämme gefundenen Zellen; und (g) Vergleichen der Anwesenheit von Zellen im ersten biokompatiblen Schwamm mit der Anwesenheit von Zellen im zweiten biokompatiblen Schwamm, wodurch ein Modulator der Zellmigration durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß der unter Verwendung des ersten biokompatiblen Schwamms gemessenen Zellmigration im Vergleich zu der unter Verwendung des zweiten biokompatiblen Schwamms gemessenen Zellmigration zu ändern. ECM-Signalmoleküle umfassen Moleküle einschließlich Human-Cyr61; das ECM-Signalmolekül kann auch mit Hydron assoziiert sein. Außerdem kann das In-vivo-Verfahren des Screenings auf einen Modulator der Zellmigration den Schritt des Verabreichens eines Radiomarkers an das Testtier und Detektieren des Radiomarkers in einem oder mehreren Schwämmen umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modulieren von Hämostase, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens eines ECM-Signalmoleküls in einem pharmazeutischannehmbaren Adjuvans, Verdünner oder Träger umfasst. Außerdem ermöglicht die Erfindung ein Verfahren des Induzierens von Wundheilung in einem Gewebe, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens eines verwundeten Gewebes mit einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmoleküls umfasst, wodurch die Wundheilung gefördert wird. Das ECM-Signalmolekül kann in Form eines ECM-Signalmolekül-Polypeptids oder einer ECM-Signalmolekül- Nucleinsäure, z. B. unter Anwendung einer Gentherapietechnik, bereitgestellt werden. Beispielsweise kann die Nucleinsäure eine operativ an das ECM-Signalmolekül gebundene Expressionskontrollsequenz umfassen, die dann in die Zellen eines verwundeten Gewebes eingeführt wird. Die Expression der kodierenden Sequenz wird z. B. durch Verwenden eines gewebespezifischen Promotors, wie z. B. des K14-Promotors, der in Hautgewebe funktionsfähig ist, kontrolliert, um die kontrollierte Induktion der Wundheilung zu bewirken. Die Nucleinsäure kann einen Vektor, wie z. B. ein Herpesvirus, ein Adenovirus, ein Adeno-assoziiertes Virus, ein Cytomegalovirus, ein Baculovirus, ein Retrovirus und ein Vacciniavirus umfassen. Geeignete verwundete Gewebe zur Behandlung mit diesem Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hautgewebe und Lungenepithel. Ein verwandtes Verfahren umfasst das Verabreichen einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmoleküls, z. B. Cyr61, an ein Tier, um die Organregeneration zu fördern. Das beeinträchtigte Organ kann das Ergebnis eines Traumas, z. B. eines chirurgischen Eingriffs, oder einer Krankheit sein. Ein weiteres Verfahren der Erfindung betrifft das Verbessern der Vaskularisierung von Transplantaten, z. B. Hauttransplantaten. Ein weiteres Verfahren der Erfindung betrifft einen Prozess zur Förderung von Knochenimplantation, einschließlich Knochentransplantaten. Das Verfahren zur Förderung der Knochenimplantation umfasst den Schritt des Kontaktierens eines Knochenimplantats oder einer Rezeptorstelle mit einer biologisch wirksamen (d. h. chondrogenisch wirksamen) Menge eines ECM-Signalmoleküls. Der Kontaktierungsschritt kann durch Aufbringen des ECM-Signalmoleküls auf einen biokompatiblen Verband, wie z. B. einer bioabbaubaren Gaze, und Kontaktieren des Verbands mit einem Knochenimplantat bewirkt werden, wodurch die Knochenimplantation gefördert wird. Die Knochenimplantate umfassen natürliche Knochen und Fragmente davon sowie leblose natürliche und synthetische Materialien, die biokompatibel sind, wie z. B. Prothesen. Zusätzlich zur direkten Aufbringung eines ECM-Signalmoleküls auf eine(n) Knochen, Prothese oder Rezeptorstelle sieht die Erfindung die Verwendung von Matrixmaterialien zur kontrollierten Freisetzung des ECM-Signalmoleküls zusätzlich zu solchen Materialien wie Gazen vor.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren des Screenings auf einen Modulator der Zellvermehrung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren einer ersten biologischen Probe, die fähig ist, Zellvermehrung zu erfahren, mit einem mutmaßlichen Modulator und einer biologisch wirksamen (d. h. mitogen wirksamen) Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, das aus der aus Human-Cyr61, einem Human-Cyr61-Fragment, einem Human-Cyr61-Analogon und einem Human-Cyr61-Derivat bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (b) davon getrenntes Kontaktieren einer zweiten biologischen Probe, die fähig ist, Zellvermehrung zu erfahren, mit einer biologisch wirksamen Menge eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, das aus der aus Human-Cyr61, einem Human-Cyr61-Fragment, einem Human-Cyr61-Analogon und einem Human-Cyr61-Derivat bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (c) Inkubieren der ersten und zweiten biologischen Proben; (d) Messen des aus Schritt (c) resultierenden Ausmaßes an Zellvermehrung; und (e) Vergleichen der Ausmaße der in Schritt (d) gemessenen Zellvermehrung, wodurch ein Modulator der Zellvermehrung durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Zelladhäsion im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (b) zu ändern.
Ebenfalls in der Erfindung umfasst ist ein Verfahren zum Vermehren einer Population undifferenzierter hämatopoetischer Stammzellen in Kultur, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Beziehen hämatopoetischer Stammzellen von einem Spender; und (b) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Nährbedingungen in Gegenwart einer biologisch wirksamen (d. h. hämatopoetisch wirksamen) Menge Cyr61.
Ein weiteres Verfahren der Erfindung ist ein Verfahren des Screenings auf ein Mitogen, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausplattieren von Zellen, die fähig sind, Zellvermehrung zu erfahren; (b) Kontaktieren eines ersten Teils der Zellen mit einer Lösung, die Cyr61 und ein mutmaßliches Mitogen umfasst; (c) Kontaktieren eines zweiten Teils der Zellen mit einer Lösung, die Cyr61 umfasst, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (c) Inkubieren der Zellen; (d) Detektieren des Wachstums des ersten Teils von Zellen und des zweiten Teils von Zellen; und (e) Vergleichen des Wachstums der ersten und zweiten Teile von Zellen, wodurch ein Mitogen durch seine Fähigkeit identifiziert wird, ein stärkeres Wachstum im ersten Teil von Zellen im Vergleich zum Wachstum des zweiten Teils von Zellen zu induzieren. Die Zellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Endothelzellen und Fibroblastenzellen. Weiters kann das Verfahren das Kontaktieren der Zellen mit einem Nucleinsäuremarker, z. B. [³H]-Thymidin, und Detektieren der Anwesenheit des Markers in den Zellen umfassen. Ein weiteres Verfahren betrifft das Verbessern von Gewebetransplantation, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Menge Cyr61, die für die Geschwindigkeit der Neovaskularisierung eines Transplantats wirksam ist, an ein Tier umfasst.
Zahlreiche weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden Abbildung und ausführlichen Beschreibung offensichtlich.
Kurzbeschreibung der Abbildung
1 stellt die vergleichenden Aminosäuresequenzen von Elementen der Cysteinreichen Proteinfamilie wachstumsregulierender Proteine dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Bei der Maus wurde gezeigt, dass das Cyr61-Protein die Zelladhäsion, -migration und -vermehrung beeinflusst. Das cyr61-Gen, das für Cyr61 kodiert, ist ein unmittelbar frühes Gen, das durch Serum-Wachstumsfaktoren in Maus-Fibroblasten transkriptionell aktiviert wird. Lau et al., EMBO J. 4, 3145–3151 (1985), hierin durch Verweis aufgenommen; Lau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1182–1186 (1987), hierin durch Verweis aufgenommen. Die für Maus-cyr61-cDNA kodierende Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt. (Die für Human-cyr61-cDNA kodierende Sequenz wird in Seq.-ID Nr. 3 bereitgestellt.) Die Aminosäuresequenz von Maus-Cyr61 ist in Seq.-ID Nr. 2 dargelegt. (Die Human-Cyr61-Aminosäuresequenz ist in Seq.-ID Nr. 4 dargestellt.) Cyr61 ist ein Polypeptid von 41 kDa Länge, das 39 Cysteinreste enthält, wobei ungefähr 10% der 379 Aminosäuren das unprozessierte Enzym ausmachen. Yang et al., Cell Growth & Diff. 2, 351–357 (1991), hierin durch Verweis aufgenommen. Untersuchungen haben offenbart, dass Maus-Cyr61 Heparin bindet und sekretiert wird. Yang et al. Im Einklang mit der beobachteten Sekretion von Cyr61 steht die Identifizierung einer N-terminalen Signalsequenz im naszierenden Cyr61, die von der Untersuchung der Maus-cyr61-cDNA-Sequenz abgeleitet wurde. Yang et al. Außerdem findet sich Cyr61 nicht im konditionierten Medium kultivierter, cyr61 exprimierender Zellen, findet sich jedoch mit der extrazellulären Matrix (ECM) und der Zelloberfläche assoziiert. Yang et al. Strukturell ähnliche, Cystein-reiche Säugetierproteine sind charakterisiert worden.
Fisp12, ein Cystein-reiches Maus-Protein, zeigt strukturelle Ähnlichkeit mit Cyr61. Die für Fisp12 kodierende cDNA-Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 5 dargelegt; die Aminosäuresequenz von Fisp12 ist in Seq.-ID Nr. 6 dargestellt. Maus-Fisp12 beeinflusst wie Cyr61 die Zelladhäsion, -vermehrung und -migration. Das Human-Ortholog von Fisp12 ist Bindegewebe-Wachstumsfaktor (CGTF), ein Protein mit ähnlicher Struktur und Funktion wie Cyr61. Fisp12 und CTGF sind jedoch von Cyr61 unterscheidbar. Beispielsweise findet sich ein höherer Anteil von sekretiertem Fisp12 im Kulturmedium als es für Cyr61 der Fall ist; ein entsprechend niedrigerer Anteil von Fisp12, als es für Cyr61 der Fall ist, ist im Bereich exprimierender Zellen (Zelloberfläche und nahe gelegene extrazelluläre Matrix) lokalisiert. Zusätzliche Ähnlichkeiten und Unterschiedlichkeiten unter den ECM-Signalmolekülen der Erfindung umfassenden Proteinen werden in den hierin unten stehenden Ausführungen offensichtlich.
Die vorliegende Erfindung weist vielfache Aspekte auf, die durch die folgenden Beispiele illustriert werden. Beispiel 1 beschreibt die Klonierung von Polynucleotiden, die für Elemente der Cystein-reichen Proteinfamilie von ECM-Signalmolekülen kodieren; Beispiel 2 beschreibt Sequenzanalysen; Beispiel 3 beschreibt RNA-Analysen; Beispiel 4 beschreibt die Produktion transgener Tiere; Beispiel 5 beschreibt die Expression von Cyr61-Polypeptiden; Beispiel 6 beschreibt die Expression von Fisp12-Polypeptiden; Beispiel 7 legt Verfahren der Polypeptidreinigung dar; Beispiel 8 stellt eine Charakterisierung der Polypeptide der Erfindung bereit; Beispiel 9 offenbart einen Heparin-Bindungstest für die Polypeptid-Elemente der Cystein-reichen Proteinfamilie; Beispiel 10 betrifft Rezeptoren für die Polypeptide; Beispiel 11 beschreibt Anti-ECM-Signalmolekül-Antikörper; Beispiel 12 betrifft inhibierende Peptide; Beispiel 13 beschreibt Zelladhäsion und auf Polypeptid basierende Verfahren zum Beeinflussen des Prozesses der Zelladhäsion; Beispiel 14 beschreibt Polypeptid-beeinflusste Migration von Fibroblasten; Beispiel 15 beschreibt die Migration von Endothelzellen und In-vitro-Tests für die Migration; Beispiel 16 beschreibt einen In-vitro-Test für Inhibitoren der Endothelzellen-Migration; Beispiel 17 beschreibt einen In-vivo-Test für Endothelzellen-Migration; Beispiel 18 beschreibt Mitogen-Potenzierung durch die Polypeptide der Erfindung; Beispiel 19 beschreibt einen In-vivo-Hornhaut-Test für angiogene Faktoren und Modulatoren; Beispiel 20 betrifft Verfahren zum Beeinflussen der Blutgerinnung unter Verwendung der Polypeptide der Erfindung; Beispiel 21 offenbart die Verwendung der Polypeptide für hämatopoetische Ex-vivo-Stammzellenkulturen; Beispiel 22 betrifft Organregeneration; Beispiel 23 beschreibt Chondrogenese und die Expression von extrazellulären Matrix-Signalmolekülen und Mesenchymzellen; Beispiel 24 beschreibt die Förderung von Zelladhäsion im Chondrogenese-Prozess unter Verwendung der Polypeptide der Erfindung; Beispiel 25 beschreibt Chondrogenese und den Einfluss der Polypeptide der Erfindung auf die Zellaggregation; Beispiel 26 beschreibt die Förderung der Zellvermehrung durch Polypeptide der Erfindung im Chondrogenese-Prozess; Beispiel 27 betrifft Verfahren zur Verwendung der Polypeptide der Erfindung, um Chondrogense zu beeinflussen; und Beispiel 28 stellt genetische Ansätze zur Verwendung der Polynucleotide der Erfindung bereit. Diese Beispiele sind zur Illustration der vorliegenden Erfindung be stimmt und sollten nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie den Schutzumfang der Erfindung einschränken.
Beispiel 1
Polynucleotid-Klonierung
Eine Human-cyr61-cDNA wurde aus einer Human-Plazenta-cDNA-Bibliothek durch Sondieren mit der Maus-cyr61-cDNA-Sequenz unter Anwendung von Techniken isoliert, die auf dem Gebiet der Erfindung standardmäßig eingesetzt werden. Siehe Sambrook et al., hierin durch Verweis aufgenommen. Die Isolierung der vollständigen Maus-cyr61-cDNA aus einer BALB/c-3T3- (ATCC CRL-1658) cDNA-Bibliothek ist beschrieben worden. O'Brien et al., Mol. Cell. Biol. 10, 3569–3577 (1990), hierin durch Verweis aufgenommen. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Maus-cyr61 sind von der GenBank-Datenbank unter der Zugangsnummer M32490 erhältlich. Die Nucleotidsequenz von Maus-cyr61 ist in Seq.-ID Nr. 1 dargestellt, die Maus-Cyr61-Aminosäuresequenz ist in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt.
Die Human-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von λgt11 (Promega Corp., Madison, WI) als Vektor konstruiert, der in E. coli transfiziert und auf LB-Agar ausplattiert wurde. Ein in pGEM-2 (O'Brian et al. (1990)) kloniertes Maus-cDNA-Expressionskonstrukt, das die gesamte für Maus-cyr61 kodierende Sequenz (Nucleotide 56–1560, unter Anwendung der Nummerierung von O'Brian et al. (1990); siehe Seq.-ID Nr. 1) enthielt, wurde als Sonde verwendet. Die Maus-cDNA-Sonde wurde durch Standardtechniken auf dem Gebiet der Erfindung radioaktiv markiert. Sambrook et al. Plaque-Screenings unter Verwendung der Maus-Sonde wurden mittels Standardtechniken durchgeführt. Sambrook et al.
Im Spezielleren wurden Agarplatten, die die oben beschriebene Human-cDNA enthielten, gegenüber Nitrozellulosefiltern (BA85, 82 mm, Schleicher & Schuell, Keene, NH) ausgesetzt und auf jede Platte gegeben. Nach Adsorption der Plaques (ungefähr 20 Minuten) wurden die Filter entfernt und ungefähr 30 Minuten lang luftgetrocknet. Anschließend wurde jedes Filter nacheinander für 30–60 Sekunden in 0,2 M NaOH, 1,5 M NaCl (100 ml); 2 × SSC, 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4 (100 ml); und 0,2 × SSC (100 ml) eingetaucht. Die Filter wurden dann bei Raumtemperatur ungefähr 1 Stunde lang getrocknet und bei 80°C unter Vakuum 2 Stunden lang behandelt. Die Filter wurden mit radiomarkierter Maus-cyr61-cDNA sondiert.
Alternativ dazu wurden Human-cyr61-cDNA-Klone mit Sonden identifiziert, die mittels RT-PCR erzeugt wurden. Im Speziellen war die Sonde für das Screening der Human-Plazenta-cDNA-Bibliothek ein mit degenerierten Primern mittels RT-PCR von Gesamt-RNA aus logarithmisch wachsenden WI38-Zellen erzeugtes PCR-Fragment. Die Primer wurden von denjenigen Sequenzen hergeleitet, die der am meisten konservierten Region des offenen Leserasters der Maus-cyr61-cDNA entsprechen. Einer der Primer, H61-5 [5'-GGGAATTCTG(TC)GG(GATC)TG(TC)TG(TC)AA(GA)GT(GC)TG-3'] genannt, enthält eine degenerierte Sequenz, die mit Ausnahme der „GGGAATTC"-Sequenz am 5'-Ende, die zur Einführung einer EcoRI-Stelle verwendet wurde, von den Nucleotiden 327–346 (Sinn-Strang) der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Maus-cyr61-Sequenz hergeleitet ist. Die Degenerierungen treten in Positionen auf, die der dritten Position der Codons in Seq.-ID Nr. 1 entsprechen. Der zweite für die PCR-Amplifizierung einer Human-cyr61-Sequenz verwendete Primer wurde H61-3 [5'-CCGGATCC(GA)CA(GA)TT(GA)TA(GA)TT(GA)CA-3'] genannt, der mit Ausnahme der 5'-Sequenz „CCGGATCC", die zur Einführung einer BamHI-Stelle verwendet wurde, dem Anti-Sense-Strang entspricht, der zu den Nucleotiden 1236–1250 der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Maus-cyr61-Sequenz komplementär ist. Die Degenerierungen treten in Positionen auf, die zu den dritten Positionen der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Codons in Maus-cyr61 komplementär sind. Die amplifizierte cyr61-cDNA wurde in pBlueScript-SK⁺-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert und mit einem Sequenaee-II-Set (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH) sequenziert.
Reihen-Screenings der Human-Plazenta-cDNA-Bibliothek führten zur Isolierung eines Klons, der eine Human-cyr61-cDNA enthielt. Die Human-cyr61-cDNA hat eine Länge von ungefähr 1.500 Basenpaaren. Die Human-cDNA ist auf einem in die EcoRI-Stelle in pGEM-2 klonierten EcoRI-Fragment enthalten. Wie in Seq.-ID Nr. 3 gezeigt, umfasst die Human-cDNA-Sequenz die gesamte kodierende Region für Human-Cyr61, gemeinsam mit 120 bp 5'-flankierender Sequenz und ungefähr 150 bp 3'-flankierender Sequenz.
Die Polynucleotide der Erfindung können völlig oder teilweise synthetisch, DNA oder RNA und einzel- oder doppelsträngig sein. Weil Polynucleotide der Erfindung für ECM-Signalmolekül-Polypeptide kodieren, die Fragmente eines ECM-Signalmolekül-Proteins sein können, können die Polynucleotide für eine Teilsequenz eines ECM-Signalmoleküls kodieren. Polynucleotidsequenzen der Erfindung sind für die Produktion von ECM-Signalmolekülen durch rekombinante Verfahren und als Hybridisierungssonden für Polynucleotide zweckdienlich, die für ECM-Signalmoleküle kodieren.
DNA-Polynucleotide gemäß der Erfindung umfassen genomische DNAs, cDNAs und Oligonucleotide, die eine kodierende Sequenz eines ECM-Signalmoleküls oder ein Fragment oder Analogon eines ECM-Signalmoleküls wie oben beschrieben umfassen, das zumindest eine der biologischen Aktivitäten eines ECM-Signalmoleküls beibehält, wie z. B. die Fähigkeit, Zelladhäsion, Zellmigration oder Zellvermehrung in solchen biologischen Prozessen wie Angiogenese, Chondrogenese und Onkogenese zu fördern, oder die Fähigkeit, einen ein ECM-Signalmolekül erkennenden Antikörper hervorzurufen.
Andere Polynucleotide gemäß der Erfindung unterscheiden sich in ihrer Sequenz von Sequenzen, die innerhalb nativer ECM-Signalmolekül-Polynucleotide enthalten sind (d. h. durch die Addition, Deletion, Insertion oder Substitution von Nucleotiden), unter der Voraussetzung, dass die Polynucleotide für ein Protein kodieren, das zu mindest eine der biologischen Aktivitäten eines ECM-Signalmoleküls beibehält. Eine Polynucleotidsequenz der Erfindung kann sich von der nativen ECM-Signalmolekül-Polynucleotidsequenz durch stille Mutationen unterscheiden, die die Sequenz der darin kodierten Aminosäuren nicht verändern. Außerdem können Polynucleotide der Erfindung ein ECM-Signalmolekül festlegen, das sich in der Aminosäuresequenz von nativen ECM-Signalmolekülsequenzen oder -untersequenzen wie oben beschrieben unterscheidet. Beispielsweise sind Polynucleotide, die für Polypeptide kodieren, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von nativen ECM-Signalmolekülen durch konservativen Ersatz eines oder mehrerer Aminosäurereste unterscheiden, in der Erfindung vorgesehen. Die Erfindung erstreckt sich auch auf Polynucleotide, die unter standardmäßigen stringenten Bedingungen an Polynucleotide hybridisieren, die für ein ECM-Signalmolekül der Erfindung kodieren, oder die hybridisieren würden, wenn es keine Degeneration des genetischen Codes gäbe. Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen umfassen die Hybridisierung bei 42°C in 50% Formamid, 5 × SSC, 20 mM Na·PO₄, pH 6,8 und Waschen in 0,2 × SSC bei 55°C. Dem Fachkundigen ist klar, dass die Variation dieser Bedingungen auf Basis der Länge und des GC-Nucleotidgehalts der zu hybridisierenden Sequenzen erfolgt. Formeln, die auf dem Gebiet der Erfindung standardmäßig verwendet werden, sind für die Ermittlung der exakten Hybridisierungsbedingungen geeignet. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, §§ 9.47–9.51 (1989).
ECM-Signalmolekül-Polynucleotide, die RNA umfassen, liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugtes RNA-Polynucleotid gemäß der Erfindung ist eine mRNA von Human-cyr61. Andere RNA-Polynucleotide der Erfindung umfassen RNAs, die sich von einer nativen ECM-Signalmolekül-mRNA durch die Insertion, Deletion, Addition oder Substitution von Nucleotiden (siehe oben) unterscheiden, unter der Voraussetzung, dass sie für ein Polypeptid kodieren, das eine mit einem ECM-Signalmolekül in Verbindung stehende biologische Aktivität beibe hält. Weitere RNAs der Erfindung umfassen Anti-Sense-RNAs (d. h. RNAs, die eine RNA-Sequenz umfassen, die zu einer ECM-Signalmolekül-mRNA komplementär ist).
Demgemäß wurde in einer weiteren Ausführungsform ein Satz von DNA-Fragmenten, die gemeinsam die Human-cyr61-cDNA umfassen, in pGEM-2 und M13-Derivaten unter Anwendung von Verfahren geklont, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind, um die Nucleotidsequenzanalysen zu erleichtern. Die pGEM-2-Klone stellten Substrate für die enzymatische Erzeugung von Reihen-Deletionen unter Anwendung von Techniken bereit, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Diese Sammlung von Klonen, die gemeinsam eine Reihe von DNA-Fragmenten enthielten, die verschiedene Abschnitte der für cyr61-cDNA kodierenden Region umfassten, sind in den Verfahren der Erfindung zweckdienlich. Die resultierenden Reihen von geschachtelten pGEM-2-Klonen stellten ihrerseits Substrate für Nucleotidsequenzanalysen unter Verwendung der enzymatischen Kettenterminationstechnik bereit. Die Fragmente sind auch als Nucleinsäuresonden und zur Herstellung von Cyr61-Deletions- oder Trunkations-Analoga zweckdienlich. Beispielsweise können die cyr61-cDNA-Klone verwendet werden, um cyr61-Klone aus Human-Gen-Bibliotheken, die im Handel erhältlich sind, zu isolieren. (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA.) Genomische Klone können ihrerseits verwendet werden, um den cyr61-Locus, einen Locus, der mit einem bekannten Krankheits-Locus assoziiert ist, im Human-Genom zu kartieren.
Andere Ausführungsformen umfassen die Polynucleotide der Erfindung, die in einer Vielzahl von Vektoren enthalten sind, einschließlich Plasmid-, Virus- (z. B. prokaryotischen und eukaryotischen Virusvektoren, die von Lambda-Phagen, Herpesviren, Adenovirus, Adeno-assoziierten Viren, Cytomegalovirus, Vacciniavirus, der M13-f1-fd-Familie von Viren, Retroviren, Baculovirus und anderen hergeleitet sind), Phagemid-, Cosmid- und YAC- (d. h. Yeast-Artificial-Chromosome) Vektoren.
Andere Ausführungsformen umfassen die Polynucleotide der Erfindung, die innerhalb von heterologen Polynucleotid-Umgebungen enthalten sind. Polynucleotide der Erfindung sind in heterologe Genome insertiert worden, wodurch Transgene und transgene Tiere gemäß der Erfindung erzeugt wurden. Im Speziellen sind zwei Arten von Genfusionen, die Maus-cyr612-Teilgensequenzen enthalten, verwendet worden, um transgene Mäuse zu erzeugen. (Siehe unten.) Eine Art von fusioniertem Gen rekombinierte die kodierende Sequenz von cyr61 mit einem von drei verschiedenen Promotoren: 1) dem Keratin-Promotor K14, 2) dem β-Actinpromotor oder 3) dem Phosphoglycerokinase-Promotor. Adra et al., Gene 60, 65–74 (1987). Diese Fusionskonstrukte wurden unter Anwendung von Standardtechniken, wie unten im Zusammenhang mit einer Phosphoglycerokinase-Promotor- (pgk-1-) cyr61-Fusion beschrieben wird, erzeugt. Ein genomisches XhoI-ScaI-DNA-Fragment, das die gesamte für cyr61 kodierende Region und alle Introns enthält, dem jedoch die Transkriptionsinitiationsstelle und das Polyadenylierungssignal fehlt, wurde in Plasmid pgk/β-gal kloniert, wobei die für lacZ kodierende Sequenz ersetzt wurde. Das resultierende Konstrukt stellte cyr61 unter die Kontrolle des starken pgk-1-Promotors, der in allen Zellen aktiv ist.
Die zweite Art der Genfusion rekombinierte die cyr61-Expressionskontrollsequenzen (d. h. Promotor) mit der für E.-coli-β-Galactosidase kodierenden Sequenz. Das cyr61-lacZ-Fusionsgen wurde unter Anwendung des folgenden Ansatzes konstruiert. Ein die Nucleotide –2065 bis +65 in Bezug auf das Transkriptionsinitiationsnucleotid umfassendes DNA-Fragment wurde verwendet, um den pgk-1-Promotor (Adra et al., Gene 60, 65–74 (1987)) im Plasmid pgk/β-gal durch stumpfendige Klonierung zu ersetzen. Zusätzlich wurde das Polyadenylierungssignal aus dem Rinder-Wachstumshormon-Gen in das das Fusionsgen enthaltende Plasmid kloniert. Das resultierende Konstrukt, Plasmid 2/lacZ, weist das E.-coli-lacZ-Gen unter transkriptioneller Kontrolle eines 2-kb-DNA-Fragments auf, das den cyr61-Promotor enthält. Das verwandte Plasmid 1.4/lacZ wurde von Plasmid 2lacZ durch Entfernen von ungefähr 600 bp cyr61-DNA, die sich stromauf einer AfIII-Stelle finden, hergeleitet. Auch ähnelt Plas mid 2M/lacZ dem Plasmid 2/lacZ mit der Ausnahme eines mittels PCR erzeugten C→T-Übergangs in der CArG-Box. Diese Konstrukte wurden aus den Vektoren durch NotI-Verdau herausgeschnitten, mittels GeneClean (Bio101 Inc., La Jolla, CA) gereinigt und dazu verwendet, um transgene Mäuse zu erzeugen (siehe unten).
Ein für Maus-fisp12 kodierendes cDNA-Fragment ist ebenfalls mittels Standardtechniken kloniert worden. Ryseck et al., Cell Growth & Diff. 2, 225–233 (1991), hierin durch Verweis aufgenommen. Die Klonierung wurde durch Ligieren eines die für fisp12-cDNA kodierende Region enthaltenden XhoI-Fragments in BamHI-gespaltetes pBlueScriptBacIII, einem Baculovirus-Expressionsvektor (Invitrogen Corp., San Diego, CA), erzielt. Rekombinante Baculovirus-Klone wurden wie in Summers et al., TX Ag. Exp. Sta., Bulletin 1555 (1987), beschrieben erhalten.
Das Human-Ortholog von fisp12, das für CTGF kodierende Gen, wurde durch Screenen einer Fusions-cDNA-Bibliothek mit Anti-Plättchen-hergeleiteten Wachstumsfaktor- (Anti-Platelet-Derived-Growth-Factor-, Anti-PDGF-) Antikörpern, wie in US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 12, Zeile 16, bis Spalte 13, Zeile 29, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben kloniert. Die Screening-Strategie nutzte die immunologische Kreuzreaktivität von CTGF und PDGF.
Die klonierten Kopien der cyr61-, fisp12- und ctgf-cDNAs stellen eine fertige Quelle für Polynucleotidsonden bereit, um die Isolierung genomischer kodierender Regionen sowie allelischer Varianten der genomischen DNAs oder cDNAs zu erleichtern. Außerdem können die existierenden cDNA-Klone oder Klone, die durch Sondieren wie oben beschrieben isoliert wurden, verwendet werden, um transgene Organismen zu erzeugen. Beispielsweise sind transgene Mäuse, die cyr61 beherbergen, unter Anwendung von Standardtechniken wie im nächsten Beispiel beschrieben erzeugt worden.
Ein Klon, hCyr61-cDNA, der die in Seq.-ID Nr. 3 dargelegte Human-cyr61-cDNA-Sequenz enthält, und ein mit diesem Klon transformierter Bakterienstamm, Escherichia coli DH5α (hCyr61cDNA), wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 USA, am 14. März 1997 hinterlegt.
Beispiel 2
Sequenzanalysen
Die Nucleotidsequenz von Maus-cyr61 ist beschrieben worden, O'Brian et al. (1990); Latinkic et al., Nucl. Acids Res. 19, 3261–3267 (1991), und ist hierin als Seq.-ID Nr. 1 dargelegt.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Maus-Cyr61 ist beschrieben worden, O'Brian et al. (1990), und ist in Seq.-ID Nr. 2 dargelegt.
Die Nucleotidsequenz der Human-cyr61-cDNA wurde unter Anwendung des Verfahrens von Sanger, wie in Sambrook et al. beschrieben, ermittelt. Es wurden Sequenzierungstemplate durch Konstruieren einer Reihe von verschachtelten Deletionen aus einem pGEM-2-Human-cyr61-cDNA-Klon wie oben in Beispiel 1 beschrieben erzeugt. Die Human-cyr61-cDNA-Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt. Die Aminosäuresequenz von Human-Cyr61 wurde von der Human-cyr61-cDNA-Sequenz abgeleitet und ist in Seq.-ID Nr. 4 dargelegt.
Ein Vergleich von Maus- und Human-Cyr61-Sequenzen, die in Seq.-ID Nr. 2 bzw. Seq.-ID Nr. 4 dargestellt sind, offenbart 91% Ähnlichkeit. Beide Sequenzen zeigen eine N-terminale Signalsequenz, die für ein prozessiertes und sekretiertes Protein kennzeichnend ist; beide Proteine enthalten ferner 38 Cysteinreste, die bei beiden Proteinen über das gesamte Protein verteilt sind, jedoch den zentralen Regionen von Maus- sowie Human-Cyr61 in besonderem Maße fehlen. Beachtenswerterweise ist diese zentrale, von Cysteinresten freie Region diejenige Region der höchsten Sequenzabweichung zwischen den für Maus- und Human-Cyr61 kodierenden Regionen. Jedoch sind die 5'-untranslatierten Regionen der Maus- und Human-cyr61-cDNAs sogar stärker voneinander abweichend (67% Ähnlichkeit). Im Gegensatz dazu sind die 3'-untranslatierten Regionen die ähnlichsten Regionen (91% Ähnlichkeit). Die Gesamtlänge des kodierten Maus-Cyr61 beträgt 379 Aminosäuren; die der Human-Cyr61 beträgt 381 Aminosäuren.
Eine fisp12-cDNA-Sequenz ist ebenfalls ermittelt worden und ist in Seq.-ID Nr. 5 dargelegt. Die Aminosäuresequenz von Fisp12 ist von der fisp12-cDNA-Sequenz abgeleitet worden und ist in Seq.-ID Nr. 6 dargelegt. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von Maus-Cyr61 und -Fisp12 offenbart, dass die beiden Proteine zu 65% identisch sind. Die Strukturähnlichkeit von Cyr61 und Fisp12 steht im Einklang mit ähnlichen Funktionseigenschaften der beiden Proteine, die unten beschrieben sind.
Eine cDNA-Teilsequenz von CTGF, die die gesamte für CTGF kodierende Region enthält, ist ebenfalls ermittelt worden. Die CTGF-cDNA-Sequenz wurde unter Verwendung von M13-Klonen als Template für die enzymatischen Sequenzierungsreaktionen wie beschrieben erhalten. 040-Patent, in Spalte 12, Zeile 68, bis Spalte 13, Zeile 14. Zusätzliche Klonierung, gekoppelt mit doppelsträngigen enzymatischen Sequenzierungsreaktionen, klärte die gesamte Sequenz der für CTGF kodierenden cDNA auf. US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 14, Zeile 44, bis Spalte 15, Zeile 8, hierin durch Verweis aufgenommen. Die Nucleotidsequenz der für CTGF kodierenden cDNA ist hierin in Seq.-ID Nr. 7 dargestellt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der für CTGF kodierenden cDNA ist in Seq.-ID Nr. 8 dargestellt.
Beispiel 3
RNA-Analysen
Polynucleotidsonden sind zweckdienliche diagnostische Werkzeuge für angiogene und andere mit Cyr61-Expression in Beziehung stehende Störungen, da geeignet konstruierte Sonden Ort und Ausmaß der cyr61-Genexpression auf transkriptioneller Ebene offenbaren kann. Die Expression von cyr61 zeigt ihrerseits an, ob Gene, die den Prozess der Angiogenese kontrollieren, in typischen oder erwarteten Ausmaßen exprimiert werden oder nicht.
Unter Verwendung dieser Werkzeuge wurde das Maus-cyr61-mRNA-Expressionsmuster unter Anwendung einer RNase-Schutztechnik ermittelt. O'Brian et al. (1992). Im Speziellen wurde eine Antisense-Ribosonde mit 289 Nucleotiden verwendet, die für gewöhnlich 246 Nucleotide der Maus-cyr61-mRNA schützt (Nucleotide 67 bis 313 unter Verwendung der Nummerierung von O'Brian et al.). Die Tests zeigten das Auftreten von cyr61-mRNA in PSA-1-Zellen (10 μg Gesamt-RNA) des undifferenzierten Stadiums oder der Stadien 1, 2 und 3 der Differenzierung (PSA-1-Zellen erfahren drei Stadien der Zelldifferenzierung, die Maus-Embryozellen der folgenden Trächtigkeitsalter in Tagen entsprechen: 4,5–6,5 (PSA-1-Stadium 1); 6,5–8,5 (PSA-1-Stadium 2); 8,5–10,5 (PSA-1-Stadium 3)). Ein Vergleich des Schutzes von Embryo- und Plazenta-Gesamt-RNAs (je 20 μg) zeigte, dass cyr61 in embryonalen Geweben zu Zeitpunkten exprimiert wird, die mit den Prozessen der Zelldifferenzierung und -vermehrung zusammenfallen.
Expressionscharakteristika von Human-cyr61 wurden durch Northern-Analyse unter Anwendung von Techniken ermittelt, die auf dem Gebiet der Erfindung standardmäßig eingesetzt werden. Sambrook et al. RNA wurde aus der diploiden Human-Fibroblasten-Zelllinie WI38 (ATCC CCL-75) isoliert. Außerdem wurde RNA aus Rattenzellen (REF52), Hamsterzellen (CHO) und Affenzellen (BSC40) isoliert. Jede dieser Zelllinien wurde in MEM-10 (Eagle's Minimal Essential Medium mit Earle's Salzen (Gibco-BRL Inc.), 2 mM Glutamin und 10% Fötalkälberserum (fcs)) zur Konfluenz gezüchtet und zwei Tage lang in MEM-0,5 (ein Medium mit 0,5% Serum) gehalten. Die Kulturen wurden dann mit 20% fcs in An- und Abwesenheit von Cycloheximid durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren stimuliert. Lau et al. (1985, 1987). Zehn-Mikrogramm-Aliquoten von aus diesen Zelllinien isolierter RNA wurden dann mittels Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, transferiert und an Nitrozellulosefiltern immobilisiert und gegenüber einer [³²P]-radiomarkierten Volllängen-Maus-cyr61-cDNA-Sonde unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz ausgesetzt. Die Human-cyr61-RNA-Expression war der Maus-cyr61-Expression ähnlich. Sowohl Maus- als auch Human-cyr61-Expression lieferten RNAs von ungefähr 2 Kilobasen. Sowohl die Maus- als auch die Human-Expression von Cyr61 wurden außerdem durch Serum stimuliert und waren gegen Cycloheximid resistent.
Die Verteilung von Human-cyr61-mRNA wurde ferner unter Verwendung mehrfacher Gewebe-Northern-Blots (Clontech) untersucht. Die Blots wurden in einer Express-Hyb-Lösung (Clontech) gemäß den Anleitungen des Herstellers hybridisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass cyr61-mRNA in menschlichem/r Herz, Lunge, Pankreas und Plazenta reichlich vorhanden ist; in niedrigen Mengen in Skelettmuskel, Niere und Hirn vorhanden ist; und in Leber nicht detektierbar ist. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Expression von cyr61 in Mausgeweben.
Außerdem wurde zelluläre Gesamt-RNA aus Human-Hautfibroblasten (HSFs) isoliert, die entweder ruhend, exponentiell wachsend, von Serum stimuliert oder gegenüber Cycloheximid ausgesetzt waren. HUVE-Zellen (ATCC CRL 1730) wurden in Ham's F12-Medium gehalten, das mit 10% fbs (Intergene), 100 μg/ml Heparin (Gibco BRL) und 30 μg/ml Endothelzellen-Wachstumsergänzung (Collaborative Biomedical Products) ergänzt war. Human-Hautfibroblasten (HSF, ATCC CRL-1475) und WI38-Fibroblasten (ATCC CCL-75) wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) gezüchtet, das mit 10% fbs ergänzt war. Ruhende HSFs wurden durch Züchten in mit 10% fbs ergänztem DMEM bis zur Konfluenz, gefolgt von Mediumswechsel gegen 0,1% fbs enthaltendes DMEM 2 Tage lang hergestellt. Serum-Stimulierung wurde durch Mediumswechsel auf 20% fbs 1 Stunde lang durchgeführt. Wo angezeigt, wurde Cycloheximid auf 10 μg/ml gleichzeitig mit Serum 3 Stunden lang zugesetzt.
RNAs aus den oben erwähnten Zellen wurden unter Anwendung einer Guanidinium-Isothiocyanat-Arbeitsvorschrift isoliert. Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 156–159 (1987). RNA-Proben wurden durch elektrophoretische Trennung in Formaldehyd-Agarose-Gelen analysiert, gefolgt vom Transfer auf Nylon-Filter. Die Blots wurden mit willkürlich geprimten Sonden hybridisiert, die unter Verwendung von entweder cyr61 oder GAPDH als Templat erzeugt wurden. Adams et al., Nature 355, 632–634 (1992). Die Ergebnisse zeigten an, dass Human-cyr61-mRNA in ruhenden Human-Hautfibroblasten nicht nachweisbar, in logarithmisch wachsenden und Serumstimulierten HSFs reichlich vorhanden ist und durch Cycloheximid superinduziert wird.
Die Analyse von RNA, die für CTGF kodiert, umfasste auch Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung standardmäßig eingesetzt werden. Im Speziellen umfasste die Untersuchung von RNA, die für CTGF kodiert, die Isolierung von zellulärer Gesamt-RNA und Northern-Analysen, die wie in US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 11, Zeile 59, bis Spalte 12, Zeile 14, und Spalte 13, Zeilen 10–29, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben durchgeführt wurde. Es wurde eine 2,4-kb-RNA identifiziert. Die Expression von CTGF war hoch in Plazenta, Lunge, Herz, Niere, Skelettmuskel und Pankreas. Jedoch war die CTGF-Expression in Leber und Hirn niedrig.
Beispiel 4
Transgene Tiere
Die Konstruktion transgener Mäuse, die integrierte Kopien rekombinanter cyr61-Sequenzen trugen, wurde unter Verwendung linearer DNA-Fragmente erzielt, die ein Fusionsgen enthielten. Die für cyr61 kodierende Sequenz wurde unabhängig voneinander an die β-Actin-, K14- und pgk-Promotoren wie oben beschrieben fusioniert.
Die Expression von cyr61 wurde von diesen Promotoren in den transgenen Tieren angetrieben. Das Fusionsgen wurde durch geeignete Restriktionsendonuclease-Verdauungen mittels Standardtechniken produziert. Die Fusionsgenfragmente wurden in Einzelzell-Zygoten von Swiss-Webster-Mäusen injiziert. Die injizierten Zygoten wurden dann in scheinträchtige Weibchen implantiert. Mehrere Würfe von Mäusen wurden auf diese Weise produziert. Neugeborene, die ungewöhnliche Phänotypen zeigten, wurden weiteren Analysen unterzogen. Beispielsweise zeigten neugeborene transgene Mäuse, die cyr61 unter dem pgk-Promotor exprimierten, Skelettdeformationen, einschließlich gewellter Schwänze, unbeweglicher Gelenke und verdrehter Extremitäten, was Fortbewegungsschwierigkeiten bewirkte. Diese Mäuse waren typischerweise verkümmert und verendeten innerhalb von sieben Tagen nach der Geburt. Transgene Mäuse, die cyr61 unter dem β-Actin-Promotor exprimierten, zeigten keinen offensichtlichen Phänotyp, außer dass die Mäuse kleiner waren. Wenn Mäuse, die das Transgen trugen, zum Inzucht-Stamm C57BL/6 rückgekreuzt wurden, verkümmerten die Nachkommen der Mäuse mit fortgesetzter Rückkreuzung in zunehmendem Maße. Nach drei oder vier solcher Rückkreuzungen überleben im Wesentlichen keine Nachkommen zur Reproduktion. Transgene Mäuse, die cyr61 unter dem K14-Promotor exprimierten, zeigten eine Form von fibrotischer Dermatitis. Die Pathologie umfasste ausgeprägte Oberflächenkratzwunden, die manchmal in Blutungen resultierten. Transgene Organismen, die Knockout-Mutationen von cyr61 aufwiesen, können unter Anwendung dieser Standardtechniken ebenfalls erzeugt wer den (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory Press (1994)) und sind zweckdienlich als Modelle von Krankheitszuständen.
Beispiel 5
Cyr61-Expression
Natives Cyr61 wird in Embryogeweben exprimiert und wird in einer Vielzahl verwundeter Gewebe induziert. Siehe unten; siehe auch O'Brian et al. (1992). Die Gewebeverteilung von Cyr61 wurde mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Cyr61-Antikörpern untersucht, die unter Anwendung herkömmlicher immunologischer Technik (Harlow et al. (1987)) hervorgerufen und affinitätsgereinigt wurden. Unter Verwendung affinitätsgereinigter polyklonaler Anti-Cyr61-Antikörper gemäß der Erfindung wurde cyr61-Expression in einer Vielzahl von Geweben gefunden, einschließlich Glattmuskel, Kardiomyozyten und Endothelen des kardiovaskulären Systems; Hirn, Rückenmark, Ganglien und Neuronen und Retina des Nervensystems; Knorpel und Knochen des Skelettsystems; Epidermis, Haar, Mund-Epithel und Hornhaut der Haut; Bronchiolen und Blutgefäßen der Lunge; und Plazenta-Geweben. Zusätzlich zu den auf natives cyr61 (mRNA und Protein) gerichteten Expressionsuntersuchungen haben Untersuchungen unter Verwendung von oben beschriebenen cyr61-Transgenen zum Verständnis der Erfinder über die Cyr61-Expression beigetragen. Die Verwendung von Transgenfusionen, die die Expressionskontrollsequenzen von cyr61 und die kodierende Sequenz von lacZ (für β-Galactosidase kodierend) umfassen, hat einen zweckmäßigen kolorimetrischen Test für die Proteinexpression bereitgestellt.
Der kolorimetrische Test umfasst die Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (d. h. X-Gal) als Substrat für β-Galactosidase, das Genprodukt von lacZ. Die enzymatische Spaltung von X-Gal durch β-Galactosidase produziert einen intensiv gefärbten Indigo-Farbstoff, der für histochemische Färbung zweckdienlich ist. In der Praxis werden der Analyse unterzogene embryonale und adulte Gewebe seziert und in 2% Formaldehyd, 0,2% Glutaraldehyd, 0,02% Nonidet P-40 und 0,01 Natriumdesoxycholat in standardmäßiger phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Die Fixierungszeiten variierten von 15–120 Minuten in Abhängigkeit von der Größe und Dichte von Organ- oder Embryoproben, die der Analyse unterzogen werden. Anschließend wurden die Proben in PBS gewaschen und über Nacht bei 37°C in einer PBS-Lösung gefärbt, die 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 2 mM MgCl₂, 0,02% Nonidet P-40, 0,01% Natriumdesoxycholat und 1 mg/ml X-Gal (40 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO)) enthielt. Die Proben wurden dann in PBS gespült, in 4% Paraformaldehyd 1–2 Stunden lang nachfixiert und in 70% Ethanol bei 4°C gelagert, bis sie der mikroskopischen Untersuchung unterzogen wurden. Mäuse, die das cyr61-lacZ-Transgen enthalten, wurden verwendet, um das Expressionsprofil von cyr61 zu kartieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 für embryonales Gewebe am Tag 12,5 dargestellt.
Tabelle 1
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cyr61 in einer Vielzahl embryonaler Zelltypen exprimiert wird. Zusätzliche Information wurden der ektopischen Expression von Cyr61 entnommen, die aus einem anderen Typ von Transgenfusior resultiert, die eine an die kodierende Sequenz von cyr61 gekoppelte heterologe Exhressionskontrollsequenz umfasst. Die Kontrollsequenzen, der K14-Keratin-Promotor, der β-Actin-Promotor und der Phosphoglycerokinase-Promotor, steuerten die Expression von Cyr61 in einem Muster, das sich von seiner nativen Expression unterschied.
Transgene Mäuse, die Cyr61 ektopisch exprimierten, waren üblicherweise kleiner als Mäuse der Wildform und zeigten eine Verringerung der durchschnittlichen Lebensdauer. Darüber hinaus hatten diese transgenen Mäuse abnormale Herzen (d. h. verdickte Kammerwände mit einer entsprechenden Verminderung der inneren Kapazität) und abnormale Skelette, die durch gekrümmte Wirbelsäulen, geschwollene Gelenke bis zur Unbeweglichkeit und gewellte Schwänze gekennzeichnet waren. Daher stört die ektopische Expression von Cyr61 die Angiogenese (Blutgefäßentwicklung und Herzentwicklung) und Chondrogenese (Skelettentwicklung). Außerdem können transgene Mäuse, die Knockout-Mutationen von cyr61 tragen, als Modelle von Krankheitszuständen entwickelt und getestet werden, die mit dem Fehlen von Cyr61-Aktivität in Verbindung stehen.
Eine Strategie für die Expression von rekombinantem cyr61 wurde unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors in Sf9-Zellen konstruiert. Baculovirus-Expressionsvektoren und Sf9-Zellen umfassende Expressionssysteme sind in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), §§ 16.9.1–16.12.6 (1987), beschrieben. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung implementierte die Expressionsstrategie durch Klonieren der Maus-cyr61-cDNA in pBlueBac2, einem Transfervektor. Der rekombinante Klon wurde gemeinsam mit AcMNPV- (d. h. Autographa-california-Kern-Polyhedrose-Virus oder Baculovirus) Ziel-DNA zu Sf9-Zellen mittels Liposom-vermittelter Transfektion unter Verwendung des MaxBac-Sets (Invitrogen Inc., San Diego, CA) gemäß den Anleitungen des Herstellers zugeführt. Der rekombinante Virus wurde Plaque-gereinigt und durch drei Passagen durch Sf9-Zellen über Infektion amplifiziert.
Konditioniertes Medium von Sf9-Insektenzellen, die mit einem Baculovirus-Konstrukt infiziert waren, das die Synthese von Maus-Cyr61 antreibt, wurde als Quelle zur Reinigung von Cyr61 verwendet (siehe unten). Das gereinigte rekombinante Cyr61 behält gewisse Eigenschaften des endogenen Proteins bei, z. B. die Neparin-Bindungsaktivität von Cyr61 (unten beschrieben) aus 3T3-Fibroblastenzellen, und wies eine Struktur auf, die dem endogenen Protein ähnlich ist, wie durch unabhängige Peptid-Profile offenbart wurde, die durch Teilproteolyse unter Verwendung von Chymotrypsin oder Trypsin (Sequenzierqualität; Boehringer-Mannheim Inc., Indianapolis, IN) produziert wurden.
Human-cyr61 wurde ebenfalls mit dem Baculovirus-System exprimiert. Ein Smal-HindIII-Fragment (den Nucleotiden 100–1649 der Seq.-ID Nr. 3 entsprechend) von cyr61-cDNA, das das gesamte offene Leseraster von Human-cyr61 umfasste, wurde in einen pBlueBac3-Baculovirus-Expressionsvektor (Invitrogen) subkloniert. Rekombinante Baculovirus-Klone wurden erhalten, Plaque-gereinigt und durch drei Passagen von Sf9-Infektion unter Anwendung herkömmlicher Techniken amplifiziert. Die Infektion von Sf9-Zellen und Human-Cyr61- (hCyr61-) Reinigung wurde unter Anwendung von Standardtechniken mit einigen Modifizierungen durchgeführt. Sf9-Zellen wurden in Serum-freiem Sf900-II-Medium (Sigma) gehalten. Sf9-Zellen wurden zu 2–3 × 10⁶ Zellen je 150-mm-Petrischale in Monolayer-Kulturen ausgesät und wurden mit 5 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des rekombinanten Virus pro Zelle infiziert. Das konditionierte Medium wurde nach 8 und 96 Stunden nach Infektion gesammelt, durch Zentrifugation (5000 × g, 5 Minuten) geklärt und auf 50 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure), pH 6,0, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 1 mM EDTA eingestellt. Das Medium wurde in einem Verhältnis von 5 ml Sepharose-S-Perlen je 500 ml konditioniertem Medium mit Sepharose-S-Perlen gemischt, die mit Beladungspuffer (50 mM MES, pH 6,0, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) äquilibriert waren, und die Proteine wurden bei 4°C (über Nacht) unter sanftem Schütteln an die Sepharose S binden gelassen. Die Sepharose-S-Perlen wurden durch Sedimentation ohne Rühren 20 Minuten lang gesammelt und auf die Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 6 Volumina 0,3 M NaCl in Beladungspuffer gewaschen, und rekombinantes Human-Cyr61 wurde mit einem Stufengradienten von NaCl (0,4–0,8 M) in Beladungspuffer von der Säule eluiert. Diese Prozedur resultierte in 3–4 Milligramm gereinigtem Cyr61-Protein aus 500 ml konditioniertem Medium, und das gereinigte Cyr61 war zu über 90% rein, wie durch Coomassie-Blau-Färbung von SDS-Gelen beurteilt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform wird die vollständige Human-cyr61-cDNA in einen Cytomegalovirus-Vektor, wie z. B. pBK-CMV (Stratagene, LaJolla, CA) unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (Hayashi, in: PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. (Hrsg.), Birkhauser, 3–13 (1994)) und Taq-Polymerase mit Editing-Funktion kloniert, gefolgt von herkömmlichen Klonierungstechniken, um das PCR-Fragment in einen Vektor zu insertieren. Der Expressionsvektor wird dann durch Liposom-vermittelte Transfektion in HUVE-Zellen eingeführt. Empfänger-Klone, die das Vektor-getragene neo-Gen enthalten, werden mittels G418 selektiert. Selektierte Klone werden vermehrt und die Cyr61-Expression mittels Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (d. h. RT-PCR; Chelly et al., in: PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. (Hrsg.), Birkhauser, 97–109 (1994)) oder Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (d. h. ELISA; Stites et al., in: Basic and Clinical Immunology, Stites et al. (Hrsg.), Appleton & Lange, 243 (1991)) identifiziert.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird Cyr61-Protein in Bakterienzellen oder anderen Expressionssystemen (z. B. Hefe) exprimiert, und zwar unter Verwendung der für cyr61-cDNA kodierenden Region, die an Promotoren gebunden ist, die im verwendeten Zelltyp operativ sind. Unter Verwendung von einem dieser Ansätze kann Cyr61-Protein in einer Form erhalten werden, die direkt an Patienten, z. B. durch intravenöse Wege, verabreicht werden kann, um angiogene, chondrogene oder onkogene Störungen zu behandeln. Ein Fachkundiger wird üblicherweise anerkennen, dass andere Verabreichungswege ebenfalls verfügbar sind, wie z. B. topische oder lokale Anwendung, Liposom-vermittelte Abgabetechniken oder subkutane, intradermale, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion.
Beispiel 6
Fisp12-Expression
Die Expression von Fisp12 und ein Vergleich der Expressionseigenschaften von Cyr61 und Fisp12 wurden unter Anwendung immunhistochemischer Techniken untersucht. Für diese immunhistochemischen Analysen wurden Gewebeproben (siehe unten) zunächst 2–4 lang Stunden einer Behandlung mit Methyl-Carnoy's-Fixiermittel (60% Methanol, 30% Chloroform und 10% Eisessig) unterzogen. Dann wurden sie entwässert, geklärt und in Paraplast-X-tra-Wachs bei 55–56°C für eine minimale Zeit infiltriert. 7 μm dicke Abschnitte wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern (Sigma) gesammelt, montiert und entwachst. Dann wurden sie mit einer 0,03%igen H₂O₂-Lösung in Methanol 30 Minuten lang behandelt, um endogene Peroxidaseaktivität zu inaktivieren. Nach Rehydratisierung wurden die Abschnitte 15 Minuten lang in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS: 10 mM Tris, pH 7,6 und 140 mM NaCl) gegeben. An diesem Punkt wurden die Abschnitte geblottet, um überschüssiges TBS mit Papiertüchern zu entfernen, und mit 3%igem normalen Ziegenserum in TBS 10 Minuten lang in einer feuchten Kammer blockiert. Überschüssiger Puffer wurde dann abgetropft und primäre Antikörper aufgegeben. Affinitätsgereinigte Anti-Cyr61-Antikörper wurden 1 : 50 in 3%iger Normal-Ziegenserum-TBS-Lösung verdünnt. Die Verdünnung für affinitätsgereinigte Anti-Fisp12-Antiköper betrug 1 : 25. Die routinemäßige Kontrolle war 3%iges Normal-Ziegenserum-TBS oder ein irrelevanter Antikörper (beispielsweise monoklonales Anti-Glattmuskelzellen-α-Actin). Die Spezifität der Färbung wurde durch Inkubation von Anti-Cyr61- oder Anti-Fisp12-Antikörpern mit einem Überschuss des entsprechenden Antigens auf Eis für zumindest zwei Stunden vor dem Aufgeben auf Abschnitte bestätigt. Es wurde vollständige Konkurrenz beobachtet. Im Gegensatz dazu trat keine Kreuz-Konkurrenz (Inkubation von Cyr61-Antikörpern mit Fisp12-Antigen und umgekehrt) auf.
Die primären Antikörper wurden über Nacht bei 4°C auf den Abschnitten belassen. Sie wurden dann zweimal mit TBS gewaschen und einer 30-minütigen Inkubation mit Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur unterzogen. Die verwendeten Sekundärantikörper waren Ziege-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-Konjugate von Boehringer-Mannheim Inc., Indianapolis, IN (in einer Verdünnung von 1 : 400 verwendet). Die Abschnitte wurden zweimal in TBS gewaschen, und es wurde chromogenes Meerrettichperoxidase-Substrat 5 Minuten lang angewendet (1 mg/ml Diaminobenzidin in 50 mM Tris-HCl, pH 7,2 und 0,03% H₂O₂). Die Abschnitte wurden dann in Ehrlichschem Hämatoxylin oder in Alcian-Blau gegengefärbt, entwässert und in Permount montiert.
Maus-Embryos zwischen Neuralfalten- (E8.5) und spätem Organogenese- (E18.5) Stadium der Entwicklung wurden geschnitten und der Immunfärbung mit Antigen-affinitätsgereinigten Kaninchen-Anti-Cyr61- und Anti-Fisp12-Antikörpern unterzogen. Während sich verschiedene Organe im Zuge der Embryogenese entwickelten, wurde die Anwesenheit von Cyr61 und Fisp12 bestimmt. Cyr61 und Fisp12 waren gemeinsam in einer Reihe von Geweben und Organen lokalisiert. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Plazenta, wo beide Proteine leicht detektierbar waren. Im Speziellen wurden Cyr61 sowie Fisp12 in tropoblastischen Riesenzellen und um diese herum gefunden, was die frühere Detektion von cyr61-mRNA in diesen Zellen durch In-situ-Hybridisierung (O'Brian und Lau (1992)) bestätigt. Sowohl Cyr61- als auch Fisp12-Signale der immunhistochemischen Färbung wurden vom entsprechenden Cyr61- oder Fisp12-Antigen blockiert, jedoch weder untereinander noch durch irrelevante Proteine, was die Spezifität belegt. Im Allgemeinen konnten Cyr61- und Fisp12-Proteine sowohl intrazellulär, als auch extrazellulär detektiert werden.
Zusätzlich zur Plazenta wurden sowohl Cyr61, als auch Fisp12 im kardiovaskulären System detektiert, einschließlich im Glattmuskel, in den Kardiomyozyten und Endothelen. Beide Proteine wurden auch in den Bronchiolen und Blutgefäßen der Lunge gefunden. Niedrige Ausmaße an Anti-Cyr61- und Anti-Fisp12-Färbung konnten vorübergehend im Skelettmuskel detektiert werden. Diese Färbung ist mit der Bindegewebshülle und nicht mit Myozyten assoziiert; in diesem Fall war das Färbemuster eindeutig extrazellulär.
Ein komplexeres Verteilungsmuster wurde in der Epidermis und der Epithelen gefunden. Sowohl Cyr61- als auch Fisp12-Färbung konnten in der frühen Einzelzellschicht der embryonalen Epidermis sowie in der späteren mehrschichtigen, sich differenzierenden Epidermis detektiert werden. Fisp12 in der Epidermis sank mit dem Ende der Trächtigkeit auf nicht nachweisbare Mengen ab und blieb so während der adulten Phase, wogegen Cyr61 in der Epidermis leicht detektierbar war. Im Neugeborenen wurde eine starke Färbung von Fisp12 im Mund-Epithel beobachtet, wo die Cyr61-Färbung viel schwächer war, während Cyr61 im oberen Kieferknochen gefunden wurde, wo Fisp12 nicht beobachtet wurde. Das Anti-Fisp12-Signal im Mund-Epithel erhöhte sich allmählich und blieb bis in die adulte Phase intensiv. In der Zunge wurden sowohl Cyr61 als auch Fisp12 im keratinisierten Epithel beobachtet, obgleich das Fisp12-Färbemuster, nicht jedoch das von Cyr61, die Papilla filiformis ausschloss.
Abgesehen von den oben erwähnten Stellen der Lokalisierung waren Cyr61 und Fisp12 ferner einzeln in mehreren Organsystemen zugegen. Beispielsweise war Cyr61, nicht jedoch Fisp12 in den Skelett- und Nervensystemen vorhanden. Wie von den In-situ-Hybridisierungsexperimenten zu erwarten war (O'Brian und Lau (1992)), konnte Cyr61-Protein in den Sklerotom-Massen von Somiten und in Knorpel und Knochen in späteren Entwicklungsstadien leicht detektiert werden. Im Gegensatz dazu war Fisp12 im Skelettsystem nicht nachweisbar. Da die Korrelation mit der chondrozytischen Differenzierung eine der markantesten Eigenschaften der cyr61-Ex pression ist (O'Brian und Lau (1992)), könnte das Fehlen von Fisp12 im Skelettsystem einen wichtigen Unterschied bezüglich der biologischen Rollen von Cyr61 und Fisp12 unterbewerten. Im E14.5-Embryo konnte Cyr61 im ventralen Rückenmark, in Dorsalganglien, Axialmuskel und Sklerotom-hergeleiteten knorpeligen Wirbeln detektiert werden. Fisp12 wurde jedoch in diesen Geweben nicht detektiert.
Im Gegensatz dazu war Fisp12 in verschiedenen Sekretionsgeweben für sich alleine vorhanden. Beginnend bei E16.5, konnte Fisp12 in Pankreas, Nieren und Speicheldrüse detektiert werden. Im Pankreas war Fisp12 strikt auf die Peripherie der Langerhans-Inseln begrenzt. In der Niere wurde eine starke Fisp12-Färbung in den Sammelröhrchen und Henle-Schleifen beobachtet, Regionen, wo Cyr61 nicht gefunden wurde. In der schleimartigen submandibularen Speicheldrüse färbten sich nur die Sammelkanäle auf Fisp12, wogegen in der gemischten schleimig/serösen Submandibulardrüse sich sowohl die serösen Azini als auch die Sammelkanäle färbten. Das Signal in den Azini war peripher, was die Möglichkeit erhebt, dass Fisp12 Kapsel-assoziiert ist. In einfachen holokrinen Talgdrüsen wurde ein starkes azelluläres Fisp12-Signal detektiert.
Zusammenfassend sind Cyr61 und Fisp12 gemeinsam in der Plazenta, im kardiovaskulären System, in Lunge und Haut lokalisiert worden. Kein Protein wurde weder im Verdauungssystem noch in den endokrinen Drüsen detektiert. Einzigartige Lokalisierung von Cyr61 kann im Skelettmuskel und Zentralnervensystem detektiert werden, und Fisp12 findet sich in Sekretionsgeweben, wo sich kein Cyr61 findet.
Ein mit der Proteinexpression in engem Zusammenhang stehendes Thema betrifft das metabolische Schicksal der exprimierten Proteine. Elemente der Cystein-reichen Proteinfamilie sind lokalisiert worden. Wie oben erörtert, findet sich sekretiertes Cyr61 in der ECM und an der Zelloberfläche, nicht jedoch im Kulturmedium (Yang und Lau (1991)), jedoch konnte Fisp12 im Kulturmedium leicht detektiert werden (Ryseck et al. (1991)). Um die Frage anzusprechen, ob Fisp12 ebenfalls ECM-asso ziiert ist, wurde das Schicksal von Cyr61 sowie Fisp12 mittels Pulse-Chase-Experimenten verfolgt. Serum-stimulierte, subkonfluente NIH-3T3-Fibroblasten wurden metabolisch 1 Stunde lang Pulse-markiert und in kaltem Medium für verschiedene Zeitspannen verfolgt. Die Proben wurden in Zell-, ECM- und Medium-Fraktionen fraktioniert, gefolgt von Immunpräzipitation, um Cyr61 und Fisp12 zu detektieren. Beide Proteine hatten eine ähnliche Halbwertszeit von ungefähr 30 Minuten in der Zellfraktion, die neu synthetisierte intrazelluläre Proteine sowie mit der Zelloberfläche assoziierte, sekretierte Proteine (Yang und Lau (1991)) einschließt. Es sollte angemerkt werden, dass der Hauptanteil von sekretiertem Cyr61 mit der Zelloberfläche assoziiert ist, da Cyr61 nach der Synthese quantitativ sekretiert wird und nur ein geringfügiger Anteil stabil mit der ECM assoziiert ist (Yang und Lau (1991)).
Ein Anteil von Cyr61 wurde in die ECM getrieben, wo es mehrere Stunden lang stabil war. Neu synthetisiertes Fisp12 wurde ebenfalls in die ECM getrieben, wo seine Halbwertszeit nur ungefähr 1 Stunde betrug. Ein größerer Anteil von Fisp12 wurde in das konditionierte Medium getrieben, wo kein Cyr61 detektierbar war. Fisp12 im konditionierten Medium hatte ebenfalls eine kurze Halbwertszeit von ungefähr 2 Stunden. Folglich ist Fisp12 eher übergangsmäßig mit der ECM assoziiert, wogegen Cyr61 stark mit der ECM assoziiert ist. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Fisp12 in der Lage sein könnte, an einer Stelle fern vom Ort seiner Synthese und Sekretion zu wirken, wogegen Cyr61 eher lokal wirken könnte.
Da viele ECM-Proteine über eine Wechselwirkung mit Heparinsulfat-Proteoglykanen mit der Matrix assoziieren, könnte die Affinität, mit der ein Protein Heparin bindet, ein Faktor seiner Wechselwirkung mit der ECM sein. Die unten beschriebenen Ergebnisse von Heparin-Bindungstests stehen mit dieser Hypothese im Einklang.
Beispiel 7
Proteinreinigung
Serum-stimulierte NIH-3T3-Fibroblastenzellen wurden lysiert, um eine Quelle von nativem Maus-Cyr61 bereitzustellen. Yang et al. Gleichermaßen sind Human-Fibroblasten eine Quelle von nativem Human-Cyr61.
Rekombinantes Maus-Cyr61 wurde aus Sf9-Zellen gereinigt, die den oben beschriebenen rekombinanten Baculovirus-Vektor trugen, der die gesamte für cyr61 kodierende Sequenz enthält. Obgleich Maus-Cyr61 in Sf9-Zelllysaten unlösliche Aggregate bildete, wie es mit bakteriellen Zellextrakten der Fall war, wurden ungefähr 10 des synthetisierten Cyr61 in löslicher Form in das Medium sekretiert. Die lösliche, sekretierte Form von Cyr61 wurde daher der Reinigung unterzogen.
Zunächst wurden subkonfluente Sf9-Zellen in Monolayer-Kulturen in ergänztem Grace-Medium (GIBCO-BRL Inc., Grand Island, NY) erzeugt. Grace, Nature 195, 788 (1962). Die Sf9-Zellen wurden dann mit 10 Plaque-bildenden Einheiten pro Zelle des rekombinanten Baculovirus-Vektors infiziert, 16 Stunden lang inkubiert und mit serumfreiem Grace-Medium gefüttert. Diese Zellen wurden in serumfreiem Grace-Medium vermehrt. Das konditionierte Medium wurde 48 Stunden nach der Infektion gesammelt, obgleich die Cyr61-Expression 24 Stunden nach der Infektion detektiert werden konnte. Anschließend wurde das konditionierte Medium durch 5-minütige Zentrifugation bei 5.000 × g geklärt, auf 4°C gekühlt, auf 50 mM MES, pH 6,0, 2 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) eingestellt und auf eine Sepharose-S-Säule (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei 4°C (5 ml Ausschlussvolumen pro 500 ml Medium) aufgegeben. Die Säule wurde mit einem 150 mM NaCl enthaltenden Puffer (50 mM MES, pH 6,0, 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF) gewaschen, und gebundene Proteine wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,2–1,0 M) im selben Puffer eluiert. Die vereinigten Cyr61-Fraktionen eluierten bei 0,6–0,7 M NaCl als deutlicher breiter Peak. Die Säulenfraktionen waren zu 90% rein, wie mittels 10%iger SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung und Western-Analyse unter Anwendung von Standardverfahren auf dem Gebiet der Erfindung ermittelt wurde. Yang et al.; siehe auch Sambrook et al., siehe oben. Für die Western-Analyse wurden die Blots mit affinitätsgereinigten Anti-Cyr61-Antikörpern wie in Yang et al. (siehe oben) beschrieben sondiert. Nach der Antikörpersondierung wurden die Western-Blots mit ECL^TM- (d. h. Enhanced ChemiLuminescence-) Detektionsreagenzien (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) gefärbt. Cyr61 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, mit Tris-HCl, pH 7,5, auf pH 7,5 eingestellt, und es wurde vor der Lagerung der Aliquote bei –70°C Glycerin auf 10% zugegeben. Die Proteinkonzentration wurde mit dem modifizierten Lowry-Verfahren unter Verwendung des BioRad-Proteintestsets (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA) bestimmt. Dieses Reinigungsverfahren wurde zumindest fünf Mal mit ähnlichen Resultaten wiederholt. Die typische Ausbeute betrug 3–4 mg von 90% reinem Cyr61-Protein aus 500 ml konditioniertem Medium.
Fisp12 wurde unter Anwendung einer Modifizierung des Cyr61-Reinigungsschemas gereinigt (Kireeva et al., Experimental Cell Research, im Druck). Serumfreies konditioniertes Medium (500 ml) von Sf9-Zellen, die mit 10 pfu pro Zelle infiziert waren, wurden 48 Stunden nach der Infektion gesammelt und auf eine 5-ml-Sepharose-S-Säule (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) aufgegeben. Nach reichlichem Waschen mit 0,2 M und 0,4 M NaCl wurden gebundene Proteine durch Stufenelution mit 0,5 M NaCl enthaltendem 50 mM MES (pH 6,0) gewonnen. Fisp12 enthaltende Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 80% wurden vereinigt, bezüglich NaCl auf 0,15 M eingestellt und das Protein an einer 0,5-ml-Sepharose-S-Säule mit Elution des Proteins bei 0,6 M NaCl 3- bis 5fach aufkonzentriert.
Dieses Reinigungsschema ermöglichte die Isolierung von 1,5 mg rekombinantem Fisp12-Protein mit einer Reinheit von zumindest 80% aus 500 ml serumfreiem konditioniertem Medium.
CTGF wurde mittels Affinitätschromatographie unter Anwendung der PDGF-Kreuzreaktivität zwischen CTGF und PDGF, wie in US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 7, Zeile 15, bis Spalte 9, Zeile 63, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben gereinigt.
Beispiel 8
Polypeptid-Charakterisierung
Das Maus-Cyr61-Protein weist ein M_r von 41.000 und eine Länge von 379 Aminosäuren einschließlich des N-terminalen Sekretionssignals auf. Es besteht eine Aminosäuresequenzidentität von 91% mit der Aminosäuresequenz von 381 Aminosäuren des Human-Proteins. Von jenen Regionen der Maus- und Human-Proteine, die zur Ähnlichkeit der beiden Proteine beitragen, sollte erwartet werden, dass sie zu den biologischen Aktivitäten beitragen, die beide Proteine gemeinsam aufweisen und hierin offenbart sind. Jedoch unterscheiden sich die Maus- und Human-Proteine signifikant im zentralen Teil des Proteins, wo beide Proteine frei von Cysteinen sind. Siehe O'Brian et al., Cell Growth & Diff. 3, 645–654 (1992). Eine Cystein-freie Region in der Maus-Cyr61-Aminosäuresequenz findet sich zwischen den Aminosäureresten 164 bis 226 (Seq.-ID Nr. 2). Eine entsprechende Cystein-freie Region findet sich in der Human-Cyr61-Aminosäuresequenz zwischen den Aminosäureresten 163 bis 229 (Seq.-ID Nr. 4). Im Spezielleren unterscheiden sich die Maus- und Human-Cyr61-Proteine am meisten zwischen den Cyr61-Aminosäuren 170–185 und 210–225. Andere Elemente der ECM-Signalmolekülfamilie Cystein-reicher Proteine, z. B. Fisp12 (Seq.-ID Nr. 6) und CTGF (Seq.-ID Nr. 8), zeigen ähnliche Strukturen, die auf sekretierte Proteine hinweisen, die Sequenzen aufweisen, die von Cysteinresten dominiert sind.
Da Maus-Cyr61 38 Cysteine im sekretierten Teil von 355 Aminosäuren enthält, wurde der Beitrag der Bildung von Disulfidbindungen an der Cyr61-Tertiärstruktur untersucht. Das Aussetzen von Cyr61 gegenüber 10 mM Dithiothreit (DTT) 16 Stunden lang beeinflusste die Fähigkeit von Cyr61 nicht, die Zellanhaftung zu vermitteln (siehe unten). Jedoch wurde Cyr61 durch Erwärmen bei 75°C 5 Minuten lang, Inkubation in 100 mM HCl oder bei extensivem Verdau mit Chymotrypsin inaktiviert. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Maus-Cyr61 ein hitze- und säurelabiles Protein ist, dessen aktive Konformation gegen Reduktionsmittel nicht empfindlich ist. Die oben erwähnten strukturellen Ähnlichkeiten von Maus- und Human-Cyr61-Polypeptiden legen nahe, dass Human-Cyr61 ebenfalls gegen Hitze oder Säure empfindlich, jedoch unempfindlich gegen Reduktionsmittel ist. Außerdem ist Cyr61 weder phosphoryliert noch glykosyliert.
Um zu ermitteln, ob das oben beschriebene gereinigte rekombinante Maus-Cyr61 dasselbe wie das native Maus-Cyr61 war, wurden zwei zusätzliche Eigenschaften von Maus-Cyr61 bestimmt. Zuerst wurden zwei unabhängige Protein-Fingerprints von rekombinantem und nativem Maus-Cyr61 erhalten. Gereinigtes rekombinantes Maus-Cyr61 und ein Lysat von Serum-stimulierten 3T3-Zellen, die bekanntermaßen natives Maus-Cyr61 enthalten, wurden begrenzter Proteolyse entweder mit Trypsin oder Chymotrypsin unterzogen, und ihre Verdauungsprodukte wurden verglichen. Tryptische Teilverdauungen des rekombinanten Proteins sowie des Zelllysats lieferten zwei Cyr61-Fragmente von ungefähr 21 und 19 kDa. Gleichermaßen produzierte das Fingerprinting beider Präparate durch partiellen Chymotrypsinverdau stabile Fragmente von 23 kDa aus rekombinantem Maus-Cyr61 und nativem Maus-Cyr61.
Ein weiteres verwendetes Kriterium zur Beurteilung der Eigenschaften von rekombinantem Cyr61 war seine Fähigkeit, Heparin zu binden, wie unten beschrieben wird. Gereinigtes rekombinantes Maus-Cyr61 band quantitativ an Heparin-Sepharose bei 0,15 M NaCl und wurde bei 0,8–1,0 M NaCl eluiert. Diese Heparin-Bindungskapazität ist ähnlich dem nativen Maus-Cyr61, das aus Serum-stimulierten Maus-Fibroblasten erhalten wurde. Wegen der Ähnlichkeiten der Maus- und Human-Cyr61-Proteine sollte rekombinantes Human-Cyr61 Eigenschaften zeigen, die dem nativen Human-Cyr61 ähnlich sind, wie es für die Maus-Polypeptide der Fall war.
Die Polypeptide der Erfindung erstrecken sich ferner auf Fragmente, Analoga und Derivate der oben erwähnten Vollänge-ECM-Signalmoleküle, wie z.B Human- und Maus-Cyr61. Die Erfindung umfasst Peptidfragmente von ECM-Signalmolekülen, die wie oben beschrieben zumindest eine biologische Aktivität eines ECM-Signalmoleküls beibehalten. Kandidat-Fragmente zur Erhaltung von zumindest einer biologischen Eigenschaft eines ECM-Signalmoleküls umfassen Fragmente, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die einer konservierten Region bekannter ECM-Signalmoleküle entsprechen. Beispielsweise wären Fragmente, die eine oder mehrere der konservierten Cysteinreste von ECM-Signalmolekülen beibehalten, wahrscheinliche Kandidaten für ECM-Signalmolekülfragmente, die zumindest eine biologische Aktivität beibehalten. Über die natürlich auftretenden Aminosäuresequenzen von ECM-Signalmolekülfragmenten hinaus umfassen die Polypeptide der Erfindung Analoga der Aminosäuresequenzen oder -untersequenzen nativer ECM-Signalmoleküle.
ECM-Signalmolekül-Analoga sind Polypeptide, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von nativen ECM-Signalmolekülen unterscheiden, jedoch zumindest eine biologische Aktivität eines nativen ECM-Signalmoleküls wie oben beschrieben beibehalten. Diese Analoga können sich in ihrer Aminosäuresequenz von nativen ECM-Signalmolekülen unterscheiden, z. B. durch Insertion, Deletion oder konservative Substitution von Aminosäuren. Eine konservative Substitution einer Aminosäure, d. h. das Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften (z. B. Hydrophilie, Ausmaß und Verteilung geladener Regionen), wird auf dem Gebiet der Erfindung als typischerweise geringfügige Änderung angesehen. Diese geringfügigen Änderungen können teilweise durch Betrachtung des Hydropathie-Index von Aminosäuren festgestellt werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982). Der Hydropathie-Index einer Aminosäure basiert auf der Betrachtung seiner Hydrophobie und Ladung und umfasst die folgenden Werte: Alanin (+1,8), Arginin (–4,5), Asparagin (–3,5), Aspartat (–3,5), Cystein/Cystin (+2,5), Glycin (–0,4), Glutamat (–3,5), Glutamin (–3,5), Histidin (–3,2), Isoleucin (+4,5), Leucin (+3,8), Lysin (–3,9), Methionin (+1,9), Phenylalanin (+2,8), Prolin (–1,6), Serin (–0,8), Threonin (–0,7), Tryptophan (–0,9), Tyrosin (–1,3) und Valin (+4,2). Es ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, dass Aminosäuren mit ähnlichen Hydropathie-Indizes substituiert werden können und nach wie vor Proteinfunktion beibehalten. Vorzugsweise werden Aminosäuren substituiert, die Hydropathie-Indizes von +/–2 aufweisen.
Die Hydrophilie von Aminosäuren kann ebenfalls verwendet werden, um Substitutionen zu finden, die Proteine liefern würden, die ihre biologische Funktion beibehalten. Eine Betrachtung der Hydrophilie von Aminosäuren im Zusammenhang mit einem Polypeptid erlaubt die Berechnung der höchsten lokalen, mittleren Hydrophilie dieses Polypeptids, ein zweckdienliches Maß, von dem berichtet worden ist, dass es gut mit Antigenität und Immunogenität korreliert. US-Patent Nr. 4.554.101, hierin durch Verweis aufgenommen. Hydrophilie-Werte für jede der gewöhnlichen Aminosäuren, wie sie im US-Patent Nr. 4.554.101 berichtet werden, sind die folgenden: Alanin (–0,5), Arginin (+3,0), Asparagin (+0,2), Aspartat (+3,0 +/–1), Cystein (–1,0), Glycin (0), Glutamat (+3,0 +/–1), Glutamin (+0,2), Histidin (–0,5), Isoleucin (–1,8), Leucin (–1,8), Lysin (+3,0), Methionin (–1,3), Phenylalanin (–2,5), Prolin (–0,5 +/–1), Serin (+0,3), Threonin (–0,4), Tryptophan (–3,4), Tyrosin (–2,3) und Valin (–1,5). Die Substitution von Aminosäuren mit ähnlichen Hydrophiliewerten kann Proteine liefern, die biologische Aktivität beibehalten, beispielsweise Immunogenität, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Vorzugsweise werden Substitutionen mit Aminosäuren durchgeführt, die Hydrophiliewerte innerhalb von +/–2 voneinander haben. Sowohl der Hydrophobie-Index als auch der Hydrophilie-Wert von Aminosäuren werden von der speziellen Seitenkette dieser Aminosäure beeinflusst. Im Einklang mit dieser Beobachtung hängen Aminosäuresubstitutionen, die mit biologischer Funktion kompatibel sind, von der relativen Ähnlichkeit der Aminosäuren und insbesondere der Seitenket ten dieser Aminosäuren ab, wie durch die Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und andere Eigenschaften gezeigt wurde.
Außerdem sind Computeralgorithmen verfügbar, um die Vorhersage von Aminosäuresequenzdomänen zu unterstützen, die voraussichtlich einem wässrigen Lösungsmittel zugänglich sind. Diese Domänen sind, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, häufig gegen die Außenseite des Proteins hin angeordnet, wodurch sie möglicherweise zur Bindung von Determinanten, einschließlich antigenen Determinanten, beitragen. Wenn man die DNA-Sequenz zur Verfügung hat, wird die Herstellung solcher Analoga durch Verfahren erzielt, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind, z. B. (ortsgerichtete) Mutagenese und andere Techniken.
Derivate von ECM-Signalmolekülen sind in der Erfindung ebenfalls vorgesehen. ECM-Signalmolekül-Derivate sind Proteine oder Peptide, die sich von nativen ECM-Signalmolekülen auf andere Weisen als in der Primärstruktur (d. h. Aminosäuresequenz) unterscheiden. Illustrativ können ECM-Signalmolekül-Derivate sich von nativen ECM-Signalmolekülen durch Glykosylierung, einer Form von posttranslationeller Modifizierung, unterscheiden. Beispielsweise können Polypeptide Glykosylierungsmuster aufgrund der Expression in heterologen Systemen zeigen. Wenn diese Polypeptide zumindest eine biologische Eigenschaft eines nativen ECM-Signalmoleküls beibehalten, dann sind diese Polypeptide ECM-Signalmolekül-Derivate gemäß der Erfindung. Andere ECM-Signalmolekül-Derivate umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Fusionsproteine mit einem kovalent modifizierten N- oder C-Terminus, PEGylierte Polypeptide, mit Lipidgruppierungen assoziierte Polypeptide, alkylierte Polypeptide, über eine funktionelle Aminosäureseitenkettengruppe an andere Polypeptide oder Chemikalien gebundene Polypeptide und zusätzliche Modifizierungen, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise selbstverständlich sind. Außerdem sieht die Erfindung ECM-Signalmolekül-verwandte Polypeptide vor, die an einen ECM-Signalmolekül-Rezeptor binden, wie unten beschrieben wird.
Die oben beschriebenen, verschiedenen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als einzelne Polypeptide bereitgestellt werden oder z. B. durch kovalente Bindungen an andere Verbindungen gebunden sein. Beispielsweise können immunogene Träger, wie z. B. Schlüsselloch-Wellschnecke-Hämocyanin an ein ECM-Signalmolekül der Erfindung gebunden sein.
Beispiel 9
Heparin-Bindungstest
Der von Yang et al. beschriebene Heparin-Bindungstest für natives Maus-Cyr61 wurde für das gereinigte rekombinante Maus-Protein modifiziert. Zunächst wurde rekombinantes gereinigtes Cyr61 in RIPA- (Radioimmunpräzipitationstest-) Puffer (150 mM NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert. Als Nächstes wurden 200 μl einer Aufschlämmung von 50 Vol.-% Heparin-Sepharose-CL-6B-Kügelchen (Pharmacia-LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) zu 100 μl der rekombinanten Cyr61-Lösung zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde Human-Cyr61 quantitativ an Heparin-Agarose gebunden. Das Aufgeben eines Salzkonzentrationsgradienten in RIPA-Puffer resultierte in der Elution von rekombinantem Maus-Cyr61 bei 0,8–1,0 M NaCl. Das Elutionsprofil des rekombinanten Proteins war ähnlich dem Elutionsprofil für natives Maus-Cyr61.
Man könnte erwarten, dass Fisp12 Heparin mit einer niedrigeren Affinität als Cyr61 bindet, da es nicht so stark mit der ECM wechselwirkt wie Cyr61. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden metabolisch markierte (³⁵S-Cystein; 100 μCi pro 100-mm-Platte; ICN) Zelllysate mit Heparin-Agarose-Perlen inkubiert, die anschließend gewaschen wurden, um ungebundene Proteine zu entfernen. Gebundene Proteine wurden in ansteigenden Salzkonzentrationen eluiert. Fisp12 aus Zelllysaten wurden auf Heparin-Agarose zurückgehalten, wurde jedoch bei 0,2 bis 0,6 M NaCl mit Peak- Elution bei 0,4 M NaCl eluiert. Dies steht im Gegensatz zu Cyr61, das bei wesentlich höheren NaCl-Konzentrationen eluiert wurde. Dieser Unterschied hinsichtlich der Heparin-Bindung steht im Einklang mit den unterschiedlichen Affinitäten von Cyr61 und Fisp12 für die ECM, was darauf hinweist, dass die Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane ein hauptsächlicher Mechanismus ist, durch den beide Proteine mit der ECM assoziieren.
Beispiel 10
Rezeptoren
Human-Cyr61 war wie Maus-Cyr61 an der Zelloberfläche und ECM lokalisiert. Die Lokalisierung von Cyr61 an der Zelloberfläche implizierte einen Cyr61 bindenden Zelloberflächenrezeptor. Im Einklang mit dieser Schlussfolgerung werden die biologischen Wirkungen von Cyr61 durch α_vβ₃-Integrin oder Vitronectin-Rezeptor vermittelt. Das α_vβ₃-Integrin bildet in Verbindung mit anderen Integrinen Proteincluster, die Kristallisationspunkte für die Zytoskelett-Anhaftung bereitstellt. Cyr61 induziert die Bildung von Proteinclustern, einschließlich der α_vβ₃-Integrin enthaltenden Proteincluster. Außerdem wurden unter Verwendung eines In-vitro-Tests die biologischen Wirkungen von Cyr61, einschließlich der Cyr61-induzierten Zelladhäsion und Mitogenese, durch die Zugabe von irgendeinem der beiden gegen das α_vβ₃-Integrin gerichteten monoklonalen Antikörper LM609 (Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6471–6475 (1987)) oder Anti-VnR 1 (Chen et al., Blood 86, 2606–2615 (1995)) aufgehoben.
Die in Beispiel 13 unten beschriebene Cyr61-Induktion der HUVE-Zelladhäsion führte zu einer Untersuchung der gegen zweiwertige Kationen empfindlichen Zelloberflächenrezeptoren, die von HUVE-Zellen exprimiert werden. Die Zelladhäsionseigenschaften von Cyr61 wurden verwendet, um den Rezeptor zu identifizieren, der ein gegen zweiwertige Kationen empfindlicher Zelloberflächenrezeptor ist. Die Fähigkeit von Cyr61, die Zelladhäsion zu vermitteln, verbunden mit der absoluten Bedingung von zweiwertigen Kationen im Prozess, wies darauf hin, dass Cyr61 mit einem der von zweiwertigen Kationen abhängigen Adhäsionsmoleküle aus den Integrin-, Selectin- oder Cadherin-Familien wechselwirkt. Ruoslahti et al., Exp. Cell Res. 227, 1–11 (1996). Unter Anwendung gut charakterisierter Ansätze der Rezeptoridentifizierung wurde eine Reihe von Hemmuntersuchungen durchgeführt. Inhibitoren oder Blockierungsmittel mit verschiedenen Spezifitätsgraden (EDTA, ähnlich dem oben beschriebenen EGTA; inhibierende Peptide, die Varianten des RGD- (Einbuchstaben-Aminosäurecode) Integrin-Erkennungsmotivs beherbergen, wie z. B. RGDS, SGDR und RGDSPK (Ruoslahti et al., Science 238, 491–497 (1987); E. Ruoslahti, Ann. Rev. of Cell and Dev. Biol. 12, 698–715 (1996)); und bekannte, spezifische Anti-Rezeptor-Antikörper) wurden verwendet, um einen Cyr61-Rezeptor zu identifizieren. Dieser Rezeptor war das α_vβ₃-Integrin, der auch dahingehend bekannt ist, dass er als Vitronectin-Rezeptor fungiert. Die Bestätigung dieser Identifizierung wurde erhalten, indem gezeigt wurde, das der Antikörper LM609, ein spezifischer Anti-α_vβ₃-Integrin-Antikörper, die Wirkung von Cyr61 auf die Zelladhäsion blockieren konnte. Integrine bilden eine große Familie heterodimerer Adhäsionsrezeptoren mit einem breiten Ligandenspezifitätsbereich, die an Zelle-Zelle- und Zelle-Matrix-Wechselwirkungen beteiligt sind. Über ihre Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen und ihre Beteiligung an Zelle-Matrix-Adhäsionsereignissen (R. O. Hynes, Cell 69, 11–25 (1992)) hinaus sind Integrine auch an der Zellmigration (Damsky et al., Curr. Opin. Cell Biol. 4, 772–781 (1992); Doerr et al., J. Biol. Chem. 271, 2443–2447 (1996)) und -vermehrung (Juliano et al., J. Cell Biol. 120, 577–585 (1993); Plopper et al., Mol. Biol. Cell 6, 1349–1365 (1995); und Clark et al., Science 268, 233–239 (1995)) beteiligt, zwei weiteren Prozessen, die mit Cyr61-Aktivität verbunden sind. Das α_vβ₃-Integrin erwies sich als essentiell für die Cyr61-vermittelte Zelladhäsion.
Die Charakterisierung der CTGF-Bindung an Zellen hat gezeigt, dass sie über einen Zelloberflächenrezeptor stattfindet, der auch mit PDGF-BB (der BB-Isoform von PDGF) wechselwirkt, wie im US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 11, Zeile 10, bis Spalte 12, Zeile 14, hierin durch Verweis aufgenommen, angeführt ist. Die Identifizierung der vorangehenden Rezeptoren erlaubt die Konstruktion und Produktion von Molekülen, die an die jeweiligen Rezeptoren binden, um die Aktivitäten von ECM-Molekülen zu hemmen.
Beispiel 11
Anti-ECM-Signalmolekül-Antikörper
Antikörper, die, wie unten beschrieben, gegebenenfalls an einen Marken oder an ein Toxin gebunden sind, sind in der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorgesehen. Die Verfügbarkeit der Human-cyr61-cDNA-Sequenz und der abgeleiteten Cyr61-Proteinsequenz erleichtert die Implementierung von Verfahren, die zur Hervorrufung von Anti-Cyr61-Antikörpern unter Anwendung einer Reihe von Standardtechniken auf dem Gebiet der Erfindung (Harlow et al.) entworfen wurden.
In einer Ausführungsform werden gegen Cyr61 gerichtete polyklonale Antikörper erzeugt. Die Erzeugung von Anti-Cyr61-Antikörpern, die für Human-Cyr61 spezifisch sind, wird beispielsweise durch Konstruieren geeigneter Antigene optimiert. Das Human-Cyr61-Protein hat einschließlich des N-terminalen Sekretionssignals eine Länge von 381 Aminosäuren. Wie oben beschrieben weist Human-Cyr61 91% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz von 379 Aminosäuren des Maus-Proteins auf. Jedoch unterscheiden sich die Maus- und Human-Proteine am signifikantesten im zentralen Teil der Proteine, wo sie frei von Cysteinen sind (siehe oben). Diese Sequenzunterschiede werden genützt, um Antikörper hervorzurufen, die gegen das Human-Cyr61 spezifisch sind, indem ein Peptid als Antigen verwendet wird, das eine Sequenz aufweist, die sich von einer der unterschiedlichen Regionen im Human-Protein herleiteten, obgleich gegen eine konservierte Region gerichtete Antikörper in der Erfindung ebenfalls vorgesehen sind.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden monoklonale Antikörper unter Verwendung von intaktem rekombinantem Cyr61 hervorgerufen, obgleich ein Fragment verwendet werden kann. Weibliche BALB/c-Mäuse werden intraperitoneal mit einem Gemisch von 0,25 ml bakteriell produziertem oder in eukaryotischen Zellen produziertem, rekombinantem Human-Cyr61 (5–50 Mikrogramm) und 0,25 ml komplettem Freundschem Adjuvans inokuliert. Vierzehn Tage später werden die Injektionen wiederholt, wobei das komplette Freundsche Adjuvans durch inkomplettes Freundsches Adjuvans ersetzt wird. Nach weiteren zwei Wochen wird eine weitere Injektion von Human-Cyr61 in inkomplettem Freundschen Adjuvans verabreicht. Ungefähr zwei Wochen nach der dritten Injektion wird an den Schwänzen Blut abgenommen und Serumproben auf Human-Anti-Cyr61-Antikörper durch Immunpräzipitation mit radiomarkiertem rekombinantem Human-Cyr61 gescreent. Ungefähr 2 Monate nach der ersten Injektion werden denjenigen Mäusen, deren Sera die höchsten Antikörpertiter lieferten, Booster-Injektionen von Cyr61 verabreicht (5–50 Mikrogramm in inkomplettem Freundschen Adjuvans, 0,1 ml intravenös und 0,1 ml intraperitoneal). Drei Tage nach der Booster-Injektion werden die Mäuse getötet. Splenozyten werden dann aus jeder Maus mittels Standardtechniken isoliert und die Zellen gewaschen und einzeln mit einer Myelomzelllinie, z. B. der X63Ag8.653-Zelllinie (Harlow et al.), unter Verwendung von Polyethylenglykol durch Techniken fusioniert, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Andere geeignete Zelllinien zur Fusion mit Splenozyten sind in Harlow et al. auf Seite 144, in Tabelle 6.2, beschrieben, hierin durch Verweis aufgenommen. Fusionierte Zellen werden aus der PEG-Lösung entfernt, in ein gegenselektives Medium (z. B. Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin- oder HAT-Medium) verdünnt, um unfusionierte Myelomzellen abzutöten, und in Multi-Well-Gewebekulturplatten inokuliert.
Ungefähr 1–2 Wochen später werden Proben der Gewebekulturüberstände aus den Wells, die wachsende Hybridome enthalten, entfernt und auf die Anwesenheit von Anti-Cyr61-Antikörpern durch Binden an rekombinantes, an Nitrozellulose gebundenes Cyr61 und Screenen mit markiertem Anti-Immunglobulin-Antikörper in einem standardmäßigen Antikörper-Fang-Test getestet. Zellen aus positiven Wells werden gezüchtet, und es werden einzelne Zellen auf Feeder-Schichten von Splenozyten kloniert. Die klonierten Zelllinien werden gefroren gelagert. Monoklonale Antikörper werden unter Anwendung von Standardtechniken, z. B. Hydroxyapatit-Chromatographie, gesammelt und gereinigt. In einer Alternative können als Antigene verwendete Cyr61-Peptide an immunogene Träger, wie z. B. an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Trägerprotein gebunden werden, um monoklonale Anti-Cyr61-Antikörper hervorzurufen.
Eine weitere Ausführungsform umfasst die Erzeugung von Antikörperprodukten gegen ein Fusionsprotein, das einen Teil des Human-Cyr61 oder das gesamte Human-Cyr61 enthält, wobei ausreichend Proteinsequenz umfasst ist, um ein brauchbares Epitop in einem Fusionsprotein zu entfalten. Die Fusion der großen Untereinheit von Anthranilat-Synthase (d. h. TrpE) an Maus-Cyr61 und die Fusion von Glutathion-S-Transferase (d. h. GST) an Maus-Cyr61 sind verwendet worden, um erfolgreich Antikörper gegen Maus-Cyr61 herzustellen. Yang et al. Außerdem kann eine breite Vielfalt von Polypeptiden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind, bei der Bildung von Cyr61-Fusionspolypeptiden gemäß der Erfindung verwendet werden.
Im Spezielleren beschrieb Yang ein TrpE-Cyr61-Fusionspolypeptid, das aus einem rekombinanten Klon exprimiert wurde, der durch Klonen eines Fragments von Maus-cyr61-cDNA, die die Nucleotide 456 bis 951 (für die Cyr61-Aminosäuren 93–379 kodierend) enthält, in die SacI-Stelle des pATH1-Vektors konstruiert wurde. Dieckman et al., J. Biol. Chem. 260, 1513–1520 (1985). Das rekombinante Konstrukt wurde in einen bakteriellen Wirt, z. B. E. coli K12, transformiert, und die Expression des Fusionsproteins wurde durch Zugabe von 25 μg/ml Indolacrylsäure zu wachsenden Kulturen induziert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und das Gesamtzelllysat durch Elektrophorese an einem 7,5%igen Polyacrylamidgel fraktioniert. Das Fusionsprotein der vorhergesagten Größe war die einzige von Indolacrylsäure induzierte Bande; diese Bande wurde aus dem Gel eluiert und als Antigen verwendet, um New-Zealand-White-Kaninchen (Langshaw Farms) mittels Standardtechniken auf dem Gebiet der Erfindung zu immunisieren. Harlow et al. Zusätzlich zu polyklonalen Antikörpern umfasst die Erfindung monoklonale Antikörper, die gegen solche Fusionsproteine gerichtet sind.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden rekombinante Antikörperprodukte verwendet. Beispielsweise liegen chimäre Antikörperprodukte, „humanisierte" Antikörperprodukte und CDR-Pfropf-Antikörperprodukte im Schutzumfang der Erfindung. Kashmiri et al., Hybridoma 14, 461–473 (1995), hierin durch Verweis aufgenommen. Antikörperfragmente sind in der Erfindung ebenfalls vorgesehen. Die Antikörperprodukte umfassen die oben erwähnten, als isolierte Antikörper oder als an Marker gebundene Antikörper verwendeten Arten von Antikörperprodukten. Marker können signalerzeugende Enzyme, Antigene oder Antikörper, Lectine, Kohlenhydrate, Biotin, Avidin, Radioisotope, Toxine, Schwermetalle und andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Zusammensetzungen sein; Bindungstechniken sind auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls wohl bekannt.
Anti-Cyr61-Antikörper sind bei der Diagnose eines Thrombose-Risikos zweckdienlich, wie unten in Beispiel 20 ausführlicher erläutert wird. Außerdem werden Anti-Cyr61-Antikörper in Therapien verwendet, die zur Prävention oder Verringerung unerwünschter, abnormalen Cyr61-Spiegeln zurechenbarer Gerinnung entworfen wurden. Weiters können Antikörper gemäß der Erfindung an Toxine, wie z. B. Ricin, unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannten Techniken gebunden werden. Diese Antikörperprodukte gemäß der Erfindung sind bei der Abgabe von spezifisch abzielenden Zytotoxinen an Zellen zweckdienlich, die Cyr61 exprimieren, z. B. Zellen, die an der Neovaskularisierung von massiven Tumoren teilnehmen. Diese Antikörper werden durch eine Reihe von Verabreichungswegen in pharmazeutischen Zusammensetzungen abgegeben, die Träger und Verdünnen umfassen, wie von Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlverstanden wird.
Antikörper, die Fisp12 spezifisch erkennen, sind ebenfalls unter Verwendung eines Fusionsproteins hervorgerufen worden. Das zur Herstellung von Anti-Fisp12-Antikörpern verwendete Antigen band Gluthathion-S-Transferase (GST) an den zentralen Teil von Fisp12 (GST-Fisp12), wo keine Sequenzähnlichkeit mit Cyr61 besteht (O'Brian und Lau (1992)). Ein Konstrukt, dass für Aminosäuren 165 bis 200 von Fisp12 kodierende cDNA enthielt, wurde an die für Glutathion-S-Transferase (GST) kodierende Sequenz fusioniert. Dies wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt, um die Synthese eines DNA-Fragments, das jenes Fisp12-Fragment umfasste, das von einer 5'-BamHI-Restriktionsstelle und einer 3'-EcoRI-Restriktionsstelle flankiert war, zu lenken. Der 5'-Primer weist die Sequenz 5'-GGGGATCTGTGACGAGCCCAAGGAC-3' (Seq.-ID Nr. 9) auf, und der 3'-Primer weist die Sequenz 5'-GGGAATTCGACCAGGCAGTTGGCTCG-3' (Seq.-ID Nr. 10) auf. Für Cyr61-spezifisches Antiserum wurde ein Konstrukt, das den zentralen Teil von Cyr61 (Aminosäuren 163–229), der keine Sequenzähnlichkeit zu Fisp12 enthält, an GST fusioniert, unter Verwendung des 5'-Primers 5'-GGGGATCCTGTGATGAAGACAGCATT-3' (Seq.-ID Nr. 11) und des 3'-Primers 5'-GGGAATTCAACGATGCATTTCTGGCC-3' (Seq.-ID Nr. 12) in derselben Weise hergestellt. Diese wurden gerichtet in den pGEX2T-Vektor (Pharmacia-LKB Inc.) kloniert und die Klone mittels Sequenzanalyse bestätigt. Das GST-Fusionsprotein wurde an Glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia-LKB Inc.) gemäß den Anleitungen des Herstellers isoliert und dazu verwendet, um New-Zealand-White-Kaninchen zu immunisieren. Für Affinitätsreinigungen wurden Antisera zunächst durch eine GST-Protein-Affinitätssäule geschickt, um gegen GST erzeugte Antikörper zu entfernen, und dann durch eine GST-Fisp12- oder GST-Cyr61-Protein-Affinitätssäule, um Anti-Fisp12- oder Anti-Cyr61-Antikörper zu isolieren (Harlow et al. (1988)).
Diese Antikörper immunpräzipitierten das Fisp12-Proteinprodukt der korrekten Größe, das, von fisp12-mRNA gelenkt, in vitro synthetisiert wurde. Die Antikörper sind für das Fisp12-Polypeptid spezifisch und zeigen keine Kreuzreaktivität mit Cyr61.
CTGF erkennende polyklonale Antikörper sind ebenfalls bekannt. US-Patent Nr. 5.408-040, Spalte 7, Zeile 41, bis Spalte 9, Zeile 63, hierin oben durch Verweis aufgenommen, offenbart eine immunologische Kreuzreaktivität zwischen PDGF und CTGF, wie sie oben beschrieben wird.
Beispiel 12
Hemmende Peptide
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von hemmenden Peptiden in therapeutischen Strategien, die zur Hemmung der Aktivität des Cyr61-Proteins entworfen wurden. Ein Ansatz ist die Synthese eines hemmenden Peptids auf Basis der Proteinsequenz von Cyr61. Beispielsweise konkurriert ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zwischen Maus-Cyr61 (Seq.-ID Nr. 2) und Human-Cyr61 (Seq.-ID Nr. 4) konserviert ist, mit nativem Cyr61 um seine Bindungsstellen. Diese Konkurrenz hemmt dadurch die Wirkung von nativem Cyr61. Beispielsweise hemmt die Verabreichung eines hemmenden Peptids über wohl bekannte Wege die Fähigkeit von Cyr61, die Kaskade von Ereignissen zu beeinflussen, die Blutgerinnsel, Vaskularisierung von Tumoren oder abnormale Vaskularisierung des Auges (z. B. Augenstörungen, die durch Vaskularisierung der Retina oder Glaskörperflüssigkeit gekennzeichnet sind) usw. bewirkt. Insbesondere verhindert ein hemmendes Peptid, dass Cyr61 die Wirkung von Gewebefaktorpfad-Inhibitor (Tissue-Factor-Pathway-Inhibitor) oder TFPI wie unten beschrieben hemmt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wurden hemmende Peptide so konstruiert, dass sie mit Cyr61 konkurrieren. Diese hemmenden Peptide dienen wie die Antikörper des vorhergehenden Beispiels als Beispiele von Modulatoren der Cyr61-Aktivität, wie sie im Zusammenhang mit einer Reihe von hierin offenbarten Tests der Cyr61-Aktivität beschrieben sind. Die Peptid-Konstruktion war von Sequenzvergleichen un ter Maus-Cyr61, Fisp12 und Nov (ein Vogel-Proto-Onkogen) geleitet. Die Aminosäuresequenzen von mehreren Elementen dieser Familie werden in 1 verglichen. Diese Arten von Sequenzvergleichen stellen eine Basis für eine rationale Konstruktion einer Vielzahl von hemmenden Peptiden bereit. Einige dieser konstruierten Peptide, zum Beispiel Peptide, die die Aminosäuren 48–68 (Seq.-ID Nr. 13), 115–135 (Seq.-ID Nr. 14), 227–250 (Seq.-ID Nr. 15), 245–270 (Seq.-ID Nr. 16) und 310–330 (Seq.-ID Nr. 17) der Seq.-ID Nr. 2 umfassen, sind synthetisiert worden. Ein Vergleich der Maus-Cyr61-Aminosäuresequenz und der Human-Cyr61-Aminosäuresequenz offenbart, dass ähnliche Domänen aus dem Human-Protein bei der Konstruktion von Peptiden, die Human-Cyr61 hemmen, verwendet werden können. Außerdem können Sequenzvergleiche die Human-Cyr61-Aminosäuresequenz umfassen; Vergleiche können ferner das Human-Homolog von Fisp12, Connective-Tissue-Growth-Factor, umfassen, das ebenfalls als Element dieser Proteinfamilie identifiziert worden ist. O'Brian et al. (1992).
Hemmende Peptide können auch konstruiert werden, um mit anderen ECM-Signalmolekülen, z. B. Fisp12 oder CTGF, um die Bindung an ihre entsprechenden Rezeptoren zu konkurrieren. Die Konstruktion hemmender Peptide wird durch die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen unter den ECM-Signalmolekülen erleichtert. Außerdem kann die Konstruktion von hemmenden Peptiden durch ein oder mehrere Verfahren gelenkt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifizierung von Aminosäuresequenzen bekannt sind, die wahrscheinlich funktionelle Domänen umfassen (z. B. hydrophile Aminosäuresequenzen wie äußere/Oberflächen-Proteindomänen; Sequenzen, die mit α-Helixbildung als Membran-umspannende Domänen kompatibel sind). Diese Verfahren sind in Form von im Handel erhältlicher Software, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, implementiert worden. Siehe z. B. „Intelligenetics Suite of Analytical Programs for Biomolecules". Intelligenetics Inc., Mountain View, CA. Unter Anwendung dieser Ansätze können hemmende Peptide konstruiert werden, die die biologische Aktivität eines ECM-Signalmoleküls, wie z. B. Cyr61, Fisp12 oder CTGF, stören. Mit der Konstruktion einer Ami nosäuresequenz eines hemmenden Peptids kann die Produktion dieses Peptids durch eine Reihe wohl bekannter Techniken realisiert werden, einschließlich rekombinanter Produktion und chemischer Synthese, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielhafte Peptide, von denen gezeigt worden ist, dass sie zumindest eine biologische Eigenschaft von Cyr61 spezifisch hemmen, umfassen Peptide, die das „RGD"-Motiv oder Motiv-Varianten, wie z. B. „RGDS", „RGDSPK", „GDR" oder „SGDR", aufweisen (Ruoslahti et al., Science 238, 491–497 (1987); E. Ruoslahti, Ann. Rev. of Cell and Dev. Biol. 12, 698–715 (1996)), wie oben in Beispiel 10 beschrieben wurde.
Beispiel 13
Zelladhäsion
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von Cyr61. zur Vermittlung der Anhaftung von Zellen an die extrazelluläre Matrix. Die Induktion der Zelladhäsion wurde unter Verwendung von Maus-Cyr61, Fibronectin und Rinderserumalbumin (BSA) untersucht. Immunologische 96-Well-Platten (Marke Falcon) wurden mit 50 μl 0,1% BSA in PBS bei 4°C in Gegenwart von 0–30 μg/ml Maus-Cyr61 oder Fibronectin beschichtet. Nach zwei Stunden Aussetzen gegenüber der Beschichtungslösung wurden unverdünnte Immun- oder Prä-Immunantisera (30 μl/Well) oder affinitätsgereinigte Anti-Cyr61-Antikörper zugegeben. In einigen Wells wurde das Beschichtungsgemisch auf 10 mM DTT oder 100 mM HCl eingestellt. Nach 16 Stunden Inkubation wurde die Beschichtungslösung entfernt und die Welloberfläche mit 1% BSA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. HUVE-Zellen wurden in komplettem Ham-F12K-Medium (Gibco-BRL Inc.; Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53, 786 (1965)) zu 5 × 10³–10⁴ Zellen/Well ausplattiert. Cycloheximid wurde auf 100 μg/ml unmittelbar vor dem Ausplattieren zugegeben, und Monensin wurde auf 1 μM 14 Stunden vor der Ausplattierung zugegeben. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Wells mit PBS gewaschen, und anhaftende Zellen wurden fixiert und mit Methylenblau gefärbt. Die Anhaftungseffizienz wurde durch quantitative Farbstoffextraktion und Messung der Extraktabsorption bei 650 nm bestimmt. Oliver et al., J. Cell. Sci. 92, 513–518 (1989).
HUVE-Zellen hafteten schlecht an mit BSA alleine behandelten Platten, hafteten jedoch gut an mit Fibronectin beschichteten Platten. Maus-Cyr61-beschichtete Oberflächen unterstützten ebenfalls die Anhaftung von HUVE-Zellen auf dosisabhängige Weise, ähnlich wie Fibronectin. Beispielsweise ergaben Cyr61 und Fibronectin bei 1 μg/ml A₆₅₀-Werte von 0,1. Ein A₆₅₀-Wert von 0,5 entsprach der Anhaftung von 6 × 10³ Zellen. Am anderen Ende des getesteten Konzentrationsbereichs, 30 μg/ml, ergab Cyr61 eine A₆₅₀ von 0,8; Fibronectin ergab eine A₆₅₀ von 0,9. Cyr61 förderte auch die Anhaftung von NIH-3T3-Zellen, obgleich weniger effektiv als Fibronectin. Cyr61-vermittelte Zellanhaftung kann schon 30 Minuten nach Ausplattierung beobachtet werden, wie mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden kann.
Die Adhäsion von HUVE-Zellen an Maus-Cyr61-beschichteten Oberflächen wurde durch Anti-Cyr61-Antiserum und durch affinitätsgereinigte Anti-Cyr-61-Antikörper spezifisch gehemmt, nicht jedoch durch Prä-Immunserum. Im Gegensatz dazu wurde die Anhaftung von Zellen an Fibronectin-beschichtete Platten weder durch das Anti-Cyr61-Antiserum noch durch affinitätsgereinigte Anti-Cyr61-Antikörper beeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verstärkung der Zelladhäsion eine spezifische Aktivität des Cyr61-Proteins ist. Darüber hinaus war die Cyr61-vermittelte Zellanhaftung unempfindlich gegen Cycloheximid- oder Monensin-Behandlung, was darauf hinweist, dass Cyr61 nicht durch Induzieren der De-novo-Synthese von ECM-Komponenten, Stimulation von Fibronectin oder Collagen-Sekretion agiert. Die Daten stützen vielmehr die direkte Einwirkung von Cyr61 auf Zellen, die die Adhäsion beeinflussen. Die Cyr61-vermittelte Anhaftung von HUVE-Zellen wurde durch die Gegenwart von EGTA vollständig aufgehoben; jedoch wurde die Anhaftung durch Zusatz von CaCl₂ oder MgSO₄ zum Medium wiederhergestellt. Diese Ergebnisse zei gen an, dass die Wechselwirkung zwischen Cyr61 und seinem Oberflächenrezeptor zweiwertige Kationen erfordert, was mit den Beobachtungen übereinstimmt, die zur Identifizierung des α_vβ₃-Integrins als den oben in Beispiel 10 beschriebenen Cyr61-Rezeptor führte.
Die Fähigkeit von Cyr61, die Zelladhäsion zu fördern, und die Fähigkeit von Molekülen, wie z. B. Anti-Cyr61-Antikörpern, diesen Prozess zu hemmen, wird in einem Test für Modulatoren der Zelladhäsion ausgenützt. Der Test umfasst einen Vergleich der Zelladhäsion an Oberflächen, z. B. Kunststoff-Gewebekulturwells, die mit Cyr61 und einem mutmaßlichen Modulator der Zelladhäsion beschichtet sind. Als Kontrolle wird eine ähnliche Oberfläche mit Cyr61 alleine beschichtet. Nach dem Kontakt mit geeigneten Zellen werden die an den Oberflächen anhaftenden Zellen gemessen. Ein relativer Anstieg der Zelladhäsion in Gegenwart des mutmaßlichen Modulators relativ zum Ausmaß an Zellanhaftung an einer Cyr61-beschicheten Oberfläche identifiziert einen Förderer der Zelladhäsion. Eine relative Abnahme der Zelladhäsion in Gegenwart des mutmaßlichen Modulators identifiziert einen Inhibitor der Zelladhäsion.
Die Identifizierung eines Cyr61-Rezeptors führte zur Entwicklung eines schnellen und spezifischen Ligand-Rezeptor-Tests (d. h. Integrin-Bindungstests) für Cyr61. Der monoklonale Antikörper LM609 (Anti-α_vβ₃) ist beschrieben worden. Cheresh (1987). Der monoklonale Antikörper JBS5 (Anti-Fibronectin-Antikörper) wurde von Chemicon bezogen. Anti-Human- und Anti-Rinder-Vitronectin-Antisera stammten von Gibco BRL. HRP-konjugierter Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper stammte von KPL. RDGSPK-Peptid stammte von Gibco BRL; RGDS- und SDGR-Peptide stammten von American Peptide Company. Die Peptide für die funktionellen Tests wurden zu 10 mg/ml in PBS gelöst und der pH mit NaOH auf 7,5–8,0 eingestellt. Human-Plasma-Vitronectin stammte von Collaborative Biomedical Products.
Die α_vβ₃-Integrin-Reinigung aus HUVE-Zelllysaten wurde wie in Pytela et al., Meth. Enzymol. 144, 475–489 (1987), beschrieben durchgeführt. Zusammenfassend wur den 10⁸ Zellen in 1 ml PBS lysiert, das 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM PMSF und 100 mM Octylglucosid enthielt. Das Lysat wurde vier Mal durch eine 0,5-ml-Säule geschickt die RDGSPK-Sepharose (hergestellt aus der Bromcyan-aktivierten Sepharose CL 4B, wie beschrieben in S.C.-T. Lam, J. Biol. Chem. 267, 5649–5655 (1992)) enthielt. Die Säule wurde mit 10 ml des Lysepuffers gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit 2 ml desselben Puffers, der 1 mM RGDS-Peptid enthielt, bei Raumtemperatur eluiert. Das α_vβ₃-Integrin wurde gegen PBS dialysiert, das 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM Octylglucosid und 0,1 mM PMSF enthielt, wobei der Dialysepuffer drei Mal ausgetauscht wurde, um das RGDS-Peptid zu entfernen. Das Protein wurde in Aliquoten bei –70°C gelagert. Die Reinheit des Integrins wurde mittels SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen bestimmt, gefolgt von Silberfärbung. Western-Blotting mit Anti-CD47-Antikörper zeigte, dass dieses α_vβ₃-Integrin-Präparat keinerlei Integrin-assoziierten Proteine enthält.
Der Integrin-Bindungstest wurde gemäß den Offenbarungen in Brooks et al., Cell 85, 683–693 (1996), und S.C.-T. Lam (1992) entwickelt. Ungefähr 50 ng des Integrins in einem Gesamtvolumen von 50 μl wurden pro Well immunologischer 96-Well-Pro-Bind-Platten (Falcon) zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Unspezifische Stellen wurden mit 20 mg/ml BSA im selben Puffer blockiert und vier Mal in diesem Puffer gewaschen. Die behandelten Platten wurden mit 1 μg/ml Cyr61 oder 0,1 μg/ml Vitronectin 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. EDTA (5 mM), RGDS-Peptid (0,5 mM) und blockierende Antikörper wurden entweder mit dem immobilisierten Integrin 1 Stunde lang vor der Zugabe des Protein-Liganden vorinkubiert oder gemeinsam mit dem Liganden zugegeben. Die Endverdünnung der LM609-Aszitesflüssigkeit betrug 1 : 200. Gebundene Proteine wurden durch spezifische polyklonale Antisera (Anti-Cyr61-Antiserum wurde 1 : 500 und Anti-Vitronectin-Antiserum wurde 1 : 1000 in PBS verdünnt, das 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 5 mg/ml BSA enthielt), gefolgt von einem sekundären Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugat (1 : 20.000 im selben Puffer) detektiert. Die Platten wurden nach jeder Inkubation vier Mal mit 1 mM CaCl₂ und 1 mM MgCl₂ enthaltendem PBS gespült. Meerrettichperoxidase (HRP) wurde mit einem HRP-Immuntestset (Bio-Rad Laboratories) detektiert. Die kolorimetrische Reaktion wurde 15–20 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickelt, durch Zugabe von H₂SO₄ gestoppt, und die Absorption bei 450 nm wurde gemessen. Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung werden verstehen, dass eine Vielzahl von Techniken anstelle des beispielhaften enzymgebundenen immunologischen Ansatzes eingesetzt werden könnten. Beispielsweise könnten andere Marker, wie z. B. Radiomarker, fluoreszierende Verbindungen und dergleichen, z. B. kovalent an einen Antikörper oder ein anderes Mittel, welches das Peptid von Interesse, wie z. B. Cyr61, erkennt, gebunden werden.
Die Ergebnisse der Integrin-Bindungstests zeigten, dass Vitronectin und Cyr61 an das immobilisierte Integrin banden. Weiters war sowohl die Cyr61- als auch die Vitronectin-Bindung an α_vβ₃ saturierbar. Die Konzentration von Cyr61, bei der Sättigung erreicht wurde, war signifikant höher als die für Vitronectin erforderliche Konzentration zur Sättigung. Dieser Unterschied könnte eine niedrigere Affinität von α_vβ₃ für Cyr61 im Vergleich zu Vitronectin widerspiegeln, was im Einklang mit den Ergebnissen von Zelladhäsionstests steht, die zeigen, dass HUVE-Zellen auf konzentrationsabhängige Weise an Vitronectin und schwächer an Cyr61 anhaften (siehe unten). Die Spezifität der Wechselwirkung wurde durch Blockieren der Ligandenbindungsstelle des Integrins untersucht, und zwar unter Anwendung einer beliebigen von mehreren Techniken, einschließlich Verarmung an zweiwertigen Kationen, RGDS-Peptid-Konkurrenz und LM609-Antikörper-Hemmung. Die Wechselwirkung beider Proteine (Cyr61 und Vitronectin) mit α_vβ₃ wurde von EDTA, RGDS-Peptid und LM609-Antikörper gehemmt. Diese Eigenschaften der Cyr61-Wechselwirkung mit α_vβ₃ standen ferner im Einklang mit den Ergebnissen des Zelladhäsionstests und zeigten an, dass die HUVE-Zellen-Adhäsion an Cyr61 durch die direkte Wechselwirkung von Cyr61 mit dem α_vβ₃-Integrin vermittelt wurde.
Außerdem induziert Cyr61 Fokaladhäsion, d. h. Zelloberflächen-Fokuspunkte für Zytoskelettanhaftungen. Die Fokaladhäsion wird durch Zelloberflächen-Proteinkomple xe oder -cluster bewirkt. Diese Proteincluster sind komplex und umfassen eine Reihe von Rezeptoren aus der Integrin-Familie und eine Reihe von Proteinkinasen. Die Induktion der Fokaladhäsion durch Cyr61 widerspiegelt sich in der Fähigkeit von Cyr61, spezielle Elemente dieser Zelloberflächencluster zu induzieren. Beispielsweise induziert Cyr61 die Phosphorylierung der Fokal-Adhäsion-Kinase, einem 125-kDa-Polypeptid, und Paxillin, einem weiteren Protein, das bekanntermaßen an den Fokaladhäsions-Zelloberflächenproteinkomplexen beteiligt ist. Darüber hinaus haben indirekte Immunfluoreszenz-Untersuchungen gezeigt, dass Cyr61 an einen Rezeptor (siehe oben) in Fokaladhäsions-Plaques gebunden wird. Die Plaques ihrerseits sind charakteristisch für Fokaladhäsions-Proteinkomplexe. Fokal-Adhäsion-Kinase, Paxillin und α_vβ₃-Integrin sind gemeinsam an den Fokaladhäsions-Plaques lokalisiert, die durch Cyr61-induzierte Fokaladhäsionskomplexbildung produziert wurden. Diese Fokaladhäsions-Proteinkomplexe binden Cyr61 an der Zelloberfläche; die Komplexe heften sich auch innen an das Zytoskelett. Daher sind Maus-Cyr61 und Human-Cyr61 (siehe unten) zum Teil Adhäsionsmoleküle, eine Eigenschaft, die Cyr61 von herkömmlichen Wachstumsfaktoren unterscheidet. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass das α_vβ₃-Integrin in Verbindung mit Cyr61 verwendet werden kann, um auf Modulatoren der Cyr61-Bindung an seinen Rezeptor zu screenen. In einer Ausführungsform wird das Integrin immobilisiert und entweder gegenüber (a) Cyr61 und einem mutmaßlichen Modulator der Rezeptorbindung oder (b) Cyr61 alleine ausgesetzt. Anschließend wird gebundenes Cyr61 detektiert, z. B. durch Anti-Cyr61-Antikörper, der mittels Techniken markiert ist, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z. B. Radiomarkierung, Fluoreszenzmarkierung und die Verwendung von Enzymen, die kolorimetrische Reaktionen katalysieren. Ein Förderer der Cyr61-Bindung an seinen Rezeptor würde die Bindung von Cyr61 im Vergleich zur Bindung durch Cyr61 alleine erhöhen (und ein Inhibitor würde Cyr61 vermindern).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde die Wirkung von Maus-Cyr61 auf die Zellmorphogenese durch einen Zellausbreitungstest ermittelt. Polysty rol-Petrischalen wurden mit 2 ml einer 10-μg/ml-Lösung von Cyr61 oder Fibronectin in PBS mit 0,1% BSA beschichtet und wie oben beschrieben behandelt. Eine dritte Platte wurde mit BSA behandelt und diente als Kontrolle. Jede Platte erhielt 7 × 10⁶ Zellen und wurde 2 Stunden lang inkubiert. Die Zellausbreitung wurde durch Mikroskopie bei 100facher Vergrößerung analysiert. Die Ergebnisse zeigen an, dass Maus-Cyr61 die HUVE-Zellausbreitung ungefähr im selben Ausmaß wie Fbronectin induziert. Die effiziente Anhaftung (siehe oben) und Ausbreitung von Zellen auf Maus-Cyr61-beschichteten Substraten zeigte an, dass Cyr61 mit einem signaltransduzierenden Zelloberflächenrezeptor wechselwirken könnte, was zu einer Kaskade von Zytoskelett-Umordnungen und zu einer möglichen Bildung von Fokalkontakten führt. Folglich können Cyr61 und Cyr61-verwandte Polypeptide bei der Kontrolle der Zelladhäsion zweckdienlich sein, z. B. bei Zelladhäsionsereignissen, die metastasierende Krebszellen, Organreparatur und -regenerierung oder Chondrozyten-Besiedelung von Prothesenimplantaten begleiten, wie unten erörtert wird.
Im Gegensatz zu Maus-Cyr61, das die Anhaftung sowie Migration von HUVE-Zellen vermittelt, vermittelte hCyr61 die Zelladhäsion, nicht jedoch die Ausbreitung von HUVE-Zellen. Immunologische Platten (96-Well-ProBind-Testplatten, Falcon) wurden mit 0,1–30 μg/ml hCyr61, Fbronectin (Gibco BRL) oder Vitronectin (Gibco BRL) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,1% Protease-freies BSA (Sigma) enthielt, 16 Stunden lang bei 4°C beschichtet. Die Wells wurden mit 1% BSA in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und mit PBS gewaschen. HUVE-Zellen wurden mit 0,02% EDTA in PBS geerntet, zweimal mit serumfreiem F12-Medium gewaschen und in serumfreiem F12 resuspendiert. In einigen Experimenten wurde fbs auf 5–10% zugegeben. Auch wurde in Experimenten mit Vitronectin-beschichteten Platten endogenes Vitronectin durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von polyklonalen Anti-Vitronectin-Antikörpern aus Rindern (Gibco) von fbs entfernt. Norris et al., J. Cell Sci. 95, 255–262 (1990). Die Zellen wurden zu 10⁴ Zellen/Well ausplattiert. Nach zwei Stunden wurden die Zellen mit 4% Paraform aldehyd fixiert, mit Methylenblau gefärbt und wie beschrieben quantifiziert. Oliver et al., J. Cell Sci. 92, 513–518 (1989).
Unter serumfreien Bedingungen vermittelte hCyr61 die Zellanhaftung, nicht jedoch die Ausbreitung von HUVE-Zellen. Die Anhaftung von HUVE-Zellen an hCyr61-beschichtete Platten wurde durch Aufnahme von Serum in das Kulturmedium verstärkt. In Gegenwart von Serum erfolgte die Anhaftung und Ausbreitung von HUVE-Zellen an hCyr61 auf eine ähnliche Weise, wie sie an Fibronectin beobachtet worden ist. Human-Cyr61 förderte die Adhäsion von HUVE-Zellen auf dosisabhängige Weise bei hohen (10%) und niedrigen (0,5%) Serumkonzentrationen. Jedoch war in Gegenwart von 10% fbs der maximale Anteil an Zellen, die bei niedrigerer hCyr61-Konzentration anhafteten, und der Anteil von anhaftenden Zellen höher. Von Human-Cyr61 zeigte sich ebenfalls, dass es mit Vitronectin bei der Förderung der Adhäsion und Ausbreitung von HUVE-Zellen kooperierte. Zwei hauptsächliche Zelladhäsionsproteine, die sich in Säugetier-Seren finden, sind Fibronectin und Vitronectin, die auch als „Serum-Ausbreitungsfaktor" bekannt sind. Für einen Überblick siehe Felding-Habermann et al., Curr. Opin. Cell Biol. 5, 864–868 (1993). Zellanhaftung, -ausbreitung und -wachstum auf Gewebekultur-Kunststoff hängten aus den folgenden Gründen von Vitronectin und nicht von Fibronectin im Serum ab: (1) erhebliche Verarmung von Fibronectin in den fbs-Chargen wegen „Gerinnung" bei 4°C; und (2) Unfähigkeit von Fibronectin, den Kunststoff in Gegenwart einer überschüssigen Menge anderer Serumproteine effizient zu beschichten. Im Gegensatz dazu beschichtete Vitronectin die Kunststoffoberflächen unter denselben Bedingungen effizient.
Es wurde die Fähigkeit von HUVE-Zellen verglichen, in Gegenwart von pseudo-immunverarmtem fbs und Serum, das mit Anti-Rinder-Vitronectin-Antikörpern immunverarmt war, an hCyr61-beschichteten Platten zu haften. HUVE-Zellen hafteten an hCyr61-beschichteten Oberflächen signifikant besser in Gegenwart von löslichem Vitronectin oder pseudo-immunverarmtem fbs als in Gegenwart von serumfreiem Medium oder Medium, das mit Vitronectin-immunverarmtem fbs ergänzt war. Die Zugabe von Vitronectin (30 μg/ml) zu Vitronectin-immunverarmtem Serum stellte die Fähigkeit von HUVE-Zellen zur Anhaftung und Ausbreitung an hCyr61-beschichteten Platten im selben Ausmaß wieder her, wie sie beobachtet wurde, wenn Gesamtserum im Zellanhaftungstest verwendet wurde. Darüber hinaus stellte lösliches Vitronectin alleine bei einer Konzentration, die gleich seiner Konzentration in 10% Serum war (30 μg/ml), das Ausmaß an Zelladhäsion und -ausbreitung auf jenes Ausmaß wieder her, das in Gegenwart von 10% Serum gefunden wurde. Folglich ist Vitronectin eine notwendige und hinreichende Serumkomponente, die zur Adhäsion und Ausbreitung von HUVE-Zellen an hCyr61-beschichteten Kunststoffoberflächen beiträgt. Kontrolluntersuchungen zeigten, dass die Wirkung von Vitronectin nicht auf seine bevorzugte Retention an den Kunststoffplattenoberflächen in Gegenwart von hCYR61 zurückzuführen war.
Außerdem wurde die Anhaftung und Ausbreitung von HUVE-Zellen in Gegenwart einer ansteigenden Menge von Vitronectin untersucht. Die Lösungen zum Beschichten der Platten enthielten ansteigende Mengen Vitronectin (0–10 μg/ml) mit einer festgelegten Menge hCyr61 (10 μg/ml). Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass an den mit den beiden Proteinen beschichteten Platten mehr Zellen anhafteten, als durch Addition der einzelnen Adhäsionskapazitäten von Vitronectin und hCyr61 zu erwarten gewesen wäre. Dieser nicht-additive Anstieg der Adhäsion in Gegenwart von Vitronectin und hCyr61 war nicht auf die höheren Mengen von am Kunststoff adsorbiertem Vitronectin zurückzuführen. Ein ELISA-Test mit Anti-Human-Vitronectin-Antikörpern zeigte, dass die Menge an Vitronectin, die an den gegenüber Vitronectin/hCyr61-Gemisch ausgesetzten Kunststoffplatten adsorbierten, jene von Vitronectin alleine um nicht mehr als 20% überschritt. Dieser Unterschied reicht nicht aus, um den beobachteten Unterschied an Zelladhäsion (3- bis 5fach in verschiedenen Experimenten) zu erklären. Außerdem haftete auch ein höherer Anteil an HUVE-Zellen an das Gemisch von Proteinen an, wenn die Beschichtungslösung verdünntes Vitronectin (2,5 μg/ml) enthielt, als an Platten, die mit höheren Konzentrationen an reinem Vitronectin (10 μg/ml) oder reinem hCyr61 (10 μg/ml) beschichtet waren. Folglich kooperieren Vitronectin und hCyr61 funktionell und bestätigen eine synergistische Wirkung auf die Adhäsion von HUVE-Zellen.
Die Fähigkeit von Fisp12, die Zelladhäsion zu beeinflussen, wurde ebenfalls untersucht. Fisp12-Zellanhaftungstests wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Oliver et al. (1989)) durchgeführt. Immunologische 96-Well-Platten wurden 16 Stunden lang bei 4°C mit 20 μg/ml Cyr61, Fisp12 oder Fibronectin (Gibco BRL) in 0,1 mg/ml BSA enthaltendem PBS beschichtet und mit 10 mg/ml BSA 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. HUVE-Zellen wurden zu 10⁴ Zellen/Well in F12K-Medium mit 10 FBS (Hyclone Laboratories Inc., Logan, Utah) ausplattiert; NIH-3T3-Fibroblasten wurden zu 3 × 10⁴ Zellen/Well ausplattiert, und Mv1Lu-Zellen wurden zu 5 × 10⁴ Zellen/Well in Minimal-Essential-Medium (MEM) mit 10% FBS ausplattiert. Nach einstündiger Inkubation wurden die Zellen fixiert, mit Methylenblau gefärbt und wie beschrieben (Oliver et al. (1989)) quantifiziert. Die Zellausbreitung wurde an Zellen untersucht, die auf mit 2,5 ml einer Lösung von 20 μg/ml Cyr61, Fisp12 oder Fibronectin beschichteten 100-mm-Polystyrol-Petrischalen ausplattiert waren. 10⁷ Zellen wurden auf jeder Platte ausplattiert und die Zellausbreitung 90 Minuten nach Ausplattierung durch Mikroskopie bei 100facher Vergrößerung analysiert.
Die Ergebnisse zeigten an, dass Fisp12 sowie Cyr61, wenn sie auf Kunststoffplatten beschichtet waren, die Anhaftung von drei verschiedenen Zelltypen förderte: HUVE-Zellen, NIH-3T3-Fibroblasten und Nerz-Lungenepithel- (Mv1Lu-) Zellen. Diese Zellen hafteten schlecht an unbeschichteten Kunststoffplatten oder Kunststoffplatten, die mit Rinderserumalbumin beschichtet waren, hafteten jedoch signifikant besser an Platten, die entweder mit Fibronectin, Cyr61 oder Fisp12 beschichtet waren. Die Fähigkeit von Cyr61 oder Fisp12, die Zellanhaftung zu vermitteln, ist vergleichbar mit jener von Fibronectin für alle drei Zelltypen. Während die Fähigkeit von Cyr61, die Zellanhaftung zu vermitteln, bereits früher für Fibroblasten und Endothelzellen nachgewiesen worden ist (Kireeva et al. (1996)), zeigen diese Untersuchungen eine Zell anhaftungsaktivität für Fisp12 sowie Cyr61 in Epithelzellen zusätzlich zu Endothelzellen und Fibroblasten.
Wie die Zellanhaftung von Fibronectin und Cyr61 (Kireeva et al (1996)) wurde die Fisp12-vermittelte Zellanhaftung gehemmt, wenn zum Kulturmedium EDTA zugesetzt wurde. Diese Hemmung wurde durch die Zugabe von überschüssigem MgCl₂ vollständig aufgehoben, was auf die Notwendigkeit von zweiwertigen Kationen für die Fisp12-vermittelte Zellanhaftung hinweist. Zusätzlich zur Zellanhaftung fördert Fisp12 auch die Zellausbreitung. Eine ähnliche Zellausbreitung wurde gefunden, wenn NIH-T3T-Zellen auf Platten, die entweder mit Fibronectin, Cyr61 oder Fisp12 beschichtet waren, ausplattiert wurden, nicht jedoch bei Beschichtung mit BSA. Endothelzellen und Epithelzellen breiteten sich ebenfalls aus, wenn sie auf Fibronectin, Cyr61 oder Fisp12 ausplattiert wurden.
Beispiel 14
Migration von Fibroblasten
Cyr61 beeinflusst ferner Chondrozyten, z. B. die an der Skelettentwicklung beteiligten Fibroblasten. In Speziellen beeinflusst Cyr61 die Entwicklung und möglicherweise die Erhaltung von Knorpel, im Gegensatz zu einer Vielzahl von wachstumsbezogenen Proteinen, die ausschließlich die Entwicklung und Erhaltung des Knochenskeletts beeinflussen. Die chemotaktische Reaktion von NIH-3T3-Zellen auf Maus-Cyr61 wurde unter Verwendung einer modifizierten Boyden-Kammer (Neuroprobe Inc., Katalognummer AP48) untersucht. Grotendorst, Meth. Enzymol. 147, 144–152 (1987). Gereinigtes Cyr61-Protein wurde in Rinderserumalbumin (BSA; 0,2 mg/ml) enthaltendem DMEM reihenverdünnt und zum unteren Well der Kammer zugegeben. Der untere Well wurde dann mit einem Collagen-beschichteten Polycarbonatfilter (8 μm Porendurchmesser; Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) bedeckt. Zellen (6 × 10⁴) wurden dann in den oberen Well eingebracht. Nach 5 Stunden Inkubation (10% CO₂, 37°C) wurde das Filter entfernt und die Zellen unter Verwendung von Wright-Giemsa-Farbstoff (Harleco-Formulierung; EM Diagnostic Systems, Gibbstown, NJ) fixiert und gefärbt. Zellen aus der oberen Oberfläche des Filters wurden dann durch Abwischen mit einem Gewebetupfer entfernt. Die chemotaktische Reaktion wurde durch Zählen der Gesamtzahl migrierender Zellen bestimmt, die in zehn zufällig gewählten Hochleistungs-Mikroskopie-Feldern (400fache Vergrößerung) an der unteren Oberfläche des Filters detektiert wurden. Doppelversuche wurden für jedes Experiment durchgeführt, und das Experiment wurde drei Mal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit der Daten sicherzustellen.
NIH-3T3-Zellen reagierten auf Cyr61 als chemotaktischer Faktor auf dosisabhängige Weise im Boyden-Kammer-Test. Ohne Cyr61 migrierten ungefähr 4,8 Zellen pro Hochleistungs-Feld. In Gegenwart von 0,5 μg/ml Maus-Cyr61 fanden sich ungefähr 5,2 Zellen pro Feld. Wenn die Konzentration von Cyr61 auf 1, 5 und 10 μg/ml erhöht wurde, stieg die mittlere Anzahl migrierender Zellen pro Feld auf 7,5, 18,5 und 18,7. Folglich agiert Maus-Cyr61 als chemisch anziehendes Mittel für Fibroblasten. Die optimale Konzentration für die chemotaktische Aktivität von Cyr61 beträgt in diesem Test 1–5 μg/ml; dieser Konzentrationsbereich steht im Einklang mit den berichteten Bereichen, bei denen andere ECM-Moleküle für eine wirksame chemotaktische Stimulierung sorgen. Beispielsweise weist Thrombospondin bei 5–50 μg/ml eine chemotaktische Wirkung auf Endothelzellen auf (Taraboletti et al., J. Cell Biol. 111, 765–772 (1990)); Fibronectin fungiert ebenfalls als chemotaktisches Mittel bei 1–30 μg/ml (Carsons et al., Role of Fibronectin in Rheumatic Diseases, in: Fibronectin, Mosher (Hrsg.), Academic Press (1989); Carsons et al., Arthritis. Rheum. 28, 601–612 (1985)), wie unter Verwendung ähnlicher Boyden-Kammer-Tests ermittelt wurde. Das Human-Cyr61-Polypeptid kann verwendet werden, um die Chemoattraktion von Fibroblasten auf eine zum Maus-Cyr61 analoge Weise zu bewirken. Vom Human-CTGF ist ebenfalls berichtet worden, dass es die Migration von Nicht-Human-Säugetierzellen, wie z. B. NIH-3T3-Zellen (Maus-Fibroblasten) und BASM-Zellen (Rinder- Aorta-Glattmuskelzellen) stimuliert, wie in US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 7, Zeile 65, bis Spalte 11, Zeile 7, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben wird.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst ein Test für Modulatoren der Zellmigration, wie z. B. der Migration von Chondrozyten, eine Kombination eines mutmaßlichen Modulators der Zellmigration und Cyr61, die dem unteren Well einer Boyden-Kammer zugegeben werden. Als Kontrolle wird Cyr61 gesondert dem unteren Well einer anderen Boyden-Kammer zugegeben. Relative Zellmigrationen werden dann gemessen. Ein Anstieg der Zellmigration in Gegenwart des mutmaßlichen Modulators verglichen mit der Zellmigration als Reaktion auf Cyr61 alleine identifiziert einen Förderer der Chondrozyten-Zellmigration, während eine relative Abnahme der Zellmigration in Gegenwart des mutmaßlichen Modulators einen Inhibitor identifiziert.
Beispiel 15
Migration von Endothelzellen – In-vitro-Tests
Das Endprodukt der In-vitro-Angiogenese ist ein wohldefiniertes Netzwerk von kapillarähnlichen Röhren. Wenn auf Gelmatrizes, z. B. Collagen, Fibrin oder Matrigel-Gelen, kultiviert wird, müssen Endothelzellen zuerst in die Matrix eindringen, bevor reife Gefäße gebildet werden. (Matrigel ist ein komplexes Gemisch von Basalmembran-Proteinen, die Laminin, Collagen Typ IV, Nidogen/Entactin und Proteoglykan-Heparinsulfat mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren umfassen. Kleinman et al., Biochem. 25, 312–318 (1986)). Die invasiven Strukturen sind Stränge, die letztlich anastomosieren, um die gefäßähnlichen Strukturen auszubilden. Die angiogene Wirkung von Human-Cyr61 auf konfluente Monoschichten von Human-Nabelvenen-Endothelzelen wird durch Aussäen der Zellen auf dreidimensionalen Collagen- oder Fibrin-Gelen in Gegenwart oder Abwesenheit von Cyr61 ermittelt. HUVE-Zellen dringen nicht spontan in solche Gele ein, tun dies jedoch bei Induktion durch solche Mittel wie Tumor-Promotoren.
Collagen-Gele wurden hergestellt, indem zunächst Typ-I-Collagen (Collaborative Research Inc., Bedford, MA) in einer sterilen 1 : 1000-Verdünnung (Vol./Vol.) von Eisessig (300 ml pro Gramm Collagen) solubilisiert wurde. Die resultierende Lösung wurde durch eine sterile Dreifach-Gaze filtriert und bei 16.000 × g 1 Stunde lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde gegen 0,1X-Eagle's-Minimal-Essential-Medium (MEM; Gibco-BRL Inc.) dialysiert und bei 4°C gelagert. Gele von rekonstituierten Collagenfasern wurden durch schnelles Erhöhen von pH-Wert und Ionenstärke der Collagenlösung hergestellt. Die Einstellungen von pH und Ionenstärke wurden durch schnelles Mischen von 7 Volumina kalter Collagenlösung mit einem Volumen 10X-MEM und 2 Volumina Natriumbicarbonat (11,76 mg/ml) in einer sterilen Flasche erzielt. Die Lösung wurde auf Eis gehalten, um die sofortige Gelierung zu verhindern. Das kalte Gemisch wurde in 18-mm-Gewebekulturwells verteilt und 10 Minuten lang bei 37°C gelieren gelassen.
Fibringele wurden durch Auflösen von Fibrinogen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) unmittelbar vor der Verwendung in Calcium-freiem MEM hergestellt, um eine Endkonzentration von 2,5 mg Protein/ml zu erreichen. Die Gerinnung wurde durch schnelles Mischen von 1,35 ml Fibrinogen-Lösung mit 15 μl 25 U/ml Thrombin (Sigma Chemical Co.) enthaltendem 10X-MEM in einem Kunststoffröhrchen ausgelöst. Das Gemisch wurde sofort in 18-mm-Gewebekulturwells übertragen und für ungefähr 2 Minuten lang bei 37°C gelieren gelassen.
In manchen Wells wurde Cyr61 vor der Gelierung in die Gelmatrix gemischt (Endkonzentration 10 μg/ml), während sich in anderen Wells Cyr61 nicht in der Gelmatrix befand, sondern als Teil des Nährmediums zugegeben wurde (ähnliche Konzentrationsbereiche wie in der Matrix), nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten. HUVE-Zellen wurden zu 5 × 10⁴ Zellen pro Well in 10% Fötalrinderserum, 100 μg/ml Heparin und 30 μg/ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor enthaltendem Ham-F12K-Medium (Gibco-BRL Inc.) auf die Gelmatrixoberfläche gesät. Sobald die Zellen Kon fluenz erreichten, wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit frischem Medium ohne Endothelzellen-Wachstumsfaktor versorgt. Manche Kulturen erhielten gereinigtes rekombinantes Cyr61, während andere Cyr61 und polyklonale Anti-Cyr61-Antikörper erhielten. Folglich umfasste die Reihe von Kulturen bei Konfluenz Folgendes: a) Kulturen ohne Cyr61; b) Kulturen mit Cyr61 im Inneren der Matrix; c) Kulturen mit Cyr61, welches das Medium ergänzte; und d) Kulturen mit Cyr61, welches das Medium gemeinsam mit polyklonalen Anti-Cyr61-Antikörpern ergänzte.
Die Invasion der Gelmatrix wurde ungefähr 4–7 Tage nach Behandlung der konfluenten Kulturen quantifiziert. Zufällig gewählte Felder einer Größe von 1,0 mm × 1,4 mm wurden in jedem Well phasenkontrastmikroskopisch mit einem invertierten Zeiss-Axiovert-Fotomikroskop fotografiert. Fotografien wurden auf einer einzigen Ebene unter der Oberflächen-Monoschicht aufgenommen. Die Invasion wurde durch Messen der Gesamtlänge aller Zellstränge quantifiziert, die unter die Oberflächen-Monoschicht eindrangen. Ergebnisse wurden als mittlere Länge in Mikrometer pro Feld für zumindest 3 zufällig gewählte Felder aus jedem von zumindest drei gesonderten Experimenten berechnet.
Um das Netzwerk von Strängen im Inneren der Matrix für die Bildung kapillarähnlicher Röhren zu untersuchen, wurden Kulturen in situ über Nacht mit 2,5% Glutaraldehyd und 1% Gerbsäure in 100 mM Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4, fixiert. Die Kulturen wurden dann intensiv in 100, mM Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4, gewaschen. Die Gele wurden in 2 mm × 2 mm große Stücke geschnitten, in 1% Osmiumtetroxid in Veronalacetatpuffer (um Gewebequellung zu minimieren; siehe Hayat, in: Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications 1, Litton Educational Publishing Inc., 38 (1970)) 45 Minuten lang nachfixiert, im Ganzen mit 0,5% Uranylacetat in Veronalpuffer 45 Minuten lang gefärbt, durch Aussetzen gegenüber einer abgestuften Ethanolreihe entwässert und in flachen Formen in Epon eingebettet. Semidünnschnitte wurde quer zur Kulturebene mit einem Ultramikrotom geschnitten, mit 1% Toluidinblau gefärbt und unter Durchlicht mit einem Axiophot-Fotomikroskop (Zeiss) fotografiert.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein mutmaßlicher Modulator der Angiogenese mit Cyr61 kombiniert und die Kombination wie vorher vor oder nach der Ausbildung eines Gels zugegeben. In dieser Ausführungsform wird eine Kontrolle durch Verwenden von Cyr61 alleine eingeführt. Die Migration von Zellen als Reaktion auf den mutmaßlichen Modulator und Cyr61 wird dann mit der Migration von Zellen als Reaktion auf Cyr61 alleine verglichen. Ein Förderer oder positiver Effektor wird die Zellmigration erhöhen, während ein Inhibitor oder negativer Effektor die Zellmigration vermindern wird.
In einem alternativen In-vitro-Test für angiogene Aktivität wurde ein Test für Endothelzellen-Migration entwickelt. Von diesem Chemotaxis-Test ist gezeigt worden, dass er die Wirkungen von Cyr61-Konzentrationen in der Größenordnung von Nanogramm pro Milliliter detektiert. Primäre mikrovaskuläre Human-Endothelzellen (HMVEC PO51; Clonetics, San Diego, CA) wurden in DME mit 10% Donor-Kälberserum (Flow Laboratories, McLean, VA) und 100 μg/ml Endothelzellen-Mitogen (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) gehalten. Die Zellen wurden zwischen Passagen 10 und 15 verwendet. Um die Migration zu messen, wurden die Zellen für 24 Stunden in 0,1% BSA enthaltendem DME ausgehungert, geerntet, in DME mit 0,1% BSA resuspendiert und zu 1,75 × 10⁴ Zellen/Well an der unteren Oberfläche eines gelatinierten 0,5-μm-Filters (Nucleopore Corporation, Pleasanton, CA) in einer invertierten modifizierten Boyden-Kammer ausplattiert. Nach 1–2 Stunden bei 37°C, währenddessen die Anhaftung der Zellen an das Filter ermöglicht wurde, wurde die Kammer in ihre normale Position umgedreht. Zum oberen Well gesonderter Kammern wurde basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (eine positive Kontrolle), Cyr61 oder eine negative Kontrolllösung (konditioniertes Medium, dem bekanntermaßen Chemoattraktoren fehlen, oder DME plus BSA, siehe unten) in Konzentrationen im Bereich von 10 ng/ml bis 10 μg/ml zugegeben. Die Kammern wurden dann 3–4 Stun den lang bei 37°C inkubiert, um Migration zu ermöglichen. Die Kammern wurden zerlegt, die Membranen fixiert und gefärbt und die Anzahl von Zellen, die zur Oberseite des Filters migriert sind, in 3 Hochleistungs-Feldern bestimmt. Tolsma et al., J. Cell Biol. 122, 497–511 (1993) (durch Verweis aufgenommen) und darin zitierte Arbeiten. DME mit 0,1% BSA wurde als negative Kontrolle verwendet, und es wurde entweder bFGF (10 ng/ml) oder konditioniertes Medium aus angiogenen Hamster-Zelllinien (20 μg/ml Gesamtprotein) als positive Kontrolle verwendet. Rastinejad et al., Cell 56, 345–355 (1989). Jede Probe wurde in vierfacher Ausführung (Testverbindung, wie z. B. Cyr61, positive Kontrolle, konditioniertes Medium als negative Kontrolle und DME plus BSA als negative Kontrolle) in einem einzigen Experiment getestet; Experimente wurden zumindest zweimal wiederholt.
Um den Vergleich von Experimenten zu ermöglichen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, sind die Migrationsdaten als prozentuelle maximale Migration gegenüber der positiven Kontrolle angegeben, die nach Subtraktion der in Gegenwart von DME plus BSA beobachteten Hintergrundmigration beobachtet wurde. Testverbindungen, die die Zufallsbewegung von Endothelzellen unterdrückten, zeigten einen negativen Wert für die prozentuelle Migration. Sehr hohe Konzentrationen von Thrombospondin (TSP) bewirkten die Ablösung von Endothelzellen von der Membran. Die Ablösung wurde durch Zählen der Zellen an der Unterseite der Membran detektiert. Wenn der Zellverlust 10% überschritt, wurde die Anzahl migrierter Zellen um diesen Verlust korrigiert. Die Ergebnisse zeigen an, dass 0,01–10 μg/ml bFGF die Migration von konstanten 92 Zellen je drei Hochleistungs-Mikroskopfeldern induzierte. Migration in Gegenwart von Cyr61 offenbarte eine stärkere Konzentrationsabhängigkeit. Bei 10 ng/ml induzierte Cyr61 im Mittel die Migration von 64 Zellen je drei untersuchten Hochleistungsfeldern. Bei 100 ng/ml Cyr61 fanden sich ungefähr 72 Zellen in drei Feldern; bei 1 μg/ml Cyr61 ist ein Maximum von 87 Zellen migriert; bei ungefähr 7 μg/ml Cyr61 wurden ungefähr 61 Zellen beobachtet; und bei 10 μg/ml Cyr61 fanden sich ungefähr 57 Zellen, die migriert sind. Die negative Kontrolle zeigte ein konstantes Grundausmaß von Endothelzellen-Migration von 53 Zellen je drei Hochleistungs-Mikroskopfeldern. Zusätzlich zu diesen Ergebnissen besteht eine perfekte Korrelation der Ergebnisse aus diesem In-vitro-Test und der Ergebnisse aus dem unten beschriebenen In-vivo-Hornhaut-Test.
Um die Toxizität zu beobachten, wurden Endothelzellen mit jeder der getesteten Verbindungen in einem Konzentrationsbereich unter Bedingungen behandelt, die mit jenen der im Migrationstest verwendeten identisch waren. Die Zellen wurden dann mit Trypanblau gefärbt, und es wurden die Trypanblau ausschließenden Zellen gezählt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen lebensfähig blieben und dass die Hemmung der Migration nicht auf Toxizität zurückzuführen war. Wo zweckdienlich, wurden Endothelzellen 36–48 Stunden lang mit Peptiden zu 20 μM in DME mit 0,1% BSA vor der Verwendung in den Migrationstests vorbehandelt. Die Toxizität wurde während dieser Zeitspanne ebenfalls getestet und erwies sich als vernachlässigbar.
Die Fähigkeit von Cyr61, Matrix-Invasion und Röhrenbildung durch HUVE-Zellen zu induzieren, sowie die Fähigkeit von Cyr61, die Migration von mikrovaskulären Human-Endothelzellen zu induzieren, belegt die angiogenen Eigenschaften dieses Proteins. Es wird erwartet, dass andere Elemente der ECM-Signalmolekül-Familie Cystein-reicher Proteine, wie z. B. Fisp12 und CTGF, ähnliche Eigenschaften aufweisen, die in Verfahren der Erfindung zum Screenen auf angiogene Bedingungen und Modulieren angiogener Bedingungen verwendet werden können. Im Speziellen kann ein gewöhnlich Fachkundiger auf dem Gebiet der Erfindung nachvollziehen, dass ein In-vitro-Test für angiogene Inhibitoren den oben beschriebenen Test umfasst und eine wirksame Menge Cyr61 mit oder ohne Kandidat-Inhibitor einschließt.
Beispiel 16
Migration von Endothelzellen – ein In-Vitro-Test für Angiogenese-Inhibitoren
Die Aufnahme einer wirksamen Menge eines ECM-Signalmoleküls, wie z. B. Cyr61, in den im vorhergehenden Beispiel beschriebenen In-vitro-Migrations- (d. h. Chemotaxis-) Test stellt einen Test bereit, der zur Detektion von Inhibitoren von ECM-Signalmolekülen und Angiogenese konstruiert ist. Wegen der entscheidenden Rolle der Neovaskularisierung in solchen Prozessen wie Wachstum und Metastase massiver Tumoren wäre die Entwicklung von Tests zur Detektion von Verbindungen zweckdienlich, die diese Prozesse antagonisieren könnten.
Der oben beschriebene In-vitro-Migrationstest wurde adaptiert, so dass er ein ECM-Signalmolekül, Cyr61, umfasste. Cyr61 wurde zu 1 μg/ml aufgenommen, das sich in Titrationsuntersuchungen als optimale Dosis erwies. Wie im vorhergehenden Beispiel wurden mikrovaskuläre Human-Endothelzellen (Clonetics) verwendet. In einer der Testserien wurden mehrere Kohlenhydrate und Kohlenhydratderivate analysiert. Diese Verbindungen umfassten 10 mM Mannose, 10 mM Mannose-6-phosphat und 10 mM Galactose. Ergebnisse dieser Tests zeigten, dass Cyr61 plus Mannose ungefähr 73 Zellen pro Satz von drei Hochleistungs-Mikroskopfeldern (siehe oben) lieferte. Cyr61 plus Galactose induzierte die Migration von ungefähr 74 Zellen pro Satz von drei Hochleistungsfeldern. Jedoch lieferte Cyr61 plus Mannose-6-phosphat ungefähr 2 migrierende Zellen für jeden Satz von drei untersuchten Hochleistungsfeldern. Kontrollexperimente zeigen, dass die Hemmung der Cyr61-Aktivität durch Mannose-6-phosphat spezifisch ist.
Die angiogene Aktivität von basischem FGF (10 ng/ml) wurde ebenfalls wie oben beschrieben mit und ohne Mannose-6-phosphat getestet. In Gegenwart von 10 mM Mannose-6-phosphat induzierte bFGF die Migration von 51 Zellen pro Satz von drei Hochleistungsfeldern; in dessen Anwesenheit induzierte bFGF die Migration von un gefähr 52 Zellen. Wenn jedoch entweder Cyr61 oder Insulin-Wachstumsfaktor II (IGF-II) getestet wurden, verminderte Mannose-6-phosphat die Anzahl migrierender Zellen von ungefähr 48 bzw. 47 Zellen auf ungefähr 12 bzw. 11 Zellen. Die Wirkung von Mannose-6-phosphat auf die IGF-II-Aktivität war erwartet, da Mannose-6-phosphat bekanntermaßen mit IGF II um ihren gemeinsamen Rezeptor (den IGF-II-Rezeptor) konkurrieren. Folglich hemmt Mannose-6-phosphat spezifisch die chemotaktische Aktivität von Cyr61 an Human-Endothelzellen. Darüber hinaus ist Mannose-6-phosphat wegen der im Wesentlichen perfekten Korrelation zwischen In-vitro-Migrationstest und In-vivo-Angiogenese-Test (unten beschrieben) als Inhibitor der Angiogenese auf Basis der Ergebnisse des hierin offenbarten Tests identifiziert worden. Demgemäß sieht die Erfindung ein Verfahren der Angiogense-Hemmung vor, das den Schritt des Verabreichens eines Inhibitors der angiogenen Aktivität von Cyr61, wie z. B. Mannose-6-phosphat, umfasst. Tests wie der oben beschriebene können ferner verwendet werden, um auf andere Inhibitoren der Angiogenese zu screenen, die bei der Behandlung von Krankheiten, die mit Angiogenese in Verbindung stehen, wie z. B. Krebs, und Krankheiten des Auges, die von Neovaskularisierung begleitet sind, zweckdienlich sein können.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren des Screenings auf Modulatoren der Angiogenese einen Vergleichstest. Ein Satz von Bedingungen umfasst die Exposition von Zellen mit einer Kombination von Cyr61 und einem mutmaßlichen Modulator der Zellmigration. Als Kontrolle wird ein Paralleltest durchgeführt, der Zellen gegenüber Cyr61 alleine aussetzt. Ein Förderer der Zellmigration erhöht die Rate der In-vitro-Zellmigration im Vergleich zur Migrationsrate in Gegenwart von Cyr61 alleine; das Gegenteil trifft für einen Inhibitor der Chemoattraktionsfähigkeit von Cyr61 zu.
Beispiel 17
Migration von Endothelzellen – ein In-vivo-Test
Ein In-vivo-Test für Endothelzellen-Migration ist ebenfalls entwickelt worden. Im Allgemeinen steht das Testprotokoll mit der Offenbarung von Tolsma et al. (1993) im Einklang. Um die mit der Bildung von Granulationsgewebe (d. h. das neu gebildete, proliferative, fibroblastische Hautgewebe um die Wunden während der Heilung) in Verbindung stehende Angiogenese zu ermitteln, wurden Schwammimplantate wie früher beschrieben (Fajardo et al., Lab. Invest. 58, 718–724 (1988)) verwendet. Polyvinylalkohol-Schaumstoffscheiben (10 mm Durchmesser, 1 mm Dicke) wurden hergestellt, indem zunächst ein Kernstück des Schwamms von 2 mm Durchmesser entfernt wurde. PBS oder ein RGDS-Peptid (andere mögliche Testverbindungen umfassen Fragmente von Cyr61, RGDS-Peptid, kleine Moleküle, wie z.B Mannose-6-phosphat) wurden dem Schwammkernstück zu 100 μM zugegeben, das dann mit 5 μl sterilem Hydron (Interferon Sciences, New Brunswick, NJ) beschichtet wurde. Nach Verfestigung wurde der beschichtete Kern in das Zentrum des Schwamms zurückgesetzt, der dann an beiden Seiten mit 5-μm-Filtern bedeckt und mit Klebstoff (Millipore Corp., Bedford, MA) gesichert wurde. Eine Kontrolle und eine Testscheibe wurden dann subkutan in den Unterleib anästhetisierter weiblicher Balb/c-Mäuse implantiert, wo Granulationsgewebe in den freien Rand der Scheibe eindringen konnte. Die Wunden wurden mit Autoclips verschlossen und die Tiere ungestört belassen, bis sie getötet wurden.
Quantitative Schätzungen der Thymidin-Inkorporation in situ in die Endothelzellen in den Scheiben wurden wie früher beschrieben erhalten (Polverini et al., J. Immunol. 118, 529–532 (1977)). Schwammimplantate wurden an Tagen 5, 7, 10 und 14 nach Implantation beurteilt. Dreißig Minuten vor der Tötung wurde den Mäusen eine [³H]-Thymidin in Kochsalzlösung (spezifische Aktivität 6,7 Ci/mM; New England Nuclear/Du Pont, Wilmington, DE) enthaltende Lösung im Ausmaß von 1 μCi pro Gramm Körpergewicht injiziert. Die Schwämme wurden entfernt und flächenseitig eingebettet, um einen gleichmäßigen Schnitt des gesamten Umfangs zu erhalten. Die Gewebe wurden in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, in einer abgestuften Alkoholreihe entwässert und in Glykolmethacrylat (Polysciences, Miles, IL) eingebettet. Autoradiogramme wurden durch Eintauchen der auf säuregereinigten Glasobjektträgern montierten Schnitte in NTB-Emulsion Typ 2 (Eastman Kodak) hergestellt. Nach Exposition für 4 Wochen bei 4°C wurden die Autoradiogramme in D-19-Entwickler der halben Stärke entwickelt, in Kodak-Rapid-Fixierer fixiert und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Quantifizierung der Endothelzellen-Markierung wurde durch Zählen aller Endothelzellen, die Kapillaren und Venolen beschichteten, die sich von der Peripherie zum Zentrum des Schwamms erstreckten, durch Rektilinearscanning unter Ölimmersion (× 1.000) durchgeführt. Insgesamt 500–700 Endothelzellen wurden in jedem der beiden Schwämme gezählt, die entweder PBS, TSP oder Peptidfragmente (d. h. Thombospondin-Fragmente) enthielten. Die Zellen wurden als markiert betrachtet, wenn fünf oder mehr Körner über dem Kern detektiert wurden. Der prozentuelle Anteil markierter Zellen wurde berechnet, und es wurde eine Chi-Quadrat-Analyse der von Kontrolle und Schwämmen des Experiments hergeleiteten Daten durchgeführt.
Die Ergebnisse des vorangegangenen Tests zeigten, dass Thrombospondin-Fragmente den Angiogenese-Prozess hemmen konnten. Allgemeiner gesprochen würde ein Fachkundiger auf dem Gebiet der Erfindung erkennen, dass der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sich auf solche In-vivo-Tests auf mutmaßliche Modulatoren von ECM-Signalmolekül-Aktivitäten erstreckt, wie z. B. die chemotaktische Fähigkeit von Cyr61, die Zellmigration zu induzieren. Wie mit anderen Tests der Erfindung umfasst ein Vergleichstest das Aussetzen von Zellen in vivo gegenüber einem Schwamm, der mit Cyr61 in Gegenwart oder Abwesenheit eines mutmaßlichen Modulators der Cyr61-Aktivität beladen ist. Im Anschluss an die Implantation, Inkubation und Entfernung werden die relativen Raten der Zellmigration bestimmt. Ein Förderer der Cyr61-Aktivität wird die Zellmigrationsrate im Vergleich zur von Cyr61 alleine in duzierten Zellmigration erhöhen; ein Inhibitor wird die Zellmigrationsrate im Vergleich zum Ausmaß, das Cyr61 allein zugeschrieben werden kann, erniedrigen.
Beispiel 18
Mitogen-Potenzierung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung verstärkte Maus-Cyr61 die mitogene Wirkung von Wachstumsfaktoren auf Fibroblasten und Endothelzellen. Wenn NIH-3T3-Fibroblasten oder HUVE-Zellen mit einer nicht sättigenden Dosis von entweder basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) oder Blutplättchen-hergeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF-BB) behandelt wurden, erhöhte die Zugabe von Maus-Cyr61 signifikant die Inkorporation von radimarkiertem Thymidin im Vergleich zu Zellen, die mit den Wachstumsfaktoren alleine behandelt worden sind. Der Thymidin-Inkorporationstest ist eine Standardtechnik, um zu bestimmen, ob Zellen aktiv wachsen, indem das Ausmaß ermittelt wird, in dem Zellen in die S-Phase eingetreten sind und DNA synthetisieren. Die Cyr61-Verstärkung von bFGF- oder PDGF-BB-induzierter Thymidin-Inkorporation war dosisabhängig und erforderte eine Minimalkonzentration von 0,5 bis 1,0 μg/ml rekombinantem Protein für jeden Zelltyp. Die Verstärkung der DNA-Synthese durch Cyr61 wurde durch die Zugabe von spezifischem Anti-Cyr61-Antiserum gehemmt.
Im Spezielleren wurden NIH-3T3-Fibroblastenzellen auf 24-Well-Platten zu 3 × 10⁴ Zellen/Well ausplattiert und in DMEM mit 10% Fötalrinderserum (Intergen Co., Purchase, NY) 3–4 Tage lang gezüchtet und mit 0,2% FBS enthaltendem Medium für die folgenden 48 Stunden inkubiert. Die folgenden Verbindungen wurden dann zu den ausplattierten Zellen in den in Klammern angegebenen Endkonzentrationen in frischem, 0,2%iges fbs und [³H]-Thymidin (1 μCi/ml Endkonzentration; ICN Biochemicals Inc., Costa Mesa, CA), bFGF (15 ng/ml), PDGF-BB (30 ng/ml) und Maus-Cyr61 (0,5–5 μg/ml) enthaltendem DMEM zugegeben. Diese Verbindungen wurden den ein zelnen Platten nach folgendem Muster zugegeben: 1) keine Ergänzung; 2) Maus-Cyr61; 3) bFGF; 4) Maus-Cyr61 und bFGF; 5) PDGF-BB; und 6) Maus-Cyr61 und PDGF. Nach 18–20 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 10% Trichloressigsäure fixiert. DNA wurde in 0,1 N NaOH gelöst und die Thymidin-Inkorporation bestimmt. Die Ergebnisse zeigten an, dass Maus-Cyr61 in Abwesenheit eines Wachstumsfaktors die mittels Tritium-Thymidin-Inkorporation gemessene DNA-Synthese nicht stimulierte. Ohne irgendwelche Ergänzungen inkorporierten 3T3-Zellen ungefähr 1,8 × 10⁴ cpm [³H]-Thymidin in Gegenwart und Abwesenheit von Cyr61. Zellen, die gegenüber bFGF alleine ausgesetzt wurden, inkorporierten ungefähr 1,2 × 10⁵ cpm; mit bFGF und Maus-Cyr61 kontaktierte Zellen inkorporierten 2 × 10⁵ cpm. Zellen, die PDGF-BB erhielten, inkorporierten etwa 1,2 × 10⁵ cpm; und Zellen, die gegenüber PDGF-BB und Maus-Cyr61 ausgesetzt wurden, inkorporierten etwa 2,4 × 10⁵ cpm. Daher fungierte Maus-Cyr61 selbst nicht als Mitogen, potenzierte jedoch die mitogene Aktivität von bFGF und PDGF-BB, zwei bekannten Wachstumsfaktoren.
Die Fähigkeit von Maus-Cyr61, die mitogene Wirkung von verschiedenen bFGF-Konzentrationen zu potenzieren, offenbarte auch die Notwendigkeit eines Schwellenwerts für den Wachstumsfaktor. Human-Nabelvenen-Endothelzellen wurden im Wesentlichen wie oben für 3T3-Zellen beschrieben ausplattiert und einer konstanten Menge Maus-Cyr61 ausgesetzt; Kontrollen erhielten kein Cyr61. Verschiedene Platten wurden dann verschiedenen bFGF-Konzentrationen ausgesetzt, die eine Reihe von bFGF-Konzentrationen im Bereich von 0–10 ng/ml umfassten. Nach Züchtung der Kultur in Gegenwart von [³H]-Thymidin für 72 Stunden zeigten gegenüber 0–0,1 ng/ml bFGF ausgesetzte Zellen ein Basislinienniveau von Thymidin-Inkorporation (ungefähr 4 × 10² cpm) in Gegenwart und Abwesenheit von Cyr61. Bei 1 ng/ml bFGF erhöhten jedoch HUVE-Zellen ihre Thymidin-Inkorporation in Gegenwart von bFGF auf 6 × 10² cpm; in Gegenwart von 1 ng/ml bFGF und Maus-Cyr61 inkorporierten HUVE-Zellen 1,3 × 10³ cpm. Bei 10 ng/ml bFGF inkorporierten gegenüber bFGF aus gesetzte Zellen ungefähr 1,8 × 10³ cpm Thymidin; Zellen, die 10 ng/ml bFGF und Cyr61 erhielten, inkorporierten ungefähr 6,1 × 10³ cpm.
Die Fähigkeit von Maus-Cyr61, die mitogene Aktivität von bFGF zu potenzieren, wurde durch einen Thymidin-Inkorporationstest verifiziert, der HUVE-Zellen und verschiedene Kombinationen von bFGF, Cyr61 und Anti-Cyr61-Antikörpern umfasste. Die Zellen wurden wie oben beschrieben ausplattiert und gezüchtet. Die folgenden Kombinationen von Ergänzungen (Endkonzentrationen der Platten in Klammern angegeben) wurden dann 1 Stunde lang vor Zugabe zu den einzelnen Platten vorinkubiert: 1) Prä-Immunantiserum (3%); 2) bFGF (15 ng/ml) und Prä-Immunantiserum (3%); 3) Prä-Immunantiserum (3%) und Cyr61 (4 μg/ml); 4) Prä-Immunantiserum (3%), Cyr61 (4 μg/ml) und bFGF (15 ng/ml); 5) Anti-Cyr61-Antiserum (3%); 6) Anti-Cyr61-Antiserum und bFGF (15 ng/ml); 7) Anti-Cyr61-Antiserum (3%) und Cyr61 (4 μg/ml); und 8) Anti-Cyr61-Antiserum (3%), Cyr61 (4 μg/ml) und bFGF (15 ng/ml).
Nach der wie oben beschriebenen Inkubation in Gegenwart von [³H]-Thymidin inkorporierten gegenüber Prä-Antiserum ausgesetzte Zellen ungefähr 2 × 10² cpm Thymidin; mit Prä-Immunserum und bFGF kontaktierte Zellen inkorporierten 1,3 × 10³ cpm; Prä-Immunserum und Cyr61 erhaltende Zellen inkorporierten 1 × 10² cpm; Prä-Immunserum, Cyr61 und bFGF erhaltende Zellen inkorporierten 3,6 × 10³ cpm; gegenüber Anti-Cyr61-Antiserum ausgesetzte Zellen inkorporierten 2 × 10² cpm; Anti-Cyr61-Antiserum und bFGF erhaltende Zellen inkorporierten ungefähr 1,3 × 10³ cpm; mit Anti-Cyr61-Antiserum und Cyr61 kontaktierte Zellen inkorporierten ungefähr 1 × 10²; und Anti-Cyr61-Antiserum, Cyr61 und bFGF erhaltende Zellen inkorporierten 1 × 10³ cpm. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Präimmun-Antiserum keine Wirkung auf die Cyr61-induzierte Potenzierung mitogener bFGF-Aktivität hatte. Anti-Cyr61-Antiserum jedoch hob die Potenzierung von bFGF durch Cyr61 vollständig auf. Darüber hinaus war die Wirkung von Anti-Cyr61-Antiserum gegen die Cyr61-induzierte mitogene Potenzierung spezifisch, da Anti-Cyr61-Antiserum an sich keine Wirkung auf die mitogene Aktivität von bFGF hatte. Daher kann Cyr61 als Reagens verwendet werden, um auf brauchbare Mitogene zu screenen.
Die DNA-Synthese für HUVE-Zellen und NIH-3T3-Fibroblasten wurde durch Thymidin-Inkorporation wie früher beschrieben (Kireeva et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1326–1334 (1996)) mit geringfügigen Modifizierungen gemessen. HUVE-Zellen wurden in 24-Well-Platten bis zum Zustand der Subkonfluenz gezüchtet, 24 Stunden lang an Serum verarmt und mit 10% Fötalkälberserum (FBS), 1 μCi/ml [³H]-Thymidin und 10 ng/ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (Gibco-BRL Inc.) enthaltendem F12K-Medium mit verschiedenen Konzentrationen von Cyr61 und Fisp12 wie angegeben behandelt. NIH-3T3-Fibroblasten wurden bis nahe der Konfluenz gezüchtet, 48 Stunden lang an Serum verarmt und mit 0,5% FBS, 1 μCi/ml [³H]-Thymidin, bFGF und verschiedene Konzentrationen von Cyr61 und Fisp12 enthaltendem Minimal-Essential-Medium (MEM) behandelt. Die Thymidin-Inkorporation in die in Trichloressigsäure unlösliche Fraktion wurde nach 24 Stunden langer Inkubation bestimmt. Logarithmisch gewachsene Nerz-Lungenepithelzellen (Mv1Lu, CCL64) wurden mit verschiedenen Konzentrationen TGF-β1 (Gibco-BRL) und 2 μg/ml Cyr61 oder Fisp12 18 Stunden lang behandelt; [³H]-Thymidin wurde dann zu 1 μCi/ml für 2 Stunden zugegeben. Die Thymidin-Inkorporation wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Gereinigtes rekombinantes Fisp12-Protein zeigte keinerlei mitogene Aktivität unter irgendeiner der getesteten Testbedingungen. Dagegen war Fisp12 fähig, durch Fibroblasten-Wachstumsfaktor induzierte DNA-Synthese in NIH-3T3-Fibroblasten sowie HUVE-Zellen zu verstärken. Diese Aktivität war von der durch Cyr61 gezeigten nahezu ununterscheidbar.
Während Cyr61 und Fisp12 die Wachstumsfaktor-induzierte DNA-Synthese in Fibroblasten und Endothelzellen verstärken, verstärken beide Proteine auch Wachstumsfaktor-vermittelte Wirkungen auf andere Weise. Es ist bekannt, dass TGF-β die DNA- Synthese in Epithelzellen hemmt (Satterwhite et al. (1994)). Es wurde beobachtet, dass sowohl Cyr61 als auch Fisp12 die Fähigkeit von TGF-β verstärkten, die DNA-Synthese in Nerz-Lungenepithelzellen zu hemmen. Die Daten belegen, dass rekombinantes Cyr61 und Fisp12, aus serumfreien Quellen gereinigt, selbst nicht mitogen sind, jedoch die Fähigkeit haben, mit den Wirkungen von Polypeptid-Wachstumsfaktoren in Synergie zu treten. Cyr61 und Fisp12 verstärken die DNA-Synthese-Induktion durch FGF und verstärken die DNA-Synthese-Hemmung durch TGF-β.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner die Verwendung von CTGF in Verfahren zur Potenzierung der mitogenen Wirkung echter Wachstumsfaktoren oder zum Screening auf echte Wachstumsfaktoren. Diese vorgesehenen Verwendungen stehen im Gegensatz zur beschriebenen Verwendung von CTGF selbst als Mitogen oder Wachstumsfaktor. US-Patent Nr. 5.408.040, Spalte 7, Zeile 65, bis Spalte 11, Zeile 7, hierin oben durch Verweis aufgenommen.
Weiters umfasst die Erfindung Verfahren zum Screenen auf Modulatoren der Mitogen-Potenzierung. Ein Vergleichstest setzt subkonfluente Zellen einem ECM-Signalmolekül, wie z. B. Cyr61, einem Wachstumsfaktor, und einem mutmaßlichen Modulator eines ECM-Signalmoleküls aus. Als Kontrolle wurden ähnliche Zellen dem ECM-Signalmolekül und Wachstumsfaktor ausgesetzt. Eine weitere Kontrolle setzt ähnliche Zellen gegenüber dem Wachstumsfaktor und dem mutmaßlichen Modulator in Abwesenheit des ECM-Signalmoleküls aus. Auf Basis der z. B. durch [³H]-Thymidin-Inkorporation gemessenen relativen Zellvermehrungsraten kann eine Identifizierung eines mutmaßlichen Modulators als Förderer der Mitogen-Potenzierung (erhöhte Zellvermehrung in Gegenwart aller drei Moleküle) oder eines Inhibitors der Mitogen-Potenzierung (erniedrigte Zellvermehrung in Gegenwart der drei Moleküle) erzielt werden.
Beispiel 19
Hornhaut-Test für angiogene Faktoren und Modulatoren
Ein weiterer Test für Modulatoren der Angiogenese, der Hornhaut-Test, ist ein In-vivo-Test zur Ermittlung der Wirkung eines mutmaßlichen Modulators in Gegenwart eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, wie z. B. Cyr61, auf die Angiogenese. Der Hornhaut-Test macht sich die Abwesenheit von Blutgefäßen in der Hornhaut zunutze, die in Gegenwart eines angiogenen Faktors in der detektierbaren Entwicklung von Kapillaren resultiert, die sich von der Lederhaut in die Hornhaut erstreckt. Friedlander et al., Science 270, 1500–1502 (1995). Dieses Hineinwachsen neuer Blutgefäße von der Lederhaut kann mikroskopisch bestimmt werden. Weiters kann die visuell bestimmte Migrationsrate verwendet werden, um Änderungen der Angiogenese-Rate zu bestimmen. Diese Hornhaut-Tests können unter Verwendung einer breiten Vielfalt von Tiermodellen durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Hornhaut-Tests unter Verwendung von Ratten durchgeführt. Als Beispiel wird ein Test auf mutmaßliche Modulatoren von Cyr61 unter Anwendung dieses Tests offenbart. Um diesen Test durchzuführen, wird Cyr61 zunächst unter Verwendung primärer Kapillarendothelzellen titriert, um wirksame Konzentrationen von Cyr61 zu ermitteln. Anschließend wird Cyr61 in Gegenwart oder Abwesenheit eines mutmaßlichen Modulators chirurgisch in die Hornhäute von Säugetier-Labortieren, z. B. Kaninchen oder Ratten, implantiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Cyr61 (oder Cyr61 und ein mutmaßlicher Modulator) in eine biokompatible Matrix eingebettet, wobei auf dem Gebiet der Erfindung standardmäßige Matrixmaterialien verwendet werden. Anschließend werden Augen, die Implantate enthalten, visuell auf Wachstum der leicht erkennbaren Blutgefäße im Inneren des Auges beobachtet. Kontrollimplantationen können aus physiologisch ausbalancierten Puffern bestehen, die im selben Matrixmaterial eingebettet sind und in Augen derselben Labortierart, die die Cyr61-enthaltenden Implantate erhalten, implantiert werden.
Die Entwicklung eines In-vivo-Hornhaut-Tests für angiogene Faktoren weist Vorteile gegenüber bestehenden In-vitro-Tests für diese Faktoren auf. Der Prozess der Angiogenese umfasst vier unterschiedliche Phasen: Induktion von Gefäß-Diskontinuität Endothelzellen-Bewegung, Endothelzellen-Vermehrung und dreidimensionale Neustrukturierung und Sprossung. In-vitro-Tests können nur zwei dieser Schritte beurteilen: Endothelzellen-Migration und -Mitogenese. Folglich wird zur Bereitstellung eines umfassenden Tests für angiogene Faktoren ein In-vivo-Test, wie z. B. der Hornhaut-Test, bevorzugt.
Der Hornhaut-Test ist verwendet worden, um die Wirkung angiogener Faktoren, wie z. B. Cyr61, Fisp12, CTGF und Nov, auf den Prozess der Angiogenese zu bestätigen. Darüber hinaus resultiert das Modifizieren des Hornhaut-Tests durch Aufnehmen irgendwelcher dieser angiogenen Faktoren und eines mutmaßlichen Modulators ihrer Aktivität in einem Hornhaut-Test für Modulatoren der Angiogenese. Beispielsweise könnte in einer der Ausführungsformen der Erfindung die Dosierung eines angiogenen Faktors, wie z. B. Cyr61, in Hornhaut-Tests für positive Effektoren der angiogenen Aktivität von Cyr61 verwendet werden. Eine geeignete Dosis von Cyr61 würde zunächst durch Titration der Dosisantwort-Beziehung von Cyr61 zu angiogenen Ereignissen ermittelt werden. Die Einbeziehung eines Kontrolltests, dem Cyr61 fehlt, würde Verbindungen mit einer direkten Wirkung auf die Angiogenese eliminieren. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung könnte eine wirksame Dosis eines angiogenen Faktors, wie z. B. Cyr61, verwendet werden, um auf negative Modulatoren der Aktivität eines angiogenen Faktors zu testen. In noch einer weiteren alternativen Ausführungsform umfasst ein Hornhaut-Implantat Cyr61, und ein weiteres Hornhaut-Implantat umfasst Cyr61 und einen mutmaßlichen Modulator der Angiogenese. Messungen der Entwicklung von Blutgefäßen in den implantierten Hornhäuten stellen eine Basis für die Identifizierung eines mutmaßlichen Modulators als Förderer der Angiogenese bereit (erhöhte Blutgefäßentwicklung in der Hornhaut, die ein den mutmaßlichen Modulator umfassendes Implantat enthält). Eine relative Verminderung der Blutgefäßentwicklung identifiziert einen Inhibitor der Angiogenese.
Die Ratte wird als Tiermodell für den Hornhaut-Test bevorzugt. Offenbarungen auf dem Gebiet der Erfindung haben die Ratte als gut charakterisiertes System für das Analysieren der Angiogenese etabliert. Parameter, wie z. B. Implantatgröße, Proteinfreisetzungsdynamik und geeignete chirurgische Techniken, sind gründlich charakterisiert worden. Obgleich irgendein Rattenstamm im Hornhaut-Test verwendet werden kann, sind bevorzugte Stämme für gewöhnlich gut charakterisierte Laborstämme, wie z. B. der Sprague-Dawley-Stamm.
Obgleich Ratten verschiedener Größen im Hornhaut-Test verwendet werden können, ist eine bevorzugte Größe für die Ratten 150–200 g/Tier. Anästhesie wird mit Methoxyfluran induziert und 40–60 Minuten lang mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal verabreicht) aufrechterhalten. Die Augen werden vorsichtig geöffnet und durch Befestigen des oberen Augenlids mit einer nicht traumatisierenden Arterienklemme fixiert. Zwei Tropfen steriles Proparacain-Hydrochlorid (0,5%) werden dann auf jedes Auge gegeben, um eine Lokalanästhesie zu bewirken. Unter Verwendung einer geeigneten chirurgischen Klinge, wie z. B. einer Bard-Parker-Klinge Nr. 11, wird ein ungefähr 1,5 mm langer Schnitt ungefähr 1 mm vom Zentrum der Hornhaut ausgeführt. Der Schnitt erstreckt sich in das Stroma, nicht jedoch durch dieses hindurch. Ein gekrümmter Iris-Spatel von ungefähr 1,5 mm Breite und ungefähr 5 mm Länge wird dann unter den Rand des Schnitts eingeführt und vorsichtig durch das Stroma zum äußeren Augenwinkel des Auges stumpf seziert. Ein leichter Fingerdruck gegen den Augapfel hilft, das Auge während der Dissektion ruhig zu halten. Der Spatel dringt in das Stroma nicht mehr als ungefähr 2,5 mm ein. Sobald die Hornhaut-Tasche hergestellt ist, wird der Spatel entfernt und der Abstand zwischen Limbus und Basis der Tasche gemessen, um sicherzustellen, dass die Trennung zumindest ungefähr 1 mm beträgt.
Um für eine langsame Freisetzung des Proteins nach Implantation in die Hornhaut zu sorgen, wird Protein mit Poly-2-hydroxyethylmethacrylat (Hydron) oder einem gleichwertigen Mittel gemischt, um ein Pellet von ungefähr 5 μl auszubilden. Auf diese Weise hergestellte Implantate werden mit einem Tropfen steriler Ringer-Laktatlösung rehydratisiert und wie oben beschrieben implantiert. Nach Implantation wird die Hornhauttasche mit Erythromycin-Salbe verschlossen. Nach der Implantation sollte das Protein-Hydron-Pellet nahe dem Limbus der Hornhaut (Hornhaut-Lederhaut-Grenze) verbleiben, und die Sehkraft sollte nicht signifikant beeinträchtigt sein.
Nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Tiere täglich sieben Tage lang mithilfe eines Stereomikroskops untersucht, um auf Entzündung und Reaktionen zu prüfen. Um die Untersuchung zu erleichtern, wird das Tier mit Methoxyfluran anästhesiert und das Anästhetikum während der Untersuchung kontinuierlich durch einen Nasentrichter verabreicht. Während dieses siebentägigen Zeitraums werden die Tiere auf Implantatposition und Hornhaut-Exsudat beobachtet. Hornhaut-Exsudat aufweisende Tiere werden getötet. Ein bevorzugtes Verfahren der Euthanasie ist die Ausblutung. Die Tiere werden anfänglich mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg) anästhesiert und dann wie unten beschrieben perfundiert.
Nach sieben Tagen werden die Tiere mit kolliodalem Kohlenstoff (z. B. Indiaink) perfundiert. Anästhesie wird mit Methoxyfluran induziert und mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg, intraperitoneal) aufrechterhalten. Jedes Tier wird mit 100–200 ml warmer (37°C) Ringer-Laktatlösung pro 150 g Körpergewicht über die Bauchaorta perfundiert. Sobald die Schnauze vollkommen ausgebleicht ist, werden 20–25 ml kolloidaler Kohlenstoff in derselben Weise wie die Ringer-Lösung injiziert, bis Kopf und Thoraxorgane vollständig schwarz sind. Die Augen werden dann herausgeschält und fixiert. Hornhäute werden herausgeschnitten, flach gedrückt und fotografiert.
Jedes Protein wird typischerweise in drei Dosierungen gemäß der Praxis auf dem Gebiet der Erfindung getestet. Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung wird verstehen, dass sechs positive Hornhaut-Reaktionen pro Dosis erforderlich sind, um eine Identifizierung einer angiogenen Reaktion zu bestätigen. Ein beispielhafter Hornhaut-Test umfasst drei Dosierungen des untersuchten Proteins, wobei sechs Ratten bei jeder Dosis getestet werden. Außerdem werden sechs Tiere gegenüber einem Puffer-Hydron-Implantat ausgesetzt und dienen als negative Kontrollen. Das Aussetzen von zumindest drei Tieren gegenüber einem bekannten Angiogenese-Faktor-Hydron-Implantat dient als positive Kontrolle. Schließlich werden sechs Tiere gegenüber Implantaten ausgesetzt, die eine einzelne Dosis des untersuchten Proteins, einen Überschuss an neutralisierendem Antikörper und Hydron enthalten, um die Spezifität irgendeiner beobachteten Reaktion nachzuweisen.
Ein wie oben beschriebener Hornhaut-Test wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von Cyr61 zu ermitteln, Angiogenese zu induzieren. Vier Tiere erhielten Negativkontrollimplantate, die ein Puffer-Hydron-Pellet enthielten (beide Augen). Keines dieser Tiere zeigte nach sieben Tagen irgendeine Blutgefäßentwicklung in einem der beiden Augen. Sechs Tiere erhielten Implantate, die eine biologisch wirksame Menge Fibroblasten-Wachstumsfaktor (0,15 μM) in ein Auge und ein Kontrollpellet ins andere Auge enthielten; alle sechs zeigten angiogene Entwicklung im Auge, das FGF erhielt, und keines zeigte eine Neovaskularisierung im Auge, das die negative Kontrolle erhielt. Sieben Tiere erhielten 1 μg/ml Cyr61 in ein Auge, und alle sieben dieser Augen zeigten Blutgefäßwachstum; eines dieser sieben Augen, die eine negative Kontrolle erhielten, zeigte angiogene Entwicklung. Schließlich erhielten vier Tiere Implantate, die 1 μg/ml Cyr61 (Hydron, hergestellt mit einer Cyr61-Lösung von 10 μg/ml) und einen spezifischen Anti-Cyr61-Antikörper im dreifachen Überschuss gegenüber Cyr61 lokal freisetzten: keines der Augen dieser Gruppe zeigte irgendeine angiogene Entwicklung. Folglich identifiziert der In-vivo-Test für Angiogenese angiogene Faktoren, wie z. B. FGF und Cyr61. Der Test ist ferner in der Lage, die Hemmung angiogener Entwicklung zu offenbaren, die durch ECM-Signalmoleküle, wie z. B. Cyr61, induziert wird.
Beispiel 20
Blutgerinnung
ECM-Signalmoleküle sind ferner für die Korrektur von Hämostase oder abnormaler Blutgerinnung zweckdienlich. Ein Defekt der Blutgerinnung, der z. B. durch ein niedriges Expressionsausmaß von Cyr61 verursacht wird und dadurch dem Tissue-Factor-Pathway-Inhibitor (TFPI) ermöglicht, ungehindert zu agieren, kann durch Expression oder Verwendung von rekombinantem Cyr61-Protein korrigiert werden.
Cyr61 kann mit TFPI, einem Protein, das die extrinsische Blutgerinnung hemmt, in Wechselwirkung treten. TFPI hemmt die Blutgerinnung in einem Zwei-Schritt-Verfahren. Zuerst bindet TFPI an Faktor Xa, und der TFPI-Xa-Komplex tritt dann mit dem Gewebefaktor:Faktor-VIIa-Komplex (Gewebefaktor = TF („Tissue Factor")) in Wechselwirkung, wodurch der letztere Komplex gehemmt wird. Der TF:Faktor-VIIa-Komplex ist derjenige Komplex, der die Faktoren IX und X aktiviert. Durch Hemmung von TF:VIIa reguliert TFPI die Gerinnung durch Verhindern der Aktivierung der Faktoren IX und X, die für die Blutgerinnung erforderlich sind. Die Wechselwirkung von Cyr61 mit TFPI hemmt die Aktivität von TFPI und fördert so die Blutgerinnung. Cyr61 ist folglich ein Gewebefaktor-Agonist.
Wegen der Wechselwirkung von Cyr61 und TFPI kann Cyr61 die Fähigkeit von TFPI kontrollieren, die Gerinnung zu hemmen, wodurch die Hämostase reguliert wird. Ein Cyr61-Defekt kann zum Unvermögen führen, TFPI zur geeigneten Zeit zu hemmen, was in übermäßiger Gewebefaktorhemmung resultiert, wodurch die Blutgerinnselbildung verhindert wird. Eine deregulierte Expression von Cyr61 wird umgekehrt die Aktivität von TFPI konstitutiv hemmen, und der Gewebefaktor ist folglich ständig aktiv, was in übermäßiger Gerinnung resultiert. Bei deregulierter Expression von Cyr61 in Endothelzellen ist Thrombose eine mögliche Folge.
Zusätzlich zu Cyr61 hat sich von anderen ECM-Signalmolekülen, wie z. B. Fisp12 und CTGF, gezeigt, dass sie Wirkungen auf Zellen ausüben, die an der Angiogenese beteiligt sind.
Beispiel 21
Hämatopoetische Ex-vivo-Stammzellenkulturen
Um die Wirkung von Cyr61 auf das Wachstum primitiver multipotenter Stammzellen zu untersuchen, werden mehrere Tests eingesetzt, die diese Zellen von reiferen Vorläuferzellen in einer hämatopoetischen Kultur unterscheiden. Diese Tests nützen physikochemische (Fibronectin-bindende) oder Wachstums- und Entwicklungsbezogene (Erzeugung von Vorläufer-Blastzellen-Kolonien) Unterschiede zwischen unreifen und reifen Untergruppen von Zellen.
Zwei Zelllinien, die konditioniertes Medium zum Wachstum benötigen, werden als Quelle hämatopoetischer Stammzellen (HSC) verwendet. Diese klonierten, Faktorabhängigen Maus-Linien sind B6Sut (kloniert aus Langzeit-Knochenmark-Kultur und fähig, in Flüssigmedium ohne Differenzierung zu wachsen, jedoch multipotent in Agar, wie beschrieben in Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2931 (1983)) und FDCP-Gemisch (kloniert aus Langzeit-Knochenmarkkultur-Zellen, die mit dem rekombinanten Virus src-MoMuLV infiziert sind; sie sind multipotent in Agarkulturen, wie beschrieben in Spooncer et al., Nature 310, 2288 (1984)). B6Sut-Zellen werden in Kincaid-Medium mit 10% Fötalkälberserum (FCS) und 10% 6X-konzentriertem, WEHI-konditioniertem Medium vermehrt. Greenberger et al. FDCP-Gemisch-Zellen werden in Fischer-Medium mit 20% Pferdeserum und 10% 6X-konzentriertem WEHI-konditioniertem Medium vermehrt. Die Zelllinien werden bei 37°C und 5% CO₂ vermehrt.
Verschiedene Ex-vivo- oder In-vitro-Kulturen werden auf Populationswachstum in Gegenwart oder Abwesenheit von exogen zugeführtem/n Maus-Cyr61 oder polyklonalen Anti-Cyr61-Antiköpern getestet. Unter Grenzverdünnungsbedingungen wird der Kopfsteinpflasterbereich-bildende Zellen- (cobblestone area forming cell, CAFC-) Test verwendet, um Zellen mit Langzeit-Wiederbesiedelungsfähigkeit zu identifizieren. Ploemacher et al., Blood 74, 2755 (1989); Ploemacher et al., Blood 78, 2527 (1991). Zellen, die im CAFC-Test als Langzeit-wiederbesiedelungsfähig identifiziert wurden, werden dann durch Messen von drei Parametern analysiert: Populationsverdoppelungsrate; Mitose-Index und DNA-Syntheserate.
Langzeitkulturen mit oder ohne Cyr61-Ergänzung werden auf ihre Mengen an primitiven HSC im CAFC-Test hin getestet. Van der Sluijs et al., Exp. Hematol. 22, 1236 (1994). Beispielweise werden M2-10B4-Stromazellen, B6Sut und FDCP-Gemisch jeweils dem CAFC-Test auf folgende, für die M2-10B4-Zelllinie beschriebene Weise unterzogen. Stomazellschichten werden durch Inokulieren von 5 × 10⁵ M2-10B4-Stromazellen (eine aus Knochenmark-Stroma klonierte Zelllinie, Sutherland et al., Blood 78, 666 (1991)) in jeden Well einer 96-Well-Kulturplatte in DMEM mit 10 FCS hergestellt. Wenn die Zellen sich der Konfluenz nähern, werden sie mit PBS gespült und bestrahlt (20 Gy Gammabestrahlung, 1,02–1,04 Gy/Minute), um die Replikation jeglicher hämatopoetischer Zellen innerhalb des Stromas zu verhindern, ohne die Fähigkeit des Stromas zu beeinflussen, die Hämatopoese zu fördern.
Hämatopoetische Stammzellen werden zu den bestrahlten Stroma-Zellen in DMEM mit 10% FCS in Gegenwart und Abwesenheit von Cyr61 zugegeben (10 μg/ml Endkonzentration). Populationsverdoppelungsraten werden z. B. durch mikroskopische Untersuchung der Zellmorphologie bestimmt, um die Anzahl von Langzeit-wiederbesiedelnden Zellen (und reifere Kurzzeit-Vorläuferzellen) zu bestimmen, die in den verschiedenen experimentellen Langzeitkulturen vorhanden sind. Die anschließende Untersuchung der Expansions- und Differenzierungsfähigkeiten der möglichen Langzeit-HSC-Kulturen wird zur Bestätigung geeigneter Kandidat-Zelllinien verwendet.
Der Mitose-Index wird nach Verfahren bestimmt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Keram et al., Cancer Genet. Cytogenet. 55, 235 (1991). Geerntete Zellen werden in Methanol : Essigsäure (3 : 1, Vol./Vol.) fixiert, gezählt und zu 10⁶ Zellen/ml im Fixiermittel resuspendiert. Zehn Mikroliter dieser Suspension werden auf einen Objektträger gegeben, getrocknet und mit Giemsa-Farbstoff behandelt. Die Zellen in der Metaphase werden unter einem Lichtmikroskop gezählt und der Mitose-Index durch Division der Anzahl von Zellen in der Metaphase durch die Gesamtzahl von Zellen am Objektträger berechnet. Die statistische Analyse von Vergleichen von Mitose-Indizes wird unter Anwendung des zweiseitigen gepaarten t-Tests durchgeführt.
Die DNA-Syntheserate wird unter Anwendung eines Thymidin-Inkorporationstests gemessen. Verschiedene Kulturen werden in 1 μCi/ml [³H]-Thymidin (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA) 24–72 lang Stunden vermehrt. Geerntete Zellen werden dann mit PBS gespült und mit 10% Trichloressigsäure fixiert. DNA wird in 0,1 N NaOH gelöst und die Thymidin-Inkorporation beispielsweise durch Flüssigkeits-Szintillationsspektralphotometrie bestimmt.
Die Verwendung eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials, wie z. B. Cyr61, kann bei der Ex-vivo-Vermehrung hämatopoetischer Stammzellenkulturen verwendet werden. Außerdem kann mehr als ein ECM-Signalmolekülverwandtes Biomaterial verwendet werden, um diese Kulturen zu vermehren. Beispielsweise kann Cyr61 mit seiner lokal abzielenden Expression mit Fisp12 kombiniert werden, das eine ausgedehntere Abzielung zeigt, wie durch Anwesenheit von Fisp12 im Kulturmedium nachgewiesen werden kann. Als Alternative dazu kann Fisp12 durch CTGF, seinem Maus-Ortholog, ersetzt werden. Ein Fachkundiger auf dem Gebiet der Erfindung wäre in der Lage, andere Kombinationen von ECM-Signalmolekül-verwandten Biomolekülen zu ersinnen, die im Sinne der Erfindung liegen.
Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass die erfolgreiche Vermehrung hämatopoetischer Stammzellenkulturen in Gegenwart von ECM-Signalmolekülen, wie z. B. Cyr61, eine Basis für ein Verfahren des Screenings auf mutmaßliche Modulatoren jenes Vermehrungsprozesses bereitstellt. So wie in den anderen Verfahren der Erfindung wird ein mutmaßlicher Modulator mit einem ECM-Signalmolekül, wie z. B. Cyr61, kombiniert und primitiven Zellen ausgesetzt. Parallel dazu wird das ECM-Signalmolekül ähnlichen Zellen ausgesetzt. Die relativen Vermehrungsraten können verwendet werden, um einen Förderer oder Inhibitor der Fähigkeit von ECM-Signalmolekülen zu identifizieren, pluripotente hämatopoetische Stammzellenkulturen zu vermehren.
Cyr61 alleine oder in Kombination mit anderen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren können ferner verwendet werden, um aus einem Patienten entnommene Stammzellenpopulationen zu vermehren, die nach Vermehrung dem Patienten oder geeigneten Empfängerpatienten rückgeführt werden können, beispielsweise nach Chemotherapie oder anderen Behandlungsmodalitäten, die in der Verarmung von Blutzellen in einem Patienten resultieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung vermehrte Stammzellenkulturen können auch in Knochenmarkstransplantaten in einem Patienten, der dieses benötigt, verwendet werden.
Beispiel 22
Organ-Regeneration
Die Rolle von Cyr61 in den verschiedenen Zellprozessen, die durch Änderungen des Zellwachstumsstadiums hervorgerufen werden, weist darauf hin, dass dieses Protein bei der Förderung von Organ-Regeneration wirksam sein sollte. Zu diesem Zweck wurden Untersuchungen durchgeführt, um das Expressionsprofil von Maus-Cyr61 in verbleibendem Lebergewebe nach partieller Hepatektomie zu bestimmen. (Die Reaktion von verbleibendem Lebergewebe nach partieller Hepatektomie ist ein Modell für die Reaktion der Leber auf eine Reihe von Verletzungen, einschließlich chemischer Verletzungen, z. B. Aussetzen gegenüber toxischen Mengen Tetrachlorkohlenstoff.) BALB/c-3T3- (Charles-River-) Mäuse wurden partieller Hepatektomie unterzogen, wobei ungefähr 67% ihres Lebergewebes entfernt wurden. Higgins et al., Archs. Path. 12, 186–202 (1931). Aliquoten von zwanzig Mikrogramm RNA wurden vom verbleibenden Lebergewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation entfernt, und die Leber-DNA wurde durch Gewebehomogenisierung gefolgt von Guanidinium-Isothiocyanat-, Cäsiumchlorid-Präzipitation isoliert. Sambrook et al. RNAs wurden dann an Nitrozellulosefiltern immobilisiert und mit radioaktiv markierten Klonen sondiert, die verschiedene Regionen von Maus-cyr61-cDNA enthielten. Die Ergebnisse wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht und zeigten an, dass die Entfernung von Lebergewebe die cyr61-mRNA-Expression induzierte, insbesondere in Zellen, die sich nahe der Verletzungsstelle finden. Daher könnte die Induktion der cyr61-Expression, z. B. durch Rekombinationstechniken, die Regeneration von Organen, wie z. B. der Leber, fördern. Beispielsweise kann die cyr61-Expression kontrolliert werden, z. B. durch Einführen rekombinanter cyr61-Konstrukte, die so konstruiert worden sind, dass sie die Fähigkeit zur Expressionskontrolle des Gens bereitstellen, z. B. durch Verwendung von gewebespezifischen Promotoren, z. B. des K14-Promotors zur Expression in der Haut. Das rekombinante cyr61 kann in die Zellen des maßgeblichen Organs eingeführt werden, und zwar durch Gentherapietechniken unter Verwendung von Vektoren, die die homologe Rekombination erleichtern (z. B. von Herpesviren, Adenovirus, Adeno-assoziiertem Virus, Cytomegalovirus, Baculovirus, Retroviren, Vacciniavirus und anderen hergeleitete Vektoren).
Techniken zur Einführung heterologer Gene in eukaryotische Zellen und Techniken zur Integration heterologer Gene in Wirtschromosomen durch homologe Rekombination sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt.
Die Entwicklung der Haut, einem anderen Organ, wird ebenfalls von Cyr61 beeinflusst. Die Expression von cyr61 wird in Zellen in der Nähe von Hautverletzungen induziert. Ferner hat Cyr61 wie oben beschrieben eine chemotaktische Wirkung (d. h. Cyr61 induziert die Zellmigration) auf Endothelzellen und Fibroblasten. Weiters induziert Cyr61 die Vermehrung von Endothelzellen und Fibroblasten. Beide Prozesse sind an der Heilung von Hautwunden beteiligt. Demgemäß sollte eine Cyr61-Verabreichung, z. B. durch örtlich begrenzte oder topische Abgabe, die Hautregeneration fördern.
Cyr61 wird außerdem sehr stark in Lungenepithel exprimiert. Diese Zellen werden häufig durch Aussetzen gegenüber Umweltschadstoffen verletzt. Im Speziellen wird das Lungenepithel durch Oxidationsmittel in der Luft geschädigt. Die Verabreichung von Cyr61, z. B. in Zerstäubern oder Inhalatoren, kann zur Heilung von Lungenepithel, das z. B. durch Umweltschadstoffe geschädigt ist, beitragen.
Beispiel 23
Chondrogenese – ECM-Signalmoleküle werden im Mesenchym exprimiert
Manche ECM-Signalmoleküle werden auch in Zellen, wie z. B. Mesenchymzellen, exprimiert, die letzten Endes Teil des Skelettsystems werden. In diesem Beispiel wird Cyr61 als eines der in Mesenchymzellen exprimierten ECM-Signalmoleküle identifiziert. Extremitäten-Mesenchymzellen wurden in Mikromassenkultur wie oben beschrieben auf Glasobjektträgern (Fisher) 3 Tage lang gezüchtet. Die Kulturen wurden in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 mg/ml Rinderhoden-Hyaluronidase (Typ IV, Sigma) in 0,1 N Natriumacetat (pH 5,5) mit den Proteaseinhibitoren Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM), Pepstatin (1 μg/ml), Leupeptin (1 μg/ml), Aprotinin (1 μg/ml), Aminocapronsäure (50 mM), Benzamidin (5 mM) und EDTA (1 mM) inkubiert, mit 10% Ziegenserum in PBS blockiert und über Nacht bei 4°C mit Primärantikörpern gegen Cyr61 (Yang et al (1991)), Fi bronectin (Gibco) und Tenascin (Gibco) inkubiert. Kontrollen wurden mit Anti-Cyr61-Antikörpern inkubiert, die mit 1 μg/ml gereinigtem Cyr61 neutralisiert waren. Die Kulturen wurden anschließend mit FITC-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Zymed) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Für die immunhistochemische Ganzpräparat-Färbung wurden Maus-Embryos der Trächtigkeitsstadien 10,5 bis 12,5 in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, in Methanol/PBS entwässert und bei –20°C in absolutem Methanol gelagert. Nach Rehydratation wurden die Embryos mit Anti-Cyr61-Antikörpern wie in Hogan et al., Development 120, 53–60 (1994), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben inkubiert. Kontrollen wurden mit Anti-Cyr61-Antikörpern inkubiert, die mit 1 μg/ml gereinigtem Cyr61 neutralisiert waren. Die immungefärbten Embryos wurden fixiert, geklärt und fotografiert.
Im Einklang mit der vorübergehenden Expression von cyr61-mRNA in Ursegment-Mesenchymzellen, die sich zu Chondrozyten differenzieren (O'Brien et al. (1992)), wurde das Cyr61-Protein im sich entwickelnden embryonalen Skelettsystem gefunden. Cyr61 war mittels immunhistochemischer Ganzpräparatfärbung am proximalen Extremitätenknospen-Mesenchym in Embryos der Trächtigkeitstage 10,5 bis 12,5 lokalisiert. Cyr61-Protein war an den sich entwickelnden Wirbelsäulen, am Schädeldecke-Stirnbein und ersten Armbogen sowie in den Herz- und Umbilikalgefäßen lokalisiert, wobei ein Expressionsmuster ausgebildet wurde, das mit dem Expressionsmuster von cyr61-mRNA im Einklang stand (O'Brien et al. (1992)).
Cyr61-Protein konnte mittels Immunblot-Analyse in Gesamt-Extremitätenknospen und in Mikromassenkulturen von Extremitätenknospen-Mesenchymzellen detektiert werden. Die Konzentration des Cyr61-Proteins blieb während des 4-tägigen Kulturzeitraums, während der die Chondrogenese auftrat, relativ konstant. Unter Anwendung quantitativer Immunblot-Analyse wurde geschätzt, dass Cyr61 ungefähr 0,03% der gesamten zellulären und extrazellulären Proteine in den Mesenchymzellkulturen ausmacht. Cyr61, Tenascin (Gibco) und Fibronectin wurden mittels Immunfluores zenzfärbung in den Mesenchymzellkulturen an den Knorpelknötchen lokalisiert. Cyr61 und Tenascin wurden in erster Linie unter den intranodulären Zellen lokalisiert, während ein fibrilläres Färbungsmuster mit Anti-Fibronectin-Antikörpern auch um die Knorpelknötchen herum und zwischen ihnen beobachtet wurde. Ein ähnliches Immunfluoreszenzfärbemuster wurde in Querschnitten von Mikromassenkulturen für alle drei Antikörper beobachtet. Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse, dass endogenes Cyr61 sowohl in vivo als auch in vivo im sich entwickelnden Extremitätenknospen-Mesenchym lokalisiert ist.
Beispiel 24
Chondrogenese – ECM-Signalmoleküle fördern die Zelladhäsion
Cyr61 ist ein sekretiertes Protein, das die Adhäsion von Fibroblasten und Endothelzellen an Nicht-Gewebekultur-behandelte Kunststoffoberflächen vermittelt (Kireeva et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1326–1334 (1996)). Die Anhaftung von Extremitätenknospen-Mesenchymzellen an Nicht-Gewebekultur-Platten, die mit BSA, Cyr61, Tenascin und Fibronectin beschichtet waren, wurde verglichen.
Cyr61, Fibronectin (Gibco) oder Tenascin (Gibco) wurden in 0,1% proteasefreiem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit 0,5 mM PMSF auf eine Endkonzentration von 10 oder 50 μg/ml verdünnt. Ein Tropfen von 10 μl je Well wurde in eine Nicht-Gewebekultur-behandelte 24-Well-Platte (Corning) gegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang behandelt. Die Wells wurden mit 1% BSA in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und mit serumfreiem MEM (Modified Eagle's Medium) gespült. In serumfreiem MEM zu 5 × 10⁵ Zellen/ml suspendierte Extremitäten-Mesenchymzellen wurden in einem Volumen von 400 μl/Well zugegeben und bei 37°C, 5% CO₂ 1 bis 3 Stunden lang inkubiert. Zu jedem Messzeitpunkt wurde die Zellsuspension entfernt, die Wells wurden mit MEM gespült und die verbleibenden anhaftenden Zellen fotografiert.
Die Zellen hafteten schlecht an BSA-beschichteten Platten, hafteten jedoch als Cluster gerundeter Zellen an Cyr61- und Tenascin-beschichteten Platten innerhalb 1 Stunde nach Ausplattierung. Im Gegensatz dazu hafteten auf Fibronectin-beschichteten Platten ausplattierte Zellen gleichmäßig und begannen sich auszubreiten. Wenn die Anhaftung von Zellen 3 Stunden lang ermöglicht wurde, wurden sehr viel mehr anhaftende Zellen festgestellt. Darüber hinaus wurde interzelluläre Haufenbildung und rundliche Zellmorphologie in Zellen aufrechterhalten, die auf Cyr61 und Tenascin ausplattiert waren, wogegen auf Fibronectin ausplattierte Zellen sich so ausbreiteten, dass sie eine Monoschicht ausbildeten. Diese Beobachtungen zeigen, dass Cyr61 die Adhäsion und Erhaltung einer rundlichen Zellmorphologie vermittelt, die der Mesenchymzellen-Chondrogenese förderlich ist (Zanetti et al., Dev. Biol. 139, 383–395 (1990); Solursh et al., Dev. Biol. 94, 259–264 (1982)), die ähnlich derjenigen ist, die früher für Tenascin beschrieben worden ist (Mackie et al., J. Cell Biol. 105, 2569–2579 (1987)).
Wie vorhin erwähnt, kann Cyr61 in Verfahren zum Screenen auf Modulatoren der Zelladhäsion, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Adhäsion von Chondrozyten, verwendet werden. Der oben beschriebene Vergleichstest misst die relativen Adhäsionsausmaße von Zellen, die einer Kombination eines ECM-Signalmoleküls und eines mutmaßlichen Modulators der Zelladhäsion ausgesetzt sind, und von Zellen, die dem ECM-Signalmolekül alleine ausgesetzt sind, wodurch das relative Ausmaß eine Basis zur Identifizierung entweder eines Förderers oder eines Inhibitors der Zelladhäsion bereitstellt.
Beispiel 25
Chondrogenese – ECM-Signalmoleküle fördern die Zellaggregation
Da die Aggregation ein wesentlicher Schritt der chondrogenen Differenzierung ist (M. Solursh, in: The role of extracellular matrix in development, R. Trelstad (Hrsg.), Alan R. Liss, New York, S. 277–303 (1984)), wurde die Fähigkeit von Cyr61 ermittelt, die interzelluläre Aggregation in Suspensionskulturen von Mesenchymzellen zu vermitteln. Die Anzahl der zu verschiedenen Zeiten nach Isolierung verbleibenden Zellen wurde gezählt. Unbehandelte Mesenchymzellen in Suspension begannen bald nach Isolation zu aggregieren, da die Anzahl von Einzelzellen sich innerhalb eines Inkubationszeitraums von 2 Stunden auf 30% der anfänglichen Anzahl verminderte. Die Zellaggregation wurde in mit affinitätsgereinigten Anti-Cyr61-Antikörpern behandelten Kulturen signifikant gehemmt, was darauf hinweist, dass endogenes Cyr61 für die Mesenchymzellen-Aggregation von Bedeutung ist. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die affinitätsgereinigten Anti-Cyr61-Antikörper unbestimmte Komponenten enthalten, die die Aggregation stören, wurden die oben beschriebenen Anti-Cyr61-Anitkörper vor Zugabe zu den Zellen mit gereinigtem Cyr61-Protein vorinkubiert. Diese vorinkubierten Antikörper beeinträchtigten die Zellaggregation nicht mehr als die IgG- und Cyr61-Puffer-Kontrollen, was darauf hinweist, dass die Anti-Cyr61-Antikörper ihre Hemmung der Zellaggregation durch Neutralisieren des endogenen Cyr61-Proteins von Mesenchymzellen erzielten.
Zusätzlich zur oben beschriebenen Zellaggregation in Suspensionskulturen wurde auch die Wirkung von Cyr61 auf die Mesenchymzellen-Aggregation in Mikromassenkulturen untersucht. Wenn gereinigtes Cyr61-Protein (0,3 μg/ml) zu Extremitäten-Mesenchymzellen zugegeben wurde, wurde im Gegensatz zu Kontrollzellen, die kein Cyr61 erhalten haben, innerhalb von 24 Stunden eine frühzeitige Zellaggregation beobachtet. Weder Cyr61-behandelte noch Kontrollkulturen hatten sich zu diesem Zeitpunkt zu Knorpelknötchen entwickelt. Bis zum Kulturtag 3 war die Entwicklung intranodulärer Zellverdichtungen zwischen den verschiedenen Knorpelknospen in Cyr61- behandelten Kulturen stärker ausgeprägt. Diese internodulären Verdichtungen erfahren anschließend Chondrogenese, die als Alcian-Blau-Färbung der Knorpelmatrix am Kulturtag 4 zu beobachten war. Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse an, dass Cyr61 fähig ist, die Aggregation zwischen Zellen zu fördern, was ein notwendiger Schritt bei der Chondrogenese von Mesenchymzellen in Mikromassenkultur ist.
Beispiel 26
Chondrogenese – ECM-Signalmoleküle fördern die Zellvermehrung
Manche ECM-Signalmoleküle, wie z. B. Cyr61, beeinflussen die Chondrogenese, wie sich durch ihre Wirkungen auf Extremitätenknospen-Mesenchymzellen in Mikromassenkultur wie oben beschrieben offenbart. Ahrens et al., Dev. Biol. 60, 69–82 (1977), haben berichtet, dass diese Zellen in Mikromassenkultur Chondrogenese auf eine Weise erfahren, die dem In-vivo-Prozess ähnlich ist. Mesenchymzellen wurden aus Mausembryo-Extremitätenknospen durch Trypsinverdau (1 mg/ml, 1 : 250-Verdünnung von Schweinepankreas-Trypsin, Sigma Chemical Co.) erhalten. Die Zellen wurden in Kunststoffgewebekulturwells explantiert und 2 Stunden lang bei 37°C, 5 CO₂ anhaften gelassen. Die Zellen wurden dann 24 Stunden lang bei 37°C, 5% CO₂ in MEM mit 10% FBS, Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Zusammensetzung des Mediums durch Ersetzen des 10%igen FBS durch 4% NuSerum (Collaborative Biomedical Products Inc.) geändert. Einzelne Kulturen erhielten dann Cyr61, Fibronectin, Heparin (alle zu ungefähr 1 μg/ml) oder Puffer als negative Kontrolle. Eine zusätzliche Kontrolle wurde durch Zugeben einer 1 : 100-Verdünnung von affinitätsgereinigtem Anti-Cyr61-Antikörper (ungefähr 13 μg/ml Stammlösung) bereitgestellt, der nach Standardtechniken hervorgerufen und gereinigt wurde. Harlow et al.
Die Zellvermehrung wurde wie oben beschrieben mittels Thymidintest und mikroskopischer Zellzählung ermittelt. Chondrogenese wurde durch Quantifizieren der Inkorporation von [³⁵S]-Sulfat (ICN Biomedicals Inc.) in sulfatierte Glykosaminoglykane und durch qualitative Bestimmung des Chondrogenese-Ausmaßes durch Zellfärbung mit Alcian-Blau ermittelt. Die oben beschriebenen Kulturen wurden mit 2,5 μCi/ml [³⁵S]-Sulfat 18 Stunden lang markiert, zweimal in PBS gewaschen, mit Kahle-Fixiermittel (Pepper et al., J. Cell Sci. 109, 73–83 (1995)) fixiert und 18 Stunden lang in 0,5% Alcian-Blau, pH 1,0, gefärbt. Das Ausmaß der Chondrogenese korrelierte mit der Intensität der Alcian-Blau-Färbung. San Antonio et al., Dev. Biol. 115, 313–324 (1986). Die Ergebnisse zeigen, dass Cyr61 die Vermehrung und Aggregation von Extremitätenknospen-Mesenchymzellen erhöhte, was verstärkte Chondrogenese bewirkte.
Zusätzlich zum Nachweis, dass gereinigtes Cyr61 die Wachstumsfaktor-induzierte DNA-Synthese in Fibroblasten und Endothelzellen verstärkte, wurden die Wirkungen von Cyr61 auf die Zellvermehrung direkt untersucht. Die Zellvermehrung während des 4-tägigen Kulturzeitraums wurde durch Zählen der Zellzahl und durch Inkorporation von [³H]-Thymidin bestimmt. Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden die Zellen mittels Trypsin/EDTA geerntet und mit einem Coulter-Counter gezählt. In Parallelkulturen wurde [³H]-Thymidin (1 μCi/ml; ICN) zu dem Medium 18 Stunden lang zugegeben und die Inkorporation in die TCA-unlösliche Schicht durch Flüssigszintillationszählung gemessen. Zu Extremitäten-Mesenchymzellen zugegebenes gereinigtes Cyr61-Protein erhöhte die Zellzahl und verstärkte die DNA-Synthese nach zwei und drei Tagen in Kultur, obgleich die Gesamtzellzahl in Cyr61-behandelten und Cyr61-unbehandelten Kulturen sich nach 4 Tagen auf dasselbe Ausmaß einpendelte.
Die Rolle von Cyr61 bei der Chondrogenese kann auch die Integration von Prothesen verbessern. Beispielsweise werden Skelettverletzungen und -leiden häufig durch Einsetzen einer Prothese, z. B. Hüftprothese, Knieprothese, behandelt. Über Fragen der Histokompatibilität hinaus erfordert die erfolgreiche Implantation einer Prothese, dass das fremde Element in die Skelettstruktur des Organismus integriert wird. Die Fähigkeit von Cyr61-Polypeptiden, Zelladhäsion, -migration und -vermehrung zu beeinflussen, und die Fähigkeit von Cyr61-Polypetiden, die Differenzierung von Mesenchymzellen zu Chondrozyten zu induzieren, sollte sich als wertvoll bei der Behand lung von Skelettstörungen durch Prothesenimplantation erweisen. Beispielsweise würde die Integration einer Prothese durch Chondrozyten-Kolonisierung durch therapeutische Behandlungen gefördert werden, die die Verabreichung von Cyr61 in einem pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans, Träger oder Verdünner umfassen, und zwar unter Anwendung beliebiger Verabreichungswege, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, oder durch Beschichten der Prothese mit Cyr61-Polypeptiden in einem geeigneten Träger. Der Träger kann auch ein Vehikel mit langsamer Freisetzung sein, um eine verzögerte Freisetzung der Polypeptide zu ermöglichen.
Wie vorher erwähnt, umfassen die Verfahren der Erfindung ein Verfahren des Screenings auf Modulatoren der Zellproliferation, einschließlich Chondrozyten. Ein Vergleich der relativen Raten der Zellvermehrung in Gegenwart einer Kontrolle, die ein ECM-Signalmolekül alleine umfasst (z. B. Cyr61), und in Gegenwart einer Kombination eines ECM-Signalmoleküls und eines mutmaßlichen Modulators der Zellvermehrung stellt eine Basis für die Identifizierung eines mutmaßlichen Modulators als Förderer oder Inhibitor der Chondrozyten-Vermehrung bereit.
Beispiel 27
Chondrogenese – ECM-Signalmoleküle fördern die Chondrogenese
Die chondrogene Differenzierung wurde durch Inkorporation von [³⁵S]-Sulfat (ICN) in sulfatierte Glykosaminoglykane quantifiziert und qualitativ mittels Alcian-Blau-Färbung beurteilt. Die Kulturen wurden mit 2,5 μCi/ml [³⁵S]-Sulfat 18 Stunden lang radioaktiv markiert, mit Kahle-Fixiermittel fixiert und mit 0,5% Alcian-Blau, pH 1,0, gefärbt (Lev et al. (1964)). Das Ausmaß an Chondrogenese wird mit der Intensität der Alcian-Blau-Färbung (San Antonio et al. (1986)) korreliert. [³⁵S]-Sulfat-Inkorporation in der fixierten Zellschicht wurde mittels Flüssigszintillationszählung quantifiziert.
Exogenes, gereinigtes Cyr61-Protein förderte die Extremitäten-Mesenchymzellenaggregation und resultierte in größeren, sich mit Alcian-Blau anfärbenden Knorpelregio nen in Mikromassenkulturen, was eine die Chondrogenese fördernde Wirkung nahe legt. Diese Wirkung wurde durch Inkorporation von [³⁵S]-Sulfat in sulfatierte Glykosaminoglykane (San Antonio et al. (1986)) in Cyr61-behandelten Mikromassenkulturen quantifiziert. Exogenes Cyr61 erhöhte die [³⁵S]-Sulfat-Inkorporation auf dosisabhängige Weise, was einen 1,5fachen und 3,5fachen Anstieg mit 0,3 bzw. 5 μg/ml Cyr61 bewirkte und qualitativ mit erhöhter Alcian-Blau-Färbung korrelierte. Der bei der 5-μg/ml-Cyr61-Dosis (120 nM) beobachtete Anstieg unterschätzt das tatsächlichen Ausmaß an Chondrogenese, da sich einige der großen Knorpelknötchen, die bei dieser Dosis gebildet wurden, von der Platte ablösten. Mit 10 μg/ml Cyr61 behandelte Kulturen bildeten einen massiveren Knorpelhügel.
Eine Durchsicht der Literatur wies darauf hin, dass die Chondrogenese in Extremitäten-Mesenchymzellen-Mikromassenkulturen mit der Zugabe von 10 μg/ml Heparin um das 2fache (San Antonio et al. (1987); Resh et al. (1985)) und mit 50 μg/ml Tenascin (200 nM) um das 3fache (Mackie et al. (1987)) anstieg. Die Ergebnisse zeigte, dass gereinigtes Cyr61 bei Konzentrationen (10–100 nM) wirksam war, die ähnlich oder niedriger als jene anderer Moleküle waren, die bekanntermaßen die Chondrogenese in diesem Zellsystem fördern.
Da ein gewisser Schwellwert an Zelldichte erreicht werden muss, damit die anfängliche Aggregation stattfinden kann (Umansky (1966); Ahrens et al. (1977)), sind bei niedrigen Dichten ausplattierte Embryo-Mesenchymzellen normalerweise unfähig, sich zu Chondrozyten zu differenzieren, obgleich der Zusatz exogener Faktoren, wie z. B. Heparin oder Poly-L-Lysin (San Antonio et al. (1986); San Antonio et al. (1987)) erwiesenermaßen die Chondrogenese in Zellen fördern, die unter diesen Bedingungen ausplattiert worden sind. Daher wurde die Fähigkeit von Cyr61 untersucht, die Differenzierung von Mesenchymzellen zu fördern, die mit Dichten über und unter dem Schwellwert für Chondrogenese ausplattiert waren. Mit 2,5 × 10⁶ Zellen/ml ausplattierte Zellen inkorporierten wenig [³⁵S]-Sulfat. Wenn jedoch Cyr61 zugesetzt wurde, bildeten diese Kulturen mit einer Dichte unter dem Schwellwert Knötchen und inkorporierten Sulfat bis zu einem Ausmaß, das ähnlich jenem in Kulturen war, die mit einer Dichte von 3 × 10⁶ Zellen/ml, die Chondrogenese unterstützt, ausplattiert waren. Daher kann Cyr61 Chondrogenese in Mesenchymzellen fördern, die bei nicht-chondrogenen Dichten unter dem Schwellwert ausplattiert wurden.
Daher ist es denkbar, dass bei Ausplattieren von Mesenchymzellen in einer Mikromasse hoher Dichte das Ausmaß an Chondrogenese maximal sein kann und durch exogene Faktoren, die möglicherweise auch nicht allen Zellen zugänglich sind, weiter gesteigert werden kann. Jedoch resultierte die Zugabe von exogenem Cyr61 in einer 2fachen Erhöhung der [³²S]-Sulfat-Inkorporation in Kulturen, die mit Dichten im Bereich von 3 bis 10 × 10⁶ Zellen/ml ausplattiert waren. Daher kann Cyr61 die Chondrogenese in Mikromassenkulturen hoher Dichte, die offenbar einen maximalen Grad an Differenzierung nicht erreicht haben, weiter erhöhen.
Es ist vorstellbar, dass, wenn Mesenchymzellen in einer hohen Mikromassendichte ausplattiert werden, das Ausmaß der Chondrogenese maximal sein kann und nicht durch exogene Faktoren, die auch nicht für alle Zellen zugänglich sein können, weiter erhöht werden kann. Die Zugabe von exogenem Cyr61 resultiert jedoch in einer 2fachen Steigerung der [³⁵S]-Sulfat-Inkorporation in Kulturen, die in Dichten von 3 bis 10 × 10⁶ Zellen/ml ausplattiert wurden. Daher kann Cyr61 die Chondrogenese in hohen Mikromassendichten weiter erhöhen, die offensichtlich kein maximales Ausmaß an Differenzierung erreicht haben.
Es ist möglich, dass die erhöhte [³⁵S]-Sulfat-Inkorporation in Cyr61-behandelte Kulturen zumindest teilweise auf einen Anstieg der Zellzahl zurückzuführen ist, da Cyr61 auch die Zellvermehrung fördert. Wenn dies korrekt wäre, dann würde die Normalisierung der Sulfatinkorporation bezüglich der Zellzahl jegliche Unterschiede zwischen Kontrolle und Cyr61-behandelten Kulturen eliminieren. Es erwies sich, dass dies nicht der Fall ist. Cyr61-behandelte Kulturen zeigten nach wie vor eine ungefähr 2fache Erhöhung der normalisierten Sulfatinkorporation gegenüber der Kontrolle, was darauf hinweist, dass Cyr61 einen Nettoanstieg an Chondrogenese fördert. Am Kulturtag 2 war das Sulfat : Zellzahl-Verhältnis in Cyr61-behandelten Kulturen im Ver gleich zu Kontrollen niedriger und spiegelt ein niedriges Ausmaß an [³²S]-Sulfat-Inkorporation relativ zur Zellzahl wider, da Mesenchymzellen sich in Kulturen dieses frühen Stadiums eher vermehren als differenzieren (Ede (1983)).
Die Gegenwart von endogenem Cyr61 in diesen Zellen sowohl in vivo als auch in vitro weist darauf hin, dass Cyr61 tatsächlich die biologische Funktion aufweist, die chondrogene Differenzierung zu regulieren. Die Fähigkeit von exogen zugegebenem, gereinigtem Cyr61, die interzelluläre Aggregation zu fördern und die [³⁵S]-Sulfat-Inkorporation und Alcian-Blau-Färbung in Extremitäten-Mesenchymzellen zu erhöhen, beweist, dass Cyr61 als Chondrogenese-Verstärkungsfaktor agieren kann. Wie oben in Beispiel 11 gezeigt, können Anti-Cyr61-Antikörper sowohl die Zelladhäsions- als auch die DNA-Synthese-Verstärkungsaktivitäten von Cyr61 neutralisieren. Anti-Cyr61-Antikörper wurden dem Mesenchymzellen-Kulturmedium zugegeben oder vor dem Ausplattieren mit der Zellsuspension gemischt. Die Chondrogense wurde in mit Anti-Cyr61-Antikörpern behandelten Kulturen gehemmt, wie durch Verminderungen der [³⁵S]-Sulfat-Inkorporation auf 50% und 30% der Kontrollen nachgewiesen wurde, wenn Antikörper dem Medium zugegeben bzw. mit den Zellen gemischt wurden. Diese Beobachtungen korrelierten mit verminderter Alcian-Blau-Färbung. Jedoch resultierte das Mischen der Anti-Cyr61-Antikörper mit Mesenchymzellen vor dem Ausplattieren in vollständiger Ablösung von manchen der behandelten Kulturen innerhalb von 24 Stunden.
Um die Möglichkeit einer nicht identifizierten Komponente im Antikörperpräparat als Ursache der Zellablösung zu eliminieren, wurde Anti-Cyr61-Antikörper mit 1 μg/ml gereinigtem Cyr61-Protein vor dem Mischen mit Zellen vorinkubiert. Die Hemmung der Chondrogenese in mit neutralisierten Anti-Cyr61-Antikörpern gemischten Mesenchymzellen wurde aufgehoben.
Im Allgemeinen umfasst die Erfindung ein Verfahren des Screenings auf Modulatoren der Chondrogenese. Ein Vergleichstest umfasst das Aussetzen von Chondrozyten gegenüber entweder (a) einer Kombination eines mutmaßlichen Modulators der Chondrogenese und eines ECM-Signalmoleküls, wie z. B. Cyr61, oder (b) dem ECM-Signalmolekül alleine. Messungen der relativen Chondrogenese-Raten stellen dann eine Basis für die Identifizierung des mutmaßlichen Modulators der Chondrogenese als Förderer oder Inhibitor dieses Prozesses bereit.
Die in diesem Beispiel beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass endogenes Cyr61 in Mesenchymzellen vorhanden und für ihre Chondrogenese von Bedeutung ist. Demgemäß beabsichtigt die Erfindung die Verwendung eines ECM-Signalmoleküls, wie z. B. Cyr61, um Knochenheilung zu induzieren. Beispielsweise wird eine biologisch wirksame Menge Cyr61 in eine Matrix, wie z. B. einen Schwamm, wie oben beschrieben eingeführt, und dieses Material wird dann aufgegeben, um Knochenbrüche zu fixieren, oder dazu verwendet, um die Fragmente einer Trümmerfraktur zueinander zu bringen. Es kann eine bioabbaubare Matrix eingesetzt werden, oder die Matrix kann zu einem geeigneten späteren Zeitpunkt entfernt werden. Alternativ dazu kann Cyr61 direkt auf den Knochen aufgetragen werden. Zusätzlich kann Cyr61 auf leblose Objekte, wie z. B. auf biokompatible Prothesen, wie in Beispiel 26 beschrieben angewendet werden.
Beispiel 28
Genetik
Ein anderer Weg, die Wirkungen eines ECM-Signalmolekül-verwandten Biomaterials zu kontrollieren, ist seine Inaktivierung durch Erzeugen von dominant negativen Mutationen im relevanten Gen in aktiv wachsenden und sich teilenden Zellen. Ein Ansatz umfasst die Verwendung rekombinanter Techniken, um z. B. homozygote mutierte Genotypen in Ex-vivo-Kulturen, wie z. B. HSC-Kulturen, zu erzeugen. Die Einführung dieser Zellen in einen Organismus, wie z. B. in einen humanen Patienten, würde dann eine Gelegenheit für die eingeführten mutierten Zellen bereitstellen, sich auszubreiten und die Expression des ECM-Signalmoleküls in vivo zu ändern. Mutanten, die für eine solche Mutation homozygot sind, könnten die Expression eines en dogenen ECM-Signalmoleküls der Wildform in anderen Zellen beeinflussen. Heterozygote Mutanten könnten veränderte ECM-Signalmoleküle produzieren, die zur Wechselwirkung mit dem ECM-Signalmolekül der Wildform, das ebenfalls exprimiert wird, in einer solchen Weise fähig sind, dass die Aktivitäten des ECM-Signalmoleküls moduliert oder aufgehoben werden.
Darüber hinaus könnten sich wegen der Rolle, die ECM-Signalmoleküle, wie z. B. Cyr61, bei der Regulation der Chondrogenese (d. h. Skelettentwicklung) spielen, genetische Manipulationen, die die Expression von Human-Cyr61 verändern, als medizinisch bedeutungsvoll für vorgeburtliche Screeningverfahren und Gentherapiebehandlungen erweisen, die mit Skelettleiden in Verbindung stehen, und zwar zusätzlich zu angiogenen Leiden. Beispielsweise wird das Cyr61-Gen exprimiert, wenn Mesenchymzellen ektodermalen sowie mesodermalen Ursprungs sich differenzieren, um Chondrozyten auszubilden. Folglich ist es eine Rolle, die Cyr61 spielen könnte, die Regulation der Festlegung von Mesenchymzellen auf Chondrozyten-Zelllinien, die an der Skelettentwicklung beteiligt sind. Im Einklang mit dieser Sichtweise werden transgene Mäuse, die Cyr61 ektopisch überexprimieren, mit Skelett-Abnormalitäten geboren. In allen untersuchten Fällen korreliert die Anwesenheit von Skelettdeformationen mit der Expression des Transgens. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Human-Form von Cyr61 ebenfalls die Chondrogenese und Skelettentwicklung regulieren kann. Es ist ferner möglich, dass das Human-Cyr61-Gen einem genetischen Locus entspricht, der wie bereits bekannt die Skelettentwicklung oder Geburtsdefekte in Verbindung mit der Knochen-Morphogenese beeinflusst. Die Kenntnis der Human-Cyr61-Proteinsequenz, die hierin in Seq.-ID Nr. 4 dargestellt ist, und der kodierenden Sequenz der cDNA, die hierin in Seq.-ID Nr. 3 dargestellt ist, stellen eine Basis für die Konstruktion einer Vielzahl von Gentherapieansätzen bereit.
Die Informationen stellen ferner eine Basis für die Konstruktion von Sonden bereit, die bei genotypischen Analysen, z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analysen, zweckdienlich sind. Solche Analysen sind auf den Gebieten genetischer Beratung, z. B. bei der Diagnose von Krankheiten und Leiden und der Wahrscheinlichkeit ihres Auftretens, sowie bei forensischen Analysen zweckdienlich.
Als Beispiel sind die Materialien der vorliegenden Erfindung im vorgeburtlichen Screening für eine Reihe von Leiden oder Störungen, einschließlich Blutstörungen, Skelettabnormalitäten und Krebsleiden, zweckdienlich. Wohl bekannte Techniken zum Erlangen fötaler Zellen, z. B. Amniozentese, stellen für die Diagnose benötigte Materialien bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die fötalen Zellen vermehrt und die DNA isoliert. In einer weiteren Ausführungsform werden fötale Zellen lysiert, und es werden Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung von Oligonucleotidprimern gemäß der Erfindung durchgeführt. Bei beiden Ansätzen wird die DNA dann der Analyse unterzogen. Einer der analytischen Ansätze umfasst die Bestimmung der Nucleotidsequenz bestimmter Regionen von cyr61 oder des gesamten Gens. Die verfügbare kodierende Sequenz von Human-cyr61, die hierin in Seq.-ID Nr. 3 dargestellt ist, erleichtert die Konstruktion von Sequenzierungsprimern und bringt daher die Nucleotidsequenzanalyse in den Bereich der praktischen Realität. Eine Alternative zur Nucleotidsequenzanalyse ist eine Untersuchung der Expressionseigenschaften der fötalen Nucleinsäure. Die Fähigkeit der fötalen Nucleinsäure, exprimiert werden zu können, könnte bei der Diagnose von Cyr61-bezogenen angiogenen, chondrogenen oder onkogenen Störungen entscheidend sein.
Die Erfindung umfasst auch ein Cyr61 umfassendes Set. Die Sets gemäß der Erfindung stellen Cyr61 in einer Form bereit, die zur Durchführung der oben genannten Verfahren der Erfindung zweckdienlich ist. Sets gemäß der Erfindung enthalten isoliertes und geeinigtes rekombinantes Human-Cyr61 in einem geeigneten Puffer, gegebenenfalls durch Zusatz von Glycerin zur Lagerung bei –20°C stabilisiert. Zusätzlich zum im Set bereitgestellten Cyr61 sieht die Erfindung ferner die Aufnahme von beliebigen einer Vielzahl von puffernden Mitteln, Salzen verschiedener Arten und Konzentrationen und zusätzlichen proteinstabilisierenden Mitteln, wie z. B. DTT, vor, die alle auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind. Andere Sets gemäß der Erfindung umfassen isoliertes und gereinigtes Maus-Cyr61. Sets, die ein Cyr61-Poly peptid und ein hemmendes Peptid oder einen Anti-Cyr61-Antikörper wie oben beschrieben umfassen, sind ebenfalls vorgesehen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes und isoliertes Polynucleotid, das für ein Polypeptid mit der in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert.
Gereinigtes und isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, worin die Kodierungssequenz die in Seq.-ID-Nr. 3 dargelegte ist.
Gereinigtes und isoliertes Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das fähig ist, Angiogenese, Chondrogenese, Onkogenese, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zellvermehrung zu modulieren, wobei das Polypeptid ein Fragment, ein Analog oder eine Variante des Polypeptids mit der in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Fragment, das Analog oder die Variante die Aminosäurereste 163 bis 229 von Seq.-ID-Nr. 4 umfasst.
Gereinigtes und isoliertes Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das fähig ist, Angiogenese, Chondrogenese, Onkogenese, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zellvermehrung zu modulieren, wobei das Polypeptid ein Fragment, ein Analog oder eine Variante des Polypeptids mit der in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Fragment, das Analog oder die Variante die Aminosäurereste 170 bis 185 von Seq.-ID-Nr. 4 umfasst.
Vektor, der ein Polynucleotid nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.
Wirtszelle, die mit einem Polynucleotid oder Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche transformiert oder transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, für das ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, folgende Schritte umfassend: (a) Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 6 unter geeigneten Nährbedingungen; sowie (b) Reinigen des Polypeptids aus der Wirtszelle oder aus einem Wachstumsmedium der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 7, das weiters das Bereitstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine biologisch wirksame Menge des Polypeptids und ein bzw. einen pharmazeutisch annehmbares/-en Adjuvans, Verdünner oder Träger umfasst.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid, das die in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid, das fähig ist, Angiogenese, Chondrogenese, Onkogenese, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zellvermehrung zu modulieren, und das ein Fragment, ein Analog, eine Variante oder ein Derivat des Polypeptids mit der in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Fragment, das Analog, die Variante oder das Derivat die Aminosäurereste 163 bis 229 von Seq.-ID-Nr. 4 umfasst.
Gereinigtes und isoliertes Polypeptid, das fähig ist, Angiogenese, Chondrogenese, Onkogenese, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zellvermehrung zu modulieren, und das ein Fragment, ein Analog, eine Variante oder ein Derivat des Polypeptids mit der in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Fragment, das Analog, die Variante oder das Derivat die Aminosäurereste 170 bis 185 von Seq.-ID-Nr. 4 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine biologisch wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und ein bzw. einen pharmazeutisch annehmbares/-en Adjuvans, Verdünner oder Träger umfasst.
Isolierter Antikörper, der für ein Polypeptid nach Anspruch 9 spezifisch ist.
Antikörper nach Anspruch 13, der sich innerhalb der Aminosäurereste 163 bis 229 von Seq.-ID-Nr. 4 bindet.
Antikörper nach Anspruch 13, der sich innerhalb der Aminosäurereste 170 bis 185 von Seq.-ID-Nr. 4 bindet.
Verfahren zum Screenen bezüglich eines Modulators von Angiogenese, Chondrogenese, Zellvermehrung oder Onkogenese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren einer ersten biologischen Probe, die fähig ist, Angiogenese, Chondrogenese oder Zellvermehrung zu erfahren, oder ein erster Tumor ist, mit einer biologisch wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und einem mutmaßlichen Modulator; (b) davon getrenntes Kontaktieren eine zweiten biologischen Probe, die fähig ist, Angiogenese, Chondrogenese oder Zellvermehrung zu erfahren, oder ein zweiter Tumor ist, mit einer biologisch wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (c) Messen des Ausmaßes an Angiogenese, Chondrogenese oder Zellvermehrung oder, wenn die erste und die zweite biologische Probe der erste und der zweite Tumor sind, das Messen des aus Schritt (a) und Schritt (b) resultierenden Ausmaßes an Onkogenese; (d) Vergleichen der in Schritt (c) gemessenen Ausmaße an Angiogenese, Chondrogenese, Zellvermehrung oder Onkogenese, wodurch ein Modulator von Angiogenese, Chondrogenese, Zellvermehrung oder Onkogenese durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Angiogenese, Chondrogenese, Zellvermehrung oder Onkogenese im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (b) zu verändern.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der Modulator ein Inhibitor von Angiogenese, Chondrogenese, Zellvermehrung oder Onkogenese ist, der durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Angiogenese, Chondrogenese, Zellvermehrung oder Onkogenese im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (b) zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, worin das Polypeptid die in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren zum Screenen bezüglich eines Modulators von Angiogenese, folgende Schritte umfassend: (a) Herstellen eines ersten Implantats, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 11 umfasst, und eines zweiten Implantats, das das Polypeptid und einen mutmaßlichen Modulator umfasst; (b) Implantieren des ersten Implantats in eine erste Hornhaut eines Testtieres und des zweiten Implantats in eine zweite Hornhaut des Testtieres; (c) Messen der Entwicklung von Blutgefäßen in der ersten und der zweiten Hornhaut; sowie (d) Vergleichen der in Schritt (c) gemessenen Ausmaße an Blutgefäßentwicklung, wodurch ein Angiogenese-Modulator durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Blutgefäßentwicklung in der ersten Hornhaut im Vergleich zur Blutgefäßentwicklung in der zweiten Hornhaut zu verändern.
Verfahren zum Screenen bezüglich eines Modulators für Zelladhäsion, folgende Schritte umfassend: (a) Herstellen einer mit Zellhaftung kompatiblen Oberfläche; (b) davon getrenntes Aufbringen einer ersten und einer zweiten biologischen Probe auf die Oberfläche, wobei jede Probe fähig ist, Zelladhäsion zu erfahren; (c) Kontaktieren der ersten biologischen Probe mit einem mutmaßlichen Modulator und einer biologisch wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11; (d) davon getrenntes Kontaktieren der zweiten biologischen Probe mit einer biologisch wirksamen Menge eines der Polypeptide, wodurch eine Kontrolle bereitgestellt wird; (e) Messen des Ausmaßes an Zelladhäsion, das aus Schritt (c) und aus Schritt (d) resultiert; sowie (f) Vergleichen der in Schritt (e) gemessenen Ausmaße an Zelladhäsion, wodurch ein Zelladhäsionsmodulator durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Zelladhäsion im Vergleich zur Kontrolle von Schritt (d) zu ändern.
Verfahren zum Screenen bezüglich eines Modulators für Zellmigration, folgende Schritte umfassend: (a) Bilden einer Gelmatrix, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und einen mutmaßlichen Modulator für Zellmigration umfasst; (b) Herstellen einer Kontroll-Gelmatrix, die eines der Polypeptide umfasst; (c) Säen von Endothelzellen, die fähig sind, Zellmigration zu erfahren, auf der Gelmatrix von Schritt (a) und der Kontroll-Gelmatrix von Schritt (b); (d) Inkubieren der Endothelzellen; (e) Messen der Ausmaße an Zellmigration durch Untersuchung des Inneren der Gelmatrix und der Kontroll-Gelmatrix auf Zellen; (f) Vergleichen der in Schritt (e) gemessenen Ausmaße an Zellmigration, wodurch ein Modulator für Zellmigration durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Zellmigration in der Gelmatrix im Vergleich zum Ausmaß an Zellmigration in der Kontrollgelmatrix zu ändern.
In-vitro-Verfahren zum Screenen auf Zellmigration, folgende Schritte umfassend: (a) Bilden eines ersten gelatinisierten Filters und eines zweiten gelatinisierten Filters, wobei jedes Filter zwei Seiten hat; (b) Kontaktieren der ersten Seite jedes Filters mit Endothelzellen, die fähig sind, Zellmigration zu erfahren, wodurch die Zellen an jedem der Filter haften; (c) Aufbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und eines mutmaßlichen Modulators für Zellmigration auf die zweite Seite des ersten gelatinisierten Filters und auf die zweite Seite des zweiten gelatinisierten Filters; (d) Inkubieren beider Filter, (e) Detektieren von Zellen auf der zweiten Seite jedes Filters; und (f) Vergleichen des Vorhandenseins von Zellen auf der zweiten Seite des ersten gelatinisierten Filters mit dem Vorhandensein von Zellen auf der zweiten Seite des zweiten gelatinisierten Filters, wodurch ein Modulator für Zellmigration durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das auf dem ersten gelatinisierten Filter gemessene Ausmaß an Zellmigration im Vergleich zu der auf dem zweiten gelatinisierten Filter gemessenen Zellmigration zu ändern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, worin das Polypeptid die in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
In-vivo-Verfahren zum Screenen bezüglich eines Modulators für Zellmigration, folgende Schritte umfassend: (a) Entfernen eines ersten zentralen Abschnitts eines ersten biokompatiblen Schwamms und eines zweiten zentralen Abschnitts eines zweiten biokompatiblen Schwamms; (b) Aufbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und eines mutmaßlichen Modulators auf den ersten zentralen Abschnitt und eines der Polypeptide auf den zweiten zentralen Abschnitt; (c) Wiedervereinigen des ersten zentralen Abschnitts mit dem ersten biokompatiblen Schwamm und des zweiten zentralen Abschnitts mit dem biokompatiblen Schwamm; (d) Befestigen eines ersten Filters an einer ersten Seite des ersten biokompatiblen Schwamms und eines zweiten Filters an einer zweiten Seite des ersten biokompatiblen Schwamms; (e) Befestigen eines dritten Filters an einer ersten Seite des zweiten biokompatiblen Schwamms und eines vierten Filters an einer zweiten Seite des zweiten biokompatiblen Schwamms; (f) Implantieren jedes biokompatiblen Schwamms in ein Testtier, wobei jeder biokompatible Schwamm den zentralen Abschnitt und die Filter umfasst; (e) Entnehmen jedes Schwamms nach einer Inkubationszeit; (f) Messen der Zellen, die in jedem der biokompatiblen Schwämme zu finden sind; und (g) Vergleichen des Vorhandenseins von Zellen im ersten biokompatiblen Schwamm mit dem Vorhandensein von Zellen im zweiten biokompatiblen Schwamm, wodurch ein Modulator für Zellmigration durch seine Fähigkeit identifiziert wird, das Ausmaß an Zellmigration, die unter Verwendung des ersten biokompatiblen Schwamms gemessen wird, im Vergleich zur Zellmigration, die unter Verwendung des zweiten biokompatiblen Schwamms gemessen wird, zu ändern.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Polypeptid die in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren zum Vermehren einer Population undifferenzierter haematopoetischer Stammzellen in Kultur, folgende Schritte umfassend: (a) Erhalten haematopoetischer Stammzellen von einem Donor; und (b) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Nährbedingungen in Gegenwart einer biologisch wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Polypeptid die in Seq.-ID-Nr. 4 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.