DE69830492T2

DE69830492T2 - Antikörper als ARZNEIMITTEL GEGEN LYMPHOCYTISCHE TUMORE (AUSSCHLIESSLICH MYELOME)

Info

Publication number: DE69830492T2
Application number: DE69830492T
Authority: DE
Inventors: Yasuo Gotenba-shi KOISHIHARA; Yasushi Gotenba-shi YOSHIMURA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2018-02-13
Also published as: CA2280875A1; EP0997152A4; PL335140A1; TR199901949T2; HK1026368A1; ES2241114T3; KR20000070989A; KR100655979B1; ATE297219T1; HUP0001136A2; SK110099A3; AU5956398A; RU2177805C2; UA65561A; KR20030097614A; US20030113334A1; BR9811094A; HUP0001136A3; CN1191855C; CA2280875C

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Mittel für lymphatische Tumoren (ausgenommen Myelom), umfassend als wirksamen Inhaltsstoff Antikörper, die spezifisch an Proteine binden, die in diesen lymphatischen Tumoren exprimiert sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Mittel für T-Zell-Tumoren oder B-Zell-Tumoren (ausgenommen Myelom). Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die spezifisch an Proteine binden, die in lymphatischen Tumoren exprimiert sind, und die eine zytotoxische Wirkung haben.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Lymphatische Zellen sind hauptsächlich für die Immunität im lebenden Körper verantwortlich. Lymphatische Zellen stammen alle von den gleichen hämopoetischen Stammzellen ab, welche nach wiederholten Differenzierungen durch die Einwirkung verschiedener Differenzierungs-induzierender Faktoren oder Wachstumsfaktoren im Knochenmark oder anderen Organen in das periphere Blut freigesetzt werden. Aufgrund von Unterschieden in dieser Differenzierung werden Lymphozyten grob in B-Zellen und T-Zellen klassifiziert. Von den B-Zellen wird angenommen, dass sie die Fähigkeit zum Herstellen von Antikörpern haben, während von den T-Zellen angenommen wird, dass sie die Fähigkeit haben, Antigene zu präsentieren, Zytotoxizität auszuüben und ähnliches. Wenn in diesen Zellen aus irgendeinem Grund in bestimmten Stadien der Differenzierung eine tumorigene Änderung auftritt, und diese in unkontrollierter Weise im Knochenmark, den lymphatischen Geweben, dem Blut oder ähnlichem zu proliferieren beginnen, wird ein solcher Zustand als lymphatischer Tumor bezeichnet.
Aufgrund der Einführung neuer Techniken, insbesondere technischer Vorteile, die von monoklonalen Antikörpern gegen Differenzierungsantigene auf der Zelloberfläche Verwendung machen, ist es möglich geworden, den Ursprung und/oder das Differenzierungsstadium lymphatischer Zellen zu identifizieren. Hiervon begleitet wurde es ebenfalls nicht nur möglich zu bestimmen, ob solche Tumorzellen von T- oder B-Zellen abstammen, sondern auch den Grad der Reife der Tumorzellen zu identifizieren.
Lymphatische Tumoren werden grob in B-Zell-Tumoren und T-Zell-Tumoren, in Abhängigkeit des Ursprungs und des Grads der Reife der Tumorzellen, eingeteilt. Auf der Grundlage des Grads der Reife der Tumorzellen werden die B-Zell-Tumoren in akute B-lymphatische Leukämie (B-ALL), chronische B-lymphatische Leukämie (B-CLL), Prä-B-Lymphom, Burkitt-Lymphom, follikuläres Lymphom, follikuläres Palliumlymphom, diffuses Lymphom und ähnliche eingeteilt. Dagegen werden die T-Zell-Tumoren auf der Grundlage des Reifegrades der Tumorzellen in akute T-lymphatische Leukämie (T-ALL), chronische T-lymphatische Leukämie (T-CLL), adulte T-Zell-Leukämie (ATL), nicht-ATL-periphäres T-Lymphom (PNTL) und ähnliche eingeteilt (Zukai Rinsho [Gan] (illustrated Clinical: Cancer), Seriennr. 17 Leukemia and Lymphoma, Takashi Sugimura et al., Medical View Co., Ltd., 1987, B cell tumors, Kiyoshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991).
Es ist wahr, dass trotz kürzlicher Fortschritte in den medizintechnischen Technologien Behandlungen lymphatischer Tumoren nicht befriedigend sind. Die Heilungsrate der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) ist beispielsweise noch immer 20 % niedriger und die von Lymphomen beträgt im fortgeschrittenen Stadium noch immer ungefähr 50 %, obwohl die Heilungsrate beim B-Zell-Lymphom aufgrund des Fortschritts in Multi-Medikamenten-Therapien angeblich relativ hoch ist. Des weiteren ist ein T-Zell-Lymphom schlechter aufzuspüren und hat eine Heilungsrate von gegenwärtig ungefähr 30 %, und die Rate beträgt weniger als 10 % bei der adulten T-Zell-Leukämie (ATL).
Andererseits haben Goto, T. et al. von einem monoklonalen Antikörper (Anti-HM1.24-Antikörper) berichtet, der durch die Immunisierung von Mäusen mit menschlichen Myelomzellen erhalten wurde (Blood (1994) 84, 1922–1930). Wenn der Anti-HM1.24-Antikörper einer Maus verabreicht wurde, der menschliche Myelomzellen transplantiert waren, häuft sich der Antikörper in den Tumorgeweben in spezifischer Form an (Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, 627–635), was nahelegte, dass der Anti-HM1.24-Antikörper bei der Diagnose der Tumorlokalisierung durch Radioisotopenmarkierung, Missile-Therapie, wie beispielsweise eine Radioimmuntherapie und ähnliche, angewandt werden könnte. Es ist jedoch nicht bekannt, dass der Anti-HM1.24-Antikörper für die Behandlung anderer lymphatischer Tumoren nützlich ist.
Ozaki S. et al berichten in Blood, Bd. 90, Nr. 8 (1997), S. 3179–3186 von der Behandlung von Mäusen, die mit Myelom-Zelllinien ARH-77 und RPMI 8226 xenotransplantiert wurden mit einem murinen monoklonalen Antikörper, der für HM1.24 spezifisch ist.
EP 0733643 offenbart ein Membranprotein-Polypeptid mit der Funktion der Unterstützung des Prä-B-Zellwachstums. Das Polypeptid hat die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 der vorliegenden Erfindung. Ein monoklonaler Antikörper, der dieses Polypeptid erkennt, ist ebenfalls offenbart.
EP 0960936 und EP 1020522 offenbaren ungeformte humane Anti-HM1.24-Antikörper.
EP 1023906 stellt einen Verstärker für einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein Protein mit Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 der vorliegenden Erfindung bindet.
EP 0972524 offenbart einen Inhibitor der Lymphocytenaktivierung, welcher den Anti-HM1.24-Antikörper umfasst.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Therapeutische Verfahren für lymphatische Tumoren, die gegenwärtig verwendet werden, schließen verschiedene Chemotherapien, Röntgenstrahlen-Therapien, die Knochenmarkstransplantation und ähnliche ein. Wie oben erwähnt wurde, ist jedoch bis jetzt keine hiervon bis für die Erkrankungen zufriedenstellend, und daher werden jetzt Epochen-machende therapeutische Mittel oder Verfahren, die lymphatische Tumoren lindern können und die Überlebensdauer des Patienten verlängern können, erwartet.
D.h., dass es ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein neues therapeutisches Mittel für lymphatische Tumoren, ausgenommen Myelome, bereitzustellen. Um ein solches therapeutisches Mittel bereitzustellen, haben die Erfinder umfangreiche in vitro Studien, einschließlich Durchflusszytometrie (FCM)-Analyse, die Bestimmung der zytotoxischen Wirkungen, wie beispielsweise der ADCC-Wirkung, der CDC-Wirkung, etc. durchgeführt, sowie in vivo Studien der Anti-Tumor-Wirkungen unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers (Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1922–1930) sowie Studien zur Isolierung des Antigenproteins, an das der Anti-HM1.24-Antikörper spezifisch bindet. Im Ergebnis haben die Erfinder herausgefunden, dass das Antigenprotein, dass durch Anti-HM1.24-Antikörper erkannt wird, auf lymphatischen Tumoren exprimiert wird, und das der Anti-HM1.24-Antikörper eine Anti-Tumor-Wirkung gegen lymphatische Tumoren hat, und dadurch haben sie die vorliegende Erfindung vollendet.
D.h., dass die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers bereitstellt, der spezifisch an ein HM1.24-Antigenprotein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 ausgeführt ist, bindet, und der zytotoxische Wirkung hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung lymphatischer Tumoren, mit der Ausnahme des Myeloms.
Die vorliegende Erfindung stellt eine solche Verwendung zur Behandlung von T-Zell-Tumoren oder B-Zell-Tumoren (ausgenommen Myelom) bereit.
Die bevorzugten Aspekte der Erfindung werden in den beiliegenden Ansprüchen ausgeführt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Histogramm der FCM-Analyse der angegebenen B-Zelllinie mit Hilfe der indirekten Methode unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers und Kontroll-Maus-IgG2a.
2 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
3 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
4 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti- HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
5 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
6 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
7 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
8 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
9 zeigt ein Histogramm der angegebenen B-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
10 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
11 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
12 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
13 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
14 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
15 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
16 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
17 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
18 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
19 zeigt ein Histogramm der angegebenen T-Zelllinie, die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
20 zeigt ein Histogramm der angegebenen Non-T-, Non-B-Zelllinie die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
21 zeigt ein Histogramm der angegebenen Non-T-, Non-B-Zelllinie die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
22 zeigt ein Histogramm der angegebenen Non-T-, Non-B-Zelllinie die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
23 zeigt ein Histogramm der angegebenen Non-T-, Non-B-Zelllinie die durch das indirekte Verfahren unter Verwendung des Anti-HM1.24-Antikörpers sowie den Kontroll-Maus-IgG2a FCM-analysiert wurde.
24 ist ein Graph, der zeigt, dass der Anti-HM1.24-Antikörper in dosisabhängiger Weise eine zytotoxische Wirkung auf die T-Zell-Tumorlinien CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 und HPB-MLT ausübt.
25 ist ein Graph, der zeigt, dass der Anti-HM1.24-Antikörper in dosisabhängiger Weise eine zytotoxische Wirkung auf die B-Zell-Tumorlinien EB-3, MC 116 und CCRF-SB ausübt.
26 ist ein Graph, der zeigt, dass ein Anstieg des Tumorvolumens bei Mäusen, die mit einem menschlichen lymphatischen Tumor transplantiert wurden, in der Anti- HM1.24-Antikörper-Verabreichungsgruppe unterdrückt wird, verglichen mit der Kontroll-Maus-IgG2a-Verabreichungsgruppe.
27 ist ein Graph, der zeigt, dass in Mäusen, die mit einem menschlichen lymphatischen Tumor transplantiert worden sind, die Überlebensdauer in der Anti-HM1.24-Antikörper-Darreichungsgruppe im Vergleich mit der Kontroll-Maus-IgG2a-Verabreichungsgruppe verlängert wurde.
AUSFÜHRUNGSFORM ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
1. ANTIKÖRPERHERSTELLUNG
1-1. Hypridom-Herstellung
Hybridome, die Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung herstellen, können grundsätzlich unter Verwendung eines, wie unten beschrieben, bekannten Verfahrens hergestellt werden. Das bedeutet, dass das HM1.24-Antigenprotein oder Zellen, die das HM1.24-Antigen exprimieren, als Sensibilisierungsantigen verwendet werden können, und für die Immunisierung in einem konventionellen Immunisierungsverfahren verwendet wird. Die Immunzellen, die auf diese Weise erhalten werden, werden mit bekannten Elternzellen in einem konventionellen Zellfusionsverfahren fusioniert, und dann werden sie mit Hilfe konventioneller Screening-Verfahren durchmustert, um Zellen auszuwählen, die monoklonale Antikörper herstellen.
Genauer gesagt, können monoklonale Antikörper auf folgende Weise erhalten werden. Beispielsweise kann als HM1.24-Antigen-exprimierende Zelle, die ein Sensibilierungsantigen zum Erhalt von Antikörper ist, die menschliche multiple Myelom-Zelllinie KPMM2 (japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7-236475) oder KPC-32 (Goto T. et al., Jpn. J. Clin. Hematom. (1991) 32, 1400) verwendet werden. Alternativ dazu kann als Sensibilisierungsantigen ein Protein mit der in SEQ ID NO: 1 ausgeführten Aminosäuresequenz verwendet werden, oder ein Peptid oder Polypeptid, welches ein Epitop enthält, das von einem Anti-HM1.24-Antikörper erkannt wird.
Hierin ist cDNA, die ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 ausgeführt ist, in die XbaI-Spaltstelle des pUC19-Vektors inseriert worden, um das Plasmid pRS38-pUC19 herzustellen. E. coli mit diesem Plasmid sind international unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrags als Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19) am 05. Oktober 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, als FERM BP-4434 hinterlegt worden (siehe die japanische nicht-geprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7-196694). Das in diesem Plasmid enthaltene cDNA-Fragment pRS38-pUC19 kann verwendet werden, um ein Peptid oder ein Polypeptid herzustellen, das ein Epitop enthält, das von dem Anti-HM1.24-Antikörper erkannt wird, indem die Genmanipulationstechnologie verwandt wird.
Bevorzugt werden Säuger, die mit dem Sensibilisierungsantigen immunisiert werden sollen, unter Beachtung ihrer Kompatibilität mit der Eltern-Zelllinie zur Verwendung der Zellfusion ausgewählt. Diese schließen allgemein Nager, wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Hamster und ähnliche ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Immunisierung von Tieren mit einem Sensibilisierungsantigen wird mit einem bekannten Verfahren durchgeführt. Ein allgemeines Verfahren schließt z.B. die intraperitoneale oder subkutane Verabreichung des Sensibilisierungsantigens an den Säuger ein. Genauer gesagt, wird ein Sensibilisierungsantigen, das wie gewünscht in einer geeigneten Menge phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder physiologischer Kochsalzlösung etc. verdünnt und suspendiert worden ist, mit einer geeigneten Menge an Freund's kompletten Adjuvans gemischt. Nachdem es emulgiert worden ist, wird es bevorzugt mehrere Male alle 4 bis 21 Tage einem Säuger verabreicht. Alternativ dazu kann ein geeigneter Träger zum Zeitpunkt der Immunisierung mit dem Sensibilisierungsantigen verwendet werden.
Nach der Immunisierung und der Bestätigung eines Anstiegs des gewünschten Antikörperniveaus im Serum, werden die Immunzellen aus dem Säuger entnommen und einer Zellfusion unterzogen, bei der bevorzugte Immunzellen insbesondere Milzzellen einschließen.
Die Säuger-Myelomzellen als die anderen Elternzellen, die mit den oben erwähnten Immunzellen einer Zellfusion unterworfen werden, schließen bevorzugt bekannte Zelllinien ein, wie beispielsweise P3X63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 1548–1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1–7), NS-1 (Kohler, G. und Milstein, C., Eur. J. Immunol (1976) 6: 511–519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8: 405–415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269–270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1–21), 5194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313–323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131–133) und ähnliche. Die Zellfusion zwischen den obengenannten Immunzellen und den Myelomzellen kann im wesentlichen in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren, wie beispielsweise in Milstein et al. (Kohler, G. und Milstein, C., Methods Enzymol (1981) 73: 3–46) und ähnlichen durchgeführt werden.
Genauer gesagt, wird die oben erwähnte Zellfusion in einer konventionellen Nährflüssigkeit in Gegenwart von beispielsweise einem Zellfusionsbeschleuniger durchgeführt. Als Zellfusionsbeschleuniger können beispielsweise Polyethylenglycol (PEG), das Sendai-Virus (HVJ) und ähnliche verwendet werden, und zusätzlich kann ein Adjuvans, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid etc. nach Wunsch hinzugegeben werden, um die Fusions-Effizienz zu verstärken.
Das bevorzugte Verhältnis der Immunzellen und der Myelomzellen, die zu verwenden sind, beträgt beispielsweise 1:10-mal mehr Immunzellen als Myelomzellen. Beispiele für ein zu verwendendes Kulturmedium, bei der oben erwähnten Zellfusion, schließen RPMI 1640-Medium und MEM-Kulturmedium ein, die für das Wachstum der oben erwähnten Myelom-Zelllinien geeignet sind, und das für diese Art von Zellkultur verwendete konventionelle Kulturmedium, und daneben kann ein Serumsupplement, wie beispielsweise fötales Kälberserum (FCS) hinzugegeben werden.
Bei der Zellfusion werden zuvor bestimmte Mengen der oben erwähnten Immunzellen und Myelomzellen in dem oben erwähnten Kulturmedium gut miteinander gemischt, zu dem eine zuvor auf ungefähr 37°C erwärmte PEG-Lösung, beispielsweise eine PEG-Lösung mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 1.000 bis 6.000 in einer Konzentration von 30 bis 60 % (w/v) hinzugegeben wird, und zugemischt wird, um die erwünschten Fusionszellen (Hybridome) zu erhalten. Dann können durch Wiederholung der aufeinanderfolgenden Zugabe eines geeigneten Kulturmediums und Zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen, Zellfusionsmittel etc., die für das Wachstum des Hybridoms unerwünscht sind, entfernt werden.
Dieses Hybridom wird durch Kultivieren in einem konventionellen Selektionsmedium, z.B. HAT-Kulturmedium (eine Kulturflüssigkeit, die Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält) ausgewählt. Die Kultivierung in diesem HAT-Kulturmedium wird allgemein für einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, um andere Zellen als die gewünschten Hybridome (nicht-fusionierte Zellen) abzutöten, im allgemeinen einige Tage bis einige Wochen. Das konventionelle "Limiting-Dilution"-Verfahren wird durchgeführt, wobei Hybridome, die den gewünschten Antikörper herstellen, ausgewählt werden und monoklonal kloniert werden.
Um zusätzlich das oben erwähnte Hybridom durch Immunisieren eines Tiers mit einem Antigen zu erhalten, welches nicht ein Mensch ist, ist es ebenfalls möglich, menschliche Lymphocyten in vitro mit dem HM1.24-Antigen oder HM1.24-Antigenexprimierenden Zellen zu sensibilisieren, und die erhaltenen sensibilisierten Lymphocyten werden mit menschlichen Myelomzellen, beispielsweise U266, fusioniert, um den gewünschten menschlichen Antikörper mit der Fähigkeit an das HM1.24-Antigen oder an HM1.24-Antigen exprimierende Zellen zu binden, zu erhalten (siehe japanische geprüfte Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 1-59878). Des weiteren wird ein transgenes Tier mit einem Repertoire aller menschlichen Antikörpergenen mit dem Antigen immunisiert, d.h. mit dem HM1.24-Antigen oder HM1.24-Antigenexprimierenden Zellen, um den gewünschten humanisierten Antikörper in dem oben beschriebenen Verfahren zu erhalten (siehe internationale Patentanmeldungen WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 und WO 96/33735).
Die auf diese Weise hergestellten den monoklonalen Antikörper herstellenden Hybridome können in einem konventionellen Kulturmedium subkultiviert werden, oder sie können für einen längeren Zeitraum in Flüssigstickstoff aufbewahrt werden.
Um den monoklonalen Antikörper aus diesem Hybridom zu erhalten, können ein Verfahren ein Verfahren erwähnt werden, in dem dieses Hybridom auf konventionelle Weise kultiviert wird, und die Antikörper in dem Überstand erhalten werden, oder ein Verfahren, bei dem das Hybridom einem Säuger verabreicht wird und darin gezüchtet wird, der mit diesem Hybridom kompatibel ist und die Antikörper werden in der Ascitesflüssigkeit erhalten. Das zuerst genannte Verfahren ist geeignet, um Antikörper von hoher Reinheit zu erhalten, während das Letzte für die Herstellung von Antikörpern im großen Maßstab geeignet ist.
Genauer gesagt, kann das Anti-HM1.24-Antikörper-herstellende Hybridom durch das Verfahren von Goto, T. et al. (Blood (1994) 84: 1922–1930) hergestellt werden. Es kann durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem das Anti-HM1.24-Antikörper-hergestellende Hybridom, das international unter den Vorraussetzungen des Budapester Vertrages als FERM PB-5233 am 04.September 1995 beim National Institut of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technolgoy, of 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki perf., Japan hinterlegt wurde, intraperitoneal in BALB/c-Mäuse injiziert wird (hergestellt von CLEA Japan), um die Ascitesflüssigkeit zu erhalten, aus der der Anti-HM1.24-Antikörper gereinigt wird, oder durch ein Verfahren, bei dem dieses Hybridom in einem geeigneten Kulturmedium, wie beispielsweise RPMI 1640-Medium, enthaltend 10 % fötales Rinderserum und 5 % BM-Condimed H1 (hergestellt von Boehringer Mannheim), das Hybridom-SFM-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL), das PFHM-II-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL) und ähnliche, kultiviert wird, und der Anti-HM1.24-Antikörper kann aus dem Überstand gereinigt werden.
1-2. Rekombinanter Antikörper
Ein rekombinanter Antikörper, der durch die rekombinante Gentechnik hergestellt wurde, bei der ein Antikörpergen aus dem Hybridom kloniert wurde und in einen geeigneten Vektor integriert wurde, der dann in einen Wirt eingeschleust wurde, kann in der vorliegenden Erfindung als monoklonaler Antikörper verwendet werden (siehe z.B. Carl, A.K., Borrebaeck, and James, W. Larrick, THERPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, veröffentlicht in Großbritannien von MICMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).
Genauer gesagt, wird mRNA, die die variable Region (V-Region) des gewünschten Antikörpers kodiert, aus dem Hybridom isoliert, das diesen Antikörper herstellt. Die Isolierung der mRNA wird durchgeführt, indem die gesamte RNA hergestellt wird, wobei beispielsweise ein bekanntes Verfahren, wie das Guanidin-Ultrazentrifugations-Verfahren (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294–5299), das AGPC-Verfahren (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156–159) durchgeführt wird, und die mRNA dann aus der Gesamt-RNA unter Verwendung des mRNA-Purification-Kits (hergestellt von Pharmacia) und ähnlicher gereinigt wird. Alternativ kann mRNA direkt unter Verwendung des Quick-Prep-mRNA-Purification-Kit (hergestellt von Pharmacia) hergestellt werden.
Die cDNA der V-Region des Antikörpers kann aus der mRNA, die auf diese Weise erhalten wurde, unter Verwendung der Reversen Transkriptase synthetisiert werden. cDNA kann unter Verwendung des AMV-Reverse-Transkriptase-Erststrang-cDNA-Synthese-Kits und ähnlicher synthetisiert werden. Alternativ dazu kann zur Synthese und Amplifizierung der cDNA der 5'-Ampli FINDER RACE Kit (hergestellt von Clontech) und das 5'-RACE-Verfahren (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998–9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919–2932), welche die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) benutzen, verwendet werden. Das gewünschte DNA-Fragment wird aus dem erhaltenen PCR-Produkt gereinigt und kann in Vektor-DNA ligiert werden. Außerdem wird ein rekombinanter Vektor hieraus konstruiert und dann in E. coli etc. eingeschleust, aus denen Kolonien ausgewählt werden, um einen gewünschten rekombinanten Vektor herzustellen. Die Nucleotidsequenz der gewünschten DNA kann durch ein bekanntes Verfahren, wie beispielsweise das Dideoxyverfahren, bestätigt werden.
Sobald die DNA, die für die V-Region des gewünschten Antikörpers kodiert, erhalten worden ist, kann sie mit DNA, die den konstanten Bereich (C-Region) des gewünschten Antikörpers kodiert, ligiert werden, welche dann in einen Expressionsvektor integriert wird. Alternativ dazu kann DNA, die die V-Region des Antikörpers kodiert, in einen Expressionsvektor integriert werden, der bereits die DNA enthält, die die C-Region des Antikörpers kodiert.
Um den Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung herzustellen wird das Antikörpergen, wie unten beschrieben, in einen Expressionsvektor integriert, so dass er unter Kontrolle der Expressions-Regulationsregion, beispielsweise eines Enhancers und/oder eines Promotors, exprimiert wird. Anschließend kann der Expressionsvektor in eine Wirtszelle transformiert werden und der Antikörper kann hierin exprimiert werden.
1-3. Veränderter Antikörper
Erfindungsgemäß kann ein künstlich veränderter rekombinanter Antikörper, wie beispielsweise ein chimärer Antikörper und ein humanisierter Antikörper zum Zwecke der Absenkung der heterologen Antigenizität gegen Menschen verwendet werden. Diese veränderten Antikörper können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden.
Ein chimärer Antikörper kann durch das Ligieren der so erhaltenen DNA, die eine V-Region des Antikörpers enthält, mit DNA, die eine C-Region des menschlichen Antikörpers enthält, erhalten werden, welche dann in einen Expressionsvektor inseriert wird, und zur Produktion des Antikörpers in einen Wirt eingeschleust wird (siehe europäische Patentanmeldung EP 125023 und die internationale Patentanmeldung WO 96/02576). Unter Verendung dieses bekannten Verfahrens kann ein für die vorliegende Erfindung nützlicher chimärer Antikörper erhalten werden.
Beispielsweise sind E. coli mit dem Plasmid, das DNA enthält, welche für die L-Ketten-V-Region oder die H-Ketten-V-Region des chimären Anti-HM1.24-Antikörpers kodiert, international unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrages als Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24L-gĸ) bzw. Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24H-gγ1) am 29. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki perf., Japan als FERM BP-5646 und FERM BP-5644, (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 9-271536) hinterlegt worden.
Ein humanisierter Antikörper, der ebenfalls als umgeformter menschlicher Antikörper bezeichnet wird, wurde durch die Aufpfropfung der Komplimentaritäts-bestimmenden Region (CDR) eines Antikörpers eines Säugers, der nicht ein Mensch ist, beispielsweise eines Maus-Antikörpers, in die CDR-Region eines menschlichen Antikörpers hergestellt. Die allgemeine rekombinante DNA-Technik zur Herstellung solcher Antikörper ist ebenfalls bekannt (siehe europäische Patentanmeldung EP 125023 und die internationale Patentanmeldung WO 96/02576).
Genauer wird eine DNA-Sequenz, die dafür entworfen wurde, die CDR eines Maus-Antikörpers mit dem Rahmenbereich (FR) eines menschlichen Antikörpers mit Hilfe des PCR-Verfahrens aus mehreren geteilten Oligonucleotiden mit den Abschnitten, die miteinander an den Enden überlappen, synthetisiert. Die so erhaltene DNA wird mit der DNA ligiert, die die C-Region des menschlichen Antikörpers kodiert und dann in einen Expressionsvektors inseriert, welcher dann zur Antikörperproduktion in einen Wirt eingeschleust wird (siehe europäische Patentanmeldung EP 239400 und die internationale Patentanmeldung WO 96/02576).
FRs menschlicher Antikörper, die durch CDRs verbunden werden, werden so ausgewählt, dass die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen eine günstige Antigen-Bindungsstelle bilden. Falls erwünscht, können die Aminosäuren in den Rahmenregionen des Antikörpers der variablen Region substituiert werden, dass die Komplimentaritäts-bestimmende Region des umgeformten menschlichen Antikörpers eine geeignete Antigen-Bindungsstelle bilden kann.
Beispielsweise sind E. coli mit dem Plasmid, das eine DNA enthält, die die Version a (SEQ ID NO: 2) der L-Ketten-V-Region und die die Version r (SEQ ID NO: 3) der H-Ketten-V-Region eines humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers kodiert international unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrages als Escherichia coli DH5α (pUC19-RV-La-AHM-gk) und Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHr-AHM-gγ1) am 29. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, of 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibarak pref., Japan, als FERM BP-5645 bzw. FERM BP-5643 (japanische Patentveröffentlichung Nr. 9-271536) hinterlegt worden (japanische Patentveröffentlichung Nr. 9-271536). Des weiteren sind E. coli mit dem Plasmid, welches eine DNA enthält, die die Version s (SEQ ID NO: 4) der H-Ketten-V-Region des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers kodiert unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrages als Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHs-AHM-gγ1) am 29. September 1997 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, of 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibarak pref., Japan, als FERM BP-6127 (japanische Patentveröffentlichung Nr. 9-271536) hinterlegt worden.
Bei chimären Antikörpern oder humanisierten Antikörpern wird die C-Region des menschlichen Antikörpers verwendet, und bevorzugter Weise kann menschliches Cγ, wie beispielsweise Cγ1, Cγ2, Cγ3 und Cγ4 als konstanter Bereich des menschlichen Antikörpers verwendet werden. Aus diesen haben Antikörper, die die Cγ1 und Cγ3 enthalten, eine starke zytotoxische Aktivität, d.h. eine ADCC-Aktivität und CDC-Aktivität, und daher werden sie erfindungsgemäß bevorzugt verwendet.
Ein chimärer Antikörper umfasst die variable Region eines Antikörpers, der von einem Säuger, der nicht der Mensch ist, stammt, und die C-Region, die von einem menschlichen Antikörper stammt, während humanisierte Antikörper die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen eines Antikörper s umfassen, die von einem Säuger stammen, der nicht der Mensch ist, und die Rahmenbereiche (FRs) und die C-Region des Antikörpers stammen aus einem menschlichen Antikörper. Entsprechend wurde die Antigenizität hiervon im menschlichen Körper reduziert, so dass sie als wirksamer Inhaltsstoff der therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines humanisierten Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließt den humanisierten Anti-HM1.24-Antikörper (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 9-271536) ein. Eine bevorzugte Ausführungsform einer L-Ketten-V-Region des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers schließt eine ein, die eine Aminosäuresequenz hat, die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, die in SEQ ID NO: 2 ausgeführt ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der H-Ketten-V-Region des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers schließt eine ein, die eine Aminosäuresequenz hat, die durch die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 3 oder 4 ausgeführt ist, kodiert wird.
1-4. Expression und Produktion
Antikörpergene, die wie oben beschrieben hergestellt werden, können exprimiert werden und der Antikörper kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden. Im Falle von Säugerzellen kann die Expression unter Verwendung eines Expressionsvektors erreicht werden, der einen für gewöhnlich verwendeten nützlichen Promotor, ein Antikörpergen, das exprimiert werden soll und DNA, in der ein Poly-A-Signal funktionsfähig 3'-stromabwärts damit verbunden ist oder ein Vektor, der diese DNA enthält, verwendet werden. Beispiele des Promotors/Enhancers schließen den menschlichen Cytomegalievirus "immediate early Promotor/Enhancer" ein.
Zusätzlich können als Promotor/Enhancer, die zur Expression eines Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, virale Promotor/Enhancer, wie beispielsweise ein Retrovirus, Polyomavirus, Adenovirus und Simian virus 40 (SV40) verwendet werden, und Promotor/Enhancer, die aus Säugerzellen stammen, wie beispielsweise der menschliche Elongationsfaktor 1α (HEF1α).
Beispielsweise kann eine Expression leicht mit Hilfe des Verfahrens von Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108) erreicht werden, wenn ein SV40-Promotor/Enhancer verwendet wird, oder mit dem Verfahren von Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), wenn der HEF1α-Promotor/Enhancer verwendet wird.
Im Falle von E. coli kann die Expression mit einem funktionsfähigen und für gewöhnlich verwendeten nützlichen Promotor, einer Signalsequenz zur Antikörpersekretion und dem zu exprimierenden Antikörpergen, gefolgt von der Expression hiervon durchgeführt werden. Als Promotor kann beispielsweise der lacz-Promotor und der araB-Promotor erwähnt werden. Das Verfahren von Ward et al. (Nature (1098) 341, 544–546; FASEB J. (1992) 6, 2422–2427) kann verwendet, wenn der lacz-Promotor verwendet wird, und das Verfahren von Better et al. (Science (1988) 240, 1041–1043) kann verwendet werden, wenn der araB-Promotor verwendet wird.
Als Signalsequenz zur Antikörpersekretion, wenn sie im Periplasma von E. coli produziert werden, kann die pelB-Signalsequenz (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) verwendet werden. Nach dem Abtrennen des Antikörpers, die im Periplasma hergestellt wurde, wird die Struktur des Antikörpers vor der Verwendung richtig zurückgefaltet (siehe z.B. WO 96/20394).
Als Replikationsursprung kann ein solcher verwendet werden, der von SV40, Polyomavirus, Adenovirus, Rinderpapillomavirus (BPV) und ähnlichen stammt. Des weiteren kann zur Amplifizierung der Gen-Kopienanzahl im Wirtszellsystem ein Expressionsvektor als selektionierbarer Marker das Aminoglycosidtransferase (APH)-Gen, das Thymidinkinase (TK)-Gen, das E. coli Xanthin-Guaninphosphoribosyl-Transferase (Ecogpt)-Gen, das Dihydrofolatreduktase (dhfr)-Gen und ähnliche enthalten.
Zur Herstellung eines Antikörpers zur Verwendung nach der vorliegenden Erfindung kann jedes Herstellungssystem verwendet werden. Das Produktionssystem zur Antikörperherstellung umfasst ein in vitro oder in vivo Produktionssystem. Als in vitro Produktionssystem können ein Produktionssystem erwähnt werden, das eukaryontische Zellen verwendet und ein Produktionssystem, das prokaryontische Zellen verwendet.
Wenn eukaryontische Zellen verwendet werden, gibt es Produktionssysteme die Tierzellen, Pflanzenzellen und Pilzzellen benutzen. Bekannte Tierzellen schließen (1) Säugerzellen, wie beispielsweise CHO-Zellen, COS-Zellen, Myelomazellen, Baby-Hamster-Nieren-Zellen (BHK), HeLa-Zellen und Vero-Zellen ein, (2) Amphibienzellen, wie beispielsweise Xenopus-Oocyten oder (3) Insektenzellen, wie beispielsweise sf9, sf21 und Tn5. Bekannte Pflanzenzellen schießen beispielsweise solche ein, die vom Genus Nicotiana stammen, genauer gesagt, Zellen die aus Nicotiana tabacum stammen, welche einer Calluskultur unterworfen werden. Bekannte Pilzzellen schießen Hefen ein, wie beispielsweise den Genus Saccharomyces, genauer gesagt Saccharomyces cereviceae, oder filamentöse Pilze, wie beispielsweise den Genus Aspergillus, genauer gesagt Aspergillus niger.
Wenn prokaryontische Zellen verwendet werden, gibt es Produktionssysteme, die bakterielle Zellen verwenden. Bekannte bakterielle Zellen schließen Escherichia coli (E. coli) und Bacillus subtilis ein.
Durch Einschleusung des Gens des gewünschten Antikörpers in diese Zellen durch eine Transformation und der Kultivierung der transformierten Zellen in vitro kann ein Antikörper erhalten werden. Die Kultur wird in bekannten Verfahren durchgeführt. Beispielsweise können als Kulturmedien DMEM, MEM, RPMI1640 und IMDM verwendet werden, und Serumzusatzstoffe, wie beispielsweise fötales Kälberserum (FCS) können in Kombination verwendet werden. Zusätzlich können Antikörper in vivo durch das Implantieren von Zellen, in die das Antikörpergen eingeschleust wurde, in die Abdominalhöhle eines Tieres und ähnliches hergestellt werden.
Als weitere in vivo Produktionssysteme können solche erwähnt werden, die Tiere benutzen, und solche, die Pflanzen benutzen. Wenn Tiere verwendet werden, gibt es Produktionssysteme, die Säuger und Insekten benutzen.
Als Säuger können Ziegen, Schweine, Schafe, Mäuse und Rinder verwendet werden (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Ebenfalls können Seidenraupen als Insekten verwendet werden.
Wenn Pflanzen verwendet werden, kann beispielsweise Tabak verwendet werden.
Antikörpergene werden in diese Tiere oder Pflanzen eingeschleust, die Antikörper werden in solchen Tieren oder Pflanzen hergestellt und gewonnen. Beispielsweise kann ein Antikörpergen in die Mitte des Gens inseriert werden, das ein Protein kodiert, das inhärent in der Milch produziert wird, wie beispielsweise Ziegen-β-Kasein, um so Fusionsgene herzustellen. DNA-Fragmente, die das Fusionsgen enthalten, in das das Antikörpergen inseriert worden ist, werden in einen Ziegen-Embryo injiziert, und der Embryo wird in eine weibliche Ziege eingepflanzt. Der gewünschte Antikörper wird aus der Milch gewonnen, die von der transgenen Ziege hergestellt wird, die von der Ziege geboren wurde, die den Embryo erhielt, oder von den Nachkommen hiervon. Um die Milchmenge zu erhöhen, die den gewünschten Antikörper enthält, welcher von der transgenen Ziege hergestellt wird, können, falls notwendig, Hormone der transgenen Ziege gegeben werden (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699–702).
Wenn Seitenraupen verwendet werden, wird ein Baculovirus, in das ein gewünschtes Antikörpergen inseriert worden ist, in die Seidenraupe infiziert und der gewünschte Antikörper kann aus der Körperflüssigkeit der Seidenraupe gewonnen werden (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592–594). Wenn außerdem Tabak verwendet wird, kann ein gewünschtes Antikörpergen in einen Expressionsvektor für Pflanzen, beispielsweise pMON 530, inseriert werden, und der Vektor wird in ein Bakterium, wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens, eingeschleust. Das Bakterium wird dann in Tabak, wie beispielsweise Nicotiana tabacum, infiziert, um den gewünschten Antikörper aus den Blättern des Tabaks zu gewinnen (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131–138).
Wenn ein Antikörper wie oben beschrieben in in vitro oder in vivo Produktionssystemen hergestellt wird, kann DNA die die schwere Kette (H-Kette) oder die leichte Kette (L-Kette) des Antikörpers kodiert, getrennt voneinander in einen Expressionsvektor inseriert werden, und die Wirte werden gleichzeitig transformiert, oder DNA, die die H-Kette und die L-Kette kodieren können, werden in einen einzigen Expressionsvektor integriert, und der Wirt hiermit transformiert (siehe internationale Patentanmeldung WO 94-11523).
Der wie oben hergestellte Antikörper kann zur Verwendung als modifizierter Antikörper an zahlreiche Moleküle gebunden werden, wie beispielsweise Polyethylenglycol (PEG). "Antikörper" schließt, so wie er hier verwendet wird, diese modifizierten Antikörper ein. Um einen solchen modifizierten Antikörper zu erhalten, kann der Antikörper chemisch modifiziert werden. Diese Verfahren sind bereits im Stand der Technik etabliert worden.
2. ABTRENNUNG UND REINIGUNG DES ANTIKÖRPERS
2-1. Abtrennung und Reinigung des Antikörpers
Antikörper, die wie oben beschrieben hergestellt und exprimiert wurden, können vom Inneren oder Äußeren der Zelle oder vom Wirt abgetrennt werden und dann bis zur Homogenität gereinigt werden. Die Abtrennung und Reinigung des Antikörpers zur erfindungsgemäßen Verwendung kann durch Affinitätschromatographie erfolgen. Als Säule, die in einer solchen Affinitätschromatographie verwendet wird, können beispielsweise eine Protein-A-Säule und Protein-G-Säule erwähnt werden. Beispiele für Träger für die Protein-A-Säulen sind Hyper D, POROS, Sepharose F. F. und ähnliche.
Alternativ können ohne Beschränkung Verfahren zur Trennung und Reinigung, die für Proteine konventionell benutzt werden, verwendet werden. Die Abtrennung und Reinigung eines Antikörpers zur erfindungsgemäßen Verwendung kann durch das Kombinieren einer geeigneten Chromatographie, die anders ist als die oben erwähnte Affinitätschromatographie, von Filtration, Ultrafiltration, Aussalzung, Dialyse und ähnlicher erreicht werden. Die Chromatographie schließt beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration und ähnliche ein. Diese Chromatographien können auf die HPLC angewandt werden. Alternativ dazu kann Umkehrphasenchromatographie verwendet werden.
2-2. Bestimmung der Antikörperkonzentration
Die Konzentration des in dem obigen 2-1 erhaltenen Antikörpers kann durch die Messung der Absorption oder durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) und ähnliche bestimmt werden. D.h., wenn eine Absorptionsmessung verwendet wird, dass der Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung oder eine Probe, die den Antikörper enthält, entsprechend mit PBS(–) verdünnt wird und dann wird die Absorption bei 280 nm gemessen, gefolgt von der Berechnung unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten bei 1,35 OD entsprechend 1 mg/ml. Wenn das ELISA-Verfahren verwendet wird, wird die Messung wie folgt durchgeführt. D.h., dass 100 μl Ziege-Anti-Human-IgG (hergestellt von BIO SOURCE), welches auf 1 μg/ml in 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt ist, zu einer 96-Well-Platte (hergestellt von Nunc) gegeben wird, und über Nacht bei 4°C inkubiert wird, um den Antikörper zu immobilisieren.
Nach dem Blockieren werden 100 μl jedes entsprechend verdünnten Antikörpers der vorliegenden Erfindung oder eine Probe, die den Antikörper enthält, oder 100 μl humanes IgG einer bekannten Konzentration als Standard hinzugegeben, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen werden 100 μl eines 5.000-fach verdünnten alkalischen Phosphatase-markierten Anti-Human-IgG-Antikörpers (hergestellte von BIO SOURCE) hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wird die Substratlösung hinzugegeben und inkubiert, gefolgt von der Messung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung des MICROPLATE READER-Modells 3550 (hergestellt von Bio-Rad) um die Konzentration des gewünschten Antikörpers zu berechnen.
3. FCM-ANALYSE
Die Reaktivität des Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gegenüber lymphatischen Tumorzellen kann durch die Durchflusszytometrie (FCM)-Analyse untersucht werden. Die verwendeten Zellen können etablierte Zelllinien sein oder frisch isolierte Zellen. Als etablierte Zelllinien können als T-Zelllinie beispielsweise verwendet werden RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), CCRF-CEM (ATCC CCL-119), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammen, HPB-ALL (FCCH1018), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt, HPB-MLT (FCCH1019), die aus einem T-Lymphom stammt, JM (FCCH1023), die aus einem akuten lymphatischen Leukämie stammt, MOLT-4 (ATCC CRL-1582), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, Jurkat (FCCH1024), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, MT-1 (FCCH1043), die aus einer adulten T-Zell-Leukämie stammt, KT-3, die aus einem Lennert's-Lymphom stammt (Shimizu, S. at al., Blood (1988) 71, 196–203) und ähnliche; als B-Zelllinie können eine EB-Virus-transformierte Zelle CESS (ATCC TIB-190), eine EB-Virus-positive B-Zelle SKW 6.4 (ATCC TIP-215), MC116 (ATCC CRL-1649), die aus einem B-Lymphom stammt, CCRF-SB (ATCC CCL-120), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, die B-Zelle RPMI 6410 (FCCH6047), die aus einem Patienten mit akuter myelozytischer Leukämie stammt, Daudi (ATCC CCL-213), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, EB-3 (ATCC CCL-85), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, Jijoye (ATCC CCL-87), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, Raji (ATCC CCL-86), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, verwendet werden und als Non-T-, Non-B-Zelllinie HL-60 (ATCC CCL-240), die von einer akuten myelozytischen Leukämie stammt, THP-1 (ATCC TIB-202), die von einer akuten monozytischen Leukämie abstammt, U-937 (ATCC CRL-1593), die aus einem histiozytischen Lymphom stammt, K-562 (ATCC CCL-243), die aus einer chronischen myelozytischen Leukämie stammt und ähnliche.
Nach dem Waschen der oben genannten Zellen in PBS(–), werden 100 μl eines Antikörpers oder eines Kontroll-Antikörpers, der auf 25 μg/ml in dem FACS-Puffer (PBS(–), enthaltend 2 fötales Kälberserum und 0,1 % Natriumazid) verdünnt ist, hinzugegeben, welche dann auf Eis für 30 Minuten inkubiert werden. Nach dem Waschen in FACS-Puffer werden 100 μl 25 μg/ml FITC-markierter Ziege-Anti-Maus-Antikörper (GAM, hergestellt von Becton Dickinson) hinzugegeben, welche dann für 30 Minuten auf Eis inkubiert werden. Nach dem Waschen im FACS-Puffer werden die Zellen in 600 μg oder 1 ml FACS-Puffer suspendiert und jede der Zellen kann hinsichtlich ihrer Fluoreszenzintensität unter Verwendung des FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) gemessen werden.
Aus dem gemessenen Wert der Fluoreszenzintensität für jede der Zellen kann die Reaktivität des Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung mit jeder der Zellen erkannt werden. D.h., dass aus dem gemessenen Fluoreszenzintensitätswert für jede der Zellen erkannt werden kann, ob das HM1.24-Antigen auf jeder der Zellen (positiv oder negativ) exprimiert ist, oder der Grad der Expression kann erkannt werden. Das Vorhandensein und die Intensität der Expression des HM1.24-Antigens in lymphatischen Tumorzellen werden in der FCM-Analyse in Beispiel 2.2. unten beschrieben.
Die Tumorzellen der lymphatischen Tumoren, die Ziel der Behandlung der vorliegenden Erfindung sein können, exprimieren das HM1.24-Antigen. Genauer gesagt sind die Tumorzellen der lymphatischen Tumoren bevorzugt solche, bei denen die prozentuale Positivität des HM1.24-Antigens niedriger als 5 % ist. Noch genauer ausgedrückt, sind die Tumorzellen der lymphatischen Tumoren bevorzugt solche, bei denen die prozentuale Positivität des HM1.24-Antigens 20 oder mehr ist. Genauer gesagt sind die Tumorzellen der lymphatischen Tumoren bevorzugt solche, bei denen die prozentuale Positivität des HM1.24-Antigens 50 % oder mehr ist. Genauer gesagt sind die Tumorzellen der lymphatischen Tumoren bevorzugt solche, bei denen die prozentuale Positivität des HM1.24-Antigens 80 % oder mehr ist.
4. ZYTOTOXISCHE AKTIVITÄT
4-1. Messung der CDC-Aktivität
Der Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung ist einer, der als zytotoxische Aktivität beispielsweise eine CDC-Aktivität besitzt.
Die CDC-Aktivität eines erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels für lymphatische Tumoren kann auf folgende Weise gemessen werden. Zuerst werden die Zielzellen zu 4 × 10⁵ Zellen/ml in einem geeigneten Medium hergestellt, z.B. einem RPMI1640-Medium, das 10 % fötales Kälberserum (hergestellt von GIBCO-BRL) enthält. Als Zielzellen können verwendet werden CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), MC116 (ATCC CAL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K-562 (ATCC CCL-243) und ähnliche. 50 μl dieser Zellen werden z einer 96-Well-Flachbodenplatte (hergestellt von FALCON) gegeben und die Platte wird in einem CO₂-Inkubator bei 37°C über Nacht inkubiert.
Dann wird der Antikörper, dessen CDC-Aktivität zu messen ist, hinzugegeben und für 60 Minuten inkubiert, und dann passend verdünntes Komplement, z.B. Baby-Kaninchen-Komplement (hergestellt von CEDARLANE) zugegeben und für 2 Stunden inkubiert. Zu jedem der Wells werden 10 μl Alamar Blue (hergestellt von BIO SOURCE) hinzugegeben und für 4 Stunden inkubiert, welches dann unter Verwendung eines Fluoreszenzmessungssystems CytoFluor 2350 (hergestellt von MILLIPORE) hinsichtlich seiner Fluoreszenzintensität gemessen wird (Anregungswellenlänge 530 nm, Emissionswellenlänge 590 nm). Die zytotoxische Aktivität (%) kann als (A – C)/(B – C) × 100 berechnet werden, bei der A die Fluoreszenzintensität ist, wenn in Gegenwart des Antikörpers inkubiert wurde, B die Fluoreszenzintensität ist, wenn im Medium alleine, welches keinen Antikörper enthält, inkubiert wird, und C die Fluoreszenzintensität eines Wells ist, das keine Zellen enthält.
4-2. Messung der ADCC-Aktivität
Der Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung ist einer, der als zytotoxische Aktivität beispielsweise eine ADCC-Aktivität aufweist.
Die ADCC-Aktivität eines erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels für lymphatische Tumoren kann auf folgende Weise gemessen werden. Zuerst werden mononukleare Zellen als Effektorzellen aus menschlichen peripherem Blut oder Knochenmark durch das Gravitäts-Zentrifukations-Verfahren isoliert. Als Zielzellen werden CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HAB-2 (ATCC CCL-120.1), HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), MC116 (ATCC CAL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K-562 (ATCC CCL-243) oder ähnliche mit ⁵¹Cr markiert, um die Zielzellen herzustellen. Anschließend wird der für die ADCC-Aktivität zu messende Antikörper zu den markierten Zielzellen hinzugegeben und inkubiert. Effektorzellen in einem geeigneten Verhältnis zu den Zielzellen werden dann hinzugegeben und inkubiert.
Nach der Inkubation wird der Überstand eingesammelt und hinsichtlich der Radioaktivität unter Verwendung eines Gamma-Strahlenmessgeräts gemessen, wobei 1 % NP-40 für die Messung der maximalen freien Radioaktivität verwendet werden kann. Die zytotoxische Aktivität (%) kann berechnet werden als (A – C)/(B – C) × 100, wobei A die Radioaktivität (cpm) ist, die in Gegenwart des Antikörpers freigesetzt wird, B die Radioaktivität (cpm) ist, die durch NP-40 freigesetzt wurde, und C die Radioaktivität (cpm) ist, die vom Medium selbst freigesetzt wurde, welches keinen Antikörper enthielt.
4-3. Verstärkung der zytotoxischen Aktivität
Um eine zytotoxische Wirkung, wie beispielsweise eine ADCC-Wirkung und eine CDC-Wirkung auszuüben, wird es bevorzugt Cγ, insbesondere Cγ1 und Cγ3 als konstanten Bereich (C-Bereich) des Antikörpers bei Menschen zu verwenden. Des weiteren kann eine stärkere ADCC-Aktivität oder CDC-Aktivität durch Zugeben, Verändern oder Modifizieren eines Teils der Aminosäuren im C-Bereich des Antikörpers induziert werden.
Beispielhaft können die Konstruktion eines IgM-artigen Polymers aus IgG durch eine Aminosäuresubstitution erwähnt werden (Smith, R.I.F. & Morrison, S.L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683–688), die Konstruktion eines IgM-artigen Polymers aus IgG durch die Aminosäureaddition (Smith, R.I.F. et al., J. Immunology (1995) 154, 2226–2236), die Expression eines Tandem-artig ligierten Gens, das die L-Kette enthält (Shuford, W. et al., Science (1991) 252, 724–727), die Dimerisierung von IgG mittels Aminosäuresubstitution (Caron, P.C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191–1195, Shopes, B., J. Immunology (1992) 148, 2918–2911), die Dimerisierung von IgG durch chemische Modifikation (Wolff, E. A. et al., Cancer Res. (1993) 53, 2560–2565) und die Einschleusung einer Effektorfunktion durch Änderung der Aminosäuren in dem Scharnierbereich des Antikörpers (Norderhaug, L. et al., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379–2384) und ähnliche. Diese können mit Hilfe der Oligomer-ortsspezifischen Mutagenese unter Verwendung eines Primers, der Zugabe einer Basensequenz unter Verwendung einer Restriktions-Enzyms-Spaltungsstelle oder der Verwendung eines chemischen Modifikationsmittels, das eine kovalente Bindung erzeugt, erreicht werden.
5. BESTÄTIGUNG DER THERAPEUTISCHEN WIRKUNGEN
Die therapeutischen Wirkungen eines therapeutischen Mittels zur erfindungsgemäßen Verwendung für lymphatische Tumoren können durch die Verabreichung des Antikörpers in der erfindungsgemäßen Verwendung an Tiere bestätigt werden, die mit lymphatischen Tumorzellen transplantiert wurden, und dann durch Ermittlung der Antitumorwirkung auf die Tiere.
Als lymphatische Tumorzellen, die dem Tier gegeben werden können, können eine etablierte Zelllinie oder frisch isolierte Zellen verwendet werden. Als etablierte Zelllinie können CCRF-CEM (ATCC CCL-119), HPB-MLT (FCCH1019), MOLT-4 (ATCC CRL-1582), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) und ähnliche als T-Zelllinie und CESS (ATCC TIP-190), SKW 6.4 (ATCC TIB-215), CCRF-SB (ATCC CCL-120), RPMI 6410 (FCCH6047), EB-3 (ATCC CCL-85) und ähnliche als B-Zelllinie verwendet werden.
Tiere, die ein Transplantat erhalten sind bevorzugt solche, deren immunologische Funktionen reduziert oder nicht vorhanden sind. Beispielsweise können eine Nacktmaus, eine SCID-Maus, eine Beige-Maus, eine Nacktratte und ähnliche verwendet werden. Die Antitumorwirkungen, die ermittelt werden sollen, können durch Messung des Volumens und Gewicht des Tumors, oder der Überlebensdauer der Tiere und ähnliches bestätigt werden.
Wie in den Beispielen unten gezeigt wird, führte die Verabreichung des Anti-HM1.24-Antikörpers zur Unterdrückung einer Zunahme im Tumorwachstum und außerdem zur Verlängerung der Überlebensdauer der Tumor-transplantieren Mäuse. Diese Fakten weisen darauf hin, dass der Anti-HM1.24-Antikörper eine Antitumorwirkung auf lymphatische Tumoren hat.
6. VERABREICHUNGSWEG UND PHARMAZEUTISCHE Herstellung
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel für lymphatische Tumoren können entweder systemisch oder lokal, auf parenteralem Wege, z.B. intravenöse Injektion, die Tröpfcheninfusion, intramuskuläre Injektion, intraperitoneale Injektion und subkutane Injektion verabreicht werden. Das Verabreichungsverfahren kann in Abhängigkeit vom Alter und dem Zustand des Patienten passend gewählt werden. Die wirksame Dosis wird ausgewählt aus dem Bereich von 0,01 mg bis 100 mg pro kg Körpergewicht je Verabreichung. Alternativ dazu kann der Dosisbereich von 1 bis 1.000 mg, bevorzugt 5 bis 50 mg pro Patient gewählt werden.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel für lymphatische Tumoren können abhängig von dem Verabreichungsweg pharmazeutisch annehmbare Träger oder Zusatzstoffe enthalten. Beispiele solcher Träger oder Zusatzstoffe schließen Wasser, ein pharmazeutisch annehmbares organisches Lösungsmittel, Kollagen, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, ein Carboxyvinylpolymer, Carboxymethylcellulosenatrium, Polyacrylnatrium, Natriumalginat, wasserlösliches Dextran, Carboxymethylstärkenatrium, Pektin, Methylcellulose, Ethylcellulose, Xanthangum, Gummi-Arabicum, Kasein, Gelatine, Agar, Diglycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Vaseline, Paraffin, Stearylalkohol, Stearinsäure, menschliches Serumalbumin (HSA), Mannitol, Sorbitol, Lactose, ein pharmazeutisch annehmbares Tensid und ähnliche ein. Verwendete Zusatzmittel werden aus den oben genannten oder aus Kombinationen daraus in Abhängigkeit von der Dosierungsform ausgewählt, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die erfindungsgemäß zu behandelnden Erkrankungen sind lymphatische Tumoren (ausgenommen Myelome), die ein Antigen auf den Tumorzellen haben, an die der Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung bindet. Spezifisch können die akute B-lymphatische Leukämie (B-ALL), chronische B- lymphatische Leukämie (B-CLL), Pre-B-Lymphom, Burkitt-Lymphom, follikuläres Lymphom, follikuläres Palliumlymphom, diffuses Lymphom, akute T-lymphatische Leukämie (T-ALL), chronische T-lymphatische Leukämie (T-CLL), adulte T-Zell-Leukämie (ATL), nicht-ATL-peripheres T-Lymphom (PNTL) und ähnliche erwähnt werden. Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel sind als therapeutische Mittel für diese lymphatischen Tumoren nützlich.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun unten in genaueren Details unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Es ist anzumerken, dass die vorliegende Erfindung in keiner Weise durch diese Beispiele beschränkt wird.
BEISPIEL 1 Herstellung EINES ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPERS
1. Herstellung von Maus-Ascitesflüssigkeit, enthaltend den Anti-HM1.24-Antikörper.
Hybridome, die einen Anti-HM1.24-Antikörper herstellen, wurden gemäß dem Verfahren von Goto, T. et al. (Blood (1994) 84, 1922–1930) erhalten.
Einer BALB/c-Maus (von CLEA Japan gezüchtet), die zuvor eine intraperitoneale Verabreichung von 500 μl von 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden jeweils 11 und 3 Tage zuvor 5 × 10⁶ Hybridomzellen intraperitoneal injiziert. Ab Tag 10 nach der Injektion der Hybridomzellen wurde Ascitesflüssigkeit, die sich in der Abdominalhöhle der Maus ansammelte, über eine 19 Gauge Dauer-Nadel Happycas (hergestellt von Medikit) eingesammelt. Die eingesammelte Ascitesflüssigkeit wurde zweimal bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 1.000 und 3.000 RPM unter Verwendung einer Niedriggeschwindigkeits-Zentrifuge RLX-131 (hergestellt von Tomy Seiko) zentrifugiert, um das Hybridom und die Kontaminanten, wie beispielsweise Blutzellen und ähnliche, zu entfernen.
2. Reinigung des Anti-HM1.24-Antikörpers aus Maus-Ascitesflüssigkeit.
Die Reinigung des Anti-HM1.24-Antikörpers aus der oben genannten Maus-Ascitesflüssigkeit wurde mit dem folgenden Verfahren durchgeführt. Nach der Hinzugabe einer gleichen Menge an PBS(–) zur Maus-Ascitesflüssigkeit wurde das Gemisch unter Verwendung eines Hohlphaserfilters Medi-aprep (hergestellt von MILLIPORE) filtriert, und dann wurde es unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Antikörperreinigungsinstruments ConSep LC100 (hergestellt von MILLIPORE) affinitätsgereinigt und mit der Hyper-D-Protein-A-Säule (Säulenvolumen 20 ml, hergestellt von Nihon Gaisi), und PBS(–) als Adsorptionspuffer sowie 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 4) als Elutionspuffer gemäß den beigefügten Anweisungen gereinigt. Die eluierten Fraktionen wurden durch Hinzugabe von 1 M Tris-HCl (pH 8,0) sofort auf einen pH-Wert von ungefähr 7,4 eingestellt und wurden dann einer Aufkonzentrierung und Ersetzen des Puffers gegen PBS(–) unter Verwendung eines Zentrifugen-Ultrafilrationskonzentrat Centriprep 10 unterworfen, welches dann mit dem Membranfilter MILLEX-GV mit einer Porengröße von 0,22 μm filtersterilisiert wurde (hergestellt von MILLIPORE), um den gereinigten HM1.24-Antikörper zu erhalten.
3. BESTIMMUNG DER ANTIKÖRPERKONZENTRATION
Die Konzentration des gereinigten Antikörpers wurde durch die Messung der Absorption bestimmt. D.h., dass der gereinigte Antikörper in PBS(–)verdünnt wurde, die Absorption bei 280 nm gemessen wurde und die Konzentration unter Verwendung von 1,35 OD bei 1 mg/ml berechnet wurde.
BEISPIEL 2 UNTERSUCHUNG DER REAKTIVITÄT DES ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPERS GEGENÜBER LYMPHATISCHEN TUMORZELLEN
1. Reinigung von Kontroll-IgG2a der Maus
Kontroll-IgG2a der Maus wurde im folgenden Verfahren gereinigt. Kommerziell erhältliches IgG2a (KAPPA) (UPC 10) Ascitesflüssigkeit (hergestellt von CAPPEL) wurde in gereinigtem Wasser und PBS(–) gelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung des Membranfilters Acrodisc (hergestellt von Gelman Sciences) mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriert und wurde dann unter Verwendung des Hochgeschwindigkeits-Antikörperreinigungsinstruments ConSep LC100 (hergestellt von MILLIPORE) und der Hyper-D-Protein-A-Säule (Säulenvolumen 20 ml, hergestellt von Nihon Gaisi), und PBS(–) als Adsorptionspuffer und 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 4) als Elutionspuffer gemäß den beigefügten Instruktionen gereinigt.
Die eluierten Fraktionen wurden durch Zugabe von 1 M Tris-HCl (pH 8,0) sofort auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, und dann wurden mit Hilfe eines Zentrifugations-Ultrafiltrations-Konzentrators Centriperp 10 sie einer Aufkonzentrierung und einem Ersatz des Puffers gegen PBS(–)unterworfen, welches dann mit einem Membranfilter MILLEX-GV (hergestellt von MILLIPORE) mit einer Porengröße von 0,22 μm Filtersterilisiert wurde, um den gereinigten Kontroll-IgG2a der Maus zu erhalten.
Die Bestimmung der Konzentration des Kontroll-IgG2a der Maus wurde gemäß dem obigen 3 durchgeführt.
BESTIMMUNG DER ANTIKÖRPERKONZENTRATION
2. FCM-ANALYSE
Die Reaktivität des Anti-HM1.24-Antikörpers mit lymphatischen Tumorzellen wurde durch Durchflusszytometrie (FM)-Analyse untersucht. Nach dem Waschen der T-Zelllinie RPMI 8402 (ATCC CRL-1995), CCRF-CEM (ATCC CRL-119), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, von HPB-ALL (FCCH1018), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt, von HPB-MLT (FCCH1019), die aus einem T-Lymphom stammt, von JM (FCCH1023), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt, von MOLT-4 (ATCC CRL-1582), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, von Jurkat (FCCH1024), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt, von CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, von MT-1 (FCCH1043), die aus einer akuten T-Zellleukämie stammt, und von KT-3, die aus dem Lennert's-Lymphom stammt (Shimizu, S. et al., Blood (1988) 71, 196–203); sowie als B-Zelllinie der EB-Virustransformierte Zelle CESS (ATCC TIB-190), der EB-Viruspositive B-Zelle SKW 6.4 (ATCC TIB-215), von MC116 (ATCC CRL-1649), die aus einem B-Lymphom stammt, von CCRF-SB (ATCC CCL-120), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, der B-Zelle-RPMI 6410 (FCCH6047), die aus einem Patienten mit akuter myelozytischer Leukämie stammt, von Daudi (ATCC CCL-213), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, von EB-3 (ATCC CCL-85), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, von Jijoye (ATCC CCL-87), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, von Raji (ATCC CCL-86), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, und als Non-T-, Non-B-Zelllinie der HL-60 (ATCC CCL-240), die aus einer akuten myelozytischen Leukämie stammt, von THP-1 (ATCC TIB-202), die aus einer akuten monocytischen Leukämie stammt, von U-937 (ATCC CRL-1593), die aus einem histiocytischen Lymphom stammt und von K-562 (ATCC CCL-243), die aus einer chronischen myelocytischen Leukämie stammt in PBS(–), wurden 100 μl Anti-HM1.24-Antikörper oder der gereinigte Kontrollmaus-IgG2a-Antikörper, der auf 25 μg/ml in FACS-Puffer (PBS(–), enthaltend 2 % fötales Kälberserum und 0,1 % Natriumazid) verdünnt war, hinzugegeben, welche dann für 30 Minuten auf Eis inkubiert wurden.
Nach dem Waschen im FACS-Puffer, wurde 100 μl 25 μg/ml FITC-markierter Ziege-Anti-Maus-Antikörper (GAM) hier zugegeben, welche dann für 30 Minuten auf Eis inkubiert wurden. Nach dem Waschen im FACS-Puffer wurden die Zellen in 600 μl oder 1 ml FACS-Puffer suspendiert und jede Zellsuspension wurde hinsichtlich ihrer Fluoreszenzintensität unter Verwendung von FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) gemessen. Die Ergebnisse, die in den 1 bis 23 gezeigt werden, bestätigten, dass alle T-Zelllinien und alle B-Zelllinien (ausgenommen Daudi und Raji, die nicht reagierten) mit dem Anti-HM1.24-Antikörper reagierten und das HM1.24-Antigen stark exprimierten. Andererseits reagierte keine der Non-T-, Non-B-Zelllinien mit dem Anti-HM1.24-Antikörper und die Expression des Antigens wurde in keiner hiervon nachgewiesen.
In den Histogrammen der 1 bis 23 wurden Histogrammmarker so angesetzt, dass die negativen Zellen 98 % und die positiven Zellen für 2 % bei der Färbung mit dem Kontroll-Maus-IgG2a ausmachten. Dann wurde gemäß den Histogrammmarkern der Prozentsatz der HM1.24-Antigenpositiven Zellen, wenn der Anti-HM1.24-Antikörper verwendet wurden, ausgerechnet und das Ergebnis wird in Tabelle 1 gezeigt. Bei dem Prozentsatz der HM1.24-Antigen-positiven Zellen wurde die Expressionsrate des HM1.24-Antigens in 5 Stadien unterteilt: –, +/–, +, ++ und +++. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass alle T-Zelllinien und B-Zelllinien (ausgenommen Daudi und Raji) das HM1.24-Antigen ähnlich den Ergebnissen in 1 bis 23 stark exprimierten. Ebenfalls war in allen Fällen der Non-T-, Non-B-Zelllinien der Prozentsatz der HM1.24-Antigen-positiven Zellen negativ oder betrug weniger als 5 %, was darauf hindeutete, dass die Expression des Antigens nicht vorhanden oder sehr niedrig ist.
TABELLE 1

– <5 %
+/–, 5 – 20 %;
+, 20 – 50 %;
++, 50 – 80 %;
+++, >80 %

BEISPIEL 3 BESTIMMUNG DER CDC-AKTIVITÄT
Die CDC-Aktivität des Anti-HM1.24-Antikörpers gegen lymphatische Tumorzellen wurde wie folgt bestimmt:
1. HERSTELLUNG VON ZIELZELLEN
Als Zielzelle wurde CCRF-CEM (ATCC CCL-119), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammt, HPB-MLT (FCCH1019), die aus einem T-Lymphom stammt, EB-3 (ATCC CCL-85), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, MC 116 (ATCC CAL-1649), die aus einem Burkitt-Lymphom stammt, CCRF-SB (ATCC CCL-120), die aus einer akuten lymphatischen Leukämie stammt und K-562 (ATCC CCL-243), die aus einer chronischen myelozytischen Leukämie stammt zu 4 × 10⁵ Zellen/ml in dem RPMI 1540-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL), enthaltend 10 % fötales Kälberserum (GIBCO-BRL), gegeben. 50 μl jeder dieser Zellsuspensionen wurden in eine 96-Well-Flachbodenplatte (hergestellt von FALCON) gegeben und bei 5 % CO₂ in einem Hochfeuchtigkeits-Inkubator (hergestellt von TABAI) über Nacht bei 37°C inkubiert.
2. HERSTELLUNG DES ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPERS
Der gereinigte Anti-HM1.24-Antikörper, der im obigen Beispiel 1 erhalten wurde, wurde zu 0, 0,2, 2 und 20 μg/ml in dem RPMI 1640-Medium, das 10 % fötales Kälberserum enthält (hergestellt von GIBCO-BRL) hergestellt und 50 μl hiervon wurde zu der im obigen 1. hergestellten 96-Well-Flachbodenplatte hinzugegeben. Nach dem Inkubieren der Platte in einem 5%igen CO₂-Hochfeuchtigkeitsinkubator (hergestellt von TABA1) für 60 Minuten bei 37°C wurde in der Niedriggeschwindkeitszentrifuge O5PR-22 (hergestellt von Hitachi) bei 100 UPM für 5 Minuten zentrifugiert und 50 μl des Überstands wurden entfernt.
3. HERSTELLUNG VON KOMPLEMENT
Babykaninchen-Komplement (hergestellt von DECARLANE) wurde in gereinigtem Wasser zu 1 ml pro Fläschchen gelöst, welches weiter in 5 ml RPMI 1640-Medium (hergestellt von GIBCO-BRL), ohne FCS verdünnt wurde. 50 μl wurden in die 96-Well-Flachbodenplatte gegeben, die in dem obigen Abschnitt 2 hergestellt wurde und in einem 5 % CO₂-Hochfeuchtigkeitsinkubator (hergestellt von TABA1) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
4. BESTIMMUNG DER CDC-AKTIVITÄT
Nachdem die Inkubation beendet war, wurden 10 μl Alamar Blue (hergestellt von BIO SOURCE) zu jedes Well der 96-Well-Flachbodenplatte des obigen Abschnitts 3 hinzugegeben und bei 37°C für 4 Stunden in einem 5 % CO₂-Hochfeuchtigkeitsinkubator (hergestellt von TABA1) inkubiert. Jedes Well wurde dann hinsichtlich der Fluoreszenzintensität (Anregungswellenlänge 530 nm, Emissionswellenlänge 590 nm) unter Verwendung Fluoreszenzmessungssystem CytoFluor 2350 (hergestellt von MILLIPORE) gemessen. Die zytotoxische Aktivität (%) wurde berechnet als (A – C)/(A – V) × 100, wobei A die Fluoreszenzintensität ist, wenn in Gegenwart des Antikörpers inkubiert wurde, B die Fluoreszenzintensität ist, wenn im Medium alleine ohne Antikörper inkubiert wurde, und C die Fluoreszenzintensität des Wells ohne Zellen war.
Das Ergebnis zeigte, dass, wie in 24 und 25 gezeigt, K562 in der FCM-Analyse nicht mit dem Anti-HM1.24-Antikörper reagierte und keine Zytotoxizität aufwies, selbst nachdem der Anti-HM1.24-Antikörper hinzugegeben wurde, während CCRF-CM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MC116 und CCRF-SB, die mit dem Anti-HM1.24-Antikörper reagierten, Zytotoxizität in einer Konzentrations-abhängigen Weise vom Anti-HM1.24-Antikörper zeigten. Dies stellte klar, dass der Anti-HM1.24-Antikörper gegen lymphatische Tumoren, welche ein Antigenprotein auf der Oberfläche haben, an das der Anti-HM1.24-Antikörper spezifisch bindet, eine CDC-Aktivität besitzt.
BEISPIEL 4 ANTITUMORWIRKUNGEN DES ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPERS AUF MÄUSE, DIE MIT EINEM HUMANEN LYMPHATISCHEN TUMOR TRANSPLANTIERT WURDEN:
1. HERSTELLUNG DES ZU VERABREICHENDEN ANTIKÖRPERS
1-1. Herstellung des Anti-HM1.24-Antikörpers
Der gereinigte Anti-HM1.24-Antikörper, der im obigen Beispiel 1 erhalten wurde, wurde zu 1 mg/ml und 200 μg/ml in Filtersterilisiertem PBS(–) hergestellt und wurde für die folgenden Experimente verwendet.
1-2. Herstellung von Kontroll-IgG2a der Maus
Der im obigen Beispiel 2 erhaltene gereinigte Antikörper wurde zu 1 mg/ml in Filter-sterilisiertem PBS(–) hergestellt und wurde für die folgenden Experimente verwendet.
2. ANTITURMORWIRKUNGEN DES ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPERS BEI MÄUSEN, DENEN EIN HUMANER LYMPHATISCHER TUMOR TRANSPLANTIERT WURDE
2-1. Herstellung von Mäusen, denen ein humaner lymphatischer Tumor transplantiert wurde.
Mäuse, die mit einem humanen lymphatischen Tumor transplantiert wurden, wurden wie folgt hergestellt. Die aus einer akuten lymphoblastischen Leukämie stammenden CCRF-HSB-2-Zellen (ATCC CCL 120.1), die in vivo unter Verwendung von SCID-Mäusen (CLEA Japan) subkultiert wurden, wurden zu 1 × 10⁸-Zellen pro ml in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum (hergestellt von GIBCO-BRL) hergestellt. Die Zellsuspensionen, die wie oben hergestellt wurden, wurden subkutan in den Unterbauch der SCID-Mäuse (männlich, 6 Wochen alt) injiziert, die jeweils zuvor (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) am vorherigen Tag eine intraperitoneale Verabreichung von 100 μl Anti-Asialo-GM1 erhalten hatten.
2-2. Verabreichung des Antikörpers
Am Tag 7 nach der Transplantation des Tumors wurde der Durchmesser des Tumors unter Verwendung von Messschiebern an der Stelle, wo die CCRF-HSB-2 der oben genannten Mäuse, die mit einem humanen lymphatischen Tumor transplantiert wurden gemessen. Nachdem das Volumen des Tumores berechnet worden war, wurden die Tiere eingruppiert, so dass das mittlere Tumorvolumen jeder Gruppe ungefähr gleich der anderen war (acht Tiere je Gruppe, 3 Tiere). Vom gleichen Tag an wurden 100 μl 1 mg/ml oder 200 μg/ml des Anti-HM1.24-Antikörpers oder 1 mg/ml des Kontroll-Maus-IgG2a, das im obigen 1 hergestellt worden war, intraperitoneal jeder Gruppe verabreicht. Die Verabreichung wurde zweimal pro Woche insgesamt 19-mal in gleiche Weise durchgeführt. Während dieser Zeit wurde der Durchmesser des Tumors unter Verwendung von Messschiebern zweimal je Woche gemessen und das Volumen des Tumores wurde berechnet.
2-3. Untersuchung der Anti-Tumorwirkung des AntiHM1.24-Antikörpers in Mäusen, denen ein menschlicher lymphatischer Tumor transplantiert worden ist
Die Tumorwirkung des Anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch Veränderungen des Tumorvolumens und die Überlebensdauer der Mäuse untersucht. Im Ergebnis, wie in 26 gezeigt, wurde ein Anstieg des Volumen des Tumors in der Gruppe der Anti-HM1.24-Antikörper verabreicht wurde, im Vergleich zur Gruppe, der Kontroll-Maus-IgG2a verabreicht wurde, unterdrückt. Wie ebenfalls in 27 gezeigt, wurde eine Verlängerung der Überlebensdauer in der Anti-HM1.24-Antikörper- Verabreichungsgruppe im Vergleich zur Kontroll-Maus-IgG2a-Verabreichungsgruppe beobachtet. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass der Anti-HM1.24-Antikörper einen Antitumoreffekt bei Mäusen hat, denen ein humaner lymphatischer Tumor transplantiert worden ist.
REFERENZBEISPIEL 1 HERSTELLUNG VON HYBRIDOMEN, DIE DEN MONOKLONALEN ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPER HERSTELLEN
In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992–1930, wurden Hybridome, die einen monoklonalen Maus-Anti-HM1.24-Antikörper herstellen, hergestellt.
Die Plasmazelllinie KPC-32 (1 × 10⁷), die aus dem Knochenmark eines Patienten mit einem menschlichen multiplen Myelom stammt (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400) wurde zweimal alle 6 Wochen in die Abdominalhöhle einer BALB/c-Maus (hergestellt von Charles River) injiziert.
3 Tage vor dem Opfern des Tiers wurden 1,5 × 10⁶ KPC-32 in die Milz der Maus injiziert, um die Antikörper-Produktionsfähigkeit der Maus weiter zu verstärken (Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Nach dem Opfern des Tieres wurde die Milz entnommen und das herausgenommene Organ wurde einer Zellfusion mit der Myelomzelle SP2/0 gemäß dem Verfahren von Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) unterworfen.
Durch Zell-ELISA (Posner, M.R. et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) unter Verwendung von KPC-32, wurde der Kulturüberstand des Hybridoms auf Antikörper durchmustert. 5 × 10⁴ KPC-32 wurden in 50 ml PBS suspendiert und dann wurden sie in eine 96-Well-Platte aliquotiert (U-bodenförmig, Corning, hergestellt von Iwaki), welche dann bei 37°C über Nacht luftgetrocknet wurde. Nach dem Blockieren mit PBS, das 1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, wurde der Kulturüberstand des Hybridoms zugegeben und für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Dann wurde ein Peroxidase-markierter Anti-Maus-IgG-Ziegen-Antikörper (hergestellt von Zymed) für 1 Stunde bei 4°C reagieren gelassen. Nach dem Waschen wurde eine o-Phenylendiaminlösung (hergestellt von Sumitomo Bakelite) bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgesetzt.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2 N Schwefelsäure gestoppt und die Absorption wurde bei 492 nm unter Verwendung des ELISA-Readers gemessen (hergestellt von Bio-Rad). Um das Hybridom, das die Antikörper gegen humanes Immunglobulin produziert, zu entfernen, wurde der Kulturüberstand des positiven Hybridoms zuvor gegen Humanserum adsorbiert und die Reaktivität gegenüber anderen Zelllinien wurde mittels ELISA gescreent. Positive Hybridome wurden ausgewählt und ihre Reaktivität gegenüber verschiedenen Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Der zuletzt ausgewählte Hybridomklon wurde zweimal kloniert und wurde in die Abdominalhöhle einer Pristan-behandelten BALB/c-Maus injiziert und hieraus wurde Ascitesflüssigkeit gewonnen.
Monoklonale Antikörper wurden mittels Ammoniumsulfatpräzipitierung aus der Ascitesflüssigkeit der Maus gereinigt und mit einem Protein A-Affinitätschomatographie-Kit (Ampure PA, hergestellt von Amersham). Die gereinigten Antikörper wurden unter Verwendung des Qick-Tag-FITC Binding Kit (hergestellt von Boehringer Mannheim) mit FITC markiert.
Im Ergebnis reagierten monoklonale Antikörper, die von 30 Hybridomklonen hergestellt wurden, mit KPC-32 und RPMI 8226. Nach dem Klonieren wurde die Reaktivität des Kulturüberstandes dieser Hybridome gegenüber andere Zelllinien oder peripherer mononuklearer Blutzellen untersucht.
Hiervon produzierten 3 Klone monoklonale Antikörper, die spezifisch mit der Plasmazelle reagierten. Von diesen drei Klonen wurde ein Hybridomklon, der am nützlichsten für die Durchflusszytometrieanalyse war und eine CDC-Aktivität gegen RPMI 8226 wurde ausgewählt und als HM1.24 bezeichnet. Die Subklasse des monoklonalen Antikörpers, der von diesem Hybridom hergestellt wird, wurde mit Hilfe eines ELISAs unter Verwendung eines Subklassen-spezifischen Anti-Maus-Kaninchen-Antikörpers (hergestellt von Zymed) bestimmt. Anti-HM1.24-Antikörper hat die Subklasse IgG2a ĸ. Das Hybridom HM1.24, das den Anti-HM1.24-Antikörper produziert, wurde international unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrags als FERM BP-5233 am 14. September 1995 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, hinterlegt.
REFERENZBEISPIEL 2 HERSTELLUNG EINES HUMANISIERTEN ANTI-HM1.24-ANTIKÖRPERS
Ein humanisierter Anti-HM1.24-Antikörper wurde in dem folgenden Verfahren gewonnen.
Vom Hybridom HM1.24, das in Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde, wurde mit Hilfe eines konventionellen Verfahrens Gesamt-RNA hergestellt. Hieraus wurde cDNA, die die V-Region des Mausantikörpers kodiert, synthetisiert und mit Hilfe des Polymerasekettenreaktion (PCR)-Verfahrens und dem 5'-RACE-Verfahren amplifiziert. Ein DNA-Fragment, das das Gen enthält, das die Maus-V-Region kodiert, wurde gewonnen, welches jeweils in einen Plasmid-pUC-Klonierungsvektor ligiert wurde und dann in kompetente E. coli-Zellen eingeschleust wurde, um eine E. coli-Transformante zu gewinnen. Das oben erwähnte Plasmid wurde aus der Transformante gewonnen. Die Nukleotidsequenz der cDNA-kodierenden Region in dem Plasmid wurde in konventioneller Weise bestimmt, und die Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) jeder V-Region wurde bestimmt.
Um einen Vektor herzustellen, der einen chimären Anti-HM1.24-Antikörper exprimiert, wurde cDNA, die die V-Region sowohl der L-Kette und der H-Kette des Maus-Anti-HM1.24-Antikörpers kodiert, in den HEF-Vektor inseriert. Des weiteren wurde eine V-Region-CDR eines Maus-Anti-HM1.24-Antikörpers auf einen menschlichen Antikörper mit Hilfe des CDR-Grafting-Verfahrens aufgepfropft, um einen humanisierten Anti-HM1.24-Antikörper zu konstruieren. Die L-Kette des menschlichen Antikörpers REI wurde als L-Kette des menschlichen Antikörpers verwendet, die FRs 1 bis 3 des menschlichen Antikörpers HG3 wurden als Rahmenbereiche (FRs) 1 bis 3 der H-Kette des menschlichen Antikörpers verwendet, und FR4 des menschlichen Antikörpers JH6 wurde als FR4 verwendet. Einige Aminosäuren im FR und der H-Kette-V-Region wurden ersetzt, so dass der CDR-transplantierte Antikörper eine geeignete Antigen-bindende Stelle ausformen kann.
Um das Gen der L-Kette und der H-Kette des so konstruierten humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers in einer Säugerzelle zu exprimieren, wurde jedes Gen separat in den HEF-Vektor eingeschleust, um einen Vektor zu konstruieren, der die L-Kette oder die H-Kette des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers exprimiert.
Durch das gleichzeitige Einschleusen dieser zwei Expressionsvektoren in CHO-Zellen, wurde eine Zelllinie etabliert, die humanisierten Anti-HM1.24-Antikörper herstellt. Die Antigen-Bindungsaktivität und die Bindungs-Inhibierungsaktivität an der menschlichen Amnion-Zelllinie WISH des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers, der durch Kultivieren dieser Zelllinie erhalten wurde, wurde durch Zell-ELISA untersucht. Das Ergebnis zeigte an, dass der humanisierte Anti-HM1.24-Antikörper Antigen-Bindungsaktivität hat, die dem chimären Antikörper gleich ist, und bei Bindungs-Inhibierungsfähigkeit unter Verwendung eines biotinylierten Maus-Anti-HM1.24-Antikörpers hatte er ebenfalls eine gleiche Aktivität wie der chimäre Antikörper oder Maus-Antikörper.
Im übrigen sind E. coli mit dem Plasmid, das die DNA enthält, welche die L-Ketten-V-Region kodiert, und die für die H-Ketten-V-Region des chimären Anti-HM1.24-Antikörpers international unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrages als Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24L-gĸ) bzw. Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24H-gγ1) am 29. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, als FERM BP-5646 bzw. FERM BP-5644 hinterlegt worden. Des weiteren sind E. coli mit dem Plasmid, das die DNA enthält, welche die Version a (SEQ ID NO: 2) der L-Ketten-V-Region oder die für die Version r (SEQ ID NO: 3) der H-Ketten-V-Region des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers enthält international unter den Vorraussetzungen des Budapester Vertrages als Escherichia coli DH5α (pUC19-RV-La-AHM-gĸ) bzw. Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHr-AHM-gγ1) am 29. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, als FERM BP-5645 bzw. FERM BP-5643 hinterlegt worden. Des weiteren sind E. coli mit dem Plasmid, das die DNA enthält, das die Version s (SEQ ID NO: 4) der H-Ketten-V-Region und des humanisierten Anti-HM1.24-Antikörpers kodiert international unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrages als Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHs-AHM-gγ1) am 29. September 1997 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, als FERM BP-6127 hinterlegt worden.
REFERENZBEISPIEL 3 KLONIERUNG VON cDNA, DIE DAS HM1.24-ANTIGENPROTEIN KODIERT
Es wurde cDNA, die das HM1.24-Antigenprotein kodiert, welche spezifisch vom Anti-HM1.24-Antikörper erkannt wird, kloniert.
1. KONSTRUKTION DER cDNA-BIBLIOTHEK
1) Herstellung von Gesamt-RNA
Aus der menschlichen multiplen Myelomazelllinie KPMM2 wurde Gesamt-RNA gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry, 18, 5294 (1979)) hergestellt. Das bedeutet, dass 2,2 × 10⁸ KPMM2-Zellen vollständig in 20 ml 4 M Guanidinthiocyanat (hergestellt von Nacalai Tesque Inc.) homogenisiert wurden. Das Homogenat wurde auf eine 5,3 M Cäsiumchloridlösung in einer Zentrifugationsröhre geschichtet, welche dann in einem Beckman-SW40-Rotor bei 31.000 UPM für 24 Stunden bei 20°C zentrifugiert wurde, um RNA zu präzipitieren. Das RNA-Präzipitat wurde in 70 Ethanol gewaschen und dann in 300 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1 mM EDTA und 0,5 % SDS, gelöst. Pronase (hergestellt von Boehringer) wurde in einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben und wurde dann für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Gemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und die RNA wurde mit Ethanol präzipitiert. Das RNA-Präzipitat wurde dann in 200 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1 mM EDTA, gelöst.
2) Herstellung von Poly(A)+RNA
Poly(A)+RNA wurde unter Verwendung von 500 μg der Gesamt-RNA, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, als Material mit Dem Fast Track 2.0 mRNA-Isolationskit (hergestellt von Invitrogen) gemäß der Anordnung, die dem Kit beigefügt war, gereinigt.
3) Konstruktion der cDNA-Bibiliothek
Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von 10 μg der oben erwähnten Poly(A)+RNA mit dem cDNA-Synthesekit TimeSaver cDNA Synthese Kit (hergestellt von Pharmacia) als Material gemäß der Anordnung, die dem Kit beigefügt war, synthetisiert und wurde weiter mit dem EcoRI-Adaptor, der im Kit geliefert wurde, unter Verwendung der Directional Cloning Toolbox (hergestellt von Pharmacia) gemäß den Anordnungen, die dem Kit beigefügt waren, ligiert. Die Kinierung und die Behandlung des EcoRI-Adaptors mit dem Restriktionsenzym NotI wurden gemäß den Anordnungen, die dem Kit beigefügt waren, durchgeführt. Des weiteren wurde die doppelsträngige cDNA mit einer Größe von ungefähr 500 bp oder mehr, der ein Adaptor angefügt worden war, abgetrennt und unter Verwendung eines 1,5%igen Agarosegels mit niedrigem Schmelzpunkt (hergestellt von Sigma) gereinigt, um ungefähr 40 μl der doppelsträngigen cDNA mit angefügten Adaptor zu gewinnen.
Die doppelsträngige cDNA mit angefügtem Adaptor, die auf diese Weise konstruiert wurde, wurde unter Verwendung des pCOS1-Vektors (japanische Patentanmeldung 8-255196) unter T4-DNA-Ligase (hergestellt von GIBCO-BRL), die zuvor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI und alkalischer Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo) behandelt worden war, ligiert, um eine cDNA-Bibliothek zu konstruieren. Die konstruierte cDNA-Bibliothek wurde in den E. coli-Stamm DH5α (hergestellt von GIBCO-BRL) transduziert und entsprechend wurde geschätzt, dass das für einen unabhängigen Klon eine Gesamtgröße von ungefähr 2,5 × 10⁶ vorliegt.
2. KLONIERUNG DURCH DAS DIREKTE EXPRESSIONSVERFAHREN
1) Transfektion von COS-7-Zellen
Ungefähr 5 × 10⁵-Klone der oben transduzierten E. coli wurden in 2-YT-Medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), enthaltend 50 μg/ml Apicillin kultiviert, um cDNA zu amplifizieren, welche dann einem Alkaliverfahren unterworfen wurde (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), um Plasmid-DNA aus E. coli zu gewinnen. Die Plasmid-DNA, die auf diese Weise gewonnen wurde, wurde mit Hilfe des Elektroporationsverfahrens unter Verwendung eines Gen-Pulser-Instruments (hergestellt von Bio-Rad) in COS-7-Zellen transfiziert.
Das bedeutet, dass 10 μg der gereinigten Plasmid-DNA zu 0,8 ml der COS-7-Zelllösung gegeben wurden, in der die Zellen in PBS zu 1 × 10⁶-Zellen/ml verdünnt worden waren und das Gemisch wurde Pulsen von 1.500 V und 25 μFD Kapazität ausgesetzt. Nach einer 10-minütigen Erholungsdauer bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in einem DMEM-Kulturmedium (hergestellt von GIBCO-BRL), enthaltend 10 % fötales Kälberserum (hergestellt von GIBCO-BRL) unter Bedingungen von 5 % CO₂ bei 37°C für 3 Tage kultiviert.
2) Herstellung einer Panningvorrichtung
Eine Panningvorrichtung, auf die Maus-Anti-HM1.24-Antikörper geschichtet worden war, wurde gemäß dem Verfahren von B. Seed et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365–3369 (1987)) hergestellt. D.h., dass Maus-Anti-HM1.24-Antikörper in einer Konzentration von 10 μg/ml zu 50 ml Tris-HCl (pH 9,5) gegeben wurde. 3 ml der Antikörperlösung, die auf diese Weise hergestellt wurde, wurde zu einer Zellkulturvorrichtung mit einem Durchmesser von 60 mm gegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen in 0,15 M NaCl-Lösung wurde PBS, das 5 % fötales Kälberserum, 1 mM EDTA und 0,02 % NaN₃ enthält, zu der Schale gegeben. Nach dem Blockieren wurde diese für das folgende Klonieren verwendet.
3) Klonierung der cDNA-Bibliothek
Die COS-7-Zellen, die wie oben beschrieben transfiziert worden waren, wurden mit PBS, enthaltend 5 mM EDTA, abgelöst. Nach dem einmaligen Waschen der Zellen in PBS, enthaltend 5 % fötales Rinderserum, wurden sie in PBS, enthaltend 5 % fötales Rinderserum und 0,02 % NaN₃ in einer Konzentration von ungefähr 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Die Suspension wurde in die Panning-Schale gegeben, die wie oben beschrieben, hergestellt worden war, und für ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem vorsichtigen dreimaligen Waschen in PBS, enthaltend 5 % fötales Kälberserum und 0,02 % NaN₃, wurde Plasmid-DNA aus den Zellen gewonnen, die an die Panning-Schale gebunden hatten, indem eine Lösung verwendet wurde, die 0,6 % SDS und 10 mM EDTA enthält.
Die gewonnene Plasmid-DNA wurde in E. col DH5α transduziert. Nach der oben beschriebenen Amplifizierung wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe des Alkaliverfahrens gewonnen. Die gewonnene Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des Elektroporationsverfahrens in COS-7-Zellen transfiziert, und Plasmid-DNA wurde wie oben beschrieben aus den Zellen gewonnen. Ein ähnliches Verfahren wurde einmal wiederholt und die gewonnene Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI verdaut, wodurch die Konzentration des Inserts mit einer Größe von ungefähr 0,9 kbp bestätigt wurde. Des weiteren wurden E. coli-Zellen, in die ein Teil der gewonnenen Plasmid-DNA transfuziert worden ist, in eine 2-YT-Agarplatte, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert. Nach der Kultur über Nacht wurde Plasmid-DNA aus einer Einzelkolonie gewonnen. Diese wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI verdaut, um den Klon p3.19 zu gewinnen, bei dem die Größe des Inserts ungefähr 0,9 kbp beträgt.
Dieser Klon wurde unter Verwendung des PRISM, Dye Terminator Cycle Sequenzing Kit (hergestellt von Perkin Elmer) gemäß den Anweisungen, die dem Kit beilagen, umgesetzt und die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung des ABI 373A-DNA-Sequenzgeräts (hergestellt von Perker Elmer) bestimmt. In diese Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz werden in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die Ergebnisse der FCM-Analyse zeigten, dass der Anti-HM1.24-Antikörper stark mit den meisten der Zellen reagierte, die aus menschlichen lymphatischen Tumoren stammen, was darauf hindeutet, dass in vielen der lymphatischen Tumoren ein Polypeptid mit einem Epitop, das von dem Anti-HM1.24-Antikörper erkannt wird, stark exprimiert wird. Des weiteren führte bei Mäusen, denen ein humaner lymphatischer Tumor transplantiert worden ist, der mit dem Anti-HM1.24-Antikörper reagiert, die Verabreichung des Anti-HM1.24-Antikörpers zur Unterdrückung der Zunahme des Tumorvolumens und außerdem zur Verhängerung der Überlebensdauer. Diese Fakten weisen darauf hin, dass der Anti-HM1.24-Antikörper oder Antikörper, die von einem Polypeptid mit einem Epitop, das von einem Anti-HM1.24-Antikörper, mit einer zytotoxischen Aktivität gegen viele lymphatischen Tumoren erkannt wird, was daher vermuten lässt, dass der Antikörper für die Behandlung von Patienten mit einem lymphatischen Tumor nützlich sein kann.
Bezugsnahme auf Mikroorganismen, die unter dem Patentzusammenarbeitsvertrag, Regel 13-2 hinterlegt wurden und der Name des Hinterlegungsinstitut. HINTERLEGUNGSINSTITUT

Name: The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology

Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Tsukuba city, Ibaraki perf., Japan
MIKROORGANISMUS (1)
Name: Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19)
Zulassungsnummer: FERM BP-4434
Hinterlegungsdatum: 5. Oktober 1993
MIKROORGANISMUS (2)
Name: Hybridom HM1.24
Zulassungsnummer: FERM BP-5233
Hinterlegungsdatum: 14. September 1995
MIKROORGANISMUS (3)
Name: Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHr-AHM-gγ1)
Zulassungsnummer: FERM BP-5643
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996
MIKROORGANISMUS (4)
Name: Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24H-gγ1)
Zulassungsnummer: FERM BP-5644
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996
MIKROORGANISMUS (5)
Name: Escherichia coli DH5α (pUC19-RVLa-AHM-gĸ)
Zulassungsnummer: FERM BP-5645
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996
MIKROORGANISMUS (6)
Name: Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24L-gγ)
Zulassungsnummer: FERM BP-5643
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996
MIKROORGANISMUS (7)
Name: Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHs-AHM-gγ1)
Zulassungsnummer: FERM BP-6127
Hinterlegungsdatum: 29. September 1997
SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung eines Antikörpers, der sich speziell an ein HM1.24-Antigenprotein mit der in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Aminosäuresequenz bindet und zytotoxische Aktivität hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung lymphatischer Tumore, mit Ausnahme von Myelomen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der lymphatische Tumor ein T-Zell-Tumor ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der lymphatische Tumor ein B-Zell-Tumor ist, mit Ausnahme eines Myeloms.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die zytotoxische Aktivität eine ADCC-Aktivität ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die zytotoxische Aktivität eine CDC-Aktivität ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Antikörper eine konstante Humanantikörperregion Cγ hat.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die konstante Humanantikörperregion Cγ Cγ1 oder Cγ3 ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Antikörper ein chimärer Antikörper oder ein humanisierter Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein chimärer Anti-HM1.24-Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein humanisierter Anti-HM1.24-Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei sich der Antikörper speziell an ein Epitop bindet, das vom Anti-HM1.24-Antikörper erkannt wird, der von dem als FERM BP-5233 hinterlegten Hybridom produziert wird.