DE69830675T2

DE69830675T2 - Chromatographische Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis eines Analyts in einer Vollblutprobe

Info

Publication number: DE69830675T2
Application number: DE69830675T
Authority: DE
Inventors: Toru Yoshimura; Toshihiro Matsudo-shi OGASAWARA; Michihiro Saito; John P. Groff
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1998-12-29
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2018-12-30
Also published as: PL342658A1; DE69816339D1; TR200002051T2; KR100575390B1; IL136236A; CZ294954B6; DE69830675D1; CN1125343C; ATE244890T1; LT2000071A; US20010006823A1; US6673629B2; EP1047943A1; CN1285918A; CN1495428A; CO5090841A1; JP2002509254A; MY129171A; PT1047943E; NO20003569D0

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Chromatographieassay-Vorrichtungen und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Vollblutprobe, und genauer eine Vorrichtung und ein Verfahren, das ein Trennmittel für rote Blutkörperchen verwendet, um rote Blutkörperchen zu aggregieren, und ein Neutralisationsmittel, um eventuelle negative Effekte zu neutralisieren, die das Trennmittel für rote Blutkörperchen auf das Assaysystem haben könnte.
Hintergrund der Erfindung
Moderne klinische Diagnoseverfahren werden routinemäßig an Blutproben durchgeführt. Leider behindern rote Blutkörperchen viele diagnostische Bestimmungen. In Assays für einen Analyten können rote Blutkörperchen die Bindung zwischen spezifischen Bindungspaargliedern hemmen. In ähnlicher Weise haben rote Blutkörperchen eine Enzymaktivität, welche, abhängig von dem verwendeten Assay, das erzeugte Signal stören kann. Des Weiteren können in einem schnellen Testformat unter Verwendung einer Chromatographieassay-Vorrichtung, insbesondere einer Chromatographieimmunoassay-Vorrichtung, rote Blutkörperchen den Flüssigkeitsstrom hemmen, welcher notwendig ist, damit Reaktionen auf der Vorrichtung stattfinden können. Aus diesem Grund und aus anderen Gründen werden viele Assaymethoden an Plasma oder Serum durchgeführt, welches zunächst von einer Vollblutprobe abgetrennt werden muss.
Es gibt viele bekannte Techniken zum Abtrennen von roten Blutkörperchen aus Plasma in einer Vollblutprobe. Die Zentrifugation ist ein gut bekanntes Verfahren im Fachgebiet, durch welches Plasma (vor der Gerinnung) und Serum (nach der Gerinnung) von Vollblut abgetrennt werden. In diesem Verfahren setzen sich rote Blutkörperchen am Boden des Teströhrchens ab, und das Serum wird durch Dekantieren oder irgendein anderes Verfahren abgetrennt. Das Stratifizieren von Vollblut durch Zentrifugation hat jedoch viele Nachteile. Im Allgemeinen erfordert die Zentrifugation, dass eine große Blutprobe entnommen wird. Des Weiteren ist das Verfahren zeitaufwändig und erfordert eine umfangreiche Laborausrüstung, welche oft nicht in der Praxis eines Arztes aufgestellt ist. Schließlich erhöht die zusätzliche Handhabung des Blutes potentielle Gefahren durch den Kontakt mit durch Blut übertragenen Pathogenen.
Um die Notwendigkeit zur Zentrifugation zu reduzieren oder zu eliminieren, wurden Assayvorrichtungen entwickelt, welche Gradientenmembranen oder Sammelmembranen verwenden, um rote Blutkörperchen aus dem flüssigen Teil des Blutes abzutrennen. Immobilisierte Anti-rote-Blutkörperchen-Antikörper wurden auch verwendet.
Andere bekannte Techniken zum Abtrennen von roten Blutkörperchen aus Plasma oder Serum schließen folgende ein: (1) Kombinieren einer Vollblutprobe mit einem Bindemittel für rote Blutkörperchen, Filtrieren der Mischung durch ein festes saugfähiges Element, an welches mindestens ein spezifisches Bindungspaarglied gebunden ist, um die agglutinierten roten Blutkörperchen zu entfernen; (2) Hindurchführen des Vollbluts durch einen Glasmikrofaserfilter, welcher eventuell ein inkorporiertes Agglutinationsmittel haben kann; (3) Verwenden einer Schranke oder Ausschlussschicht von Polysaccharidmaterial, um zu verhindern, dass rote Blutkörperchen hindurchtreten und den Nachweis oder die Visualisierung eines Signals auf einem trockenen Teststreifen stören; und (4) Verwenden eines Trägers, der eine polykationische Oberfläche hat, die rote Blutkörperchen, aber nicht Plasma bindet.
Viele dieser Techniken zur Abtrennung von roten Blutkörperchen aus Plasma sind kostspielig, kompliziert, können zu einer unvollständigen Abtrennung der roten Blutkörperchen führen und können eine Hämolyse bewirken. Hämolyse führt zu einer nicht spezifischen Bindung oder hohen Hintergrundwerten, was einen Verlust an Assayempfindlichkeit bewirkt. Dies kann das Resultat sein von freiem Hämoglobin, welches die Nachweiszone einfärben kann, so dass die Zone eine Farbe erhalten kann, die im Bereich von rosa bis dunkelbraun reicht. Als Ergebnis kann die Erzeugung eines visuellen chemischen Signals vollständig oder teilweise durch die Anwesenheit der Hämoglobinfarbe in der Nachweiszone überdeckt werden. Des Weiteren neigt die Verwendung eines Abtrennungsmittels, wie zum Beispiel eines Polykations, in einem Assaysystem dazu, das System zu stören, oft durch Aggregation von anderen Reagenzien oder Bindungsgliedern zusätzlich zu den roten Blutkörperchen.
Dementsprechend besteht die Notwendigkeit einer Vorrichtung und eines Verfahrens zum Nachweis eines Analyten in einer Blutprobe, ohne das Assaysystem negativ zu beeinflussen. Eine solche Vorrichtung und ein solches Verfahren sollten geeignet sein für Vollblutproben mit verschiedenen Größen, einschließlich kleiner Proben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Chromatographievorrichtung, die Folgendes umfasst: einen Chromatographieträger, welcher einen Weg für einen Flüssigkeitsstrom definiert, der in der Lage ist, Kapillarfluss zu unterstützen, eine Applikationsstelle für die Blutprobe in Flüssigkeitsströmungskontakt mit dem Chromatographieträger, eine Nachweisstelle auf dem Chromatographieträger, die entfernt von der Applikationsstelle angeordnet ist, eine diffundierend gebundene markierte Substanz, die stromabwärts von der Applikationsstelle angeordnet ist, ein diffundierend gebundenes rote Blutkörperchen abtrennendes Mittel zum Abtrennen von Plasma oder Serum aus der Blutprobe stromaufwärts von der Nachweisstelle und ein diffundierend gebundenes Neutralisationsmittel, das in der Lage ist, sich an das Abtrennungsmittel stromabwärts vom gebundenen Abtrennungsmittel und stromaufwärts von der Nachweisstelle zu binden, wodurch eine positive Ladung des Abtrennungsmittels neutralisiert wird.
Vorzugsweise befindet sich das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen an der Applikationsstelle, so dass die roten Blutkörperchen aus dem Serum oder Plasma abgetrennt werden, bevor das Serum oder Plasma den Chromatographieträger hinabwandert.
EP-A-0 325 413 offenbart eine immunochromatographische Testvorrichtung, die eine Zone mit einem diffundierend gebundenen polykationischen Reagenz umfasst, stromaufwärts von der Nachweisstelle angeordnet zum Einfangen/Abtrennen von roten Blutkörperchen aus Plasmaserum. Die Vorrichtung hat kein Mittel zum Neutralisieren des Überschusses von polykationischem Reagenz. US-A-5,670,381 offenbart eine immunochromatographische Testvorrichtung, die ein polykationisches Reagenz umfasst, das nicht diffundierend in der Nachweiszone gebunden ist, ein Markerreagenz und ein Einfangreagenz, das aus einem Konjugat-Einfangmolekül-Polyanion besteht, worin der Marker und das Einfangreagenz diffundierend an die Probenapplikationszone gebunden sind. Das polykationische Reagenz hat die Funktion, die Migration von Einfangkonjugat in die Nachweiszone zu erleichtern. WO-A-96/31270 offenbart eine immunochromatographische Testvorrichtung, die eine Zone mit einem diffundierend gebundenen Polyol umfasst, angeordnet stromaufwärts von der Nachweisstelle, zum Abfiltrieren von roten Blutkörperchen aus Plasmaserum. EP-A-0 735 369 offenbart einen Teststreifen, der einen chemischen Zeitmesser umfasst, zur Minimierung von unzuverlässigen Testablesungen aufgrund hoher Färbung der Probe.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, vorzugsweise einer Blutprobe, welches das Bereitstellen eines Chromatographieträgers umfasst, welcher einen Weg für den Flüssigkeitsstrom bestimmt, der in der Lage ist, Kapillarfluss zu unterstützen, entlang dem sich Folgendes befindet: (a) eine Applikationsstelle für die Blutprobe in Flüssigkeitsströmungskontakt mit dem Chromatographieträger, (b) eine Nachweisstelle auf dem Chromatographieträger, die entfernt von der Applikationsstelle angeordnet ist, (c) eine diffundierend gebundene markierte Substanz, die stromabwärts von der Applikationsstelle angeordnet ist, (d) ein diffundierend gebundenes Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen zum Abtrennen von Plasma oder Serum aus der Blutprobe stromaufwärts von der Nachweisstelle und (e) ein diffundierend gebundenes Neutralisationsmittel, das in der Lage ist, sich an das Abtrennungsmittel zu binden, angeordnet stromabwärts von dem gebundenen Abtrennungsmittel und stromaufwärts von der Nachweisstelle, wodurch eine positive Ladung des Abtrennungsmittels neutralisiert wird; In-Kontakt-Bringen der Applikationsstelle mit der Blutprobe, so dass das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen das Plasma oder Serum von der Blutprobe abtrennt und das Neutralisationsmittel die positive Ladung des Abtrennungsmittels neutralisiert, wenn die Probe entlang dem Flüssigkeitsweg fließt; und Nachweisen der Anwesenheit von Analyt in der Blutprobe.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Chromatographieassay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Beobachtung, daß rote Blutkörperchen in Vollblutproben die Bestimmungen der Anwesenheit oder Menge von Analyt in einer Blutprobe behindern, welche sonst leicht über Assaysysteme durchgeführt werden könnten. Zum Beispiel ist es unwahrscheinlich, dass in einem Immunoassay eine Vollblutprobe in Kontakt mit einer Applikationsstelle den Streifen über Kapillarwirkung hinabwandert, aufgrund der hindernden oder störenden Anwesenheit von roten Blutkörperchen. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, ohne die Genauigkeit des Assaysystems zu beeinträchtigen.
Die folgenden Definitionen können zum Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
"Analyt" oder "Analyt von Interesse" bezieht sich auf die Verbindung oder die Zusammensetzung, die nachgewiesen oder gemessen werden soll und welche mindestens ein Epitop oder eine Bindungsstelle hat. Der Analyt kann jede Substanz sein, für welche es ein natürlich vorkommendes Analyt-spezifisches Bindungsglied gibt oder für welche ein Analyt-spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann. Analyten schließen Folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Toxine, organische Verbindungen, Proteine, Peptide, Mikroorganismen, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Hormone, Steroide, Vitamine, Drogen (einschließlich derjenigen, welche für therapeutische Zwecke verabreicht werden, ebenso wie derjenigen, welche für illegale Zwecke verabreicht werden) und Metaboliten von oder Antikörper zu einer beliebigen der oben genannten Substanzen. Der Begriff "Analyt" schließt auch beliebige Antigensubstanzen, Haptene, Antikörper, Makromoleküle und Kombinationen davon ein.
"Chromatographischer Träger" bezieht sich auf ein beliebiges geeignetes poröses, absorbierendes, saugfähiges, isotropes oder kapillares Material, welches die Nachweisstelle der Vorrichtung einschließt und durch welches der Analyt oder die Testprobe durch Kapillarwirkung oder Dochtwirkung transportiert werden kann. Es wird vom Fachmann anerkannt werden, dass der Chromatographieträger aus einem einzigen Material oder aus mehr als einem Material hergestellt sein kann (z.B. können unterschiedliche Zonen, Abschnitte, Schichten, Gebiete oder Stellen aus unterschiedlichen Materialien hergestellt sein), solange die vielfachen Schichten in Flüssigkeitsströmungskontakt miteinander sind, wodurch das Hindurchtreten der Testprobe zwischen den Materialien ermöglicht wird. Flüssigkeitsströmungskontakt gestattet das Hindurchtreten von mindestens einigen Komponenten der Probe, d.h., des Analyten, zwischen den Zonen des porösen Materials und ist vorzugsweise homogen entlang der Kontaktgrenzfläche zwischen den unterschiedlichen Zonen. Natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die synthetisch modifiziert sind, können als Chromatographieträger verwendet werden und schließen Folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Papier (faserig) oder Membranen (mikroporös) von Zellulosematerialien, wie zum Beispiel Papier; Zellulose und Zellulosederivate, wie zum Beispiel Zelluloseacetat und Nitrozellulose; Glasfaser; Gewebe, sowohl natürlich vorkommend (z.B. Baumwolle) als auch synthetisch (z.B. Nylon); poröse Gele und dergleichen.
"Marker" bezieht sich auf jede beliebige Substanz, die in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das durch visuelle oder instrumentelle Mittel nachweisbar ist. Verschiedene Marker, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Marker ein, welche Signale durch chemische oder physikalische Mittel erzeugen. Beispiele schließen Enzyme und Substrate, Chromogene, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, gefärbte oder färbbare organische Polymerlatexpartikel und Liposome oder andere Bindemittel, die direkt sichtbare Substanzen enthalten, ein. Vorzugsweise werden radioaktive Marker, kolloidale metallische Partikel oder kolloidale nicht metallische Partikel in der vorliegenden Erfindung verwendet. Bevorzugte Marker schließen kolloidale Gold- und Latexpartikel ein.
"Markierte Substanz" oder "Konjugat" bezieht sich auf eine Substanz, die einen nachweisbaren Marker umfasst, gebunden an ein spezifisches Bindungsglied. Die Bindung kann kovalent oder nicht kovalent sein und Nukleinsäurehybridisierung einschließen. Der Marker ermöglicht es der markierten Substanz, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das direkt oder indirekt mit der Menge an Analyt in einer Testprobe in Zusammenhang steht. Die spezifische Bindungsgliedkomponente der markierten Substanz wird ausgewählt, um sich direkt oder indirekt an den Analyten zu binden.
"Spezifisches Bindungsglied" bezieht sich auf ein Glied eines spezifischen Bindungspaars, d.h., zweier unterschiedlicher Moleküle, worin eines der Moleküle sich durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Wenn das spezifische Bindungsglied ein Immunreagenz ist, kann es zum Beispiel Folgendes sein: ein Antikörper, Antigen, Hapten oder ein Komplex davon, und wenn ein Antikörper verwendet wird, kann er ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper, ein rekombinantes Protein oder ein rekombinanter Antikörper, ein chimärischer Antikörper, eine Mischung (Mischungen) oder Fragment (Fragmente) davon ebenso wie eine Mischung aus einem Antikörper und anderen spezifischen Bindungsgliedern sein. Spezifische Beispiele für spezifische Bindungsglieder schließen Biotin und Avidin, einen Antikörper und sein entsprechendes Antigen (wobei beide keine Beziehung zu einer zu untersuchenden Probe haben), eine einzelsträngige Nukleinsäure und ihr Komplement und dergleichen ein.
"Einfangende Substanz" bezieht sich auf ein oder mehrere spezifische Bindungsglieder, die innerhalb eines oder auf einem Teil des chromatographischen Trägers gebunden sind, um eine oder mehrere "Einfangstellen" zu bilden, worin der Analyt, das markierte Reagenz und/oder das Kontrollreagenz auf dem Chromatographieträger immobilisiert werden. Das Verfahren der Bindung ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Die einfangende Substanz erleichtert die Beobachtung des nachweisbaren Signals im Wesentlichen durch Abtrennen des Analyten und/oder der markierten Substanz von ungebundenen Assayreagenzien und den restlichen Komponenten in der Testprobe. Die einfangende Substanz kann auf dem Chromatographieträger vor oder während der Durchführung des Assays durch ein beliebiges geeignetes Bindungsverfahren immobilisiert werden. Des Weiteren kann die einfangende Substanz an einer einzelnen Nachweisstelle oder an mehreren Stellen auf oder in dem Chromatographieträger bereitgestellt werden. Die einfangende Substanz kann auch in einer Vielzahl von Konfigurationen bereitgestellt werden, um unterschiedliche Nachweis- oder Messformate zu erzeugen. Zum Beispiel kann die einfangende Substanz als ein Buchstabe, eine Zahl, ein Piktogramm oder ein Symbol oder eine beliebige Kombination davon ausgestaltet sein.
Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung eine Chromatographieassay-Vorrichtung für den Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, vorzugsweise einer Blutprobe, bereit. Die Vorrichtung liegt vorzugsweise in Form eines chromatographischen Streifens vor, der einen chromatographischen Träger hat, welcher einen Weg für den Flüssigkeitsstrom definiert und welcher in der Lage ist, Kappilarfluß zu unterstützen, eine Applikationsstelle für die Blutprobe und eine Nachweisstelle, die entfernt von der Applikationsstelle angeordnet ist, zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge eines Analyten, der in der Blutprobe vorhanden ist. Vorzugsweise schließt die Vorrichtung auch eine markierte Substanz (oder ein Konjugat), diffundierend an den chromatographischen Träger gebunden, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die markierte Substanz sich an den Analyten binden oder mit dem Analyten um die Bindung an der Nachweisstelle konkurrieren. Die Vorrichtung enthält vorzugsweise zwei zusätzliche Stoffe, diffundierend an den chromatographischen Träger gebunden: (1) einen Stoff zur Abtrennung von roten Blutkörperchen stromaufwärts (hiernach wird die Richtung der Bewegung einer Probe, bewirkt durch Kapillarwirkung, "stromabwärts" genannt, und die umgekehrte Richtung wird "stromaufwärts" genannt) von der Nachweisstelle, welche in der Lage ist, Plasma oder Serum aus der Blutprobe abzutrennen, und (2) ein Neutralisationsmittel stromabwärts vom Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen und stromaufwärts von der Nachweisstelle, um jeden möglichen Effekt, insbesondere jeden nachteiligen Effekt, des Abtrennungsmittels für rote Blutkörperchen auf das Chromatographiesystem zu neutralisieren.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann der Ausdruck "diffundierend gebunden", wie auf ein bestimmtes Reagenz angewendet, definiert werden als jedes Reagenz, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine markierte Substanz, ein spezifisches Bindungsglied, ein Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen oder Neutralisationsmittel, soll bedeuten, daß das Reagenz/die Reagenzien in einer Art und Weise gebunden sind, die es dem gebundenen Reagenz/den Reagenzien erlaubt, entlang dem Strömungsweg zu fließen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jedes Assaysystem verwendet werden. Immunoassaysysteme werden bevorzugt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf laterale Fließsysteme, vertikale Fließsysteme, Einsaugsysteme und Messstäbe. Eine allgemeine Beschreibung von bekannten Assaysystemen ist unten zu finden.
Im Allgemeinen werden in einem chromatographischen Streifen mindestens eine Probenaufbringungsstelle und eine Nachweisstelle auf einem Chromatographieträger angebracht. Eine Probenlösung, in diesem Fall vorzugsweise eine Blutprobe, von der vermutet wird, dass sie einen Analyten von Interesse enthält, d.h., einen Analyten, bewegt sich durch Kapillarwirkung durch den Chromatographieträger, wenn sie auf die Probenapplikationsstelle aufgetragen wird, und eine markierte Substanz oder ein Konjugat, das in einem Markierungsmittel enthalten ist, das im Voraus auf einen Chromatographieträger aufgetragen wurde, sammelt sich an der Nachweisstelle in direktem oder umgekehrtem Verhältnis zu der Anwesenheit oder Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probenlösung, was bewirkt wird durch eine Bindungsreaktion (wie zum Beispiel eine immunologische Reaktion), so dass die Anwesenheit oder die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probenlösung durch Messen der Anwesenheit oder Menge der so akkumulierten markierten Substanz oder des Konjugats festgestellt werden kann. Verschiedene Arten von Chromatographiestreifen sind bekannt, und all diese bekannten Chromatographiestreifen, einschließlich derjenigen, die später beschrieben werden, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Begriff "Chromatographieassay-Vorrichtung", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Chromatographiestreifen, der so hergestellt wird, dass er in einem Assay verwendet, gelagert und transportiert werden kann.
Im Folgenden wird ein typisches Beispiel für einen Chromatographiestreifen beschrieben. Eine Probenaufbringungsstelle kann sich an demselben Platz befinden wie die markierte Substanz, vorzugsweise an einer Position stromaufwärts von der markierten Substanz. Wenn eine Probenlösung, von der vermutet wird, dass sie einen zu untersuchenden Analyten enthält, mit der Probenaufbringungsstelle in Kontakt gebracht wird, bewegt sich die Probenlösung durch den Chromatographieträger in der Stromabwärtsrichtung zusammen mit dem Analyten, was durch Kapillarwirkung ausgelöst wird. Typischerweise ist der Analyt eine Verbindung, die sich in einer spezifischen Art und Weise an eine einfangende Substanz bindet, die an die Nachweisstelle fixiert ist, oder er ist eine Verbindung, die sich in einer spezifischen Art und Weise an ein Konjugat bindet, das sich spezifisch an die einfangende Substanz an der Nachweisstelle bindet. Zum Beispiel ist der Analyt ein Antikörper, wenn die einfangende Substanz ein Antigen ist oder das Konjugat ein Antigen enthält, und der Analyt ist ein Antigen, wenn die einfangende Substanz ein Antikörper ist oder das Konjugat einen Antikörper enthält. Als weiteres Beispiel kann der Analyt eine Nukleinsäure sein, welche sich an ein komplementäres Konjugat und eine einfangende Substanz bindet.
Wenn die Probenapplikationsstelle sich an einer Stromaufwärtsposition zu einer markierten Substanz befindet, kann die markierte Substanz angrenzend an die Probenapplikationsstelle oder an einer Position, die von der Probenapplikationsstelle entfernt liegt, aufgetragen werden.
Die Zugabe der markierten Substanz kann durch verschiedene Mittel durchgeführt werden, zum Beispiel durch Hinzufügen derselben an einer bestimmten Position außerhalb der Chromatographiestreifen-Nachweisstelle nach der Zugabe der Probenlösung.
Da die markierte Substanz so angeordnet wird, dass sie durch die Kapillarwirkung der Probenlösung wandert, wandert die markierte Substanz in der Stromabwärtsrichtung, wenn die Probenlösung zu dem Probenhinzufügungsmittel gegeben wird.
Die Nachweisstelle ist im Allgemeinen an einer Stromabwärtsposition zur markierten Substanz und in einer bestimmten Entfernung von der markierten Substanz angeordnet. An der Nachweisstelle ist eine einfangende Substanz, welche sich nur an einen Analyten oder ein Konjugat in einer spezifischen Art und Weise bindet oder sich spezifisch an jede der zu untersuchenden Substanzen und eine markierte Substanz bindet, an den Chromatographieträger fixiert. Folglich bindet sich in einer Ausführungsform der Analyt (der manchmal an eine markierte Subtanz gebunden ist), bewegt durch Kapillarwirkung der Probenlösung, an die einfangende Substanz oder an ein Konjugat, welches sich wiederum an die einfangende Substanz bindet. Die markierte Substanz bindet sich an die so gebundene zu untersuchende Substanz, wodurch eine Akkumulierung der markierten Substanz in dem Nachweismittel als Reaktion auf die Anwesenheit oder die Menge des Analyten bewirkt wird. Alternativ binden die markierte Substanz und der Analyt, durch Kapillarwirkung bewegt, sich kompetitiv an die einfangende Substanz oder an ein Konjugat, welches sich wiederum an die einfangende Substanz bindet, wodurch eine Akkumulierung der markierten Substanz in umgekehrtem Verhältnis zu der Menge an zu untersuchender Substanz bewirkt wird.
Es gibt einen Fall, in dem eine bestimmte markierte Substanz sich sowohl an eine einfangende Substanz (oder ein Konjugat, welches sich dann wieder an eine einfangende Substanz bindet) als auch an einen Analyten bindet, aber nicht gleichzeitig, und in diesem Fall bindet sich der Analyt zuerst an die markierte Substanz und die restliche markierte Substanz, welche sich nicht an die zu untersuchende Substanz gebunden hat, bindet sich an die einfangende Substanz. Folglich kann die Anwesenheit oder die Menge des Analyten analysiert werden durch Messen der markierten Substanz, die sich in dem Nachweismittel angesammelt hat.
Je nach Bedarf befinden sich verschiedene Substanzen stromaufwärts von der Nachweisstelle. Zum Beispiel kann so ein Konjugat beweglich angeordnet sein.
In einigen Fällen können eine oder mehrere zusätzliche Nachweisstellen stromabwärts von der ersten Nachweisstelle angeordnet sein. Auch kann sich stromabwärts von der Nachweisstelle eine weitere Verlängerung des Chromatographieträgers befinden, so dass eine Probenlösung vollständig aufgetragen werden kann oder der Träger kann mit einem Material zur Absorption der Probenlösung ausgestattet sein.
Somit kann das Vorhandensein oder die Menge eines Analyten von Interesse in einer Probenlösung festgestellt werden durch Messen des Vorhandenseins oder der Menge einer markierten Substanz, die sich an der Nachweisstelle angesammelt hat. In einem Fall kann dies visuell vorgenommen werden.
Die vorliegende Erfindung dient zur Verwendung mit einer beliebigen Blutprobe, einschließlich Serum und Plasma, aber sie wird vorzugsweise mit einer Blutprobe verwendet, die rote Blutkörperchen enthält, zum Beispiel Vollblut.
Bevor der Analyt von Interesse in der Blutprobe untersucht wird, werden die roten Blutkörperchen vorzugsweise entfernt, wenn der Assay mit der gewünschten Genauigkeit durchgeführt werden soll. Somit wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen an den Chromatographieträger gebunden. Vorzugsweise wird das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen diffundierend an den Chromatographieträger gebunden. Das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen kann an den Chromatographieträger an jedem Ort gebunden sein, welcher zur Abtrennung der roten Blutkörperchen vom Plasma oder Serum fungiert. Er ist vorzugsweise diffundierend stromaufwärts von der Nachweisstelle an den chromatographischen Träger gebunden. Am meisten bevorzugt wird das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen diffundierend an die Probenaufbringungsstelle gebunden. Dieser Ort ist vorzuziehen, weil er die Aggregation der roten Blutkörperchen, sobald sie auf den Chromatographieträger aufgebracht werden, bewirkt, was, wenn überhaupt, nur zu einer minimalen Störung in dem Fluss des Serums oder Plasmas entlang des Trägers durch Kapillarwirkung führt.
Das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen der vorliegenden Erfindung kann jede Substanz sein, die in der Lage ist, rote Blutkörperchen zu aggregieren. Bevorzugte Stoffe sind positiv geladene Materialien, wie zum Beispiel Polykationen, einschließlich z.B. Poly-L-lysinhydrobromid; Poly(dimethyldiallylammonium)chlorid (Merquat^®-100, Merquat^® 280, Merquat^® 550); Poly-L-argininhydrochlorid; Poly-L-histidin; Poly(4-vinylpyridin), Poly(4-vinylpyridin)hydrochlorid; Poly(4-vinylpyridin)quervernetzt; Methylchlorid quaternäres Salz; Poly(4-vinylpyridin-co-styrol); Poly(4-vinylpyridinium poly(hydrogenfluorid)); Poly(4-vinylpyridinium-P-toluensulfonat); Poly(4-vinylpyridinium-tribromid); Poly(4-vinylpyrrolidon-co-2-dimethylaminoethylmethacrylat); Polyvinylpyrrolidon, quervernetzt; Polyvinylpyrrolidon, Poly(melamin-co-formaldehyd); teilweise methyliert; Hexadimethrinbromid; Poly(Glu, Lys) 1:4 hydrobromid; Poly(Lys, Ala) 3:1 hydrobromid; Poly(Lys, Ala) 2:1 hydrobromid; Poly-L-lysin succinyliert; Poly(Lys, Ala) 1:1 hydrobromid; und Poly(Lys, Trp) 1:4 hydrobromid. Das am meisten bevorzugte Polykation ist Poly(dimethyldiallylammonium)chlorid (Merquat^®-100).
Das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen der vorliegenden Erfindung kann in jeder Menge verwendet werden, die geeignet ist, um die roten Blutkörperchen von dem Rest der Probe abzutrennen. Vorzugsweise kann das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen in einer Konzentration von ungefähr 0,04% bis ungefähr 1,3% (Gewicht pro Volumen) vorhanden sein, wobei von ungefähr 0,13% bis ungefähr 0,33% (Gewicht pro Volumen) stärker bevorzugt wird und wobei ungefähr 0,20% bis ungefähr 0,33% (Gewicht pro Volumen) am meisten bevorzugt wird.
Eine positive Ladung auf dem Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen hat eine Tendenz, jeden negativ geladenen Stoff, der auf dem Streifen vorhanden ist, zu aggregieren. Zum Beispiel kann eine markierte Substanz oder ein Konjugat, das an den Chromatographieträger gebunden ist, auch durch das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen aggregiert werden, was die Bindung des Analyten an das Konjugat oder, in einem kompetitiven Assay, die Bindung der markierten Substanz und des Analyten von Interesse an die einfangende Substanz an der Nachweisstelle oder ein Konjugat behindert. Letztlich kann die Sensitivität und Genauigkeit des Immunoassaysystems beeinträchtigt werden.
Dementsprechend verwendet die vorliegende Erfindung, wenn das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen ein positiv geladenes Material ist, vorzugsweise ein Neutralisierungsmittel. Das Neutralisierungsmittel ist in der Lage, die positive Ladung des Abtrennungsmittels für rote Blutkörperchen zu neutralisieren, wodurch jede Störung des Assaysystems durch das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen eliminiert oder zumindest minimiert wird. Vorzugsweise ist das Neutralisierungsmittel diffundierend an den chromatographischen Träger gebunden. Das Neutralisierungsmittel kann an jeder Stelle auf dem chromatographischen Träger diffundierend gebunden sein, wo es bewirkt, dass ein Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen neutralisisert wird, aber es befindet sich vorzugsweise stromabwärts von dem Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen und stromaufwärts von der Nachweisstelle und stärker bevorzugt an derselben Stelle auf der Chromatographie wie die diffundierend gebundene markierte Substanz.
Das Neutralisierungsmittel kann jedes Polyanion sein, das in der Lage ist, die positive Ladung des Abtrennungsmittels für rote Blutkörperchen zu neutralisieren. Bevorzugte Polyanionen schließen Poly(acrylsäure), Poly(acrylsäure, Natriumsalz), Poly(methylmethacrylsäure), Poly(Na-4-styrolsulfonat), Poly(vinylsulfonsäure), Poly-L-asparaginsäure und Carboxymethylcellulose ein, wobei Dextransulfat das am meisten bevorzugte ist.
Das Neutralisierungsmittel kann in jeder beliebigen Menge vorhanden sein, welche bewirkt, dass die positive Ladung des Abtrennungsmittels für rote Blutkörperchen neutralisiert wird. Im Allgemeinen ist die Konzentration des Neutralisierungsmittels abhängig von der Konzentration des Abtrennungsmittels für rote Blutkörperchen, das verwendet wird. Vorzugsweise ist das Neutralisierungsmittel in einer Konzentration von ungefähr 0,33% bis ungefähr 20% (Gewicht pro Volumen) vorhanden, wobei ungefähr 0,34% bis ungefähr 10% (Gewicht pro Volumen) stärker bevorzugt wird und wobei 0,34% bis 10% (Gewicht pro Volumen) am meisten bevorzugt wird.
1 zeigt eine Ausführungsform einer immunochromatographischen Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 10 umfasst einen Chromatographieträger 20. Auf dem Chromatographieträger 20 befindet sich eine Applikationsstelle 30 für die Blutprobe. In dieser bevorzugten Ausführungsform befindet sich das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen, d. h. Merquat^® 100, auf der Applikationsstelle 30. Angrenzend an die Applikationsstelle 30 ist ein Konjugatkissen 40, das das Konjugat, d. h. eine Selen-markierte Bindungssubstanz und ein Neutralisierungsmittel, d. h. Dextransulfat, enthält. Weiter stromabwärts befindet sich die Nachweisstelle 50, welche, nachdem der Assay durchgeführt wurde, einen Kontrollstreifen 60 aufweisen wird und wenn die zu untersuchende Substanz vorhanden ist, einen Teststreifen 70.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Puffer mit der Applikationsstelle in Kontakt gebracht werden, vorzugsweise nachdem die Applikationsstelle mit der Probe in Kontakt gebracht wurde. Der Puffer hilft beim Aufrechterhalten einer akzeptablen Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit entlang dem Flüssigkeitsweg auf dem chromatographischen Träger. Der Puffer kann jede beliebige Substanz sein, die in der Lage ist, durch Kapillarwirkung entlang dem Flüssigkeitsströmungsweg zu fließen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphatpuffer, Phosphatpuffersalzlösung, Tris-HCl-Puffer, Carbonatpuffer, Citratpuffer, HEPES (2-Hydroxypiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)-Puffer, MOPS (3-(N-morpholino)propansulfonsäure)-Puffer, MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure)-Puffer und dergleichen. Obwohl die Konzentration und der pH jede beliebige Konzentration und jeder beliebige pH sein können, welche in der gewünschten Assayvorrichtung funktionieren, liegt die Molarität vorzugsweise in einem Bereich von ungefähr 10 mM bis ungefähr 100 mM, und der pH beträgt von ungefähr 5–9 und stärker bevorzugt von ungefähr 6–8. Am meisten bevorzugt ist der verwendete Puffer 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4.
Das Flüssigkeitsvolumen, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist abhängig von der Größe der Vorrichtung. Wünschenswerterweise wird genug Flüssigkeitsvolumen verwendet, um eine Flüssigkeitsströmung durch die Vorrichtung zu der Nachweisstelle zu ermöglichen. Vorzugsweise liegt das Flüssigkeitsvolumen in einem Bereich von ungefähr 25 μl bis ungefähr 100 μl und stärker bevorzugt von ungefähr 40 μl bis ungefähr 60 μl. Dementsprechend kann der Puffer, wenn benötigt, in einem Volumenbereich von ungefähr 10 μl bis ungefähr 40 μl hinzugefügt werden, und stärker bevorzugt von ungefähr 20 μl bis ungefähr 30 μl.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten in einer Blutprobe. Vorzugsweise verwendet das Verfahren die Chromatographieimmunoassay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung. Genauer umfasst das Verfahren Folgendes: (1) Bereitstellen eines Chromatographieträgers, der einen Weg für die Flüssigkeitsströmung bestimmt, der in der Lage ist, Kapillarfluss zu unterstützen und entlang dem sich Folgendes befindet: eine Applikationsstelle für die Blutprobe, welche in Flüssigkeitskontakt mit dem Chromatographieträger ist, eine Nachweisstelle auf dem Chromatographieträger, entfernt angeordnet von der Applikationsstelle, eine diffundierend markierte Substanz (oder ein Konjugat), welches) sich an den Analyten bindet oder mit dem Analyten um die Bindung an der Nachweisstelle konkurriert, ein diffundierend gebundenes Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen zum Abtrennen von Plasma oder Serum aus der Blutprobe stromaufwärts von der Nachweisstelle und ein Konjugat, das an den Chromatographieträger gebunden ist; (2) In-Kontakt-Bringen der Applikationsstelle mit der Blutprobe, so dass das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen die roten Blutkörperchen von dem Plasma oder Serum der Blutprobe abtrennt und das Neutralisierungsmittel die positive Ladung des Abtrennungsmittels neutralisisert; und (3) Nachweisen der Anwesenheit von Analyt in der Blutprobe.
Vorzugsweise ist das Abtrennungsmittel für Blutkörperchen ein positiv geladenes Material und der Weg des Flüssigkeitsflusses enthält ein diffundierend gebundenes neutralisierendes Mittel, welches vorzugsweise in der Lage ist, sich an das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen zu binden und sich stromabwärts von dem Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen und stromaufwärts von der Nachweisstelle befindet, wodurch die positive Ladung des Abtrennungsmittels neutralisiert wird.
Somit wird, in der bevorzugten Ausführungsform von 1, eine Blutprobe auf die Applikationsstelle 30 aufgebracht und das Abtrennungsmittel für rote Blutkörperchen trennt die roten Blutkörperchen ab, indem es sie aggregiert und es dem Plasma oder Serum gestattet, durch Kapillarwirkung den chromatographischen Träger 20 hinabzuwandern. Das neutralisierende Mittel in dem Konjugatkissen 40 neutralisiert die Wirkungen des Abtrennungsmittels für rote Blutkörperchen auf die Vorrichtung 10 und Konjugat und der Analyt bindet sich an das Konjugat, das im Konjugatkissen 40 vorhanden ist. Der Analyt, gebunden an das Konjugat, bewegt sich weiter stromabwärts zu der Nachweisstelle 50. Wenn der Analyt von Interesse vorhanden ist, erscheint der Teststreifen 70. Um anzuzeigen, dass der Test richtig funktioniert, wird der Kontrollstreifen 60 erscheinen, unabhängig davon, ob der Analyt von Interesse vorhanden ist oder nicht.
Die vorliegende Erfindung kann vorzugsweise eine nicht reaktive Abdeckung oder Umhüllung um die Vorrichtung herum einschließen. Vorzugsweise schließt die Abdeckung mindestens den Chromatographieträger ein, um Kontakt mit und Kontamination der einfangenden Stellen zu vermeiden. Die Abdeckung kann auch einen erhöhten Bereich einschließen, angrenzend an die Applikationsstelle, um das Empfangen und/oder Halten eines bestimmten Volumens der Probe zu erleichtern. Zusätzlich kann die Abdeckung (einen) ausgeschnittene(n) Bereich(e) in Form eines Buchstabens, einer Zahl, eines Piktogramms oder Symbols oder einer beliebigen Kombination davon einschließen. In dieser Ausführungsform bildet/bilden der/die ausgeschnittene(n) Bereich (Bereiche) das Design für (eine) spezielle Nachweisstelle(n), wenn der Streifen vollständig eingeschlossen ist. Es wird bevorzugt, dass ein ausreichender Anteil des Streifens eingeschlossen ist, um zu verhindern, dass die aufgebrachte Probe die Nachweisstellen berührt, ohne zuerst durch einen Teil des Streifens hindurchgegangen zu sein.
Die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können in jedem Assaysystem verwendet werden, in welchem eine Blutprobe einen Analyten von Interesse enthält. Beispiele für bevorzugte Systeme schließen Folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Hepatitis C-Virus ("HCV"), Hepatitis A-Virus ("HAV"), Human Immunodeficiency Virus ("HIV"), Hepatitis B-Oberflächenantikörper ("HBsAb"), Hepatitis B-Oberflächenantigen ("HBsAg"), Hepatitis B-Kernantikörper ("HBcAb"), Hepatitis B-Kernantigen ("HBcAg"), Carcinoembryonales Antigen ("CEA"), alpha-Fetoproten ("AFP"), einen Pancreaskrebsmarker ("CA19-9"), Syphilis, Tuberkulose, Malaria, Leishmanie und Denguefieber.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die vorliegende Erfindung, aber sie sollten in keiner Weise als ihren Schutzumfang einschränkend verstanden werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Rote-Blutkörperchen-Aggregation vs. Se-Konjugat-Aggregation durch Polykationen
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die Aggregation von roten Blutkörperchen (red blood cells, rbcs) in Vollblut erwünscht, während die Aggregation des Selenkonjugats nicht erwünscht ist. Verschiedene Polykationen wurden getestet, um zu sehen, welches eine ausreichende Aggregation von rbcs bewirkt, während das Selenkonjugat nur minimal aggregiert wird.
Selenkonjugat von rekombinantem HIV-1-Protein wurde auf folgende Art und Weise hergestellt: Zuerst wurde Selenkolloid hergestellt durch Reagieren von 32 mM Selenoxid mit 91 mM L-Ascorbinsäure in einer wässerigen Lösung über 72 Stunden bei 42°C. Dieses Selenkolloid wurde verdünnt auf eine optische Dichte von 30 bei einer Wellenlänge von 550 nm und dann mit 40 μg/ml rekombinantem HIV-1-Hüllprotein in 30 mM Trispuffer, pH 7,4, 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Dieses mit Selenkolloid markierte HIV-1-Proteinkonjugat wurde als Nächstes auf eine optische Dichte von 30 bei einer Wellenlänge von 550 nm in 10 mM Trispuffer, pH 7,4, der 0,1% Casein enthielt, verdünnt und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Konjugatlösung wurde dann bei 1970 × g 20 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde verworfen. Ein Volumen von 30 mM Trispuffer, pH 7,4, der 2% Casein enthielt, äquivalent zu einem Zehntel des Volumens des Überstandes, wurde dann zu dem Überstand hinzugefügt. Schließlich wurde diese Konjugatlösung auf eine optische Dichte von 10 bei einer Wellenlänge von 550 nm in 50 mM Trispuffer, pH 7,4, verdünnt, der 1% Casein, 2% Saccharose und 2% Laktose enthielt.
Wässerige Lösungen der folgenden Polykationen wurden bei 0,25% (m/v) hergestellt: Poly-L-Lysinhydrobromid, Molekulargewicht (mw) 37000; Poly-L-Argininhydrochlorid, mw 12100, 42400 und 92000; Poly-L-Histidin, mw 18400; Hexadimethrinbromid, Poly Lysin, Alanin) 3:1 hydrobromid, mw 35000; Poly(Lysin, Alanin) 2:1 hydrobromid, mw 49300; Poly(Lysin, Alanin) 1:1 hydrobromid, mw 41600, Poly(Lysin, Tryptophan) 1:4 hydrobromid, mw 38000 (alle der oben genannten Polykationen wurden von Sigma, St. Louis, MO, erworben); Poly(diallyldimethylammoniumchlorid), mw 10⁵ bis 10⁶ (Merquat^®-100, Calgon, Pittsburgh, PA).
Die Fähigkeit dieser Polykationen, entweder rbcs in Vollblut oder das Selenkonjugat zu aggregieren, wurde in verschiedenen Reaktionen beobachtet durch Hinzufügen von 350 μl von 0,25% der verschiedenen Polykationlösungen zu demselben Volumen von entweder Vollblut oder dem Selenkonjugat. Die Lösungen wurden gemischt und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gelagert, dann wurde die Aggregation visuell bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Ein einfaches Plus (+) zeigt eine schwache Aggregation an, 2+ zeigt eine moderate Aggregation an, und 3+ und 4+ zeigen eine starke Aggregation an.
TABELLE 1
Ein Polykation, das die Aggregation von rbcs (2+ oder höher) und gleichzeitig eine minimale Aggregation von Selenkonjugat (2+ oder weniger) bewirkt, wäre eine gute Wahl. Diese Polykationen mit einem 2+ in beiden Kategorien erfüllen diese Kriterien. Poly-L-Lysin HBr und Merquat^®-100 wurden für die weitere Arbeit gewählt, wobei Merquat^®-100 das kosteneffektivste ist.
Beispiel 2
Verhindern der Konjugat-Aggregation durch Polyanion-Neutralisierung
A. Konjugatfluss und Aggregationsverhinderung durch Verwendung von Dextransulfat
Unter Verwendung von Poly-L-Lysin als rbc-Aggregations-Polykationreagenz wurden verschiedene Konzentrationen des Polyaniondextransulfats getestet, um zu sehen, ob die positive Ladung des Polykations durch das Dextransulfat neutralisiert werden könnte, wodurch die Aggregation des Selenkonjugats, bewirkt durch das Polykation, verhindert würde. Das Dextransulfat wurde hinzugefügt, nachdem das Polykation bereits eine Aggregation der rbcs bewirkt hatte, aber vor der Polykationwechselwirkung mit dem Selenkonjugat. Das folgende Experiment bewertete die Wirkung des Polykations und des Dextransulfats auf die Aggregation des Selenkonjugats und seine resultierende Fähigkeit, entlang dem immunochromatographischen Streifen zu fließen.
Ein immunochromatographischer Streifen, zusammengesetzt aus einem Probenkissen, einem Neutralisationskissen, einem Konjugatkissen und einem Nachweisstreifen, wurde zusammengesetzt. Das Probenkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 20 mm langen Glasfaserfilters (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) in eine wässerige Lösung von 0,33% Poly-L-Lysinhydrobromid, mw 37000 (Sigma, St. Louis, MO), dann Trocknen desselben unter Vakuum.
Neutralisationskissen, die unterschiedliche Konzentrationen von Dextransulfat enthielten, wurden hergestellt durch Eintauchen von 4 mm breiten und 13 mm langen Filtern, hergestellt aus Holzzellstoff und Polyester (Sontara 8801, Du pont, Wilmington, Delaware) in wässerige Lösungen, die 0%, 1,1%, 3,3% oder 10% Dextransulfat, mw 5000 (Sigma, St. Louis, MO), enthielten. Nach dem Tränken wurden die Kissen unter Vakuum getrocknet.
Das Konjugatkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 4,3 mm langen Glasfaserfilters (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) in mit Selenkolloid markiertes HIV-1-rekombinantes Proteinkonjugat, hergestellt und verdünnt wie in Beispiel 1. Nach dem Eintauchen wurde das Konjugatkissen unter Vakuum getrocknet.
Der Nachweisstreifen war ein 4 mm breiter und 40 mm langer Nitrocellulosemembranfilter (Katalog Nr. H9643G1, Millipore, Bedford, MA). HIV-1-Hüllantigen bei einer Konzentration von 5 mg/ml in 100 mM Trispuffer, pH 7,4, 1% Saccharose enthaltend, wurde zu der Nitrocellulosemembran gegeben, um eine Linie entlang der Breite des Streifens in einer Position ungefähr 1 cm von dem Ende der Membran entfernt zu bilden. Die Linienregion wurde mit Polyesterlaminat kaschiert (Code Nr. 7733, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA). Dieses wurde ausreichend trocknen gelassen, um das Antigen an die Nitrocellulose zu fixieren.
Immunochromatographiestreifen, 4 mm breit, wurden unter Verwendung der obigen Komponenten zusammengesetzt, indem sie Ende-an-Ende in Längsrichtung mit einer Überlappung von 1 mm zwischen jedem Abschnitt platziert wurden, mit dem 20 mm langen Probenkissen am einen Ende, neben dem eines der 13 mm langen Neutralisationskissen platziert wurde, gefolgt von einem 4,3 mm langen Konjugatkissen und schließlich einem 40 mm langen Nachweisstreifen. Der zusammengesetzte Streifen wurde dann mit Polyesterlaminat (Code Nr. 8648, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA) von der Spitze des Nachweisstreifens bis 10 mm über dem unteren Ende des Streifens beschichtet, wobei ungefähr 10 mm des Probenkissens freigelassen wurden. Achtzig μl Plasma wurden dann auf die Probenkissen jedes der Immunochromatographiestreifen aufgebracht, die Neutralisationskissen mit entweder 0%, 1,1%, 3,3% oder 10% Dextransulfat enthielten. Die Aggregation des roten Selenkonjugats und die Fähigkeit des Konjugats, entlang dem Streifen zu fließen, wurden visuell beobachtet.
Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 2 unten, zeigten, dass ohne die Anwesenheit von Dextransulfat zur Neutralisierung der Ladung von der Polykationlösung das Selenkonjugat aggregierte und nicht den Streifen entlangfließen konnte. Es gab ein umgekehrtes Verhältnis zwischen Konjugataggregation und Fluss, wobei die Konzentrationen von Dextransulfat von 3,3% oder höher ausreichend waren, um die Konjugataggregation zu verhindern und es dem Konjugat zu ermöglichen, den Streifen entlangzufließen.
TABELLE 2
B. RBC (rote Blutkörperchen)-Aggregation in der Anwesenheit von Dextransulfat
Um die Auswirkung von Dextransulfat auf die Aggregation von roten Blutkörperchen zu bewerten, wurde das obige Experiment wiederholt, unter Verwendung von Vollblut als Probe mit 10% Dextransulfat auf einem 4,3 mm langen und 4 mm breiten Neutralisationskissen. Nach dem Zusammensetzen des Immunochromatographiestreifens wie oben, unter Verwendung dieses Neutralisationskissens, wurden 80 μl Vollblut auf das Probenkissen aufgetragen. Fünfzehn Minuten später wurde das Ergebnis der rbc-Aggregation visuell beobachtet und die Fähigkeit des resultierenden Plasmas, den Streifen entlangzufließen, wurde gemessen. Die roten Blutkörperchen aggregierten, wurden auf dem Probenkissen zurückgehalten und flossen nicht auf den Streifen, wohingegen das Plasma in 15 Minuten 33 mm den Streifen entlangfloss. Dies zeigte, dass das Polykation in dem Probenkissen noch in der Lage war, eine Aggregation der roten Blutkörperchen in der Vollblutprobe zu bewirken, und dass die Anwesenheit des Polyanions, Dextransulfat, in dem Neutralisationskissen diese Aggregation roter Blutkörperchen nicht behinderte.
C. Konjugat-Aggregationsverhinderung durch Polyanionen
Andere Polyanionen wurden getestet zur Bewertung ihrer Fähigkeit, die Aggregation des Selenkonjugats zu verhindern, wie in Beispiel 2.A. Ein 15,5 mm langes und 4 mm breites Probenkissen wurde in eine wässerige Lösung, die 0,26% Merquat^®-100 enthielt, getaucht, dann bei 55°C getrocknet. Neutralisationskissen wurden nicht verwendet, und stattdessen wurde das Selenkonjugat in 10 mM Trispuffer verdünnt, pH 7,4, enthaltend 1% Casein, 2% Saccharose, 2% Lactose und 0%, 1,1% oder 3,3% des Polyanions Dextransulfat, mw 5000 (Sigma, St. Louis, MO), oder 0%, 0,5%, 1% oder 2% von einem der folgenden Polyanionen (alle von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI): Poly(Acrylsäure), mw 5000; Poly(Natrium-4-styrolsulfonat), mw 70.000; Poly(Vinylsulfonsäure, Natriumsalz); Poly(Methylmethacrylsäure), mw 9500; Poly(Acrylsäure, Natriumsalz), mw 2100. Die Konjugatkissen wurden in die verschiedenen Selenkonjugatlösungen eingetaucht und unter Vakuum getrocknet. Der Nachweisstreifen wurde hergestellt wie in Beispiel 2.A. und Immunochromatographiestreifen wurden zusammengesetzt. Fünfzig μl Plasma wurden dann auf die Probenkissen jedes der Immunochromatographiestreifen aufgebracht, die Konjugatkissen mit den verschiedenen Polyanionen enthielten. Die Aggregation des roten Selenkonjugats wurde visuell beobachtet. Tabelle 3 zeigt den relativen Grad der Konjugataggregation, der mit den verschiedenen Konzentrationen von getesteten Polyanionen beobachtet wurde. TABELLE 3

nt: = nicht getestet

Wie zuvor aggregierte das Selenkonjugat, wenn kein Polyanion vorhanden war, um die positive Ladung des Polykations aus dem Probenkissen zu neutralisieren (was für die Aggregation roter Blutkörperchen, wenn Vollblut getestet wird, notwendig ist). Alle in dem Konjugationskissen verwendeten Polyanionen verhinderten bei mindestens einer der getesteten Konzentrationen, dass eine Konjugataggregation auftrat. Dieses Experiment zeigte auch, daß das Polyanion nicht auf ein separates Kissen aufgetragen werden musste, sondern mit dem Selenkonjugat auf dem Konjugationskissen kombiniert werden konnte.
Beispiel 3
Verwendung von Dextransulfat in dem Neutralisationskissen im Vergleich zum Konjugationskissen in einem HIV-1-Antikörperassay
Immunochromatographiestreifen wurden hergestellt wie in Beispiel 2.A., mit oder ohne ein 4 mm breites und 4,3 mm langes Glasfaserfilter (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH)-Neutralisationskissen. Im ersteren Fall wurde das Neutralisationskissen in eine wässerige Lösung, die 3,3% Dextransulfat enthielt, getaucht, dann unter Vakuum getrocknet. In Streifen ohne ein Neutralisationskissen wurde das Selenkonjugat in 10 mM Trispuffer, pH 7,4, verdünnt, der 1% Casein, 2% Saccharose, 2% Laktose und 3,3% Dextransulfat enthielt, und das Konjugatkissen wurde in diese Lösung getaucht, dann unter Vakuum getrocknet. Das verwendete Probenkissen war wie in Beispiel 2.A., außer dass es in eine wässerige Lösung von 0,2%-igem Merquat^®-100 getaucht wurde.
Humanserum, das HIV-1-Antikörper enthielt, wurde 1:2048 entweder in HIV-negativem menschlichem Vollblut (basierend auf dem Plasmavolumen) mit einem Hämatokritwert von 50% oder in HIV-negativem menschlichem Plasma verdünnt. Drei weitere serielle 1:2-Verdünnungen wurden hergestellt, wiederum unter Verwendung von entweder Vollblut oder Plasma als Verdünnungsmittel. Achtzig μl von negativem Vollblut oder Proben aus der HIV-1-positiven Vollblutverdünnungsserie wurden zu dem Probenkissen der Immunochromatographiestreifen gegeben, die mit Dextransulfat auf einem separaten Neutralisationskissen oder Dextransulfat in der Selenkonjugatlösung auf dem Konjugatkissen präpariert wurden. Achtzig μl von negativem Plasma oder Proben aus der HIV-1-positiven Plasmaverdünnungsserie wurden nur auf Immunochromatographiestreifen mit Dextransulfat auf dem Konjugatkissen getestet. Die Ergebnisse wurden 15 Minuten nach der Probenaufbringung abgelesen (Tabelle 4). Ein positives Ergebnis zeigte eine rote Farbe auf dem Nachweisstreifen, wo der rote Selen-HIV-1-Antigenkonjugat-HIV-1-Antikörperkomplex an das HIV-1-Antigen auf der Linienregion des Streifens gebunden war. Ein negatives Ergebnis zeigte keine Farbe in diesem Bereich auf dem Nachweisstreifen. TABELLE 4

nt: = nicht getestet

Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen an, dass HIV-1-Antikörper aus Vollblut in einem Immunochromatographiestreifenassay nachweisbar sind, unter Verwendung des Polykations Merquat^®-100, um rote Blutkörperchen zu aggregieren und es der Probe zu ermöglichen, den Streifen entlangzufließen, und des Polyanions Dextransulfat als Neutralisierungsmittel, das die Aggregation des Selenkonjugats durch das Polykation verhindert und es dem Konjugat ermöglicht, sich zu binden und einen Komplex mit einer positiven Probe zu bilden und den Streifen entlang zu dem Nachweisbereich zu fließen. Es wurde gezeigt, dass das Polyanion wirksam ist, wenn es entweder in einem separaten Neutralisationskissen verwendet oder mit dem Selenkonjugat auf dem Konjugatkissen kombiniert wird. In diesem Assay wies die Sensitivität beim Nachweis von HIV-1-Antikörpern eine zweifache Verbesserung bei Verwendung des Polyanions (Dextransulfat) in dem Konjugatkissen gegenüber Verwendung auf einem separaten Neutralisationskissen auf.
Zusätzlich zeigen die Ergebnisse in Tabelle 4, dass das Polykation die roten Blutkörperchen in dem Vollblut wirksam aggregiert, wie gezeigt durch gleiche Sensitivität beim Nachweis von HIV-1-Antikörpern, ob in Vollblut, wo die roten Blutkörperchen aggregiert werden müssen, damit die Probe fließt, oder Plasma, wo es keine roten Blutkörperchen gibt, die den Probenfluss verhindern. Dies zeigt auch, dass die Anwesenheit des Polyanions, entweder in einem separaten Neutralisationskissen oder in dem Konjugatkissen, nicht die Fähigkeit des Polykations beeinträchtigt, die Aggregation von roten Blutkörperchen in Vollblut effektiv zu bewirken.
Beispiel 4 Verwendung von Merquat^® und verschiedenen Polyanionen in einem HBsAg-Assay
Immunochromatographiestreifen wurden für den Nachweis des Hepatitis B-Oberflächenantigens (HBsAg) in Vollblutproben hergestellt. Merquat^®-100 wurde als das Polykation zur Aggregation der roten Blutkörperchen in dem Probenkissen verwendet und verschiedene Polyanionen wurden in dem Konjugatkissen als Polykationneutralisationsreagenzien zur Verhinderung der Aggregation des Selenkonjugats bewertet.
Immunochromatographiestreifen, zusammengesetzt aus einem Probenkissen, einem Konjugatkissen und einem Nachweisstreifen, wurden zusammengesetzt. Das Probenkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 15,5 mm langen Glasfaserfilters in eine wässerige Lösung von 0,26% Merquat^®-100 und anschließendes Trocknen bei 55°C.
Das Selenkonjugat wurde hergestellt unter Verwendung eines Selenkolloids, wie in Beispiel 1, und 12 μg/ml monoklonalem Maus-Antikörper gegen HBsAg (anti-HBs). Dieses mit Selenkolloid markierte Anti-HBs-Konjugat wurde dann auf eine optische Dichte von 2,6 bei einer Wellenlänge von 550 nm in Trispuffer verdünnt, der eines der folgenden Polyanionen enthielt: 0,5% Poly(Acrylsäure), mw 2000 (PAA-2000); 0,5% Poly(Acrylsäure), mw 240.000 (PAA-240.000); 0,5% Dextransulfat, mw 5000; 0,8% Poly-L-Asparaginsäure, mw 36.300; 0,5% Carboxymethylcellulose, mw 90.000 (CMC). Das Dextransulfat und Poly-L-Asparaginsäure stammten von Sigma, St. Louis, MO, und die restlichen Polyanionen stammten von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI.
Das Konjugatkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 4,3 mm langen Glasfaserfilters in mit Selenkolloid markiertes Anti-HBs-Konjugat, hergestellt und verdünnt mit einem der obigen Polyanionen. Nach dem Eintauchen wurde das Konjugatkissen unter Vakuum getrocknet.
Der Nachweisstreifen war ein 4 mm breiter und 40 mm langer Nitrocellulosemembranfilter, hergestellt wie in Beispiel 2 unter Verwendung von monoklonalem Maus-Anti-HBs in einer Konzentration von 3 mg/ml und zu der Nitrocellulosemembran gegeben, um eine Linie über die Breite des Streifens in einer Position ungefähr 1 cm von dem Ende der Membran entfernt zu bilden. Die Linienregion wurde mit Polyesterlaminat kaschiert. Dieses wurde ausreichend trocknen gelassen, um den Antikörper an die Nitrocellulose zu fixieren.
Immunochromatographiestreifen wurden zusammengesetzt unter Verwendung der obigen Komponenten, indem sie Ende-an-Ende in Längsrichtung platziert wurden, mit einer Überlappung von 1 mm, mit dem Probenkissen an einem Ende, neben dem ein Konjugatkissen platziert wurde, und zuletzt ein Nachweisstreifen. Der zusammengesetzte Streifen wurde dann mit Polyesterlaminat bedeckt, wobei ungefähr 10 mm des Probenkissens freigelassen wurden.
Rekombinantes HBsAg wurde zu HBsAg-negativem menschlichem Vollblut mit einem Hämatokritwert von 50% bis zu einer Konzentration von 12,5 ng/ml gegeben. Drei weitere 1:2 serielle Verdünnungen wurden in Vollblut vorgenommen. Fünfzig μl des negativen Vollbluts oder der Proben aus der HBsAg-positiven Vollblutverdünnungsserie wurden zu dem Probenkissen der Immunochromatographiestreifen gegeben, die mit verschiedenen Polyanionen in dem Konjugatkissen präpariert wurden. Die Ergebnisse wurden fünfzehn Minuten nach der Probenaufbringung abgelesen (Tabelle 5). Ein positives Ergebnis zeigte eine rote Farbe auf dem Nachweisstreifen, wo der rote Selen-Anti-HBs-Konjugat-HBsAg-Komplex an das Anti-HBs auf dem Linienbereich des Streifens gebunden war. Ein negatives Ergebnis zeigte keine Farbe in diesem Bereich des Nachweisstreifens. Eine Aggregation des roten Selenkonjugats an dem Anfang des Nachweisstreifens wurde visuell beobachtet.
TABELLE 5
Es ermöglichten zwar alle Polyanionen einen HBsAg-Nachweis, aber diejenigen Polyanionen, die die Konjugataggregation verhinderten, PAA-2000, Dextransulfat und Poly-L-Asparaginsäure, wiesen eine 2- bis 4-mal empfindlichere Detektion von HBsAg in Vollblutproben auf.
Das obige Experiment wurde wiederholt unter Verwendung des mit Selenkolloid markierten Konjugats, verdünnt in Trispuffer, der PAA-2000 als Polyanion enthielt, außer dass 25 μl von 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, eine Minute nach der Zugabe der HBsAg-Vollblutproben zu dem Probenkissen hinzugefügt wurde. Die Ergebnisse, die unter Anwendung dieses Verfahrens erzielt wurden, mit der Zugabe des Puffers nach der Probenaufbringung, waren identisch mit den Ergebnissen ohne diesen Schritt. Somit können diese Assays entweder mit oder ohne Zugabe von Puffer nach der Probenaufbringung durchgeführt werden.
Beispiel 5
Verwendung von Merqauat^® und Dextransulfat in einem Assay für Tuberkulose
Immunochromatographiestreifen wurden hergestellt für den Nachweis von Antikörpern gegen Mycobacterium tuberculosis (Anti-Mtb) in Vollblutproben. Merquat^®-100 wurde verwendet als Polykation für die Aggregation der roten Blutkörperchen in dem Probenkissen, und verschiedene Konzentrationen des Polyanions Dextransulfat wurden im Konjugatkissen bewertet als Polykationneutralisationsreagenz, um die Aggregation des Selenkonjugats zu verhindern.
Immunochromatographiestreifen, zusammengesetzt aus einem Probenkissen, einem Konjugatkissen und einem Nachweisstreifen, wurden zusammengesetzt. Das Probenkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 15,5 mm langen Glasfaserfilters in eine wässerige Lösung von 0,26% Merquat^®-100 und anschließendes Trocknen desselben in einem Vakuum.
Das Selenkonjugat wurde hergestellt unter Verwendung von Selenkolloid, wie in Beispiel 1, und 3,5 μg/ml von rekombinantem Mtb-Antigen aus E. coli. Dieses mit Selenkolloid markierte Mtb-Konjugat wurde dann auf eine optische Dichte von 2,5 bei einer Wellenlänge von 550 nm in Trispuffer, der entweder 0%, 0,34%, 1,1% oder 3,3% Dextransulfat enthielt, verdünnt.
Das Konjugatkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 4,3 mm langen Glasfaserfilters in mit Selenkolloid markiertes Mtb-Konjugat, hergestellt und verdünnt mit einer der obigen Dextransulfatkonzentrationen. Nach dem Eintauchen wurde das Konjugatkissen unter Vakuum getrocknet.
Der Nachweisstreifen war ein 4 mm breiter und 40 mm langer Nitrocellulosemembranfilter, hergestellt wie in Beispiel 2 unter Verwendung von rekombinantem Mtb-Antigen mit einer Konzentration von 0,15 mg/ml und zu der Nitrocellulosemembran gegeben, um eine Linie über die Breite des Streifens in einer Position ungefähr 1 cm von dem Ende der Membran entfernt zu bilden. Die Linienregion wurde mit Polyesterlaminat kaschiert. Dies ließ man ausreichend trocknen, um das Antigen an die Nitrocellulose zu fixieren.
Immunochromatographiestreifen wurden zusammengesetzt unter Verwendung der obigen Komponenten, indem sie Ende-an-Ende in Längsrichtung platziert wurden, mit einer Überlappung von 1 mm, mit dem Probenkissen an einem Ende, neben welches ein Konjugatkissen platziert wurde, und zuletzt ein Nachweisstreifen. Der zusammengesetzte Streifen wurde dann mit Polyesterlaminat überzogen, wobei ungefähr 10 mm des Probenkissens freigelassen wurden.
Anti-Mtb-positives Serum wurde 1:100 in negativem menschlichem Vollblut mit einem Hämatokritwert von 50% verdünnt. Zwei weitere serielle 1:2-Verdünnungen wurden in Vollblut hergestellt. Fünfzig μl von negativem Vollblut oder Proben aus der Anti-Mtb-positiven Vollblutverdünnungsserie wurden zu dem Probenkissen der Immunochromatographiestreifen gegeben, die mit verschiedenen Konzentrationen von Dextransulfat in dem Konjugatkissen präpariert wurden. Die Ergebnisse wurden 15 Minuten nach der Probenaufbringung abgelesen (Tabelle 6). Ein positives Ergebnis zeigte eine rote Farbe auf dem Nachweisstreifen, wo der rote Selen-Mtb-Konjugat-Anti-Mtb-Komplex im Linienbereich des Streifens an das Mtb gebunden wurde. Ein negatives Ergebnis zeigte keine Farbe in diesem Bereich des Nachweisstreifens. Die Aggregation des roten Selenkonjugats am Anfang des Nachweisstreifens wurde visuell beobachtet.
TABELLE 6
Die Daten in Tabelle 6 zeigen, dass der Assay nicht ohne die Anwesenheit eines Polyanions, in diesem Fall Dextransulfat, die Aggregation des Konjugats verhindert. Es besteht ein umgekehrtes Verhältnis zwischen Konjugataggregation und Assaygenauigkeit. Bei einer Dextransulfatkonzentration von 3,3% tritt keine Konjugataggregation auf, und der Assay zeigt den genauesten Nachweis von Anti-Mtb.
Beispiel 6
Syphilisassay unter Verwendung von Merquat^® und Dextransulfat
Immunochromatographiestreifen wurden für den Nachweis von Antikörper gegen Treponema pallidum (Anti-TP) in Vollblut- oder Plasmaproben hergestellt. Durch Vergleichen der Sensitivität des Nachweises in Vollblut gegenüber Plasma konnte bestimmt werden, ob rote Blutkörperchen durch das Polykation im Vollblut effektiv aggregiert wurden, so dass sie die Sensitivität des Nachweises des Assays nicht behinderten und somit verminderten. Merquat^®-100 wurde als das Polykation für die Aggregation von roten Blutkörperchen in dem Probenkissen verwendet, und das Polyanion Dextransulfat wurde in dem Konjugatkissen als das Polykationneutralisierungsreagenz verwendet, um die Aggregation des Selenkonjugats zu verhindern.
Immunochromatographiestreifen, zusammengesetzt aus einem Probenkissen, einem Konjugatkissen und einem Nachweisstreifen, wurden zusammengesetzt. Das Probenkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 15,5 mm langen Glasfaserfilters in eine wässerige Lösung von 0,2% Merquat^®-100 und anschließendes Trocknen bei 55°C.
Das Selenkonjugat wurde hergestellt unter Verwendung von Selenkolloid, wie in Beispiel 1, und 7,5 μg/ml Treponemapallidumlysat (TP). Dieses mit Selenkolloid markierte TP-Konjugat wurde dann auf eine optische Dichte von 2,8 bei einer Wellenlänge von 550 nm in Trispuffer, der 3,3% Dextransulfat enthielt, verdünnt.
Das Konjugatkissen wurde hergestellt durch Eintauchen eines 4 mm breiten und 4,3 mm langen Glasfaserfilters in das mit Selenkolloid markierte TP-Konjugat, das oben hergestellt wurde. Nach dem Eintauchen wurde das Konjugatkissen unter Vakuum getrocknet.
Der Nachweisstreifen war ein 4 mm breiter und 40 mm langer Nitrocellulosemembranfilter, hergestellt wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Treponema pallidum-Lysat bei einer Konzentration von 44 μg/ml und zu der Nitrocellulosemembran gegeben, um eine Linie über die Breite des Streifens in einer Position ungefähr 1 cm von dem Ende der Membran entfernt zu bilden. Die Linienregion wurde mit Polyesterlaminat kaschiert. Dies wurde ausreichend trocknen gelassen, um das TP-Lysat an die Nitrocellulose zu fixieren.
Immunochromatographiestreifen wurden zusammengesetzt unter Verwendung der obigen Komponenten, indem sie Ende-an-Ende in Längsrichtung platziert wurden, mit einer Überlappung von 1 mm, mit dem Probenkissen an einem Ende, neben welches ein Konjugatkissen platziert wurde, und zuletzt ein Nachweisstreifen. Der zusammengesetzte Streifen wurde dann mit Polyesterlaminat überzogen, wobei ungefähr 10 mm des Probenkissens freiblieben.
Anti-TP-positives Humanserum wurde 1:10,8 in entweder negativem menschlichem Vollblut mit einem Hämatokritwert von 50% oder in negativem Humanplasma verdünnt. Vier weitere 1:2 serielle Verdünnungen wurden hergestellt, wiederum unter Verwendung von entweder Vollblut oder Plasma als Verdünnungsmittel. Sechzig Mikroliter von negativem Vollblut oder Plasma oder Proben aus dem Anti-TP-positiven Vollblut oder der Plasmaverdünnungsserie wurden zu dem Probenkissen der Immunochromatographiestreifen gegeben. Ergebnisse wurden 15 Minuten nach der Probenaufbringung abgelesen (Tabelle 7). Ein positives Ergebnis zeigte eine rote Farbe auf dem Nachweisstreifen, wo der rote Selen-TP-Konjugat-Anti-TP-Komplex an das TP-Lysat auf der Linienregion des Streifens gebunden war. Ein negatives Ergebnis zeigte keine Farbe in diesem Bereich des Nachweisstreifens.
Tabelle 7 zeigt, dass die Sensitivität für den Nachweis von Anti-TP sowohl in Vollblut als auch in Plasma die gleiche war, was anzeigt, dass das Polykation, Merquat^®-100, die roten Blutkörperchen in dem Vollblut effektiv aggregierte.
TABELLE 7

Claims

Eine Chromatographie-Assay-Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten in einer Blutprobe, die folgendes umfasst: einen Chromatographie-Träger, der einen Pfad für den Fluidfluß definiert und Kapillarfluss unterstützt, eine Applikationsstelle für die Blutprobe in Fluidfluss-Kontakt mit dem Chromatographieträger, eine Detektionsstelle auf dem Chromatographieträger, räumlich getrennt von der Applikationsstelle, mit einer nicht-diffundierend gebundenen Einfangsubstanz, die daran gebunden ist, eine diffundierend gebundene markierte Substanz, die sich an der Applikationsstelle befindet, ein diffundierend gebundenes Polykation zum Trennen von Plasma oder Serum von der Blutprobe stromaufwärts von der Nachweisstelle und ein diffundierend gebundenes Polyanion zum Neutralisieren des Polykations stromabwärts vom gebundenen Polykation und stromaufwärts von der Nachweisstelle.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin die Vorrichtung eine Immunassay-Vorrichtung ist.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Polykation an der Applikationsstelle für die Blutprobe gebunden ist.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Polykation gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly-L-lysinhydrobromid, Poly-L-argininhydrochlorid, Poly-L-histidin, Poly(lysin, alanin) 3:1 hydrobromid, Poly(lysin, alanin) 2:1 hydrobromid, Poly(lysin, alanin) 1:1 hydrobromid, Poly(lysin, tryptophan) 1:4 hydrobromid und Poly(diallyldimethylammoniumchlorid).
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Polykation Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) ist.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Polyanion gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dextransulfat, Poly(acrylsäure), Poly(natrium-4-styrolsulfonat), Poly(vinylsulfonsäure), Poly(methylmethacrylsäure), Poly-L-asparaginsäure und Carboxymethylzellulose.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Polyanion Dextransulfat ist.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Polyanion an derselben Stelle wie die markierte Substanz diffundierend an den Chromatographieträger gebunden ist.
Die Chromatographie-Assay-Vorrichtung von Anspruch 1, worin die markierte Substanz eine mit Selen markierte Substanz ist.
Ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten in einer Blutprobe, das folgende Schritte umfasst: Bereitstellen eines Chromatographie-Trägers, der einen Pfad für Fluidfluß definiert und den Kapillarfluss unterstützt, entlang dem sich folgendes befindet: (a) eine Applikationsstelle für die Blutprobe in Fluidflußkontakt mit dem Chromatographie-Träger, (b) eine Nachweisstelle auf dem Chromatographie-Träger, räumlich getrennt von der Applikationsstelle, mit einer nicht-diffundierend gebundenen Einfangsubstanz, die daran gebunden ist, (c) eine markierte Substanz, die sich an der Applikationsstelle befindet, (d) ein diffundierend gebundenes Polykation zum Trennen von Plasma oder Serum von der Blutprobe stromaufwärts von der Nachweisstelle und (e) ein diffundierend gebundenes Polyanion zum Neutralisieren des Polykations, das sich stromabwärts vom gebundenen Polykation und stromaufwärts von der Nachweisstelle befindet; In-Kontakt-Bringen der Applikationsstelle mit der Blutprobe und Nachweisen des Vorhandenseins von Analyt in der Blutprobe.
Das Verfahren von Anspruch 10, worin die markierte Substanz eine mit Selen markierte Substanz ist.
Das Verfahren von Anspruch 10, worin das Polyanion an derselben Stelle wie die markierte Substanz diffundierend an den Chromatographieträger gebunden ist.
Das Verfahren von Anspruch 10, worin das Polykation gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly-L-lysinhydrobromid, Poly-L-argininhydrochlorid, Poly-L-histidin, Poly(lysin, alanin) 3:1 hydrobromid, Poly(lysin, alanin) 2:1 hydrobromid, Poly(lysin, alanin) 1:1 hydrobromid, Poly(lysin, tryptophan) 1:4 hydrobromid und Poly (diallyldimethylammoniumchlorid).
Das Verfahren von Anspruch 10, worin das Polyanion gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dextransulfat, Poly(acrylsäure), Poly(natrium-4-styrolsulfonat), Poly(vinylsulfonsäure), Poly(methylmethacrylsäure), Poly-L-asparaginsäure und Carboxymethylzellulose.