ES2202931T3 - Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre. - Google Patents
Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre.Info
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Abstract
Un dispositivo de ensayo cromatográfico para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre que comprende: un vehículo cromatográfico que define una vía para el flujo de fluido y soporta el flujo capilar, un sitio de aplicación de dicha muestra de sangre en contacto por el flujo del fluido con dicho vehículo cromatográfico, un sitio de detección en dicho vehículo cromatográfico separado de dicho sitio de aplicación que tiene unido al mismo una sustancia de captura unida no difusivamente, una sustancia marcada unida difusivamente situada corriente abajo de dicho sitio de aplicación, un policatión unido difusivamente para separar el plasma o el suero de dicha muestra de sangre corriente arriba de dicho sitio de detección y un polianión unido difusivamente para neutralizar el policatión corriente abajo de dicho policatión unido y corriente 20 arriba de dicho sitio de detección.
Description
Dispositivo cromatográfico y procedimiento de
detección de un analito en una muestra de sangre.
La presente invención se refiere a dispositivos
para ensayos cromatográficos y a un método para detectar un analito
en una muestra de sangre completa, y más particularmente a un
dispositivo y a un método que emplean un agente separador de
glóbulos rojos sanguíneos para agregar los glóbulos rojos sanguíneos
y un agente neutralizante para neutralizar cualquier efecto negativo
que pueda tener el agente separador de glóbulos rojos sanguíneos
sobre el sistema de ensayo.
Los métodos de diagnóstico clínico modernos se
llevan a cabo rutinariamente en muestras de sangre.
Desgraciadamente, los glóbulos rojos sanguíneos interfieren con
muchas determinaciones diagnósticas. En los ensayos para determinar
un analito, los glóbulos rojos sanguíneos pueden inhibir la unión
entre miembros de pares de unión específica. De igual modo, los
glóbulos rojos sanguíneos tienen actividad enzimática que,
dependiendo del ensayo empleado, puede interferir con la señal
producida. Además, en un formato de ensayo rápido que utilice un
dispositivo de ensayo cromatográfico, particularmente un dispositivo
de inmunoensayo cromatográfico, los glóbulos rojos sanguíneos pueden
inhibir el flujo de fluido que es necesario para que tengan lugar
las reacciones en el dispositivo. Por estas y otras razones, muchas
metodologías de ensayo se llevan a cabo en plasma o en suero que
deben ser separados primeramente de una muestra de sangre
completa.
Existen muchas técnicas conocidas para separar
los glóbulos rojos sanguíneos del plasma en una muestra de sangre
completa. La centrifugación es un método bien conocido en la técnica
mediante el cual se separa el plasma (antes de la coagulación) y el
suero (después de la coagulación) de la sangre completa. En este
procedimiento, los glóbulos rojos sanguíneos sedimentan en el fondo
del tubo de ensayo, y el suero es separado por decantación o
mediante algún otro método. La estratificación de sangre completa
por centrifugación tiene, sin embargo, muchas desventajas.
Generalmente, la centrifugación requiere la extracción de una
muestra de sangre grande. Además, el proceso requiere mucho tiempo y
un equipamiento de laboratorio voluminoso que no está presente a
menudo en la consulta de un médico. Finalmente, la manipulación
extra de la sangre incrementa la exposición a los peligros
potenciales de los patógenos llevados por la sangre.
Con el fin de reducir o eliminar la necesidad de
centrifugación, se han desarrollado dispositivos de ensayo que
emplean membranas de gradiente o membranas de captura para separar
los glóbulos rojos sanguíneos de la porción líquida de la sangre. Se
han utilizado también anticuerpos anti-glóbulos
rojos sanguíneos inmovilizados.
Otras técnicas conocidas para separar los
glóbulos rojos sanguíneos del plasma o del suero incluyen (1) la
combinación de una muestra de sangre completa con un agente que se
una a los glóbulos rojos sanguíneos, filtrando la mezcla a través de
un elemento absorbente sólido al que está unido al menos un miembro
de un par de unión específica para extraer los glóbulos rojos
sanguíneos aglutinados; (2) el pase de sangre completa a través de
un filtro de microfibra de vidrio que puede tener o no un agente
aglutinante incorporado; (3) el empleo de una capa de barrera o
exclusión de material polisacarídico para impedir que pasen los
glóbulos rojos sanguíneos e interfieran con la detección o la
visualización de una señal en una tira de análisis seco; y (4) la
utilización de un soporte que tiene una superficie policatiónica a
la que se unen los glóbulos rojos sanguíneos pero no el plasma.
Muchas de estas técnicas para la separación de
los glóbulos rojos sanguíneos del plasma son costosas, complicadas,
pueden tener como resultado una separación incompleta de los
glóbulos rojos sanguíneos y pueden causar hemolisis. La hemolisis
conduce a una unión no específica o a fondos elevados que producen
una pérdida de la sensibilidad del ensayo. Ésta puede ser el
resultado de la hemoglobina libre que puede colorear la zona de
detección de tal manera que la zona puede obtener un color que varía
desde rosa a marrón oscuro. Como resultado, la producción de una
señal química visual puede ser totalmente o parcialmente oscurecida
por la presencia del color de la hemoglobina en la zona de
detección. Además, la utilización de un agente separador, tal como
un policatión, en un sistema de ensayo tiende a interferir con el
sistema, mediante la agregación a menudo de otros reactivos o de
otros miembros de unión además de los glóbulos rojos sanguíneos.
Por consiguiente, existe la necesidad de un
dispositivo y de un método para detectar un analito en una muestra
de sangre sin afectar de manera adversa al sistema de ensayo. Tal
dispositivo y método deben ser adecuados para muestras de sangre
completa de varios tamaños, incluyendo muestras pequeñas.
EP-A-0 325 413
describe un dispositivo para determinar un analito en una muestra de
sangre completa, que comprende un soporte del que al menos una
porción tiene una superficie policatiónica para que se unan los
glóbulos rojos sanguíneos y del que al menos una porción contiene un
miembro de un par de unión específica unido de manera no difusiva a
la misma, y un método para separar plasma de una muestra de sangre
completa utilizando tal dispositivo.
La presente invención se refiere a un dispositivo
cromatográfico y a un método para detectar la presencia de un
analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre, según
se define en las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 1 representa una realización preferida
del dispositivo para ensayos cromatográficos de la presente
invención.
La presente invención está basada en la
observación de que los glóbulos rojos sanguíneos en las muestras de
sangre completa interfieren con las determinaciones de la presencia
o cantidad de un analito en la muestra de sangre que podrían
realizarse fácilmente de otro modo a través de sistemas de ensayo.
Por ejemplo, en un inmunoensayo, es poco probable que una muestra de
sangre completa puesta en contacto con un sitio de aplicación se
mueva hacia abajo de la tira por acción capilar debido al
impedimento o a la interferencia causados por la presencia de los
glóbulos rojos sanguíneos. La presente invención resuelve este
problema sin interferir con la sensibilidad del sistema de
ensayo.
Las definiciones siguientes pueden ser útiles
para comprender las realizaciones de la presente invención.
"Analito" o "analito de interés" se
refiere al compuesto o a la composición que se va a detectar o
medir, que tiene al menos un epítopo o un sitio de unión. El analito
puede ser cualquier sustancia para la que exista un miembro de unión
específica con el analito que esté presente de forma natural o para
la que pueda prepararse un miembro de unión específica con el
analito. Los analitos incluyen, pero no están limitados a, toxinas,
compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos,
aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas,
fármacos (incluyendo los administrados con fines terapéuticos así
como las drogas administradas con fines ilícitos) y metabolitos de,
o anticuerpos hacia, cualquiera de las sustancias anteriores. El
término "analito" incluye también cualquier sustancia
antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de
los mismos.
"Vehículo cromatográfico", se refiere a
cualquier material poroso, absorbente, bíbulo, isotrópico o capilar
adecuado, que incluye el sitio de detección del dispositivo y a
través del cual el analito o la muestra de ensayo pueden ser
transportados por acción capilar o acción de mecha. Se apreciará por
una persona experta en la técnica que el vehículo cromatográfico
puede estar constituido por un único material o por más de un
material (por ejemplo, zonas, porciones, capas, áreas o sitios
diferentes pueden estar constituidos por materiales diferentes) con
la condición de que las múltiples capas estén en contacto unas y
otras con el flujo del fluido, permitiendo de este modo el paso de
la muestra de ensayo entre los materiales. El contacto con el flujo
del fluido permite el paso de al menos algunos componentes de la
muestra, esto es del analito, entre las zonas del material poroso y
es preferiblemente uniforme a lo largo de la interfase de contacto
entre las diferentes zonas. Pueden utilizarse como vehículo
cromatográfico materiales naturales, sintéticos o materiales que
existan de manera natural y que estén modificados sintéticamente, e
incluyen, pero no se limitan a: papel (fibroso) o membranas
(microporosas) de materiales de celulosa tales como papel; celulosa
y derivados de celulosa tales como acetato de celulosa y
nitrocelulosa; fibra de vidrio; tejidos, naturales (por ejemplo
algodón) y sintéticos (por ejemplo nailon); geles porosos y
similares.
"Marca" se refiere a cualquier sustancia que
sea capaz de producir una señal que sea detectable por medios
visuales o instrumentales. Varias marcas adecuadas para ser
utilizadas en la presente invención incluyen marcas que producen
señales por medios químicos o físicos. Ejemplos incluyen enzimas y
sustratos, cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, partículas de látex con polímeros orgánicos
coloreadas o coloreables y liposomas u otras vesículas conteniendo
sustancias visibles directamente. Preferiblemente, en la presente
invención se emplean marcas radioactivas, partículas metálicas
coloidales o partículas no metálicas coloidales. Las marcas
preferidas incluyen oro coloidal y partículas de látex.
"Sustancia marcada" o "conjugado" se
refiere a una sustancia que contiene una marca detectable unida a un
miembro de unión específica. La unión puede ser unión covalente o no
covalente y puede incluir la hibridación de ácidos nucleicos. La
marca permite a la sustancia marcada producir una señal detectable
que está relacionada directamente o indirectamente con la cantidad
de analito en una muestra de ensayo. El componente de la sustancia
marcada que es un miembro de unión específica es seleccionado para
que se una directamente o indirectamente al analito.
"Miembro de unión específica" se refiere a
un miembro de un par de unión específica, esto es dos moléculas
diferentes donde una de las moléculas se une específicamente a la
segunda molécula por medios químicos o físicos. Si el miembro de
unión específica es un inmunorreactivo puede ser, por ejemplo, un
anticuerpo, un antígeno, un hapteno o un complejo de los mismos, y
si se utiliza un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o
policlonal, una proteína o anticuerpo recombinante, un anticuerpo
quimérico, mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así
como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de unión
específica. Ejemplos específicos de miembros de unión específica
incluyen biotina y avidina, un anticuerpo y su antígeno
correspondiente (sin tener ninguno de los dos relación con la
muestra que va a ser analizada), un ácido nucleico de hebra sencilla
y su complemento, y similares.
"Sustancia de captura" se refiere a uno o
más miembros de unión específica que están fijados en o sobre una
porción del vehículo cromatográfico para formar uno o más "sitios
de captura" en los que el analito, el reactivo marcado y/o el
reactivo control resultan inmovilizados en el vehículo
cromatográfico. El método de fijación no es crítico para la presente
invención. La sustancia de captura facilita la observación de la
señal detectable separando sustancialmente el analito y/o la
sustancia marcada de los reactivos del ensayo no unidos y de los
componentes restantes de la muestra de ensayo. La sustancia de
captura puede ser inmovilizada en el vehículo cromatográfico antes o
durante la realización del ensayo por medio de cualquier método de
fijación adecuado. Además, la sustancia de captura puede ser
proporcionada en un solo sitio de detección o en múltiples sitios de
detección sobre o en el vehículo cromatográfico. La sustancia de
captura puede ser proporciona también en una variedad de
configuraciones con el fin de producir diferentes formatos de
detección o medida. Por ejemplo, la sustancia de captura puede ser
configurada como una letra, un número, un icono, un símbolo o
cualquier combinación de los mismos.
En particular, la presente invención proporciona
un dispositivo de ensayo cromatográfico para detectar la presencia
de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre.
El dispositivo está preferiblemente en la forma de una tira
cromatográfica que tiene un vehículo cromatográfico definiendo una
vía para el flujo de fluido y que es capaz de soportar el flujo
capilar, un sitio de aplicación de la muestra de sangre y un sitio
de detección separado del sitio de aplicación para detectar la
presencia o la cantidad de analito presente en la muestra de sangre.
El dispositivo incluye también una sustancia marcada (o conjugado)
unida difusivamente al vehículo cromatográfico. En una realización
preferida, la sustancia marcada se unirá al analito o competirá con
el analito para unirse al sitio de detección. El dispositivo
contiene dos agentes adicionales unidos difusivamente al vehículo
cromatográfico: (1) un agente separador de los glóbulos rojos
sanguíneos corriente arriba (de aquí en adelante, la dirección del
movimiento de una muestra causado por acción capilar es denominada
"corriente abajo" y la dirección opuesta es denomina
"corriente arriba") del sitio de detección que es capaz de
separar el plasma o el suero de la muestra de sangre, y (2) un
agente neutralizante corriente abajo del agente separador de los
glóbulos rojos sanguíneos y corriente arriba del sitio de detección
para neutralizar cualquier efecto, particularmente un efecto
adverso, del agente separador de glóbulos rojos sanguíneos sobre el
sistema cromatográfico.
En el contexto de la presente invención, la frase
"unido difusivamente" según es aplicada a un reactivo dado que
puede ser definido como cualquier reactivo utilizado en la presente
invención, incluyendo pero no limitándose a, una sustancia marcada,
un miembro de unión específica, un agente separador de glóbulos
rojos sanguíneos o un agente neutralizante, está destinada a indicar
que el(los) reactivo(s) está(n) unido(s) de una
manera que permite al(los) reactivo(s) unido(s)
fluir a lo largo de la vía de flujo.
Para los fines de la presente invención, puede
emplearse cualquier sistema de ensayo. Se prefieren los sistemas de
inmunoensayo incluyendo, pero no limitándose a, sistemas de flujo
lateral, sistemas de flujo vertical, sistemas de impregnación y
varillas de inmersión. A continuación se presenta una descripción
general de sistemas de ensayo conocidos.
De manera general, en una tira de cromatografía,
al menos un sitio de aplicación de la muestra y un sitio de
detección de la muestra están dispuestos en un vehículo
cromatográfico. Una solución de muestra, en este caso
preferiblemente una muestra de sangre, sospechosa de tener un
analito de interés, esto es un analito, se mueve a través del
vehículo cromatográfico por acción capilar cuando es añadida al
sitio de aplicación de la muestra, y una sustancia marcada o
conjugado que está contenida en un medio de marcaje colocado
previamente en un vehículo cromatográfico se acumula en el sitio de
detección en proporción directa o inversa a la presencia o cantidad
de la sustancia a analizar en la solución de la muestra, efectuado
por una reacción de unión (tal como una reacción inmunológica), de
tal manera que puede encontrarse la presencia o cantidad de la
sustancia a analizar en la solución de la muestra midiendo la
presencia o la cantidad de la sustancia marcada o conjugado así
acumulada. Se conocen varios tipos de tiras para cromatografía y
todas estas tiras para cromatografía conocidas, incluyendo las que
serán descritas posteriormente, pueden ser utilizadas en la presente
invención. El término "dispositivo de ensayo cromatográfico"
según se utiliza en la presente, indica una tira para cromatografía
que está producida de tal manera que puede ser utilizada en un
ensayo y es capaz de ser almacenada y transportada.
Lo siguiente describe un ejemplo típico de una
tira para cromatografía. Un sitio de aplicación de la muestra está
situado en una posición corriente arriba de la sustancia marcada.
Cuando una solución de muestra, sospechosa de contener un analito a
analizar, es puesta en contacto con el sitio de aplicación de la
muestra, la solución de la muestra se mueve a través del vehículo
cromatográfico en dirección corriente abajo junto con el analito por
acción capilar. Típicamente, el analito es un compuesto que se une
de manera específica a una sustancia de captura fijada al sitio de
detección, o es un compuesto que se une de manera específica a un
conjugado que se une específicamente a la sustancia de captura en el
sitio de detección. Por ejemplo, el analito es un anticuerpo cuando
la sustancia de captura es un antígeno o cuando el conjugado
contiene un antígeno, y el analito es un antígeno cuando la
sustancia de captura es un anticuerpo o cuando el conjugado contiene
un anticuerpo. A manera de ejemplo adicional, el analito puede ser
un ácido nucleico que se une a un conjugado complementario y a la
sustancia de captura.
Cuando el sitio de aplicación de la muestra está
situado en una posición corriente arriba respecto a una sustancia
marcada, la sustancia marcada puede estar dispuesta adyacente al
sitio de aplicación de la muestra o en una posición desconectada del
sitio de aplicación de la muestra.
La adición de la sustancia marcada puede ser
realizada por varios medios, por ejemplo añadiéndola a una cierta
posición fuera del sitio de detección de la tira cromatográfica
después de la adición de la solución de la muestra.
Como la sustancia marcada está dispuesta de tal
manera que se mueve por la acción capilar de la solución de la
muestra, la sustancia marcada se mueve en dirección corriente abajo
cuando la solución de muestra es añadida al medio de adición de la
muestra.
El sitio de detección está situado generalmente
en una posición corriente abajo de la sustancia marcada y a cierta
distancia de la sustancia marcada. En el sitio de detección, una
sustancia de captura que se une solamente a un analito o a un
conjugado de manera específica, o que se une específicamente a cada
una de las sustancias que van a ser analizadas y a la sustancia
marcada, está fijada al vehículo cromatográfico. Por consiguiente,
en una realización el analito (algunas veces unido a una sustancia
marcada), movido por la acción capilar de la solución de la muestra,
se une a la sustancia de captura o a un conjugado que a su vez se
une a la sustancia de captura. La sustancia marcada se une a la
sustancia a analizar así unida, produciendo de este modo la
acumulación de la sustancia marcada en el medio de detección en
respuesta a la presencia o cantidad del analito. Alternativamente,
la sustancia marcada y el analito, movidos por acción capilar, se
unen competitivamente a la sustancia de captura o a un conjugado que
a su vez se une a la sustancia de captura, produciéndose de este
modo la acumulación de la sustancia marcada en proporción inversa a
la cantidad de la sustancia a analizar.
Existe un caso en el que una cierta sustancia
marcada se une a una sustancia de captura (o a un conjugado que se
une a su vez a una sustancia de captura) y a un analito, pero no
simultáneamente y, en ese caso, el analito se une primeramente a la
sustancia marcada y la sustancia marcada restante que no se había
unido a la sustancia a analizar se une a la sustancia de captura. En
consecuencia, puede analizarse la presencia o la cantidad del
analito midiendo la sustancia marcada acumulada en el medio de
detección.
Eventualmente, varias sustancias son colocadas
corriente arriba del sitio de detección. Por ejemplo, un conjugado
puede ser así colocado de manera movible.
En algunos casos, uno o más sitios de detección
adicionales pueden ser dispuestos corriente abajo del primer sitio
de detección. Además, corriente abajo del sitio de detección puede
haber una extensión adicional del vehículo cromatográfico de tal
manera que una solución de muestra pueda ser descargada
completamente, o el vehículo puede estar equipado con un material
para ser utilizado en la absorción de la solución de la muestra.
Por tanto, puede determinarse la presencia o la
cantidad de un analito de interés en una solución de muestra
midiendo la presencia o la cantidad de una sustancia marcada
acumulada en el sitio de detección. En un caso, esto puede
realizarse visualmente.
La presente invención está destinada a ser
utilizada con cualquier muestra de sangre, incluyendo suero y
plasma, pero se utiliza preferiblemente con una muestra de sangre
que contenga glóbulos rojos sanguíneos, por ejemplo, sangre
completa.
Antes del ensayo para determinar el analito de
interés en la muestra de sangre, los glóbulos rojos sanguíneos son
extraídos preferiblemente si el ensayo ha de trabajar con la
sensibilidad deseada. Por tanto, de acuerdo con la presente
invención, un agente separador de glóbulos rojos sanguíneos es unido
al vehículo cromatográfico. El agente separador de los glóbulos
rojos sanguíneos es unido difusivamente al vehículo cromatográfico.
El agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos puede ser unido
al vehículo cromatográfico en cualquier posición que funcione para
separar los glóbulos rojos sanguíneos del plasma o del suero. Es
unido difusivamente al vehículo cromatográfico corriente arriba del
sitio de detección. Muy preferiblemente, el agente separador de los
glóbulos rojos sanguíneos es unido difusivamente al sitio de
aplicación de la muestra. Esta localización es preferible porque
produce la agregación de los glóbulos rojos sanguíneos tan pronto
como son aplicados al vehículo cromatográfico, teniendo como
resultado una interferencia mínima, si es que la hay, en el flujo
del suero o del plasma a lo largo del vehículo por acción
capilar.
Los agentes separadores de glóbulos rojos
sanguíneos de la presente invención son materiales cargados
positivamente tales como policationes, incluyendo por ejemplo,
bromhidrato de poli-L-lisina;
cloruro de poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100,
Merquat®-280, Merquat®-550); clorhidrato de
poli-L-arginina;
poli-L-histidina;
poli(4-vinilpiridina), clorhidrato de
poli(4-vinilpiridina);
poli(4-vinilpiridina)reticulada, sal
cuaternaria cloruro de metilo;
poli(4-vinilpiridina-co-estireno);
poli(4-vinilpiridinio poli(fluoruro
de hidrógeno));
poli(4-vinilpiridinio-P-tolueno
sulfonato);
poli(4-vinilpiridinio-tribromuro);
poli(4-vinilpirrolidona-co-2-dimetilaminoetil
metacrilato); poli vinilpirrolidona, reticulada; poli
vinilpirrolidona,
poli(melamina-co-formaldehído);
parcialmente metilado; bromuro de hexadimetrina; bromhidrato de
poli(Glu, Lys) 1:4; bromhidrato de poli(Lys, Ala) 3:1;
bromhidrato de poli(Lys, Ala) 2:1;
poli-L-lisina succinilada;
bromhidrato de poli(Lys, Ala) 1:1 y bromhidrato de
poli(Lys, Trp) 1:4. El policatión más preferido es cloruro de
poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100).
El agente separador de glóbulos rojos sanguíneos
de la presente invención puede ser utilizado en cualquier cantidad
adecuada que funcione para separar los glóbulos rojos sanguíneos del
resto de la muestra. Preferiblemente, el agente separador de
glóbulos rojos sanguíneos puede estar presente en una concentración
desde el 0,04% aproximadamente hasta el 1,3% aproximadamente (peso
por volumen), siendo más preferida una concentración desde el 0,13%
aproximadamente hasta el 0,33% aproximadamente (peso por volumen), y
siendo una concentración desde el 0,20% aproximadamente hasta el
0,33% aproximadamente (peso por volumen) la más preferida.
Una carga positiva en el agente separador de
glóbulos rojos sanguíneos tiene tendencia a agregar cualquier agente
cargado negativamente presente en la tira. Por ejemplo, una
sustancia o conjugado marcados unidos al vehículo cromatográfico
pueden ser también agregados por el agente separador de los glóbulos
rojos sanguíneos interfiriendo con la unión del analito al conjugado
o, en un ensayo competitivo, con la unión de la sustancia marcada y
del analito de interés a la sustancia de captura en el sitio de
detección o a un conjugado. Finalmente, la sensibilidad y la
precisión del sistema de inmunoensayo pueden estar
comprometidas.
Por consiguiente, como el agente separador de
glóbulos rojos sanguíneos es un material cargado positivamente, la
presente invención emplea un agente neutralizante. El agente
neutralizante es capaz de neutralizar la carga positiva del agente
separador de glóbulos rojos sanguíneos, eliminando de este modo, o
al menos minimizando, cualquier interferencia con el sistema de
ensayo causada por el agente separador de los glóbulos rojos
sanguíneos. El agente neutralizante es unido difusivamente al
vehículo cromatográfico. El agente neutralizante es colocado
corriente abajo del agente separador de los glóbulos rojos
sanguíneos y corriente arriba del sitio de detección, y es colocado
más preferiblemente en el mismo lugar sobre el vehículo
cromatográfico que la sustancia marcada unida difusivamente.
El agente neutralizante es un polianión capaz de
neutralizar la carga positiva del agente separador de los glóbulos
rojos sanguíneos. Los polianiones preferidos incluyen poli(ácido
acrílico), poli(ácido acrílico, sal de Na), poli(ácido metil
metacrílico),
poli(Na-4-estireno
sulfonato), poli(ácido vinil sulfónico), ácido
poli-L-aspártico y carboximetil
celulosa, siendo el más preferido dextrán sulfato.
El agente neutralizante puede estar presente en
cualquier cantidad que funcione para neutralizar la carga positiva
del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos. Generalmente,
la concentración del agente neutralizante depende de la
concentración del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos
que esté siendo utilizado. Preferiblemente, el agente neutralizante
está presente en una concentración desde el 0,33% aproximadamente
hasta el 20% aproximadamente (peso por volumen), siendo más
preferida una concentración desde el 0,34% aproximadamente hasta el
10% aproximadamente (peso por volumen) y siendo una concentración
desde el 0,34% hasta el 10% (peso por volumen) la más preferida.
La Figura 1 representa una realización de un
dispositivo de ensayo inmunocromatográfico de acuerdo con la
presente invención. El dispositivo 10 contiene un vehículo
cromatográfico 20. Situado en el vehículo cromatográfico 20 está un
sitio de aplicación 30 para la muestra de sangre. En esta
realización preferida, el agente separador de los glóbulos rojos
sanguíneos, esto es Merquat®-100, está situado en el sitio de
aplicación 30. Adyacente al sitio de aplicación 30 hay una
almohadilla de conjugado 40 que contiene el conjugado, esto es una
sustancia de unión marcada con selenio, y un agente neutralizante,
esto es dextrán sulfato. Más corriente abajo está el sitio de
detección 50, el cual después de que se haya realizado el ensayo
presentará un barra de control 60 y, si la sustancia a analizar está
presente, una barra de ensayo 70.
En otra realización de la presente invención, un
tampón puede ser puesto en contacto con el sitio de aplicación,
preferiblemente después de que el sitio de aplicación haya sido
puesto en contacto con la muestra. El tampón ayuda a mantener una
velocidad de flujo del fluido aceptable a lo largo de la vía de
flujo en el vehículo cromatográfico. El tampón puede ser cualquier
sustancia que sea capaz de fluir por acción capilar a lo largo de la
vía de flujo del fluido incluyendo, pero no limitándose a, tampón
fosfato, solución salina tamponada con fosfato, tampón
Tris-HCl, tampón carbonato, tampón citrato, tampón
HEPES (ácido
2-hidroxipiperazina-N'-2-
etanosulfónico), tampón MOPS (ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico), tampón MES
(ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) y
similares. Aunque la concentración y el pH pueden ser cualquier
concentración y cualquier pH que funcionen en el dispositivo de
ensayo deseado, preferiblemente la molaridad está en un rango desde
10 mM aproximadamente hasta 100 mM aproximadamente y el pH es de
5-9 aproximadamente y más preferiblemente de
6-8 aproximadamente. Muy preferiblemente, el tampón
empleado es tampón fosfato 50 mM, pH 7,4.
El volumen de fluido empleado en la presente
invención depende del tamaño del dispositivo. Deseablemente, se
utiliza un volumen de fluido suficiente para permitir el flujo de
fluido a través del dispositivo hasta el sitio de detección.
Preferiblemente, el volumen de fluido está en un rango de 25 \mul
aproximadamente hasta 100 \mul aproximadamente, y más
preferiblemente desde 40 \mul aproximadamente hasta 60 \mul
aproximadamente. Por consiguiente, el tampón, cuando es necesario,
puede ser añadido en un rango de volumen desde 10 \mul
aproximadamente hasta 40 \mul aproximadamente, y más
preferiblemente desde 20 \mul aproximadamente hasta 30 \mul
aproximadamente.
La presente invención está dirigida también a un
método para detectar la presencia de un analito en una muestra de
sangre según está definido en las reivindicaciones
10-14.
Así, en la realización preferida de la Figura 1,
una muestra de sangre es aplicada en el sitio de aplicación 30 y el
agente separador de glóbulos rojos sanguíneos separa los glóbulos
rojos sanguíneos agregando los mismos y permitiendo que el plasma o
el suero desciendan por acción capilar por el vehículo
cromatográfico 20. El agente neutralizante de la almohadilla de
conjugado 40 neutraliza los efectos del agente separador de glóbulos
rojos sanguíneos en el dispositivo 10 y en el conjugado y el analito
se une al conjugado presente en la almohadilla de conjugado 40. El
analito unido al conjugado continúa descendiendo hacia el sitio de
detección 50. Si el analito de interés está presente aparecerá la
barra de ensayo 70. Para indicar que el análisis está funcionando
correctamente, aparecerá la barra de control 60 esté presente o no
el analito de interés.
La presente invención puede incluir
preferiblemente una tapa o cubierta no reactiva alrededor del
dispositivo. Preferiblemente, la cubierta incluye al menos el
vehículo cromatográfico para evitar el contacto con, y la
contaminación de, los sitios de captura. La cubierta puede incluir
también un área levantada adyacente al sitio de aplicación para
facilitar la recepción y/o la inclusión de un cierto volumen de
muestra. Adicionalmente, la cubierta puede incluir un área o áreas
para recortar en forma de una letra, número, icono o símbolo, o
cualquier combinación de los mismos. En esta realización, el área o
áreas para recortar forman el diseño de sitio(s) de detección
particular(es) cuando la tira está completamente cerrada. Se
prefiere que una porción suficiente de la tira esté cubierta para
impedir que la muestra aplicada entre en contacto con los sitios de
detección sin pasar primero a través de una porción de la tira.
El dispositivo y el método de la presente
invención pueden ser utilizados en cualquier sistema de ensayo en el
que una muestra de sangre contenga un analito de interés. Ejemplos
de sistemas preferidos incluyen, pero no se limitan a, virus de la
hepatitis C ("VHC"), virus de la hepatitis A ("VHA"),
Virus de la Inmunodeficiencia Humana ("VIH"), anticuerpo de
superficie de la hepatitis B ("HBsAb"), antígeno de superficie
de la hepatitis B ("HBsAg"), anticuerpo del núcleo central de
la hepatitis B ("HBcAb"), antígeno del núcleo central de la
hepatitis B ("HBcAg"), antígeno carcinoembrionario
("CEA"), alfa-fetoproteína ("AFP"), un
marcador de cáncer de páncreas ("CA19-9"),
sífilis, tuberculosis, malaria, Leishmania y fiebre de Dengue.
Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente
la presente invención.
Para los fines de la presente invención, se desea
la agregación de los glóbulos rojos sanguíneos (rbcs) en sangre
completa mientras que no se desea la agregación del conjugado de
selenio. Se analizaron varios policationes para ver cual produciría
una agregación suficiente de los rbcs mientras que agregara sólo
mínimamente el conjugado de selenio.
El conjugado de selenio de la proteína
recombinante del VIH-1 fue preparado de la manera
siguiente: Primeramente se preparó selenio coloidal haciendo
reaccionar óxido de selenio 32 mM con ácido
L-ascórbico 91 mM en una solución acuosa durante 72
horas a 42ºC. Este coloide de selenio fue diluido hasta una densidad
óptica de 30 a una longitud de onda de 550 nm y se hizo reaccionar
posteriormente con 40 \mug/ml de proteína de la envoltura del
VIH-1 recombinante en tampón Tris 30 mM, pH 7,4,
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Este conjugado de
proteína del VIH-1 marcada con el coloide de selenio
fue diluido a continuación hasta una densidad óptica de 30 a una
longitud de onda de 550 nm en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, que
contenía un 0,1% de caseína e incubado durante 20 minutos a
temperatura ambiente. La solución de conjugado fue luego
centrifugada a 1970 x g durante 20 minutos a 4ºC, se retiró el
sobrenadante y se desechó la pella. Posteriormente se añadió al
sobrenadante un volumen de tampón Tris 30 mM, pH 7,4, conteniendo un
2% de caseína, equivalente a un décimo del volumen del sobrenadante.
Finalmente, esta solución de conjugado fue diluida hasta una
densidad óptica de 10 a una longitud de onda de 550 nm en tampón
Tris 50 mM, pH 7,4, conteniendo un 1% de caseína, un 2% de sacarosa
y un 2% de lactosa.
Se prepararon soluciones acuosas de los
policationes siguientes a un 0,25% (p/v): bromhidrato de
poli-L-lisina, peso molecular (PM)
37000; clorhidrato de
poli-L-arginina, PM 12100, 42400 y
92000; poli-L-histidina, PM 18400;
bromuro de hexadimetrina, bromhidrato de poli(Lisina,
Alanina) 3:1, PM 35000; bromhidrato de poli(Lisina, Alanina)
2:1, PM 49300; bromhidrato de poli(Lisina, Alanina), 1:1, PM
41600; bromhidrato de poli(Lisina, Triptófano) 1:4, PM 38000
(todos los policationes anteriores fueron adquiridos a Sigma, St.
Louis, MO); poli(cloruro de dialildimetilamonio), PM 10^{5}
a 10^{6} (Merquat®-100, Calgon, Pittsburgh, PA).
La capacidad de estos policationes para agregar
los rbcs en sangre completa o el conjugado de selenio fue observada
en reacciones separadas añadiendo 350 \mul de las diferentes
soluciones de policationes al 0,25% a un volumen igual de sangre
completa o del conjugado de selenio. Las soluciones fueron mezcladas
y almacenadas a temperatura ambiente durante 10 minutos,
posteriormente la agregación fue evaluada visualmente. Los
resultados están resumidos en la Tabla 1. Un signo más (+) indica
agregación débil, 2+ indica agregación moderada y 3+ y 4+ indican
agregación potente.
| Agregación | |||
| Policatión | Peso molecular | Glóbulos rojos sanguíneos | Conjugado de Se |
| Poli-L-Lys HBr | 37000 | 2+ | 2+ |
| Merquat®-100 | 10^{5} a 10^{6} | 2+ | 2+ |
| Poli-L-Arg HCl | 12100 | 2+ | 2+ |
| Poli-L-Arg HCl | 42400 | 2+ | 2+ |
| Poli-L-Arg HCl | 92000 | 2+ | 2+ |
| Poli-L-His | 18400 | + | 4+ |
| Hexadimetrina Br | + | + | |
| Poli (Lys, Ala) 3:1 HBr | 35000 | 2+ | 2+ |
| Poli (Lys, Ala) 2:1 HBr | 49300 | + | 2+ |
| Poli (Lys, Ala) 1:1 HBr | 41600 | + | 2+ |
| Poli (Lys, Trp) 1:4 HBr | 38000 | 3+ | 3+ |
Un policatión que produzca agregación de los rbcs
(2+ o mayor) mientras que produce una agregación mínima del
conjugado de selenio (2+ o menor) sería una buena elección. Aquellos
policationes con un 2+ en ambas categorías cumplen este criterio. Se
eligieron poli-L-lisina HBr y
Merquat®-100 para los trabajos posteriores, siendo Merquat®-100 el
más rentable.
Utilizando
poli-L-lisina como reactivo
agregante de rbc policatiónico, se analizaron varias concentraciones
del polianión dextrán sulfato para ver si la carga positiva del
policatión podía ser neutralizada por el dextrán sulfato, impidiendo
así la agregación del conjugado de selenio causada por el
policatión. El dextrán sulfato fue añadido después de que el
policatión hubiera producido ya la agregación de los rbcs, pero
antes de la interacción del policatión con el conjugado de selenio.
El experimento siguiente evaluó el efecto del policatión y del
dextrán sulfato sobre la agregación del conjugado de selenio y su
capacidad posterior para fluir a la largo de la tira
inmunocromatográfica.
Se montó una tira inmunocromatográfica compuesta
por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de Neutralización,
una Almohadilla de Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla
de Muestra fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de
4 mm de ancho por 20 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester,
NH) en una solución acuosa de bromhidrato de
poli-L-lisina al 0,33%, PM 37000
(Sigma, St. Louis, MO), y secándolo posteriormente bajo vacío.
Las Almohadillas de Neutralización, que contenían
diferentes concentraciones de dextrán sulfato, fueron preparadas
impregnando filtros de 4 mm de ancho por 13 mm de largo compuestos
de pulpa de madera y poliéster (Sontara 8801, Du Pont, Wilmington,
Delaware) en soluciones acuosas que contenían un 0%, un 1,1%, un
3,3% o un 10% de dextrán sulfato, PM 5000 (Sigma, St. Louis, MO).
Después de ser impregnadas, las almohadillas fueron secadas bajo
vacío.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada
impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm
de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) en un conjugado de
proteína recombinante del VIH-1 marcada con coloide
de selenio preparado y diluido como en el Ejemplo 1. Después de ser
impregnada, la Almohadilla de Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo (# de catálogo
H9643G1, Millipore, Bedford, MA). El antígeno de la envoltura del
VIH-1 a una concentración de 5 mg/ml en tampón Tris
100 mM, pH 7,4, que contenía un 1% de sacarosa, fue añadido a la
membrana de nitrocelulosa con el fin de formar una línea a través de
la anchura de la tira en una posición a 1 cm aproximadamente del
extremo de la membrana. La región con la línea fue reforzada con una
Lámina de Poliéster (# de código 7733, Adhesives Research Inc., Glen
Rock, PA). Ésta se dejó secar suficientemente para fijar el antígeno
a la nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas, de 4 mm de
ancho, fueron montadas utilizando los componentes anteriores,
colocándolos uno tras otro longitudinalmente con un solapamiento de
1 mm entre cada sección, con la Almohadilla de Muestra de 20 mm de
largo en un extremo, a continuación de la cual estaba colocada una
de las Almohadillas de Neutralización de 13 mm de largo, seguida por
una Almohadilla de Conjugado de 4,3 mm de largo, y finalmente una
Tira de Detección de 40 mm de largo. La tira montada fue cubierta
posteriormente con una Lámina de Poliéster (# de código 8648,
Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA) desde el extremo superior de
la Tira de Detección hasta una distancia de 10 mm del extremo
inferior de la tira, dejando 10 mm aproximadamente de la Almohadilla
de Muestra expuestos. Se aplicaron posteriormente 80 \mul de
plasma a las Almohadillas de Muestra de cada una de las tiras
inmunocromatográficas que contenían Almohadillas de Neutralización
con un 0%, 1,1%, 3,3% ó 10% de dextrán sulfato. La agregación del
conjugado de selenio rojo y la capacidad del conjugado para fluir a
lo largo de la tira fueron observadas visualmente.
Los resultados, mostrados en la Tabla 2
siguiente, indicaban que, sin la presencia de dextrán sulfato para
neutralizar la carga de la solución del policatión, el conjugado de
selenio se agregaba y no era capaz de fluir a lo largo de la tira.
Había una relación inversa entre la agregación del conjugado y el
flujo, siendo suficientes concentraciones de dextrán sulfato del
3,3% o mayores para prevenir la agregación del conjugado y permitir
que el conjugado fluyera a lo largo de la tira.
| Concentración de dextrán sulfato | Agregación del conjugado | Flujo del conjugado |
| 0% | ++ | - |
| 1,1% | + | +/- |
| 3,3% | - | + |
| 10% | - | + |
Con el fin de determinar el efecto del dextrán
sulfato sobre la agregación de rbc, se repitió el experimento
anterior utilizando sangre completa como muestra con un 10% de
dextrán sulfato en una Almohadilla de Neutralización de 4,3 mm de
largo por 4 mm de ancho. Después de ensamblar la tira
inmunocromatográfica igual que anteriormente, utilizando esta
Almohadilla de Neutralización, se aplicaron 80 \mul de sangre
completa a la Almohadilla de Muestra. Quince minutos más tarde, el
resultado de la agregación de rbc fue observado visualmente y se
midió la capacidad del plasma resultante para fluir a lo largo de la
tira. Los rbc se agregaban, siendo retenidos en la Almohadilla de
Muestra, y no fluían sobre la tira, mientras que el plasma fluyó 33
mm a lo largo de la tira en 15 minutos. Esto indicaba que el
policatión de la Almohadilla de Muestra era todavía capaz de
producir la agregación de los rbcs en la muestra de sangre completa,
y que la presencia del polianión, dextrán sulfato, en la Almohadilla
de Neutralización no interfería con esta agregación de rbc.
Se analizaron otros polianiones con el fin de
evaluar su capacidad para prevenir la agregación del conjugado de
selenio igual que en el Ejemplo 2.A. Una Almohadilla de Muestra de
15,5 mm de largo por 4 mm de ancho fue impregnada en una solución
acuosa que contenía un 0,26% de Merquat®-100 y posteriormente fue
secada a 55ºC. No se utilizaron Almohadillas de Neutralización y en
su lugar el conjugado de selenio fue diluido en tampón Tris 10 mM,
pH 7,4, que contenía caseína 1%, sacarosa 2%, lactosa 2% y un 0%, un
1,1% o un 3,3% del polianión dextrán sulfato, PM 5000 (Sigma, St.
Louis, MO) o un 0%, un 0,5%, un 1% o un 2% de uno de los polianiones
siguientes (todos de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI): Poli
(ácido acrílico), PM 5000; Poli (sulfonato de
sodio-4-estireno), PM 70.000; Poli
(ácido vinil sulfónico, sal de sodio); Poli (ácido metil
metacrílico), PM 9500; Poli (ácido acrílico, sal de sodio), PM 2100.
Las Almohadillas de Conjugado fueron impregnadas en las diferentes
soluciones de conjugado de selenio y secadas bajo vacío. La Tira de
Detección fue preparada igual que en el Ejemplo 2.A. y se
ensamblaron las tiras inmunocromatográficas. Se aplicaron
posteriormente 50 \mul de plasma a las Almohadillas de Muestra de
cada una de las tiras inmunocromatográficas que contenían las
Almohadillas de Conjugado con los diferentes polianiones. La
agregación del conjugado de selenio rojo fue observada visualmente.
La Tabla 3 muestra la cantidad relativa de agregación de conjugado
observada con las diferentes concentraciones de polianiones
analizadas.
| Agregación del conjugado de selenio | |||||
| Concentración de polianión | |||||
| Polianión | 0% | 0,5% | 1-1,1% | 2% | 3,3% |
| Dextrán Sulfato | ++ | na | + | na | - |
| Poli(ácido acrílico) | ++ | - | - | - | na |
| Poli(sulfonato de Na- 4-estireno) | ++ | ++ | ++ | + | na |
| Poli(ácido vinil sulfónico) | ++ | +/- | - | - | na |
| Poli(ácido metil metacrílico) | ++ | - | - | - | na |
| Poli(ácido acrílico sal de Na), | ++ | + | +/- | - | na |
| na = no analizado |
Igual que anteriormente, el conjugado de selenio
se agregaba si no había un polianión presente para neutralizar la
carga positiva del policatión de la Almohadilla de Muestra (que es
necesario para la agregación de los rbc cuando se analiza sangre
completa). Todos los polianiones utilizados en la Almohadilla de
Conjugación impidieron que tuviera lugar la agregación del conjugado
a al menos una de las concentraciones analizadas. Este experimento
mostró también que el polianión no tenía que ser aplicado en una
almohadilla separada, sino que podía ser combinado con el conjugado
de selenio en la Almohadilla de Conjugación.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía igual
que en el Ejemplo 2.A. con o sin una Almohadilla de Neutralización
de filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo
(Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH). Cuando se utilizó, la
Almohadilla de Neutralización fue impregnada en una solución acuosa
que contenía un 3,3% de dextrán sulfato, y posteriormente fue secada
bajo vacío. En las tiras sin Almohadilla de Neutralización, el
conjugado de selenio fue diluido en tampón Tris 10 mM, pH 7,4 que
contenía caseína 1%, sacarosa 2%, lactosa 2% y dextrán sulfato 3,3%,
y la Almohadilla de Conjugado fue impregnada en esta solución y
luego secada bajo vacío. La Almohadilla de Muestra utilizada fue
como la del Ejemplo 2.A., excepto en que fue impregnada en una
solución acuosa de Merquat®-100 al 0,2%.
Suero humano que contenía anticuerpos hacia el
VIH-1 fue diluido 1:2048 en sangre completa humana
negativa para VIH (sobre la base del volumen plasmático) con un
valor de hematocrito del 50% o bien fue diluido en plasma humano
negativo para VIH. Se realizaron tres diluciones seriadas 1:2
adicionales, utilizando de nuevo como diluyente sangre completa o
plasma. Se añadieron 80 \mul de sangre completa negativa o de las
muestras de la serie de diluciones con sangre completa positivas
para VIH-1 a la Almohadilla de Muestra de tiras
inmunocromatográficas preparadas con dextrán sulfato en una
Almohadilla de Neutralización separada o con dextrán sulfato en la
solución del conjugado de selenio en la Almohadilla de Conjugado. Se
analizaron 80 \mul de plasma negativo o de muestras de la serie de
diluciones en plasma positivas para VIH-1 solamente
en tiras inmunocromatográficas con dextrán sulfato en la Almohadilla
de Conjugado. Los resultados fueron leídos 15 minutos después de la
aplicación de las muestras (Tabla 4). Un resultado positivo mostraba
un color rojo en la Tira de Detección cuando el complejo anticuerpo
hacia el VIH-1-conjugado del
antígeno del VIH-1 con selenio rojo se unía al
antígeno del VIH-1 en la región de la línea de la
tira. Un resultado negativo no presentaba color en esta región de la
Tira de Detección.
| Dextrán sulfato en la almohadilla | Dextrán sulfato en la almohadilla | ||
| de neutralización | de conjugado | ||
| Dilución de | Sangre completa | Sangre completa | Plasma |
| la muestra | |||
| 1:2048 | + | + | + |
| 1:4096 | + | + | + |
| 1:8192 | - | + | + |
| 1:16384 | na | - | - |
| Control | - | - | - |
| Negativo | |||
| na = no analizado |
Los resultados de la Tabla 4 indican que son
detectables anticuerpos hacia el VIH-1 de sangre
completa en un ensayo con una tira inmunocromatográfica utilizando
el policatión Merquat®-100 para agregar los rbcs y permitir que la
muestra fluya a lo largo de la tira, y el polianión dextrán sulfato
como agente neutralizante, impidiendo la agregación del conjugado de
selenio por el policatión y permitiendo que el conjugado se una y
forme un complejo con una muestra positiva y fluya a lo largo de la
tira hacia el área de detección. Se demostró que el polianión era
eficaz cuando se utilizaba en una Almohadilla de Neutralización
separada o combinado con el conjugado de selenio en la Almohadilla
de Conjugado. En este ensayo, la sensibilidad para detectar
anticuerpos hacia el VIH-1 mostró una mejora de 2
veces cuando se utilizó el polianión (dextrán sulfato) en la
Almohadilla de Conjugado en lugar de en una Almohadilla de
Neutralización separada.
Adicionalmente, los resultados de la Tabla 4
indican que el policatión está agregando eficazmente los rbcs en la
sangre completa según se muestra por la misma sensibilidad de
detección de los anticuerpos hacia el VIH-1 en
sangre completa, en la que los rbcs deben ser agregados para que
fluya la muestra, o en plasma, en el que no hay rbcs que impidan el
flujo de la muestra. Esto muestra también que la presencia del
polianión, en una Almohadilla de Neutralización separada o en la
Almohadilla de Conjugado, no interfiere con la capacidad de
policatión para producir eficazmente la agregación de los rbcs en
sangre completa.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para
la detección del antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) en
muestras de sangre completa. Se utilizó Merquat®-100 como policatión
para la agregación de los rbcs en la Almohadilla de Muestra, y se
evaluaron varios polianiones en la Almohadilla de Conjugado como
reactivos neutralizantes del policatión para impedir la agregación
del conjugado de selenio.
Se montaron tiras de inmunocromatografía
compuestas por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de
Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue
preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho
por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de Merquat®-100 al
0,26%, secándolo posteriormente a 55ºC.
El conjugado de selenio fue preparado utilizando
un coloide de selenio, igual que en el Ejemplo 1, y 12 \mug/ml de
anticuerpo monoclonal de ratón hacia HBsAg
(anti-HBs). Este conjugado de
anti-HBs marcado con el coloide de selenio fue
diluido posteriormente hasta una densidad óptica de 2,6 a una
longitud de onda de 550 nm en tampón Tris que contenía uno de los
polianiones siguientes: Poli (ácido acrílico), PM 2000
(PAA-2000) 0,5%; Poli (ácido acrílico), PM 240.000
(PAA-240.000) 0,5%; dextrán sulfato, PM 5000 0,5%;
ácido Poli-L-aspártico, PM 36.300
0,8%; Carboximetil celulosa, PM 90.000 (CMC) 0,5%. El dextrán
sulfato y el ácido Poli-L-aspártico
eran de Sigma, St. Louis, MO, y los restantes polianiones eran de
Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada
impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm
de largo en un conjugado de anti-HBs marcado con el
coloide de selenio preparado y diluido con uno de los polianiones
anteriores. Después de la impregnación, la Almohadilla de Conjugado
fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado igual
que en el Ejemplo 2, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-HBs a una concentración de 3 mg/ml y añadido a
la membrana de nitrocelulosa de manera que formara una línea a
través de la anchura de la tira en una posición a 1 cm
aproximadamente del extremo de la membrana. La región de la línea
fue reforzada con Lámina de Poliéster. Ésta se dejó secar
suficientemente para que se fijara el anticuerpo a la
nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas fueron montadas
utilizando los componentes anteriores, colocando los mismos uno tras
otro longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm, con la
Almohadilla de Muestra en un extremo, a continuación de la cual
estaba colocada la Almohadilla de Conjugado y finalmente la Tira de
Detección. La tira montada fue cubierta posteriormente con una
Lámina de Poliéster, dejando expuestos 10 mm aproximadamente de la
Almohadilla de Muestra.
Se añadió HBsAg recombinante a sangre completa
humana negativa para HBsAg con un valor de hematocrito del 50% a una
concentración de 12,5 ng/ml. Se realizaron tres diluciones seriadas
1:2 adicionales en sangre completa. Se añadieron 50 \mul de sangre
completa negativa o de muestras de la serie de diluciones en sangre
completa positivas para HBsAg a la Almohadilla de Muestra de tiras
inmunocromatográficas preparadas con varios polianiones en la
Almohadilla de Conjugado. Los resultados fueron leídos 15 minutos
después de la aplicación de las muestras (Tabla 5). Un resultado
positivo mostraba un color rojo en la Tira de Detección donde el
complejo de HBsAg-conjugado de
anti-HBs con selenio rojo se unía a los
anti-HBs en la región de la línea de la tira. Un
resultado negativo no presentaba color en esta región de la Tira de
Detección. La agregación del conjugado de selenio rojo en la entrada
de la Tira de Detección se observó visualmente.
| Concentración de HBsAg | ||||||
| (ng/ml) | ||||||
| Polianión | 12,5 | 6,25 | 3,13 | 1,56 | 0 | Agregación |
| del | ||||||
| conjugado | ||||||
| PAA-2000 | + | + | + | - | - | - |
| PAA-240.000 | + | + | - | - | - | + |
| Dextrán | + | + | + | - | - | - |
| sulfato | ||||||
| Poli-L-Asp | + | + | + | - | - | - |
| CMC | + | - | - | - | - | + |
Aunque todos los polianiones permitieron que
tuviera lugar la detección de HBsAg, aquellos polianiones que
impidieron la agregación del conjugado, PAA-2000,
dextrán sulfato y ácido
Poli-L-aspártico, mostraban una
detección de HBsAg en muestras de sangre completa de 2 a 4 veces más
sensible.
El experimento anterior fue repetido utilizando
el conjugado marcado con coloide de selenio diluido en tampón Tris
que contenía PAA-2000 como polianión, excepto en que
se añadieron 25 \mul de tampón fosfato 50 mM, pH 7,4, a la
Almohadilla de Muestra un minuto después de la adición de las
muestras de sangre completa con HBsAg. Los resultados obtenidos
utilizando este procedimiento, con la adición del tampón después de
la aplicación de la muestra, fueron idénticos a los resultados sin
esta etapa. Por tanto, estos ensayos pueden ser realizados con o sin
la adición de tampón después de la aplicación de la muestra.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para
la detección de anticuerpos hacia Mycobacterium tuberculosis
(anti-Mtb) en muestras de sangre completa. Se
utilizó Merquat®-100 como policatión para la agregación de los rbcs
en la Almohadilla de Muestra, y se evaluaron varias concentración
del polianión dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado como
reactivo neutralizante del policatión para prevenir la agregación
del conjugado de selenio.
Se montaron las tiras inmunocromatográficas
compuestas por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de
Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue
preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho
por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de Merquat®-100 al
0,26%, secándolo posteriormente bajo vacío.
El conjugado de selenio fue preparado utilizando
coloide de selenio, igual que en el Ejemplo 1, y 3,5 \mug/ml de
antígeno Mtb recombinante procedente de E. coli. Este
conjugado de Mtb marcado con el coloide de selenio fue diluido
posteriormente hasta una densidad óptica de 2,5 a una longitud de
onda de 550 nm en tampón Tris que contenía un 0%, un 0,34%, un 1,1%
o un 3,3% de dextrán sulfato.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada
impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm
de largo en el conjugado de Mtb marcado con el coloide de selenio,
preparado y diluido con una de las concentraciones anteriores de
dextrán sulfato. Después de la impregnación, la Almohadilla de
Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado igual
que en el Ejemplo 2, utilizando el antígeno Mtb recombinante a una
concentración de 0,15 mg/ml y añadido a la membrana de nitrocelulosa
de manera que formara una línea a través del ancho de la tira en una
posición a 1 cm aproximadamente del extremo de la membrana. La
región de la línea fue reforzada con una Lámina de Poliéster. Ésta
se dejó secar suficientemente para fijar el antígeno a la
nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas fueron
ensambladas utilizando los componentes anteriores, colocando los
mismos uno tras otro longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm,
con la Almohadilla de Muestra en un extremo, a continuación de la
cual estaba colocada la Almohadilla de Conjugado y finalmente la
Tira de Detección. La tira ensamblada fue cubierta posteriormente
con una Lámina de Poliéster, dejando expuestos 10 mm aproximadamente
de la Almohadilla de Muestra.
Se diluyó suero positivo para
anti-Mtb 1:100 en sangre humana completa negativa
con un valor de hematocrito del 50%. Se realizaron dos diluciones
seriadas 1:2 adicionales en sangre completa. Se añadieron 50 \mul
de sangre completa negativa o de las muestras de la serie de
diluciones en sangre completa positivas para
anti-Mtb a la Almohadilla de Muestra de las tiras
inmunocromatográficas preparadas con varias concentraciones de
dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado. Los resultados
fueron leídos 15 minutos después de la aplicación de las muestras
(Tabla 6). Un resultado positivo mostraba un color rojo en la Tira
de Detección donde el complejo
anti-Mtb-conjugado de Mtb con
selenio rojo se unía al Mtb en la región de la línea de la tira. Un
resultado negativo no presentaba color en esta región en la Tira de
Detección. La agregación del conjugado de selenio rojo en la entrada
de la Tira de Detección se observó visualmente.
| Dextrán | Dilución del anti-Mtb | ||||
| sulfato | |||||
| (%) | 1:100 | 1:200 | 1:400 | Control | Agregación |
| negativo | del conjugado | ||||
| 0 | - | - | - | - | ++ |
| 0,34 | - | - | - | - | ++ |
| 1,1 | + | - | - | - | + |
| 3,3 | + | + | - | - | - |
Los datos de la Tabla 6 muestran que el ensayo no
funciona sin la presencia de un polianión, en este caso dextrán
sulfato, para prevenir la agregación del conjugado. Hay una relación
inversa entre la agregación del conjugado y la sensibilidad del
ensayo. A una concentración de dextrán sulfato del 3,3% no tiene
lugar la agregación del conjugado y el ensayo presenta la detección
más sensible de anti-Mtb.
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para
la detección de anticuerpos hacia Treponema pallidum
(anti-TP) en muestras de sangre completa o de
plasma. Comparando la sensibilidad de detección en sangre completa
respecto a plasma, se podría determinar si los rbcs de la sangre
completa estaban siendo agregados eficazmente por el policatión para
no interferir con, y disminuir de este modo, la sensibilidad de
detección del ensayo. Se utilizó Merquat®-100 como policatión para
la agregación de los rbcs en la Almohadilla de Muestra, y se utilizó
el polianión dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado como
reactivo de neutralización del policatión para prevenir la
agregación del conjugado de selenio.
Se montaron tiras inmunocromatográficas
compuestas por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de
Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue
preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho
por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de Merquat®-100 al 0,2%,
secándolo luego a 55ºC.
El conjugado de selenio fue preparado utilizando
coloide de selenio, igual que en el Ejemplo 1, y 7,5 \mug/ml de
lisado de Treponema pallidum (TP). Este conjugado de TP
marcado con coloide de selenio fue diluido posteriormente hasta una
densidad óptica de 2,8 a una longitud de onda de 550 nm en tampón
Tris que contenía un 3,3% de dextrán sulfato.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada
impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm
de largo en el conjugado de TP marcado con el coloide de selenio
preparado anteriormente. Después de la impregnación, la Almohadilla
de Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de
nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado igual
que en el Ejemplo 2 utilizando un lisado de Treponema
pallidum a una concentración de 44 \mug/ml y añadido a la
membrana de nitrocelulosa de manera que formara una línea a través
de la anchura de la tira en una posición a 1 cm aproximadamente del
extremo de la membrana. La región de la línea fue reforzada con una
Lámina de Poliéster. Ésta se dejó secar suficientemente con el fin
de fijar el lisado de TP a la nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas fueron
ensambladas utilizando los componentes anteriores, colocando los
mismos uno tras otro longitudinalmente, con un solapamiento de 1 mm,
con la Almohadilla de Muestra en un extremo, a continuación de la
cual estaba colocada la Almohadilla de Conjugado y finalmente la
Tira de Detección. La tira montada fue cubierta posteriormente con
una Lámina de Poliéster, dejando expuestos 10 mm aproximadamente de
la Almohadilla de Muestra.
Suero humano positivo para
anti-TP fue diluido 1:10,8 en sangre humana completa
negativa con un valor de hematocrito del 50% o en plasma humano
negativo. Se realizaron cuatro diluciones seriadas 1:2 adicionales,
utilizando de nuevo como diluyente sangre completa o plasma. Se
añadieron a la Almohadilla de Muestra de las tiras
inmunocromatográficas 60 \mul de sangre completa o de plasma
negativos, o de las muestras de la serie de diluciones en sangre
completa o en plasma positivas para anti-TP. Los
resultados fueron leídos 15 minutos después de la aplicación de las
muestras (Tabla 7). Un resultado positivo presentaba un color rojo
en la Tira de Detección donde el complejo
anti-TP-conjugado de TP con selenio
rojo se unía al lisado de TP en la región de la línea de la tira. Un
resultado negativo no presentaba color en esta región de la Tira de
Detección.
La Tabla 7 muestra que la sensibilidad de
detección de anti-TP era la misma en sangre completa
y en plasma, indicando que el policatión Merquat®-100 agregaba
eficazmente los rbcs de la sangre completa.
| Dilución de la muestra | Sangre completa | Plasma |
| de anti-TP | ||
| 1:10,8 | + | + |
| 1:21,6 | + | + |
| 1:43,2 | + | + |
| 1:86,4 | + | + |
| 1:172,8 | - | - |
| Control negativo | - | - |
Claims (14)
1. Un dispositivo de ensayo cromatográfico para
detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre que
comprende:
un vehículo cromatográfico que define una vía
para el flujo de fluido y soporta el flujo capilar,
un sitio de aplicación de dicha muestra de sangre
en contacto por el flujo del fluido con dicho vehículo
cromatográfico,
un sitio de detección en dicho vehículo
cromatográfico separado de dicho sitio de aplicación que tiene unido
al mismo una sustancia de captura unida no difusivamente,
una sustancia marcada unida difusivamente situada
corriente abajo de dicho sitio de aplicación,
un policatión unido difusivamente para separar el
plasma o el suero de dicha muestra de sangre corriente arriba de
dicho sitio de detección y
un polianión unido difusivamente para neutralizar
el policatión corriente abajo de dicho policatión unido y corriente
arriba de dicho sitio de detección.
2. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, donde dicho dispositivo es un dispositivo para
inmunoensayo.
3. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicho policatión está unido a dicho
sitio de aplicación de dicha muestra de sangre.
4. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicho policatión es seleccionado del
grupo que consta de bromhidrato de
poli-L-lisina, clorhidrato de
poli-L-arginina,
poli-L-histidina, bromhidrato de
poli(lisina, alanina) 3:1, bromhidrato de poli(lisina,
alanina) 2:1, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 1:1,
bromhidrato de poli(lisina, triptófano) 1:4 y
poli(cloruro de dialildimetilamonio).
5. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicho policatión es poli(cloruro
de dialildimetilamonio).
6. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicho polianión es seleccionado del
grupo que consta de dextrán sulfato, poli(ácido acrílico),
poli(sulfonato de
sodio-4-estireno), poli(ácido vinil
sulfónico), poli(ácido metil metacrílico), ácido
poli-L-aspártico y carboximetil
celulosa.
7. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicho polianión es dextrán sulfato.
8. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicho polianión está unido difusivamente
al vehículo cromatográfico en el mismo lugar que dicha sustancia
marcada.
9. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la
reivindicación 1, en el que dicha sustancia marcada es una sustancia
marcada con selenio.
10. Un método para detectar la presencia de una
analito en una muestra de sangre que comprende las etapas de:
la provisión de un vehículo cromatográfico que
define una vía para el flujo de fluido y soporta el flujo capilar, a
lo largo del cual están (a) un sitio de aplicación de dicha muestra
de sangre en contacto por el flujo de fluido con dicho vehículo
cromatográfico, (b) un sitio de detección en dicho vehículo
cromatográfico separado de dicho sitio de aplicación que tiene unido
al mismo una sustancia de captura unida no difusivamente, (c) un
sustancia marcada situada corriente abajo de dicho sitio de
aplicación, (d) un policatión unido difusivamente para separar el
plasma o el suero de dicha muestra de sangre corriente arriba de
dicho sitio de detección y (e) un polianión unido difusivamente para
neutralizar el policatión situado corriente abajo de dicho
policatión unido y corriente arriba de dicho sitio de detección;
la puesta en contacto de dicho sitio de
aplicación con dicha muestra de sangre y
la detección de la presencia del analito en dicha
muestra de sangre.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
dicha sustancia marcada es una sustancia marcada con selenio.
12. El método de la reivindicación 10, en el que
dicho polianión está unido difusivamente al vehículo cromatográfico
en el mismo lugar que dicha sustancia marcada.
13. El método de la reivindicación 10, en el que
dicho policatión es seleccionado del grupo que consta de bromhidrato
de poli-L-lisina, clorhidrato de
poli-L-arginina,
poli-L-histidina, bromhidrato de
poli(lisina, alanina) 3:1, bromhidrato de poli(lisina,
alanina) 2:1, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 1:1,
bromhidrato de poli(lisina, triptófano) 1:4 y
poli(cloruro de dialildimetilamonio).
14. El método de la reivindicación 10, en el que
el polianión es seleccionado del grupo que consta de dextrán
sulfato, poli(ácido acrílico), poli(sulfonato de
sodio-4-estireno), poli(ácido vinil
sulfónico), poli(ácido metil metacrílico), ácido
poli-L-aspártico y carboximetil
celulosa.
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