DE69921594T2

DE69921594T2 - Methoden zur synthese von polynukleotiden durch ligation von multiplen oligomeren

Info

Publication number: DE69921594T2
Application number: DE69921594T
Authority: DE
Inventors: Hashem Akhavan-Tafti
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2019-07-23
Also published as: CA2304258A1; IL134729A; ES2233062T3; DK1017855T3; JP2002521036A; DE69921594D1; ATE281532T1; IL134729A0; CA2304258C; AU772995B2; EP1017855A1; WO2000005412A1; EP1017855B1; AU5205299A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Synthetisieren von Polynukleotiden. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zum Synthetisieren von Polynukleotiden durch Ligation einer Vielzahl oligomerer Einheiten an einem matrizengebundenen Primer. Die Vielzahl von Oligomeren kann so vorher ausgewählt werden, dass sie Oligomere enthält, die mit dem Matrizen-Strang komplementär sind oder die Oligomere können als Bibliothek bereitgestellt werden und die Selbstauswahl ermöglicht werden. Die Synthese durch Ligation kann unidirektional oder bidirektional vom Primer fortschreiten und kann dazu verwendet werden, beide Stränge simultan durch Verwendung zweier Primer zu synthetisieren. Die Amplifikation kann linear oder exponentiell durchgeführt werden und kann dazu verwendet werden, DNA und RNA zu kopieren. Die Verfahren der Erfindung sind bei einer Vielzahl von Anwendungen von Nutzen, einschließlich dem Klonieren, der Herstellung markierter Polynukleotide zur diagnostischen Anwendung, der Mutationsanalyse und dem Screening, der Genexpression-Überwachung bzw. Monitoring und der Sequenzanalyse.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die enzymatische Ligation von Oligonukleotid-Paaren, die an eine Zielnukleinsäure gebunden sind, ist weithin bekannt. Es wird allgemein angenommen, dass die Oligomere jeweils eine minimale Länge aufweisen müssen, um effizient ligiert werden zu können. Kürzliche Arbeiten haben gezeigt, dass diese minimale Länge ungefähr 6–8 Basen ist (C.E. Pritchard und E.M. Southern, Nucl. Acids Res., 25, 3403–3407 (1997)). Es wird allgemein angenommen, dass die Ligation von Oligonukleotiden, die kürzer als ungefähr 6 Basen sind, nicht möglich ist.
Unter bestimmten Bedingungen kann eine Primer unabhängige Ligation unter Verwendung von Oligomeren von zumindest 6 Basen Länge erreicht werden. Auf diese Weise wurden PCR-Primer in situ aus verketteten Gruppen einer kleinen Anzahl von Hexameren, Heptameren oder Oktameren hergestellt (T. Kaczorowski und W. Szybalski, Gene, 179, 189–193 (1996); L.E. Kotler, D. Zevin-Sonkin, I.A. Sobolev, A.D. Beskin und L.E. Ulanovsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4241–4245 (1993)). Eine solche Ligation in Abwesenheit eines Primers ist in den vorliegenden Verfahren nicht erwünscht und muss vermieden werden. Der Erfolg beim Replizieren einer Polynukleotidsequenz in einer kontrollierten und definierten Art und Weise liegt in der Kenntnis des Ursprungspunktes des neu synthetisierten Strangs.
WO-A-9708344 offenbart eine Ligase-basierten Assay zur Identifizierung von Mutationen in einer Targetsequenz. Eine einsträngige Target- bzw. Zielsequenz hybridisiert beispielsweise mit zumindest drei Oligonukleotiden. Die Oligonukleotide weisen Sequenzen auf, die mit sequenziellen und angrenzenden Bereichen der Zielnukleinsäure komplementär sind und mit diesen hybridisieren. Die Oligonukleotide werden anschließend ligiert, um ein einzelnes Ligationsprodukt zu bilden.
Nukleinsäuren können aus einer Matrize, einem Primer und Nukleotidtriphosphaten (NTPs) durch Wirkung einer Polymerase-Wirkung synthetisiert werden. Markierungen können durch Substituieren eines Prozentsatzes markierter NTPs eingebaut werden. Das Vermögen, einen hohen Grad einer Markierungs-Einfügung zu erreichen ist beschränkt und die präzise Beabstandung der Markierungen ist nicht kontrollierbar.
Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR) ist ein Verfahren zum Amplifizieren der Menge eines Polynukleotids durch Verwendung eines Primers, der mit jedem Strang komplementär ist, der die zu replizierende Region überspannt. Die Nukleinsäuresynthese schreitet durch Verlängerung jedes Primers mit einer Polymerase und den vier dNTPs fort. Das thermal cycling ermöglicht die Synthese vielfacher Kopien der Matrize, wobei die Menge des Amplikons in jedem Zyklus bzw. Umlauf ungefähr verdoppelt wird. Eine Variante mit dem Namen Ligase-Kettenreaktion (ligase chain reaction = LCR) involviert die Ligation zweier Oligonukleotidpaare mit einem Ligase-Enzym, so dass die Sequenz von Interesse repliziert wird (D.Y. Wu und R.B. Wallace, Genomics, 4, 560–569 (1989)). Die beiden zu ligierenden Oligonukleotide stellen die Gesamtlänge des Stranges dar. Die Ligation einer großen Anzahl kleiner Oligomere an einen Primer zur Replikation einer Nukleinsäure wurde bisher nach bestem Wissen des Anmelders nicht erreicht.
Ein Verfahren zur Bereitstellung einer Sequenzinformation unter Verwendung einer Nukleotidligation sind in US 5,750,341 und US 5,770,367 und in einer Veröffentlichung (S. Dubiley, E. Kirilov, Y. Lysov und A. Mirzabekov, Nucl. Acids Res., 25, 2259–2265 (1997)) offenbart. Die berichteten Verfahren unterscheiden sich von denjenigen der vorliegenden Erfindung fundamental dahingehend, als sie erfordern, dass die Oligomere zu jeweils einem pro Zeitpunkt ligiert werden und die Sequenz nach jedem Schritt analysiert wird. Dieses Verfahren ist deswegen weit arbeitsintensiver als diejenigen der vorliegenden Erfindung.
Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren – Die vorliegenden Verfahren der Markierung von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden schließen das Tailing- bzw. Ansynthetisieren von Enden-Verfahren, das Random Primed Labeling, die Nicktranslation, die markierte verzweigtkettige DNA und die Endmarkierung unter Verwendung eines markierten Primers, ein. Jedes Verfahren leidet bei bestimmten Anwendungen unter Nachteilen. Die Verwendung eines endmarkierten Primers, der durch PCR mit unmarkierten Basen verlängert wird, führt zu nur einer oder wenigen Markierungen pro Nukleinsäure-Produkt.
Das Tailingverfahren schließt eine unbestimmte oder unkontrollierte Anzahl an Markierungen ein, in dem ein Schwanz bzw. Ende nicht komplementärer Basen an die Nukleinsäure von Interesse angehängt wird. Dies fügt viele zusätzliche Basen hinzu, was nicht nur teuer ist, sondern auch die Hybridisierung stört und zu einer unspezifischen Bindung führt. Zusätzlich ist dies nicht einfach auf die Synthese kurzer Nukleinsäuren oder von Oligonukleotiden anwendbar, weil die Länge des Schwanzes bzw. Endes die Länge der Sequenz von Interesse überschreiten könnte.
Das Random Prime Verfahren, anwendbar auf die Markierung langer Nukleinsäuren verwendet ein Gemisch von Primern, die durch eine Polymerase mit einem Gemisch markierter und unmarkierter Basen verlängert werden. Die Anzahl Basen, die eingebaut werden kann, ist variabel und in ihrer Anzahl willkürlich. Ein Gemisch zahlreicher Nukleinsäurefragmente variierender Längen werden aus beiden Strängen erzeugt. In ähnlicher Weise erzeugt die Nicktranslation ein Gemisch zahlreicher Nukleinsäurefragmente variierender Längen aus beiden Strängen. Brüche in beiden DNA-Strängen werden erzeugt und neue Nukleinsäurestränge werden aus der Position des Bruchs synthetisiert, unter Verwendung eines Gemisches markierter und unmarkierter Basen. Weil die Position des Bruchs bzw. Schnittes willkürlich ist, ist der Markierungseinbau ebenfalls nicht kontrollierbar.
Die verzweigte DNA-Technologie wurde in diagnostischen Tests als Mittel verwendet, um mehrere Markierungen an eine Ziel-DNA anzubinden. Die Methodik beruht auf der Erzeugung mehrerer Verzweigungen synthetischer Nukleinsäuren, die jeweils an eine Sonde gebunden sind, gefolgt von der Hybridisierung multipler markierter Oligonukleotide an jede der verzweigten Amplifikationsmultimere. Das Verfahren erfordert die kostenintensive Zubereitung vieler Sonden und verzweigte DNA ist nicht allgemein anwendbar, insbesondere zur Erzeugung kurzer Stücke stark markierter DNA.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Synthetisieren ein- oder doppelsträngiger Polynukleotide bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Synthetisieren von Polynukleotiden durch Ligieren einer Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Phosphaten an einen Primer bereitzustellen, der an ein Matrizen-Polynukleotid hybridisiert ist. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Synthetisieren von Polynukleotiden unter Verwendung einer Bibliothek aus Oligonukleotid-5'-Phosphaten bereitzustellen. Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Synthetisieren markierter Polynukleotide mit einer spezifizierten Position und Grad an Markierungs-Einbau bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Amplifizieren der Menge einer Nukleinsäure durch Primer-gerichtete Ligation bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Detektion von Genen und die Analyse der Genexpression bereitzustellen. Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Detektion genetischer Mutationen bereitzustellen. Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Analyse der Basensequenz einer Nukleinsäure bereitzustellen. Das neue Verfahren der Erfindung ist in Anspruch 1 definiert.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
Es wurde herausgefunden, dass eine Reihe kurzer Oligonukleotid-5'-Phosphate simultan an einen matrizen-gebundenen Primer in einer direkt aneinander liegenden Art und Weise ligiert werden kann, so dass der komplementäre Strang eines Matrizenpolynukleotids oder – nukleinsäure erzeugt werden kann. Die erzeugte Nukleinsäure kann entweder markiert oder unmarkiert sein, in dem entweder markierte oder unmarkierte kurze Oligomere verwendet werden. Die Oligomere im Satz enthalten jeweils vorzugsweise die gleiche Anzahl an Basen. Wenn eine zu synthetisierende Sequenz exakt bekannt ist, kann ein Satz verwendet werden, der die minimale Anzahl an Oligomeren enthält. Die Oligomere werden in der korrekten Reihenfolge ligiert, ausgehend vom Primer, um die korrekte Sequenz zu erzeugen. Die Primer unabhängige Ligation tritt nicht auf, wenn Oligonukleotide einer Länge ≤5 Basen verwendet werden. Wenn die zu synthetisierende Sequenz nicht bekannt ist, wird eine Bibliothek einer großen Anzahl des gesamten möglichen Pools an Oligomeren verwendet. Die letztere Situation tritt in der Sequenzanalyse und im Mutationsscreening auf. Ligationen werden vorzugsweise mittels eines Ligaseenzyms durchgeführt. Bekannte chemische Mittel zum Ligieren von Nukleotiden und Oligonukleotiden können ebenso verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt schematisch die Ligation zweier Oligomere P1 und P2 an einen matrizengebundenen Primer in Gegenwart eines konkurrierenden nicht ligierbaren, komplementären Oligomers P3.
2 veranschaulicht ein Verfahren zum Amplifizieren der Menge einer Nukleinsäure unter Verwendung einer matrizengebundenen Primer-gerichteten Ligation multipler Oligomere. Die Synthese, die dargestellt wird, tritt in einer Richtung in jedem Strang auf, kann jedoch auch bidirektional bzw. in zwei Richtungen, wie unten beschrieben wird, erreicht werden.
3 zeigt schematisch ein Verfahren zum Nachweisen einer Punktmutation in einem Gen durch Ligation nachweisbar markierter mutationsspezifischer Oligomere an einem matrizengebundenen Primer.
4 zeigt schematisch ein Verfahren zum Nachweis zweier unterschiedlicher Genotypen einer Mutation in einem Gen durch Ligation unterschiedlicher nachweisbar markierter mutationsspezifischer oder Wild-Typ spezifischer Oligomere an einen matrizengebundenen Primer. Die mutationsspezifischen Oligomere tragen einer erste Markierung, wohingegen die Wild-Typ spezifischen Oligomere eine zweite Markierung tragen.
5 zeigt ein Beispiel für eine verzweigtkettige DNA oder von Amplifikationsmultimeren.
6 zeigt eine Adaption einer verzweigtkettigen DNA, bei der zumindest die erste Verzweigung durch Ligation markierter Oligomere zur Bereitstellung von Verzweigungspunkten in regelmäßig beabstandeten Intervallen hergestellt wird.
7 zeigt schematisch ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Nukleinsäure durch Ligation einmal vorkommender markierter Oligomere an einen matrizen-gebundenen Primer, Abspaltung der Markierungen bzw. Marker und Analyse der Masse jedes einmal vorkommenden Markers.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Oligomer, Oligonukleotid – wie hierin verwendet – betrifft eine Verwendung, die eine Phosphodieester-Internukleotid-Bindung und eine 5'-terminalen Monophosphatgruppe enthält. Die Nukleotide können die normalerweise vorkommenden Ribonukleotide A, C, G und U oder Desoxyribonukleotide sein, dA, dC, dG und dT.
Primer oder Sonde/Primer – betrifft ein Oligonukleotid, das dazu verwendet wird, den On der Ligation zu steuern und ist dazu erforderlich, den Ligationsprozesss zu starten. Primer weisen eine Länge auf, die ausreichend ist, um stabil an die Matrize zu hybridisieren und repräsentieren eine einzigartige bzw. einmal vorkommende Sequenz in der Matrize. Primer weisen üblicherweise ungefähr 15–30 Basen Länge auf, obwohl längere Primer verwendet werden können. Markierte Primer, die nachweisbare Marker oder Marker enthalten, die einen Festphasen-Einfang ermöglichen, sind innerhalb des Umfangs des Begriffes, wie er hierin verwendet wird. Als Primer zählen ebenfalls aneinander angrenzende gestapelte Oligomere von zumindest sechs Basen, wie es in der Technik bekannt ist (T. Kaczorowski und W. Szybalski, Gene, 179, 189–193 (1996)).
Matrize, Testpolynukleotid, Target werden austauschbar verwendet und bezeichnen die Nukleinsäure, deren Länge repliziert werden soll.
Probe – eine Flüssigkeit, die ein oder mehrere Analyten, die untersucht werden sollen, enthält oder unter dem Verdacht steht, diese zu enthalten. Typische Proben, die durch Chemilumineszenzreaktion untersucht werden, sind biologische Proben, die Körperflüssigkeiten einschließen, beispielsweise Blut, Plasma, Serum, Urin, Samen, Speichel, Zelllysate, Gewebsextrakte und dergleichen. Andere Typen an Proben schließen Nahrungsmittelproben und Umweltproben wie beispielsweise Boden oder Wasser ein.
Kurzes Oligonukleotid – wie hierin verwendet ein Oligonukleotid-5'-Phosphat von zumindest 2 bis zu ungefähr 10 Basen Länge. Die Basen können Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder Analoge hiervon sein. Die Länge eines kurzen Oligonukleotids, das in einem vorgegebenen Kontext von Nutzen ist, kann innerhalb dieses Bereichs variieren und kann weniger als der Gesamtbereich sein. Die bevorzugte Länge variiert abhängig von der speziellen Anwendung.
Spezifisches Bindungspaar – zwei Substanzen, die eine wechselseitige Bindungsaffinität zeigen. Beispiele schließen Antigen-Antikörper, Hapten-Antikörper oder Antikörper-Antikörperpaare, komplementäre Oligonukleotide oder Polynukleotide, Avidin-Biotin, Straptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lecithin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nukleinsäure -Nukleinsäure bindendes Protein und Nukleinsäure-Antinukleinsäureantikörper und Metallkomplex-Liganden, ein.
Ein bevorzugtes Verfahren der Ligation verwendet eine Ligase wie beispielsweise eine DNA Ligase. Repräsentative Ligasen schließen T4 Ligase, T7 Ligase, Tth Ligase, Taq-Ligase und E. coli DNA Ligase ein. Die Ligase kann eine thermostabile Ligase sein, und in diesem Fall sind thermal cycling Techniken, wie unten diskutiert, möglich. Thermal cycling mit einer thermostabilen Ligase ist in den Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuren in einer Art und Weise analog der Polymerasekettenreaktion nützlich, jedoch unter Verwendung von Oligomeren und einer Ligase anstelle von dNTPs und einer Polymerase. Verfahren zur Durchführung enzymatischer Ligationsreaktionen sind allgemein beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, beschrieben.
Enzymatische Ligationsreaktionen werden üblicherweise in einer Pufferlösung durchgeführt, wahlweise in Gegenwart von Additiven zur Förderung der Hybridisierung. Der Puffer weist einen pH typischerweise im Bereich von 6–9, besonders üblich 7–8,5 und vorzugsweise im Bereich von 7,5–8 auf. Puffer, die dazu in der Lage sind, einen pH in diesem Bereich aufrecht zu erhalten, sind geeignet. Die Reaktion kann über einen Temperaturbereich im Bereich von 0 bis ungefähr 50 °C durchgeführt werden. Die optimalen Temperaturen variieren über den Bereich abhängig von der Natur und Größe der Oligonukleotidphosphate, die ligiert werden sollen, dem Enzym, dem Vorhandensein und der Menge an Additiv bzw. Zusatzstoff und können empirisch unter Bezugnahme auf allgemeine Literatur über Ligasen und unter Bezugnahme auf die speziellen Beispiele unten optimiert werden. Die Zeitspanne zur Durchführung der Ligation kann nur einige Minuten bis zu mehreren Stunden betragen, obwohl es wünschenswert ist, die Reaktion so rasch wie möglich durchzuführen. Einsträngige DNA-Bindungsproteine können den Oligonukleotidligationsreaktionen zugesetzt werden, um ihre Effizienz zu verbessern. Ihre Wirkung ist auf ihre Entspannung jeglicher Sekundärstruktur zurückzuführen, die im Matrizenstrang vorliegt, was es den komplementären Oligonukleotiden ermöglicht, zu binden und zu ligieren. Einsträngiges E. coli Bindungsprotein (Promega, Madison, WI oder Amersham/USB) und T4 Gen 32 Protein (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) können verwendet werden. Die Verwendung von Volumenaustauschmitteln, beispielsweise Polyethylenglykolen (PEG) kann bei der Förderung bzw. Unterstützung der Ligationen von Vorteil sein. Der Einschluss von bis zu 200 mM NaCl kann ebenfalls zum Unterstützen der Ligationen von Nutzen sein. Die Verwendung anderer Additive bei enzymatischen Ligationen wird in Erwägung gezogen und liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Verfahren. Additive schließen Phosphattransfer bzw. Übertragungsmittel wie beispielsweise ATP, Sulfhydrylreagenzien, einschließlich DTT und 2-Mercaptoethanol und zweiwertige Kationen wie beispielsweise Mg⁺²-Salze ein.
Die Ligation von Oligomer 5'-Phosphaten schließt ebenfalls nicht enzymatische Verfahren der Ligation ein. Chemische Reagenzien, die die Bildung der Phosphodiester-Internukleotid-Bindung bewirken, sind bekannt (CNBr: K.D. James, A.D. Ellington, Chemistry & Biology, 4,595,605, (1997); N-Cyanoimidazole: T. Li, K.C. Nicalaou, Nature, 369, 218–221 (1994); EDAC: D. Sievers, G. Von Kiedrowski, Nature, 369, 221–224 (1994)). Chemische Ligationsverfahren wurden auf Verfahren der Sequenzanalyse nicht angewendet.
Der Einbau von nicht zueinander passenden bzw. mismatched Oligomeren kann wie bei anderen Techniken auftreten, insbesondere, wenn die Sequenz einen hohen G-C-Gehalt aufweist. Das Auftreten von Nicht-Übereinstimmungen ist kontrollierbar, wie es bei anderen Hybridisierungsverfahren der Fall ist. Die Temperatur, Salzkonzentration und Additive können alle in der in der Technik bekannten Art und Weise verwendet werden, um die Stringenz des Hybridisierungsprozesses zu kontrollieren. Weil die Wirkung einer Nicht-Übereinstimmung auf ein kleines Oligomer proportional größer als auf ein größeres sein müsste, mag die Unterscheidung nicht richtiger Sequenzen eine Verbesserung gegenüber anderen Ligationstechniken zeigen.
Eine weitere Ausführungsform verwendet eine Bibliothek möglicher Sequenzen, um die Ligation einer Reihe kurzer Oligomere der Länge n-Basen zu erreichen, um eine komplementäre Nukleinsäure zu synthetisieren. Die Bibliothek enthält viel mehr mögliche Kombinationen der n-Basen (n-mere) als sie erforderlich sind, um das Nukleinsäureprodukt zu bilden. Wenn n beispielsweise gleich 5 ist, existieren 4⁵ oder 1024 mögliche 5-mere, die die vier natürlich vorkommenden Basen A, C, G, T und U enthalten. Die Bibliothek kann alle 4ⁿ möglichen Oligomere enthalten oder auch weniger als den vollen Satz, sollte jedoch zumindest einen beträchtlichen Anteil (> 50%, vorzugsweise > 75%, am meisten bevorzugt > 90%) der möglichen Oligomere enthalten.
Bekannte Verfahren zum Synthetisieren von Polynukleotiden durch Polymerase-Verlängerungen mit dntps oder Ligation vorgeformter Oligonukleotide funktionieren durch Bereitstellung einer nur kleinen Zahl unterschiedlicher Reaktanten zur zum Einbau in das Produkt-Molekül. Bekannte ligationsbasierte Verfahren füllen üblicherweise das eine Nukleotid mit der korrekten Sequenz vorher aus. Polymeraseverlängerungsverfahren führen die vier individuellen Basen zum Einbau zu. Die vorliegenden Verfahren unterscheiden sich fundamental in der Bereitstellung einer großen Anzahl potentieller Reaktanten im Reaktionsgemisch. Darüber hinaus weist eine signifikante Anzahl der kurzen Oligonukleotide eine Sequenz auf, die zur Hybridisierung an das Target geeignet ist, die jedoch, wenn es hybridisiert ist, den Ligationsprozess blockieren oder vorzeitig beenden würde.
Wie in 1 ersichtlich ist, ist das Oligomer P3 einem Anteil der Targetsequenz gegenüber komplementär, würde jedoch, wenn es hybridisiert, die Ligation von P1 und P2 an den Primer blockieren. Überraschenderweise stört das Vorhandensein komplementärer Oligomere, die nicht an den Primer ligiert werden können, die erfolgreiche Ligation der erwünschten Oligomere an den matrizen-gebundenen Primer nicht und verhindert diese auch nicht.
Die Bibliothek enthält ebenfalls eine Mehrzahl an Oligonukleotidsequenzen, die gegenüber dem Target nicht komplementär oder nur teilweise komplementär sind. Dieser Überschuss an Oligonukleotiden konkurriert tatsächlich mit den korrekten Sequenzen bezüglich der Erkennung und Ligation. Nichtsdestoweniger tritt die Ligation kurzer Oligonukleotide in der korrekten Reihenfolge trotz der statistischen Unwahrscheinlichkeit effektiv ein. Das Vermögen, eine Nukleinsäure zuverlässig durch aufeinanderfolgende Ligation vieler kurzer Oligonukleotide in einem Schritt zu replizieren ist unerwartet und vereinfacht den Prozess im Vergleich zu den anderen im Stand der Technik bekannten Prozessen in großem Maße.
Die Länge der Oligonukleotide zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren richtet sich nach dem Verhältnis mehrerer konkurrierender Faktoren. Größere Oligomere hybridisieren stärker unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen (Salzkonzentration, Temperatur) und können deswegen bei einer höheren Temperatur hybridisieren. Wenn die Länge des Oligonukleotids zunimmt, nimmt die Anzahl getrennter Verbindungen, die dazu erforderlich sind, die vollständige Bibliothek aller möglichen n-mere aufbauen, um einen Faktor von 4 für jede Einheit-Zunahme von n, zu.

Länge des Oligomers Gesamtanzahl Sequenzen

1 4

2 16

3 64

4 256

5 1024

6 4096

7 16.384

8 65.536

9 262.144

10 1.048.576
Kürzere Oligomere erfordern weniger Verbindungen zur Konstruktion der Gesamtbibliothek, es wird jedoch schwieriger, beispielsweise bei niedriger Temperatur, zu hybridisieren und zu ligieren, wenn ihre Länge abnimmt. Dies übersetzt sich wiederum in eine größere Stringenz bei einer gegebenen Temperatur. Ein noch weiterer Faktor ist die Fähigkeit des Oligonukleotids, an einer Stelle zu hybridisieren und die Verlängerung zu initiieren, die mit dem Primer nicht in Verbindung steht. Eine Primer-unabhängige Hybridisierung wurde unter den richtigen Bedingungen mit Oligonukleotiden von nur sechs Basen demonstriert. Eine Ligation von zwei oder mehr benachbarten Hexameren zur Erzeugung beispielsweise eines Dodekamers oder Octadekamers erzeugt dann effektiv einen neuen Primer. Wenn dies eintritt, wird das Vermögen, den Ausgangspunkt für die Polynukleotidsynthese zu kontrollieren, beeinträchtigt. Andererseits erhöht die Wahrscheinlichkeit, ein vielfaches Auftreten einer vorgegebenen Sequenz in einer Nukleinsäure von hunderten Basen zu finden, sich beträchtlich, wenn kürzere Oligonukleotide verwendet werden. Bei Anwendungen, die die Sequenzbestimmung mit einschließen, ist es wünschenswert, das Auftreten doppelter Sequenzelemente zu vermeiden oder zu minimieren. Die Auswahl des Oligonukleotids mit der optimalen Länge zur Anwendung ist ein Kompromiss zwischen diesen in Konflikt stehenden Wirkungen. Die optimale Länge wird bei verschiedenen Endanwendungen unterschiedlich sein.
In der Praxis mag es nicht notwendig sein, die volle Oligonukleotidbibliothek der Länge n zu verwenden. Wenn die Anzahl der Oligonukleotide, die zur Erzeugung der gegebenen Sequenzen notwendig ist, im Vergleich zur Gesamtzahl der Oligonukleotide in der Bibliothek klein ist, können Teilbibliotheken verwendet werden und noch eine hohe Wahrscheinlichkeit aufrechterhalten, dass alle erforderlichen Oligonukleotide anwesend sein werden. Es kann in einigen Fällen wünschenswert sein, bestimmte Sequenz-Oligonukleotide auszuschließen, die zu schwach oder zu stark hybridisieren. Es ist in den vorliegenden Verfahren, außer wenn es explizit angemerkt wird, nicht notwendig, dass jeder Bestandteil des Sets an Oligonukleotid-5'-Phosphaten in einem gegebenen Verfahren verwendet, dieselbe Anzahl von Basen aufweist. Es kann in einigen Ausführungsformen vorteilhaft sein, eine Kombination auf Oligomeren von zwei oder mehreren unterschiedlichen Längen zu verwenden, beispielsweise Pentamere und Hexamere, um das Auftreten zweifacher Oligomere zu vermeiden. Es wird oftmals bevorzugt, dass die in einem vorgegebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotide dieselbe Anzahl von Basen aufweisen. Diese Anzahl ist vorzugsweise 2 bis 6, besonders bevorzugt 5.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine matrizengerichtete Ligation einer Vielzahl eines Satzes oder einer Reihe kurzer Oligonukleotide derselben Längen an einen Primer in einer Art und Weise durchgeführt werden, die den Endpunkt der Ligation durch Verwendung nicht verlängerbarer Oligomere kontrolliert. Ein nicht verlängerbares Oligomer kann die gleiche oder eine unterschiedliche Anzahl an Basen wie die anderen Oligomere im Satz enthalten. Das nicht verlängerbare Oligomer enthält ein 5'-Phosphat, so dass es ligiert werden kann, so dass ihm aber die 3-OH Gruppe fehlt. Es könnte beispielsweise eine Didesoxybase am 3'-Ende des Oligomers aufweisen, so dass zur Ligation kein 3'-OH zur Verfügung steht. Ein weiterer Typ eines nicht verlängerbaren Oligomers enthält eine blockierte 3-OH-Gruppe, beispielsweise, wo die Hydroxylgruppe mit einer Methylgruppe blockiert ist oder eine Phosphatgruppe, um eine anschließende Ligation zu vermeiden. Modifikationen der terminalen Base, die eine Ligation verhindern, sind ein weiterer möglicher Typ eines nicht verlängerbaren Oligomers. Das nicht verlängerbare Oligomer kann markiert oder unmarkiert sein, abhängig vom jeweiligen Bedarf. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, Oligomere zu verwenden, die am 3'-Terminus eine Didesoxybase enthalten. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Synthetisieren einer Nukleinsäure durch Ligation einer Vielzahl von Oligonukleotid 5-Phosphate an einen matrizengebundenen Primer sowohl in der 5' → 3' als auch 3' → 5' Richtung zur selben Zeit. Dieses Verfahren kann beispielsweise durchgeführt werden, indem eine 5' Phosphatgruppe am Primer bereitgestellt wird. Eine Ligation kann gleichzeitig von beiden Termini bzw. Enden des Primers auftreten, solange die geeigneten ligierbaren Oligomere bereitgestellt werden. Der Terminationspunkt der Synthese in jeder oder beiden Richtungen kann durch Verwendung nicht verlängerbarer Oligomere oder durch Ausschließen ausgewählter Oligomere kontrolliert werden. Ein nicht verlängerbares Oligomer zum Beenden der Synthese in der 3' → 5' Richtung würde die 5' Phosphatgruppe nicht aufweisen.
Die Matrizen-gerichtete Ligation einer Vielzahl von Sätzen kurzer Oligonukleotide an einem Primer kann in einem Verfahren zum Amplifizieren der Menge einer Ziel-DNA verwendet werden. Demgemäss umfasst ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnukleinsäure unter Verwendung einer Ligase, von zwei Primern und eines Satzes kurzer Oligonukleotide, wobei die Sonden zu Regionen an gegenüberliegenden Strängen komplementär sind, die die Region des zu amplifizierenden Zieles überspannen. Mindestens muss der zur Reaktion bereitgestellte Oligomer-Satz solche Oligomere enthalten, die zum Verlängern beider Primer in ihren jeweiligen Strängen erforderlich sind, soweit die dem 5' Ende des anderen Primers entsprechende Position betroffen ist. Zusätzliche Oligomere können eingeschlossen werden, wie es beispielsweise eintreten würde, wenn die gesamte Bibliothek von Oligomeren anstelle der Vorauswahl des Satzes an Oligomeren verwendet wird. Der schematisch in 2 dargestellte Prozess entscheidet sich von der Polymerasekettenreaktion, PCR, durch Verwendung einer Bibliothek von Oligomeren und einer Ligase anstelle der vier Desoxyribonukleotide und einer Polymerase. Jeder Zyklus des Annealings, der Ligase-Verlängerung und der Dehybridisierung hat eine zweifache Amplifikation der Zielsequenz zur Folge. Weil ein Erhitzen im allgemeinen zur Auftrennung der neu synthetisierten Duplex-Nukleinsäure erforderlich ist, kann eine zusätzliche Ligase in anschließenden Runden der Ligations-Verlängerung zugesetzt werden müssen. Alternativ kann das Verfahren mit einer thermostabilen Ligase durchgeführt werden. Das Thermocycling kann dann ohne ein Ersetzen der Ligase in jedem Zyklus durchgeführt werden.
Gemäß der oben angeführten Beschreibung ist ein Verfahren zum Amplifizieren der Menge eines Teils einer doppelsträngigen Nukleinsäure bereitgestellt, die einen ersten Strang und einen zweiten Strang aufweist, wie es in Anspruch 2 definiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform eines Amplifikationsverfahrens ist ein Satz an Oligomeren vorher ausgewählt worden, so dass er nur solche Oligomere enthält, die zum Replizieren der beiden Stränge notwendig sind, d. h. solche Oligomere, die an den beiden Strängen in der Region auftreten, die durch die beiden Primer überspannt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden nicht verlängerbare Oligomere für die terminalen Positionen jedes Strangs verwendet. Diese beiden terminierenden Oligomere weisen per Definition eine Basensequenz auf, die zur ersten Gruppe von Basen der Länge des Oligomers am 5' Ende jedes Primers komplementär ist.
Amplifikationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Synthese jedes Stranges in sowohl der 5' → 3' als auch 3' → 5' Richtung zur selben Zeit erreicht werden. Dieses bidirektionale Amplifikationsverfahren kann beispielsweise durchgeführt werden, indem eine 5'-Phosphatgruppe am Primer bereitgestellt wird. Die Ligation kann simultan von beiden Termini jedes Primers weg auftreten, solange die geeigneten ligierbaren Oligomere bereitgestellt werden. Der Terminationspunkt der Synthese in jeder oder beiden Richtungen kann durch Verwendung nicht verlängerbarer Oligomere und durch Ausschluss ausgewählter Oligomere wie oben beschrieben kontrolliert werden.
Wie es auch bei anderen Anwendungen der vorliegenden Oligomer-Ligationsmethode zum Synthetisieren einer Nukleinsäure der Fall ist, können entweder markierte oder unmarkierte Oligomere verwendet werden. Der verwendete Satz an Oligomeren kann eine gesamte Bibliothek, ein beträchtlicher Anteil der Bibliothek oder ein vorher ausgewählter Untersatz sein, wenn die zu amplifizierende Sequenz von vorneherein bekannt ist.
In einem weiteren Aspekt kann das Verfahren zum Synthetisieren spezifischer Nukleinsäuresequenzen durch Ligieren von Oligomeren an targetgebundene Primer in diagnostischen Anwendungen verwendet werden.
Spezielle Sequenzen, die für das Ziel von Interesse charakteristisch sind, können unter Verwendung markierter Oligomere in einem Verfahren zum Synthetisieren des neuen Stranges nachgewiesen werden. Wenn die Basensequenz der Zielnukleinsäureregion bekannt ist, werden die entsprechenden Oligomere verwendet, die zur Vervollständigung dieser Sequenz von Nöten sind, von denen zumindest einige einen nachweisbaren Marker tragen sollten. Solche Verfahren weisen auf vielen Gebieten der Nukleinsäurediagnostik einschließlich des Nachweises infektiöser Mittel wie beispielsweise C. trachomatis und N. gonorrhoeae, P. carinii, M. tuberculosis, beim Nachweis in der Nahrung enthaltener Pathogene, wie beispielsweise Salmonella und E. coli, Verfahren zum Nachweisen genetischer Abnormalitäten, in der forensischen Austestung von DNA Proben aus verdächtigten Personen, bei der Identitätszuordnung menschlicher Überreste und beim Vaterschaftstest Nutzen auf, wobei eine spezifische Sequenz ausgewählt und von einer anderen verwandten Sequenz unterschieden wird.
Auf dem Gebiet des Testes nach einer genetischen Abnormalität besteht eine Anwendung in einem Verfahren zum Nachweis von genetischen Mutationen. Die Mutationen können eine Punktmutation (a und β-Thalassämie), Einbasensubstitution (Sichelzellanämie), eine Deletion (zystische Fibrose ΔF₅₀₈, Tay-Sachs), eine Insertion, eine Duplikation, eine Transposition von Basen oder eine Kombination des obigen sein. Markierte Oligomere werden zur Ligation an eine Sonde/Primer derart ausgewählt, dass der sich ergebende verlängerte Primer ein markiertes mutationsspezifisches Polynukleotid ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Bereitstellung eines Verfahrens zur Differenzierung Heterozygoter von Homozygoten für einen solchen genetischen Zustand verwendet werden. Weil zwei Kopien eines Chromosoms, die eine DNA Sequenz von Interesse enthalten, in einer Probe vorliegen, stellt das Verfahren zum Synthetisieren markierter komplementärerer DNA ein Mittel zum Unterscheiden von Heterozygoten von jeder Homozygote bereit. Ein Satz von Oligomeren, der eine erste Markierung trägt, die, wenn sie ligiert ist, einen Teil eines Stranges erzeugen, die gegenüber der normalen Sequenz komplementär sind, wird zur Ligation bereitgestellt. Ein weiterer Satz an Oligomeren, der einen zweiten Marker trägt, erzeugt einen Anteil eines Stranges, der zur mutierten Sequenz nach Ligation komplementär ist (4). Die Ligation der Oligomersätze an eine Sonde, die an eine Ziel-DNA in der Probe hybridisierte, erzeugt ein Polynukleotid, das zum Proben-Genotyp komplementär ist. Die drei Genotypen werden durch Bestimmen aufgetrennt, welche Markierungen in der neu synthetisierten DNA vorliegen. Homozygote DNA enthält eine Markierung oder die andere; heterozygote DNA wird beide enthalten.
Wenn die zu synthetisierende Sequenz nicht bekannt ist, wird eine Bibliothek einer großen Anzahl des gesamten möglichen Pools an Oligomeren verwendet. Die letztere Situation tritt in Sequenzanalysen und Mutations-Screening ein. Wenn sie in Verbindung mit den Verfahren zur Sicherstellung der Basensequenz eines neu synthetisierten Polynukleotids, das ausführlich unten beschrieben ist, verwendet werden, können zahlreiche Mutationen eines speziellen Gens untersucht und simultan identifiziert werden. Das Vermögen, in einem Gen nach multiplen Mutationen zu testen, würde ein Screening nach genetischen Erkrankungen, wie beispielsweise zystischer Fibrose ermöglichen, für das mehr als 500 Mutationen identifiziert wurden.
Gemäß eines noch weiteren Aspektes ist der Primer immobilisiert.
Nach der Ligation werden die Oligonukleotid-5'-Monophosphate, die nicht ligiert sind, entfernt, und das eingefangene Sonden-Testnukleinsäurehybrid, das eine verlängerte doppelsträngige Region aufweist, wird denaturiert, um die Testnukleinsäure vom festen Träger zu entfernen und die immobilisierte einsträngige Nukleinsäure zu erzeugen.
Das Verfahren kontrolliert den Ursprungspunkt und ist nicht durch die Größe des Oligomers, das ligiert werden soll, beschränkt. Wenn die zu transkribierende Sequenz exakt bekannt ist, können die Oligomere vorselektiert werden, um Kosten und Komplexizität zu reduzieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Synthetisieren vielfacher markierter Nukleinsäuren, wobei der Umfang des Marker-Einbaus kontrolliert wird und eine hohe Dichte einer Markierung bereitstellt. Wenn ein immobilisierter Primer für den einfachen Zweck verwendet wird, Sonde und Primer einzufangen, wird das eingefangene Hybrid mit einer Vielzahl markierter Oligonukleotid-5'-Monophosphate in Berührung gebracht, die im Anschluss an die Ligation der markierten Oligonukleotid 5'-Monophosphate nicht ligiert sind, entfernt werden; und das eingefangene Sonden-Testnukleinsäurehybrid mit einer verlängerten doppelsträngigen Region wird denaturiert, um die Testnukleinsäure vom festen Träger zu entfernen, und um eine immobilisierte markierte einsträngige Nukleinsäure zu erzeugen, die eine Vielzahl von Markern enthält.
Der Primer kann alternativ ein nicht immobilisierter Primer zum Zweck des Synthetisierens einer vielfach markierten Nukleinsäure sein. Diese Ausführungsform verwendet eine Vielzahl markierter Oligonukleotid-5'-Monophosphate und nach Ligation werden die markierten Oligonukleotid-5'-Monophosphate, die nicht ligiert sind, entfernt.
Das Verfahren kann weiterhin den Schritt umfassen, den verlängerten Primerstrang vom Matrizennukleinsäure-Strang, falls erwünscht, zu trennen. Die von jedem Oligonukleotid 5'-Monophosphat getragene Markierung kann verschieden sein oder kann insgesamt dieselbe Markierung sein. Alternativ kann eine begrenzte Anzahl unterschiedlicher Marker verwendet werden, beispielweise 2–5 Marker. Die Auswahl von Markern, die verwendet wird, wird von der Endanwendung bestimmt werden.
Die vorliegenden Verfahren können im Gegensatz zu anderen Verfahren zum Markieren von Nukleinsäuren, die im Abschnitt „Hintergrund" beschrieben sind, tatsächlich Nukleinsäuren jeder Länge herstellen, wären jedoch am meisten für Produkte von Nutzen, die zumindest ungefähr 50 Basen aufweisen. Kürzere Produkte würden weniger angeheftete Markierungen aufweisen. Einer der Hauptvorteile besteht darin, dass der Grad und die Position einer Marker-Bindung präzise kontrolliert wird. Beispielsweise führen Pentamere, die jeweils eine Markierung tragen, zu einem Produkt, bei dem jede fünfte Base markiert ist, was eine Markerdichte von 20% bereitstellt. Noch höhere Dichten können mit kürzeren Oligomeren oder mit Pentameren erreicht werden, die jeweils zwei oder mehr Markierungen tragen.
Die Fähigkeit, bei diesen hohen Dichten kontrollierbar zu markieren, werden in den diagnostischen Tests besonders von Vorteil sein, bei denen die Nachweisempfindlichkeit bzw. -sensitivität an erster Stelle steht. Höhere Markerdichten sollten zu verbesserten Nachweisgrenzen führen. Eine kontrollierte Markierung wird zu einer verbesserten Assaypräzision beitragen. Die Marker können tatsächlich nachweisbare Spezies sein, einschließlich von Radioisotopen, chemilumineszierenden Markern und fluoreszierenden Markern, colorimetrischen Markern, die auf Grundlage der Absorption von Licht nachgewiesen werden, spezifische Bindungsmoleküle, die Antigene und Antikörper einschließen, Bindungsproteine, wie beispielsweise Streptavidin und Haptene wie beispielsweise Biotin und Dioxigenin. Zusätzlich kann, wenn der Marker ein kleines Hapten ist, der nachweisbare Marker eine Spezies wie beispielsweise ein Enzym sein, das an eine Nukleinsäure über ein Enzym-Anti-Haptenkonjugat gebunden ist. In letzterer Hinsicht stellt die Verwendung einer Pentamerligation zur Erzeugung einer markierten Nukleinsäure einen noch weiteren Vorteil bereit. Die sperrigen Enzymmarker würden an jeder fünften Base befestigt werden, was diese in nahezu 180° Winkeln entlang der Doppelhelix von der nächsten benachbarten Markierung anordnet. Eine Betrachtung der Internukleotid-Trennung und Molekulardurchmesser von Enzymen enthüllt, dass sogar relativ große globuläre Protein in diese Markierungsdichte ohne ernsthafte sterische Überlastung bzw. Behinderung aufgenommen werden können.
Noch höhere Markerdichten können durch Einführen des Prinzips der verzweigten Marker in Verbindung mit dem Einbau regelmäßig markierter Oligomere erreicht werden, wie es in den 5 und 6 dargestellt ist. In der Praxis würden einige oder alle der Oligomere eine „Handel" oder „Griff", wie beispielsweise ein Hapten oder eine kurze Erkennungssequenz bilden, die zur Bindung an ein verzweigtkettiges Amplifikations-Multimer verwendet wird.
Alternativ können die Arme der Verzweigungen durch Ligation markierter kurzer Oligomere hergestellt werden, so dass jede der multiplen Arme nachweisbare Marker trägt. Die Synthese dicht markierter Nukleinsäuren durch Ligation markierter Oligomere kann an andere Typen der verzweigten DNA Technologie angepasst werden, wie beispielsweise an die DNA Dendrimere (Polyprobe, Philadelphia).
Die Oligonukleotid-5'-Phosphate, die in den oben offenbarten Verfahren zur Synthese, Amplifikation, Herstellung markierter Polynukleotide oder immobilisierter Polynukleotide verwendet werden, sind vorzugsweise relativ kurz. Es ist in diesen Anwendungen nicht notwendig, eine beträchtliche Fraktion der Gesamtbibliothek von Oligomeren einer vorgegebenen Länge zu verwenden, um dazu in der Lage zu sein, die erwünschte Nukleinsäure mit bekannter Sequenz zu synthetisieren. Die Größe der Oligomere kann irgendeinen geeigneten Wert annehmen, typischerweise von 2 bis ungefähr 20 Basen. Wenn eine hochdichte Markierung erwünscht ist, wird bevorzugt, dass die Oligomere weniger als ungefähr 10 Basen und vorzugsweise von ungefähr 4 bis ungefähr 8 Basen enthalten.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Sequenz (Sequenzierung) einer unbekannten einsträngigen Nukleinsäure bereitgestellt. Das Verfahren kann auf RNA, ssDNA und denaturierte dsDNA Sequenzen geeigneter Längen angewendet werden, vorausgesetzt, dass zumindest ein Anteil der Sequenz bekannt ist. Die letztere Einschränkung ist notwendig, um eine Einfangsonde/Primer entwickeln zu können.
Die Einfangsonde/Primer ist immobilisiert oder ist dazu in der Lage, an einem festen Träger, wie beispielsweise einem Kügelchen, Reagenzglas, Filter, Membran, Mikrotiterplatte oder einem Chip immobilisiert zu werden. Die Einfangsonde sollte eine ausreichende Basenlänge aufweisen, um eine effiziente Hybridisierung zu garantieren und eine einzigartige bzw. einmal vorkommende Teilsequenz auf der Testnukleinsäure repräsentieren. Diese Bedingungen werden allgemein zufriedengestellt werden mit einer Länge von zumindest 10 Basen und vorzugsweise zumindest 15 Basen. Die Einfangsonde kann an dem festen Träger in einer im Stand der Technik bekannten Art und Weise immobilisiert werden. Ein üblicherweise verwendetes Mittel besteht darin, eine Biotinmarkierung zur Bindung an einen Streptavidinbeschichteten Träger bereitzustellen. Streptavidinbeschichtete Kügelchen und Mikrotiterplatten sind kommerziell erhältlich.
Die Oligonukleotid-5'-Phosphate, die in den gemäß der hierin offenbarten Verfahren durchgeführten Sequenzanalysebestimmungen verwendet werden, sind vorzugsweise relativ kurz. Es ist notwendig, eine beträchtliche Fraktion aller möglichen Oligomere einer gegebenen Länge zu verwenden, um dazu in der Lage zu sein, lange Strecken einer Nukleinsäure mit unbekannter Sequenz zu synthetisieren. Um die Gesamtbibliothek größer handhabbar zu halten ist es wünschenswert, die Größe des Oligomers auf weniger als ungefähr 8 Basen zu beschränken. Es wird noch mehr bevorzugt, dass die Oligomere 5 oder 6 Basen enthalten. Ein weiteres Erfordernis in Ausführungsformen, die eine Sequenzanalyse einschließen, besteht darin, dass alle Oligonukleotid-5'-Phosphate dieselbe Anzahl an Basen aufweisen.
Abspaltbare Marker können irgendein molekulares Fragment sein, das dazu in der Lage ist, aus der verlängerten Sonde/Primer freigesetzt zu werden. Bevorzugte Marker sind kleine organische Moleküle mit einer Molekularmasse von weniger als ungefähr 50.000 amu. Es ist wünschenswert, dass die Marker alle einen strukturellen Typ aufweisen, der eine gemeinsame funktionelle Gruppe aufweist, so dass alle durch übliche Mittel spaltbar sind. Ein Mittel zur Bewirkung einer Spaltung ist die Thermolyse einer thermisch labilen Gruppe. Eine bevorzugte thermisch labile Gruppe zur Verwendung in spaltbaren Markern ist 1,2-Dioxetan. Es ist wohlbekannt, dass 1,2-Dioxetane eine thermische Fragmentierung des Dioxetan-Rings durchmachen, so dass zwei Carbonylfragmente erzeugt werden. Dioxetan-markierte Oligomere können hergestellt werden, die eine Carbonylverbindung durch Anbinden einer Dioxetangruppe an Ribonukleotid oder Desoxyribonukleotid freisetzen, wenn sie erhitzt sind.
Eine Bibliothek von Oligomeren würde den Satz aller möglichen Sequenzen von n Basen umfassen, die jeweils kovalent an eine einmal vorkommende Dioxetan-Komponente gebunden sind. Zur Vereinfachung der Synthese sollte die Verbindungsfunktionalität, die die Dioxetanringruppe an das Oligomer bindet, allen Elementen der Familie der markierten Oligomere gemein sein. Substituenten am Dioxetanring am Kohlenstoff, der gespalten wird, variieren unter den Elementen der Reihe der Verbindungen.
Weitere thermisch spaltbare funktionelle Gruppen wie beispielsweise nichtzyklische Peroxide sind bekannt und können verwendet werden. Die zur Thermolyse erforderliche Temperatur muss gering genug sein, so dass eine Oligonukleotidfragmentierung nicht eintritt.
Die Mittel zur Spaltung des spaltbaren Markers sind nicht auf die thermische Spaltung beschränkt. Irgendein Mittel zur kontrollierbaren Freisetzung des Markers auf der verlängerten Sonde/Primer kann verwendet werden. Andere Mittel schließen ohne Einschränkung enzymatische Reaktionen, chemische Reaktionen, die nukleophile Verdrängungen einschließen, wie beispielsweise fluorid-induzierte Silylether-Spaltung, basische oder saure hydrolytische Fragmentierungen, wie beispielsweise Esterhydrolyse oder Vinyletherhydrolyse, fotochemische Fragmentierungen, reduktive Spaltung wie beispielsweise metallinduzierte reduktive Spaltung eines Disulfids oder Peroxids, eine oxidative Spaltung von Alkenen oder Diolen, ein.
Eine beispielhafte enzymatische Reaktion zur Abspaltung eines Markers verwendet enzymatisch markierbare Dioxetane als Marker. Die enzymatische Entschützung eines geschützten phenolischen Substituenten löst die Spaltung des Dioxetanrings in zwei Carbonylverbindungen aus, wie oben dargestellt ist. Die Reaktion kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und die Geschwindigkeit der Spaltung kann durch die Menge und die Art des auslösenden Enzyms kontrolliert werden und durch die Eigenschaft der Reaktionslösung, beispielsweise durch den pH. Zahlreiche auslösbare bzw. ansteuerbare Dioxetanstrukturen sind in der Technik wohlbekannt und sind Gegenstand zahlreicher Patente. Die Spiroadamantyl-stabilisierten Dioxetane, die in US 5,707,559 offenbart sind, sind ein Beispiel, andere, die Alkyl- oder Cycloalkylsubstituenten enthalten, wie in US 5,578,253 offenbart, wären ebenfalls geeignet. Ein Verbindungssubstituent aus dem vorher erwähnten Spiroadamantyl-Alkyl oder Cycloalkylgruppen wäre erforderlich, um den Dioxetan-Marker an das Oligomer zu binden. Verbindbare Dioxetane sind im US 5,770,743 offenbart.
Chemische Verfahren zum Spalten ansteuerbarer Dioxetane sind ebenfalls wohlbekannt und wären in ähnlicher Weise in den Verfahren der Erfindung von Nutzen. Im obigen Beispiel kann X eine Trialkylsilyl-Gruppe und das auslösende Mittel bzw. der Trigger Fluorid sein. Weitere auslösende Mittel/spaltbare Gruppenpaare sind beispielsweise in den vorher erwähnten 5,707,559, 5,578,253 und 5,770,743 Patenten beschrieben.
Es existieren mehrere Wege, auf denen der Marker nachgewiesen werden kann. Jedes Verfahren oder jeder Typ an Marker stellt eine unterschiedliche Ausführungsform der Erfindung dar. In einer Ausführungsform ist der Marker fluoreszierendes Molekül, beispielsweise die fluoreszierenden Mittel FAM, JOE, ROX und TAMRA, die üblicherweise bei der automatisierten Didesoxy-Sequenzierung verwendet werden. Zahlreiche Verfahren zur Markierung von Nukleotiden und Oligonukleotiden sind in der Technik bekannt und schließen die direkte Bindung eines Markers ein (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, (Molecular Probes, Eugene, OR), 1992). Eine Markierung kann ebenfalls durch indirekte Mittel erreicht werden, wo beispielsweise ein Universal-Linker wie beispielsweise Biotin als primärer Marker bereitgestellt wird und ein mit einem Fluorescer markierter Bindungspartner für Biotin stellt den Marker bereit.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Marker eine chemilumineszierende Verbindung und die Quantität des Markers wird durch die Lichtintensität nachgewiesen, die durch auslösende Erzeugung der Chemilumineszenz von dem Marker erzeugt wird. Mehrere Arten chemilumineszierender Verbindungen sind bekannt und können als Marker verwendet werden. Repräsentative Beispiele schließen Acridiniumester und Sulfonamide, Luminol oder Isoluminolderivate und Dioxetane ein (R. Handley, H. Akhavan-Tafti, A.P. Schaap, J. Clin. Ligand Assay, 20(4) 302–312 (1997)). Ein bevorzugter chemilumineszierender Marker ist eine Acridanphosphatverbindung, die in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung des Anmelders offenbart, siehe WO-A-9966328. Die letzteren Verbindungen werden in vorteilhafter Weise wegen ihrer Stabilität, hohen Chemilumineszenzquanteneffizienz, Einfachheit der Konjugation bzw. Bindung und ihrem Vermögen verwendet, in einem breiten Bereich von Bedingungen angesteuert zu werden, einschließlich in Elektrophoresegelen. Biolumineszierende und elektrochemilumineszierende Verbindungen werden als im Umfang der nachweisbaren chemilumineszierenden Marker liegend angesehen.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Marker eine chromogene Verbindung und die Menge des Markers wird durch Lichtabsorption bzw. Extinktion nachgewiesen. Ein anderer Markertyp ist ein Radioisotop wie beispielsweise ³²P und ³⁵S, deren Gegenwart unter Verwendung einer Scintillationszählung oder einer Röntgen-Bildgebung nachgewiesen werden kann. Der Marker kann ebenfalls ein Enzym wie beispielsweise alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Luciferase und Meerrettichperoxidase sein. Die Menge des Enzyms wird durch Messung der Wirkung des Enzyms auf ein fluorogenes, chromogenes oder chemiluminogenes Substrat bestimmt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure durch Nachweisen einer markierten verlängerten Nukleinsäure, die zum Target komplementär ist, wobei das Verfahren eine einfachere Alternative als das traditionelle Southern und Northern Blotting ist. Die Herstellung der markierten verlängerten komplementären Nukleinsäure wird durch Ligation einer Vielzahl markierter kurzer Oligomere auf eine Sonde/Primer durchgeführt, die an das Target hybridisiert ist. Die Verlängerung wird durch das Denaturieren einer elektrophoretischen Auftrennung und den Nachweis der markierten Spezies gefolgt. Das Vorhandensein des markierten verlängerten Primers weist auf das Vorhandensein des Targets hin, weil die Ligation nur stattfindet, wenn der Primer an das Target hybridisiert wird. Es wird bevorzugt, dass der Marker im Gel nachweisbar ist. Geeignete Marker schließen Acridanalkene ein, wie in WO-A-9966328 beschrieben, die durch Chemilumineszenz nachgewiesen werden kann und fluoreszierende Mittel, die einfach in Gel nachweisbar sind. In dieser Ausführungsform wird kein Blotting durchgeführt. Wenn der Marker derart ist, dass der Nachweis im Gel nicht möglich ist, wird ein Blotten auf eine Membran durchgeführt und danach wird der Nachweis des Markers auf der Membran durchgeführt. In keinem Fall ist die Hybridisierung auf der Membran, die Antikörperbindung, die Enzym-Konjugatsbindung, Substrataddition oder andere üblicherweise verwendeten Verfahren notwendig.
In einer alternativen Ausführungsform dieses Verfahrens bleibt die markierte verlängerte komplementäre Nukleinsäure an das Target hybridisiert und nach Elektrophorese wird die Bande bei dem geeigneten Molekulargewicht in der oben beschriebenen Weise nachgewiesen. Diese Art und Weise kann wünschenswert sein, wenn eine genaue Molekulargewichtsinformation von Nöten ist. Es ist in diesem Verfahren bequemer, im wesentlichen die vollständige Bibliothek möglicher 5'-Phosphate von n Basen bereitzustellen, wenn das Target viel länger als die Sonde/Primer ist. In Fällen, in denen die Targetsequenz bekannt ist und wo dessen Länge es praktischer macht, kann es bevorzugt sein, die Untergruppe der Oligonukleotid-5'-Phosphate vorher auszuwählen.
Eine noch weitere Ausführungsform umfasst die Bereitstellung eines geeigneten fluoreszierenden Donors als Marker auf einer Sonde/Primer und eines geeigneten fluoreszierenden Akzeptors als Marker auf den Oligomeren. Es ist nicht notwendig, jedes Oligomer zu markieren. Die Ligation wird auf hybridisiertem Primer durchgeführt, um einen verlängerten Primer zu bilden, der einen fluoreszierenden Donor und ein oder mehrere fluoreszierende Akzeptormarker trägt. Unter geeigneten Bedingungen, d. h. wenn Donor und Akzeptor ausreichende spektrale Überlappungen aufweisen, damit der Energietransfer möglich ist und die räumliche Trennung zwischen Donor und Akzeptoren innerhalb der Försterdistanz liegen, kann eine Energieübertragung bzw. Energietransfer zwischen fluoreszierenden Stoffen innerhalb des verlängerten Primers eintreten. Die Bestrahlung des verlängerten Primers in einer Wellenlänge, die von dem fluoreszierenden Donor am Primer absorbiert wird, hat eine Fluoreszenz aus dem Akzeptor auf dem verlängerten Anteil zur Folge. Dieses Verfahren kann deswegen als Basis für einen homogenen Assay zum Nachweis einer Targetnukleinsäure dienen, weil das Vorhandensein eines Targets erforderlich ist, damit eine Ligation eintritt und dadurch die Fluorophore in Energietransferdistanz bringt.
Ein weiteres Verfahren zum Nachweisen einer Targetnukleinsäure, das auf der Ligation einer Vielzahl markierter Oligomere basiert, umfasst die Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs als Marker. Es ist bekannt, dass bestimmte Farbstoffe fluoreszierend werden, wenn sie innerhalb der Doppelhelix oder doppelsträngigen Nukleinsäure interkaliert sind. Ein Beispiel ist die weithin verwendete Verbindung Ethidiumbromid.
Als optionaler Schritt kann Agarose der Reaktion zugesetzt werden, um die Fluoreszenz zu erhöhen. In Abwesenheit eines Targets tritt eine Ligation nicht ein und so ist der Nachweis einer Fluoreszenz der Beweis für das Vorhandensein des Targets und ist zusätzlich ein Beweis dafür, dass der Primer ausreichend mit dem Target zur Hybridisierung komplementär war. Die Sammlung an Oligomeren kann die volle Bibliothek aller möglichen Sequenzen sein oder eine Untergruppe, die vorher ausgewählte Elemente enthält, wenn die Targetsequenz bekannt ist.
Die Fraktion markierter Oligomere zur Verwendung kann empirisch bezüglich des erwünschten Grades der Nachweissensitivität durch Verwendung eines Bereiches unterschiedlicher Markierungs-Dichten ausgewählt werden. Es kann wünschenswert sein, abhängig von der Größe der Oligonukleotid-5'-Phosphate, die Fraktion der markierten Oligomere zu begrenzen, um eine Selbstlöschung der Fluoreszenz zu vermeiden.
Synthese der Oligomere – Oligonukleotide werden leicht unter Verwendung von Standardverfahren der Synthese synthetisiert, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind, beispielsweise unter Verwendung einer Phosphoramidatchemie. Die Phosphorylierung von Oligonukleotiden wird unter Verwendung einer Polynukleotidkinase von ATP oder durch chemische Verfahren der Phosphorylierung durchgeführt, wie in L.A. Slotin, Synthesis, 737–752 (1977); T. Horn, M. Urdea, Tetrahedon Lett., 27, 4705–4708 (1986) beschrieben. Ein Kit bzw. Bausatz zum Durchführen der 5'-Phosphorylierung ist kommerziell erhältlich (Phosphat-ON, Clontech, Palo Alto, CA).
Verfahren zur automatisierten Synthese von Oligonukleotiden sind in der Technik wohlbekannt und in üblicher kommerzieller Verwendung. Ein übliches Verfahren verwendet einen festen Träger der Immobilisierung und eine automatisierte Reagenzhandhabung, um die Nukleotide sequentiell zuzusetzen. Alle Additions-, Blockierungs- und Endblockierungsschritte erfolgen unter Computerkontrolle. Solche Instrumente sind von mehreren kommerziellen Zulieferern erhältlich, beispielsweise Applied Biosystems, CA (Model 392 und 394). Automatisierte Instrumente zum Transfer flüssiger Reagenzien und Proben können unter Computerkontrolle unter Verwendung von Laborrobotern durchgeführt werden, wie sie beispielsweise kommerziell erhältlich sind (Perkin-Elmer, Model 800 Katalysator, Beckman Instruments Biomek). Neuere Techniken zur Hochgeschwindigkeitssynthese oder zur Synthese großer Anzahlen von Oligonukleotiden verwenden Photolithographietechniken oder Tintenstrahltechnologie zur raschen und präzisen Abgabe der Reagenzien und Reaktanten.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung umfasst das Annealing eines Primer Oligonukleotid 5'-Phosphats an eine einsträngige Matrize und, in der oben offenbarten Weise, die Ligierung einer Bibliothek von Oligomeren, um den Primer von beiden Enden her zu verlängern, um den Matrizenstrang zu duplizieren. Das Verfahren ist in einem Verfahren von Nutzen, um eine einsträngige Matrize doppelsträngig zu machen, um diese zu klonen. Dies würde in Verfahren zum Isolieren verwandter Gene oder Genfamilien Anwendung finden.
In einem beispielhaften Verfahren wird ein Primer Oligonukleotid an einen Matrizenstrang in Gegenwart einer Bibliothek aller möglichen Kombinationen von Pentameren, einer DNA Ligase und eines geeigneten Reaktionspuffers hybridisiert. Pentamere, die für den Matrizenstrang komplementär sind und in exakter Auflistung mit den 5' und 3'-Enden des Primeroligonukleotids werden einem Annealing unterzogen und werden aufeinanderfolgend durch Wirkung der DNA Ligase ligiert. Der Matrizenstrang wird dadurch im wesentlichen kopiert oder doppelsträngig gemacht. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, Target-Matrizen in einem Gemisch aus Nukleinsäuresträngen zu verwenden und doppelsträngige Nukleinsäuren zum Klonieren herzustellen, unter Verwendung von Klonierungsvektoren und Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind.
BEISPIELE
Beispiel 1. Allgemeines Verfahren
Die in diesem Experiment verwendete Matrize war ein PCR amplifiziertes Produkt (200 bp), der Exon 10-Region des zystischen Fibrose-Transmembranregulator- (CFTR) Gens. Die PCR amplifizierte DNA des CFTR Gens wurde entweder durch Laufenlassen über eine Säule (Qiaquick PCR purification kit, Qiagen, Santa Clarita, CA) oder durch Ethanolpräzipitation aufgereinigt. Die DNA wurde in destilliertem Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 0,5 μg/μL resuspendiert. Pentamere, die eine 5'-Phosphatgruppe tragen und Primer wurden kommerziell bezogen (Oligos Etc., Wilsonville, OR):
Die Primer und Pentamere wurden so entwickelt, dass sie entweder zum Sense- oder Antisense-Strang der verwendeten Matrize komplementär waren. Die Länge des in diesem Experiment verwendeten Primers bewegten sich von 21 bis 26 Nukleotiden. Die Pentamere wurden in einer solchen Weise entwickelt, dass das erste Pentamer sich unmittelbar danach am 3' Ende des Primers an die Matrize annealt bzw. wieder verbindet. Eine Hybridisierung des Primers und der Pentamer an die Matrize gefolgt von Ligation durch T4 DNA Ligase hat eine back to back-Ligation an den 5'–3' Kreuzungen zur Folge. Um den Nachweis der ligierten Primer-Pentamerprodukte zu ermöglichen wurden Biotin-dUTP markierte Pentamere (an der inneren dTTP Position) verwendet.
Eine Hybridisierung des Primers und der Pentamere an die Matrize und ihre Ligation aneinander wurde in einem dreistufigen Verfahren erreicht. Zunächst wurde das Matrizen-Primer-Pentamergemisch auf 94 °C erhitzt und für fünf Minuten gehalten, um die Denaturierung der doppelsträngigen Matrize zu ermöglichen. Das Gemisch wurde auf 60 °C oder 65 °C abgekühlt, abhängig von der Größe und Basenzusammensetzung des Primers, um den Primer für zwei Minuten an der Matrize einem Annealing zu unterwerfen. Zuletzt wurden die Reagenzgläser auf 16 °C abgekühlt. Nach ungefähr zwei Minuten bei 16 °C wurden Ligationspuffer (66mM Tris HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 66 μM ATP, Amersham) und T4 DNA Ligase, 1 U (Amersham, 1:10 Verdünnung) zugesetzt und bei 16 °C für zwei Stunden ligiert. Die Ligationsreaktion wurde durch Zusatz 1/10 Volumens Beladungsfarbstoff gestoppt (0,01 Xylencyanol und 0,01% Bromphenolblau, und 0,01 M EDTA in entionisiertem Formamid).
Die Ligationsreaktionen wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisiert, zusammen mit biotinmarkierten Oligonukleotidgrößen-Markern. Die DNA wurde auf eine Nylon-Membran kapillar-übertragen, mit Anti-Biotin-Antikörper-HRP Konjugat gebunden und durch Umsetzen mit Lumigen PS-3 (ein chemilumineszierendes HRP Substrat) und durch Aussetzen gegenüber einem Röntgenfilm nachgewiesen. Die Größe des ligierten Produktes variiert abhängig von der Anzahl der Pentamere, die an den Primer ligiert sind.
Beispiel 2. Bestimmung der optimalen Konzentration der Matrize, des Primers und der Pentamere.
Matrize: Ein 200 by PCR Produkt von CFTR Exon 10 (siehe die Anlage für die Matrizen DNA Sequenz) wurde durch PCR Amplifikation unter Verwendung eines Satzes Sense (5' ACTTCACTTCTAATGATGATTATG 3') (Sequenz ID NO: 1) und Antisense (5' CTCTTCTAGTTGGCATGCTTTGAT 3') (Sequenz ID NO: 2) Primer gewonnen.
Ein 26 Basenoligonukleotid, komplementär zum Sense-Strang der Matrizen DNA wurde als Primer (5' AGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCA 3') (Sequenz ID NO: 3) entwickelt.
Pentamere: Sechs 5-Basen lange Oligonukleotid-5'-Phosphate, komplementär zum Sense-Strang unmittelbar benachbart dem 3'-Ende des Primers wurden hergestellt. Das 5'-Ende des ersten Pentamers richtet sich unmittelbar benachbart dem 3'-Ende des Primers aus, das 5'-Ende des zweiten Pentamers richtet sich unmittelbar benachbart dem 3'-Ende des ersten Pentamers aus usw. Um die Ligation zu vereinfachen wurde das 5'-Ende des Pentamers phosphoryliert. Um den Nachweis der Ligationsprodukte zu ermöglichen wurden die Pentamere 1 und 3 mit Biotin-dUTP einer zentralen dTTP Position markiert und das letzte Pentamer wurde mit Biotin am 3' Ende markiert. Die Pentamere waren wie folgt:
Pentamer 1 : 5' PO₄-GTTTT 3'
Pentamer 2 : 5' PO₄-CCU*GG 3'U* = U-Biotin
Pentamer 3 : 5' PO₄-ATTAT 3'
Pentamer 4 : 5' PO₄-GCCU*G 3'
Pentamer 5 : 5' PO₄-GCACC 3'
Pentamer 6 : 5' PO₄-ATTAA 3'-Biotin.
Die Ligationen wurden unter Verwendung von T3 DNA Ligase und Ligationspuffer (Amersham) gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Ligationsbedingungen durchgeführt. Die Ligationen wurden in einem Volumen von 20 μL durchgeführt. Die Menge an Matrize wurde konstant bei ungefähr 1 μg pro Reaktion gehalten. Die Menge an Primer wurde von 100 ng auf 1 pg zwischen diesen Reaktionen variiert. Die Menge jedes Pentamers variierte von 2 ng bis 0,2 pg in jeder Reaktion. Die Reaktion mit 1 μg Matrize, 100 ng Primer und 2 ng jedes Pentamers enthielt ungefähr äquimolare Konzentrationen der Matrize, des Primers und der Pentamere. Die Primer und Pentamere wurden systematisch variiert, um die niedrigste Menge an nachweisbarem Ligationsprodukt zu bestimmen.
Die Ligationsreaktionen wurden elektrophoretisiert, auf eine Nylonmembrankapillare transferiert, mit Anti-Biotin-Antikörper-HRP Konjugat gebunden und mit Lumigen PS-3 wie in Beispiel 1 beschrieben nachgewiesen. Ein volle Länge Primer-Pentamer-Ligationsprodukt der erwarteten Größe (56 bp) wurde in den Ligationsreaktion nachgewiesen, die 100 ng Primer und 20 ng jedes Pentamers (0,6 μM) enthielt. Niedere Konzentrationen des Primers und der Pentamere in der Ligationsreaktion ergab eine sehr geringe Menge oder kein nachweisbares Ligationsprodukt unter diesen Bedingungen.
Beispiel 3. Ligationen mit variierenden Pentameranzahlen.
Um zu zeigen, dass die Pentamere sequentiell an den Primer ausgehend vom ersten Primer (unmittelbar stromabwärts des Primers) ligiert werden, wurden Ligationen unter Verwendung der Matrize, des Primers und von Pentameren aus Beispiel 2 durch Steigerung der Anzahl der Pentamere in jeder Reaktion durchgeführt. Alle Reaktionen enthielten äquimolare Konzentrationen (0,6 μM) der Matrize, des Primers und jedes Pentamers. Die Ligationen wurden wie oben beschrieben durchgeführt und die Produkte durch Bindung mit Anti-Biotin HRP Antikörper und durch Umsetzen mit Lumigen PS-3 Substrat nachgewiesen.
Wie erwartet nahm die Größe des Ligationsproduktes mit dem Zusatz jedes Pentamers um fünf Basen zu, ausgehend vom ersten Pentamer usw. Es existierte kein Ligationsprodukt in Abwesenheit des ersten Pentamers und mit dem Rest der Pentamere in der Reaktion wurde das Erfordernis des Primers und die Spezifität der Pentamer für die Ligation zu deren Eintritt demonstriert. In einer Ligationsreaktion, die die ersten vier Pentamere enthielt, existierten zwei Banden des ligierten Produktes, von denen eine die erwartete Größe aufwies und die andere die erwartete Größe aufwies, wenn alle fünf Pentamere in der Reaktion vorlagen. Ein Vergleich der Sequenzen der Pentamere zeigte eine einzige Basendifferenz zwischen den dritten und fünften Pentameren. Das dritte Pentamer scheint an der fünften Pentamerposition zu hybridisieren, wenn das vierte Pentamer in der Reaktion vorliegt.
In Reaktion 1 wurde das Produkt, das aus dem Primer alleine bestand, mittels eines Markers am Primer nachgewiesen.
Beispiel 4. Konkurrenz durch einen Pentamersatz „aus der Liste".
Dieses Beispiel demonstriert, dass die Ligation eines Satzes Pentamere an einen Primer in einer direkt aneinanderliegenden Kette ausgehend vom 3'-Ende des Primers durch Vorhandensein eines zweiten Satzes Pentamere nicht beeinträchtigt wird, die ebenfalls zur Matrize komplementär sind und sich ebenfalls direkt aneinanderliegend ausrichten, jedoch eine Position „eine Base außerhalb" vom 3'-Ende des Primers beginnt. Sowohl die korrekten Pentamer-Sätze (1–8) als auch die Ein-Basen-außerhalb Pentamere (1a–5a) wurden in die Reaktion zusammen mit der Matrize und dem Primer während der Denaturierung, dem Annealing bei 60°C und die Ligationsschritten eingeschlossen. Die Ligationsreaktionen enthielten äquimolare (0,6 μM) Konzentrationen an Matrize, Primer und jedem der Pentamere.
Primer (5' ATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCAT 3') (Seq. ID NO:4).
Pentamer 1 : 5' PO₄-TCU*GT 3'
Pentamer 1a : 5' PO₄-CTGTT 3'
Pentamer 2 : 5' PO₄-TCTCA 3'
Pentamer 2a : 5' PO₄-CTCAG 3'
Pentamer 3 : 5' PO₄-GTTTU* 3'
Pentamer 3a : 5' PO₄-TTTTC 3'
Pentamer 4 : 5' PO₄-CCU*GG 3'
Pentamer 4a : 5' PO₄-CTGGA 3'
Pentamer 5 : 5' PO₄-ATTAT 3'
Pentamer 5a : 5' PO₄-TTATG 3'
Pentamer 6 : 5' PO₄-GCCU*G 3'
Pentamer 6a : 5' PO₄-CCTGG 3'
Pentamer 7 : 5' PO₄-GCACC 3'
Pentamer 8 : 5' PO₄-ATTAA 3'-Biotin
Die Targetregion der Matrize umfasst die folgende Sequenz: 3' TAA TTC GTG TCA CCT TCT TAA AGT AAG ACA AGA GTC AAA AGG ACC TAA TAC GGA CCG TGG TAA TT 5' (Seq. ID NO: 5).
Sogar in Gegenwart eines Satzes von sechs konkurrierenden Pentameren waren die gebildeten Ligationsprodukte das Ergebnis einer Ligation der „korrekten" Pentamere, die an den Primer ligiert wurden. Reaktion 10 bestätigte, dass das Vorhandensein von Primer für das Auftreten einer Ligation erforderlich ist. Die Ein-Basen-Außerhalb Pentamere schienen die Ligation der richtigen Pentamere nicht zu stören.
Beispiel 5. Konkurrenz von markiertem „Aus der Liste" Pentamer.
Das Experiment wie in Beispiel 4, jedoch Pentamer 1a, wurde biotinyliert. Dies lieferte die Gelegenheit, die Bildung jeglicher Ligationsprodukte aus dem Satz der Pentamere 1a–6a direkt zu beobachten. Keine Ligationsprodukte waren aus dem Satz der Ein-Basen-Außerhalb Pentamere zu beobachten.
Beispiel 6. Ligationsexperimente unter Verwendung einer JH Stromabwärts-Matrize.
Primer-gerichtete Pentamerligationsprodukte wurden ebenfalls unter Verwendung einer 700 by DNA stromabwärts der Immunglobulin schwere Kette-Verbindungsregion (JH) als Matrize beobachtet, die in einen Plasmidvektor kloniert wurde. Die stromabwärts gelegene JH-Region wurde durch PCR amplifiziert, in einen Plasmidvektor kloniert, der darauf mit Eco RI digeriert wurde, um eine ausreichende Menge der Matrizen-DNA zu erhalten. Der Restriktionsverdau wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und die DNA Bande von Interesse unter Verwendung eines Gelextraktionskits (Qiagen) extrahiert. Die DNA wurde in destilliertem Wasser in einer Konzentration von ungefähr 0,5 μg/μl resuspendiert.
Der Primer und die Pentamere, die mit dieser Matrize verwendet wurden, sind unten dargestellt:
21mer Primer: 5' GAAACCAGCTTCAAGGCACTG 3' (Seq. ID NO: 6)
Pentamer 1 : 5' Phosphate AGGU*C
Pentamer 2 : 5' Phosphate CU*GGA 3'
Pentamer 3 : 5' Phosphate GCCU*C 3'
Pentamer 4 : 5' Phosphate CCU*AA 3'
Pentamer 5 : 5' Phosphate GCCCC 3'-Biotin
Die Ligationen wurden mit 500 ng Matrize, 100 ng Primer und 20 ng jedes Pentamers in jeweils 20 μL Ligationsreaktion durchgeführt. Die Anzahl an Pentameren wurde schrittweise in jeder aufeinanderfolgenden Ligationsreaktion erhöht, um zu zeigen, dass die Größe des Ligationsproduktes in 5 Basen-Schritten zunahm, mit jedem Zusatz eines Pentamers.
Nach Durchführen der Ligationsreaktionen gemäß des allgemeinen Verfahrens von Beispiel 1 existierte eine 5-Basenschritt-Zunahme in der Größe des Ligationsproduktes mit jedem Zusatz aufeinanderfolgender Pentamere. Es existierten zwei Banden in der Ligationsreaktion, die die ersten vier Pentamere enthielten, wobei die obere Bande intensiver als die untere Bande war. Die Größe der oberen Band war dieselbe als wenn alle fünf Pentamere für die Ligation verwendet wurden. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass eine Sequenzähnlichkeit zwischen den dritten und fünften Pentameren besteht und so wurde das dritte Pentamer ebenfalls in der fünften Pentamerposition ligiert.
Beispiel 7. Ligation bei verschiedenen Temperaturen.
Ligationen unter Verwendung der Matrize, des Primers und der ersten vier Pentamere aus Beispiel 6 wurden bei 30 °C, 37 °C, 40 °C und 45 °C durchgeführt, um die Wirkung der Ligationstemperatur auf die Unterscheidung von Nicht-Übereinstimmungen zu überprüfen. Die Matrizen-, Primer- und Pentamerkonzentrationen waren dieselben wie im vorhergehenden Experiment. Parallele Reaktionen wurden durchgeführt und die relative Menge der vier Pentamer und fünf Pentamer Verlängerungsprodukte wurde festgestellt. Bei einer Ligationstemperatur von 30 °C war die korrekte Größe und die unspezifischen Ligationsprodukte von derselben Intensität. Eine größere Menge des Ligationsprodukts mit richtiger Menge wurde bei Ligationstemperaturen von 37 °C und 40 °C nachgewiesen. Bei 45 °C war die nachgewiesene Menge an Ligationsprodukt mit korrekter Größe vermindert.
Beispiel 8. Ligation unter Verwendung von Oktameren.
Ligationen von Oktameren mit 5' Phosphat und einer internen Biotinmarkierung an einen 23mer Primer, der für die pUC18 Plasmidmatrize spezifisch ist, wurden unter Verwendung von T4 DNA Ligase (Amersham), Taq DNA Ligase (New England Biolabs) und Ampligase^TM (Epicenter Technologies, Madison, WI), und einer NAD abhängigen thermostabilen Ligase durchgeführt, jeweils unter Verwendung ihrer jeweiligen Ligationspuffer. In diesen Experimenten wurden 100 bis 800 ng Eco RI linearisierte Plasmidmatrize verwendet. Die Konzentrationen des Primers und der Oktamere waren 12 pmol pro Reaktion.
In Experimenten mit T4 DNA Ligase und Taq DNA Ligase wurde zuerst die Matrize, der Primer und das Pentamergemisch bei 94 °C für 5 Minuten erhitzt, für 2 Minuten zum Annealing des Primers an die Matrize auf 60 °C abgekühlt und weiter auf 16 °C (für die T4 DNA Ligase) oder 45 °C (für Taq DNA Ligase) für 2 Minuten abgesenkt. Darauf wurden die jeweiligen Ligationspuffer und Enzyme (1 U/Reaktion) zugesetzt und für 2 Stunden ligiert.
Zur Ligation mit Ampligase wurde das Ligationsgemisch, das die Matrize, den Primer und die Oktamere enthielt (die gleiche wie oben) für 5 Minuten auf 94 °C erhitzt, darauf wurden Zyklisierungstemperaturen von 94 °C für 5 Minuten und 45 °C für 5 Minuten (35 Zyklen) zur Ligation verwendet. In einem anderen Experiment unter Verwendung der Ampligase wurde ein kurzes PCR Produkt von pUC18 (100 bp) als Matrize verwendet und die Ligationsbedingungen waren 94 °C für 1 Minute, 55 °C für 1 Minute und 15 °C für 5 Minuten für insgesamt 20 Zyklen.
Die Ligationsprodukte wurden auf einem 8% PAGE-Urea Gel elektrophoretisiert, auf eine positiv geladene Nylonmembran halb-trocken geblottet (Hoefer TE90 Blotter), UV vernetzt, mit Anti-Biotin-Antikörper konjugiert an HRP inkubiert und mit Lumigen PS-3 Substrat nachgewiesen.
Mit T4 DNA Ligase und Ampligase unter Verwendung des linearisierten pUC18 Plasmids wurde ein Ligationsprodukt der erwarteten Größe nachgewiesen. Jedoch erschien unter den verwendeten Bedingungen die Ampligase viel weniger effizient als die T4 DNA Ligase, wie aus den Mengen des nachgewiesenen Ligationsproduktes ersichtlich wurde und die Taq DNA Ligasereaktion ergab kein nachweisbares Ligationsprodukt. Unter Verwendung des kurzen pCR Produktes von pUC18 erzeugte die Ampligaseligation mehr Ligationsprodukt als die Verwendung des volle Länge pUC18.
Beispiel 9. Bidirektionale Ligation.
In diesem Beispiel wurde ein 5'-phosphorylierter Primer an beiden Enden an einen Satz Pentameren mit 5'-Phosphat unter Verwendung einer T4 DNA Ligase ligiert. Eine CFTR PCR Produktmatrize, Primer und Pentamergemisch wurde für 5 Minuten auf 94 °C erhitzt, der Primer für 5 Minuten bei 65 °C einem Annealing unterzogen und die Pentamere für 2 Stunden bei 16 °C ligiert. Der Ligationspuffer und das Enzym wurden zugesetzt, nachdem das Reaktionsgemisch bei 16 °C für 2 Minuten vorlag. Das Reaktionsgemisch wurde elektrophoretisiert, geblottet und wie in Beispiel 8 nachgewiesen. Die Pentamere wurden an den Primer in sowohl der 5' als auch 3' Richtung vom Primer ligiert. Produktionsbanden der beobachteten Größe konnten nur durch Ligation jedes der Pentamere erzeugt werden. Die Signale der Ligationsprodukte, die sich aus der Ligation der Pentamer am 5'-Ende des Primer ergaben, waren weniger intensiv als solche, die am 3'-Ende des Primers ligiert waren. Dies könnte entweder auf Unterschiede in der Ligationseffizienz in zwei Richtungen oder in der Markierung mit Biotin der beiden Pentamersätze zurückzuführen sein.
Beispiel 10. Isothermische Ligation bei verschiedenen Temperaturen.
Die Ligation eines Satzes 5-phosphorylierter Oktamere an einem matrizegebundenen Primer wurde bei einer konstanten Temperatur ohne vorheriges Erhitzen und Reannealing des Primers an die Matrize durchgeführt. Alle Komponenten der Ligationsreaktion – die Matrize, der Primer, die Oktamere, der Ligationspuffer und die Ligase wurden bei Raumtemperatur zugesetzt und bei entweder 25 °C, 30 °C, 37 °C oder 45 °C für 2 Stunden ligiert. Linearisiertes pUC18 (EcoRI) wurde bei Konzentrationen im Bereich von 10 ng bis 800 ng als Matrize für Ligationen unter Verwendung einer 74 DNA Ligase verwendet. Die Primer und Oktamerkonzentrationen, die verwendet wurden, waren 12 pmol in jeder Reaktion.
Isothermische Ligationen (37 °C, 45 °C, 55 °C, 65 °C) wurden ebenfalls mit TaqDNA Ligase, Ampligase und Pfu DNA Ligase unter Verwendung ihrer jeweiligen Ligationspuffer durchgeführt. Mit T4 DNA Ligase war das Ligationsprodukt bei allen verwendeten isothermischen Bedingungen nachweisbar. Bei 37 °C erzeugten nur 10 ng der Matrize ein nachweisbares Ligationsprodukt. Größere Mengen der Matrize ergaben Ligationsprodukt mit intensivem Signal.
Keine der anderen Ligasen erzeugte unter den isothermischen Bedingungen irgendein nachweisbares Ligationsprodukt.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Synthetisieren eines Stranges einer Nukleinsäure, der zu zumindest einem Teil einer einsträngigen Zielnukleinsäure-Matrize komplementär ist, das folgendes umfasst: (a) Bereitstellen eines Reaktionsgemisches, das die Matrize, einen Primer mit zumindest 15 Basen, der zu einem Teil der einsträngigen Zielnukleinsäure-Matrize komplementär ist und eine Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten, die jeweils nicht mehr als 10 Basen aufweisen, umfasst; (b) Hybridisieren des Primers mit der Matrize unter Bedingungen, die eine stabile Hybridisierung des Primers, jedoch nicht eine stabile Hybridisierung der Oligonukleotid-5'-Monophosphate erlauben, um ein Primer-Matrizen-Hybrid mit einer einsträngigen Region und einer doppelsträngigen Region zu bilden; (c) Ligieren an das Primer-Matrizen-Hybrid der Reihe nach zumindest einige der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten in einer zusammenhängenden Weise an den Primer in einem kontinuierlichen Verfahren unter Bedingungen, die eine stabile Hybridisierung des Primers, jedoch nicht eine stabile Hybridisierung der Oligonukleotid-5'-Monophosphate erlauben, um die doppelsträngige Region zu verlängern und dadurch einen Nukleinsäurestrang zu synthetisieren, der dem Teil der Matrize komplementär ist, wobei die Ligation der Oligonukleotid-5'-Monophosphate nur in Gegenwart eines hybridisierten Primers eintritt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Menge des Teils einer doppelsträngigen Nukleinsäure mit einem ersten Strang und einem zweiten Strang amplifiziert wird, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Bereitstellen der doppelsträngigen Nukleinsäure, eines ersten Primers mit zumindest 15 Basen, der einem Bereich des ersten Stranges komplementär ist, eines zweiten Primers mit zumindest 15 Basen, der einer Region des zweiten Stranges komplementär ist, wobei die ersten und zweiten Regionen den Teil der doppelsträngigen Nukleinsäure definieren, der amplifiziert werden soll, und einer Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten, die jeweils aus nicht mehr als 10 Basen bestehen, in einem Reaktionsgemisch; (b) Trennen der ersten und zweiten Stränge der doppelsträngigen Nukleinsäure; (c) Hybridisieren der ersten und zweiten Primer mit den getrennten Strängen; unter Bedingungen, die eine stabile Hybridisierung der Primer, jedoch nicht eine stabile Hybridisierung der Oligonukleotid-5'-Monophosphate ermöglichen; (d) Ligieren an jeden der hybridisierten ersten und zweiten Primer zumindest einige der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten in einer zusammenhängenden Weise in einem kontinuierlichen Verfahren unter Bedingungen, die eine stabile Hybridisierung der Primer, jedoch nicht eine stabile Hybridisierung der Oligonukleotid-5'-Monophosphate ermöglichen, um die ersten und zweiten Primer zu verlängern, wobei die Ligation nur in Gegenwart der hybridisierten Primer eintritt, wodurch eine doppelsträngige Nukleinsäure erzeugt wird; und (e) Wiederholen der Schritte (b) bis (d), um die Menge des Teils der doppelsträngigen Nukleinsäure zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Ligation mittels eines Ligase-Enzyms durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligation durch die T4 DNA Ligase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Ligation durch ein Ligase-Enzym durchgeführt wird, das thermostabil ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes der Oligonukleotid-5'-Monophosphate dieselbe Anzahl an Basen enthält und die Anzahl an Basen von 2–6 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Anzahl der Basen 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei jedes der Oligonukleotid-5'-Monophosphate dieselbe Anzahl von Basen enthält und die Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten ein Satz Oligonukleotid-5'-Monophosphate ist, der so vorgewählt ist, dass er nur solche Oligomere enthält, die zum Replizieren des Stranges notwendig sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Sequenz der synthetisierten Nukleinsäure im voraus bekannt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleotid-5'-Monophosphate dieselbe Anzahl von Basen enthalten und die Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten eine Bibliothek aus Oligonukleotid-5'-Monophosphaten ist, die zumindest 50% aller möglichen Oligonukleotid-5'-Monophosphate derselben Länge umfassen, die A, C, G und T enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Synthese des Stranges der Nukleinsäure unidirektional erfolgt und durch Ligation an das 3' Ende der Primers fortschreitet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Synthese des Stranges der Nukleinsäure unidirektional erfolgt und durch Ligation an das 5' Ende des Primers fortschreitet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Primer oder zumindest einer der Primer eine 5' Phosphat-Gruppe enthält und die Synthese des Stranges oder jedes Nukleinsäurestranges bidirektional erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Primer an der festen Phase immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem nach Schritt (c) die Oligonukleotide, die nicht ligiert sind, entfernt werden und das Produkt, das einen doppelsträngigen Bereich aufweist, zur Entfernung der Matrize und zur Erzeugung eines immobilisierten einsträngigen Nukleinsäureproduktes denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Primer in einer Lösung vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, 14, 15 oder 16, wobei zumindest einige der Oligonukleotid-5'-Monophosphate eine nachweisbare Markierung aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei alle Oligonukleotid-5'-Monophosphate markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei jedes der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten 5 Basen enthält.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei jedes der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten eine identische Länge aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei zumindest einige der Vielzahl von Oligonukleotid 5'-Monophosphaten eine unterschiedliche Anzahl an Basen als andere der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten enthalten.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Ligation mittels eines Ligase-Enzyms durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Ligase-Enzym aus T4 Ligase, T7 Ligase, Tth Ligase, Taq Ligase und E. coli DNA Ligase ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Ligase-Enzym T4 DNA Ligase ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei jedes markierte Oligonukleotid-5'-Monophosphat mit derselben Markierung markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei jedes markierte Oligonukleotid-5'-Monophosphat mit einem Oligonukleotid-5'-Monophosphat spezifischen Marker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei jedes Oligonukleotid-5'-Monophosphat einen Marker enthält.
Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei der nachweisbare Marker aus Radioisotopen, chemilumineszierenden Markern, fluoreszierenden Markern, colorimetrischen Markern, Enzymen, Bindungsproteinen, Antigenen, Antikörpern und Haptenen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei jeder Marker ein Oligonukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der nachweisbare Marker aus dem synthetisierten komplementären Nukleinsäurestrang vor dem Nachweis abgespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Nachweis der gespaltenen Marker durch Bestimmung der Molekülmasse der abgespaltenen Marker durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 18, das weiterhin den Einbau zumindest eines nicht verlängerbaren Oligomers umfasst, das die Synthese des Nukleinsäurestranges terminiert.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei jedes der nicht verlängerbaren Oligomere aus Oligomeren, die eine Didesoxybase am 3' Ende aufweisen, aus Oligomeren, die eine blockierte 3'-OH Gruppe am 3' Ende aufweisen und aus Oligomeren ausgewählt ist, denen eine Phosphat Gruppe am 5' Ende fehlt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Synthese des Nukleinsäurestranges, der in Schritt (d) synthetisiert wird, in einer vorherbestimmen Position durch Ausschließen aus der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten zumindest eines Oligonukleotid-5'-Monophosphates, das zur einsträngigen Nukleinsäure-Matrize komplementär ist und das eine Sequenz aufweist, die zur Verlängerung der doppelsträngigen Region notwendig ist, beendet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Synthese des Stranges der Nukleinsäure unidirektional erfolgt und durch Ligation an das 3' Ende des Primers fortschreitet.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Primer eine 5' Phosphat Gruppe enthält und die Synthese des Stranges der Nukleinsäure unidirektional erfolgt und durch Ligation an das 5' Ende des Primers fortschreitet.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Primer eine 5' Phosphat-Gruppe enthält und die Synthese des Nukleinsäurestranges von beiden Enden des Primers her fortschreitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 14, 15 oder 16, bei dem die einsträngige Zielnukleinsäurematrize ein Analyt ist, zumindest einige der Oligonukleotid-5'-Monophosphate markiert sind und bei dem nach Schritt (c) alle nicht ligierten Oligonukleotide entfernt werden und die markierte Nukleinsäure von Schritt (c) nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 38, wobei die einsträngige Nukleinsäurematrize ein Segment bekannter Sequenz aufweist, wobei der Primer zu einem Teil des Segmentes bekannter Sequenz komplementär ist und die Vielzahl markierter Oligonukleotid-5'-Monophosphate einen Satz markierter Oligonukleotid-5'-Monophosphate umfasst, der so ausgewählt ist, dass er zu einem Teil des Segments einer bekannten Sequenz der Matrize, die an einen Primer angrenzt, komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jedes der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten 5 Basen enthält.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jedes der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten eine identische Länge aufweist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei einige der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten eine unterschiedliche Anzahl von Basen als andere aus der Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten enthält.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Ligation mittels eines Ligase-Enzyms durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei das Ligase-Enzym aus T4 Ligase, T7 Ligase, Tth Ligase, Taq Ligase und E. coli DNA Ligase ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei das Ligase-Enzym 74 DNA Ligase ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jedes markierte Oligonukleotid-5'-Monophosphat mit demselben Marker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jedes markierte Oligonukleotid-5'-Monophosphat mit einem Oligonukleotid-5'-Monophosphat spezifischen Marker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jedes Oligonukleotid-5'-Monophosphat einen Marker enthält.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jeder Marker aus Radioisotopen, chemilumineszierenden Markern, fluoreszierenden Markern, colorimetrischen Markern und Enzymen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei jeder Marker aus Bindungsproteinen, Antigenen, Antikörpern, Haptenen und Oligonukleotiden ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 50, wobei zumindest ein Marker an ein verzweigtes Amplifikationsmultimer bindet, das nachweisbar markiert ist, wobei der Analyt durch Nachweisen der Marker an gebundenen Amplifikationsmultimeren nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 38, das weiterhin folgendes umfasst: (a) Bindung der Marker mit einem Konjugat eines Enzyms und einer Substanz, die eine spezifische Bindungsaffinität für die Marker aufweist; und (b) Umsetzen der gebundenen Enzymkonjugate mit einem Substrat für das Enzym, um ein nachweisbares Reaktionsprodukt zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 50, wobei die Reaktion des Enzyms mit dem Substrat eine Chemilumineszenz als nachweisbares Produkt erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Marker ein fluoreszierender interkalierender Farbstoff ist und bei dem die Fluoreszenz vom interkalierten, gebundenen Marker im Nachweisschritt nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Synthetisieren einer markierten doppelsträngigen Nukleinsäure, wobei beide Stränge markiert sind, und wobei die Vielzahl von Oligonukleotid-5'-Monophosphaten markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Unterscheiden zwischen verschiedenen Nukleinsäuresequenzen in einer Probe, wobei die Probe zumindest einen Teil einer einsträngigen Zielnukleinsäurematrize umfasst; das Reaktionsgemisch einen Primer, der zu einem Teil jeder der unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen und für jede Sequenz, die unterschieden werden soll, komplementär ist, einen Satz Oligonukleotid-5'-Monophosphate, die zur der Sequenz komplementär sind, wobei zumindest eines der Oligonukleotid-5'-Monophosphate in jedem Satz mit einem Marker markiert ist, der für jeden Satz einzigartig ist, enthält; wobei das Produkt von Schritt (c) ein markierter komplementärer Nukleinsäurestrang ist, der einen Marker enthält, der für die Sequenz spezifisch ist und diese identifiziert; und das Verfahren weiterhin die zusätzlichen Schritte wie folgt umfasst: (d) Entfernen aller nicht ligierten Oligonukleotid-5'-Monophosphate; und (e) Nachweisen des markierten Nukleinsäureproduktes von Schritt (c) als Hinweis auf das Vorhandensein unterschiedlicher Nukleinsäuren in der Probe, wodurch zwischen den verschiedenen Nukleinsäuren in der Probe unterschieden wird.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei eine der unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen eine normale Sequenz repräsentiert und die anderen Sequenzen jeweils eine andere Mutation enthalten.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei jede verschiedene Nukleinsäuresequenz eine andere Mutation enthält.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei die unterschiedlichen Sequenzen unterschiedliche Genotypen repräsentieren.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei der Nachweis markierter Nukleinsäureprodukte die Differenzierung einer Heterozygote und einer ersten und zweiten Homozygote für einen genetischen Zustand erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei die Nukleinsäuren in der Probe, wenn sie in doppelsträngiger Form vorliegen, in Einzelstränge aufgeteilt werden, bevor oder während der Primer hybridisiert.