JP2002521036A

JP2002521036A - 多数のオリゴマーの結紮によるポリヌクレオチドの合成法

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Publication number: JP2002521036A
Application number: JP2000561358A
Authority: JP
Inventors: ハシェム・アクハヴァン−タフティ
Original assignee: ルミゲンインコーポレイテッド
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2002-07-16
Also published as: CA2304258A1; IL134729A; ES2233062T3; DK1017855T3; DE69921594D1; ATE281532T1; IL134729A0; CA2304258C; AU772995B2; EP1017855A1; WO2000005412A1; EP1017855B1; AU5205299A; DE69921594T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドの合成法、とりわけ、鋳型結合プライマーに対する多数のオリゴマー単位の結紮によるポリヌクレオチドの合成法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は一般的に、ポリヌクレオチドの合成法に関する。とりわけ本発明は、
鋳型結合プライマーに対する多数のオリゴマー単位の結紮によるポリヌクレオチ
ドの合成法に関する。該多数のオリゴマーは、鋳型鎖に相補的であるオリゴマー
を含むように予備選択され、または該オリゴマーは、ライブラリーとして提供さ
れ自己選択が可能である。結紮による合成は、プライマーから一方向または二方
向で進行し、二つのプライマーの使用により両者の鎖を同時に合成するために使
用できる。増幅は、等速的にまたは指数的に実施でき、ＤＮＡ及びＲＮＡをコピ
ーするために使用できる。本発明の方法は、クローニング、診断用途のための標
識化ポリヌクレオチドの調製、突然変異分析及びスクリーニング、遺伝子発現モ
ニター及び配列分析を含む各種の応用で有用である。

【０００２】

【従来の技術】

標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドのペアの酵素的結紮は、広く周知であ
る。それぞれのオリゴマーは、効率的に結紮されるように最小の長さを有さなけ
ればならないと一般的に解される。最近の研究は、この最小の長さが約６−８塩
基であることを示している(C.E. Pritchard及びE.M. Southern, Nucl. Acids Re
s., 25, 3403-3407 (1997))。約６塩基より短いオリゴヌクレオチドの結紮は、
不可能であると一般的に解される。

【０００３】特定の条件下で、プライマー非依存的結紮は、少なくとも６塩基の長さのオリ
ゴマーを使用して達成され得る。この方法において、ＰＣＲプライマーは、少数
のヘキサマー、ヘプタマーまたはオクタマーの連鎖状の群からインシトゥーで調
製された(T. Kaczoroski及びW. Szybalski, Gene, 179, 189-193 (1996); L.E.
Kotler, D. Zevin-Sonkin, I.A. Sobolev, A.D. Beskin及びL.E. Ulanovsky, Pr
oc. Natl. Acad. Sci USA, 90, 4241-4245 (1993))。プライマーの不存在下での
上記結紮は、本方法においては所望されず、避けなければならない。制御され定
義された方法でのポリヌクレオチド配列の複製の成功は、新たに合成された鎖の
開始点を知らしめる。

【０００４】核酸は、ポリメラーゼ機能の働きによって、鋳型、プライマー及びヌクレオチ
ド三リン酸（ＮＴＰ）から合成され得る。標識は、標識化ＮＴＰのパーセントを
置換することによって取り込まれ得る。高い度合の標識の取り込みを達成する可
能性は制限され、標識の正確な間隔は制御可能ではない。

【０００５】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、複製される領域に亘る各鎖に相補的なプ
ライマーの使用による、ポリヌクレオチドの量を増幅する方法である。核酸合成
は、ポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰでの各プライマーの伸長によって進行する
。熱サイクルにより、合成される鋳型の複数のコピーが、各サイクルでアンプリ
コンの量を約二倍化する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と称される変形法は、興
味ある配列を複製するために、リガーゼ酵素でオリゴヌクレオチドの二つのペア
の結紮を含む(D.Y. Wu及びR.B. Wallace, Genomics, 4, 560-569 (1989))。結紮
される二つのオリゴヌクレオチドは、該鎖の全長を構成する。核酸を複製するた
めの大量の小さいオリゴマーのプライマーへの結紮は、出願人の最良の知識に達
していない。

【０００６】オリゴヌクレオチド結紮を使用する配列情報を提供する方法は、米国特許第5,
750,341号及び第5,770,367号及び文献に開示される(S. Dubiley, E. Kirilov, Y
. Lysov及びA Mirzabekov, Nucl. Acids Res., 25, 2259-2265 (1997))。報告さ
れた方法は、オリゴマーが一度に一つ結紮され、配列が各工程の後に分析される
必要がある点で、本発明の方法とは本質的に異なる。それ故、これらの方法は、
本発明の方法より煩雑である。

【０００７】核酸の標識法−核酸またはオリゴヌクレオチドを標識するこの方法は、テーリ
ング法、ランダム開始標識化、ニックトランスレーション、標識化分枝状ＤＮＡ
及び標識化プライマーを使用した末端標識を含む。各方法は、特定の応用におい
て欠点をもつ。非標識化塩基でのＰＣＲによって伸長した末端標識化プライマー
の使用は、生成核酸当たり一つのみまたは２，３個の標識しか導かない。

【０００８】テーリング法は、興味ある核酸に非相補的塩基のテールを付加することによっ
て、非決定的で非制御的な数の標識を取り込む。これは、多くのさらなる塩基を
加え、該塩基は長さを増大するだけではなく、ハイブリダイゼーションを妨げ、
非特異的な結合を導く。さらに、テールの長さは興味ある配列の長さを越えるた
め、短い核酸またはオリゴヌクレオチドの合成には容易に適用できない。

【０００９】長い核酸の標識化に適用可能な無作為開始法は、標識化及び非標識化塩基の混
合物でポリメラーゼによって伸長されるプライマーの混合物を使用する。取り込
まれ得る塩基の数は可変的であり、不定数である。長さの異なる数多くの核酸の
断片の混合物が、両者の鎖から生産される。同様に、ニックトランスレーション
は、両方の鎖から各種の長さの数多くの核酸断片の混合物を生産する。両者のＤ
ＮＡの鎖の切断が形成され、新しい核酸の鎖は、標識化及び非標識化塩基の混合
物を使用して該ニックの位置から合成される。ニック化の位置は不定であるため
、これも標識の取り込みは制御できない。

【００１０】分枝状ＤＮＡ法は、標的ＤＮＡに対していくつかの標識を付着する手段として
診断試験において使用されている。該方法体系は、プローブに対して結合される
合成核酸のいくつかの分枝の作製、引き続き分枝した増幅マルチマーのそれぞれ
に対する多数の標識化オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに依存する
。該方法は、多くのプローブ及び分枝したＤＮＡの高価な調製を必要とし、特に
高く標識化されたＤＮＡの短い断片の生産のためには、一般的には適用可能では
ない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】

一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法を提供することが、本発明
の一つの目的である。鋳型ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするプライ
マーに、多数のオリゴヌクレオチド5'-リン酸を結紮することによる、ポリヌク
レオチドを合成する方法を提供することが、本発明の別の目的である。オリゴヌ
クレオチド5'-リン酸のライブラリーを使用するポリヌクレオチドを合成する方
法を提供することが、本発明の別の目的である。特定の位置及び度合の標識の取
り込みで標識化ポリヌクレオチドを合成する方法を提供することが、本発明の別
の目的である。本発明の別の目的は、プライマー誘導結紮による核酸の量を増幅
する方法を提供することである。本発明の別の目的は、遺伝子の検出及び遺伝子
発現の分析のための方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、遺
伝学的突然変異の検出のための方法を提供することである。本発明のさらに別の
目的は、核酸の塩基配列の分析のための方法を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】

短いオリゴヌクレオチド-5'-リン酸のセットが、鋳型ポリヌクレオチドまたは
核酸の相補的鎖を生産するために、隣接した態様で鋳型結合プライマーに対して
同時に結紮できることを発見した。生産された核酸は、標識化または非標識化さ
れた短いオリゴマーのいずれかを使用して、標識化または非標識化できる。それ
ぞれのセット中のオリゴマーは、好ましくは同数の塩基を含む。合成される配列
が正確に既知である場合、最小数のオリゴマーを含むセットが使用できる。該オ
リゴマーは、正確な配列を生産するために、プライマーから始まる正しい順序で
結紮される。プライマー非依存的結紮は、５塩基以下の長さのオリゴヌクレオチ
ドが使用される場合生じない。合成される配列が未知である場合、多数のオリゴ
マーの全体の可能性のあるプールのライブラリーが使用される。後者の場合は、
配列分析及び突然変異スクリーニングで生ずる。結紮は好ましくは、リガーゼ酵
素によって実施される。ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを結紮するための
周知の化学的試薬も、同様に使用できる。

【００１３】

【発明の実施の形態】

定義ここで使用されるオリゴマー、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド内ホスホ
ジエステル結合及び5'-末端モノリン酸基を含む化合物を指す。該ヌクレオチド
は、通常存在するリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ及びＵまたはデオキシリボヌクレ
オチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴとし得る。

【００１４】プライマーまたはプローブ／プライマーは、結紮の部位に向けて使用されるオ
リゴヌクレオチドを指し、結紮工程を開始するために必要とされる。プライマー
は、鋳型に対して安定にハイブリダイズするのに十分な長さを有し、鋳型中で独
特の配列を表す。プライマーは通常、約１５−３０塩基の長さであるが、より長
いプライマーも使用できる。検出可能な標識または固相での捕獲が可能な標識を
含む標識化プライマーは、ここで使用される用語の範囲内に含まれる。プライマ
ーはまた、本分野で周知である少なくとも６塩基の隣接して並んだオリゴマーを
企図する(T. Kaczorowski及びW. Szybalski, Gene, 179, 189-193 (1996))。

【００１５】鋳型、試験ポリヌクレオチド、標的は、互換的に使用され、その長さが複製さ
れる核酸を指す。

【００１６】サンプルは、アッセイされる一つ以上の分析物を含むまたは含む疑いのある液
体を指す。化学発光反応法によって分析される典型的なサンプルは、血液、血漿
、血清、尿、精液、唾液、細胞溶解液、組織抽出液のような体液を含む生物学的
サンプルである。他の型のサンプルは、食料サンプル及び土または水のような環
境のサンプルを含む。

【００１７】ここで使用される短いオリゴヌクレオチドは、少なくとも２から約１０塩基の
長さを有するオリゴヌクレオチド5'-リン酸を指す。該塩基は、リボヌクレオチ
ドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはその類似体であり得る。本分脈で有用
な短いオリゴヌクレオチドの長さは、この範囲内で変化し、全体の範囲よりも短
くてもよい。好ましい長さは、特定の応用に依存して変化する。

【００１８】特異的結合ペアは、相互に結合親和性を示す二つの物質を指す。例としては、
抗原−抗体、ハプテン−抗体または抗体−抗体ペア、相補的オリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプタビジン−ビオチン、
ホルモン−レセプター、レクチン−炭化水素、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核
酸結合タンパク質、及び核酸−核酸抗体、及び金属錯体−リガンドを含む。

【００１９】かくして本発明の一つの目的は、標的一本鎖核酸鋳型の少なくとも一部に相補
的な核酸の鎖を合成するための方法であり、該方法は以下の工程を含む：ａ）標的一本鎖核酸鋳型の一部に相補的であるプライマーを提供すること；ｂ）一本鎖領域及び二本鎖領域を有するプライマー−鋳型ハイブリッドを形成す
るために、鋳型とプライマーをハイブリダイズすること；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'−一リン酸と、プライマー−鋳型ハイブリッド
を接触させること；ｄ）二本鎖領域を伸長し、それによって該鋳型の一部に相補的である核酸鎖を合
成するために、多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを
、配列中のプライマー−鋳型ハイブリッドに結紮すること。

【００２０】結紮の好ましい方法は、ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼを使用する。代表的
なリガーゼは、Ｔ４リガーゼ、Ｔ７リガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ
、及び大腸菌ＤＮＡリガーゼを含む。該リガーゼは熱安定性リガーゼであり得、
その場合以下に記載される熱サイクル法が可能である。熱安定性リガーゼでの熱
サイクルは、ポリメラーゼ連鎖反応と類似の方法だが、ｄＮＴＰ及びポリメラー
ゼの代わりにオリゴマー及びリガーゼを使用する、核酸を増幅する方法で有用で
ある。酵素的結紮反応を実施する方法は一般的に、Sambrook等, Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yor
k, 1989に記載される。

【００２１】酵素的結紮反応は一般的に、任意にハイブリダイゼーションを促進するための
添加剤の存在下で、緩衝溶液中で実施される。緩衝液は典型的に、６−９の範囲
、より一般的には７−８．５，好ましくは７．５−８の範囲のｐＨを有する。こ
の範囲でｐＨを維持できる緩衝液が適している。反応は、０から約５０℃の範囲
の温度範囲で実施され得る。至適温度は、結紮されるオリゴヌクレオチドリン酸
の性質及びサイズ、酵素、添加剤の存在及び量に依存して変化し、特にリガーゼ
についての一般的な文献及び以下の特異的な実施例を参考にして至適化され得る
。結紮を実施するための時間の長さは、数分程度から数時間まで可能であるが、
できるだけ迅速に反応を実施することが望ましい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
が、反応の効率を改善するためにオリゴヌクレオチド結紮反応に加えることがで
きる。その効果は、鋳型鎖中に存在するいずれかの二次構造を緩め、それ故相補
的オリゴヌクレオチドをリガーゼに結合させるために生ずる。大腸菌一本鎖結合
タンパク質(Promega, Madison, WIまたはAmersham/USB)及びT4 Gene 32タンパク
質(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)が使用できる。ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）のような容積減少剤の使用は、結紮を促進するために有利であ
ろう。２００ｍＭまでのＮａＣｌを含めることも、結紮を実施するために有用で
あろう。酵素的結紮における他の添加剤の使用が企図され、本方法の範囲内に含
まれる。添加剤は、ＡＴＰのようなリン酸転移剤、ＤＴＴ及び2-メルカプトエタ
ノールを含むスルフィドリル剤、及びＭｇ²⁺塩のような二価カチオンを含む。

【００２２】オリゴマー5'-リン酸の結紮はまた、非酵素的な結紮法も同様に考慮される。
ヌクレオチド内ホスホジエステル結合の形成に影響する化学的試薬が周知である
(CNBr: K.D. James, A.D. Ellington, Chemistry & Biology, 4,595,605 (1997)
; N-シアノイミダゾール: T. Li, K.C. Nicalaou, Nature, 369, 218-221 (1994
); EDAC: D. Sievers, G. Von Kiedrowski, Nature, 369, 221-224 (1994))。化
学的結紮法は、配列分析の方法には適用されていない。

【００２３】ミスマッチオリゴマーの取り込みは、特に該配列が高いＧ−Ｃ含有量を有する
場合、他の方法において生じ得る。ミスマッチの出現は、他のハイブリダイゼー
ション法の場合と同様に制御可能である。温度、塩濃度、及び添加剤は全て、ハ
イブリダイゼーション工程の緊縮性を制御する技術を認識した態様で使用できる
。小さいオリゴマーに対するミスマッチの影響は、大きいオリゴマーに対する影
響よりも割合的に大きいはずであるため、不正確な配列の識別は、他の結紮法以
上の改良を示すであろう。

【００２４】別の実施態様は、相補的な核酸を合成するため、長さｎ塩基の短いオリゴマー
のシリーズの結紮を達成する、可能性のある配列のライブラリーを使用する。該
ライブラリーは、生成物核酸を形成するために必要とされる以上のｎ塩基（ｎマ
ー）の多くの可能性のある組み合わせを含む。例えばｎ＝５である場合、４個の
天然に存在する塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵを含む４⁵または１０２４の可能性の
ある５−マーが存在する。該ライブラリーは、全ての４ⁿの可能性のあるオリゴ
マーまたはフルセットより少ないものを含むが、可能性のあるオリゴマーの少な
くともかなりの割合（＞５０％、及び好ましくは＞７５％、最も好ましくは＞９
０％）を含むべきである。

【００２５】ｄＮＴＰでのポリメラーゼ伸長または事前に決定されたオリゴヌクレオチドの
結紮による、ポリヌクレオチドを合成する周知の方法は、該生成物分子内への取
り込みのための少量の異なる反応物のみを提供することによって機能する。周知
の結紮ベース法は通常、正確な配列を有する一つのオリゴヌクレオチドを予備選
択する。ポリメラーゼ伸長法は、取り込みのため４個の個々の塩基を供給する。
本方法は、反応混合物中に大量の可能性のある反応物を提供する点で、本質的に
異なる。さらに、顕著な数の短いオリゴヌクレオチドは、標的に対するハイブリ
ダイゼーションのための適切な配列を有するが、もしハイブリダイズしたならば
、結紮工程をブロックまたは成熟前に終結させるであろう。

【００２６】図１に示されるように、オリゴマーＰ３は、標的配列の一部に相補的であるが
、もしハイブリダイズしたならば、該プライマーに対するＰ１及びＰ２の結紮を
ブロックするであろう。驚くべきことに、プライマーに結紮され得ない相補的オ
リゴマーの存在は、鋳型結合プライマーに対する所望のオリゴマーの成功した結
紮を妨害または妨げない。

【００２７】該ライブラリーはまた、標的に対して相補的ではない、または部分的にのみ相
補的である多数のオリゴヌクレオチドを含むであろう。この過剰なオリゴヌクレ
オチドは、事実上、認識及び結紮について正しい配列と競合する。それでも、正
しい順序での短いオリゴヌクレオチドの結紮は、統計学的に生じ得ないにも関わ
らず、効果的に生じるのである。一つの工程中で多数の短いオリゴヌクレオチド
の連続した結紮によって核酸を正確に複製する能力は予期せぬものであり、本分
野で周知の他の方法と比較して工程を顕著に単純化する。

【００２８】本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドの長さは、いくつかの競
合する因子の相互作用によって支配される。より長いオリゴマーは、所定のセッ
トの条件（塩濃度、温度）の下でより強力にハイブリダイズし、それ故より高い
温度でハイブリダイズできる。オリゴヌクレオチドの長さが長くなればなるほど
、全ての可能性のあるｎ−マーの完全なライブラリーを集めるために必要とされ
る個別的な化合物の数は、ｎの各単位の増大に対して４の因数によって増大する
。

【００２９】オリゴマーの長さ配列のトータルの数１４２１６３６４４２５６５１０２４６４０９６７１６，３８４８６５，５３６９２６２，１４４１０１，０４８，５７６

【００３０】より短いオリゴマーは、完全なライブラリーを構築するためにより少ない化合
物を必要とするが、例えばより低い温度といった、その長さの減少と共にハイブ
リダイズ及び結紮することがより困難となる。これは次いで、所定の温度でのよ
り高い緊縮性で翻訳を実施する。また別の因子は、該プライマーと関連しない部
位でのハイブリダイズ及び伸長を開始する該オリゴヌクレオチドの能力である。
プライマー非依存的ハイブリダイゼーションは、６塩基程度の小さいオリゴヌク
レオチドで正しい条件下で生じることが示されている。次いで、例えばドデカマ
ーまたはオクタデカマーを生産するための２以上の連続的なヘキサマーのライゲ
ーションは、新たなプライマーを効率よく生産する。もしこれが生じたならば、
ポリヌクレオチド合成のための開始点をコントロールする能力が欠如する。他方
で、数百塩基の核酸中の所定の配列の複数の出現を発見する可能性は、より短い
オリゴヌクレオチドが使用されると顕著に増大する。配列決定を含む応用におい
ては、二重の配列エレメントの出現は避けるまたは最小化することが望ましい。
使用される最適なオリゴヌクレオチドの長さの選択は、これらの相反する効果の
間での妥協の産物である。最適な長さは、異なる末端使用者において異なるであ
ろう。

【００３１】実際、長さｎのオリゴヌクレオチドの完全なライブラリーを使用することは必
要ではない。所定の配列を生産するために必要とされるオリゴヌクレオチドの数
が、該ライブラリー中のオリゴヌクレオチドの全部の数と比較して小さい場合、
部分的なライブラリーが使用され、さらに必要とされる全てのオリゴヌクレオチ
ドが存在する可能性は高く維持される。いくつかの例においては、あまりに弱く
または強くハイブリダイズする特定の配列のオリゴヌクレオチドを排除すること
が望ましい。

【００３２】以下に明示的に記載されるものを除いて、所定の方法で使用されるオリゴヌク
レオチド5'-リン酸のセットの各構成成分が同数の塩基より成ることは、本方法
において必要ではない。二重のオリゴマーの出現を避けるために、ペンタマー及
びヘキサマーのような２以上の異なる長さのオリゴマーの組み合わせを使用する
ことが、いくつかの実施態様において有利であり得る。

【００３３】別の実施態様において、プライマーと同じ長さの短いオリゴヌクレオチドの多
数のセットの鋳型誘導結紮が、伸長不可能オリゴマーの使用による結紮の終点を
コントロールする態様で実施できる。伸長不可能オリゴマーは、セット中の他の
オリゴマーと同じまたは異なる数の塩基を含むことができる。伸長不可能オリゴ
マーは、結紮するための5'-リン酸を含むが、3'-ＯＨ基を欠く。例えばそれは、
結紮のための3'-ＯＨが存在しないように該オリゴマーの3'-末端でジデオキシ塩
基を有する。別の型の伸長不可能オリゴマーは、引き続く結紮を防ぐために、例
えばヒドロキシル基が、メチル基またはリン酸基でブロックされている、ブロッ
ク化3'-ＯＨ基を含む。結紮を防ぐ末端塩基に対する修飾は、別の可能性のある
伸長不可能オリゴマーの型である。伸長不可能オリゴマーは、必要に応じて標識
されまたは標識されない。好ましい実施態様は、3'-末端にジデオキシ塩基を含
むオリゴマーの使用である。

【００３４】本発明の別の態様は、同時に5'→3'及び3'→5'方向の両者で鋳型結合プライマ
ーに対する多数のオリゴヌクレオチド5'-リン酸の結紮による、核酸を合成する
ための方法である。結紮は、適切な結紮可能オリゴマーが提供される範囲で、プ
ライマーの両末端から同時に生じ得る。一方向または両方向の合成の終結点は、
伸長不可能オリゴマーの使用によって、または選択されたオリゴマーを排除する
ことによってコントロールされ得る。3'→5'方向での合成の終結のための伸長不
可能オリゴマーは、5'-リン酸基を有さないであろう。

【００３５】プライマーに対する多数のセットの短いオリゴヌクレオチドの鋳型に向けた結
紮は、標的ＤＮＡの量を増幅する方法で使用できる。従って、本発明の別の態様
は、リガーゼ、二つのプライマー及び短いオリゴヌクレオチドのセットを使用し
て、標的核酸を増幅する方法を含み、ここで該プローブは、増幅される標的の領
域に並ぶ反対の鎖の領域に相補的である。最小では、反応のために提供されるオ
リゴマーのセットは、他のプライマーの5'末端に相当する位置まで、それぞれの
鎖で両プライマーを伸長するために必要とされるオリゴマーを含む。例えばオリ
ゴマーのセットを予備選択する代わりにオリゴマーの完全なライブラリーを使用
した場合存在するであろうように、さらなるオリゴマーが含まれ得る。図２に模
式的に示された方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲとは区別されるが、４種
のデオキシリボヌクレオチド及びポリメラーゼの代わりにオリゴマーのライブラ
リー及びリガーゼを使用する。アニーリングの各サイクル、リガーゼ伸長及び脱
ハイブリダイズ化は、標的配列の二倍の増幅を引き起こす。加熱が一般的に、新
たに合成された二本鎖核酸を分離するために必要とされるため、さらなるリガー
ゼが、結紮−伸長の引き続く周で加えられる必要がある。別法として、該方法は
熱安定性リガーゼで実施され得る。その場合熱サイクルは、各周でリガーゼを交
換することなく実施される。

【００３６】上述の方法に従って、第一の鎖及び第二の鎖を有する二本鎖核酸の一部の量を
増幅するための方法が提供され、該方法は以下の工程を含む：ａ）第一の鎖の領域に相補的な第一のプライマー、第二の鎖の領域に相補的な第
二のプライマーを提供すること、この場合第一及び第二の領域は、増幅される二
本鎖核酸の一部を定義する；ｂ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を提供すること；ｃ）二本鎖核酸の第一及び第二の鎖を分離すること；ｄ）分離された鎖と第一及び第二のプライマーをハイブリダイズすること；ｅ）二本鎖領域を伸長し、それによって鋳型の一部に相補的な核酸鎖を合成する
ために、多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを、配列
中のハイブリダイズした第一及び第二のプライマーに対して結紮すること；及びｆ）二本鎖核酸の増幅された部分の量を増大するために所望のようにｃ−ｅ工程
を多数繰り返すこと。

【００３７】増幅反応の好ましい実施態様において、オリゴマーのセットは、二つの鎖を複
製するのに必要なオリゴマーのセットのみ、即ち二つのプライマーによって配置
される領域中の二つ鎖で存在するオリゴマーを含むように予備選択される。別の
好ましい実施態様として、伸長不可能オリゴマーが、各鎖の末端位置で使用され
る。定義されるところによってこれらの二つの終結オリゴマーは、各プライマー
の5'末端でオリゴマーの長さの塩基の第一の群に相補的な塩基配列を有する。

【００３８】本発明に従った増幅法は、5'→3'及び3'→5'方向の両者を各鎖の合成によって
同時に達成できる。この二方向性増幅法は、例えばプライマーに対して5'リン酸
基を提供することによって実施できる。結紮は、適切な結紮可能オリゴマーが提
供される範囲で、各プライマーの両末端から同時に生じ得る。一方向または両方
向の合成の終結点は、伸長不可能オリゴマーの使用によってまたは上述の選択さ
れたオリゴマーの排除によってコントロールできる。

【００３９】核酸合成のこのオリゴマー結紮法の他の使用の場合として、標識化または非標
識化オリゴマーが使用できる。使用されるオリゴマーのセットは、完全なライブ
ラリーでもよく、もし増幅される配列が事前に既知であれば、ライブラリーのか
なりの部分または予備選択されたサブセットでもよい。

【００４０】別の態様として、標的結合プライマーに対してオリゴマーを結紮することによ
る特異的核酸配列を合成する方法は、診断の応用で使用できる。興味ある標的に
特徴的な特異的配列は、新たな鎖を合成する方法において標識化オリゴマーを使
用して検出できる。標的核酸領域の塩基配列が既知である場合、この配列を完全
にするために必要とされる相当するオリゴマーが使用され、その少なくともいく
つかは、検出可能な標識を有する。上記方法は、C. trachomatis及びN. gonorrh
oeae, P. carinii, M. tuberculosisのような感染生物の検出、サルモネラ菌及
び大腸菌のような食料寄生病原体の検出、高性能スクリーニングアッセイにおけ
る遺伝子の発現の検出法、遺伝学的異常の検出法、被験者からのＤＮＡサンプル
の法医学的試験、ヒトの残存物のマッチングの同定、及び親子鑑定試験、特異的
配列の同定、及び他の関連配列からのその分離を含む、多くの領域の核酸診断の
使用を有する。

【００４１】遺伝学的異常の領域において、一つの応用は、遺伝学的突然変異の検出のため
の方法である。該突然変異は、塩基の点突然変異（α及びβ−セラセミア）、一
塩基置換（鎌状赤血球貧血）、欠失（嚢胞性線維症ΔＦ₅₀₈、テイ‐サックス病
）、挿入、二倍化、転移または上述の組み合わせであり得る。標識化オリゴマー
は、生じた伸長プライマーが標識化突然変異特異的ポリヌクレオチドであるよう
に、プローブ／プライマーに対する結紮のため選択される。

【００４２】本発明の方法は、遺伝学的条件のようなもののための同型接合体から異型接合
体の分離のための方法を提供するために使用できる。興味あるＤＮＡ配列を含む
染色体の二つのコピーがサンプル中に存在するため、標識化相補的ＤＮＡを合成
する方法は、各同型接合体から異型接合体を識別するための方法を提供する。結
紮された場合、正常な配列に対して相補的な鎖の一部を提供する第一の標識を有
するオリゴマーのセットが、結紮のために提供される。第二の標識を有するオリ
ゴマーの別のセットは、結紮に際して突然変異体配列に相補的な鎖の一部を生産
する（図４）。サンプル中において標的ＤＮＡにハイブリダイズするプローブに
対するオリゴマーのセットの結紮は、サンプル遺伝子型に相補的なポリヌクレオ
チドを作製する。三つの遺伝子型が、どの標識が新たに合成されたＤＮＡ中に存
在するかを決定することによって明らかにされる。同型接合体ＤＮＡは、一つの
標識または他方の標識を含み、異型接合体は両者の標識を含むであろう。

【００４３】合成された配列が、既知ではない場合、多数の全部の可能性のあるプールのオ
リゴマーのライブラリーが使用される。後者の場合は、配列分析及び突然変異体
スクリーニングで生ずる。以下に記載される新たに合成されたポリヌクレオチド
の塩基配列を特定する方法と結びついて使用される場合、特定の遺伝子の数多く
の突然変異が同時に分析され同定され得る。遺伝子中の複数の突然変異について
試験する能力は、５００以上の突然変異が同定されている嚢胞性線維症のような
遺伝学的疾患に対するスクリーニングを可能にするであろう。

【００４４】また別の態様として、試験核酸の塩基配列の一部に相補的な配列を有する領域
を有する固定化一本鎖核酸を合成する方法が提供され、該方法は以下の工程を含
む：ａ）試験一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供する
こと；ｂ）試験一本鎖核酸を捕獲し、一本鎖領域及び二本鎖領域を有する捕獲プローブ
−試験核酸ハイブリッドを形成するようにハイブリダイズする条件下で、試験一
本鎖核酸と捕獲プローブ／プライマーを接触させること；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸で捕獲されたハイブリッドを接触さ
せること；ｄ）二本鎖領域を伸長するために、捕獲プローブ／プライマーに対して多数のオ
リゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）結紮しないオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；及びｆ）固相から試験核酸を取り外し固定化一本鎖核酸を生産するために、伸長した
二本鎖領域を有する捕獲されたプローブ−試験核酸ハイブリッドを変性すること
。

【００４５】該方法は開始点をコントロールし、結紮されるオリゴマーのサイズによって制
限されない。転写される配列が正確に既知である場合、オリゴマーはコストと複
雑性を減少するために予備選択され得る。

【００４６】本発明の別の態様は、多数で標識化された核酸を合成する方法であり、ここで
標識の取り込みの度合がコントロールされ、高密度の標識化が提供される。捕獲
プローブ及びプライマーの二重の目的を助けるために固定化プライマーを使用す
る場合、該方法は、固定化された多数で標識化された一本鎖核酸を合成する方法
を含み、該方法は以下の工程を含む：ａ）試験一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供する
こと；ｂ）試験一本鎖核酸を捕獲し、一本鎖領域及び二本鎖領域を有する捕獲プローブ
−試験核酸ハイブリッドを形成するようにハイブリダイズする条件下で、試験一
本鎖核酸と捕獲プローブ／プライマーを接触させること；ｃ）多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸で捕獲されたハイブリッドを
接触させること；ｄ）伸長した二本鎖領域を有する捕獲されたプローブ／試験核酸ハイブリッドを
形成するために、捕獲プローブ／プライマーに対して多数の標識化オリゴヌクレ
オチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）結紮しない標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；及びｆ）固相から試験核酸を取り外し、多数の標識を含む固定化された標識化一本鎖
核酸を生産するために、伸長した二本鎖領域を有する捕獲されたプローブ−試験
核酸ハイブリッドを変性すること。

【００４７】別法として、該プライマーは、多数で標識化された核酸を合成する目的のため
に非固定化プライマーであり得る。この実施態様は以下の工程を含む：ａ）試験一本鎖核酸の一部に相補的であるプライマーを提供すること；ｂ）試験一本鎖核酸を捕獲し、一本鎖領域及び二本鎖領域を有するプライマー−
試験核酸ハイブリッドを形成するようにハイブリダイズする条件下で、試験一本
鎖核酸と該プライマーを接触させること；ｃ）多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸で該ハイブリッドを接触させ
ること；ｄ）伸長した二本鎖領域を有する伸長したプライマー−試験核酸ハイブリッドを
形成するために、該プライマーに対して多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一
リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）結紮しない標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること。

【００４８】さらに該方法は、所望であれば鋳型核酸鎖から伸長したプライマー鎖を分離す
る工程を含む。各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸で生じた標識は異なってもよ
く、または全てが同じ標識でもよい。別法として、例えば２−５標識といった異
なる標識の制限された数が使用され得る。使用される標識の選択は、最終的な応
用によって決定されるであろう。

【００４９】発明の背景に記載された核酸標識化の他の方法に対して、本方法は実質的に何
れの長さの核酸も調製できるが、おそらく少なくとも約５０塩基の生成物に対し
て最も有用であろう。より短い生成物は、より少ない付着した標識を有するであ
ろう。主要な利点の一つは、標識の付着の度合及び位置が、正確にコントロール
されることである。例えば、それぞれ一つの標識を有するペンタマーは、５塩基
ごとに標識化された生成物を導き、２０％の標識密度を提供する。さらに高い密
度は、より短いオリゴマーで、または二つ以上のそれぞれの標識を有するペンタ
マーで達成できる。

【００５０】これらの高い密度で制御的に標識する能力は、検出感度が最も重要な診断試験
で特に有利であろう。より高い標識密度は、検出の改良された限界と言い換えら
れるであろう。制御された標識化は、改良されたアッセイ精度に寄与するであろ
う。該標識は、放射性同位元素、化学発光標識及び蛍光標識、光の吸収に基づい
て検出される色素形成標識、抗原及び抗体を含む特異的結合分子、ストレプタビ
ジンと、ビオチン及びジゴキシゲニンのようなハプテンといった結合タンパク質
を含む、現実的に検出可能な種であり得る。さらに、該標識が小さいハプテンで
ある場合、検出可能な標識は、酵素−抗ハプテン接合物を経て核酸に結合する酵
素のような種であり得る。後者の場合、標識化核酸を生産するためのペンタマー
結紮の使用は、さらに別の利点を提供する。大きな酵素の標識は、５塩基ごとに
付着され、最も近傍の標識から二重らせんに沿ってほぼ１８０℃の角度で配置さ
れる。ヌクレオチド内での距離及び酵素の分子直径の考慮は、平均して比較的大
きい大きさのタンパク質が、過度の立体的な混乱なくこの標識化の密度で適応可
能であることを明らかにする。

【００５１】またより高い密度は、図５及び６に示されたように規則的な標識化オリゴマー
の取り込みに関連して、分枝した標識物質を適用することによって達成できる。
実際、オリゴマーのいくつかまたは全てが、分枝した増幅マルチマーに結合する
ために使用されるハプテンまたは短い認識配列のような「ハンドル」を構成する
であろう。

【００５２】別法として、分枝の腕が、複数の腕が検出可能な標識を有するように、標識化
された短いオリゴマーの結紮によって調製できる。標識化オリゴマーの結紮によ
る密接に標識化された核酸の合成は、ＤＮＡデンドリマー(Polyprobe, Philadel
phia)のような他の型の分枝状ＤＮＡ法に適用できる。

【００５３】上述の合成法、増幅法、標識化ポリヌクレオチドまたは固定化ポリヌクレオチ
ドの調製法で使用されるオリゴヌクレオチド5'-リン酸は、好ましくは比較的短
い。これらの応用において、既知の配列の所望の核酸を合成できるために、所定
の長さのオリゴマーの全ライブラリーのかなりの分画を使用することは必要では
ない。オリゴマーのサイズは、典型的には２から約２０塩基までのいずれかの従
来の値を採用することができる。高い密度の標識化が所望される場合、オリゴマ
ーは約１０塩基より短い、好ましくは約４から８塩基を含むことが好ましい。

【００５４】本発明の別の態様として、未知の一本鎖核酸の配列を決定する（シークエンス
する）ための方法が提供される。該方法は、該配列の少なくとも一部が既知であ
る場合、適切な長さのＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ及び変性ｄｓＤＮＡ配列に適用できる
。後者の制限は、捕獲プローブ／プライマーをデザインするために必要である。

【００５５】捕獲プローブ／プライマーは、ビーズ、チューブ、フィルター、膜ミクロタイ
タープレート、またはチップのような固相に固定化されるまたは固定化可能であ
る。捕獲プローブは、十分なハイブリダイゼーションを保証し、試験核酸に対し
て独特の部分的配列を表すように、十分な塩基の長さを有するべきである。これ
らの条件は一般的に、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基の長
さで満足されるであろう。捕獲プローブは、いずれかの本分野で認識された方法
で固相に固定化され得る。一般的に使用される手段は、ストレプタビジン皮膜支
持体に結合するためのビオチン標識を提供することである。ストレプタビジン皮
膜ビーズ及びミクロタイタープレートは、商業的に入手可能である。

【００５６】ここで開示される本方法に従って実施される配列分析決定で使用されるオリゴ
ヌクレオチド5'-リン酸は好ましくは比較的短い。未知の配列の核酸の長い断片
を合成できるように、所定の長さの全ての可能性のあるオリゴマーのかなりの分
画を使用することが必要である。全てのライブラリーのサイズを制御可能にする
ために、オリゴマーのサイズを約８塩基より小さく制限することが望ましい。該
オリゴマーは５または６塩基を含むことがより好ましい。配列分析に関わる実施
態様におけるさらなる必要性は、全てのオリゴヌクレオチド5'-リン酸が同じ数
の塩基より成ることである。

【００５７】本発明のこの態様において、一本鎖核酸の一部の配列を決定するための方法は
、以下の工程を含む：ａ）一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供すること
；ｂ）一本鎖核酸を捕獲し、一本鎖領域及び二本鎖領域を有する捕獲されたプロー
ブ−核酸ハイブリッドを形成するために、一本鎖核酸と捕獲プローブ／プライマ
ーをハイブリダイズすること；ｃ）捕獲されたハイブリッドを、多数の同数の塩基の標識化オリゴヌクレオチド
5'-一リン酸と接触すること、各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸は独特の標識を
有する；ｄ）伸長した二本鎖領域を有する捕獲されたプローブ−核酸ハイブリッドを形成
するために、捕獲プローブ／プライマーに対して多数の標識化オリゴヌクレオチ
ド5'-一リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）結紮しないオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；ｆ）固相支持体から核酸を取り出し、多数の標識と配列が該核酸の領域に相補的
である領域を含む、固定化された相補的一本鎖核酸を生産するために、伸長した
二本鎖領域を有する捕獲されたプローブ−核酸ハイブリッドを変性すること；ｇ）多数の標識を検出すること；ｈ）相当するオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の同一性に対して、多数の検出さ
れた標識を関連づけること；及びｉ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の同一性から、該核酸の部分の塩基
配列を決定すること。

【００５８】多数の検出された標識から得られた部分的塩基配列の集積を変換する方法は、
決定される全配列中の正しい相対的順序及び位置に、部分的塩基の集積を対応さ
せる分析のセットを実施することを含む。部分的塩基配列のサブセットは、最初
の結紮実験で同定される。次いで、全配列中の各部分的配列の出現の順序は、一
つの部分的配列を表す一つのオリゴマーが全ての同定された部分的配列のセット
から排除される実験のセットから推定される。Ｎ塩基の核酸配列について、ｎ塩
基の同定された部分的配列の数は、二重の存在を仮定しないとＮ／ｎであろう。
それぞれ（Ｎ／ｎ）−１のオリゴマーを含み、異なるオリゴマーを欠く上記セッ
トの数は、部分的配列の数、Ｎ／ｎに等しい。ハイブリダイズされたプライマー
に対するこれらのセットの結紮反応は、０から該プライマーの長さにｎ塩基加え
たＮ／ｎのさらなるセットまでの範囲の異なる長さの伸長したプライマー、即ち
プライマー＋ｎ、＋２ｎ、＋３ｎ等の集積を生じる。伸長したオリゴマーの同一
性（配列）は各実験について既知であるので、全部の配列における相対的位置は
、式：１＋該実験で取り込まれたさらなるｎ塩基単位によって与えられる。

【００５９】それぞれの上述のＮ／ｎ実験の反応生成物を同定可能であるいくつかの方法が
存在する。各方法は、本発明の異なる実施態様を構成する。一つの実施態様とし
て、独特の切断可能標識が、各オリゴマーに提供される。多数の独特の標識が、
それぞれ独特の分子量を有する標識断片のセットを生産するために、伸長したプ
ローブ／プライマーから切断される。配列分析のこの方法は、図７に模式的に表
される。標識断片のセットは、マススペクトルメーターに導入することによって
分析される。好ましい態様として、分子量の分析は、各標識断片の元となるイオ
ンが検出可能な条件下で実施される。各実験の実験結果は、分子量のセットより
成り、各セットは異なる数値を含む。分子量のセットの集積は、決定される全配
列中の各独特の標識の相対的位置及び関連する部分的塩基配列を決定するために
比較される。この分析は、コンピューターアルゴリズムによって最も簡便に実施
される。

【００６０】切断可能標識は、伸長したプローブ／プライマーから制御可能に放出できるい
ずれかの分子断片であり得る。好ましい標識は、約５０，０００ａｍｕ以下の分
子量の小さい有機分子である。該分子は、全てが一般的な手段で切断可能なよう
に一般的な官能基を有する一つの構造的型を有することが望ましい。切断に影響
する一つの手段は、熱変性的な基の熱分解によるものである。切断可能標識にお
ける使用のための好ましい熱変性的な基は、1,2-ジオキセタンである。1,2-ジオ
キセタンは、二つのカルボニル断片を生産するためにジオキセタン環の熱断片化
を受けることが周知である。リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド
にジオキセタン基を結合することによって、熱された場合にカルボニル化合物を
放出するジオキセタン標識オリゴマーが調製できる。

【化１】

【００６１】オリゴマーのライブラリーは、独特のジオキセタン部分にそれぞれ共有結合さ
れたｎ塩基の全ての可能性のある配列のセットを含むであろう。簡便な合成のた
めに、該オリゴマーに対するジオキセタン環基を連結する結合官能性は、標識化
オリゴマーのファミリーの全てのメンバーで共通であるべきである。切断される
炭素でのジオキセタン環に対する置換は、化合物のセットのメンバーの間で変化
するであろう。

【００６２】非環状過酸化物のような他の熱的に切断可能な官能基が周知であり、使用され
得る。熱分解のために必要とされる温度は、オリゴヌクレオチドの断片化が生じ
ないように十分に低くなければならない。

【００６３】切断可能標識の切断の手段は、熱的切断に制限されない。伸長したプローブ／
プライマーから標識を制御可能に遊離させるいずれかの手段が使用され得る。他
の手段は、酵素反応、フッ化物誘導シリルエーテル切断のような求核置換を含む
化学的反応、エステル加水分解またはビニルエーテル加水分解のような塩基性ま
たは酸性加水分解断片化、光化学的断片化、ジスルフィドまたは過酸化物の金属
誘導性還元的切断のような還元的切断、アルケンまたはジオールの酸化的切断を
制限することなく含む。

【００６４】標識切断のための例示的な酵素反応は、標識として誘発可能ジオキセタンを酵
素学的に利用する。保護的フェノール性置換基の酵素的脱保護は、上述のような
カルボニル化合物へのジオキセタン環の切断を誘発する。該反応は室温で実施で
き、切断の速度は、誘発酵素の量及び性質、並びに例えばｐＨといった反応溶液
の特徴によって制御される。数多くの誘発可能ジオキセタン構造物が本分野で周
知であり、たくさんの特許の主題となっている。米国特許第5,707,559号に開示
されたスピロアダマンチル安定化ジオキセタンは一つの例であり、米国特許第5,
578,253号に開示されたアルキルまたはシクロアルキル置換基を含む他のものも
適しているであろう。上述のスピロアダマンチル、アルキルまたはシクロアルキ
ル基から得た結合置換基は、該オリゴマーにジオキセタン標識を付着するために
必要であろう。結合可能ジオキセタンは、米国特許第5,770,743号に開示される
。

【化２】

【００６５】誘発可能ジオキセタンの切断の化学的方法もまた周知であり、本発明の方法に
おいて同様に有用であろう。上述の例において、Ｘはトリアルキルシリル基であ
り、誘導化剤はフッ化物である。他の誘導化剤／切断可能基のペアは、例えば上
述の米国特許第5,707,559号、第5,578,253号、及び第5,770,743号の特許に記載
されている。

【００６６】上述の方法は以下の工程を含む：１）標識化オリゴマーで初期結紮実験を実施すること；２）該標識を放出すること；３）該標識を検出すること；４）該標識と会合する部分的塩基配列のセットを決定すること；５）全配列中の正確な相対的順序または位置に対して、部分的塩基配列の集積を
対応させるための予備分析において同定されたオリゴマーのサブセットで、結紮
反応のセットを実施すること。別法として、該予備結紮及び分析は省略でき、該配列は、各セットにおいて一つ
のオリゴマーを排除して、結紮反応のセットを実施することによって決定できる
。この態様において、該セットは、排除された一つを差し引いた部分的配列の全
ライブラリーを含むことが必要であろう。次いで、該標識の検出及び／または定
量は、上述と同じ方法で実施される。

【００６７】整列がオリゴマーのセットから一つのオリゴマーを除いて調製される上述の方
法において、別法としてのアプローチは、さもなければ排除されるであろう特定
のオリゴマーに対して伸長不可能オリゴマーを取り込むものであろう。伸長不可
能オリゴマーは、必要に応じて標識されまたは標識されない。上記伸長不可能オ
リゴマーは、結紮のための3'-ＯＨが存在しないように、該オリゴマーの3'末端
でジデオキシ塩基を有するであろう。該3'-ＯＨは、引き続く結紮を防ぐように
、例えばメチル基またはリン酸基でブッロクされてもよい。結紮を防ぐ末端塩基
の修飾は、別の可能性もある。

【００６８】別の態様として、配列分析の目的のための鋳型結合プライマーへのオリゴマー
の結紮の方法は、定量的な分析で単一の標識を使用して実施され得る。配列を測
定する方法は、結紮反応のセットを実施することによって達成でき、各反応は、
一般的に上述のような一つ少ないｎ塩基のオリゴマーの全ライブラリーを含む。
各オリゴマーは、同じ検出可能な標識を含む。各結紮反応は、０から該プライマ
ーの長さにｎ塩基を加えたＮ／ｎのさらなるセットまでの範囲の長さの伸長した
プライマー、即ちプライマー＋ｎ、＋２ｎ、＋３ｎ等を生じる。各反応における
検出可能な標識の量は、結紮されたオリゴマーの数に比例する。伸長したプライ
マーのセットは集積的に、該伸長したプライマーが鋳型配列中に存在しない全て
の反応を引き起こす最大値で０からＮ／ｎまでの全ての値を生ずる。０の値は、
伸長したオリゴマーが鋳型配列中の最初の５塩基を表す場合に生ずる。伸長した
オリゴマーの同一性（配列）は、各実験について既知であるため、全配列中の相
対的位置は、式：１＋該実験で取り込まれたさらなるｎ塩基単位の数によって表
される。次いで、鋳型配列は、各部分的配列（オリゴマー）の存在する順序から
推定される。

【００６９】標識を検出できるいくつかの方法が存在する。各方法または標識の型は、本発
明の異なる実施態様を構成する。一つの実施態様として、該標識は、自動ジデオ
キシシークエンスにおいて一般的に使用される蛍光分子ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ
及びＴＡＭＲＡのような蛍光分子である。ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド
を標識する多くの方法が本分野で周知であり、標識の直接的付着を含む(Hauglan
d, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, (Molecular Pro
bes, Eugene, OR), 1992)。標識化は、例えばビオチンのような万能なリンカー
が主要標識として提供され、ビオチンに対する蛍光分子標識化結合パートナーが
標識を提供する場合のように、間接的な手段によって達成することもできる。

【００７０】別の実施態様として、該標識は化学発光化合物であり、標識の量は、該標識か
らの化学発光の生産を引き起こすことによって生産される光強度によって検出さ
れる。化学発光化合物のいくつかの型が周知であり、標識として使用できる。代
表的な例は、アクリジニウムエステル及びスルホンアミド、ルミノールまたはイ
ソルミノール誘導体、及びジオキセタンを含む(R. Handley, H. Akhavan-Tafti,
A.P. Schaap, J. Clin. Ligand Assay, 20(4) 302-312 (1997))。好ましい化学
発光標識は、出願人の同時継続出願である09/099,656に開示されたアクリダンリ
ン酸化合物である。後者の化合物は、その安定性、高い化学発光量子効率、接合
の容易性、及び電気泳動ゲル中を含む各種の範囲の条件での誘発の能力のために
、有利に使用される。生物学的発光化合物、及び電気化学的発光化合物は、検出
可能な化学発光標識の範囲内に考慮される。

【００７１】別の実施態様として、該標識は色素生成化合物であり、標識の量は吸光度で検
出される。別の標識の型は、シンチレーションカウンティングまたはＸ線イメー
ジングを使用して存在が検出できる³²Ｐ及び³⁵Ｓのような放射性同位元素である
。該標識はまた、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素でもよい。酵素の量は、
蛍光生成、色素生成または化学発光物質に対する酵素の機能を測定することによ
って測定される。

【００７２】上述の定量的検出法は、単位分析で０からＮ／ｎまでの信号を識別する能力に
依存し、ここでＮは配列決定される塩基の全部の数であり、ｎは使用されるオリ
ゴマーリン酸中の塩基の数である。該検出法の分析度は、ｍの平行な反応のセッ
トを実施することによって減弱され、ここで該オリゴマーの所定の分画（１／ｍ
）のみが標識される。もし該ライブラリーの異なる部分（Ｎ／ｍ）が各セットで
標識され、残りの部分が標識されないｍセットの実験が実施されたならば、該ラ
イブラリーの結紮及び検出は、各セットの実験において０からＮ／５ｍの範囲で
値のセットを生ずる。ｍセットにおける情報の合計は、同じ情報を生ずるために
組み合わされる（全配列）。これは測定の正確性の必要性を減少し、結果のｍ倍
の重複を生ずる。ペンタマーのオリゴマーを使用する例として、任意に１−２０
５と称されるペンタマーが標識され、残りは第一セットにおいて標識されない。
ナンバー２０６−４１０は、第二のセットで標識され、ナンバー４１１−６１５
は第三で、６１６−８２０は第四で、８２１−１０２４は第五のセットで標識さ
れる。結紮の５個のセットのそれぞれは、０からＮ／５ｍまでの数値でデータを
提供するであろう。これらの値を生ずるための個々の反応は、５個のセットの間
で異なるであろう。

【００７３】またさらなる実施態様において、非標識化オリゴマーは、数百塩基までのポリ
ヌクレオチドに適用される場合、結紮による配列決定法で使用され得る。MALDI-
TOFマススペクトロメトリーを使用するＤＮＡ配列分析法は、核酸のエキソヌク
レアーゼ切断によって生ずる一つの塩基による長さの異なるポリヌクレオチドの
シリーズの分子量を迅速に測定するように開発されている。該方法は、分子量に
基づいて５塩基まで長さの異なるポリヌクレオチドを識別することが容易に可能
である。現在の方法は、相応な（単一塩基）分子量の分析で、約８０−１００塩
基までのポリヌクレオチドを迅速に同定できる。ペンタマーのような０から約１
００の結紮された短いオリゴヌクレオチドを含む本発明の方法に従って形成され
た結紮ポリヌクレオチド生成物のシリーズは、もはや装置による分析を必要とせ
ず、数倍を配列決定できる分子量範囲に拡張されるであろう。

【００７４】本発明の別の態様は、該標的に相補的である標識化された伸長核酸を検出する
ことによる標的核酸を検出する方法を含み、該方法は、従来のサザン及びノーザ
ンブロッティングよりも単純な別法である。標識化伸長相補的核酸の調製は、該
標的にハイブリダイズするプローブ／プライマーに多数の標識化された短いオリ
ゴマーを結紮することにより実施される。伸長に引き続き、電気泳動分離物の変
性及び標識化種の検出が実施される。標識化伸長プライマーの存在は、該プライ
マーが該標的に対してハイブリダイズする場合にのみ結紮が生ずるため、標的の
存在を示す。該標識は、ゲル中で検出可能であることが好ましい。適切な標識は
、1998年5月17日に発行された米国特許出願第09/099,656号に記載されたアクリ
ダンアルケンを含み、該化合物は、ゲル中で容易に検出可能である化学発光及び
蛍光によって検出できる。この実施態様において、ブロッティングは実施されな
い。もし該標識がゲル中での検出を実行できないようなものであれば、膜上への
ブロッティングが実施され、該標識の検出は膜上で実施される。全ての場合にお
いて、膜上でのハイブリダイゼーション、抗体結合、酵素−接合物結合、基質の
添加または他の一般的に使用される方法は必要ではない。

【００７５】この方法の代替的な実施態様として、標識化伸長相補的核酸は、該標的に対し
てハイブリダイズしたままであり、電気泳動の後にバンドが、上述の方法で適切
な分子量で検出される。この態様は、迅速な分子量情報が必要である場合に望ま
しいであろう。この方法において、標的がプローブ／プライマーよりずっと長い
場合、可能性のあるｎ塩基のオリゴマー5'-リン酸の実質的に完全なライブラリ
ーを提供することがより簡便である。標的配列が既知であり、その長さが該配列
をより実践的にする場合において、オリゴヌクレオチド5'-リン酸のサブセット
を予備選択することが好ましいであろう。

【００７６】また別の実施態様は、プローブ／プライマーへの標識として適切な蛍光ドナー
を、及び該オリゴマーへの標識として適切な蛍光アクセプターを提供することを
含む。各オリゴマーを標識することは必要ではない。結紮は、蛍光ドナー及び一
つ以上の蛍光アクセプター標識を有する伸長したプライマーを形成するためにハ
イブリダイズしたプライマーで実施される。適切な条件、即ちドナー及びアクセ
プターが適切なエネルギー転移のため十分に空間的な重なりを有し、ドナーとア
クセプターの間の空間的な分離がフェルスター距離内である場合、蛍光の間のエ
ネルギー転移は、伸長したプライマー内で生ずることができる。該プライマー上
での蛍光ドナーによって吸収される波長での伸長したプライマーの照射は、伸長
部分でのアクセプターからの蛍光を引き起こす。それ故この方法は、標的の存在
が結紮を生じさせるために必要とされ、それによってエネルギー転移距離内でフ
ルオロホアをもたらすために、標的核酸を検出する均質なアッセイの基礎として
機能できる。

【００７７】多数の標識化オリゴマーの結紮に基づいて標的核酸を検出する別の方法は、標
識として蛍光挿入色素を使用することを含む。特定の色素が、二本鎖核酸の二重
らせんの間に挿入された場合に蛍光を生ずることが周知である。例として、臭化
エチジウム化合物が広く使用される。従って、標的核酸を検出する方法は、以下
の工程を含む：ａ）少なくともいくつかが標識として蛍光挿入色素を含む、多数のオリゴヌクレ
オチド5'-リン酸を提供すること；ｂ）標的核酸の一部に相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーを提供するこ
と；ｃ）一本鎖領域及び二本鎖領域を有するプライマー−標的二本鎖を形成するため
のハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸と該プライマーを接触させること
；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と該二本鎖を接触させること；ｄ）二本鎖領域を伸長させるため、該二本鎖に多数のオリゴヌクレオチド5'−一
リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）挿入結合標識から得た蛍光を検出すること。

【００７８】任意の工程として、アガロースが、蛍光を増大するために該反応に加え得る。
標的の不存在下では結紮は生じず、それ故蛍光の検出は、標的の存在の証拠であ
り、さらに該プライマーがハイブリダイズするために該標的に対して十分に相補
的である証拠である。オリゴマーの集積は、全ての可能性のある配列の完全なラ
イブラリー、またはもし標的配列が既知であれば予備選択されたメンバーを含む
サブセットであり得る。

【００７９】使用するための標識化オリゴマーの分画は、異なる標識密度の範囲を使用する
ことによって、所望の度合の検出感度に関して経験的に選択され得る。オリゴヌ
クレオチド5'-リン酸のサイズに依存して、蛍光の自己クエンチングを避けるた
めに標識化オリゴマーの分画を制限することが望ましいであろう。

【００８０】本発明の別の態様は、短いオリゴヌクレオチド5'-リン酸のライブラリーを含
む。該オリゴヌクレオチドは、５以下の塩基より成ることが好ましく、ペンタマ
ーがより好ましい。完全なライブラリーに必要とされるペンタマーの数は、４⁵
または１０２４の個々の化合物である。

【００８１】実際に、ライブラリーを形成するｎの長さの全てのオリゴヌクレオチド5-リン
酸を含む必要はない。所定の配列のＮヌクレオチドを生産するために必要とされ
るオリゴヌクレオチドの数が、該ライブラリー中のオリゴヌクレオチドの全部の
数と比較して小さい場合（Ｎ／ｎ＜＜４ⁿ）、部分的ライブラリーは場合により
必要とされるオリゴヌクレオチドの全てを提供する高い可能性を維持するに足る
であろう。この点の説明として、５００塩基のポリヌクレオチドは、１００のペ
ンタマー単位より成る。全てのペンタマーの完全なライブラリーは１０２４の化
合物を含み、１０倍以上過剰である。

【００８２】あまりに弱くまたはあまりに強くハイブリダイズする選択されたオリゴヌクレ
オチド配列を排除する部分的ライブラリーを使用することが望ましい。試験核酸
の配列分析のための上述のいくつかの方法において、該ライブラリーは、ｘ＋１
の標識の同定から前記工程において測定されたオリゴマーの選択された数、ｘよ
り成るように予備選択されるであろう。配列決定法において、ｘ塩基の部分的ラ
イブラリーの集積がそれぞれ使用されるであろう。各部分的ライブラリーは、前
記工程に基づいて同定されたｘ＋１のオリゴマーの異なる配列を欠くであろう。

【００８３】部分的ライブラリーは、事前にｘのオリゴマーの可能性のある組み合わせの全
てを調製することによって予備形成され得る。別法として、部分的ライブラリー
は、個々のオリゴマーから必要とされるように集積され得る。上記部分的ライブ
ラリーの集積は、自動液体操作性能を有するロボットワークステーションによっ
て達成され得る。

【００８４】一般的に、オリゴヌクレオチド5'-一リン酸のライブラリーは、特に検出可能
な標識を有する標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を含むであろう。いくつ
かの用途において、ライブラリーのメンバーの全ては、検出可能な標識を有する
であろう。他の応用において、該メンバーの予備選択された分画が、標識される
であろう。例として、例えば全ての可能性のあるオリゴマーの５個のライブラリ
ーが形成され、各ライブラリーは標識されているメンバーの異なる１／５の分画
を有する、上記開示された定量的分析の方法が挙げられる。

【００８５】ライブラリーの別の実施態様として、ライブラリーの構成物の少なくとも一つ
は、伸長不可能オリゴマーである。該伸長不可能オリゴマーは、標識されるまた
は標識されない。上記伸長不可能オリゴマーは、結紮のための3'-ＯＨが存在し
ないように、該オリゴマーの3-末端でジデオキシ塩基を有するであろう。該3'-
ＯＨは、引き続く結紮を防ぐために、例えばメチル基またはリン酸基でブロック
され得る。結紮を防ぐ末端塩基に対する修飾は、別の可能性もある。

【００８６】オリゴマーの合成−オリゴヌクレオチドは、例えばホスホロアミダート化学を含
む当業者に周知の標準的な合成法を使用して容易に合成される。オリゴヌクレオ
チドのリン酸化は、ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰを使用して、または記
載されたようなリン酸化の化学的方法によって実施される(L.A. Slotin, Synthe
sis, 737-752 (1977); T. Horn, M. Urdea, Tetrahedon Lett., 27, 4705-4708
(1986))。5'-リン酸化を実施するためのキットが、商業的に入手可能である(Pho
sphate-ON, Clontech, Palo Alto, CA)。

【００８７】オリゴヌクレオチドの自動合成のための方法が本分野及び一般的な商業的使用
において周知である。一般的な方法は、固定化の固相支持体及びヌクレオチドを
連続的に付加するための自動試薬処理を使用する。全ての添加、ブロック及び脱
ブロック工程は、コンピューター制御の下に存する。上記装置は、Applied Bios
ystems, CA (Model 392及び394)のようないくつかの商業的な供給者から入手可
能である。液体試薬及びサンプルの転移のための自動装置は、商業的に入手可能
であるような研究室のロボットを使用してコンピューター制御の下で実施できる
(Perkin-Elmer, model 800 Catalyst, Beckman Instruments Biomek)。高速度合
成または多数のオリゴヌクレオチドの合成のためのより新しい方法は、試薬及び
反応生成物の迅速で正確な輸送のために、写真石版法またはインクジェット法を
利用する。

【００８８】本発明のまたさらなる態様は、上述の態様で、一本鎖鋳型に対するオリゴヌク
レオチド5'-リン酸プライマーのアニーリング、鋳型鎖を複製する目的での両末
端からのプライマーの伸長のためのオリゴマーのライブラリーの結紮を含む。該
方法は、一本鎖鋳型をクローン化するために二本鎖にする方法で有用である。こ
れは、関連遺伝子または遺伝子ファミリーを単離するための方法において有用性
が見出されるであろう。

【００８９】例示的な方法において、プライマーオリゴヌクレオチドは、ペンタマーの全て
の可能性のある組み合わせのライブラリー、ＤＮＡリガーゼ、及び適切な反応緩
衝液の存在下で鋳型鎖にハイブリダイズする。鋳型鎖に相補的であり、該プライ
マーのオリゴヌクレオチドの5'及び3'末端で正確な整合を有するペンタマーがア
ニールし、ＤＮＡリガーゼの機能によって引き続き結紮される。それによって鋳
型鎖は、実質的に複製され、二本鎖となる。この方法は、核酸鎖の混合物中の標
的鋳型を検出し、クローニングベクター及び本分野で周知の方法を使用してクロ
ーニングのための二本鎖核酸を調製するために使用できる。

【００９０】本発明の各種の態様をより十分に記載するために、以下の実施例が、如何なる
方法においても本発明の範囲を制限せずに提示される。

【００９１】

【実施例】

実施例１．一般的方法この実験で使用される鋳型は、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝
子のエクソン１０領域のＰＣＲ増幅された生成物（２００ｂｐ）であった。ＣＦ
ＴＲ遺伝子のＰＣＲ増幅ＤＮＡを、それをカラムで移動させることによって(Qia
quick ＰＣＲ増幅キット, Qiagen, Santa Clarita, CA)またはエタノール沈降に
よってのいずれかで精製した。該ＤＮＡを、約０．５μｇ／μＬの濃度で蒸留水
中に懸濁した。5'-リン酸基を有するペンタマー及びプライマーを商業的に入手
した(Oligos Etc., Wilsonville, OR)。

【００９２】プライマー及びペンタマーを、使用される鋳型のセンス鎖またはアンチセンス
鎖のそれぞれに相補的にデザインした。この実験で使用されるプライマーの長さ
は、２１から２６ヌクレオチドまでの範囲であった。ペンタマーは、第一のペン
タマーが該プライマーの3'末端に直ぐ隣接して鋳型にアニールするようにデザイ
ンした。引き続くプライマーは、第一のペンタマーの3'末端で継続的に開始する
ようにそろえる。鋳型に対するプライマー及びペンタマーのハイブリダイゼーシ
ョンに引き続き、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結紮は、5'-3'接合で後方への結紮
を引き起こす。結紮されたプライマー−ペンタマー生成物の検出を可能にするた
めに、ビオチン−ｄＵＴＰ標識化ペンタマー（内部のｄＴＴＰ位置で）を使用し
た。

【００９３】鋳型に対するプライマー及びペンタマーのハイブリダイゼーション及びそれぞ
れの結紮は、３工程の方法で達成された。第一に、鋳型−プライマー−ペンタマ
ー混合物を９４℃に加熱し、二本鎖鋳型が変性するように５分間維持した。該プ
ライマーのサイズ及び塩基組成に依存して、該混合物を６０℃または６５℃に冷
却し、鋳型に対して２分間プライマーをアニールさせた。最後に、反応チューブ
を１６℃に冷却した。１６℃で２分後、結紮緩衝液（６６ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
、ｐＨ７．６、６．６ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、６６μＭＡＴＰ, Am
ersham)及びＴ４ＤＮＡリガーゼ、１Ｕ(Amersham, 1:10希釈）を加え、１６℃
で２時間結紮した。結紮反応を、１／１０倍の容量のローディング色素（０．０
１％キシレンシアノール及び０．０１％ブロモフェノールブルー、及び脱イオン
化ホルムアミド中に０．０１ＭＥＤＴＡ）を加えることによって停止した。

【００９４】結紮反応物を、ビオチン標識化オリゴヌクレオチドサイズマーカーと共に、変
性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＤＮＡを、抗ビオチン抗ＨＲＰ接
合物で結合したナイロン膜に毛管転移し、Lumigen PS-3（化学発光ＨＲＰ基質）
での反応によって検出し、Ｘ線フィルムに感光させた。結紮生成物のサイズは、
該プライマーに結紮したペンタマーの数に依存して変化する。

【００９５】実施例２．鋳型、プライマー及びペンタマーの光学濃度の測定鋳型：ＣＦＴＲエクソン１０の２００ｂｐＰＣＲ生成物（添付した鋳型ＤＮＡ配
列参照）を、センス(5' ACTTCACTTCTAATGATGATTATG 3')（配列番号１）及びアン
チセンス(5' CTCTTCTAGTTGGCATGCTTTGAT 3')（配列番号２）プライマーのセット
を使用してＰＣＲ増幅によって得た。

【００９６】鋳型ＤＮＡのセンス鎖に対して相補的な２６塩基のオリゴヌクレオチドを、プ
ライマー(5' AGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCA 3')（配列番号３）としてデザインし
た。

【００９７】ペンタマー：鋳型の3'末端に直ぐ隣接したセンス鎖に相補的な６個の５塩基の長
さのオリゴヌクレオチド5'-リン酸を調製した。第一のペンタマーの5'末端は、
該プライマーの3'末端の直ぐ次に整列し、第二のペンタマーの5'末端は、第一の
ペンタマーの3'末端の直ぐ次に整列し、以下同様である。結紮を容易にするため
に、各ペンタマーの5'末端は、リン酸化された。結紮生成物の検出を可能にする
ために、ペンタマー１及び３は、中央のｄＴＴＰ位置でビオチン−ｄＵＴＰで標
識され、最後のペンタマーは、3'末端でビオチンで標識された。該ペンタマーは
以下のものであった：

【００９８】ペンタマー１：5' PO₄-GTTTT 3' ペンタマー２：5' PO₄-CCU^★GG 3' U^★＝U-ビオチンペンタマー３：5' PO₄-ATTAT 3' ペンタマー４：5' PO₄-GCCU^★G 3' ペンタマー５：5' PO₄-GCACC 3' ペンタマー６：5' PO₄-ATTAA 3'-ビオチン

【００９９】結紮は、実施例１に記載された結紮条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び
結紮緩衝液(Amersham)を使用して実施された。結紮は、２０μＬの容量で実施さ
れた。鋳型の量は、反応当たり約１μｇで一定に維持された。プライマーの量は
、反応の間で１００ｎｇから１ｐｇまで変化した。各ペンタマーの量は、各反応
において２ｎｇから０．２ｐｇまで変化した。１μｇの鋳型、１００ｎｇのプラ
イマー、及び２ｎｇの各ペンタマーを有する反応は、該鋳型、プライマー及びペ
ンタマーのほぼ等モル濃度を含んだ。該プライマー及びペンタマーは、検出可能
な結紮生成物の最低量を測定するために体系的に変化した。結紮反応物は電気泳
動され、ナイロン膜に毛管転移され、抗ビオチン抗ＨＲＰ接合物で結合され、実
施例１に記載されたようにLumigen PS-3で検出された。予測されたサイズ（５６
ｂｐ）の全長プライマー−ペンタマー結紮生成物は、１００ｎｇのプライマー及
び２０ｎｇの各ペンタマー（０．６μＭ）を含む結紮反応において検出された。
結紮反応におけるより低い濃度のプライマー及びペンタマーは、これらの条件下
で非常に低い量または検出不可能な結紮生成物を生じた。

【０１００】実施例３．ペンタマーの変化する数での結紮ペンタマーが、第一のペンタマーから開始するプライマーに結紮する（該プラ
イマーの直ぐ下流で）ことを示すために、各反応において増加する数のペンタマ
ーによって、実施例２の鋳型、プライマー及びペンタマーを使用して結紮を実施
した。全ての反応は、等モル濃度（０．６μＭ）の鋳型、プライマー及び各ペン
タマーを含んだ。該結紮は、上述のように実施され、生成物は、抗ビオチン−Ｈ
ＲＰ抗体での結合及びLumigen PS-3基質での反応によって検出された。

【０１０１】予測したように、結紮生成物のサイズは、第一のペンタマーから開始する各ペ
ンタマーの添加、以下同様に従って５塩基ずつ増加した。反応において第一のペ
ンタマーが存在せず、該ペンタマーの残りのものが存在しても結紮生成物は生じ
ず、第一のペンタマーの必要性及び結紮が生じるためのペンタマーの特異性を示
した。第一の４個のペンタマーを含む一つの結紮反応において、結紮生成物の二
つのバンドが存在し、その一方は予測されたサイズであり、他方は全ての５個の
ペンタマーが反応中に存在する場合に予測されるサイズであった。ペンタマーの
配列の比較は、第三及び第四のペンタマーの間で単一の塩基の差異を明らかにし
た。第三のペンタマーは、第四のペンタマーが反応中に存在する場合第五のペン
タマーの位置でハイブリダイズするようである。

【０１０２】反応使用されたペンタマー生成物の長さ１２，３，４，５，６２６（プライマー）２１，２３６３１，２，３４１４１，２，３，４４６５１，２，３，４，５５１，５６６１，２，３，４，５，６５６反応１において、プライマー単独より成る生成物は、プライマーの標識のために
検出された。

【０１０３】実施例４．「順列からずれた」ペンタマーセットの競合この実施例は、プライマーの3'末端から開始する継続的な鎖中でプライマーに
対するペンタマーのセットの結紮が、鋳型に相補的であり継続的に整列している
が、プライマーの3'末端から「一塩基ずれた」位置で始まる第二のセットのペン
タマーの存在によって影響されないことを示す。正確なペンタマーのセット（１
−８）及び一塩基ずれたペンタマーのセット（１ａ−５ａ）の両者が、変性、６
０℃でのアニーリング及び結紮工程の間鋳型及びプライマーと共に反応中に含ま
れた。結紮反応は、等モル濃度（０．６μＭ）の鋳型、プライマー及び各ペンタ
マーを含んだ。プライマー (5' ATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCAT 3')（配列番号４）プライマー１：5' PO₄-TCU^★GT 3' プライマー１ａ：5' PO₄-CTGTT 3' プライマー２：5' PO₄-TCTCA 3' プライマー２ａ：5' PO₄-CTCAG 3' プライマー３：5' PO₄-GTTTU^★ 3' プライマー３ａ：5' PO₄-TTTTC 3' プライマー４：5' PO₄-CCU^★GG 3' プライマー４ａ：5' PO₄-CTGGA 3' プライマー５：5' PO₄-ATTAT 3' プライマー５ａ：5' PO₄-TTATG 3' プライマー６：5' PO₄-GCCU^★G 3' プライマー６ａ：5' PO₄-CCTGG 3' プライマー７：5' PO₄-GCACC 3' プライマー８：5' PO₄-ATTAA 3'-ビオチン

【０１０４】鋳型の標的領域は、以下の配列を含む： 3' TAA TTC GTG TCA CCT TCT TAA AGT AAG ACA AGA GTC AAA AGG ACC TAA TAC G
GA CCG TGG TAA TT 5' （配列番号５）反応使用されたペンタマー生成物の長さ１１，１ａ−６ａ３１（プライマー＋５）２１，２，１ａ−６ａ３６３１−３，１ａ−６ａ４１４１−４，１ａ−６ａ４６５１−５，１ａ−６ａ５１６１−６，１ａ−６ａ５６７１−７，１ａ−６ａ６１８１−８，１ａ−６ａ６６９２−８，１ａ２６（プライマー）１０１−８，１ａ−６ａ(フ゜ライマーなし）なし６個の競合的なペンタマーのセットの存在下でさえ、形成された結紮生成物は、
該プライマーに結紮されている「正確な」パンタマーの結紮の結果物であった。
反応１０は、プライマーの存在が、結紮が生じるために必要であることを確認し
た。一塩基ずれたペンタマーは、正確なペンタマーの結紮を妨げないようであっ
た。

【０１０５】実施例５．標識化された「順列からずれた」ペンタマーの競合ペンタマー１ａをビオチン化する以外、実施例４と同様の実験を実施した。こ
れは、ペンタマー１ａ−６ａのセットから得られた何れかの結紮生成物の形成を
、直接的に観察する機会を与えた。結紮生成物は、一塩基ずれたペンタマーのセ
ットから観察されなかった。

【０１０６】実施例６．ＪＨ下流鋳型を使用した結紮実験プライマー誘導ペンタマー結紮法はまた、プラスミドベクター内にクローン化
されたイムノグロブリン重鎖結合領域（ＪＨ）の７００ｂｐのＤＮＡ下流を鋳型
として使用して得られた。ＪＨ下流領域は、ＰＣＲによって増幅され、プラスミ
ドベクター内にクローン化され、次いで十分な量の鋳型ＤＮＡを得るためにＥｃ
ｏＲＩで該ベクターが切断された。制限切断は、アガロースゲル上で分離され、
興味あるＤＮＡバンドがゲル抽出キット(Qiagen)を使用して抽出された。該ＤＮ
Ａは、約０．５μｇ／μｌの濃度で蒸留水中に再懸濁された。

【０１０７】この鋳型で使用されるプライマー及びペンタマーは、以下に示される：２１マーのプライマー：5' GAAACCAGCTTCAAGGCACTG 3'（配列番号６）ペンタマー１：5' リン酸 AGGU^★C 3' ペンタマー２：5' リン酸 CU^★GGA 3' ペンタマー３：5' リン酸 GCCU^★C 3' ペンタマー４：5' リン酸 CCU^★AA 3' ペンタマー５：5' リン酸 GCCCC 3'-ビオチン

【０１０８】結紮は、それぞれ２０μＬの結紮反応において、５００ｎｇの鋳型、１００ｎ
ｇのプライマー、及び２０ｎｇの各ペンタマーで実施された。ペンタマーの数は
、結紮生成物のサイズが、各ペンタマーの付加で５塩基ずつ増加することを示す
ために、各連続的な結紮反応において増加した。

【０１０９】実施例１の一般的方法に従って結紮反応を実施した後、連続的なペンタマーの
それぞれの付加によって結紮生成物のサイズが５塩基ずつ増加した。第一の４個
のペンタマーを含む結紮反応において二つのバンドが存在し、上部のバンドは下
部のバンドよりより際立っていた。上部のバンドのサイズは、全ての５個のペン
タマーが結紮のために使用された場合と同様であった。これはおそらく、第三と
第四のペンタマーの間で配列の相同性が存在し、そのため第三のペンタマーが第
五のペンタマーの位置で結紮されるためであろう。

【０１１０】実施例７．各種の温度での結紮実施例６の鋳型、プライマー及び第一の４個のペンタマーを使用する結紮が、
ミスマッチ認識に対する結紮温度の効果を調べるために、３０℃、３７℃、４０
℃及び４５℃で実施された。鋳型、プライマー及びペンタマーの濃度は、以前の
実験と同様であった。平行な反応が実施され、４個のペンタマー及び５個のペン
タマーの伸長生成物の相対量が評価された。３０℃の結紮温度では、正確なサイ
ズ及び非特異的結紮生成物が、同じ強度で存在した。より多くの正確なサイズの
結紮生成物が、３７℃及び４０℃の結紮温度で検出された。４５℃では、検出さ
れた正確なサイズの結紮生成物の量は減少した。

【０１１１】実施例８．オクタマーを使用した結紮ｐＵＣ１８プラスミド鋳型に対して特異的な２３マーのプライマーに対する、
5'リン酸及び内部ビオチン標識を有するオクタマーの結紮を、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ(Amersham)、ＴａｑＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)及びAmpligase^T
^M(Epicenter Technologies, Madison, WI)、ＮＡＤ依存的熱安定性リガーゼ、そ
れぞれに関して使用される結紮緩衝液を使用して実施した。これらの実験におい
て、１００から８００ｎｇのＥｃｏＲＩ線状化プラスミド鋳型を使用した。該プ
ライマー及びオクタマーの濃度は、反応当たり１２ｐｍｏｌであった。

【０１１２】Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑＤＮＡリガーゼでの実験において、最初に、
鋳型、プライマー及びペンタマー混合物を、９４℃で５分加熱し、鋳型に対する
プライマーのアニーリングのために６０℃で２分冷却し、さらに１６℃（Ｔ４
ＤＮＡリガーゼについて）または４５℃（ＴａｑＤＮＡリガーゼについて）で
２分温度を下げた。次いでそれぞれの結紮緩衝液及び酵素（１Ｕ／反応）を加え
、２時間結紮した。

【０１１３】 Ampligaseでの結紮のため、鋳型、プライマー及びオクタマー（上述の通り）
を含む結紮混合物を、９４℃で５分加熱し、次いで９４℃で５分及び４５℃で５
分の温度サイクル（３５サイクル）を結紮のために使用した。Ampligaseを使用
した別の実験において、ｐＵＣ１８（１００ｂｐ）の短いＰＣＲ生成物を鋳型と
して使用し、結紮条件は９４℃で１分、５５℃で１分及び１５℃で５分の全部で
２０サイクルであった。

【０１１４】結紮生成物を、８％ＰＡＧＥ−Ｕｒｅａゲルで電気泳動し、正に荷電したナイ
ロン膜上に半乾燥ブロットし(Hoefer TE90ブロッター)、ＵＶ架橋し、ＨＲＰに
接合した抗ビオチン抗体でインキュベーションし、Lumigen PS-3基質で検出した
。

【０１１５】直線化ｐＵＣ１８プラスミドを使用したＴ４ＤＮＡリガーゼ及びAmpligaseで
は、予測されたサイズの結紮生成物が検出された。しかしながら、使用された条
件下で、Ampligaseは、検出された結紮生成物の量から明らかなように、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼよりもかなり非効率的であった。ＴａｑＤＮＡリガーゼ反応は、
検出可能な結紮生成物を生じなかった。ｐＵＣ１８の短いＰＣＲ生成物を使用し
て、Ampligase結紮は、全長ｐＵＣ１８を使用した場合より多くの結紮生成物を
生じた。

【０１１６】実施例９．二方向性結紮この実験において、5'-リン酸化プライマーを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し
て5'-リン酸基でペンタマーのセットに両末端で結紮した。ＣＦＴＲＰＣＲ生成
物鋳型、プライマー及びペンタマーの混合物を、９４℃で５分加熱し、プライマ
ーを６５℃で５分アニールさせ、ペンタマーを１６℃で２時間結紮した。結紮緩
衝液及び酵素を、反応混合物を１６℃で２分置いた後に加えた。反応混合物を電
気泳動し、ブロットし、実施例８のように検出した。該ペンタマーを、プライマ
ーから5'及び3'の両方向で該プライマーに結紮した。観察された生成物のバンド
のサイズは、該セット中のそれぞれのペンタマーの結紮によってのみ生じること
ができた。プライマーの5'末端でのペンタマーの結紮から生じる結紮生成物の信
号は、プライマーの3'末端で結紮されたものよりも弱かった。これは、二つの方
向における結紮効率の差異、または二つのペンタマーセットのビオチンでの標識
の差異のいずれかのためであろう。

【０１１７】実施例１０．各種の温度での等温での結紮鋳型結合プライマー上での5-リン酸化オクタマーのセットの結紮を、加熱及び
鋳型に対するプライマーのアニーリング以外で一定の温度で実施した。結紮反応
の全ての構成成分−鋳型、プライマー、オクタマー、結紮緩衝液及びリガーゼを
、室温で加え、２５℃、３０℃、３７℃、または４５℃で２時間のそれぞれで結
紮した。１０ｎｇから８００ｎｇまでの範囲の濃度での線状化ｐＵＣ１８（Ｅｃ
ｏｒＩ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用した結紮のための鋳型として使用した
。使用されたプライマー及びオクタマーの濃度は、各反応で１２ｐｍｏｌであっ
た。

【０１１８】等温での結紮（３７℃、４５℃、５５℃、６５℃）を、ＴａｑＤＮＡリガー
ゼ、Ampligase及びＰｆｕＤＮＡリガーゼでも、それぞれの結紮緩衝液で実施し
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの場合、結紮生成物は、使用された全ての等温条件で
検出可能であった。３７℃では、１０ｎｇ程度の鋳型が、検出可能な結紮生成物
を生じた。より多い量の鋳型は、強力な信号で結紮生成物を生じた。

【０１１９】他のリガーゼは、等温条件下で何れの検出可能な結紮生成物も生じなかった。

【０１２０】上述の記載及び実施例は、説明的なものであり、制限的なものとして考慮され
るべきではない。特に開示されていない特別な化合物及び方法の修正型は、本発
明の精神及び範囲から外れることなくなすことができると解される。本発明の範
囲は、添付された請求の範囲によってのみ制限される。

【０１２１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、競合的な非結紮可能である相補的オリゴマーＰ３の存
在下で、鋳型結合プライマーへの二つのオリゴマーＰ１及びＰ２の結紮を表す模
式図である。

【図２】図２は、多数のオリゴマーの鋳型結合プライマー誘導結紮を使
用した、核酸の量を増幅するための方法を表す模式図である。合成は、各鎖にお
いて一方向で生ずるように示されているが、以下に記載するように二方向で達成
することもできる。

【図３】図３は、鋳型結合プライマーに対する検出可能な標識化突然変
異特異的オリゴマーの結紮による、遺伝子中の点突然変異を検出するための方法
を表す模式図である。

【図４】図４は、鋳型結合プライマーに対する検出可能な標識化突然変
異特異的または野生型特異的オリゴマーの異なるセットの結紮による、遺伝子中
の突然変異の二つの異なる遺伝子型を検出するための方法を表す模式図である。

【図５】図５は、分枝したＤＮＡまたは増幅マルチマーの例を表す模式
図である。

【図６】図６は、少なくとも第一の分枝が、規則的な間隔で分枝点を提
供するための標識化オリゴマーの結紮により調製される分枝したＤＮＡの適用を
表す模式図である。

【図７】図７は、鋳型結合プライマーに対する独特の標識化オリゴマー
の結紮、該標識の切断、及び各独特の標識の分子量の分析による、核酸の配列を
決定するための方法を表す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０９／２４１，９７９ (32)優先日平成11年２月２日(1999．2．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／２４５，９８４ (32)優先日平成11年２月５日(1999．2．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＩＬ，ＪＰＦターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 CA11 HA14 HA19 4B063 QA01 QA17 QA18 QQ03 QQ42 QQ52 QR20 QR32 QR35 QR56 QR62 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的一本鎖核酸鋳型の少なくとも一部に相補的な核酸の鎖を
合成する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）該標的一本鎖核酸鋳型の一部に相補的であるプライマーを提供すること；ｂ）一本鎖領域及び二本鎖領域を有するプライマー−鋳型ハイブリッドを形成す
るために、該鋳型と該プライマーをハイブリダイズすること；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と該プライマー−鋳型ハイブリッド
を接触させること；ｄ）二本鎖領域を伸長し、それによって該鋳型の一部に相補的である核酸鎖を合
成するために、多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを
配列中の該プライマー−鋳型ハイブリッドに結紮すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴とする
請求項１記載の方法。
【請求項３】該リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特徴と
する請求項１記載の方法。
【請求項４】該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが同数の塩基
を含み、該塩基数が２から１０までであることを特徴とする請求項１記載の方法
。
【請求項５】該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが同数の塩基
を含み、該塩基数が２から６までであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが５塩基を含
むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸がオリゴヌクレオチ
ド5'-一リン酸の予備選択されたセットであることを特徴とする請求項４記載の
方法。
【請求項８】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸が、Ａ、Ｃ、Ｇ及び
Ｔを含む同じ長さの全ての可能性のあるオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少な
くとも５０％を含むオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のライブラリーであること
を特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項９】核酸の鎖の合成が一方向で進み、該プライマーの3'末端への
結紮によって進行することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】核酸の鎖の合成が一方向で進み、該プライマーの5'末端へ
の結紮によって進行することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】該プライマーが5'-リン酸基を含み、核酸の鎖の合成が二
方向で進むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】該プライマーが固相に固定化されることを特徴とする請求
項１記載の方法。
【請求項１３】該プライマーが溶液中に存在することを特徴とする請求項
１記載の方法。
【請求項１４】該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつか
が検出可能な標識を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】該検出可能な標識が、放射性同位元素、化学発光標識、蛍
光標識、色素生成標識、酵素、結合タンパク質、抗原、抗体及びハプテンから選
択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】該検出可能な標識が、検出の前に合成された相補的な核酸
鎖から切断されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】該切断された標識の検出が、該切断された標識の分子量を
測定することによって実施されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】少なくとも一つの伸長不可能なオリゴマーの組み込みをさ
らに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】試験核酸の塩基配列の一部に相補的である塩基配列を有す
る領域を有する固定化一本鎖核酸を合成する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）該試験一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供す
ること；ｂ）該試験一本鎖核酸を捕獲し、一本鎖領域及び二本鎖領域を有する捕獲された
プローブ−試験核酸ハイブリッドを形成するためのハイブリダイゼーション条件
下で、該試験一本鎖核酸と捕獲プローブ／プライマーを接触させること；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と捕獲されたハイブリッドを接触さ
せること；ｄ）二本鎖領域を伸長するために、捕獲プローブ／プライマーに対して多数のオ
リゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）結紮しないオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；及びｆ）固体の支持体から該試験核酸を取り出し、固定化された一本鎖核酸を提供す
るために、伸長した二本鎖領域を有する捕獲されたプローブ−試験核酸ハイブリ
ッドを変性すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】第一の鎖及び第二の鎖を有する二本鎖核酸の一部の量を増
幅する方法であり：ａ）第一の鎖の領域に相補的である第一のプライマー、及び第二の鎖の領域に相
補的である第二のプライマーを提供すること、ここで該第一及び第二の領域は、
増幅される二本鎖核酸の一部を定義する；ｂ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を提供すること；ｃ）二本鎖核酸の第一及び第二の鎖を分離すること；ｄ）分離された鎖と第一及び第二のプライマーをハイブリダイズすること；ｅ）二本鎖領域を伸長し、それによって該鋳型の一部に相補的である核酸鎖を合
成するために、多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともいくつかを
配列中のハイブリダイズした第一及び第二のプライマーに結紮すること；ｆ）二本鎖核酸の増幅された一部の量を増大するために、工程ｃ−ｅを繰り返す
こと；を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴とす
る請求項２０記載の方法。
【請求項２２】該リガーゼ酵素が熱安定性であることを特徴とする請求項
２１記載の方法。
【請求項２３】該プライマーの少なくとも一つが5'-リン酸基を含み、多
数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の、5'-リン酸基を含む少なくとも一つのプ
ライマーに対する結紮が二方向で進むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】さらに少なくとも一つの伸長不可能なオリゴマーの組み込
みを含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】該一本鎖核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレオ
チド5'-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項１
記載の方法。
【請求項２６】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションは許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２７】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上が結紮
され、オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮がハイブリダイズしたプライマー
の存在においてのみ生ずることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２８】該一本鎖核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレオ
チド5'-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項１
９記載の方法。
【請求項２９】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションは許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３０】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上が結紮
され、オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮がハイブリダイズしたプライマー
の存在においてのみ生じることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３１】該核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレオチド5'
-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項２０記載
の方法。
【請求項３２】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションは許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３３】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上が結紮
され、オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮がハイブリダイズしたプライマー
の存在においてのみ生じることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３４】ａ）一本鎖核酸鋳型、及び該一本鎖核酸鋳型の一部に相補
的であるプライマーを提供すること；ｂ）一本鎖領域及び二本鎖領域を有するプライマー−鋳型ハイブリッドを形成す
るために、該鋳型と該プライマーをハイブリダイズすること；ｃ）多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸と該プライマー−鋳型ハイブ
リッドを接触させること、ここで各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸は標識され
ている；ｄ）二本鎖領域を伸長するために、一つの継続的な方法で該プライマーに対して
隣接した態様で多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上を結紮
すること、ここでオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮はハイブリダイズした
プライマーの存在においてのみ生ずる；の工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが５塩
基を含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが同じ
長さを有することを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３７】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のいくつかが、多
数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の他のものとは異なる塩基数を含むことを
特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴とす
る請求項３４記載の方法。
【請求項３９】該リガーゼ酵素が、Ｔ４リガーゼ、Ｔ７リガーゼ、Ｔｔｈ
リガーゼ、Ｔａｑリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼから選択されることを特徴
とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】該リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特徴
とする請求項３８記載の方法。
【請求項４１】該プライマーが固相に固定化されることを特徴とする請求
項３４記載の方法。
【請求項４２】該プライマーが溶液中に存在することを特徴とする請求項
３４記載の方法。
【請求項４３】該鋳型から伸長したプライマーを分離することをさらに含
むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４４】各標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸が同じ標識で標
識されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４５】各標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸が、オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸特異的標識で標識されることを特徴とする請求項３４記載
の方法。
【請求項４６】各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸が１個の標識を含むこ
とを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４７】各標識が、放射性同位元素、化学発光標識、蛍光標識、色
素生成標識及び酵素から選択された検出可能な標識であることを特徴とする請求
項３４記載の方法。
【請求項４８】各標識が、結合タンパク質、抗原、抗体、ハプテン及びオ
リゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４９】該核酸鎖の合成を終結する少なくとも一つの伸長不可能オ
リゴマーの組み込みをさらに含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項５０】伸長不可能オリゴマーのそれぞれが、3'末端でジデオキシ
塩基を有するオリゴマー、3'末端でブロックされた3'-ＯＨ基を有するオリゴマ
ー、及び5'末端でリン酸基を欠くオリゴマーから選択されることを特徴とする請
求項４９記載の方法。
【請求項５１】工程ｄ）で合成された核酸鎖の合成が、一本鎖核酸鋳型に
相補的で、二本鎖領域を伸長するために必要な配列を有する少なくとも一つのオ
リゴヌクレオチド5'-一リン酸を、多数のオリゴヌクレオチド5'−一リン酸から
排除することによって、所定の位置で終結することを特徴とする請求項３４記載
の方法。
【請求項５２】核酸の鎖の合成が一方向で進み、該プライマーの3'末端へ
の結紮によって進行することを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項５３】該プライマーが5'-リン酸基を含み、核酸の鎖の合成が一
方向で進み、該プライマーの5'末端への結紮によって進行することを特徴とする
請求項３４記載の方法。
【請求項５４】該プライマーが5'-リン酸基を含み、核酸の鎖の合成が該
プライマーの両末端から進行することを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項５５】該一本鎖核酸鋳型が既知の配列の断片を有し、該プライマ
ーが既知の配列の断片の一部に相補的であり、多数の標識化オリゴヌクレオチド
5'-一リン酸が、該プライマーに隣接した該鋳型の既知の配列の断片の一部に相
補的であるように選択された標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸のセットを
含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項５６】該一本鎖核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレオ
チド5'-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項３
４記載の方法。
【請求項５７】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションを許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項５８】両方の鎖が標識化された、標識化二本鎖核酸を合成する方
法であり、該方法は以下の工程：ａ）二本鎖核酸鋳型、該鋳型の第一の鎖の領域に相補的である第一のプライマー
、及び該鋳型の第二の鎖の領域に相補的である第二のプライマー、及び各オリゴ
ヌクレオチド5'-一リン酸が標識された多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一リ
ン酸を提供すること；ｂ）該二本鎖核酸の第一及び第二の鎖を分離すること；ｃ）第一及び第二のプライマー−鋳型ハイブリッドを形成するために分離された
鎖と第一及び第二のプライマーをハイブリダイズすること；ｄ）第一及び第二のプライマーを伸長し、それによって二本鎖核酸を生産するた
めに、継続的な方法で各プライマー−鋳型ハイブリッドに対して隣接した態様で
多数の標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上を結紮すること、ここ
でオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮は、ハイブリダイズしたプライマーの
存在においてのみ生じる；及びｅ）工程ｂ−ｄを少なくとも一度繰り返すこと；を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】該核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレオチド5'
-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項５８記載
の方法。
【請求項６０】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションを許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６１】核酸分析物を検出する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）一本鎖形態の核酸分析物、及び該分析物の一部に相補的であるプライマーを
提供すること；ｂ）プライマー−分析物ハイブリッドを形成するために、該分析物と該プライマ
ーをハイブリダイズすること；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と該プライマー−分析物ハイブリッ
ドを接触させること、ここで該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくともい
くつかは標識される；ｄ）一つの継続的な方法で該プライマーに対して隣接した態様で多数のオリゴヌ
クレオチド5'-一リン酸の一つ以上を結紮すること、ここで少なくとも一つの標
識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸が結紮され、オリゴヌクレオチド5'-一リン
酸の結紮はハイブリダイズしたプライマーの存在においてのみ生ずる；ｅ）全ての非結紮化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；及びｆ）工程ｄの標識化核酸を検出すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】一本鎖核酸鋳型が既知の断片を有し、該プライマーが既知
の配列の断片の一部に相補的であり、多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸が
、少なくともいくつかが標識され、該プライマーに隣接して該鋳型の既知の配列
の断片の一部に相補的であるように選択されたオリゴヌクレオチド5'-一リン酸
のセットを含むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６３】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが、２
から１０までの塩基を含むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６４】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが、５
塩基を含むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６５】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれが、同
じ長さを有することを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６６】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のいくつかが、多
数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の他のものとは異なる塩基数を含むことを
特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６７】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴とす
る請求項６１記載の方法。
【請求項６８】該リガーゼ酵素が、Ｔ４リガーゼ、Ｔ７リガーゼ、Ｔｔｈ
リガーゼ、Ｔａｑリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼから選択されることを特徴
とする請求項６７記載の方法。
【請求項６９】該リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特徴
とする請求項６７記載の方法。
【請求項７０】該プライマーが固相に固定化されることを特徴とする請求
項６１記載の方法。
【請求項７１】該プライマーが溶液中に存在することを特徴とする請求項
６１記載の方法。
【請求項７２】該鋳型から伸長したプライマーを分離することをさらに含
むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項７３】各標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸が、同じ標識で
標識されることを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項７４】各標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸がオリゴヌクレ
オチド5'-一リン酸特異的標識で標識されることを特徴とする請求項６１記載の
方法。
【請求項７５】各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸が１個の標識を含むこ
とを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項７６】各標識が、放射性同位元素、化学発光標識、蛍光標識、色
素生成標識及び酵素から選択されることを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項７７】各標識が、結合タンパク質、抗原、抗体、ハプテン及びオ
リゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項７８】少なくとも一つの標識が、検出可能に標識された分枝した
増幅マルチマーに結合し、該分析物が、結合した増幅マルチマー上の標識を検出
することによって検出されることを特徴とする請求項７７記載の方法。
【請求項７９】ａ）酵素及び該標識に対して特異的な結合親和性を有する
物質の接合物で標識を結合すること；及びｂ）検出可能な反応生成物を生産するために該酵素に対する基質で該結合酵素接
合物を反応させること；の工程をさらに含むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項８０】該基質との該酵素の反応が、検出可能な生成物として化学
発光を生ずることを特徴とする請求項７９記載の方法。
【請求項８１】該一本鎖核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレオ
チド5'-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項６
１記載の方法。
【請求項８２】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションを許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項８３】標的核酸を検出する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）多数のオリゴヌクレオチド5'-リン酸を提供すること、ここで該オリゴヌク
レオチド5'-リン酸の少なくともいくつかは標識として蛍光挿入色素を含む；ｂ）該標的核酸の一部に相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する
こと；ｃ）一本鎖領域及び二本鎖領域を有するプライマー−標的二本鎖を形成するハイ
ブリダイゼーション条件下で、該標的核酸と該プライマーを接触させること；ｃ）多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と該二本鎖を接触させること；ｄ）二本鎖領域を伸長するため、該二本鎖に対して多数のオリゴヌクレオチド5'
-一リン酸の少なくともいくつかを結紮すること；ｅ）挿入されて結合した標識から得た蛍光を検出すること。を含むことを特徴とする方法。
【請求項８４】該標的核酸、プライマー及び多数のオリゴヌクレオチド5'
-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項８３記載
の方法。
【請求項８５】該プライマーが少なくとも１５塩基を有し、各オリゴヌク
レオチド5'-一リン酸が１０以下の塩基を有し、プライマーのハイブリダイゼー
ション及び結紮の工程が、該プライマーの安定なハイブリダイゼーションを許す
が、該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の安定なハイブリダイゼーションを許さ
ない条件下で実施されることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項８６】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上が標識
され、オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮がハイブリダイズしたプライマー
の存在においてのみ生じることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項８７】サンプル中の異なる核酸配列の間を識別する方法であり、
該方法は以下の工程：ａ）該サンプル及び異なる核酸配列のそれぞれの部分に相補的であるプライマー
を提供すること；ｂ）プライマー−核酸ハイブリッドを形成するために、該配列と該プライマーを
ハイブリダイズすること；ｃ）識別される各配列に対して、該配列に相補的で該プライマーに対して隣接し
て結紮可能なオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のセットを含む、多数のオリゴヌ
クレオチド5'-一リン酸と該プライマー−核酸ハイブリッドを接触させること、
ここで各セット中のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の少なくとも一つは、各セ
ットに独特な標識で標識される；ｄ）一つの継続的な方法で該プライマーに対して隣接した態様で多数のオリゴヌ
クレオチド5'-一リン酸の一つ以上を結紮すること、ここでサンプル中に存在す
る各配列に対して、少なくとも一つの標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を
含むオリゴヌクレオチド5'-リン酸のセットが結紮され、オリゴヌクレオチド5'-
一リン酸の結紮はハイブリダイズしたプライマーの存在においてのみ生ずる；ｅ）全ての非結紮化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；及びｆ）工程ｄの標識化核酸生成物を検出すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項８８】異なる核酸配列の一つが正常な配列を表し、他方の配列が
それぞれ異なる突然変異を含むことを特徴とする請求項８７記載の方法。
【請求項８９】各異なる核酸配列が異なる突然変異を含むことを特徴とす
る請求項８７記載の方法。
【請求項９０】該異なる配列が異なる遺伝子型を表すことを特徴とする請
求項８７記載の方法。
【請求項９１】標識化核酸生成物の検出が、遺伝学的条件についての異種
接合体並びに第一及び第二の同型接合体の識別を可能にすることを特徴とする請
求項９０記載の方法。
【請求項９２】もし二本鎖形態で存在するならば、サンプル中の核酸が、
該プライマーをハイブリダイズする前またはその間で一本鎖に分離されることを
特徴とする請求項８７記載の方法。
【請求項９３】該配列、プライマー及び多数のオリゴヌクレオチド5'-一
リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項８７記載の方
法。
【請求項９４】相補的な鎖の塩基配列を決定することによって一本鎖核酸
の一部の塩基配列を決定する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供すること
；ｂ）捕獲されたプローブ−核酸ハイブリッドを形成するために、一本鎖核酸と捕
獲プローブ／プライマーをハイブリダイズすること；ｃ）多数の標識化された同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と捕獲され
たハイブリッドを接触すること、各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸はオリゴヌ
クレオチド特異的標識を有する；ｄ）相補的な鎖を合成するために、一つの継続的な方法で捕獲プローブ／プライ
マーに対して連続した手段で多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の一つ以上
を結紮すること、ここでオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の結紮はハイブリダイ
ズしたプライマーの存在においてのみ生ずる；ｅ）全ての非結紮化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去すること；ｆ）結紮において付着した多数の標識を検出すること；ｇ）検出された多数の標識を、その相当するオリゴヌクレオチド5'−一リン酸の
同一性に関連づけること；ｈ）工程ｇで同定された多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の同一性から、
核酸配列の一部の塩基配列を決定すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項９５】捕獲プローブ／プライマーが、該一本鎖核酸とのハイブリ
ダイゼーションの前に固体の支持体に固定化されることを特徴とする請求項９４
記載の方法。
【請求項９６】捕獲プローブ／プライマーが、工程ｄにおいて該オリゴヌ
クレオチド5'-一リン酸を結紮した後に固体の支持体に固定化されることを特徴
とする請求項９４記載の方法。
【請求項９７】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴とす
る請求項９４記載の方法。
【請求項９８】該リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特徴
とする請求項９４記載の方法。
【請求項９９】多数の同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれ
ぞれにおける塩基数、ｎが４から８の範囲の整数であることを特徴とする請求項
９４記載の方法。
【請求項１００】多数の同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそ
れぞれにおける塩基数が５または６のいずれかであることを特徴とする請求項９
９記載の方法。
【請求項１０１】多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸が、同数の塩基
の全ての可能性のあるオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を含むことを特徴とする
請求項９９記載の方法。
【請求項１０２】各オリゴヌクレオチド特異的標識が独特の分子量を有す
ることを特徴とする請求項９４記載の方法。
【請求項１０３】各標識の少なくとも一部が合成された相補的核酸鎖から
切断され、各標識の切断された部分が検出されることを特徴とする請求項１０２
記載の方法。
【請求項１０４】該標識が、該標識の切断された部分の分子量を測定する
ことによって検出されることを特徴とする請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】該標識が1,2-ジオキセタンを含み、該ジオキセタンが熱
的、化学的または酵素的に切断されることを特徴とする請求項１０２記載の方法
。
【請求項１０６】該結紮が該プライマーの3'末端から進行することを特徴
とする請求項９４記載の方法。
【請求項１０７】該プライマーが5'-リン酸基を含み、結紮が該プライマ
ーの5'末端から進行することを特徴とする請求項９４記載の方法。
【請求項１０８】該一本鎖核酸が、二本鎖核酸を分離することによって生
産されることを特徴とする請求項９４記載の方法。
【請求項１０９】該一本鎖核酸鋳型、プライマー及び多数のオリゴヌクレ
オチド5'-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項
９４記載の方法。
【請求項１１０】相補的な鎖の塩基配列を決定することによって一本鎖核
酸の一部の塩基配列を決定する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供すること
；ｂ）多数の標識された同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のセットを形
成すること、各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸はオリゴヌクレオチド特異的標
識を有し、それぞれのセットは多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を含み、
ここで全ての他のセットに存在する一つの標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン
酸は各セットから排除される；ｃ）標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の各セットについて、該一本鎖核酸
と該捕獲プローブ／プライマーをハイブリダイズすること；ｄ）標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の各セットについて、別の反応中で
捕獲されたハイブリッドと各セットを接触させること；ｅ）一つの継続的な方法で捕獲プローブ／プライマーに対して隣接した態様で標
識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の各セットを結紮すること、ここでオリゴ
ヌクレオチド5'-一リン酸の結紮はハイブリダイズしたプライマーの存在におい
てのみ生ずる；ｆ）各セット中の全ての非結紮化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去するこ
と；ｇ）各セットについて、結紮中に付着した全ての標識を同定し、それによって各
セットで結紮した全てのオリゴヌクレオチド5'−一リン酸の数及び塩基配列を決
定し、相補的な鎖の塩基配列において排除されたオリゴヌクレオチド5'-一リン
酸の相対的位置を決定すること；ｈ）排除されたオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれの相対的位置、また
は組み合わされた全てのセットの結紮されたオリゴヌクレオチド5'-一リン酸の
数及び塩基配列のそれぞれから、相補的鎖の塩基配列を推定すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１１】多数のセット中のセットの数がＮ／ｎに等しく、ここで
ｎはオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれにおける塩基の数であり、Ｎは
配列決定される一本鎖核酸の部分における塩基の数であることを特徴とする請求
項１１０記載の方法。
【請求項１１２】多数のセット中のセットの数が、実質的に全ての可能性
のある上記セット、４ⁿを表し、ここでｎは該オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の
それぞれにおける塩基の数であることを特徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１１３】オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の多数のセットにおけ
る各セットがさらに、欠如しているオリゴヌクレオチド5'-一リン酸と同じ塩基
配列を含む独特の伸長不可能オリゴマーを含むことを特徴とする請求項１１０記
載の方法。
【請求項１１４】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴と
する請求項１１０記載の方法。
【請求項１１５】該リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特
徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１１６】同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれ
における塩基数、ｎが、４から８の範囲の整数であることを特徴とする請求項１
１０記載の方法。
【請求項１１７】同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれ
における塩基数が、５または６のいずれかであることを特徴とする請求項１２４
記載の方法。
【請求項１１８】該捕獲プローブ／プライマーが、一本鎖核酸とのハイブ
リダイズの前に固体の支持体に固定化されることを特徴とする請求項１１０記載
の方法。
【請求項１１９】該捕獲プローブ／プライマーが、工程ｅにおける該オリ
ゴヌクレオチド5'−一リン酸を結紮した後に固体の支持体に固定化されることを
特徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１２０】各オリゴヌクレオチド特異的標識が独特の分子量を有す
ることを特徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１２１】各標識の少なくとも一部が合成された相補的な核酸鎖か
ら切断され、各標識の切断された部分が検出されることを特徴とする請求項１２
０記載の方法。
【請求項１２２】該標識が、該標識の切断部分の分子量を測定することに
よって検出されることを特徴とする請求項１２１記載の方法。
【請求項１２３】該標識が1,2-ジオキセタンを含み、該ジオキセタンが熱
的、化学的または酵素的に切断されることを特徴とする請求項１２１記載の方法
。
【請求項１２４】該結紮が該プライマーの3'末端から進行することを特徴
とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１２５】該プライマーが5'-リン酸基を含み、結紮が該プライマ
ーの5'末端から進行することを特徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１２６】該一本鎖核酸が二本鎖核酸を分離することによって生産
されることを特徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１２７】相補的な鎖の塩基配列を決定することによって一本鎖核
酸の一部の配列を決定する方法であり、該方法は以下の工程：ａ）一本鎖核酸の一部に相補的である捕獲プローブ／プライマーを提供すること
；ｂ）多数の標識された同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のセットを形
成すること、各オリゴヌクレオチド5'-一リン酸は同じ検出可能な標識を有し、
それぞれのセットは多数のオリゴヌクレオチド5'-一リン酸を含み、ここで全て
の他のセットに存在する一つの標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸は各セッ
トから排除される；ｃ）捕獲されたプローブ−核酸ハイブリッドを形成するために、該一本鎖核酸と
捕獲プローブ／プライマーをハイブリダイズすること；ｄ）標識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の各セットについて、別の反応中で
捕獲されたハイブリッドと該セットを接触させること；ｅ）一つの継続的な方法で捕獲プローブ／プライマーに対して隣接した態様で標
識化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸の各セットを結紮すること、ここでオリゴ
ヌクレオチド5'-一リン酸の結紮はハイブリダイズしたプライマーの存在におい
てのみ生ずる；ｆ）各セット中の全ての非結紮化オリゴヌクレオチド5'-一リン酸を除去するこ
と；ｇ）各セットにおいて、結紮中に付着した標識の数を測定し、それによって相補
的な鎖の塩基配列における排除されたオリゴヌクレオチド5'−一リン酸の相対的
位置を決定すること；及びｈ）排除されたオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれの相対的位置から、
相補的鎖の塩基配列を推定すること；を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２８】該結紮がリガーゼ酵素によって実施されることを特徴と
する請求項１２７記載の方法。
【請求項１２９】該リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特
徴とする請求項１２７記載の方法。
【請求項１３０】同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれ
における塩基の数、ｎが、４から８の範囲の整数であることを特徴とする請求項
１２７記載の方法。
【請求項１３１】同じ長さのオリゴヌクレオチド5'-一リン酸のそれぞれ
における塩基の数が、５または６のいずれかであることを特徴とする請求項１２
７記載の方法。
【請求項１３２】該捕獲プローブ／プライマーが、一本鎖核酸とのハイブ
リダイズの前に固体の支持体に固定化されることを特徴とする請求項１２７記載
の方法。
【請求項１３３】該捕獲プローブ／プライマーが、工程ｄにおける該オリ
ゴヌクレオチド5'−一リン酸を結紮した後に固体の支持体に固定化されることを
特徴とする請求項１２７記載の方法。
【請求項１３４】該検出可能な標識が、放射性同位元素、化学発光標識、
蛍光標識、色素生成標識、酵素、結合タンパク質、抗原、抗体及びハプテンから
選択されることを特徴とする請求項１２７記載の方法。
【請求項１３５】該結紮が該プライマーの3'末端から進行することを特徴
とする請求項１２７記載の方法。
【請求項１３６】該プライマーが5'-リン酸基を含み、結紮が該プライマ
ーの5'末端から進行することを特徴とする請求項１２７記載の方法。
【請求項１３７】該一本鎖核酸が二本鎖核酸の分離によって生産されるこ
とを特徴とする請求項１２７記載の方法。
【請求項１３８】該一本鎖核酸、プライマー及び多数のオリゴヌクレオチ
ド5'-一リン酸が、反応混合物中で共に提供されることを特徴とする請求項１２
７記載の方法。