DE69133074T2

DE69133074T2 - Einen basischen Fibroblastwachstumsfaktor enthaltende Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten

Info

Publication number: DE69133074T2
Application number: DE69133074T
Authority: DE
Inventors: Keigo Hanada; Yoshiyuki Hiyama; Makoto Tamura
Original assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2011-12-18
Also published as: JP3135138B2; ATE220915T1; EP0493737B1; ES2180527T3; EP0493737A1; EP0493737A3; JPH05124975A; DE69133074D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Analogen für den menschlichen Fibroblastwachstumsfaktor zur Behandlung von Knochenkrankheiten, wie traumatischer Fraktur, Verschleißfraktur, pathologischer Fraktur, etc.

Stand der Technik

Zur Behandlung traumatischer Frakturen oder Verschleißfrakturen besteht ein Verfahren aus der Richtigstellung und Fixierung einer verletzten Stelle und dann dem Überlassen der natürlichen Heilfähigkeit des Patienten selbst. Bei dem natürlichen Heilprozess eines gebrochenen Knochens erfordert das Zusammenwachsen des Knochens zahlreiche Tage, z. B. 2 Wochen bei einem Mittelhandknochen, ungefähr 5 Wochen bei einem Unterarmknochen und ungefähr 12 Wochen bei einem Schenkelhals, im Durchschnitt. In diesem Fall wird normalerweise keine pharmakologische Behandlung durchgeführt, sondern eine Nährstoffbehandlung, wie eine Verabreichung von Calcium, falls erforderlich und gewünscht.
Ferner ist bei einer pathologischen Fraktur, die durch Osteoporose, Diabetes, etc. bedingt ist, die natürliche Heilkraft eines Patienten herabgesetzt und daher wird, zusätzlich zu der Richtigstellung und Fixierung einer verletzten Stelle, eine pharmakologische Behandlung, eine Verabreichung von Oestrogen oder Calcitonin, etc. durchgeführt; oder die oben erwähnte pharmakologische Behandlung wird in Kombination mit der Nährstoffbehandlung durchgeführt. Die pharmakologischen Behandlungen oder diejenigen in Kombination mit einer Nährstoffbehandlung werden auch zur Behandlung von verringerter Knochenfestigkeit eingesetzt, die durch Krankheiten wie Osteoporose oder Diabetes verursacht wird.
Angesichts der aktuellen Situation, dass die Frakturbehandlung der natürlichen Heilkraft des Patienten selbst überlassen wird, wurde vor kurzem über die Entwicklung eines oralen Mittels zur Beschleunigung der Knochenheilung mit 24,25- Dihydroxycholecalciferol berichtet: der Wirkstoff kann als Arzneimittel eingesetzt werden, um den Zeitraum der Knochenheilung zu verkürzen (Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 63-310828). Es wurde auch über Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten bereichtet, wie ein Mittel zur Beschleunigung von Knochenbildung mit Rentinan (Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 63-17828), ein Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten mit wenigstens einem Wirkstoff, der aus der Gruppe Chitin, Chitosan und deren Derivaten ausgewählt ist (Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 63-156726), als neue Arzneimittel zur Verkürzung des Zeitraums der Knochenheilung oder zur Verbesserung der verringerten Knochenfestigkeit als Begleiterscheinung verschiedener Krankheiten; oder ein Mittel mit physiologisch aktivem Retinagangliosid und dergleichen (Japanische Patentanmeldung KOHYO Nr. 63-502035).
Der basische Fibroblastwachstumsfaktor (hiernach abgekürzt als bFGF) ist ein peptidischer Zellwachstumsfaktor, der in der Hirnanhangdrüse, im Gehirn, in der Netzhaut, im Gelbkörper, in der Nebenniere, in der Niere, in der Plazenta, in der Prostata und in der Thymusdrüse nachgewiesen wurde. Es ist bekannt, dass der bFGF die Wucherung mesodermaler Zellen einschließlich vaskulärer Endothelzellen beinhaltet ["Cell Growth Factor Part II", herausgegeben von Tissue Culture Association, Japan, Seiten 15 bis 20, veröffentlicht von Asakura Publishing Co.). In den letzten Jahren ist der bFGF auch aus Knorpel und Knochen isoliert worden [J.B.C., 260, 2399- 2403 (1985); ibid., 261, 12665-12674 (1986)].
Es wurde erwartet, dass der bFGF die Knochenheilung wirksam beschleunigen würde, da der bFGF eine Wucherung mesodermaler Zellen einschließlich vaskulärer endothelialer Zellen bewirkt und er im Knorpel und Knochen vorhanden ist. Der in-vivo- Versuch zur Knochenbildung zeigt, dass der bFGF die Knochenbildung nur in Kombination mit entkalktem Rinderknochen, der einen Knochenwachstumsfaktor enthält, beschleunigt [Act. Orthop. Scand., 60, 473476 (1989)]. Der bFGF weist eine große strukturelle Ähnlichkeit mit einem sauren Fibroblastwachstumsfaktor auf, der die Bildung des Knochenkallus in Endbrüchen im frühen Stadium der Bruchheilung beschleunigte, jedoch den Aufbau der Knochengrundsubstanz des Knorpels oder Knochens verhinderte und somit im Vergleich mit der Kontrollgruppe als minderwertiger in der Knochenfestigkeit an der Stelle der Kallusbildung bewertet wurde [J. Orthopaedic Res., 8, 364-371 (1990)]. Der bFGF ist auch dafür bekannt, eine starke Ähnlichkeit mit dem sauren Fibroblastwachstumsfaktor hinsichtlich der in-vivo-Wirkung zu haben.
Im Zuge der Studien an dem bFGF, wie oben beschrieben, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass ein bFGF-Analogon allein die Kallusbildung an einer Bruchstelle beschleunigen, die Knochenbildung aus Knochenmangel beschleunigen, das Zusammenwachsen des Knochens fördern, die Festigkeit an einer Bruchstelle verbessern und die Knochenfestigkeit erhöhen kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der aktuellen Situation der zuvor genannten Behandlung von Knochenkrankheiten entwickelt, und es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten bereitzustellen, welches einen Heilungszeitraum verschiedener Frakturen verkürzen kann, einschließlich der Beschleunigung der Knochenbildung bei Knochenmangel, und welches die Knochenfestigkeit zusammengewachsener Knochen verbessern und auch die mit verschiedenen Krankheiten einhergehende verringerte Knochenfestigkeit verbessern kann.
Als Folge umfassender Untersuchungen zum Erreichen des vorgenannten Zieles, ist es den Erfindern gelungen, nützliche Arzneimittel zu entwickeln als Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten unter Verwendung eines basischen Fibroblastwachstumsfaktors (bFGF) und so haben sie die vorliegende Erfindung erfolgreich abgeschlossen.
Dies bedeutet, dass das Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten, das gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet ist, dass es als einen wirksamen Inhaltsstoff einen Analogon zum basischen Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF) gemäß Anspruch 1 aufweist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Abb. 1 zeigt eine weiche Röntgenaufnahme (2,3-fache Vergrößerung) eines Knochenbruchs (linkes Wadenbein) in Gruppe B des Beispiels 1, drei Wochen nach dem Bruch in Beispiel 1.
Abb. 2 zeigt eine weiche Röntgenaufnahme (2,3-fache Vergrößerung) eines Knochenbruchs (linkes Wadenbein) in der Kontrollgruppe, drei Wochen nach dem Bruch in Beispiel 1.
Abb. 3 zeigt eine weiche Röntgenaufnahme (2,3-fache Vergrößerung) eines Knochenbruchs (linkes Wadenbein) in Gruppe B des Beispiels 3, drei Wochen nach dem Bruch in Beispiel 3.
Abb. 4 zeigt eine weiche Röntgenaufnahme (2,3-fache Vergrößerung) eines Knochenbruchs (linkes Wadenbein) in der Kontrollgruppe, drei Wochen nach dem Bruch in Beispiel 3.
Abb. 5 zeigt eine mikroskopische Aufnahme (32-fach, aufgenommen von der Stelle, welche eine deutliche Knochenbildung zeigt) eines abgetrennten Gewebeabschnitts des Bruchs (rechtes Schienbein) in der Gruppe von Beispiel 4, eine Woche nach dem Knochenbruch in Beispiel 4.
Abb. 6 zeigt eine mikroskopische Aufnahme (32-fach, aufgenommen von der Stelle, welche eine leichte Knochenbildung zeigt) eines abgetrennten Gewebeabschnitts des Bruchs (rechtes Schienbein) in der Kontrollgruppe 4B, eine Woche nach dem Knochenbruch in Beispiel 4.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGEN

Hiernach wird die vorliegende Erfindung in Einzelheiten beschrieben.
Der bFGF als ein wirksamer Bestandteil eines Medikamentes zur Behandlung von Knochenkrankheiten ist ein gut bekannter Wachstumsfaktor, wie oben beschrieben, und er ist beim Menschen, beim Rind, bei der Maus, bei der Ratte, etc. nachgewiesen. Im Prinzip weist ein bFGF irgendwelchen tierischen Ursprungs dieselbe in-vivo-Wirkung auf. Wenn jedoch Mittel für die Behandlung von Knochenkrankheiten bei Menschen eingesetzt werden, wird besonders die Verwendung eines bFGF mit derselben Aminosäurensequenz, wie derjenigen, die im menschlichen Körper erzeugt wird (hiernach als menschlicher bFGF bezeichnet) im Hinblick auf die Antigenwirkung bevorzugt.
Für das Mittel, das gemäß der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten eingesetzt wird, wird das folgende bFGF- Analogon verwendet.
Um ein Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten stabil in industriellem Maßstab zu liefern, wird allgemein besonders bevorzugt, den bFGF oder seine Analogen in einem Mikroorganismus, wie E. coli, etc. oder in einer gezüchteten Zelle durch genetische Rekombinationstechnologie herzustellen, da der bFGF in lebenden Organismen nur in äußerst geringen Spuren vorhanden ist.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten umfasst als einen wirksamen Bestandteil die oben beschriebenen bFGF-Analogen. Spezielle Formen des Mittels umfassen eine Lösung mit dem bFGF und/oder seinem Analogon, physiologische Kochsalzlösung oder andere konventionelle Hilfsmittel (Glukose, Saccharose, Puffer, etc.), eine Injektion oder ein Spray, welche die Lösung einsetzen, ein Gel, eine Salbe, etc. Das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten kann in einer topischen Anwendung oder allgemeinen Anwendung eingesetzt werden, aber eine topische Behandlung wird besonders bevorzugt.
Die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist verbunden mit den unten beschriebenen Punkten A bis D.
A. Verschiedene traumatische Frakturen
B. Verschiedene Verschleißfrakturen
C. Pathologische Frakturen
a. Fraktur einhergehend mit Osteoporose primäre Osteoporose (senil, postmenopausal, juvenil) sekundäre Osteoporose {Hyperthyreose, Cushing-Syndrom (verursacht durch Steroid-Verabreichung), Akromegalie, Hypogonadismus [Hypopituitarismus, Klinfelter-Syndrom, Turner-Syndrom], Osteogenesis imperfecta, Hypophosphatasie, Homocystinurie, Immobilisations- Osteoporose, Diabetes}
b. Fraktur einhergehend mit Osteomalazie
c. Fraktur einhergehend mit bösartigem Tumor
d. Fraktur einhergehend mit multiplem Myelom
e. Fraktur einhergehend mit Osteogenesis imperfect acongenita
f. Fraktur einhergehend mit Osteocystom
g. Fraktur einhergehend mit eiternder Osteomyelitis
h. Fraktur einhergehend mit Osteopetrose
i. Fraktur einhergehend mit Ernährungsstörungen
D. Knochenfraktur bei Patienten, die an Diabetes oder irgendeiner Krankheit leiden, die durch die Verabreichung von Steroid behandelt wird.
Eine wirksame Dosis des Mittels zur Behandlung von Knochenkrankheiten in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung variiert abhängig von der Anwendungsart, dem Grad der Knochenkrankheiten, dem Alter oder der Verfassung des Patienten, etc., liegt aber allgemein in dem Bereich von ungefähr 0,1 ug bis 10 mg/Bruchstelle als wirksamer Bestandteil im Falle einer Fraktur. Allgemein besteht eine besonders bevorzugte Art der Anwendung zum Zwecke einer Beschleunigung des Heilungsprozesses darin, das Mittel in direktem Kontakt mit der Bruchstelle zu verabreichen. Jedoch kann das Mittel auch subkutan angewandt oder direkt um die Bruchstelle herum eingespritzt werden.
Das Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch bei der Behandlung von Knochenkrankheiten von Haustieren, zahmen Tieren, aufgezogenen Wildtieren, etc. eingesetzt werden. In diesem Fall kann beispielsweise ein Rinder-bFGF und/oder sein Analogon verwendet werden. Dieselben Arzneimittelformen und dieselbe Wirkdosis wie im Falle des Menschen können eingesetzt werden.
Hiernach wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Fünf (5) bis sechs (6) männliche SD-Stammratten (mit einem Gewicht zwischen 300 und 325 g), die 10 Wochen alt waren, wurden in einer Gruppe zusammengefasst, und insgesamt wurden 9 Gruppen vorbereitet. Pentobarbital-Natrium-Lösung (Konzentration von 50 mg/ml, Marke: NENBUTAL, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) wurde jedem Tier intraperitoneal in einer Dosis von 0,20 ml zur Betäubung verabreicht. Dann wurde das Haar an dem linken unteren Schenkel geschoren und die Haut und die Muskelschicht wurden über eine Länge von 1 cm aufgeschnitten, um das Wadenbein freizulegen. Das Wadenbein wurde unter Verwendung von Knochenscheren in der Mitte durchtrennt.
Die ersten 3 Gruppen wurden als Kontrollgruppen eingesetzt. Nachdem das durchtrennte Wadenbein mit einer Pinzette gerichtet war, wurden 36 ul einer mit 0,1 M Phosphat gepufferten Kochsalzlösung auf die gerichtete Stelle geträufelt und die aufgeschnittene Haut wurde genäht. Nachdem verdünnte Iodtinktur auf die Wunde nach der Operation aufgetragen wurde, wurden 0,1 ml einer mit physiologischer Kochsalzlösung 10-fach verdünnten Natrium-Penicillin-G-Streptomycin-Sulfatlösung [Penicillinkonzentration von 10000 E/ml, Streptomycin-Konzentration von 10000 ug/ml, hergestellt von Gibco Co.] subkutan verabreicht.
Die restlichen 6 Gruppen wurden als die Gruppen eingesetzt, die gemäß der Erfindung behandelt wurden. In 3 Gruppen (hiernach als Gruppe A aus Beispiel 1 bezeichnet) von den 6 Gruppen, wurden 36 ul einer Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 0,5 ug/ml) tropfenweise jedem Tier verabreicht, anstelle der 36 ul der mit 0,1 M Phosphat gepufferten Kochsalzlösung. Diese Lösung mit menschlichem bFGF wurde zuvor durch Verdünnung mit 0,1 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung hergestellt, wobei es sich dabei um eine Lösung (Konzentration von 3,3 mg/ml) mit menschlichem bFGF (Polypeptid, das von Sequenz Nr. 3 in der anhängenden Tabelle 3 gezeigt ist; hiernach bezieht sich der menschliche bFGF in der gesamten Beschreibung auf dieses Polypeptid) ausgedrückt in E. coli handelt, welche durch genetische Rekombinationstechnologie erhalten wurde. Ansonsten wurden die Gruppen danach in einer ähnlichen Weise wie die Kontrollgruppen behandelt.
Bei den restlichen 3 Gruppen dieser Erfindung (hiernach als Gruppe B des Beispiels 1 bezeichnet) wurden 36 ul einer Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 50 ug/ml), die durch Verdünnung einer Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 3,3 mg/ml) mit 0,1 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung erhalten wurde, auf jedes Tier geträufelt, anstelle der 36 ul der in Gruppe A des Beispiels 1 eingesetzten Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration 0,5 ug/ml), und ansonsten wurden die Gruppen in einer ähnlichen Weise wie Gruppe A des Beispiels 1 behandelt.
Jeweils eine Gruppe wurde aus den Kontrollgruppen (3 Gruppen insgesamt), Gruppe A des Beispiels 1 (3 Gruppen insgesamt) und Gruppe B des Beispiels 1 (3 Gruppen insgesamt) jeweils 1, 2 und 3 Wochen nach dem Bruch ausgewählt. Jedes Tier in den ausgewählten Gruppen wurde mit Ether betäubt und durch die Halsschlagader bis zum Tod ausgeblutet. Die rechten und linken Beinknochen wurden herausgenommen und direkt in 10%-igen neutralen Formadehydpuffer getaucht, um sie zu fixieren.
Unter Verwendung dieser fixierten Proben wurden die folgenden Punkte bestimmt.

(a) Bestimmung der Querschnittsfläche des gebrochenen Kallus

Nach Fixierung mit 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer wurden Aufnahmen von den Beinknochen (Schienbein und Wadenbein) mit weichen Röntgenstrahlen gemacht (Marke der verwendeten Ausrüstung: SOFTEX-CMB, hergestellt von Japan Softex Co., Ltd., Bedingungen: 24-30 kV, 1-3 mA), um weiche Röntgenbilder herzustellen. Ausgehend von diesen Bildern, wurden Aufnahmen hergestellt, die mit einem stereoskopischen Mikroskop bis zu 10-fach vergrößert waren. Basierend auf diesen Aufnahmen wurde die Querschnittsfläche des Kallus unter Einsatz einer Bildanalysevorrichtung [Marke: Oscondigitizer Model SQ-3100F, hergestellt von PHOTRON Co.] bestimmt.

(b) Bestimmung des Kallusvolumen

Nach Fixierung mit 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer wurde das Volumen des linken und rechten Wadenbeins (links: gebrochener Knochen, rechts: normaler Knochen) jeweils mit einer Vorrichtung zur Messung des Volumens [Marke PLETHYSMOMETER, hergestellt von Ugo Basile Co., Ltd.] bestimmt. Ein Wert, der durch Subtraktion der Messdaten des rechten Wadenbeins von denjenigen des linken Wadenbeins erhalten wurde, wurde als das Kallusvolumen bestimmt.

(c) Bestimmung des Knochenmineralgehaltes (BMC) und der Knochenmineraldichte (BMD) des gebrochenen Kallus

Nach Fixierung mit 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer wurde der BMC des linken und rechten Wadenbeins (links: gebrochener Knochen, rechts: normaler Knochen) jeweils mit einer Vorrichtung zur Messung des BMC [Marke Model DCS-600, hergestellt von Aloka Co., Ltd.] bestimmt. Ein Wert, der durch Subtraktion der Messdaten des rechten Wadenbeins von denjenigen des linken Wadenbeins erhalten wurde, wurde als der BMC des Kallus bestimmt. Außerdem wurde die BMD des linken und rechten Wadenbeins jeweils unter Verwendung derselben Vorrichtung bestimmt, und die BMD wurde in ähnlicher Weise wie in dem Fall des Kallus-BMC bestimmt.

(d) Biomechanische Analysen an den gebrochenen Wadenbeinen

Nachdem das linke und rechte Wadenbein 3 Wochen nach dem Bruch herausgenommen und in 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer fixiert worden waren, wurde die Bruchenergie in den so erhalten Proben mit einer Vorrichtung zur Messung des Knochenstoffwechsels [Marke RHEOROMETER MAX, hergestellt von lio Electric Co., Ltd.] bestimmt. Ferner wurde ein Verhältnis (Prozentgehalt) der Knochenfestigkeit des linken Wadenbeins (gebrochener Knochen) zu derjenigen des rechten Wadenbeins (normaler Knochen) als eine Zunahme an Knochenfestigkeit bestimmt.

(e) Histologische Untersuchung

Nach Fixierung in 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer während einer Woche, wurden das linke und rechte Wadenbein jeweils mit 10%-iger EDTA- (Ethylendiamintetraacetat)-Lösung über 10 Tage entkalkt. Nach der Entkalkung wurden die Knochen mit Wasser über 12 Stunden gewaschen und in konventioneller Weise in Paraffin eingebettet, wobei jeweils abgetrennte Gewebestücke mit einer jeweiligen Dicke von 1 bis 4 um mit einem Mikrotom hergestellt wurden. Dann wurde jede Probe mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die gefärbten Proben wurden mikroskopisch untersucht und es wurden Aufnahmen von ihnen gemacht.
Von diesen Ergebnissen sind die Ergebnisse der Messungen der Querschnittsfläche, des Volumens, des BMC und der BMD des Kallus und die Ergebnisse der Untersuchung zur Knochenfestigkeit der gebrochenen Knochen in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
* Zahlenwerte in der Tabelle zeigen (Mittelwert für die Gruppe) ± (Standardabweichung)
*1 Zahlenwerte zeigen (Mittelwert) ± (Standardabweichung) der Daten, die berechnet sind aus [(Knochenfestigkeit des gebrochenen Knochens)/(Knochenfestigkeit des normalen Knochens)] · 100
*2 (Mittelwert) ± (Standardabweichung) von 3 Proben
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, stiegen die Querschnittsfläche des Kallus und das Kallusvolumen eine Woche nach dem Bruch in Gruppe A aus Beispiel 1 und Gruppe B aus Beispiel 1 gegenüber der Kallus-Querschnittsfläche und dem Kallusvolumen in den Kontrollgruppen an. In und nach einer Woche verringerten sich sowohl die Querschnittsfläche des Kallus als auch das Kallusvolumen schrittweise sowohl in den Gruppen dieser Erfindung als auch in den Kontrollgruppen, aber die Querschnittsfläche des Kallus und das Kallusvolumen waren in den Gruppen dieser Erfindung, selbst nach 3 Wochen, größer. Diese Ergebnisse zeigen, dass das gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten die Kallusbildung beschleunigt.
Ferner wurde bezüglich des BMC und der BMD des Bruchkallus kein erkennbarer Unterschied zwischen den Gruppen der vorliegenden Erfindung und den Kontrollgruppen eine Woche nach dem Bruch festgestellt. In den Gruppen der vorliegenden Erfindung stiegen jedoch sowohl der BMC als auch die BMD um ungefähr 2,3-mal den Wert der Kontrollgruppen an. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten eine ausgezeichnete Wirkung auf den Heilungsprozess des Bruches hat. Dies wird auch deutlich aus der Tatsache, dass in den Gruppen A und B des Beispiels 1 die Zunahme bei dem Versuch zur Knochenfestigkeit nach 3 Wochen höher ist als in den Kontrollgruppen.
Außerdem zeigt die oben erwähnte stärkere Zunahme in dem Versuch zur Knochenfestigkeit an, dass die erfindungsgemäße Verwendung zur Behandlung von Knochenkrankheiten ausgezeichnet ist zur Verbesserung der Knochenfestigkeit oder der Festigkeit an der Bruchstelle des Knochens.
Die oben dargelegten Ergebnisse werden auch aus den weichen Röntgenaufnahmen deutlich, wovon einige als Zeichnungen beigefügt sind.
In der weichen Röntgenaufnahme von Gruppe B des Beispiels 1, die eine Woche nach dem Bruch aufgenommen wurde, ist ein großes Kallusbild zu sehen und die Bildung von neuem Knochen mit schwachem Lichtdurchlassgrad ist unterhalb der Knochenhaut um die gebrochene Stelle des Wadenbeins herum zu erkennen. Unter Betrachtung einer weichen Röntgenaufnahme in der Kontrollgruppe, die eine Woche nach dem Bruch aufgenommen wurde, ist die Kallusbildung mit starkem Lichtdurchlassgrad zu erkennen, aber ihre Fläche ist kleiner als in Gruppe B des Beispiels 1.
Abb. 1 zeigt eine weiche Röntgenaufnahme in Gruppe B des Beispiels 1, die 3 Wochen nach dem Bruch aufgenommen wurde. In der Aufnahme nimmt der Lichtdurchlassgrad des Kallus ab, was zeigt, dass die neue Knochenbildung erheblich beschleunigt wird. Unter Betrachtung der Abb. 2, welche eine weiche Röntgenaufnahme der Kontrollgruppe zeigt, die 3 Wochen nach dem Bruch aufgenommen wurde, bedeutet der abnehmende Lichtdurchlassgrad des Kallus eine Bildung von neuem Knochen, aber ihr Ausmaß ist geringer als in Gruppe B des Beispiels 1.
Aus den Ergebnissen der histopathologischen Untersuchung wird auch deutlich, dass das Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten die Kallusbildung fördert und eine ausgezeichnete Wirkung auf die Knochenbildung hat.
Dies bedeutet, wie es auch klar aus einer mikroskopischen Aufnahme (5-fache Vergrößerung) der zerschnittenen Gewebeabschnitte hervorgeht, dass die Wucherung von Knorpel, die Wucherung von knochenbildenden Mesenchymzellen, die von der Knochenhaut hergeleitet werden, etc., und die Bildung von neuen Knochenfasern um die Bruchstelle herum bemerkenswert sind. Auf der anderen Seite sind, wie es auch klar aus einer mikroskopischen Aufnahme in der Kontrollgruppe eine Woche nach dem Bruch hervorgeht, die Wucherung von Knorpel, die Wucherung von knochenbildenden Mesenchymzellen und die Bildung von neuen Knochenfasern um die Bruchstelle herum auch in der Kontrollgruppe eine Woche nach dem Bruch festzustellen, aber ihr Ausmaß ist geringer als in Gruppe B des Beispiels 1.
Wie es klar aus einer mikroskopischen Aufnahme in Gruppe B des Beispiels 1 drei Wochen nach dem Bruch zu erkennen ist, zeigen die knochenbildenden Mesenchymzellen ferner eine deutliche Wucherung innerhalb eines vergrößerten Kallus und die Bruchenden sind durch eine Anzahl von neu gebildeten Knochenfasern miteinander verbunden, aber es verbleibt etwas Knorpel um die Bruchstelle herum. Die Bildung einer Markhöhle ist auch zwischen den neuen Knochenfasern zu erkennen. Auf der anderen Seite, wie es auch aus einer mikroskopischen Aufnahme in der Kontrollgruppe 3 Wochen nach dem Bruch hervorgeht, ist der Kallus selbst klein und die Bildung von Knorpel ist in den Kontrollgruppen 3 Wochen nach dem Bruch gering. Zusätzlich sind die Bruchenden immer noch durch Knorpel getrennt.

Beispiel 2

Zunächst wurden fünf (5) bis sechs (6) männliche SD-Stammratten (mit einem Gewicht zwischen 300 und 325 g), die 10 Wochen alt waren, in einer Gruppe zusammengefasst, und insgesamt wurden 6 Gruppen vorbereitet. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde Pentobarbital-Natrium-Lösung (Konzentration von 50 mg/ml, Marke: NENBUTAL, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) wurde jedem Tier intraperitoneal in einer Dosis von 0,20 ml zur Betäubung verabreicht. Dann wurde das Haar an dem linken unteren Schenkel geschoren und die Haut und die Muskelschicht wurden jeweils über eine Länge von 1 cm aufgeschnitten, um das Wadenbein freizulegen. Das Wadenbein wurde unter Verwendung von Knochenscheren in der Mitte durchtrennt.
Zwei Gruppen von den 6 Gruppen wurden als Kontrollgruppen verwendet und in einer ähnlichen Weise wie die Kontrollgruppen in Beispiel 1 behandelt.
Die restlichen 4 Gruppen wurden als die Gruppen dieser Erfindung verwendet. In 2 Gruppen (hiernach als Gruppe A aus Beispiel 2 bezeichnet) von den 4 Gruppen, wurden 36 ul einer Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 1 ug/ml), die durch Verdünnung einer in einer ähnlichen Weise wie Beispiel 1 hergestellten Lösung von menschlichem bFGF (Konzentration: 3,3 mg/ml) mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung erhalten wurde, tropfenweise jedem Tier verabreicht, anstelle der 36 ul der in Gruppe A des Beispiels 1 verwendeten Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 0,5 ug/ml), und die Gruppen wurden ansonsten in einer ähnlichen Weise wie Gruppe A des Beispiels 1 behandelt.
In den restlichen 2 Gruppen dieser Erfindung (hiernach als Gruppe B des Beispiels 2 bezeichnet) wurden 36 ul einer Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 100 ug/ml), die durch Verdünnung einer in einer ähnlichen Weise wie Beispiel 1 hergestellten Lösung von menschlichem bFGF (Konzentration: 33 mg/ml) mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung erhalten wurde, tropfenweise jedem Tier verabreicht, anstelle der 36 ul der in Gruppe A des Beispiels 2 verwendeten Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration: 1 ug/ml), und die Gruppen wurden ansonsten in einer ähnlichen Weise wie Gruppe A des Beispiels 2 behandelt.
Eine Gruppe wurde aus den Kontrollgruppen (2 Gruppen insgesamt), Gruppe A des Beispiels 2 (2 Gruppen insgesamt) und Gruppe B des Beispiels 2 (2 Gruppen insgesamt) jeweils 1 und 3 Wochen nach dem Bruch ausgewählt. Die rechten und linken Beinknochen wurden in einer ähnlichen Weise wie Beispiel 1 behandelt, um in 10%-igem neutralem Formaldehydpuffer fixierte Proben herzustellen.
Dann wurden die Querschnittsfläche des Kallus, das Kallusvolumen, der BMC und die BMD des Kallus in einer ähnlichen Weise wie Beispiel 1 bestimmt. Diese Messergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
*: Zahlenwerte in der Tabelle zeigen:
(Mittelwert in der Gruppe) ± (Standardabweichung)
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, weisen die Messergebnisse in Beispiel 2 dieselbe Tendenz auf wie diejenigen in Beispiel 1, was bedeutet, dass das Mittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten die Kallusbildung beschleunigt und eine ausgezeichnete Wirkung auf den Bruchheilungsprozess hat.

Beispiel 3

Zunächst wurden viele männliche SD-Stammratten (mit einem Gewicht zwischen 300 und 325 g), die 10 Wochen alt waren, vorbereitet und eine Streptozotocin-Lösung (Konzentration von 40 mg/ml) in Natriumcitrat-Puffer (pH = 4,9) wurde durch die Schwanzvene in einer Dosis von 0,1 ml/100 g Körpergewicht intravenös verabreicht.
Dann, eine Woche nach der Verabreichung von Streptozotocin, wurde der Blutzuckerspiegel jedes Tieres mit dem Verfahren zur Messung der Absorption unter Verwendung eines Blutzuckermesskits (Marke: NEW BLOOD SUGAR TEST, hergestellt von Boehringer Yamanouchi Co., Ltd.) bestimmt. Ratten, die einen Blutzuckerspiegel von 250 mg/dl oder mehr aufwiesen, wurden als Modellratten für Diabetes ausgewählt. Fünf (5) oder sechs (6) Ratten wurden in einer Gruppe zusammengefasst und 8 Gruppen wurden insgesamt vorbereitet.
Ferner wurden fünf (5) oder sechs (6) männliche SD-Stammratten (mit einem Gewicht zwischen 300 und 325 g), die 10 Wochen alt waren, in einer Gruppe zusammengefasst, und insgesamt wurden 2 Gruppen für die Nicht-Diabetes-Kontrollgruppe vorbereitet.
Dann wurde das linke Wadenbein in der Mitte unter Verwendung von Knochenscheren in einer ähnlichen Weise wie Beispiel 1 durchtrennt.
Von den 8 Gruppen der Modellratten für Diabetes, wurden 4 Gruppen zu Kontrollgruppen gemacht. Bezüglich jedes Tieres in 2 Gruppen (hiernach als Kontrollgruppe A bezeichnet) aus diesen 4 Gruppen wurde das gebrochene Wadenbein mit Pinzette gerichtet, wonach die aufgeschnittene Haut genäht wurde, eine verdünnte Iodtinktur auf die in Behandlung befindliche Wunde aufgebracht und subkutan eine 10- fache Verdünnung von Natrium-Penicillin-G-Streptomycin-Sulfat mit physiologischer Kochsalzlösung an der genähten Stelle in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 verabreicht wurde.
In den restlichen 2 Gruppen (hiernach als Kontrollgruppe B bezeichnet) der Kontrollgruppen wurden 36 ul des Gels aus 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5), der Fibrinogen, Aprotinin und Thrombin in Konzentrationen von jeweils 41,6 mg/ml, 0,41 mg/ml und 33,3 E/ml enthielt, tropfenweise auf jedes Tier aufgebracht, anstelle der 36 ul der mit 0,1 M Phosphat gepufferten Kochsalzlösung in der Kontrollgruppe des Beispiels 1. Ansonsten wurden die Gruppen in einer ähnlichen Weise wie die Kontrollgruppe des Beispiels 1 behandelt.
Die restlichen 4 Gruppen der Modelltiere für Diabetes wurden für die Gruppen dieser Erfindung genommen. In 2 Gruppen (hiernach als Gruppe A des Beispiels 3 bezeichnet) von den 4 Gruppen wurden 36 ul des Gels, welches ferner 0,5 ug/ml des menschlichen bFGF enthielt, auf jedes Tier geträufelt, anstelle der 36 ul des Gels in Kontrollgruppe B. Ansonsten wurde das Tier in einer ähnlichen Weise wie in Kontrollgruppe B behandelt.
In den restlichen 2 Gruppen dieser Erfindung (hiernach als Gruppe B des Beispiels 3 bezeichnet) wurden 36 ul des Gels, welches ferner 50 ug/ml des menschlichen bFGF enthielt, auf jedes Tier geträufelt, anstelle der 36 ul des Gels in Kontrollgruppe B. Ansonsten wurde das Tier in einer ähnlichen Weise wie in Kontrollgruppe B behandelt.
Jeweils eine Gruppe wurde aus der Kontrollgruppe A (2 Gruppen insgesamt), Kontrollgruppe B (2 Gruppen insgesamt), Gruppe A des Beispiels 3 (2 Gruppen insgesamt), Gruppe B des Beispiels 3 (2 Gruppen insgesamt) und den Nicht-Diabetes- Kontrollgruppen (2 Gruppen insgesamt) jeweils 1 und 3 Wochen nach dem Bruch ausgewählt. Die rechten und linken Beinknochen wurden in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um in 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer fixierte Proben herzustellen.
Dann wurden das Volumen, der BMC und die BMD des Bruchkallus in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Ferner wurde eine histopathologische Untersuchung durchgeführt. Von diesen Ergebnissen sind die Messdaten bezüglich der Querschnittsfläche des Kallus, des Volumens, des BMC und der BMD des Kallus in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
*: Zahlenwerte in der Tabelle zeigen:
(Mittelwert in der Gruppe) ± (Standardabweichung)
*¹: Jeder Messwert der beiden Tiere
Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, weisen die Messergebnisse in Beispiel 3 dieselbe Tendenz auf wie diejenigen in Beispiel 1 und Beispiel 2. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von Knochenkrankheiten die Kallusbildung beschleunigt und eine ausgezeichnete Wirkung auf die Knochenbildung, auch bei den Modellratten für Diabetes, hat. Daher hat die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten die Wirkung, die Kallusbildung zu beschleunigen, und sie führt zu einem ausgezeichneten Knochenbildungseffekt, auch bei der pathologischen Fraktur.
Diese Wirkungen werden auch aus den weichen Röntgenaufnahmen deutlich, wovon einige als Zeichnungen beigefügt sind.
In einer weichen Röntgenaufnahme von Gruppe B des Beispiels 1, die eine Woche nach dem Bruch aufgenommen wurde, ist ein großes Kallusbild zu sehen, wohingegen das Kallusbild, das in einer weichen Röntgenaufnahme in der Kontrollgruppe B eine Woche nach dem Bruch zu sehen ist, klein und die Kallusbildung sehr gering ist.
In einer weichen Röntgenaufnahme (3 Wochen nach dem Bruch) von Gruppe B des Beispiels 3, die als Abb. 3 angefügt ist, ist ferner die Bildung vieler Knochen in einem großen Kallus festzustellen, was zeigt, dass das Zusammenwachsen der Bruchstelle begonnen hat. Im Gegensatz dazu, ist keine deutliche Vergrößerung des Kallus in einer weichen Röntgenaufnahme (3 Wochen nach dem Bruch) in Kontrollgruppe B, die als Abb. 4 angefügt ist, festzustellen. Ein Zusammenwachsen an der Bruchstelle ist ebenfalls nicht festzustellen.
Aus der histopathologischen Untersuchung wird auch deutlich, dass der Einsatz der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten die Kallusbildung fördert und eine ausgezeichnete Wirkung auf die Bruchheilung, auch bei Diabetes- Tiermodellen, hat.
Dies bedeutet, wie es auch klar aus der mikroskopischen Aufnahme (5-fache Vergrößerung) der zerschnittenen Gewebeabschnitte hervorgeht, dass die Kallusbildung, die Bildung von Knorpel und die Wucherung von knochenbildenden Mesenchymzellen in Gruppe B des Beispiels 3 eine Woche nach dem Bruch bemerkenswert sind. Im Gegensatz dazu, sind in einer mikroskopischen Aufnahme von zerschnittenen Gewebeabschnitten in der Kontrollgruppe B, die eine Woche nach dem Bruch aufgenommen wurde, die Bildung von Kallus, Knorpelbildungen und die Wucherung von knochenbildenden Mesenchymzellen zwar auch in Kontrollgruppe B eine Woche nach dem Bruch festzustellen, aber Knorpel und knochenbildende Mesenchymzellen sind geringer vorhanden als in Gruppe B des Beispiels 3.
Wie ferner deutlich aus der mikroskopischen Aufnahme von zerschnittenen Gewebeabschnitten zu ersehen, sind die Bruchenden zwar immer noch durch Knorpel oder Mesenchymzellen in Gruppe B des Beispiels 3, drei Wochen nach der Fraktur, getrennt, aber die Bildung neuer Knochenfasern ist bemerkenswert und die Bruchstelle hat begonnen, von der Peripherie des Kallus aus zusammenzuwachsen. Im Gegensatz dazu, wie es klar aus einer mikroskopischen Aufnahme zerschnittener Gewebeabschnitte hervorgeht, ist die Bruchstelle in Kontrollgruppe B, die drei Wochen nach der Fraktur betrachtet wurde, immer noch getrennt durch das Bindegewebe einschließlich der knochenbildenden Mesenchymzellen, und die Bildung von Knorpel und neuen Knochenfasern ist gering.

Beispiel 4

Zunächst wurden fünf (5) männliche SD-Stammratten (mit einem Gewicht zwischen 300 und 325 g), die 10 Wochen alt waren, in einer Gruppe zusammengefasst, und zwei Gruppen wurden vorbereitet. Prednisolon wurde jedem Tier dieser Gruppen zweimal jeden Tag in einer Dosis von 25 mg/kg (als 0,5%-ige wässrige Carboxymethylzellulose- Lösung) subkutan verabreicht. Diese Gruppen werden hiernach als mit Steroid behandelte Rattengruppen bezeichnet. An dem Tag nach der zweiten Behandlung wurde jedes Tier wie unten beschrieben operiert, um eine Modellratte mit Knochenfehler zu präparieren.
Ferner wurden fünf (5) männliche SD-Stammratten (eine Gruppe, mit einem Gewicht zwischen 300 und 325 g), die 10 Wochen alt waren, getrennt vorbereitet. Die 0,5%-ige wässrige Carboxymethylzellulose-Lösung wurde jedem Tier dieser Gruppen zweimal täglich anstelle des oben beschriebenen Prednisolon subkutan verabreicht. Diese Gruppe wird hiernach als nicht mit Steroid behandelte Rattengruppe bezeichnet. An dem Tag nach der zweiten Behandlung wurde jedes Tier wie unten beschrieben operiert, um eine Modellratte mit Knochenfehler zu präparieren.

Operation (Modellratte mit Knochenfehler)

Nachdem jedes Tier in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 betäubt worden war, wurde das Haar an dem rechten unteren Schenkel geschoren und die Haut und die Muskelschicht wurden über eine Länge von 1 cm aufgeschnitten, um die Vorderseite des Schienbeins freizulegen. Dann wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 1,6 mm, das die Knochenhöhle erreichte, unter Verwendung eines Zahnbohrers an der Stelle, die 1 cm von dem Gelenkkopf des Schienbeins jedes Tiers entfernt lag, hergestellt, um ein Modelltier mit Knochenfehler zu präparieren.
Nach der Operation wurden 2 ul des aus Fibrinogen, Aprotinin und Thrombin hergestellten Gels in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 3 auf die Knochenfehlerstelle (mit einem Zahnbohrer hergestelltes Loch; hiernach dasselbe) jedes Tiers in der nicht mit Steroid behandelten Rattengruppe (hiernach als Kontrollgruppe 4A bezeichnet) und in einer mit Steroid behandelten Rattengruppe (hiernach als Kontrollgruppe 4B bezeichnet) aufgeträufelt. Nach der Behandlung wurde die aufgeschnittene Haut genäht und verdünnte Iodtinktur wurde nach der Operation auf die Wunde aufgebracht. Dann wurde eine Lösung aus Penicillin-G-Streptomycin- Sulfatlösung subkutan der genähten Stelle in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 verabreicht.
In der verbleibenden einen mit Steroid behandelten Rattengruppe (hiernach als die Gruppe des Beispiels 4 bezeichnet), wurden 2 ul des Gels, welches ferner 2 ug des menschlichen bFGF enthielt, (Dosis des menschlichen bFGF: 2 ug/Knochenfehlerstelle) auf die Stelle des Knochenfehlers jedes Tiers aufgeträufelt, anstelle des in der Kontrollgruppe 4A angewandten Gels. Nach der Behandlung wurde jedes Tier wie in Kontrollgruppe 4A behandelt.
Nach der Operation wurde Prednisolon jedem Tier in der Gruppe des Beispiels 4 und in der Kontrollgruppe 4B in der oben beschriebenen Dosis subkutan verabreicht, insgesamt dreimal am nächsten Tag und am 3. und 5. Tag nach der Operation. In der Kontrollgruppe 4A wurde eine 0,5%-ige wässrige Carboxymethylzellulose-Lösung in der oben beschriebenen Dosis jedem Tier dreimal insgesamt am nächsten Tag und am 3. und 5. Tag nach der Operation subkutan verabreicht.
Eine Woche nach der Operation wurde eine Probe des rechten Schienbeins jedes Tiers, die in 10%-igem neutralen Formaldehydpuffer fixiert worden war, in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 präpariert. Nachdem ein zerschnittener Gewebeabschnitt in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 vorbereitet worden war, wurde jede Probe der Masson-Trichromfärbung unterzogen. Die Probe wurde mikroskopisch histopathologisch untersucht und photographiert. Die Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Grad der Knochenbildung * (Anzahl der Tiere)
Die Symbole für den Grad der Knochenbildung bedeuten das Folgende:
-: keine Knochenbildung
+: wenig Knochenbildung
++: mäßige Knochenbildung
+++: deutliche Knochenbildung
Wie aus Tabelle 4 deutlich hervorgeht, war eine mäßige oder deutliche Knochenbildung an der Knochenfehlerstelle jedes Tiers in der Gruppe des Beispiels 4 festzustellen, nämlich der mit Steroid behandelten Rattengruppe, die mit dem menschlichen bFGF behandelt wurde. In Gegensatz dazu, war bei vielen Ratten in Kontrollgruppe 4B, nämlich der mit Steroid behandelten Rattengruppe, der kein menschlicher bFGF verabreicht worden war, kaum eine Knochenbildung an der Knochenfehlerstelle festzustellen. Andererseits verlief der natürliche Heilungsprozess in Kontrollgruppe 4A, welche die nicht mit Steroid behandelte Rattengruppe war, normal, und eine Knochenbildung konnte bei vielen Ratten an der Knochenfehlerstelle deutlich festgestellt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten eine ausgezeichnete Beschleunigungswirkung auf die Knochenbildung, auch an der Knochenfehlerstelle von mit Steroid behandelten Ratten ausübt (entsprechend dem Modelltier mit einer Funktionsstörung der Knochenbildung).
Die oben dargelegten Ergebnisse sind deutlich anhand eines Vergleichs der mikroskopischen Aufnahmen (10-fache Vergrößerung) der zerschnittenen Gewebeabschnitte in den jeweiligen Gruppen zu sehen, von denen einige als Zeichnungen beigefügt sind.
Beispielsweise zeigt der Vergleich der mikroskopischen Aufnahme (eines Tiers mit erheblicher Knochenbildung) in der Gruppe des Beispiels 4, welche als Abb. 5 beigefügt ist, und der mikroskopischen Aufnahme (eines Tiers mit mäßiger Knochenbildung) in der Gruppe des Beispiels 4, welche nicht beigefügt ist, mit der mikroskopischen Aufnahme (eines Tiers mit wenig Knochenbildung) in der Kontrollgruppe 4B, welche als Abb. 6 beigefügt ist, dass nur sehr wenige neue Knochen an der Knochenfehlerstelle der mikroskopischen Aufnahme der Kontrollgruppe 4B, die in Abb. 6 gezeigt ist, festzustellen sind, wohingegen große Mengen neuer Knochen an der Knochenfehlerstelle der mikroskopischen Aufnahme der Gruppe des Beispiels 4, die in Abb. 5 gezeigt ist, und der nicht beigefügten mikroskopischen Aufnahme der Gruppe des Beispiels 4 festzustellen sind. Ein weiterer Vergleich zwischen der in Abb. 5 gezeigten mikroskopischen Aufnahme und der mikroskopischen Aufnahme (eines Tiers mit deutlicher Knochenbildung) in Kontrollgruppe 4A, welche nicht beigefügt ist, verdeutlicht, dass Abb. 5 ein Heilungsbild zeigt, welches fast gleich ist mit demjenigen der nicht beigefügten mikroskopischen Aufnahme der Kontrollgruppe 4A. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass der Einsatz der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochenkrankheiten eine ausgezeichnete Beschleunigungswirkung auf die Knochenbildung besitzt.

Beispiel 5

Zusätzlich zu dem menschlichen bFGF, wurde das Gel aus menschlichem bFGF- Analogon (Polypeptid, das durch Sequenz Nr. 3 in der angefügten Tabelle 3 der Aminosäurensequenzen gezeigt ist, wobei 69 Cystein (Cys) und 87 Cystein (Cys) jeweils durch Serin (Ser) ersetzt sind), das durch genetische Rekombinationstechnologie aus E. coli erhalten wurde, verwendet. Volumen, Knochenmineralgehalt (BMC) und Knochenmineraldichte (BMD) des Bruchkallus wurden in einer ähnlichen Weise wie in dem Fall des Beispiels 3 bestimmt.
Diese Ergebnisse (3 Wochen nach dem Bruch) sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
Wie aus Tabelle 5 deutlich wird, waren das Volumen, der BMC und die BMD der bFGF- Analogon-Gruppe (Gruppe B des Beispiels 5) so groß wie diejenigen der bFGF-Gruppe (Gruppe A des Beispiels 5), was zeigt, dass das menschliche bFGF-Analogon eine äquivalente Wirkung zu dem bFGF der vorliegenden Erfindung hat.

Toxizität

Sechs (6) männliche Mäuse, die 22 bis 25 g wogen, wurden in einer Gruppe zusammengefasst, und eine Vielzahl von Gruppen wurde einem Toxizitätstest unterzogen. Eine Lösung mit menschlichem bFGF (Konzentration von 3,3 mg/ml), die äquivalent zu denjenigen war, die in den Beispielen 1 bis 4 eingesetzt wurden, wurde subkutan jedem Tier in einer dem Körpergewicht entsprechenden Dosis verabreicht. Basierend auf der Sterblichkeit 72 Stunden danach, wurde ein LD&sub5;&sub0;- Wert ermittelt.
Im Ergebnis betrug der LD&sub5;&sub0;- Wert des menschlichen bFGF 75 mg/kg oder mehr.
Wie oben erwähnt, wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein neuer Einsatz für die in den Tabellen gezeigten bFGF-Analogen zur Behandlung von Knochenkrankheiten bereitgestellt, welcher die Heilungsdauer verschiedener Frakturen verkürzen kann, einschließlich der Beschleunigung von Knochenbildung bei Knochenfehlern, und welcher die mit verschiedenen Krankheiten einhergehende verringerte Knochenfestigkeit verbessern kann.

Tabelle 1

Sequenz Nr. 1
Länge der Sequenz: 146
Sequenztyp: Aminosäuren Sequenz

Tabelle 2

Sequenz Nr. 2
Länge der Sequenz: 146
Sequenztyp: Aminosäuren Sequenz

Tabelle 3

Sequenz Nr. 3
Länge der Sequenz: 154
Sequenztyp: Aminosäuren Sequenz

Tabelle 4

Sequenz Nr. 4
Länge der Sequenz: 7
Sequenztyp: Aminosäuren
Art der Sequenz: Peptid
Fragmenttyp: N-Abschlußfragment Sequenz

Tabelle 5

Sequenz Nr. 5
Länge der Sequenz: 11
Sequenztyp: Aminosäuren
Art der Sequenz: Peptid
Fragmenttyp: N-Abschlußfragment Sequenz

Claims

1. Verwendung eines Analogons eines menschlichen Fibroblastwachstumsfaktors (bFGF), welches die folgende Aminosäurensequenz aufweist:

wobei das Analogon dasjenige ist, in welchem ein aus 8 Aminosäuren bestehendes Segment mit den folgenden Sequenzen:

einem natürlichen menschlichen Fibroblastwachstumsfaktor, der aus 146 Aminosäuren an seinem N-Ende besteht, oder dem oben genannten Analogon des menschlichen basischen Fibroblastwachstumsfaktors, in welchem das 69 Cystein (cys) und das 87 Cystein (cys) jeweils durch Serin (Ser) ersetzt sind, hinzugefügt wird, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von traumatischen Knochenfrakturen, Verschleißknochenfrakturen und pathologischen Knochenfrakturen.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Knochenfraktur bei einem Patienten, der an Diabetes oder einer mit Steroid-Verabreichung behandelten Krankheit leidet.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer pathologischen Fraktur, die mit Osteoporose einhergeht.

4. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikamentes zur Beschleunigung der Kallusbildung.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament in Form einer Lösung vorliegt.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei wenigstens eine physiologische Kochsalzlösung und/oder ein Puffer in dem Medikament, zusätzlich zu dem basischen Fibroblastwachstumsfaktor-Analogon, enthalten ist.

7. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament in Form eines Gels vorliegt.

8. Verwendung gemäß Anspruch 1, welche das Auftragen des Medikamentes zur Behandlung von Knochenkrankheiten auf oder um die betroffene Stelle herum beinhaltet.