JPH05124975A

JPH05124975A - 骨疾患治療剤

Info

Publication number: JPH05124975A
Application number: JP3152517A
Authority: JP
Inventors: Keigo Hanada; 敬吾花田; Yoshiyuki Hiyama; 良之肥山; Makoto Tamura; 誠田村
Original assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-05-28
Publication date: 1993-05-21
Anticipated expiration: 2016-02-13
Also published as: JP3135138B2; ATE220915T1; EP0493737B1; DE69133074T2; ES2180527T3; EP0493737A1; EP0493737A3; DE69133074D1

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明の目的は、骨欠損に対する骨形成の促進
等も含めて種々の骨折の治癒期間を短縮させることがで
き、癒合骨の骨強度を向上させることができ、かつ種々
の病気に伴って低下した骨強度を向上させることも可能
な新たな骨疾患治療剤を提供することにある。【構成】塩基性線維芽細胞増殖因子および／またはその
同族体を有効成分とすることを特徴とする薬剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、外傷性骨折、疲労骨
折、病的骨折、種々の病気に伴う骨強度の低下等の骨疾
患骨を治療するための骨疾患治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】外傷性骨折や疲労骨折の治療には、損傷
部を整復して固定し、後は患者自身が有する自然治癒力
に任せるという方法が一般に適用されている。自然治癒
力による骨の平均癒合日数は、中手骨で２週間程、前腕
骨で５週間程、大腿骨頸部で１２週間程である。このと
き薬理学的な治療は通常、施されず、必要に応じてカル
シウムの投与といった栄養学的治療が施されている。ま
た、骨粗鬆症や糖尿病等に伴う病的骨折では、患者の骨
折に対する自然治癒力が低下していることから、損傷部
の整復および固定の他に、エストロゲンやカルシトニン
等のホルモンの投与といった薬理学的治療や、前記薬理
学的治療と上記栄養学的治療とを併用した治療が施され
ている。これら薬理学的治療や薬理学的治療と栄養学的
治療とを併用した治療は、骨粗鬆症や糖尿病等の病気に
伴う骨強度の低下の治療に対しても行われている。

【０００３】患者自身が有する自然治癒力に任せるとい
う骨折治療の現況にあって、近年では、骨折の治癒期間
を短縮させるための薬剤として、２４，２５−ジヒドロ
キシコレカルシフェロールを有効成分とする経口骨折治
癒促進剤の開発が報告されている（特開昭６３−３１０
８２８号公報）。また、骨折の治癒期間の短縮や種々の
病気に伴って低下した骨強度の向上を図るための新たな
薬剤として、レンチナンを含有する骨形成促進剤（特開
昭６３−１７８２８号公報）や、キチン、キトサン及び
これらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種
を含有する骨疾患治療剤（特開昭６３−１５６７２６号
公報）や、網膜の生理的に活性なガングリオシドを含む
組成物（特許出願公表昭６３−５０２０３５号公報）等
の開発も、それぞれ報告されている。

【０００４】

【発明の目的】本発明はこのような骨疾患の治療現況に
鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、骨欠損に
対する骨形成の促進等も含めて種々の骨折の治癒期間を
短縮させることができ、癒合骨の骨強度を向上させるこ
とができ、かつ種々の病気に伴って低下した骨強度を向
上させることも可能な新たな骨疾患治療剤を提供するこ
とにある。

【０００５】

【発明の構成】本発明者らは、上記目的を達成するため
に鋭意研究を重ねた結果、塩基性線維芽細胞増殖因子を
用いて骨疾患治療剤として有用な薬剤を開発することに
成功し、本発明を完成するに至った。塩基性線維芽細胞
増殖因子（塩基性線維芽細胞成長因子ともいう。以下、
ｂＦＧＦという。）は、脳下垂体、脳、網膜、黄体、副
腎、腎臓、胎盤、前立腺、胸腺において存在が確認され
ているペプチド性細胞成長因子であり、血管内皮細胞を
含む中胚葉系細胞の増殖作用を示すことが知られている
（『細胞成長因子partII』日本組織培養学会編、１５〜
２０頁、朝倉書店）。また近年では、軟骨および骨から
もそれぞれ単離されている［Ｊ．Ｂ．Ｃ．、２６０、２
３９９−２４０３（１９８５）、およびＪ．Ｂ．Ｃ．、
２６１、１２６６５−１２６７４（１９８６）］。

【０００６】このｂＦＧＦは、血管内皮細胞を含む中胚
葉系細胞の増殖作用を示し軟骨や骨にも存在することか
ら、骨折の治癒を効果的に促進させるのに有用な増殖因
子として期待されていたが、その後のin vivo における
骨形成試験で、骨成長因子を含むウシ脱灰骨との共同作
用で初めて骨形成を促進する［Ａｃｔ．Ｏｒｔｈｏｐ．
Ｓｃａｎｄ．、６０、４７３−４７６（１９８９）］こ
とが確認された増殖因子である。また、骨折モデルでの
評価で、骨折部位における初期の仮骨形成を促進するも
のの、軟骨や骨基質の合成を抑制し、仮骨形成部位の骨
強度は対照群に比して低い［Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉ
ｃＲｅｓ．、８、３６４−３７１（１９９０）］と評
価された酸性線維芽細胞増殖因子と構造の類似性が高
く、生体に対する作用の面でも類似性が高いと認識され
ていた増殖因子である。

【０００７】本発明者らは、ｂＦＧＦの上述のような研
究動向の中にあって、今回初めて、ｂＦＧＦの単独投与
により患部における仮骨形成を促進し、骨欠損に対して
骨形成を促進させ、骨癒合を早め、骨折部位の強度を向
上させ、骨強度を向上させることも可能な薬剤を開発し
た。すなわち本発明の骨疾患治療剤は、塩基性線維芽細
胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および／またはその同族体を有
効成分とすることを特徴とする薬剤である。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
骨疾患治療剤における有効成分であるｂＦＧＦは、前述
したように周知の増殖因子であり、ヒト、ウシ、マウ
ス、ラット等において存在が確認されている増殖因子で
ある。いずれの動物のｂＦＧＦも生体に対する作用は基
本的に同等であるが、本発明の骨疾患治療剤を人体に適
用する場合には、抗原性の点等から、人体内で産生され
るｂＦＧＦのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する
ｂＦＧＦ（以下、ヒトｂＦＧＦという）を使用すること
が特に好ましい。

【０００９】また本発明の骨疾患治療剤においては、有
効成分としてｂＦＧＦの同族体を用いてもよい。ここ
で、ｂＦＧＦの同族体とは、下記またはのポリペプ
チドを意味する。特定の哺乳動物で産生されるｂＦＧＦと実質的に同
一のアミノ酸配列からなるポリペプチド。実質的に同一
のアミノ酸配列とは、アミノ酸配列中の１〜６のアミノ
酸が別種のアミノ酸により置換されたものでｂＦＧＦの
生物活性を有するものを意味する。特定の哺乳動物で産生されるｂＦＧＦのＮ末端およ
び／またはＣ末端、または上記のポリペプチドのＮ末
端および／またはＣ末端に、追加のアミノ酸セグメント
が付加されたポリペプチド。追加のアミノ酸セグメント
とは、１〜１２個のアミノ酸からなり、ｂＦＧＦの生物
活性または上記のポリペプチドの生物活性を損なわな
いものを意味する。

【００１０】ヒトｂＦＧＦは、後記の配列表中の配列番
号１に示したアミノ酸１４６個のポリペプチドである
が、本発明の骨疾患治療剤においては、ヒトｂＦＧＦの
同族体（前記の同族体）として、例えば後記の配列表
中の配列番号２に示したアミノ酸１４６個のポリペプチ
ドを用いてもよい。この配列番号２のポリペプチドは、
ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列を構成する６９位のシステ
イン（Cys ）および８７位のシステイン（Cys ）がそれ
ぞれセリン（Ser ）により置換されたものである。また
前記の同族体として、例えば後記の配列表中の配列番
号３に示したアミノ酸１５４個のポリペプチドを用いて
もよい。このポリペプチドは、ヒトｂＦＧＦのＮ末端に
アミノ酸８個のセグメントが付加されたものである。さ
らに、前記の同族体として、例えば、ヒトｂＦＧＦの
Ｎ末端に後記の配列表中の配列番号４に示したアミノ酸
７個からなるセグメントが付加されたアミノ酸１５３個
のポリペプチドを用いてもよい。同様にして、Ｎ末端に
Met が付加されたアミノ酸１４７個のポリペプチドや、
Ｎ末端に後記の配列表中の配列番号５に示したアミノ酸
１１個のセグメントが付加されたアミノ酸１５７個のポ
リペプチドを用いてもよい。

【００１１】本発明の骨疾患治療剤においては、ｂＦＧ
Ｆおよびその同族体をそれぞれ単独で使用してもよい
し、併用してもよい。さらに、ｂＦＧＦの同族体として
は前述したように複数種があるが、これらの同族体につ
いても、それぞれ単独で使用してもよいし、併用しても
よい。なお、生体内におけるｂＦＧＦの存在量は極微量
であるため、本発明の骨疾患治療剤を工業的に安定して
供給するうえからは、遺伝子組換え技術により大腸菌等
の微生物または培養細胞に産生させた、ｂＦＧＦまたは
その同族体を使用することが特に好ましい。

【００１２】本発明の骨疾患治療剤は、上述したｂＦＧ
Ｆおよび／またはその同族体を有効成分とする薬剤であ
る。剤型の具体例としては、ｂＦＧＦおよび／またはそ
の同族体と、生理的食塩水またはその他の常用の補助剤
（ブドウ糖、蔗糖、緩衝液など）とを含む液剤、この液
剤を用いた注射剤やスプレー剤、あるいはゲル化剤等が
挙げられる。本発明の骨疾患治療剤は、局所投与剤型で
あっても全身投与剤型であってもよいが、特に局所投与
剤型が好ましい。

【００１３】本発明の骨疾患治療剤の適応症としては、
下記A 〜E のものが例示される。 A 各種外傷性骨折 B 各種疲労骨折 C 病的骨折 a 骨粗鬆症に伴う骨折・原発性骨粗鬆症（老人性、閉経後、若年性）・続発性骨粗鬆症｛甲状腺機能亢進症、クッシング症候
群（ステロイド投与によるもの）、末端肥大症、性腺機
能低下症［下垂体機能低下症、クリンフェルター（Klin
felter）症候群、ターナー（Turner）症候群］、骨形成
不全症、低ホスファターゼ症、ホモシスチン尿症、不動
性骨粗鬆症、糖尿病｝ b 骨軟化症に伴う骨折 c 悪性腫瘍に伴う骨折 d 多発性骨髄腫に伴う骨折 e 先天性骨形成不全に伴う骨折 f 骨嚢胞症に伴う骨折 g 化膿性骨髄炎に伴う骨折 h 大理石病に伴う骨折 i 栄養障害に伴う骨折 D 種々の病気（例えば上記C で例示した疾病）に伴う骨
強度の低下 E 種々の病気（例えば上記C で例示した疾病）に伴う骨
形成の抑制

【００１４】本発明の骨疾患治療剤のヒトへの有効投与
量は、適応症の種類、骨疾患の程度、患者の年齢や健康
状態等により異なるため特定することはできないが、骨
折の場合の有効成分の量で、概ね０．１μｇ〜１０ｍｇ
／患部の範囲である。また投与経路は、一般に、治癒を
促進するうえから、外科手術の際などに患部に接触させ
て投与することが特に好ましいが、皮下注入や、患部近
傍への直接的な注入でもよい。

【００１５】なお本発明の骨疾患治療剤は、家畜、愛玩
哺乳動物、飼育下野生動物等における骨疾患の治療に適
用してもよい。この場合には、例えばウシｂＦＧＦ及び
／又はその同族体を使用してもよく、剤型および投与量
はヒトに対する剤型および投与量と同様である。

【００１６】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。実施例１まず、１０週齢のＳＤ系雄性ラット（体重３００〜３２
５ｇ）を１群５〜６個体として計９群用意し、ペントバ
ルビタールナトリウム液（濃度５０ｍｇ／ｍｌ、商品
名：ネンブタール、大日本製薬株式会社製）０．２０ｍ
ｌを各個体の腹腔内に投与して麻酔した。次いで、各個
体の左下肢を剪毛し、長さ１ｃｍに亘って皮膚および筋
層を切開して腓骨をそれぞれ露出させて、腓骨の中央部
をそれぞれ骨バサミで切断した。この後、３群は対照群
とし、切断した腓骨をピンセットで整復した後に整復部
に０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水を３６μｌ滴下し、切
開した皮膚を縫合して術創に希ヨードチンキを塗布した
後に縫合部にペニシリンＧナトリウム−硫酸ストレプト
マイシン溶液［ペニシリン濃度１００００Ｕ／ｍｌ、ス
トレプトマイシン濃度１００００μｇ／ｍｌ、ギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）社製］の１０倍生理食塩水希釈液０．１
ｍｌを皮下投与した。

【００１７】また、残りの６群は実施例群とし、６群の
うちの３群（以下、実施例１Ａ群という）の各個体に
は、対照群における０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水３６
μｌに代えて、大腸菌で発現させた遺伝子組換え技術に
より得られたヒトｂＦＧＦ（後記の配列表中の配列番号
３に示したポリペプチド。以下の文中のヒトｂＦＧＦは
全てこのポリペプチドを意味する）の溶液（濃度３．３
ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で希釈し
て得た溶液（濃度０．５μｇ／ｍｌ）３６μｌを滴下し
た以外は対照群と同様の処置を施した。実施例群の残り
の３群（以下、実施例１Ｂ群という）の各個体には、実
施例１Ａ群におけるヒトｂＦＧＦ溶液の０．１Ｍリン酸
緩衝生理食塩水希釈液（濃度０．５μｇ／ｍｌ）３６μ
ｌに代えて、同様にして調製したヒトｂＦＧＦ溶液の
０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水希釈液（濃度５０μｇ／
ｍｌ）３６μｌを滴下した以外は実施例１Ａ群と同様の
処置を施した。

【００１８】骨折から１週目、２週目、および３週目毎
に、対照群（計３群）、実施例１Ａ群（計３群）、およ
び実施例１Ｂ群（計３群）からそれぞれ１群を選んで、
選択した各群の個体をエーテル麻酔した後に頸動脈より
放血屠殺し、左右の下腿骨を採取してすばやく１０％中
性ホルマリン緩衝液に浸して固定した。これらの固定標
本を用いて、以下の測定を行った。

【００１９】(a) 仮骨断面積の測定１０％中性ホルマリン緩衝液で固定した後の下腿骨（脛
骨および腓骨）を軟Ｘ線撮影（使用機種の商品名：ＳＯ
ＦＴＥＸ−ＣＭＢ、日本ソフテックス株式会社製、撮影
条件：２４〜３０ｋＶ、１〜３ｍＡ）して軟Ｘ線写真を
作成し、さらに、実体顕微鏡による１０倍拡大写真を作
成した。これらの写真から、画像解析装置［商品名：オ
スコンディジタイザＳＱ−３１００Ｆ形、フォトロン
（ＰＨＯＴＯＲＯＮ）社製］を用いて仮骨断面積を算出
した。

【００２０】(b) 仮骨体積の測定１０％中性ホルマリン緩衝液で固定した後の左右の腓骨
（左：骨折骨、右：正常骨）の体積を体積測定装置［商
品名：プレスィスモメータ（ＰＬＥＴＨＹＳＭＯＭＥＴ
ＥＲ）、ウゴバサイル（ＵｇｏＢａｓｉｌｅ）社
製］によりそれぞれ測定し、左腓骨の測定値から右腓骨
の測定値を差し引いた値を仮骨体積として算出した。

【００２１】(c) 仮骨骨塩量および骨密度の測定１０％中性ホルマリン緩衝液で固定した後の左右の腓骨
（左：骨折骨、右：正常骨）の骨塩量を骨塩量測定装置
［商品名：ＤＣＳ−６００形、アロカ（Ａｌｏｋａ）社
製］によりそれぞれ測定し、左腓骨の測定値から右腓骨
の測定値を差し引いた値を仮骨骨塩量として算出した。
また、同じ装置を用いて左右の腓骨の骨密度をそれぞれ
測定し、仮骨骨塩量と同様にして骨密度を算出した。

【００２２】(d) 骨折治癒骨の骨強度試験骨折後３週目に採取した左右の腓骨の１０％中性ホルマ
リン緩衝液固定標本における破断エネルギーを骨代謝測
定装置（商品名：レオロメーター・マックス、飯尾電機
株式会社製）によりそれぞれ測定した。また、骨強度の
増加率として、右腓骨（正常骨）の骨強度に対する左腓
骨（骨折骨）の骨強度の比（百分率）を求めた。

【００２３】(e) 病理組織学的検索１０％中性ホルマリン緩衝液で１週間固定した後の左右
の腓骨を１０％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶
液で１０日間それぞれ脱灰し、脱灰後１２時間水洗して
から常法によりパラフィン包埋を施し、ミクロトームに
より厚さ１〜４μｍの薄切組織標本をそれぞれ作成し
た。この後、各標本をヘマトキシリン・エオジン染色
し、顕微鏡下での観察および写真撮影を行った。

【００２４】これらの測定結果、試験結果および検索結
果のうち、まず、仮骨断面積の測定結果、仮骨体積の測
定結果、仮骨骨塩量および骨密度の測定結果、および骨
折治癒骨の骨強度試験結果を表１に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】表１から明らかなように、骨折後１週目の
実施例１Ａ群および実施例１Ｂ群における仮骨断面積お
よび仮骨体積は、対照群の仮骨断面積および仮骨体積よ
りも増大しており、１週目以降は実施例群と対照群の双
方において仮骨断面積および仮骨体積ともに漸減する
が、３週目においても実施例群の仮骨断面積および仮骨
体積は大きい。このことから、本発明の骨疾患治療剤は
仮骨形成に対する促進作用を有していることがわかる。
また、仮骨骨塩量および骨密度については、骨折後１週
目では実施例群と対照群との間で顕著な差は認められな
いが、３週目の実施例群では仮骨骨塩量および骨密度と
もに対照群の２．３倍程に増大している。このことか
ら、本発明の骨疾患治療剤は優れた骨形成効果を有して
いることがわかる。このことは、３週目における実施例
群の骨強度試験結果の増加率の値が対照群の値より増大
していることからも明らかである。また、３週目におけ
る実施例群の骨強度試験結果の増加率の値が対照群の値
より増大していることから、本発明の骨疾患治療剤は骨
強度または骨折癒合部位の強度を向上させる作用に優れ
ていることがわかる。

【００２７】そして、上述したことは図面として添付し
た軟Ｘ線写真（×２．３倍）からも明らかである。すな
わち、図１として添付した骨折後１週目の実施例１Ｂ群
の軟Ｘ線写真には大きな仮骨像が認められ、骨折部周辺
の骨膜下に透過性の弱い新生骨の形成が認められる。こ
れに対し、図２として添付した骨折後１週目の対照群の
軟Ｘ線写真には透過性の強い仮骨形成が認められるもの
の、その面積は実施例１Ｂ群に比して小さい。また、図
３として添付した骨折後３週目の実施例１Ｂ群の軟Ｘ線
写真においては新生骨の形成により仮骨の透過性が低下
しており、新生骨の形成が著しく亢進していることが明
らかである。これに対し、図４として添付した骨折後３
週目の対照群の軟Ｘ線写真においては新生骨の形成によ
り仮骨の透過性が低下しているものの、実施例１Ｂ群に
比してその程度は低い。

【００２８】本発明の骨疾患治療剤が仮骨形成に対して
促進作用を有しており、かつ優れた骨形成効果を有して
いることは、病理組織学的検索結果からもわかる。すな
わち、図５として添付した薄切組織標本の顕微鏡写真
（×５倍、以下同じ）から明らかなように、骨折後１週
目の実施例１Ｂ群においては軟骨の増生、骨外膜等に由
来する骨原性間葉系細胞の増生、および骨折周辺の線維
状新生骨の形成が顕著である。これに対し、図６として
添付した骨折後１週目の対照群の顕微鏡写真から明らか
なように、骨折後１週目の対照群においても軟骨の増
生、骨原性間葉系細胞の増生、および骨折周辺の線維状
新生骨の形成が認められるものの、その程度は実施例１
Ｂ群に比して小さい。また、図７として添付した骨折後
３週目の実施例１Ｂ群の顕微鏡写真から明らかなよう
に、骨折後３週目の実施例１Ｂ群においては、骨原性間
葉系細胞および仮骨の顕著な増大が認められ、骨折部は
新生した多数の線維状骨で癒合しており、軟骨は骨折部
周辺にわずかに残存するのみである。また、新生した線
維状骨間には髄腔の形成が認められる。これに対し、図
８として添付した骨折後３週目の対照群の顕微鏡写真か
ら明らかなように、骨折後３週目の対照群においては仮
骨自体が小さく、軟骨形成も乏しい。さらに、骨折結合
部位が未だ軟骨で境界されている。なお、図５〜図８に
対応するカラー顕微鏡写真を参考写真１〜参考写真４と
して別添する。

【００２９】実施例２まず、１０週齢のＳＤ系雄性ラット（体重３００〜３２
５ｇ）を１群５〜６個体として計６群用意し、実施例１
と同様にして各個体の左腓骨の中央部をそれぞれ骨バサ
ミで切断した。次いで、６群のうちの２群は対照群と
し、実施例１における対照群と同様の処置を施した。ま
た、残りの４群は実施例群とし、４群のうちの２群（以
下、実施例２Ａ群という）の各個体には、実施例１Ａ群
におけるヒトｂＦＧＦ溶液の０．１Ｍリン酸緩衝生理食
塩水希釈液（濃度０．５μｇ／ｍｌ）３６μｌに代え
て、同様にして調製したヒトｂＦＧＦ溶液の０．１Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水希釈液（濃度１μｇ／ｍｌ）３６μ
ｌを滴下した以外は実施例１Ａ群と同様の処置を施し
た。実施例群の残りの２群（以下、実施例２Ｂ群とい
う）の各個体には、実施例２Ａ群におけるヒトｂＦＧＦ
溶液の０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水希釈液（濃度１μ
ｇ／ｍｌ）３６μｌに代えて、同様にして調製したヒト
ｂＦＧＦ溶液の０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水希釈液
（濃度１００μｇ／ｍｌ）３６μｌを滴下した以外は実
施例２Ａ群と同様の処置を施した。

【００３０】骨折から１週目および３週目毎に、対照群
（計２群）、実施例２Ａ群（計２群）、および実施例２
Ｂ群（計２群）からそれぞれ１群を選び、実施例１と同
様にして各個体の左右の下腿骨の１０％中性ホルマリン
緩衝液固定標本を作成した。この後、実施例１と同様に
して仮骨断面積の測定、仮骨体積の測定、仮骨骨塩量お
よび骨密度の測定を行った。これらの測定結果を表２に
示す。

【００３１】

【表２】

【００３２】表２から明らかなように、本実施例２にお
ける各測定結果は実施例１における各測定結果と同様の
傾向を示しており、本発明の骨疾患治療剤は、仮骨形成
に対して促進作用を有し、かつ優れた骨形成効果を有し
ていることがわかる。

【００３３】実施例３まず、１０週齢のＳＤ系雄性ラット（体重３００〜３２
５ｇ）を多数個体用意し、ストレプトゾトシンをクエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．９）に溶解させた溶液
（濃度４０ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌ／体重１００ｇの
割合で各個体に尾静脈より静脈内投与した。次いで、投
与から１週間後の各個体の血糖値を、血糖値測定キット
（商品名：新ブラッドシュガーテスト、ベーリンガー山
之内社製）を用いた吸光度測定法により測定し、血糖値
が２５０ｍｇ／ｄｌ以上の個体を糖尿病病態モデルとし
て選択し、１群５〜６個体として計８群用意した。ま
た、非糖尿病対照群として、１０週齢のＳＤ系雄性ラッ
ト（体重３００〜３２５ｇ）を１群５〜６個体として計
２群用意した。この後、実施例１と同様にして各個体の
左腓骨の中央部をそれぞれ骨バサミで切断した。

【００３４】糖尿病病態モデルからなる８群のうちの４
群は対照群とし、これらの４群のうちの２群（以下、対
照群Ａという）の各個体と非糖尿病対照群の各個体とに
ついては、切断した腓骨をピンセットで整復した後、そ
のまま、切開した皮膚の縫合、術創への希ヨードチンキ
の塗布、縫合部へのペニシリンＧナトリウム−硫酸スト
レプトマイシン溶液の１０倍生理食塩水希釈液の皮下投
与を実施例１と同様にして行った。対照群の残りの２群
（以下、対照群Ｂという）の各個体には、実施例１の対
照群における０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水３６μｌに
代えて、フィブリノーゲン、アプロチニン、およびトロ
ンビンをそれぞれ４１．６ｍｇ／ｍｌ、０．４１ｍｇ／
ｍｌ、および３３．３Ｕ／ｍｌの濃度で含有する０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ＝６．５）のゲル化物を３６μｌ滴
下した以外は実施例１の対象群と同様の処置を施した。
また、糖尿病病態モデルからなる残りの４群は実施例群
とし、４群のうちの２群（以下、実施例群３Ａという）
の各個体には、対照群Ｂにおけるゲル化物に代えて、こ
のゲル化物にさらにヒトｂＦＧＦを０．５μｇ／ｍｌの
濃度で含有させてなるゲル化物を３６μｌ滴下した以外
は対照群Ｂと同様の処置を施した。実施例群の残りの２
群（以下、実施例３Ｂ群という）の各個体には、対照群
Ｂにおけるゲル化物に代えて、このゲル化物にさらにヒ
トｂＦＧＦを５０μｇ／ｍｌの濃度で含有させてなるゲ
ル化物を３６μｌ滴下した以外は対照群Ｂと同様の処置
を施した。

【００３５】骨折から１週目および３週目毎に、対照群
Ａ（計２群）、対照群Ｂ（計２群）、実施例３Ａ群（計
２群）、実施例３Ｂ群（計２群）、および非糖尿病対照
群（計２群）からそれぞれ１群を選び、実施例１と同様
にして各個体の左右の下腿骨の１０％中性ホルマリン緩
衝液固定標本を作成した。この後、実施例１と同様にし
て仮骨断面積、仮骨体積の測定、仮骨骨塩量および骨密
度の測定、および病理組織学的検索を行った。これらの
測定結果および検索結果のうち、仮骨体積の測定結果、
仮骨骨塩量および骨密度の測定結果を表３に示す。

【００３６】

【表３】

【００３７】表３から明らかなように、本実施例３にお
ける仮骨体積の測定結果、仮骨骨塩量および骨密度の測
定結果は、実施例１および実施例２における各測定結果
と同様の傾向を示しており、本発明の骨疾患治療剤は、
糖尿病病態モデルにおいても、仮骨形成に対して促進作
用を有し、かつ優れた骨形成効果を有していることがわ
かる。したがって本発明の骨疾患治療剤は、病的骨折に
おいても、仮骨形成に対して促進作用を有し、かつ優れ
た骨形成効果を有していることがわかる。

【００３８】これらのことは、図面として添付した軟Ｘ
線写真（×２．３倍）からも明らかである。すなわち、
図９として添付した骨折後１週目の実施例３Ｂ群の軟Ｘ
線写真には大きな仮骨像が認められるのに対し、図１０
として添付した骨折後１週目の対照群Ｂの軟Ｘ線写真に
認められる仮骨像は小さく、仮骨の形成は非常に乏し
い。また、図１１として添付した骨折後３週目の実施例
３Ｂ群の軟Ｘ線写真においては大きな仮骨中に新生骨の
形成が多数認められ、骨折部の癒合が認められ始めてい
る。これに対し、図１２として添付した骨折後３週目の
対照群Ｂの軟Ｘ線写真には仮骨の顕著な増生が認められ
ず、骨折部の癒合も認められない。

【００３９】そして、本発明の骨疾患治療剤が、糖尿病
病態モデルにおいても仮骨形成に対して促進作用を有
し、かつ優れた骨形成効果を有していることは、病理組
織学的検索結果からも明らかである。すなわち、図１３
として添付した薄切組織標本の顕微鏡写真（×５倍、以
下同じ）から明らかなように、骨折後１週目の実施例３
Ｂ群においては仮骨の形成、軟骨の増生、および骨原性
間葉系細胞の増生が顕著である。これに対し、図１４と
して添付した骨折後１週目の対照群Ｂの顕微鏡写真から
明らかなように、骨折後１週目の対照群Ｂにおいても仮
骨の形成、軟骨の増生、および骨原性間葉系細胞の増生
が認められるものの、これら仮骨、軟骨、および骨原性
間葉系細胞は実施例３Ｂ群に比して乏しい。また、図１
５として添付した骨折後３週目の実施例３Ｂ群の顕微鏡
写真から明らかなように、骨折後３週目の実施例３Ｂ群
においては、骨折部は未だ軟骨や間葉細胞により境界さ
れているが、新生線維骨の形成が著しく、仮骨周辺より
骨折部の癒合が認められ始めている。これに対し、図１
６として添付した骨折後３週目の対照群Ｂの顕微鏡写真
から明らかなように、骨折後３週目の対照群Ｂにおいて
は、骨折部は未だ骨原性間葉細胞を含む結合組織で境界
されており、軟骨や新生線維骨の増生も乏しい。なお、
図１３〜図１６に対応するカラー顕微鏡写真を参考写真
５〜参考写真８として別添する。

【００４０】実施例４まず、１０週齢のＳＤ系雄性ラット（体重３００〜３２
５ｇ）を１群５個体として２群用意した。これらの群の
各個体には、プレドニゾロンを２５ｍｇ／ｋｇ（０．５
％カルボキシメチルセルロース水溶液として）の割合で
１日おきに２回皮下投与した（以下、これらの群をステ
ロイド投与ラット群と総称する）。後述する手術を２回
目の投与の翌日に各個体に施して、骨欠損モデルとし
た。また、１０週齢のＳＤ系雄性ラット（体重３００〜
３２５ｇ）５個体（１群）を別途用意した。この群の各
個体には、上記のプレドニゾロンに代えて０．５％カル
ボキシメチルセルロース水溶液を１日おきに２回皮下投
与した（以下、この群を非ステロイド投与ラット群とい
う）。後述する手術を２回目の投与の翌日に各個体に施
して、骨欠損モデルとした。・手術（骨欠損モデル）実施例１と同様にして各個体を麻酔した後に右後肢を剪
毛し、さらに長さ１ｃｍに亘って皮膚および筋層を切開
して、脛骨前面をそれぞれ露出させた。次に、歯科用ド
リルを用いて、各個体の脛骨の脛骨顆より１ｃｍの部位
に骨髄にまで達する直径１．６ｍｍの穴をそれぞれあけ
て、骨欠損モデルとした。

【００４１】手術後、非ステロイド投与ラット群（以
下、対照群４Ａという）の各個体の骨欠損部（歯科用ド
リルで開けた穴。以下、同じ）とステロイド投与ラット
群の２群のうちの１群（以下、対照群４Ｂという）の各
個体の骨欠損部には、実施例３と同様にして調製したフ
ィブリノーゲンとアプロチニンとトロンビンとからなる
ゲル化物２μｌを滴下した。滴下後、切開した皮膚を縫
合して術創に希ヨードチンキを塗布し、さらに実施例１
と同様にしてペニシリンＧ−硫酸ストレプトマイシン溶
液を縫合部の皮下に投与した。また、ステロイド投与ラ
ット群の残りの１群（以下、実施例４群という）の各個
体の骨欠損部には、対照群４Ａにおけるゲル化物に代え
て、このゲル化物にさらにヒトｂＦＧＦ２μｇを含有さ
せてなる２μｌのゲル化物を滴下した（ヒトｂＦＧＦの
投与量：２μｇ／患部）。滴下後、対照群４Ａと同様の
処置を施した。そして、実施例４群と対照群４Ｂの各個
体には、手術の翌日、３日目および５日目の計３回、前
述の割合でプレドニゾロンを皮下投与した。また対照群
４Ａの各個体には、手術の翌日、３日目および５日目の
計３回、前述の割合で０．５％カルボキシメチルセルロ
ース水溶液を皮下投与した。

【００４２】手術から１週間後に、実施例１と同様にし
て各個体の右後肢脛骨の１０％中性ホルマリン緩衝液固
定標本を作成した。そして、実施例１と同様にして薄切
組織標本を作成した後に各標本をマッソン・トリクロー
ム染色して、顕微鏡下で病理組織学的観察および写真撮
影を行った。病理組織学的観察の結果を表４に示す。

【００４３】

【表４】

【００４４】表４から明らかなように、ヒトｂＦＧＦを
投与したステロイド投与ラット群である実施例４群の各
個体の骨欠損部においては、中程度ないし顕著に骨形成
が認められた。これに対して、ヒトｂＦＧＦを投与しな
かったステロイド投与ラット群である対照群４Ｂの個体
の多くでは、骨欠損部における骨形成はほとんど認めら
れなかった。一方、非ステロイド投与ラット群である対
照群４Ａでは正常に自然治癒が進行し、多くの個体の骨
欠損部において顕著に骨形成が認められた。このことか
ら、本発明の骨疾患治療剤はステロイド投与ラット（骨
形成抑制病態モデルに該当）の骨欠損部に対しても優れ
た骨形成促進効果を有していることがわかる。

【００４５】このことは、図面として添付した各群の薄
切組織標本の顕微鏡写真（×１０倍、以下同じ）を対比
することで、より明らかとなる。例えば、図１７として
添付した実施例４群の顕微鏡写真（骨形成が顕著であっ
た個体のもの）および図１８として添付した実施例４群
の顕微鏡写真（骨形成が中程度であった個体のもの）
と、図１９として添付した対照群４Ｂの顕微鏡写真（骨
形成がわずかであった個体のもの）とを対比すると、図
１９の顕微鏡写真の骨欠損部には僅かな新生骨しか認め
られないのに対して、図１７および図１８の顕微鏡写真
の骨欠損部には多量の新生骨が認められる。また、図１
７の顕微鏡写真と図２０として添付した対照群４Ａの顕
微鏡写真（骨形成が顕著であった個体のもの）とを対比
すると、図１７は図２０とほぼ同等の治癒像を示してい
ることがわかる。そして、これらの対比の結果から、本
発明の骨疾患治療剤が有する優れた骨形成促進効果が明
らかとなる。なお、図１７〜図２０に対応するカラー顕
微鏡写真を参考写真９〜参考写真１２として別添する。

【００４６】毒性試験体重２２〜２５ｇの雄性マウスを１群６個体として複数
群用い、各個体に、実施例１〜実施例４で用いたものと
同質のヒトｂＦＧＦ溶液（濃度３．３ｍｇ／ｍｌ）を体
重相応量、皮下投与し、７２時間後の死亡率からＬＤ₅₀
値を算出した。この結果、上記ヒトｂＦＧＦのＬＤ₅₀値
は７５ｍｇ／ｋｇ以上であった。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
骨欠損に対する骨形成の促進等も含めて種々の骨折の治
癒期間を短縮させることができ、かつ種々の病気に伴っ
て低下した骨強度を向上させることもできる新たな骨疾
患治療剤を提供することが可能となる。

【配列表】

【００４８】配列番号：１配列の長さ：１４６配列の型：アミノ酸配列 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly ¹ ⁵ ¹⁰ ¹⁵ His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe ²⁰ ²⁵ ³⁰ Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu ³⁵ ⁴⁰ ⁴⁵ Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg ⁵⁰ ⁵⁵ ⁶⁰ Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala ⁶⁵ ⁷⁰ ⁷⁵ Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp ⁸⁰ ⁸⁵ ⁹⁰ Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr ⁹⁵ ¹⁰⁰ ¹⁰⁵ Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg ¹¹⁰ ¹¹⁵ ¹²⁰ Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys ¹²⁵ ¹³⁰ ¹³⁵ Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser ¹⁴⁰ ¹⁴⁵

【００４９】配列番号：２配列の長さ：１４６配列の型：アミノ酸配列 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly ¹ ⁵ ¹⁰ ¹⁵ His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe ²⁰ ²⁵ ³⁰ Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu ³⁵ ⁴⁰ ⁴⁵ Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg ⁵⁰ ⁵⁵ ⁶⁰ Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala ⁶⁵ ⁷⁰ ⁷⁵ Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp ⁸⁰ ⁸⁵ ⁹⁰ Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr ⁹⁵ ¹⁰⁰ ¹⁰⁵ Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg- ¹¹⁰ ¹¹⁵ ¹²⁰ Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys ¹²⁵ ¹³⁰ ¹³⁵ Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser ¹⁴⁰ ¹⁴⁵

【００５０】配列番号：３配列の長さ：１５４配列の型：アミノ酸配列 Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly ^-5 ¹ ⁵ Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg ¹⁰ ¹⁵ ²⁰ Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp ²⁵ ³⁰ ³⁵ Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys ⁴⁰ ⁴⁵ ⁵⁰ Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly ⁵⁵ ⁶⁰ ⁶⁵ Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu ⁷⁰ ⁷⁵ ⁸⁰ Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg ⁸⁵ ⁹⁰ ⁹⁵ Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr ¹⁰⁰ ¹⁰⁵ ¹¹⁰ Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly ¹¹⁵ ¹²⁰ ¹²⁵ Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met ¹³⁰ ¹³⁵ ¹⁴⁰ Ser Ala Lys Ser ¹⁴⁵

【００５１】配列番号：４配列の長さ：７配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント

【００５２】配列番号：５配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における骨折後１週目の実施例１Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）であ
る。

【図２】実施例１における骨折後１週目の対照群の骨折
骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）である。

【図３】実施例１における骨折後３週目の実施例１Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）であ
る。

【図４】実施例１における骨折後３週目の対照群の骨折
骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）である。

【図５】実施例１における骨折後１週目の実施例１Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）である。

【図６】実施例１における骨折後１週目の対照群の骨折
骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５倍）で
ある。

【図７】実施例１における骨折後３週目の実施例１Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）である。

【図８】実施例１における骨折後３週目の対照群の骨折
骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５倍）で
ある。

【図９】実施例３における骨折後１週目の実施例３Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）であ
る。

【図１０】実施例３における骨折後１週目の対照群Ｂの
骨折骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）である。

【図１１】実施例３における骨折後３週目の実施例３Ｂ
群の骨折骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）であ
る。

【図１２】実施例３における骨折後３週目の対照群Ｂの
骨折骨（左腓骨）の軟Ｘ線写真（×２．３倍）である。

【図１３】実施例３における骨折後１週目の実施例３Ｂ
群の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×
５倍）である。

【図１４】実施例３における骨折後１週目の対照群Ｂの
骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）である。

【図１５】実施例３における骨折後３週目の実施例３Ｂ
群の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×
５倍）である。

【図１６】実施例３における骨折後３週目の対照群Ｂの
骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）である。

【図１７】実施例４における骨欠損後１週目の実施例４
群の欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成が顕著であった個体のもの）であ
る。

【図１８】実施例４における骨欠損後１週目の実施例４
群の欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成が中程度であった個体のもの）であ
る。

【図１９】実施例４における骨欠損後１週目の対照群４
Ｂの欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成がわずかであった個体のもの）であ
る。

【図２０】実施例４における骨欠損後１週目の対照群４
Ａの欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成が顕著であった個体のもの）であ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１１月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図５】実施例１における骨折後１週目の実施例１Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）であり、生物の形態を表す写真である。

【図６】実施例１における骨折後１週目の対照群の骨折
骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５倍）で
あり、生物の形態を表す写真である。

【図７】実施例１における骨折後３週目の実施例１Ｂ群
の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）であり、生物の形態を表す写真である。

【図８】実施例１における骨折後３週目の対照群の骨折
骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５倍）で
あり、生物の形態を表す写真である。

【図１３】実施例３における骨折後１週目の実施例３Ｂ
群の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×
５倍）であり、生物の形態を表す写真である。

【図１４】実施例３における骨折後１週目の対照群Ｂの
骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）であり、生物の形態を表す写真である。

【図１５】実施例３における骨折後３週目の実施例３Ｂ
群の骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×
５倍）であり、生物の形態を表す写真である。

【図１６】実施例３における骨折後３週目の対照群Ｂの
骨折骨（左腓骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真（×５
倍）であり、生物の形態を表す写真である。

【図１７】実施例４における骨欠損後１週目の実施例４
群の欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成が顕著であった個体のもの）であ
り、生物の形態を表す写真である。

【図１８】実施例４における骨欠損後１週目の実施例４
群の欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成が中程度であった個体のもの）であ
り、生物の形態を表す写真である。

【図１９】実施例４における骨欠損後１週目の対照群４
Ｂの欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成がわずかであった個体のもの）であ
り、生物の形態を表す写真である。

【図２０】実施例４における骨欠損後１週目の対照群４
Ａの欠損骨（右後肢脛骨）の薄切組織標本の顕微鏡写真
（×１０倍，骨形成が顕著であった個体のもの）であ
り、生物の形態を表す写真である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】塩基性線維芽細胞増殖因子および／または
その同族体を有効成分とすることを特徴とする骨疾患治
療剤。
【請求項２】塩基性線維芽細胞増殖因子および／または
その同族体が、遺伝子組換え技術により微生物または培
養細胞に産生させたヒト塩基性線維芽細胞増殖因子およ
び／またはその同族体である、請求項１記載の骨疾患治
療剤。
【請求項３】請求項１または２に記載の骨疾患治療剤を
患部またはその近傍に投与することを特徴とする骨疾患
の治療方法。