FI118472B - Autoantigeenistä johdettuja uusia peptidejä autoimmuunitautien immunoterapiassa käyttöä varten - Google Patents

Description

t 118472

Autoantigeenistä johdettuja uusia peptidejä autoimmuunitautien immunoterapiassa käyttöä varten

Esillä olevan keksinnön kohteena on uusi autoanti-5 geeni ja siitä johdettuja peptidejä, näiden käyttö autoimmuunitaudeissa nivelruston kroonisen tuhoutumisen hoitamiseksi, mainittuja peptidejä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia, diagnostinen menetelmä autoreaktiivisten T-solujen toteamiseksi testinäytteestä sekä mainitussa 10 menetelmässä käytettäviä testipakkauksia.

Immuunijärjestelmä perustuu kykyyn erottaa vieraat antigeenit (ei-omat antigeenit) autoantigeeneistä (omia antigeenejä, jotka ovat peräisin yksilöiden omasta kehosta), mikä on saavutettu kehitetyllä toleranssilla autoan-15 tigeenejä vastaan.

Immuunijärjestelmä suojaa yksilöitä vierailta antigeeneiltä ja tuottaa vasteen, kun tapahtuu altistus vieraalle antigeenille, aktivoimalla spesifisiä soluja, kuten T- ja B-lymfosyyttejä, sekä tuottamalla liukoisia tekijöi-20 tä, kuten interleukiineja, vasta-aineita ja komplementti-tekijöitä. Antigeeni, jolle immuunijärjestelmä tuottaa • · · *·* ’ vasteen, hajotetaan sellaisten solujen toimesta, joissa «M · * * antigeeni esiintyy (the antigen presenting cells, APCs), m ja antigeenin fragmenttia ilmennetään solun pinnalla yh- • · !.*·· 25 distettynä "major histocompatibility complex (MHC) class ί#ί*ί II" -glykoproteiineihin. MHC-glykoproteiini-antigeenifrag- :*·*: menttikompleksi tuodaan esiin T-solulle, joka tunnistaa • T-solureseptorillaan antigeenifragmentin ja tätä sitovan

MHC class II -proteiinin yhteenliittymän. T-solu aktivoi-S

,···. 30 tuu, so. proliferoituu ja/tai tuottaa interleukiineja, *** minkä seurauksena hyökkäyksen kohteena olevaan antigeeniin V.· kohdistuneiden, aktivoituneiden lymfosyyttien määrä li- ·.„· sääntyy. (Grey et ai., Sei Am., 261:38 - 46, 1989).

Omia antigeenejä myös jatkuvasti prosessoidaan ja · 35 tuodaan MHC-glykoproteiinien toimesta esiin antigeeni- • ♦· • · 2 118472 fragmentteina T-soluja varten (Jardetsky et ai., Nature 353:326 - 329, 1991). Oman tunnistaminen on siten luontaista immuunijärjestelmälle. Normaaliolosuhteissa immuunijärjestelmä on tolerantti omille antigeeneille ja välty-5 tään immuunivasteen aktivoitumiselta näillä omilla antigeeneillä.

Kun toleranssi omille antigeeneille kadotetaan, immuunijärjestelmä aktivoituu yhdelle tai useammalle omalle antigeenille, jolloin autoreaktiivisia T-soluja aktivoituu 10 ja muodostuu autovasta-aineita. Ilmiötä kutsutaan autoim-muniteetiksi. Koska immuunivaste on yleisesti ottaen tuhoavaa, so. sen tarkoitus on tuhota invasiivi vieras antigeeni, niin autoimmuunivasteet voivat aiheuttaa kehon oman kudoksen tuhoutumista.

15 T-solujen myötävaikutus autoimmuunitaudeissa on osoitettu useilla kokeilla. Hiirien kokeellista autoimmuu-nienkefalomyeliittiä (EAE) välittää erittäin rajoittunut ryhmä T-soluja, joita yhdistää spesifisyys MHC class II -molekyyliin kompleksoituneen myeliiniperusproteiinin 20 (myelin basic protein, MBP) yhteen epitooppiin. Lewis-ro-talla, joka on erilaisille autoimmuunitaudeille erittäin • · · ' altis laji, taudin on osoitettu olevan T-soluvälitteinen.

Ihmisten autoimmuunitautien on ajateltu olevan yhteydessä :.·.ϊ myös autoaggressiivisten T-solujen kehittymisen kanssa.

: 25 Tuhoavan autoimmuunivasteen on osoitettu olevan mu- * i : kana erilaisissa taudeissa, kuten nivelreumassa (rheuma- ··· ·'·*· toid arthritis, RA), jossa nivelruston yhtenäisyyttä tu- * hoaa krooninen inflammatorinen prosessi seurauksena akti- ··, voituneiden lymfosyyttien ja MHC class II -ilmentävien so- · · \.. 30 lujen suurilukumääräisestä esiintymisestä. Pelkästään rus- *;* ton läsnäolo näyttää välttämättömältä paikallisen inflam- • « :.V matorisen vasteen ylläpitämiseksi: on osoitettu, että ni- velreumassa ruston tuhoutuminen on yhteydessä rustolle ,···. vasteellisten autoreaktiivisten T-solujen aktiivisuuden • · · *, . 35 kanssa (Sigall et ai., Clin. Exp. Rheumat. 6:59, 1988; • ·♦ • « 3 118472

Giant et ai., Biochem. Soc. Trans. 18:796, 1990; Burmester et ai., Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (toim.) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). Edelleen, nivelreumapotilaiden ruston kirurgisen poiston havaittiin vä-5 hentävän inflammatorista prosessia (G.S. Panayi et ai., Clin. Exp. Rheumatol. 11(suppl. 8): SI - S8, 1993). Rusto-proteiinien on siten ajateltu toimivan kohdeautoantigee-neinä, jotka kykenevät stimuloimaan T-soluja. Näiden auto-reaktiivisten T-solujen aktivaatio johtaa autoimmuunitau-10 din kehittymiseen.

Ruston tuhoutumiseen johtavaa inflammatorista vastetta voidaan käsitellä useilla lääkkeillä, kuten steroi-dilääkkeillä. Nämä lääkkeet ovat kuitenkin usein immuno-suppressiivisia lääkkeitä, jotka ovat ei-spesifisiä ja 15 joilla on toksisia sivuvaikutuksia. Ei-spesifisen immunosuppression haitoista johtuen tällainen terapia on erittäin epäedullinen.

Antigeenispesifinen, ei-toksinen immunosuppressio-terapia tarjoaa erittäin houkuttelevan vaihtoehdon ei-spe-20 sifiselle immunosuppressiolle. Tällaisessa antigeenispesi-fisessä terapiassa potilaita käsitellään kohdeautoantigee- ··· * nillä tai tällaisesta autoantigeenistä johdetuilla syn- *!**! teettisillä T-solureaktiivisilla peptideillä. Nämä syn- teettiset peptidit vastaavat autoantigeenin T-soluepitoop- :*·.· 25 peja ja niitä voidaan käyttää indusoimaan spesifinen T-so- • * • j*. lutoleranssi sekä niille itselleen että autoantigeenille.

Vaikka tuntuu paradoksaaliselta tehdä immuunijärjestelmä vähemmän herkäksi juuri samalle antigeenille, joka on vas-tuussa immuunijärjestelmän aktivoimisesta, kohde (auto) an- • # · 30 tigeenin kontrolloitu anto voi olla hyvin tehokas immuuni- • · *·;·* järjestelmän tekemiseksi vähemmän herkäksi.

Jotta toleranssiterapiaa voidaan käyttää tehok- :***: kaasti T-soluvälitteisen rustotuhon hoitoon, täytyy tun- ··· .j. nistaa vastuussa oleva autoantigeeni ja löytää sellaisia • · · I . 35 T-solureaktiivisia peptidejä, jotka voivat tehdä potilaan • · * * tt • · 4 118472 vähemmän herkäksi autogeenille, joka aktivoi inflammatorisesta prosessista vastaavia T-soluja.

Esillä olevan keksinnön kohteena on tuoda esiin autoantigeeni ja tällaisesta antigeenistä johdettuja T-solu-5 reaktiivisia peptidejä, jotka kykenevät indusoimaan spesifisen T-solutoleranssin vastuussa olevalle rustoantigee-nille potilaissa, joilla esiintyy T-soluvälitteistä ruston tuhoutumista. Keksinnön kohteena on edelleen tuoda esiin menetelmä nivelrustoa tuhoavassa prosessissa osallisena 10 olevien autoreaktiivisten T-solujen toteamiseksi sekä testipakkauksia, joita voidaan käyttää mainitussa menetelmässä.

Havaittiin yllättäen, että Human Cartilage glycoprotein 39 -glykoproteiini (tästä eteenpäin käytetään ni-15 mitystä HC gp-39) on nivelreumapotilaissa eräs kohdeauto-antigeeni, joka aktivoi spesifisiä T-soluja ja siten aiheuttaa tai välittää inflammatorista prosessia. HC gp-39 :stä johdettuja peptidejä tunnistettiin pääasiallisesti nivelreumapotilailta saatujen autoreaktiivisten T-solujen 20 toimesta, mutta harvoin terveiltä luovuttajilta saatujen T-solujen toimesta, mikä viittaa siihen, että HC gp-39 on «e· V· autoantigeeni nivelreumassa. HC gp-39:n artritogeeninen m "**! luonne vahvistettiin vielä Balb/c-hiirillä. Mainitun pro- :j*: teiinin yksi subkutaaninen injektio Balb/c-hiiriin kykeni

·*·.· 25 aikaansaamaan artriittisia taudinmerkkejä eläimissä. HC

• ♦ • gp-39 -induisoidun taudin kululle oli tunnusomaista jak-··· soittaiset taudin uusiutumiset (relapses) etu- ja/tai ta-kakäpälissä ja kehittyminen vähitellen lievästä artriitis- ..t ta vaikea-asteisempaan muotoon. Edelleen havaittiin sai- • · · 30 rastuneiden nivelten symmetristä jakautumista, mikä yhdes- « t ·;* sä toistuvien uusiutumisten ja kyhmymuodostuksen kanssa • · ϊ ϊ : muistuttaa sairauden etenemistä artriitissa, erityisesti *“*: nivelreumassa.

»Il

Vielä yllättävämmin, havaittiin, että HC gp-39:n * t · l . 35 annosta seurasi immunologinen toleranssi ja, mikä on vielä • · · • · · • · 5 118472 tärkeämpää, artriitin kehittymisen viivästyminen ja/tai suppressortuminen.

HC gp-39:ää esiintyy sekä potilaiden että terveiden aikuisten seerumissa, vaikka proteiinin seerumipitoisuus 5 potilailla on noin kaksinkertainen verrattuna terveisiin aikuisiin. Edelleen, HC gp-39:ää koodaava mRNA voidaan tavata synoviaalilajeissa tai rustossa, joita on saatu nivelreumapotilailta, kun taas terveiden aikuisten rusto, joka on saatu kirurgisesti, ei sisällä merkittäviä määriä 10 mainittua mRNA:ta. Kun artikulaarisia kondrosyyttejä ja synoviaalisoluja kasvatetaan, niin niiden pääasialliseksi eritystuotteeksi tulee HC gp-39 (Hakala et ai., j. Biol. Chem., voi 268, 34:25 803, 1993). Hakala et ai'in julkaisussa, ja muissakaan julkaisuissa, ei ole kuvattu eikä 15 viitattu HC gp-39:n artritogeeniseen luonteeseen.

Keksinnön edelleen eräänä kohteena tuodaan esiin peptidejä, jotka sisältävät alasekvenssin autoantigeenistä HC gp-39, jolloin mainituille peptideille on tunnusomaista, että ne sisältävät yhden tai useamman aminohapposek-20 vensseistä: FGRSFTLAS (SEQ ID No. 1), FTLASSETG (SEQ ID No. 2), YDDQESVKS (SEQ ID No. 3) ja FSKIASNTQ (SEQ ID No.

• ·» • · # M \ V * 4).

*:·" Spesifisemmin, keksinnön mukainen eräs peptidi sisältää yhden tai useamman aminohapposekvensseistä: ·*·.· 25 PTFGRSFTLASSE (SEQ ID No. 5), RSFTLASSETGVG (SEQ ID No.

t ·

. 6), VGYDDQESVKSKV (SEQ ID No. 7) ja SQRFSKIASNTQSR (SEQ ID

No. 8).

• · I

"Alasekvenssi" tulee ymmärtää tarkoittavan "osaa” .. eikä sitä pidä virheellisesti ymmärtää siten, että se kä- • % 30 sittää koko mainitun proteiinin. Edullisesti, keksinnön • · *·;·' mukaisilla peptideillä on 9 - 55 aminohappotähteen amino- : happosekvenssi. Edullisemmin, keksinnön mukaisilla pepti- deillä on 9 - 35, erityisesti 9 - 25, aminohappotähteen • n aminohapposekvenssi. Edelleen edullisempia ovat peptidit,

• · I

; | 35 joilla on 9 - 15 aminohappotähteen aminohapposekvenssi.

• k i • Il • · 6 118472

Erittäin edullisia ovat peptidit, joilla on 13 tai 14 aminohappotähteen aminohapposekvenssi, kuten peptidit, joiden aminohapposekvenssit on SEQ ID No.:issa 5-8 annetun mukaiset.

5 Esillä olevan keksinnön suojapiiriin kuuluu myös keksinnön mukaisen peptidin multimeerit, kuten dimeeri tai trimeeri, joissa monomeerisekvenssit voivat mahdollisesti olla erotettuna toisistaan tilatähteillä (spacer residues). Tällaiset multimeerit tarjoavat moninkertaisesti 10 SEQ ID No.:issa 1-8 annettuja T-soluepitooppeja.

Keksinnön mukaisissa peptideissä SEQ ID No.:issa 1-8 annettujen aminohapposekvenssien päihin voi olla järjestetty ympäröiviä alueita, jotka voivat vastata HC gp-39 -proteiinin tai muiden proteiinien, joissa esiintyy 15 mainittuja aminohapposekvenssejä, aminohapposekvenssin vastaavien aminohappojen luonnollisia ympäröiviä kohtia. Vaihtoehtoisesti, mainitut ympäröivät alueet voivat olla myös ei-luonnollisia aminohapposekvenssejä, jotka on muodostettu satunnaisista aminohappotähteistä. Tällaisia ei-20 luonnollisia ympäröiviä kohtia voidaan käyttää stabiloimaan peptidejä ja siten lisäämään niiden biologista hyö-V : dynnettävyyttä. Keksinnön mukaisten peptidien biologisen *:·*: hyödynnettävyyden lisäämiseksi ei-luonnolliset jatkekohdat ! ί*ϊ ovat edullisia.

*·· ·*·,· 25 SEQ ID No. rissa 1-4 annetut aminohapposekvenssit, • · . .*. erityisesti SEQ ID No. rissa 5-8 annetut sekvenssit, mui- ·*· .···, stuttavat MHC class II -rajoittuneita T-soluepitooppeja, • * « joita esiintyy HC gp-39rssä. HC gp-39:n MHC class II -ra-joittuneita T-soluepitooppeja esittävät HC gp-39:n amino-30 happosekvenssin alueet 103 - 116, 259 - 271, 263 - 275 ja Φ · '*;·* 326 - 338 (lähtien signaalisekvenssin metioniinista, ks.

Hakala et ai. 1993). Siten esillä olevan keksinnön mukai-sesti, peptidien voidaan ymmärtää käsittävän autoantigeeni·. nin HC gp-39 sellaiset fragmentit, jotka sisältävät yhden I · · . 35 tai useamman edellä identifioidun MHC Class II -rajoittu- *. ·: 7 118472 neen T-soluepitoopin, ja myös tällaiset kuuluvat esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

Keksinnön mukaiset peptidit ovat T-solurektiivisia peptidejä, jotka tunnistetaan aktivoituneiden, autoreak-5 tiivisten T-solujen toimesta ja jotka kykenevät stimuloimaan aktivoituneita, autoreaktiivisia T-soluja. Näitä au-toreaktiivisia T-soluja tavataan nivelreumapotilaiden veressä, mutta harvoin terveissä luovuttajissa.

Siten, keksinnön mukaisesti, HC gp-39 -proteiini 10 tai synteettiset peptidit, jotka muistuttavat kohdeautoan-tigeenillä HC gp-39 esiintyviä MHC Class II -rajoittuneita T-soluepitooppeja, soveltuvat erittäin hyvin käytettäväksi terapiassa T-solutoleranssin indusoimiseksi HC gp-39:ää kohtaan potilaissa, joilla esiintyy T-soluvälitteistä rus-15 ton tuhoutumista, kuten artriittia, erityisesti nivelreumaa.

Julkaisut WO-95/01 995 ja WO-95/02 188 kuvaavat HC gp-39:n diagnostista käyttöä merkkiaineena nivelreumalle, HC gp-39:n artritogeenista luonnetta ei julkaisuissa ole 20 esitetty eikä ehdotettu. Missään ne eivät vihjaise tai ehdota HC gp-39:n, sen fragmenttien tai keksinnön mukaisten ··1 V · T-solureaktiivisten peptidien käyttöön antigeeni- tai pep- *!2· tidispesifisessä terapiassa T-soluspesifisen toleranssin : ij: indusoimiseksi HC gp-39:lie hyökkäyksen kohteena olevassa :1·.· 25 rustossa.

• .1. Esillä olevan keksinnön mukaisten peptidien valmis- • · · tus toteutetaan jollakin tunnetuista, peptidisynteesiin tarkoitetuista orgaanisen kemian menetelmistä. HC gp-39:ää ja peptidejä voidaan valmistaa myös käyttämällä yhdistel- *,,, 30 mä-DNA-tekniikoita.

• · *···1 Peptidisynteesiin tarkoitettuihin orgaanisen kemian • · menetelmiin katsotaan kuuluvaksi tarvittavien aminohappoja1: jen kytkentä kondensointireaktiolla joko homogeenisessa »lm faasissa tai ns. kiinteän faasin avulla.

• · · • · ♦ e · • · · • ·· 2 • t 8 118472

Kondensointireaktio voidaan suorittaa seuraavasti: (a) suoritetaan yhdisteen (aminohappo, peptidi), jolla on vapaa karboksyyliryhmä ja muut reaktiiviset ryhmät suojattu, kondensointi yhdisteen (aminohappo, peptidi) 5 kanssa, jolla on vapaa aminoryhmä ja muut reaktiiviset ryhmät suojattu, kondensointiaineen läsnä ollessa; (b) suoritetaan yhdisteen (aminohappo, peptidi), jolla on aktivoitu karboksyyliryhmä ja muut reaktioryhmät vapaat tai suojattu, kondensointi yhdisteen (aminohappo, 10 peptidi) kanssa, jolla on vapaa aminoryhmä ja muut reaktiiviset ryhmät vapaat tai suojattu.

Karboksyyliryhmän aktivointi voidaan suorittaa mm. konvertoimalla karboksyyliryhmä happohalogenidiksi, atsi-diksi, anhydridiksi tai aktivoiduksi esteriksi, kuten 15 N-hydroksisukkini-imidiksi, N-hydroksibentsotriatsoliksi, p-nitrofenyyliesteriksi, N-hydroksibentsotriatsoliesterik-si tai pentafluorifenoliesteriksi.

Edellä mainituista kondensointireaktioista kaikkein yleisimpiä menetelmiä ovat: karbodi-imidimenetelmä, atsi-20 dimenetelmä, seka-anhydridimenetelmä ja menetelmä, jossa käytetään aktivoituja estereitä, kuten on kuvattu esim.

·*·*♦ V * teoksessa. The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Voi.

*·**· 1-3 (toim. Gross, E. ja Meienhofer, J. ) 1979, 1980, 1981 ί,ί.ϊ (Academic Press, Inc.).

i*\j 25 Edellä mainittujen keksinnön mukaisten sopivien ; j*: peptidifragmenttien valmistus käyttäen "kiinteää faasia" M· .•J*. voidaan toteuttaa esim. julkaisuissa, J. Amer. Chem. Soc.

85:2 140 (1963) ja Int. J. Peptide Protein Res. 35:161 -214 (1990), kuvatun mukaisesti. Valmistettavien peptidien • #· 30 aminohappojen kytkentä alkaa tavallisesti karboksyylipään • ♦ *** puolelta. Tätä menetelmää varten tarvitaan sellainen kiin- • · teä faasi, jossa on reaktiivisia ryhmiä tai johon voidaan ί***: viedä tällaisia reaktiivisia ryhmiä. Tällainen voi olla ·»· t···, esim. bentseenin ja divinyylibentseenin kopolymeeri, jos- • · · I . 35 sa on reaktiivisia kloorimetyyliryhmiä, tai polymeerinen • t! • · 9 118472 kiinteä faasi, joka on tehty reaktiiviseksi hydroksimetyy-li- tai amiinifunktiolla.

Eräs erityisen edullinen kiinteä faasi on esim. p-alkoksibentsyylialkoholihartsi (4-hydroksimetyylifenok-5 simetyylikopolystreeni - 1 % divinyylibentseeni -hartsi), jonka on kuvannut Wang (1974) julkaisussa, J. Am. Chem. Soc. 95:1 328. Synteesin jälkeen peptidit voidaan katkaista tästä kiinteästä faasista lievissä olosuhteissa.

Halutun aminohapposekvenssin synteesin jälkeen seu-10 raa peptidin irroittaminen hartsista esim. trifluorietik-kahapolla, joka sisältää happoa sitovia aineita, esim. tri-isopropyylisilaania, anisolia tai etaaniditioli,tio-anisolia.

Reaktiiviset ryhmät, jotka eivät osallistu konden-15 sointireaktioon, on esitetyn mukaisesti suojattu tehokkaasti ryhmillä, jotka voidaan jälleen poistaa hyvin helposti hydrolyysillä käyttäen happoa, emästä tai pelkistystä. Siten, karboksyyliryhmä voidaan suojata tehokkaasti esim. esteröimällä metanolilla, etanolilla, tertiäärisellä 20 butanolilla, bentsyylialkoholilla tai p-nitrobentsyylial- koholilla ja kiinteään kantajaan kytketyillä amiineilla.

··· V : Ryhmiä, jotka voivat suojata tehokkaasti aminoryh- mää, ovat etoksikarbonyyli-, bentsyylioksikarbonyyli-, •j]· t-butoksikarbonyyli- (t-boc-) tai p-metoksibentsyylioksi- 25 karbonyyliryhmä, tai sulfonihaposta johdettu happoryhmä, • ·1· kuten bentseenisulfonyyli- tai p-tolueenisulfonyyliryhmä, ·2· kuitenkin, myös muita ryhmiä voidaan käyttää, kuten subs- Φ 1 tituoituja tai substituoimattomia aryyli- tai aralkyyli-ryhmiä, esim. bentsyyliä tai tr if enyy lime tyyliä, tai ryh- • ·· *... 30 miä, kuten orto-nitrofenyylisulfenyyli ja 2-bentsoyyli-l- • · *"2 metyylivinyyli. Eräs erityisen edullinen a-aminosuojaryhmä lm1t2 on esim. emäkselle herkkä 9-fluorenyylimetoksikarbonyyli- :3: (Fmoc-) ryhmä [Carpino & Hän (1970), J. Amer. Chem. Soc.

92:5 748].

• · · - • · · · 2 • · Φ • ·· 3 • 1 10 118472

Laajempi luettelo mahdollisista suojaryhmistä voidaan löytää teoksesta, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, voi. 1-9 (toim. Gross, Udenfriend ja Meienho-fer) 1979 - 1987 (Academic Press, Inc.).

5 Suojaryhmät voidaan lohkaista pois erilaisilla kon ventionaalisilla menetelmillä riippuen kyseeseen tulevan ryhmän luonteesta, ja voidaan käyttää esim. trifluorietik-kahappoa tai lievää pelkistystä, esim. vedyllä ja katalyytillä, kuten palladiumilla, tai HBr:llä jääetikkahapossa. 10 Kuten edellä on jo esitetty, HC gp-39:ää ja keksin nön mukaisia peptidejä voidaan myös valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Tätä tarkoitusta varten nukleiinihappo-sekvenssi, joka koodaa HC gp-39:ää tai keksinnön mukaista peptidiä tai mainitun peptidin multimeeria, insertoidaan 15 ilmentämisvektoriin. Sopivia ilmentämisvektoreita ovat mm. plasmidit, kosmidit, virukset ja YAC't (Yeast Artificial Chromosomes), jotka sisältävät replikaatioon ja ilmentymiseen tarvittavat kontrollialueet. Ilmentämisvektori voidaan saattaa ilmentymään isäntäsolussa. Sopivia isäntäso-20 luja ovat esim. bakteerit, hiivasolut ja nisäkässolut. Tällaiset tekniikat ovat alalla hyvin tunnettuja (Sambrook ··· V: et ai., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold *·*'· Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

*t;4i Vaikka näyttää paradoksaaliselta tehdä immuunijär isi 25 jestelmä vähemmän herkäksi käyttäen juuri samaa antigee- • ·*· niä, joka on vastuussa immuunijärjestelmän aktivoimisesta, • •a9 j'j’j niin HC gp-39:n ja/tai HC gp-39 -alasekvenssin sisältävien peptidien kontrolloitu anto voi olla tehokas tekemään im- j.# muunijärjestelmä vähemmän herkäksi. Keksinnön mukaisesti, • »· 30 potilaita, joilla rusto on autovasteellisten T-solujen **"' hyökkäyksen kohteena, voidaan käsitellä farmaseuttisella koostumuksella, joka sisältää HC gp-39 :ää, tai yhtä tai ϊ[**ϊ useampaa keksinnön mukaista peptidiä sekä farmaseuttisesti 4·|· hyväksyttävää kantajaa, näiden potilaiden spesifisten au- • · · I , 35 toreaktiivisten T-solujen tekemiseksi toleranteiksi hyök- • · a • M • · 118472 u käyksen kohteena olevassa rustossa olevalle HC gp-39:lie ja muille omille antigeeneille, jotka kantavat identifioituja T-soluepitooppeja, joilla on jokin SEQ ID No.:issa 1-8 annetuista aminohapposekvensseistä, sekä inflammato-5 risen vasteen vähentämiseksi. Keksinnön mukaisissa farmaseuttisissa koostumuksissa erityisen käyttökelpoisia peptidejä ovat peptidit, joilla on SEQ ID No.:issa 5, 6, 7 ja 8 annettu aminohapposekvenssi.

Edelleen erityisen edullisia käytettäväksi keksin-10 nön mukaisessa farmaseuttisessa koostumuksessa ovat DNA-(ilmentämis)vektorit, jotka sisältävät DNA:ta, joka koodaa HC gp-39:ää tai yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä. DNA-(ilmentämis)vektorin luovuttamisella voidaan tuottaa sellainen yhdistelmä-HC gp-39 -proteiinin tai kek-15 sinnön mukaisten peptidien ilmentymistaso, joka vastaa HC gp-39 -proteiinia tai peptidejä sisältävän farmaseuttisen koostumuksen suoralla annolla saavutettavaa tasoa.

Keksinnön mukaisen autoantigeenin ja keksinnön mukaisten peptidien etuna on, että niillä on spesifinen to-20 leroiva vaikutus autoreaktiivisiin T-soluihin ja siten ne jättävät immuunijärjestelmän muut komponentit koskematto-V * miksi verrattuna immunosuppressiivisten steroidilääkkeiden *" Ϊ ei-spesifiseen suppressoivaan vaikutukseen. Käsittely kek- ·β!φ! sinnön mukaisella autoantigeenillä tai keksinnön mukaisil- :*·.· 25 la peptideillä on turvallista eikä niillä esiinny mitään a * • toksisia sivuvaikutuksia.

a··

Toleranssi voidaan saavuttaa antamalla suuria tai • · · m pieniä annoksia autoantigeeniä tai keksinnön mukaisia pep-tidejä. Autoantigeenin tai peptidin määrä riippuu antorei- • ·· 30 tistä, antoajankohdasta, potilaan iästä sekä yleisestä • · *;·* terveyden tilasta ja ruokavaliosta.

• · •t*t! Yleisesti, voidaan käyttää 0,01 - 1 000 pg:n annos peptidiä tai proteiinia per kg kehonpaino, edullisesti tijit 0,5 - 500 pg, edullisemmin 0,1 - 100 pg peptidiä tai pro- J , 35 teiinla.

• · · • ·· • · 12 118472

Farmaseuttisesti hyväksyttävät kantajat ovat hyvin tunnettuja alan ammattilaisille ja niihin kuuluu esim. steriili suolaliuos, laktoosi, sakkaroosi, kalsiumfosfaat-ti, liivate, dekstriini, agar, pektiini, maapähkinäöljy, 5 oliiviöljy, seesamiöljy ja vesi. Muita kantajia voi olla, esim. MHC class II -molekyylejä, haluttaessa sisällytettynä liposomeihin.

Lisäksi keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus voi sisältää yhtä tai useampaa adjuvanttia. Sopiviin adju-10 vantteihin kuuluu mm. alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti, amfigeeni, tokofenolit, monofosfenyylilipidi A, mura-myylidipeptidi ja saponiinit, kuten Quill A. Adjuvantin määrä riippuu itse adjuvantin luonteesta.

Edelleen, keksinnön mukainen farmaseuttinen koostu-15 mus voi sisältää yhtä tai useampaa stabiloivaa ainetta, kuten hiilihydraatteja, joihin kuuluu sorbitoli, raannitoll, tärkkelys, sakkaroosidekstriini ja glukoosi, proteiineja, kuten albumiini tai kaseiini, ja puskurlaineita, kuten aikalisiä fosfaatteja.

20 Sopivia antoreittejä ovat intramuskulaariset injek tiot, subkutaaniset injektiot, intravenoosiset injektiot • ·*» V * tai intraperitoneaaliset injektiot, oraalinen ja intrana- ’·**· säälinen anto. Oraalinen ja intranasaalinen anto ovat ϊ.ί.ί edullisia antoreittejä.

:\j 25 Artritogeenisesta luonteesta johtuen HC gp-39:ää ; tai keksinnön mukaisia peptidejä voidaan käyttää indusoi- ··« ·*!*. maan kliininen artriitti ei-ihmisnisäkkäisiin. Annettaessa • · · « pieniä määriä HC gp-39:ää tai yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä kehittyy mainittuihin nisäkkäisiin art- • t· 30 riittisia taudinmerkkejä, jotka johtavat tautimalliin, jo- *;* ka muistuttaa taudin etenemistä artrUtissa, erityisesti • · V,! nivelreumassa. Kun Balb/c-hiiriin injektoitiin subkutaani- i"[: sesti HC gp-39:ää, eläimiin kehittyi artriittisia taudin- ,···. merkkejä. HC gp-39 -indusoidun taudin kululle oli tunnus- • · i *, . 35 omaista taudin jaksottaisesti ilmenevät uusiutumiset etu- • ·· ♦ « 13 118472 ja/takakäpälissä ja kehittyminen vähitellen lievästä art-riitista vaikea-asteisempaan muotoon. Lisäksi havaittiin sairastuneiden nivelten symmetristä jakautumista, mikä yhdessä taudin toistuvan uusiutumis- ja kyhmynmuodostusha-5 vainnon kanssa muistuttaa taudin etenemistä artriitissa, erityisesti nivelreumasssa.

Siten nämä sairastuneet eläimet tuottavat sopivan eläinmallin tutkittaessa mekanismia, joka liittyy artrii-tin kehittymisen alkuun ja etenemiseen. Lisäksi, mainittu-10 ja sairastuneita eläimiä voidaan käyttää etsittäessä uusia lääkkeitä artriitin hoitoon ja tutkittaessa näiden lääkkeiden vaikutuksia artriitin kehittymisen aikana. Edullisesti käytetään hiiriä artriitin, erityisesti nivelreuman, eläinmallina.

15 Artriitin indusoimiseksi mainituissa nisäkkäissä täytyy antaa sopivia määriä HC gp-39:ää tai keksinnön mukaista yhtä tai useampaa peptidiä. Sopivia määriä ovat 0,1-1 000 pg, edullisesti 1 - 100 pg, edullisemmin 10 -50 pg per kg kehonpaino. HC gp-39:n tai peptidien määrä 20 riippuu antoreitistä, antoajankohdasta ja käytetystä eläintyypistä. Sopivat antoreitit ovat samoja kuin edellä ··· V i on esitetty. Artriitti-induktion vaikutuksen indusoimisek- '·*’· si HC gp-39 -proteiini tai keksinnön mukaiset peptidit ί#ϊ#! voivat sisältää yhtä tai useampaa edellä kuvatun mukaista 25 stabiloivaa ainetta tai adjuvanttia.

; ·*; HC gp-39 tai keksinnön mukaiset peptidit ovat li-

• M

.'I*. säksi erittäin käyttökelpoisia diagnostiseen menetelmään nivelruston kroonisessa inflammaatiossa mukana olevien, aktivoituneiden autoreaktiivisten T-solujen läsnäolon to- • ·· *... 30 teamiseksi.

• ·

Keksinnön mukainen diagnostinen menetelmä sisältää • · ?,ϊ#ϊ seuraavat vaiheet: (a) periferaalisten veren mononukleaarisolujen (pe- ,···, ripheral blood mononuclear cells, PBMC) eristys yksilön • · · . 35 verinäytteestä, • · · • · 14 118472 (b) mainitun PBMCrn kasvatus sopivissa olosuhteissa, (c) mainitun PBMC-viljelmän inkubointi keksinnön mukaisen autoantigeenin tai siitä johdetun yhden tai 5 useamman keksinnön mukaisen peptidin läsnä ollessa, ja (d) T-solujen vasteen, esim. proliferatiivisen vasteen, toteaminen, joka vaste viittaa aktivoituneiden auto-reaktiivisten T-solujen esiintymiseen yksilössä.

Tapauksessa, jossa vaste todetaan mittaamalla auto-10 reaktiivisten T-solujen proliferatiivinen vastetta, radio-isotoopin, kuten 3H-tymidiinin, liittyminen on proliferation mitta. PBMC:ssä esiintyvien autoreaktiivisten T-solu-jen vaste voidaan todeta myös mittaamalla sytokiinin vapautumista sytokiini-spesifisellä ELISA:11a tai sytotoksi-15 suutta 51kromi-vapautumisella. Edelleen eräs toteamismenetelmä on aktivaatiomerkkiaineiden ilmentymisen mittaus FACS-analyysillä, esim. Il-2R:llä. Diagnostinen koostumus, joka sisältää yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä sekä sopivaa toteamisainetta muodostaa siten osan kek-20 sintöä. Toteamiseen käytetystä tyypistä riippuen toteamis-aine voi olla radioisotooppi, entsyymi tai vasta-aineita, • ·*· ’·* ’ jotka ovat spesifisiä solun pinnalle, tai aktivaatiomerk- • *· kiaineita.

Keksinnön suojapiiriin kuuluu edelleen testipak-*.*·! 25 kauksia, jotka sisältävät yhtä tai useampaa keksinnön mu- : kaista peptidiä. Nämä testipakkaukset soveltuvat käytettä- väksi keksinnön mukaisessa diagnostisessa menetelmässä.

Siten esillä oleva keksintö tuo esiin menetelmän, jolla voidaan todeta, esiintyykö HC gp-39:lle reaktiivisia )···. 30 autoaggressiivisia T-soluja potilaissa, jotka sairastavat • · *!* T-soluvälitteistä ruston tuhoutumista, kuten artriittia, • · V.· erityisesti nivelreumaa. Mikäli HC gp-39-spesifisiä T-so- ··· luja esiintyy, näiden T-solujen tekeminen toleranteiksi farmaseuttisella koostumuksella, joka sisältää HC gp-39:ää · 35 tai keksinnön mukaisia peptidejä tai näiden yhdistelmiä, • ·♦ • ♦ 15 118472 voi siten viivästyttää tai suppressoida artriitin kehittymistä.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu havainnollistamaan keksintöä eikä niitä pidä tulkita keksinnön suojapii-5 riä rajoittaviksi.

Kuvioiden selitykset

Kuvio 1: Artriitin alkaminen ja eteneminen HC gp-39:llä tolerantiksi tehdyissä ja ei-tolerantiksi tehdyissä Balb/c-hiirissä. Sairastuneiden eläinten artriitin koko-10 naispisteytys päivää kohti herkistymisen jälkeen annetaan sekä etu- että takakäpälälle. Edelleen annetaan sairastuneiden eläinten lukumäärä päivää kohti herkistyksen jälkeen.

Esimerkki 1: 15 Menetelmät:

Potilaat

Periferaalisia veren mononukleaarisoluja (PBMC) kerättiin potilailta, jotka oli diagnosoitu American Rheumatism Association (ARA) -kriteerien mukaista (Arnett et 20 ai., Arthritis Rheum. 31: 315, 1988) nivelreumaa sairasta- ... viksi. Nivelreumapotilaiden taudin vaikeusaste vaihteli • · · *** [ vaiheissa X - IV määritettäessä röntgenpisteytyksellä.

* PBMC:itä kerättiin kontrolliksi terveiltä luovutta- jilta, jotka kantoivat DR4Dw4- (DRB110401) tai DRl-spesi- • · *.1·; 25 f isyyttä. Lisäksi, PBMC: itä kerättiin kahdelta terveeltä ϊ.·#ί luovuttajalta, jotka eivät kantaneet yhtä nivelreumaan yh- iT: teydessä olevista DR-molekyyleistä.

MHC-tyypitys ·1. Potilaiden ja terveiden luovuttajien PBMC-kromoso- .···. 30 maaliset DNA-uutokset analysoitiin käyttäen Dynal DR "low resolution" SSP -testipakkausta. DR4-alatyypitys suoritet- *»V tiin käyttäen Dynal DRB1104SSP -testipakkausta (University ···

Transfusion service -palvelu, Radboud hospital, Nijmegen, Alankomaat).

• · 1 · • · 1 • »· • · 16 118472

Peptidit

Keksinnön mukaiset peptidit ja kontrollipeptidi syntetisoitiin kiinteäfaasipeptidisynteesillä. Lyhyesti, vapailla amino- tai karboksipäillä varustettuja peptidejä 5 syntetisoitiin Milligen 9 050 -syntetisaattorilla käyttäen Fmoc/tBu-suojattuja aktivoituja estereitä PEG-PS-hartsil-la. Irroittamisen ja suojauksen poiston jälkeen peptidit puhdistettiin preparatiivisella HPLCrllä, konvertoitiin asetaattisuoloiksi Dowex Ac -hartsilla tai kloridisuoloik-10 si ja lyofilisoitiin. Peptidit tarkastettiin massaspektrometrillä. Tässä kokeessa käytetyt peptidit on luetteloitu taulukkoon 1. N-terminaalista biotinyloitua, Influenza Haemagglutiinista johdettua peptidiä (SEQ ID No. 9), bio-tiini-tilaryhmä-IHA(307-319)F, jossa kolmas tähde (Y) oli 15 korvattu F:llä, (biotiini-NH-(CH2)5-CO-PKFVKQNTLKLAT), käytettiin merkkiainepeptidinä sitoutumiskokeissa DR4Dw4:n (DRB110 401) kanssa. Ei-biotinyloitua peptidiä IHA(307-319)F, jolla oli SEQ ID No. 9, käytettiin kontrollipepti-dinä.

20 Taulukko 1: Syntetisoitujen peptidien aminohappo sekvenssit ··1 • 1 · • » · * 1 - — . .1. Peptidi Sekvenssi HPLC-puhtaus SEQ Π) 25 1 PTFGRSFTLASSE 93.2% No. 5 • · : ;1: 2 RSFTLASSETGVG 85.6% No. 6 • · · :T: 3 VGYDDQESVKSKV 95.6% No. 7 4 SQRJFSKIASNTQSR 97.6% No. 8 • · : ’·· IHA(307-319)F PKFVKQNTLKLAT 97.9% No. 9 · · jU _ • · _______ _ I ......... ,, -- -1----------------1- 1 ~~ 1 • · ··· • *.1.1 Annetaan peptidien 1-4 ja kontrollipeptidin IHA- • 1 « (307-319 )F:n aminohapposekvenssit, jotka ovat vastaavien sekvenssi-ID:iden mukaisia.

• 1 · • · · • t1 • · 17 118472

Soluviljelmä puhdistettujen HLA-DR-molekyylien tuottamiseksi

Kaksi EBV-transformoitua B-solulinjaa, BSM (A2, B62, Cw3, DR4Dw4, DQ8, Dpw2) ja BM92 (A25, B51, Cwl, DR4-5 Dwl4, DQ8), olivat lahja Academic Hospital Leiden'Itä, Alankomaat. Soluja kasvatettiin DMEM/HAM's F12 -kasvatus-alustassa (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 10 %:lla FCS:ää (Hyclone Laboratories), 1 %:lla ei-välttämättömiä aminohappoja (ICI), L-glutamii-10 nilla, 2-ME:llä ja antibiooteilla. Solut siirrettiin rutiininomaisesti joka 2. - 3. päivä 1:2-suhteeseen. Solut kerättiin ja sen jälkeen niitä pestiin kolme kertaa PBS:s-sä (4 °C), joka sisälsi 1 mM PMSFtää. Solupellettejä säilytettiin -70 °C:ssa käyttöön saakka.

15 HLA-DR-molekyylien affiniteettipuhdistus HLA-DR:lle suoritettiin af finiteettipuhdistus solu-lysaateista käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta L243 (ATCC HB55), joka oli kohdistettu DR-kopleksilla olevaan ei-polymorfiseen determinanttiin (Lampson et ai., J. Immu-20 nol. 125:293, 1980). Proteiini G sefaroosilla puhdistettu L243 kytkettiin NHS-Sepharose 4 FFrään (Pharmacia) valmis- ··· · tajan ohjeen mukaisesti.

*·*" HLA-DR:ää ilmentävät solut sulatettiin ja niil- iJ*J le suoritettiin lyysi jäähauteella, 30 minuutin ajan, :*·.· 25 PBSissä, jossa oli 1 % NP-40, 1 mM AEBSF (Calbiochem).

• · . Lysaatti tehtiin kirkkaaksi sentrifugoimalla 15 000 ··· rpm:ssä (Sorvali, SS34-roottori) 30 minuutin ajan. Super-natantti saatettiin 0,45 pm suodattimen läpi ja lisättiin L243-NHS-sefaroosihelmiin. Yön yli inkuboinnin jälkeen • *· 30 helmet siirrettiin pylvääseen ja niitä pestiin viidellä **· tilavuudella PBS:ää, jossa oli 1 % NP-40:tä; 5 tilavuudel- ϊ.·/ la PBS:ää, jossa oli 1 % NP-40:tä; 5 tilavuudella PBS:ää, : j jossa oli 0,5 % NP-40:tä; 15 tilavuudella PBS:ää, jossa /.., Oli 0,5 % NP-40:tä, 0,1 % SDS:ää; 5 tilavuudella PBS:ää, l . 35 jossa oli 0,05 % NP-40:tä; 5 tilavuudella PBS:ää, jossa • * φ • «· « · 18 118472 oli 1 % n-oktyyliglukosidia (Sigma, St. Louis, USA) ja 5 tilavuudella 50 mM dietyyliamiinia (Fluka), 150 mM NaCliää, jossa oli 1 % n-oktyyliglukosidia, pH = 8,0. HLA-DR-molekyyit eluoitiin 50 mM:llä dietyyliamiinia, jossa 5 oli 150 mM NaCl:ää, 1 % n-oktyyliglukosidia, pH « 11. Vä-littöämästi keräämisen jälkeen fraktiot neutraloitiin 2 M glysiinillä, pH = 4,8. Kerätyt fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla ei-pelkistävissä olosuhteissa, jonka jälkeen suoritettiin hopeavärjäys. Puhdistettua HLA-DR:ää sisältävät 10 fraktiot konsentroitiin ultrasuodattamalla yli 30 kD:n poissulkevalla kalvolla.

HLA-DR-peptidin sitoutumismääritys Peptidin sitoutumiskokeet suoritettiin käyttäen aikaisemmin kuvatun (Joosten et ai., Int. Immunol. 6:751, 15 1994) puolikvantitatiivisen sitoutumismäärityksen paran nettua versiota. Puhdistettuja HLA-DR-molekyylejä (0,5 -500 nM) inkuboitiin pH-arvossa 5,0, 50 nM:n biotinyloitua merkkiainepeptidiä (biotin-tilaryhmä-lHA(307 - 319)F) kanssa ja kilpailijapeptidien (peptidit 1 - 4 ja IHA(307-20 309)F kontrollipeptidinä) pitoisuusvälin kanssa, lopulli

sessa 25 μΐ:n tilavuudessa sitoutumispuskuria (PBS, 1 mM

t · · V · AEBSF, 1 mM N-etyylimaleimidi, 8 mM EDTA, 10 μΐ pepstatii- '"** ni A, 0,01 % NaN3, 0,05 % NP-40 ja 5 % DMSO).

* ϊ,ί,ί Suunnilleen 45 tuntia huoneenlämpötilassa inkuboin- i\j 25 nin jälkeen sitoutuneet ja ei-sitoutuneet merkkiainepepti- • :*· dit erotettiin joko SDS-PAGE:lla täplänsiirtämisen (blot- • · · ting) nitroselluloosakalvolle kanssa (BioRad) tai suorit-tamalla vakuumi-DOT-täplänsiirto käyttäen nitroselluloosa-kalvoa (BioRad) ja 96-kuopan Hybry.Dot-laitteistoa (BRL). 30 Täplät blokattiin 0,5-%:isella DNA-blokkausreagenssilla *** (Boehringer Mannheim, Saksa) 0,1 M maleiinihapossa, pH = V,: 7,5, 150 mM NaClissa. Kun oli kulunut 1/2 tuntia, täplät pestiin PBS:ssä, jossa oli 0,02 % Tween 20 (Sigma, St.

,···. Louis, USA) ja inkuboitiin Streptavidiini-HRPO:n kanssa • · · . 35 (Southern Biotechnology) 1:40 000 tai vast. 1:5 000 lai- • ·· • · 19 118472 mennoksessa. DR-sitoutunut, biotinyloitu merkkiainepeptidi todettiin lisääntyneen kemoluminesenssin avulla käyttäen Western Blot ECL -testipakkausta (Amersham, UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Esivalotettuja filmejä (Hyper-5 film-ECL, Amersham, UK) valotettiin 10 minuutin ajan. Annettujen peptidien suhteellinen sitoutumisaffiniteetti suhteutettiin kilpailuun merkkiainepeptidin kanssa. Tämä suhteellinen affinitettii määriteltiin peptidipitoisuudek-si, jossa signaali pieneni 50 %:iin (RIC50).

10 SDS-PAGE:n tapauksessa RIC50-arvot määritettiin vi suaalisella tarkastelulla. DOT Blot -täplien tiheys analysoitiin käyttäen tietokoneeseen yhdistettyä densitometria (Molecular Dynamics, USA) ja Image Quant sekä Excel -ohjelmistoa.

15 Veren mononukleaarisolujen proliferatiiviset vas teet HC gp-39:ssä esiintyviin peptidisekvensseihin kohdistuvan T-solureaktiivisuuden identifioimiseksi peptideistä 1-4 tutkittiin niiden kykyä indusoida prolifera-20 tiivisia vasteita nivelreumapotilailta saadussa PBMC:ssä verrattuna terveisiin DR1- tai DR4-kontrolleihin.

• · V* ; PBMC, joka oli saatu heparinoidusta periferaalises- ***** ta laskimoverestä, eristettiin standardisentrifugoinnilla ί,ί,ϊ Ficoll-Paque-gradientilla. Soluja kasvatettiin kolmin- tai 25 nelinkertaiseksi, pitoisuudessa 1,5 x 105 solua/kuoppa, : :*: kasvatusalustassa, jota oli täydennetty 10 %:lla lämpöak- • · · ·*·*. tivoitua autologista plasmaa, L-glutamiinilla, 2-ME:lla ja antibiooteilla, tasapohjaisilla mikrotiitterilevyillä. So-luja inkuboitiin pelkässä kasvatusalustassa tai PHA:n (2,5 • ·· |... 30 pg/ml) läsnä ollessa tai antigeenien läsnä ollessa mukaan *t* lukien Candida albicans-uute (heräteantigeeni, recall an- \V tigen) (lpg/ml, 0,1 pg/ml) tai jokin peptideistä 1-4 pi- toisuudessa 100 pg/ml, 25 pg/ml tai 10 pg/ml. Viljelmiä .···, inkuboitiin 210 μ1:η kokonaistilavuudessa 7 päivän ajan, • · · l . 35 37 °C:ssa, kostutetussa 5 %:isessa CO,-atmosfäärissä. Vil- ft · v * • ·« • · 20 118472 jelmiä pulssitettiin viimeisen 18 tunnin aikana 0,25 pCi:llä 3H-tymidiiniä.

Määrittelyt

Potilaat, joiden havaittiin tuottavan vasteen vä-5 hintään yhden testatun peptidin molemmille pitoisuuksille, luokiteltiin huomattaviksi vasteen tuottajiksi (HV), potilaat, joiden havaittiin tuottavan vasteen vähintään yhden testatun peptidin vähintään yhdelle pitoisuudelle, luokiteltiin vasteen tuottajiksi (V). Sitä vastoin potilaat, 10 jotka eivät tuottaneet mitään vastetta yhdellekään testatulle peptidille, luokiteltiin ei-vasteen tuottajiksi (EV).

Annetun peptidin suhteellinen sitoutumisaffiniteetti suhteutettiin merkkiainepeptidin kanssa kilpailuun. Tä-15 mä affiniteetti määriteltiin peptidipitoisuudeksi, jossa signaali pieneni 50 %:iin (RIC50).

Tulokset

Peptideihin 1-4 kohdistuvan T-solureaktiivisuuden määrittämiseksi analysoitiin nivelreumapotilaiden ja ter-20 veiden luovuttajien PBMC-proliferatiivinen vaste.

Siten, suurin osa HVrstä ja V:stä, jotka kohdistui- »»· ϊ,1 : vat HC gp-39 -johdettuihin peptideihin, kantoi DR1-, DR4- *:2: Dw4-, DR4dw14- tai DR10-spesif isyyttä, joiden kaikkien j ;1· tiedetään olevan yhteydessä nivelreuman kehittymiselle li- 444 •\! 25 sääntyneen riskin kanssa. Osoitettiin peptidien 1-4 si- * · . .·. toutuminen DR4Dw4:ään ja DR4Dwl4:ään, kuten nähdään taulu- • i · • 4« ,···, kosta 2.

• 1 · ·· • · • ·· • •4 4 4 4 · 414 • • 4 4 · 4 4 4· 4 4 444 • 4 • 4 4 4 4 • • 44 • 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 • 44 2 4 4 21 1 1 8472 Taulukko 2: Peptidien sitoutuminen HLA-DR-molekyy- leihin.

5 Peptidi DR4Dw4 DR4Dwl4 SDS-PAGE DOT Blot SDS-PAGE DOT Blot ί 0^04 Ö~Ö4 2,5 1,95 "" 2 ~ tyÖ4 ty)8 0,2 0,19 3 j 0^23 >=50 >10 10 4 I Ö|ÖI - ""0^4 JHA(307-319)F 0^3 ' 0^55 0,3 0,53

Peptidien 1-4, joilla on vast. SEQ ID No.zissa 15 5-8 annettu aminohapposekvenssi, sitoutminen HLA-DR-mo- lekyyleihin. Peptidin situtouminen määritettiin puolikvan- titatiivisellä sitoutumismäärityksellä (kuten kuvattu esi- ♦ merkin 1 kohdassa Menetelmät), pH = 5, käyttäen 50 nM IHA-(307-319)F:ää merkkiainepeptidinä. Arvot on RIC50-arvoja 20 mikromolaarisuuksina (kilpailijapeptidin pitoisuus, jossa signaali pienenee n. 50 %:iin ilman kilpailijapeptidiä

»M

V1 saadusta signaalista). Kaikki tulokset peptidiä 4 lukuun

*ί2ί ottamatta on kahdesta riippumattomasta kokeesta (SDS-PAGE

Ϊ J1J ja vast. DOT Blot).

:2·.· 25 Suurin osa nivelreumapotilaista tuotti vasteen yh- • · • delle tai useammalle keksinnön mukaiselle peptidille (Tau-

»M

·3. lukko 3), kun taas vasteita havaittiin harvoin terveiden » « · ' ' luovuttajien ryhmässä (Taulukko 4). Kuuden nivelreumapoti-laan ei havaittu tuottavan vastetta yhdellekään testatulle • ·· 30 peptidille (tuloksia ei esitetty).

• · *;1 Nivelreumapotilaiden sairauden vaikeusaste luoki- • · *.1.1 teltiin vaiheilla I - IV. Tässä yhteydessä viitattu rönt- *·· genpisteytys on arvio nivelen tuhoutumisasteesta. HV ja V peptideille 1-4 havaittiin taudin kaikissa vaiheissa.

* · · a • · · 2

• M

3 • 1 22 118472

Keksinnön mukaiset peptidit edustavat autoreaktii-visia T-soluepitooppeja ja reaktiivisuus näille epitoo-peille havaittiin pääasiallisesti nivelreumapotilailla, mutta harvemmin terveillä luovuttajilla. Siten, nivelreu-5 mapotilailla on aktivoituneita, autoreaktiivisia T-soluja, jotka ovat kohdistuneet autoantigeeniin HC gp-39. Autoantigeeni HC gp-39 on selvästi T-solujen hyökkäyksen kohteena, jolloin seurauksena on inflammaatio ja HC gp-39 antigeenin tuhoutuminen rustossa.

··· * · · • « » • · • · · • · » ··1 • · • · · « 1· • ♦ • · · • · · ··· *·♦ i · » • · · ·· • » • 1f 1«· • · • « • 99 • · • · · » » t a · ♦ ·· • · • · a·· ··· • · · • · · ♦ • · · • ·· a m 23 118472 rt - I ti · G II I · H r*.------------- 0) ffl -H <D 01 —- H M P P P P > P Id •W □ Il I Ή MjC W® » » 0) p 3P3P V) 2 O 2 X 0> Ό . o3os_,®rt.art,grt •H G GG.dC P P .η Ρ in 3 Ό p p - . 3333 -P -P 3 +j !j to 3 P, 'G > ~ > pppc 0) <D P P P t; P 3 S) 2 "v :=: " . -- h w g p e ® o to a rt K KS3:>i=:>K>> £ p -h

gH >-^ I—> ·-—I >—< >—> 1"—· —^ ·—· ·—I <-* -rl O 3 I 5 rl Q

P —.------------- |||ri,P 10 aP

Si 10 3in S 1 <D c— ΉΕ^τ;^ (i P _ o w tN <Ν ΓΊ <S p ►*· S · ® -H -rl 01 ^ *·« a V V c-ι V -1 V a * ^ m <0 Ρ Ό

rt ------------- Φ p ™ q (0 0,-H

> τι +» w φ m w o aa « ρ»λμ ρ2ββΐΡΛ® 01 0 ·-· <D ^ M <0 Oi 5 2> 5j > -H 3 -h w rt ,j e m Ί4 ¢) ^ lpj rl 0)

.j © W CM Cls ΓΊ |H Q) ¢1 Id m 3 M

Π .— a. v ό <n «λ v cm s w ft « oi S p 3

P -------------- OWeS-H^P

(j J_1 & -H ,§ C (0 p (Ö Ö · «c Ρ a e 10 co p «H 5 ro ° 2? w w ® « § .0·^ a) 01 p w *-1 a ^ v r-> v 01 £ jj u '•pai P W ,------------- -H 0 fcn v P p P -rl P > C P * O (d

Pi ^ P -H p <fl p* (0 (d P p V) « P E Cfl,ri« 01 w ft G p rs dr, 0 P«rt§0«J-riro e S «------------- Sp t £p 11 ύ " *85 c ~ Ä 3-!= 7 Μ 1 διό — a^ovor-. — .— vvvo — -h oi w h >,0 d ' _ to -------------- HCjj'Jtntogd^ g rt «= vflip 5 g 3 w ®w r- a λ ,« <d > a) c

Ό -H (M^a _ _ ^ _ v cm m — tO?ScC(i)n-H

rt o> .------------- c , S£ S^p « > rt o p ·· ' m m 01 m a *2

···; J s szzuzz--------- Is^aSrSS

3 · ^0-=; s • rt m 0 w 0 cm — G p -· ^ oi ^ rt — g ::: p w *-<a—soiocm — vvoos—>m- 2 ** —-q .,-, .:;·. a s ------------- Ϊό.|-ί2«| *·· a' ΡηιβΗρ^^Η !:ϊ P O P Pw-H^^v^Pili • HrH 'CviW Pt/lO0Om®·*

Η Ή N a lO LT, O' ID j^tISUCH

« rt P------------- H p a® P s g ? d λ -h j_> c3 ·* co cu ε ;» p 9 ® © ^. pm2o<MWp ··* S5p ft © m m 01 rr — OrtJS^ c > 01 1 .. p —a— ,NONnv-N^« a > d \ λι οι ίο *...· rtP ecSorto> 3 S*g to 3°^SoSp"§ ::: 3s Λ > > > ' - p> o w >1 Srtwrtp«p>p ·· a·*· p 2, ä ä ^ C- ^ ^ £ fi 0101 hh *η£·η(0 3

O H, ^ 000000S00000 SSSSfSg^S

. rt O Loonor'co — τΙ0Λ(1)Η(1)3Λ3 ... tiH Λ — d-^-TS-rT'iroNr't^t^r^oo ζ-οΡ^υΐΛίΛ WE-· ··» ^ (ΊΝΝΝΜΝ^ΜΝΝΝΝ • * I I I I I I I - I . .. 1*11 • · • · · • ·« • · 24 118472

+J v+J C I '"H

οι ^ ® ® ·η <0 ®

01 tf) μ -H W

•H I X 0) +> W <0 > O 3 <d <D -Π

•H Hrl 10 01¾ O

•η 3 +j o) g >

+J ® E-4 +> β 3 P

n) r—.--———-, — —— — Η ·Η _ W (0

U H , g d-H

iTj e „ „ Q) +" ··"· -P (0 * „s-g v - - v - v 3-S.g ° -H__________________ftg 0-0¾ w c ί1-1 1·£81&1 ΰ « gSl ? ~ V V V V S1S^g,1

w to ^ a. tuO'wv-'^H

cp co μ &·η ^ in 10 ft -H-------------------M O- to Λ ω el - >S 8,0 §£

StSricEts o, — Oföfjpt « ® h a φ-Ηβΐρ+j® v w v Seoi' (0 5 to H--------- <0 a)H dj-to T1 o > 5>w 1 t tj W O' — Ή n-H ..21

Ml Φ ^ 2ΐ" V " ' V V V V v - μ S G _W , 11—------------------i|I|is I „al__fail1 I 3 _________________ &, 5 8 5 - " ^ Λ ® $ § « S £ g f~ v v v v v “ ~ v v ^ v - v - v v | ! : -j ___ P1 ra to Id > -¾ ....: _ § "Tili1 vS sl-"-SVV --ϋϊ-ϊ-ΐϊΐ iä^Beg

V;: § , :-----------------Sa=HS

!·:.! -5-ΪΪΪ-5-" :T: Si ' s «“S3g| 'S S n-------------------S -ί 8 Si? £8 '« > >>> >gfIT^frEi>&>&£-> Isicgc

!··· Hj ί ae4!JssS“ £, ryeirii®·” r 813.8 SIS

..... .. g, g 98098900000900999 H ^ , « 1 _ _ . Φ λ in\0t%(v00000'O^l^^^^®®Wp"rH .24 C ^ tri .·.·. S +j _L3_—_——I—J————————— h « C · +1 · ·,·,· 32® -rt <0 μ « <d --j <o ... 3 ® ® H ® -H ti 6 +> :: Η-μ > h +j jx ® ®

··· 3w η ή ή w ro b C

• 5 ifl 0) ·0 ¢0 <u "H c

6 > E-1O(DA!>liO

• · · · • · « • ·· 2 • · 25 118472

Esimerkki 2:

Menetelmät MG63-osteosarkoomasolulinjasta saadun HC gp-39:n puhdistus 5 MG63-soluja (ihmisen osteosarkooma ATCC CRL 1427) kasvatettiin solutuottajissa, DMEM/HAM'in F12 -seerumitto-massa kasvatusalustassa. HC gp-39 puhdistettiin viljelmän supernatantista käyttäen hepariiniaffiniteettikromatogra-fiaa ja sitten super dex 75 -kromatografiaa. Puhtaus tar-10 kistettiin SDS-PAGE:11a. Lisäksi, N-terminaalinen amino-happosekvensointi vahvisti, että puhdistettu proteiini oli identtinen Hakala et ai.’in kuvaaman proteiinin kanssa.

HC gp-39:n artritogeenisyys Balb/c-hiirissä 10 tai 50 pg puhdistettua HC gp-39:ää 100 μ1:η ti-15 lavuudessa PBS:ää (0,5 M NaCl, 0,01 M natriumfosfaattipus-kuri, pH 7,5), seostettuna 1:1 ei-täydelliseen Freundin adjuvanttiin (IFA), injektoitiin subkutaanisesti 2x4 Balb/c-naarashiiren rinnan alueeseen (Harlan CPB, Zeist, Alankomaat), kun taas 4 kontrollille injektoitiin PBS:ää 20 (1:1 IFA:ssa). Hiiristä tarkastettiin päivittäin kliinisiä merkkejä artriitista. Artriitin vaikeusaste arvioitiin ·»» V : pisteytämällä kukin käpälä asteikolla 0-3 (Giant et "'‘ϊ ai.'in artikkelin mukaisesti). Lyhyesti, pisteytys 0 = ei ϊ^ϊ muutoksia, pisteytys 1 = eryteemaa ja turvotusta, pistey- 25 tys 2 = turvotusta ja epämuodostumien ilmaantumista, pis- • ·*· teytys 3 = liikkumattomuutta johtuen taivutus- ja ojennus- t·· kyvyn häviämisestä.

Toleranssin indusoiminen HC gp-39:n intranasaali- ·· sella annolla • · * t · 30 Kaksikymmentäkahdeksan pg proteiinia annettiin int- • · *”* ranasaalisesti (2 x 10 pl) 10 Balb/c-naarashiirelle (anes- • · it!§i tetisoitu lievästi Enflurance:lla) käyttäen PT45-mikrojoh- dinta ja Hamilton-ruiskua. Antigeeniä annettiin päivänä ·!· -15, -10 ja -5 ennen artriitin indusoimista. Kontrolleille • · t • · * * ·

• M

• · 26 118472 (n * 10) suoritettiin muuten sama toimenpide, mutta ne saivat vain kantajaa (PBS) (Taulukko 5).

Immunologista toleranssia arvioitiin mittaamalla viivästyneen tyyppisen yliherkkyyden (delayd type hyper-5 sensitivity, DTH) vasteita sen jälkeen, kun oli suoritettu edellä kuvatun mukainen herkistys päivänä 0 käyttäen 10 pg proteiinia. Herkistystä päivänä 0 seurasi 50 pg:n tilavuudessa oleva 10 pg:n HC gp-39 -injektio vasempaan jalkapohjaan päivänä 8 (altistus). DTH-reaktiot mitattiin jalka-10 pohjan suurentumisena ([turpoaminen vasen (mm χ 10'3) - turpoaminen oikea (mm χ 10'3)]/turpoaminen oikea (mm x 10"3)) x 100 %. Jalkapohjan turpoaminen mitattiin 0, 24 ja 48 h altistuksen jälkeen käyttäen omassa talossa suunniteltua pmetriä.

15 Samojen hiirten toleranssia artriitti-induktiolle seurattiin sitten vielä 31 päivään saakka herkistämisestä ja hiiriä tutkittiin päivittäin kliinisten merkkien osalta. Artriitin vaikeusastetta arvioitiin edellä esitetyn mukaisesti.

aaa aaa • a · 4 • • · 4 4 4 * · # aaa • a » » · • ·· a a 4 « I * aaa • I» »M • · · • · a 4 a# a

• M

4

«M

a a • a a·· a a a a a · a a a a a taa a a a a aaa a aaa aaa aaa a a a aaa a aa a a 2? 1 1 8472

Taulukko 5: Kaavio toleranssin tuottamiseksi

-15 28 pg HC gp-39 JSSifSiS PBS

-10 28 pg HC gp-39 säälinen PBS

^ -5 28 pg HC gp-39 säälinen 0 10 pgHC gp-39 ninen 10 pg HC gp-39 nmen 8 10 pgHC gp-39, jalka- 10 pg HC gp-39 ; jalka pohja pohja

9 24 h DTH 24 .h DTH

10 10 48 h DTH 48 h DTH

artriittisten taudin- artriittisten taudin-0-31 merkkien pisteytys merkkien pisteytys DTH = viivästyneen tyyppinen yliherkkyys. PBS = 0,5 M 15 Nacl, 0,01 M natriumfosfaattipuskuri, pH 7,5.

Tulokset HC gp-39:n artritogeenisyys

Yhden, IFA:n kanssa seostetun 50 pg:n HC gp-39 -injektion jälkeen kaikille hiirille kehittyi vähitellen vai-20 kea-asteinen artriitti (Taulukko 6). Artriitin merkkejä havaittiin ensimmäisen kerran päivänä 15 - 20 herkistyk-V * sestä, neljästä eläimestä kolmen etukäpälissä. Hiirelle, ·:·*: jolla ei nähty mitään taudinmerkkejä etukäpälissä, kehit- ; tyi artriitti takakäpäliin päivään 34 mennessä herkistyk- aa* ·’·,· 25 sestä. HC gp-39-indusoidun taudin kululle oli tunnusomais- ♦ · . .·. ta taudin jaksottaisesti ilmenevät uusiutumiset etukäpä- • aa

Iissä tai takakäpälissä ja vähitellen kehittyminen lieväs- "·* * tä artriitista vaikea-asteisempaan artriittiin (taudin .•t etenemistä seurattiin 62 päivän ajan). Erittäin usein • ·· *... 30 (> 50 %) havaittiin sairastuneiden nivelten symmetristä • · *1* jakautumista, mikä tarkoitti, että molemmissa etukäpälissä • · ·.·,· tai molemmissa takakäpälissä näkyi samanaikaisesti art- • aa ·#4,ϊ riittisia taudinmerkkejä.

.···. Saavutettiin vastaavasti artriitin indusoituminen a · · S, . 35 käytettäessä IFA:n kanssa seostettua HC gp-39:ää 10 pg 50 • a! • a 28 118472 pg:n tilalla. Artriittiset pisteet olivat kuitenkin jonkin verran matalammat (tuloksia ei esitetty). Neljästä hiirestä kolmella kehittyi vaikea-asteinen artriitti. Yhdellä hiirellä näkyi kokeen keston aikana vain lieviä taudin-5 merkkejä. Koko kokeen keston ajan kontrollieläimissä ei näkynyt mitään merkkejä artriitista.

Yhteenvetona, sekä 10 että 50 pg proteiinia riitti indusoimaan progressiivisen artriitin Balb/c-hiirissä. HC gp-39:llä indusoidun artriitin krooninen luonne, jolle oli 10 tunnusomaista taudin uusiutumiset sekä nivelten symmetrinen sairastuminen, muistuttaa taudin etenemistä nivelreumassa (RA).

Taulukko 6: Artriitin alkaminen ja eteneminen HC gp-39:llä herkistetyissä Balb/c-hiirissä

Herkistys (n-4) alkaminen Artriitin merkit EK TK ei lain-f- lievä vaikea kaan PBS kontr. - 4 0 0 10 pg HC gp-39 -. 13. 15. 57 32,34.36,43 0 1 3 50 pg HC gp-39 13, 15, 15,48 29,34,34,53 0 0 4 20 EK = etukäpälä. TK = takakäpälä. Kontr. = kontrollit. Artriitin merkit: ei lainkaan: pisteytys = 0; lievä: pistey- • · · V * tys eläintä kohti ei ylitä 2, vaikea: pisteytys eläintä *"*· kohti on > 4.

* !,·.! Immunologinen toleranssi mitattuna DTH-määritykses- 25 sä • t : ;*; Kontrollihiirillä, joille oli injektoitu HC gp-39 • · · ;*$·. päivänä 0, näkyi voimakas, antigeenispesifinen DTH-vaste,

mikä viittaa siihen, että sellulaarinen immuunivaste HC

··, gp-39:lie saatiin herkistyksellä esiin (Taulukko 7). HC

• ·· *... 30 gp-39:n intranasaalinen anto kuitenkin esti DTH-vasteet * ·

"* altistettaessa autoantigeenille, mikä osoittaa, että HC

• · ϊ,ϊ,ϊ gp-39 -spesifiset T-solut oli todellakin tehty toleran- :***: teiksi.

M* #·*.φ Huomattakoon, että ei-tolerantiksi tehdyn ryhmän ‘ . 35 10:stä eläimestä 4:lie kehittyi artriitti altistuskohdan • · · • *· • · 29 118472 vieressä olevaan nilkkaniveleen. Sitä vastoin, tolerantik-si tehdylle ryhmälle ei kehittynyt artriittia altistuskoh-dan läheisyydessä oleviin niveliin, mikä viittaa siihen, että immunologinen toleranssi HC gp-39:lle tuottaa suojan 5 artriitin kehittymistä vastaan.

Taulukko 7: DTH-vasteet HC gp-39:lle nasaalisella annolla tolerantiksi tekemisen jälkeen KäsittelvI Keskimääräinen ί-tur-l Artriitti nilkkani-Kasirtej-y__poaminen___velessä_

Oh 24 h. I 48 h 10 -1,3 31,4 38.6 4/10 -0,05 3,7 1.5 0/9

Toleranssi artriitin indusoituraiselle tai etenemiselle 15 HC gp-39:llä toelranteiksi tehtyjä ja ei-toleran- teiksi tehtyjä Balb/c-hiiriä seurattiin vielä artriitin alkamisen ja etenemisen suhteen.

Kaikissa kontrolli- (ei-toleranteiksi tehdyn) ryhmän hiirissä tauti alkoi heti HC gp-39:llä herkistyksen 20 jälkeen (Taulukko 8). Seitsemälle hiirelle kehittyi vähi-... telien vaikea-asteinen artriitti, kun taas kolmella hii- • i · * , rellä näkyi vain lieviä taudinmerkkejä (korkein pisteytys • •••a 2). Sitä vastoin HC gp-39:llä toleranteiksi tehdyn ryhmän *···* viidellä hiirellä oli suoja taudin kehittymistä vastaan *. *: 25 kokeen keston ajan. Edelleen, tolerantiksi tehdyn ryhmän ·.·.· kahdella eläimellä näkyi vain lieviä taudinmerkkejä lyhyi- ··· ί.ί ϊ den aikajaksojen ajan. Kolmelle eläimelle kehittyi vaikea- asteisempi artriitti pisteytyksellä 4.

•\4 On mielenkiintoista, että toleranteiksi tehdyissä .·**. 30 hiirissä artriitin alkaminen viivästyi sekä taka- että etukäpälissä vähintään vast. 7-9 päivällä (kuvio 1).

* * · ’·*·* Vaikka tolerantiksi tehdyssä ryhmässä sairastui vähemmän ·"** *...* eläimiä, niin etukäpälien artriittinen pisteytys eläintä j*j*. kohti oli verrattavissa ei-toleranteiksi tehtyjen eläinten « .*, j 35 artriittiseen pisteytykseen. Takakäpälien artriittinen • ·* • ♦ 30 118472 pisteytys eläintä kohti oli kuitenkin jonkin verran matalampi tolerantiksi tehdyissä eläimissä (kuvio 1).

Taulukko 8: Artriitin alkaminen ja eteneminen HC gp-39:llä tolerantiksi tehdyissä ja ei-tolerantiksi teh-5 dyissä Balb/c-hiirissä „. ~ Artriitin alkaminen Artriitin merkit

Eiailwet__(Päivä)__ _ - ei lain- lievä vaikea kaan

Kontrollit (n - 10) 13-16 037

Tolerantiksi tehdyt 23-24 523 10 -U. " 10U-——----rr-i

Artriitin alkaminen: ensimmäiset merkit ilmaantuvat - suurin lukumäärä eläimiä sairastunut. Artriitin merkit: ei taudinmerkkejä: pisteytys = 0, lievä: pisteytys eläintä kohti ei ylitä 2, vaikea: pisteytys eläintä kohti on > 4. 15 Edellä esitetyt kokeet osoittavat HC gp-39:n artri- togeenisen luonteen Balb/c-hiirissä. HC gp-39:llä indusoidun taudin luonteelle oli tunnusomaista taudin jaksottaisesti ilmenevät uusiutumiset etukäpälissä ja/tai takakäpä-lissä ja kehittyminen vähitellen lievästä artriitista vai-20 kea-asteisempaan muotoon. Lisäksi havaittiin sairastuneiden nivelten symmetristä jakautumista, mikä yhdessä taudin :1·1: uusiutumishavaintojen kanssa muistutti taudin etenemistä ····· nivelreumassa. HC gp-39:n raju artritogeeninen luonne ha- . .·. vainnollistettiin yhdellä subkutaanisella 10 tai 50 pg:n .·, : 25 proteiini-injektiolla, joka aiheutti artriittisia taudin- • ·« /,·] merkkejä kaikissa eläimissä. Se, että HC gp-39 -spesifiset • · · T-solut todellakin tulevat esiin vasteena HC gp-39 -her- • · · * kistykselle, osoitettiin HC gp-39 -spesifisten DTH-vastei-den induktiolla. Nämä tulokset vahvistettiin vielä osoit- t · i 2 30 tamalla HC qp-39 -spesifiset in vitro -proliferatiiviset ··· “ vasteet eläimissä, joiden jalkapohja oli immunoitu HC gp- ·1.1· 39:llä (tuloksia ei esitetty). On merkittävää, että ei-to- • · .·1·. leranteiksi tehdyissä eläimissä kehittyi artriitti injek- tiokohdan viereiseen nilkkaniveleen, mikä todellakin viit- • · 1 • · · · • · · • · · 2 • · 31 118472 taa HC gp-39 -spesifisten T-solujen mukanaoloon artriitin indusoimisessa.

Peptidiantigeenin intranasaalista antoa on käytetty indusoimaan antigeenispesifinen immuunitoleranssi. Kokeet 5 osoittivat, että HC gp-39:n intranasaalinen anto johtaa immunologiseen ei-vasteentuottoon. Herkistystä seuraavat DTH-vasteet estyivät täysin HC gp-39:llä toleranteiksi tehdyissä hiirissä, kun taas kontrollihiirissä nähtiin an-tigeenispesifistä turvotusta. Nämä havainnot viittaavat 10 siihen, että HC gp-39:n anto johtaa periferaaliseen immuuni toleranssiin .

Ei-toleranteiksi tehdyissä eläimissä kymmenestä hiirestä neljällä DTH-vasteita seurasi artriitti nilkka-nivelessä (altistuskohdan vieressä). Sitä vastoin, HC 15 gp-39:llä toleranteiksi tehtyjen eläinten nilkkanivelet olivat täysin suojattu, mikä viittaa siihen, että auto-reaktiiviset T-solut oli tehokkaasti hiljennetty. Käsitys, että HC gp-39:llä tolerantiksi teko suojaa taudin kehittymiseltä, vahvistui entisestään havainnolla, että toleran-20 tiksi tehdyssä ryhmässä 10:stä eläimestä 5 eläintä sai suojan koko kokeen keston ajaksi. Vaikka ryhmän viiteen *·1 1 muuhun eläimeen kehittyi lopulta kliinisiä taudinmerkkejä, *·2· artriitin alkaminen viivästyi merkittävästi. Siten voidaan päätellä, että HC gp-39 -spesifiset T-solut ovat mukana i/·· 25 artritogeenisessa prosessissa ja, mikä on vielä tärkeäm- : pää, tekemällä nämä T-solut toleranteiksi keksinnön mukai- ··· :1·1: sella farmaseuttisella koostumuksella voidaan viivästyttää tai suppressoida artriitin kehittymistä.

»· • · • e· ··· • · « · • «a « · » · 1 • I · • · · · • · « · «·· a ·«· • m · « a · • · • · # • ·· 2 • · 32 1 1 8472

Sekvenssi1ista (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: 5 (A) NAME: AKZO NOBEL N.V.

(B) STREET: Velperweg 76 (C) CITY: Arnhem (E) COUNTRY: The Netherlands

(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM

(G) TELEPHONE: 0412-666376 (H) TELEFAX: 0412-650592 10 (I) TELEX: 37503 akpha nl (ii) TITLE OF INVENTION: Novel Peptides derived from autoantigen for use in Immunotherapy of Autoimmune Diseases (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 9 15 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: 0 '· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ,.,.ϊ (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: amino acid : (C) STRANDEDNESS: single 25 (D) TOPOLOGY: linear • · * t · : (ii) MOLECULE TYPE: peptide t·· ·«· • m · • · • ..4 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: ϊ *** 30 .***. Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser T 1 5 • · • · · *:.V (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: • · • * »·· /.,m (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: V : 35 (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: amino acid '* " (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 33 1 1 8472 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: 5

Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 15 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

Tyr Asp Asp Gin Glu Ser Val Lys Ser 1 5 2Q (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: amino acid : (C) STRANDEDNESS: single . (D) TOPOLOGY: linear «·· :. .I 25 (ii) MOLECULE TYPE: peptide • · · • · · ·*» ··· • · · • t (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4: ·*·.. Phe Ser Lys lie Ala Ser Asn Thr Gin 30 1 5 t · * · ··« ,/.. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: • · · • (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ”* (A) LENGTH: 13 amino acids :T: (B) TYPE: amino acid .1,. 35 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 34 1 1 8472 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu 15 10 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (li) MOLECULE TYPE: peptide (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6: je Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids 2q (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ··· • · 9 ‘*‘1 (ii) MOLECULE TYPE: peptide • · •

• t I

• t · ···

• · 9 R

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: • ·*· *·*·’ Val Gly Tyr Asp Asp Gin Glu Ser Val Lys Ser Lys Val :T: 1 5 io (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: M • · 30 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *...* (A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: amino acid •\v (C) STRANDEDNESS: single ;···. (D) TOPOLOGY: linear

• •I

•T; (ii) MOLECULE TYPE: peptide • 35 • * • I « * ·· * · 35 1 1 8472 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:

Ser Gin Arg Phe Ser Lys lie Ala Ser Asn Thr Gin Ser Arg 15 10 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids IQ (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 15 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

Pro Lys Phe Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 M1 • 1 · • · · • · 9 • · 1 • · ♦ I·· f · • · · • · 1 • · • · · • « · *·« • · 1 • · · ·· • · • ·# • · • « ··· Φ · • » · f I t • 1 ··· • · • · « · » ·««

• · I

• · 1 · • · · • ·· • ·

Claims (16)

36 118472

1. Peptidi, joka sisältää alasekvenssin HC gp-39:stä, jolloin peptidi sisältää yhden tai useamman amino- 5 happosekvensseistä: FGRSFTLAS (SEQ ID No. 1), FTLASSETG (SEQ ID No. 2), YDDQESVKS (SEQ ID No. 3) ja FSKIASNTQ (SEQ ID No. 4).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että peptidi sisältää yhden tai useamman 10 aminohapposekvensseistä: PTFGRSFTLASSE (SEQ ID No. 5) , RSFTLASSETGVG (SEQ ID No. 6), VGYDDQESVKSKV (SEQ ID No. 7) ja SQRFSKIASNTQSR (SEQ ID No. 8).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että peptidillä on aminohapposekvenssi

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että peptidillä on aminohapposekvenssi RSFTLASSETGVG (SEQ ID No. 6).

5 HC gp-39 -autoantigeenille potilaissa, jotka sairastavat artriittia, erityisesti nivelreumaa.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi, 20 tunnettu siitä, että peptidillä on aminohapposekvenssi VGYDDQESVKSKV (SEQ ID No. 7). ··· V

' 6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi, "**! tunnettu siitä, että peptidillä on aminohapposekvenssi : sqrfskiasntqsr (seq id no. 8). ··· •\j 25

7. HC gp-39 -proteiini tai jonkin patenttivaati- • · . .·, muksen 1-6 mukaiset peptidit käytettäväksi terapeuttise- .···. na aineena. • ·

8. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää HC gp- „ 39 -proteiinia tai yhtä tai useampaa peptidiä, joka on • · 30 jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen, sekä farma- • · *···* seuttisesti hyväksyttävää kantajaa. ϊΥ;

9. HC gp-39 -proteiinin tai yhden tai useamman ·**·. peptidin, joka on jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukai- ··· nen, käyttö farmaseuttisen valmisteen valmistamiseksi, jo- • · · *·* 35 ka on tarkoitettu indusoimaan spesifinen T-solutoleranssi * · · *· *! HC gp-39 -autoantigeenille potilaissa, joilla esiintyy T-soluvälitteistä ruston tuhoutumista. 37 118472

10. HC gp-39 -proteiinin tai yhden tai useamman peptidin, joka on jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen, käyttö farmaseuttisen valmisteen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu indusoimaan spesifinen T-solutoleranssi

11. HC gp-39 -proteiini tai yksi tai useampi peptidi, joka on jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen, käytettäväksi menetelmässä, jossa indusoidaan kliinisen 10 artriitti ei-ihmisnisäkkääseen, erityisesti hiireen.

12. Patenttivaatimuksien 1-6 mukaiset peptidit käytettäväksi diagnostisena aineena.

13. Diagnostinen koostumus, joka sisältää yhtä tai useampaa peptidiä, joka on jonkin patenttivaatimuksen 1 - 15. mukainen, sekä toteamisainetta.

14. Diagnostinen menetelmä aktivoituneiden autore-aktiivisten T-solujen toteamiseksi, jolloin menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: (a) periferaalisten veren mononukleaarisolujen 20 (PBMC) eristys yksilön verinäytteestä, (b) mainitun PBMC:n kasvatus sopivissa olosuhteis- ··· • · · ·.· * sa, *"*J (c) mainitun PBMC-viljelmän inkubointi HC gp-39:n, : sen fragmenttien ja/tai yhden tai useamman peptidin, joka • · 25 on jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen, läsnä olles- • · . .*. sa, ja • · · • * · .···. (d) T-solujen vasteen toteaminen, joka viittaa ak- • · · tivoituneiden autoreaktiivisten T-solujen esiintymiseen .. yksilössä. • · : ** 30 15. Testipakkaus aktivoituneiden autoreaktiviisten • · · ** • * *···* T-solujen toteamiseksi, tunnettu siitä, että testipak- :V: kaus sisältää HC gp-39:ää tai yhtä tai useampaa peptidiä, • ♦ .***. joka on jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen. ·»·

15 PTFGRSFTLASSE (SEQ ID No. 5).

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen pep- • · ♦ *·* 35 tidi, tunnettu siitä, että peptidillä on 9 - 55 amino- • ♦ · *· " happotähteen aminohapposekvenssi. 1 1 8472 38