HK40009319B - B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

Description

B7-H3抗体、其抗原结合片段及其医药用途

技术领域

本发明涉及B7-H3抗体或其抗原结合片段，进一步地，本发明涉及包含所述B7-H3抗体CDR区的完全人源抗体，本发明还涉及包含所述B7-H3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为B7-H3相关疾病诊断剂和治疗药物的用途。

背景技术

T细胞介导的免疫反应在机体抗肿瘤过程中发挥着极其重要的作用，而T细胞的活化和增殖不仅需要TCR识别的抗原信号，还需要共刺激分子提供的第二信号。B7家族分子属于共刺激分子免疫球蛋白超家族，越来越多的研究表明，该家族分子在机体正常免疫功能和病理状态下均发挥了重要的调节作用。

B7-H3是B7家族的成员之一，属于I型跨膜蛋白，包含氨基端的一个信号肽，一个细胞外的免疫球蛋白样可变区(IgV)和恒定区(IgC)、一个跨膜区和一个含有45个氨基酸的胞质尾区(Tissue Antigens.2007 Aug；70(2)：96-104)。目前，B7-H3主要存在2种剪切体，B7-H3a和B7-H3b。B7-H3a胞外段由IgV-IgC 2个免疫球蛋白结构域组成，又称为2IgB7-H3，而B7-H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC 4个免疫球蛋白结构域组成，又称为4IgB7-H3。

B7-H3蛋白质在正常组织、细胞中不表达或极低表达，却高表达于多种肿瘤组织，并与肿瘤的进展、患者的生存及预后密切相关。临床上已经报道，B7-H3在许多癌症类型中、特别是在非小细胞肺癌、肾癌、泌尿道上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中过表达(Lung Cancer.2009 Nov；66(2)：245-249；Clin CancerRes.2008 Aug 15；14(16)：5150-5157)。此外，也有文献报道，在前列腺癌中，B7-H3的表达强度与临床病理学恶性(诸如肿瘤体积、前列腺外侵袭或Gleason评分)正相关，且也与癌症进展相关(Cancer Res.2007 Aug 15；67(16)：7893-7900)。类似地，在多形性胶质母细胞瘤中，B7-H3的表达与无事件存活负相关，且在胰腺癌中，B7-H3的表达与淋巴结转移和病理学进展相关。因此，B7-H3被认为是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点

目前，已有针对B7-H3靶点的治疗策略用于临床前研究，如靶向小鼠B7-H3的抗体会增强瘤内的浸润性的CD8阳性的T细胞和抑制肿瘤生长(Mod Pathol.2010 Aug；23(8)：1104-1112)。此外，WO 2008/066691专利显示，识别B7-H3变体B7-H3a的抗体会对腺癌表现出体内抗肿瘤作用。在临床研究中，一种鼠源的B7-H3抗体与放射性I¹³¹的偶联药物可显著抑制患者成神经母细胞瘤的生长[J Neufooocol 97(3)：409-l 8(2010)]。但目前在研的B7H3抗体都是鼠源抗体经人源化改造的人源化抗体，而人源化抗体在免疫时存在的免疫原性比不含鼠源抗体成分的全人源抗体要高，在人体应用时是一个不利的因素。

噬菌体展示技术(phage display technology)是将外源蛋白质或多肽与噬菌体外壳蛋白融合表达，从而将外源蛋白表达在噬菌体的表面。噬菌体抗体库是将噬菌体展示技术、PCR扩增技术、蛋白表达技术相结合的一项运用综合技术手段所建立起来的抗体库。

噬菌体抗体库最大的优点是不经体内免疫，模拟体内抗体生成的三个过程而制备出完全人源抗体。除此之外，噬菌体抗体库还具有以下优势：①实现了基因型与表型的统一。此外，实验方法简单、快速，传统的通过杂交瘤技术抗体产生方法需历经数月，而抗体库技术只需短短几周的时间。②表达的是完全人源抗体，且分子量小，主要以活性片段Fab、scFV的形式表达，与完整抗体相比在组织穿透力方面都有明显优势。③筛选容量大，杂交瘤技术是在上千个克隆内筛选，抗体库技术可以对百万甚至亿万个分子选择。筛选到的抗体种类更多。④用途广泛，采用了原核表达系统，当大规模生产时优势更加明显(Curr OpinBiotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602；Immunotechnology，2013，48(13)48(13)：63-73)。

目前，已有WO2008100934、WO2010096734、WO2012147713、WO2015181267、WO2016044383等专利报道了B7-H3的抗体，绝大多数都是鼠源抗体或人源化抗体，但就国内外而言，大多数处于临床I期和发现阶段，还没有靶向B7-H3的抗体药物上市，因此，有必要进一步开发具有更高活性、高亲和力和高稳定性的B7-H3全人源抗体，以进行相关疾病的治疗研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供与B7-H3的胞外区的氨基酸序列或三维结构结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。此外，本发明的目的是通过筛选与所述单克隆抗体或其抗体片段竞争的高活性和高稳定性的抗人B7-H3全人源抗体。

此外，本发明将提供编码所述抗体的DNA，包含所述DNA的载体，通过转化所述载体而获得的转化体，使用所述转化体生产抗体或其抗体片段的方法，以及使用所述抗体或其抗体片段作为活性成分的诊断剂或治疗剂。

一方面，本发明提供一种B7-H3抗体或其抗原结合片段，其与人B7-H3结合，所述B7-H3抗体或其抗原结合片段是选自下面(i)至(ii)中任一种单克隆抗体或其抗原结合片段：

(i)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含1个或多个选自以下的CDR区序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：

抗体重链可变区HCDR区序列：如SEQ ID NO：10、11和12氨基酸序列所示；和抗体轻链可变区LCDR区序列：如SEQ ID NO：13、14和15氨基酸序列所示；

(ii)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含1个或多个选自以下的CDR区序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：

抗体重链可变区HCDR区序列：如SEQ ID NO：16、17和18氨基酸序列所示；和抗体轻链可变区LCDR区序列：如SEQ ID NO：19、20和21氨基酸序列所示。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是重组抗体。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源的重组抗体或其抗原结合片段。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源的重组抗体的轻链和重链可变区上的轻链和重链FR区序列分别来源于人种系的轻链和重链序列或其突变序列。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源的重组抗体含有SEQ ID NO：6或8所示的重链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO：6或8所示的重链可变区序列上具有1-10个氨基酸替换。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源的重组抗体含有SEQ ID NO：7或9所示的轻链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO：7或9所示的轻链可变区序列上具有1-10个氨基酸替换。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的B7-H3抗体进一步包括人抗体恒定区，优选所述的B7-H3抗体是分别由SEQ ID NO：22和23所示的重链和轻链序列组成的全长抗体，或分别由SEQ ID NO：22和26所示的重链和轻链序列组成的全长抗体，或分别由SEQ ID NO：24和25所示的重链和轻链序列组成的全长抗体。

在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。

另一方面，本发明提供了一种分离的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其特征在于与前述B7-H3抗体或其抗原结合片段竞争结合人B7-H3。

本发明还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明还提供一种核酸分子，其编码本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种重组载体，其包含上述的核酸分子。

本发明还提供一种根据上述重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞或酵母细胞。

本发明还提供一种根据用于生产本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将上述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，以及从培养物中回收所积累的抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种用于免疫检测或测定B7-H3的方法，所述方法包括使用本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种用于检测或测定B7-H3的试剂，所述试剂包含本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种与B7-H3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，所述诊断剂包含本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种用于诊断与B7-H3阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段检测或测定B7-H3或B7-H3阳性细胞。

另一方面，本发明还提供一种本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段在制备与B7-H3阳性细胞相关的疾病的诊断剂中的用途。

在另一方面，本发明还提供一种与B7-H3阳性细胞相关的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含本发明所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，或包含上述药物组合物，或包含上述核酸分子。

本发明还提供一种与B7-H3阳性细胞相关的疾病的治疗方法，所述方法包括使用本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或包含上述药物组合物，或上述核酸分子诱导B7-H3阳性细胞的细胞死亡。

在另一方面，本发明还提供本发明所述抗体或其抗原结合片段，或包含本发明所述的药物组合物，或本发明所述的核酸分子在制备与B7-H3阳性细胞相关的疾病的治疗剂中的用途。

附图说明

图1：不同抗体与人2Ig-B7-H3抗原的结合力；

图2：不同抗体与人4Ig-B7-H3抗原的结合力；

图3：不同抗体与鼠B7-H3抗原的交叉结合力；

图4：不同抗体与U87MG细胞的结合力；

图5：不同抗体在U87MG细胞上的内吞效果。

具体实施方式

一.术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。

术语“人抗体”与“人源抗体”可以互换使用，是指有一或多个可变区和恒定区来源于人免疫球蛋白序列。其中一个优选的方式是所有的可变区和恒定区均来自于人免疫球蛋白序列，即“完全人源抗体”或“全人抗体”。这些抗体可以通过多种方式制备获得，包括通过噬菌体展示技术，从人PBMC、脾脏、淋巴结组织分离B细胞，构建天然单链噬菌体人抗体库，或者通过免疫可表达人抗体轻重链的转基因小鼠，筛选获得的抗体。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人B7-H3的单克隆抗体。制备时用B7-H3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源B7-H3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的B7-H3嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的B7-H3嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。

CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的B7-H3抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人B7-H3抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。

术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，B7-H3)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

本发明的抗原结合片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含CDR的肽等。

Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

本发明的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。

F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。

本发明的F(ab′)2可以通过用胃蛋白酶处理本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab′来生产所述F(ab′)2。

Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本发明的特异性识别B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab′)2来生产。

此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

本发明的scFv可以通过以下步骤来生产：获得本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。

双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。

本发明的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。

dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。

本发明的dsFv可以通过以下步骤来生产：获得获得本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。

包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。

本发明的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产：构建本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。

本文中使用的术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，B7-H3分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合B7-H3，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。

术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别人B7-H3的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述表位结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的人B7-H3的氨基酸序列的抗体。

本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人B7-H3或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人B7-H3特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。

“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

此外，本发明涉及用于免疫检测或测定B7-H3的方法、用于免疫检测或测定B7-H3的试剂、用于免疫检测或测定表达B7-H3的细胞的方法和用于诊断与B7-H3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本发明的特异性识别人B7-H3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。

在本发明中，用于检测或测定B7-H3的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。

免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。

上述与B7-H3阳性细胞相关的疾病可以通过用本发明的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达B7-H3的细胞来诊断。

为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。

在本发明中，对用于检测或测定B7-H3的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达B7-H3的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。

根据所需的诊断方法，含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。

本发明还涉及治疗人B7-H3阳性细胞相关的疾病的方法，特别是在治疗癌症和炎症中的用途。

二.实施例与测试例

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1.B7-H3抗原及检测用蛋白的制备

B7-H3抗原设计

以SEQ ID NO：1所示人B7-H3作为本发明B7-H3的模板，设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列。以下B7-H3抗原未特殊说明的均指人B7-H3。

人B7-H3全长蛋白：B7-H3(SEQ ID NO：1)：

注释：

双横线部分为信号肽(Signal peptide：1-28)；

划横线部分为B7-H3胞外区(Extracellular domain：29-466)，其中29-139为Ig-like V-type 1 Domain，145-238为Ig-like C2-type 1 Domain；243-357为Ig-like V-type 2 Domain，363-456为Ig-like C2-type 2 Domain；

点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain：467-487)；

斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain：488-534)。

鼠B7-H3全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

注释：

双横线部分为信号肽(Signal peptide：1-28)；

划横线部分为B7-H3胞外区(Extracellular domain：29-248)，其中29-139为Ig-like V-type Domain，145-238为Ig-like C2-type Domain；

点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain：249-269)；

斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain：270-316)。

筛选及检测用人B7-H3抗原(SEQ ID NO：3)为商业化产品(R&D cat#1949-B3-050/CF，简称2Ig-B7-H3)，序列如下：

注释：划横线部分为B7-H3胞外区；斜体部分为His-tag标记。

检测用人B7-H3抗原(SEQ ID NO：4)为商业化产品(SinoBiological cat#11188-H08H，简称4Ig-B7-H3)，序列如下：

注释：划横线部分为B7-H3胞外区；斜体部分为His-tag标记。

筛选及检测用鼠B7-H3抗原(SEQ ID NO：5)为商业化产品(R&D cat#1397-B3-050/CF)，序列如下：

注释：划横线部分为B7-H3胞外区；斜体部分为His-tag标记。

实施例2.特异性结合人B7-H3的阳性序列的筛选

利用人PBMC、脾脏、淋巴结组织分离B细胞，并提取RNA，构建天然单链噬菌体抗体库(库容3.2×10¹⁰)。将构建的天然单链噬菌体抗体文库经过包装形成噬菌体颗粒后，采用液相法进行淘筛，噬菌体与生物素化的B7-H3液相结合，再采用链霉亲和素磁珠分离。为了获得与人B7-H3(R&D cat#1949-B3-050/CF)结合的阳性序列，采用生物素化的人B7-H3进行淘筛，挑取500个单克隆菌落包装成噬菌体单链抗体，用于噬菌体ELISA测试。分别测试单克隆噬菌体与人B7-H3(R&D cat#1949-B3-050/CF)和鼠B7-H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)的结合活性：ELISA板上分别包被1μg/ml人B7-H3或鼠B7-H3以及1％BSA，加入1∶1 blockingbuffer稀释的噬菌体上清，最后用anti-M13 HRP检测；将ELISA测试到的OD450值大于0.5，以及结合人和鼠B7-H3的ELISA OD450值除以结合1％BSA的ELISA OD450值的两个比值均大于2.0的克隆进行测序，得到9个特异性序列。

实施例3.完整单克隆抗体的构建

噬菌体库筛选得到的9个特异性序列构建完整抗体后通过ELISA结合实验确定其中2个抗体结合力强，分别是h1702和h1703。对其完整单克隆抗体构建的过程如下：

根据测序得到的单链抗体序列，设计引物PCR搭建各单链抗体序列的VH/VK/VL基因片段。获得h1702和h1703的重轻链可变区。

>h1702重链可变区序列

>h1702轻链可变区序列

>h1703重链可变区序列

>h1703轻链可变区序列

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。

其中各抗体轻重链中CDR序列如表1所示。

表1各重链及轻链CDR区序列

抗体可变区再与恒定区基因(CH1-FC/CL)片段进行同源重组，构建完整抗体VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL。

构建的完整抗体h1702-IgG1、h1703-IgG1序列如下：

h1702-IgG1：

h1702-IgG1重链氨基酸序列：(SEQ ID NO：22)

h1702轻链氨基酸序列：Lamada(SEQ ID NO：23)

h1703-IgG1：

h1703-IgG1重链氨基酸序列：(SEQ ID NO：24)

h1703轻链氨基酸序列：Kappa(SEQ ID NO：25)

为进一步提高抗体的稳定性，对h1702的轻链序列进行氨基酸突变，具体突变为轻链N端第一个氨基酸残基Q替代为D，缺失突变C端第一个氨基酸残基S，以获得更加稳定和均一的单克隆抗体。

突变修饰后的h1702-1的轻链氨基酸序列：(SEQ ID NO：26)

实施例4.全人抗体的表达与纯化

分别表达抗体轻重链的质粒以1.5∶1的比例转染HEK293E细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。

以下用测试方法验证本发明抗体性能及有益效果。

测试例1.ELISA结合实验

为检测筛选到的B7-H3抗体对于人不同形式B7-H3的体外结合能力，人2Ig-B7-H3(Cat.#1949-B3-050/CF，R&D)和人4Ig-B7-H3(Cat.#11188-H08H，Sino Biological)被用于进行体外结合检测。

用pH7.4的PBS(Sigma，P4417-100TAB)缓冲液将人B7-H3蛋白(2Ig/4Ig)稀释至1μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，加入用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％Tween-20)稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液120μl/孔，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次后，加入100μl/孔初始浓度为1μM的相应B7-H3抗体，用PBST缓冲液倍比稀释8个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板4次，加入100μl/孔用PBST稀释(1∶4000)的HRP标记的羊抗人IgG(GoatAnti-Human IgG)Fcγ片段特异性的二抗(Jackson Immuno Research，109-005-008)，37℃孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育3-5min，加入100μl/孔1M H₂SO₄终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合EC50值，结果见表2和图1、图2。

表2.不同抗体与人2Ig-B7-H3及4Ig-B7-H3抗原的结合力

EC50	人2Ig-B7-H3(nM)	人4Ig-B7-H3(nM)
			h1702	0.11	0.16
h1703	10.28	2.10

结果表明，h1702和h1703与人2Ig-B7-H3和4Ig-B7-H3都有明显的结合，其中h1702的结合力更强。

测试例2.与不同种属B7-H3的交叉结合实验

为检测筛选到的B7-H3抗体对于不同种属来源的B7-H3的体外结合能力，小鼠B7-H3(Cat.#1397-B3-050/CF，R&D)被用于进行体外结合检测。

用pH7.4的PBS(Sigma，P4417-100TAB)缓冲液将不同种属B7-H3蛋白(mouse B7-H3)稀释至1μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，加入用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05％Tween-20)稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液120μl/孔，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次后，加入100μl/孔初始浓度为1μM的相应B7-H3抗体，用PBST缓冲液倍比稀释8个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板4次，加入100μl/孔用PBST稀释(1∶4000)的HRP标记的GoatAnti-Human IgG，Fcγfragment specific的二抗(Jackson Immuno Research，109-005-008)，37℃孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育3-5min，加入100μl/孔1M H₂SO₄终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合EC50值(结果见表3和图3)。

表3.不同抗体与鼠B7-H3抗原的结合力

EC50	鼠B7-H3(nM)
		h1702	18.12
h1703	86.68

结果显示，h1702和h1703与鼠B7-H3结合力相对较弱，显示出两个单克隆抗体特异性结合人B7-H3。

测试例3.Biacore抗体亲和力实验

用Biacore，GE仪器测定抗B7-H3抗体和人、鼠B7-H3的反应亲和力。

用生物传感芯片Protein A(Cat.#29127556，GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的人2Ig-B7-H3抗原(Cat.#1949-B3-050/CF，R&D)、人4Ig-B7-H3抗原(Cat.#11188-H08H，Sino Biological)或鼠B7-H3抗原(Cat.#1397-B3-050/CF，R&D)，利用Biacore仪器(Biacore T200，GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5)(Cat.#BR-1003-54，GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲液为HBS-EP缓冲溶液(pH 7.4)(Cat.#BR-1001-88，GE)。

实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，从而得出亲和力数值。实验结果见表4-6。

表4.不同抗体与人2Ig-B7-H3抗原的反应亲和力

表5.不同抗体与人4Ig-B7-H3抗原的反应亲和力

表6.不同抗体与鼠B7-H3抗原的反应亲和力

Biacore亲和力测试结果表明，h1702与人4Ig-B7-H3的亲和力较强，达到nM水平，而与人2Ig-B7-H3和鼠B7-H3的亲和力相对较弱，h1703与人4Ig-B7-H3，人2Ig-B7-H3，和鼠B7-H3的亲和力都较弱。

测试例4.体外细胞结合实验

本实验通过检测细胞表面抗体的荧光信号，根据荧光信号强弱来评价抗体的结合。将10μg一抗与2×10⁵个U87MG细胞在冰上孵育30分钟后洗掉多余的抗体。将细胞与APCanti-human IgG Fc(Biolegend，409306)在室温孵育30分钟，洗掉多余抗体后使用BDVerse读取细胞表面的荧光信号(结果见图4)。结果表明h1702能与B7-H3过表达的肿瘤细胞系U87MG特异结合。

测试例5.体外细胞内吞实验

本实验通过检测细胞内抗体的荧光信号，根据荧光信号强弱来评价抗体的內吞效果。将B7-H3抗体和APC anti-human IgG Fc(Biolegend，409306)以1∶2的摩尔比例混合在冰上孵育15分钟。将抗体混合物与2×10⁵个U87MG细胞在冰上孵育30分钟后洗掉多余的抗体，然后将细胞转入预温37℃的培养基中，在37℃分别孵育0，15，30，60和120分钟。离心细胞并将细胞重悬在抗体洗脱液中室温孵育7分钟，洗掉抗体洗脱液，使用BD Verse读取细胞内荧光信号(结果见图5)。结果表明h1702和h1703与U87MG细胞系结合后，都能有效地被内吞入细胞。

测试例6.SD大鼠T1/2评价

SD大鼠4只(购自杰思捷实验动物有限公司)，雌雄各半，12/12小时光/暗调节，温度24±3℃恒温，湿度50-60％，自由进食饮水。实验当天对SD大鼠分别尾静脉注射受试药物，给药剂量为3mg/kg，注射体积5ml/kg。

取血时间点为：第1天给药后5min、8h、24h(第2天)，第3天，第5天，第8天，第11天，第15天，于大鼠眼底静脉取血，每次200μL(相当于取血清100μL)；收集的血样在室温下置放半小时至凝集，然后4℃下10000×g离心10分钟。收集上清，立即放置-80℃贮存。用ELISA检测血清中的B7-H3抗体浓度，进行PK分析，结果见表7。

表7.B7-H3抗体在SD大鼠中的T_1/2

结果表明，本发明在大鼠体内的半衰期约为185h(7.7天)。

测试例7.B7-H3抗体的物理稳定性

利用DSC检测不同抗体的热稳定性，比较了不同的缓冲体系不同pH条件下的热稳定性情况，不同pH对应的示例性缓冲体系如10mM PB(pH7)，10mM Acetate(pH5.2)。将样品置换到对应缓冲液中，控制样品浓度在1mg/ml左右，利用MicroCal*VP-Capillary DSC(Malvern)进行检测。检测前，将各个样品及空白buffer用真空脱气器脱气1～2min。样品板每个孔加入400μl样品或空白缓冲液(仪器上样量为300μl)。最后两对孔板分别加入14％Decon 90和ddH2O，以备清洗用，样品板加样完毕后，套上塑料软盖板。扫描温度从25℃开始到100℃结束，扫描速率60℃/h。具体结果如表8所示，在几个测试体系中h1702、h1703均表现了较好的热稳定性。

表8.不同抗体的DSC实验结果

通过SEC-HPLC监测样品纯度考察一定浓度条件下稳定性，示例性的条件比如将样品浓度控制在约40-50mg/ml，在PBS(pH7.4)体系及pH5.2醋酸/蔗糖体系中比较不同抗体在4℃、30℃、40℃保存一个月的稳定性情况。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC柱子检测抗体纯度，通过一个月的考察，h1702、h1703均表现了良好的稳定性，结果如表9所示。

表9.不同抗体的稳定性结果

样品	4℃/月/纯度	30℃/月/纯度	40℃/月/纯度
				h1702/醋酸	99.25％	98.68％	97.85％
h1702/PBS	99.21％	98.07％	96.34％
				h1703/醋酸	99.31％	99.04％	98.38％
h1703/PBS	99.18％	98.56％	96.99％

结果显示，h1702和h1703在醋酸和PBS缓冲液中均显示出优异的稳定性。

测试例8.B7-H3抗体的化学稳定性

抗体制备后化学修饰是导致产品稳定性的常见问题之一，尤其是CDR区域的部分氨基酸高度脱酰胺、氧化或者异构化修饰一般选择尽量避免或者突变降低。取500μg待测抗体溶于500μl pH 7.4的PBS中，40℃水浴；分别于0、10、20天取样，用于酶解实验。将100μg不同时间点取样的样品溶于100μl 0.2M His-HCl，8M Gua-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小时，后用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超滤两次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)，37℃水浴酶解过夜。Agilent 6530 Q-TOF进行LC-MS检测分析，对潜在的修饰位点进行质谱分析(结果见表10)，结果显示本发明中涉及的h1702、h1703均无明显的脱酰胺、氧化或者异构化加剧趋势，提示分子优异的化学稳定性。

表10.不同抗体的化学稳定性

测试例9.h1702-1抗体的稳定性

由于抗体轻链为lambda型时，在C端比kappa型轻链多出一个氨基酸S，其空间位阻可能是导致轻重链间二硫键不稳定的因素。可以通过分子克隆的方法敲除末端S氨基酸，显著提高碱性条件该抗体的稳定性。

当裸抗轻链N端第一个氨基酸为Q时，在该抗体中也会存在部分环化的现象，部分环化导致样品电荷异质性增加，对处方及产品的稳定性均会产生影响。通过分子克隆的方法将N端第一个氨基酸Q突变为D，可消除环化不完全的情况，显著提高抗体稳定性。而上述改造未显著影响改造后的抗体与抗原的亲和能力。

通过SEC、非还原CE-SDS分析检测方法(pH 9.0)和IEX分析检测方法，对h1702和h1702-1进行稳定性检测。

SEC检测：使用Waters e2695色谱仪，Xbridge BEH 200A SEC色谱柱，上样50μg抗体，PBS流动相等度洗脱。

CE-SDS NR方法：

使用Beckman SDS-MW Analysis Kit试剂盒处理样品。100μg蛋白中加入缓冲液，加热变性。使用PA800毛细管电泳仪采集数据。

IEX方法：

使用Waters Acquity H-Class色谱仪，Thermo MAbPac SCX-10色谱柱，CX-1 pHGradient Buffer Kit作为流动相，上样50μg抗体，线性梯度，采集280nm波长的紫外信号。

表11 h1702和h1702-1稳定性比较

	SEC	CE-SDS(pH9.0)	IEX
				h1702	100％	71.21％	40.5％
h1702-1	100％	94.67％	86.21％

虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

Claims (19)

1.一种B7-H3抗体或其抗原结合片段，其与人B7-H3结合，所述B7-H3抗体或其抗原结合片段是选自下面(i)至(ii)中任一种单克隆抗体或其抗原结合片段：

(i)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ IDNO：13、14和15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(ii)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

2.如权利要求1所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是重组抗体。

3.如权利要求2所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源的重组抗体。

4.如权利要求3所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源的重组抗体的轻链和重链可变区上的轻链和重链FR区序列分别来源于人种系的轻链和重链序列。

5.如权利要求4所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源的重组抗体含有SEQ ID NO:6或8所示的重链可变区。

6.如权利要求4所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源的重组抗体含有SEQ ID NO:7或9所示的轻链可变区。

7.如权利要求1-6中任一项所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的B7-H3抗体进一步包括人抗体恒定区。

8.如权利要求7中所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述的B7-H3抗体是分别由SEQ ID NO:22和23所示的重链和轻链序列组成的全长抗体，或分别由SEQ ID NO:22和26所示的重链和轻链序列组成的全长抗体，或分别由SEQ ID NO:24和25所示的重链和轻链序列组成的全长抗体。

9.如权利要求1-6中任一项所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体、二聚化的V区、二硫键稳定化的V区和包含CDR的肽的抗原结合片段。

10.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至9任一项所述的B7-H3抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

11.核酸分子，其编码权利要求1至9任一项的抗体或其抗原结合片段。

12.重组载体，其包含权利要求11的核酸分子。

13.一种用根据权利要求12所述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。

14.如权利要求13所述的宿主细胞，其为哺乳动物细胞或酵母细胞。

15.用于生产权利要求1至9任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将权利要求13或14中所述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累权利要求1至9任一项的B7-H3抗体或其抗原结合片段，以及从培养物中回收所积累的抗体或其抗原结合片段。

16.用于检测或测定人B7-H3的试剂，所述试剂包含权利要求1至9任一项的B7-H3抗体或其抗原结合片段。

17.与人B7-H3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，所述诊断剂包含权利要求1至9任一项的B7-H3抗体或其抗原结合片段。

18.与B7-H3阳性细胞相关的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含权利要求1至9任一项的B7-H3抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求10所述的药物组合物，或包含权利要求11所述的核酸分子。

19.根据权利要求1至9任一项的B7-H3抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求10所述的药物组合物、或权利要求11所述的核酸分子在制备用于治疗与B7-H3阳性细胞相关的疾病药物中的用途。