HU220345B

HU220345B - Eljárás interleukin-5-receptorfüggő, celluláris jelátvivő útra moduláló hatással rendelkező anyagok kiszűrésére

Info

Publication number: HU220345B
Application number: HU9503363A
Authority: HU
Inventors: Armin Peter Czernilofsky; Ulrike Weyer; Ian G. Young
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh.
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2001-12-28
Also published as: NO954781D0; DK0701628T3; EP0701628A1; NZ291131A; KR100318188B1; WO1994028170A1; EP0701628B1; AU6997794A; RU2139936C1; US5922549A; CA2163549A1; AU691816B2; ATE162555T1; DE4317577A1; HUT73742A; CN1125467A; HU9503363D0; KR960702532A; ES2113109T3; FI955700L

Abstract

A találmány farmakológiailag hatásos anyagok kiszűrésére alkalmaseljárásra vonatkozik. Az eljárás interleukin– 5 receptorfüggőjelátvivő utat moduláló hatással rendelkező anyagoknak emberi vagyállati sejtekben való meghatározásán alapul, amikor is az anyagnak azIL–5 receptor aktiválása által kiváltott jelátvivő út egyalkotórészére kifejtett moduláló hatását határozzák meg. ŕ

Description

A találmány farmakológiailag hatásos anyagok felkutatására alkalmas eljárásra vonatkozik. Az eljárás interleukin-5 receptorfiiggó jelátvivő utat moduláló hatással rendelkező anyagoknak emberi vagy állati sejtekben való meghatározásán alapul.

A jelenlegi, úgynevezett „radioligand teszt”-ek, amelyekben egy anyagot arra vizsgálnak, hogy mennyire képes egy receptorhoz kötött ligandumot kiszorítani, és amelyeket farmakológiailag hatásos anyagok felkutatására alkalmaznak, csak olyan anyagok azonosítását teszik lehetővé, amelyek ismert ligandumoknak receptorkötő helyekhez való kötődését befolyásolják. Ezek a vizsgálatok nem tudják megkülönböztetni, hogy a kötődő anyag agonista vagy antagonista hatású-e.

A magasabb rendű eukarióta sejtek transzmembrán jelátvivő rendszerei gyakran a következő membránhoz kötött alkotórészekből állnak:

a) egy sejtfelületi receptorból, amely adott esetben több alegységből állhat; adott esetben

b) egy guanin-nukleotid-kötő és GTP-hasító szabályozó proteinből amelyet G-proteinnek neveznek, és amely mind receptorhoz, mind effektorhoz kötődhet;

c) úgynevezett „effektorok”-ból, amelyek gyakran a „második messenger” molekulák - mint a cAMP (ciklikus adenozin-monofoszfát), DAG (diacil-glicerin), IP₃ (inozit-l,4,5-trifoszfát), stb. - koncentrációjának megváltozását idézik elő, ilyen például egy ioncsatoma vagy az adenilátciklázok, guanilátciklázok vagy foszfolipázok; és/vagy

d) különböző kinázokból.

A sejtfelületi receptorok nagyszámú extracelluláris stimulus közül felismerik a megfelelő ligandumokat. A ligandum receptorához való kötődése egy szignálkaszkádot aktivál. Ez a kaszkád a G-proteinnel kapcsolódó receptorok esetében, amelyeknél a jelátvivő út jól felderített, és amelyek nagyon különböző extracelluláris jelek hatását közvetítik, a heterodimer G-protein aktiválásával kezdődik.

Az alacsony molekulatömegű második messengerek („second messengers”), mint a cAMP (ciklikus AMP), amely az adenilátcikláz aktiválása révén keletkezik, a cGMP (ciklikus GMP), amelynek keletkezését a guanilátcikláz aktiválása váltja ki, vagy az inozit-1,4,5trifoszfát (IP₃) és a diacil-glicerinek (DAG), amelyeknek a keletkezését foszfolipázok - vagy a foszfolipáz C, vagy hidrolázok közreműködésével a foszfolipáz D [Billah et al., J. Bioi. Chem., 264, 9069-9076 (1989)] - váltják ki, intracelluláris változásokat eredményeznek, ilyen például a proteinkinázok aktiválása révén (PK.C-t az IP₃/DAG aktiválja, a PKA-t a cAMP aktiválja) a proteinek szelektív foszforilációja, bizonyos géneknél a transzkripció szabályozásának befolyásolása és a proliferáció befolyásolása. (Egy antagonista hatású anyag teljesen vagy részlegesen megszüntetheti a második messenger koncentrációváltozását, amelyet egy agonista anyag hatására létrejött kölcsönhatás okozott, illetve ez az antagonista még ellentétesen működő hatáshoz is vezethet). A sejtek ezen jelátvivő rendszeren keresztül tudnak egymással kommunikálni, és fejlődésüket, illetve az általuk kifejtett hatásokat ezen keresztül tudják koordinálni.

Minthogy egyetlen receptoraltípus (esetleg ugyanabban a sejtben vagy különböző sejtekben) nemcsak egy, hanem több effektorhoz kapcsolódhat, és számos receptoraltípus képes ugyanazon effektorok aktiválására, összetett jelátvivő hálózat alkui ki. A jelátvivő kaszkád folyamán a receptoraktiválás következményeként az aktivált transzkripciós faktorok (például: CREB protein, API protein kölcsönhatásba lépnek szabályozóDNS-elemekkel. Például a CRE (CRE elem=„cAMP responsive element”), illetve a TRE (TRE=„TPA responsive element”; TPA=forbol-12-mirisztát-13-acetát) megkötik a CREB, illetve az API proteint. Számos génben, amelyeknek a transzkripcióját a cAMP szabályozza (például: patkányszomatosztatin, humán a-gonadotropin, c-fos), az 5’ határszakasz egy állandó szekvenciát tartalmaz szabályozóelem gyanánt. A CRE szekvencia azonos vagy hasonló a palindrom TGACGTCA oktamerhez [Montminy et al., Trends Neurosci., 13, 185 (1990)]. A TRE elemek a nagyon hasonló TGAGTCA heptamer elemet tartalmazzák, amelyet az általánosan elfogadott CRE-elem-szekvenciától csak egyetlen nukleotid különböztet meg [Deutsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7922-7926 (1988)]. A TRE-motívumot - vagy a nagyon hasonló motívumokat - számos génben azonosították, amelyeknek a transzkripcióját a forbol-észter aktiválja [Angel et al., Mól. Cell. Bioi., 7, 2256-2266 (1987) és Cell. 49, 729-739 (1987); Lee et al., Cell. 49, 741-752 (1987)]. A környező DNS-szekvenciák, illetve a protein-protein kölcsönhatások más faktorokkal határozzák meg többek között egy adott génen a konkrét szabályozójelenségeket.

A további szabályozó-DNS-elemek az úgynevezett „SRE elemek”, amelyek szérumfaktorokkal reagálnak [SRE=serum responsive element”; Treisman, Cell 42, 889-902 (1985)]. A SRE elemek indukálható ciszelemek, amelyek diadikusan szimmetrikus szerkezetű 20 bázispárból állnak. A SRE elemek különböző növekedési faktorokra hatnak; nemrég közölték, hogy az SRE a különböző citokinek által közvetített c-fosindukció irányadó célja [Hatakeyama et al., Cell 59, 837-845 (1989)]. A glikokortikoidok koncentrációváltozására ható elemeket „GRE elemek”-nek nevezik [Yamamoto, Annu. Rév. Génét., 19, 209-252 (1985); Scheidereit et al., DNA 5, 383-391 (1986); Jantzen et al., Cell 49, 29-38 (1987); Stráhle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7871-7875 (1987)].

A jelátvivő utak hálózatának bonyolultságától függően úgynevezett „crosstalk” alakulhat ki a jelátvivő utak között, például az adenilátcikláz és a foszfolipáz C jelátvivő út között. „Crosstalk” alatt egy olyan jelenséget értünk, amikor egy effektor rendszer befolyásolása egy másiknak a befolyásolásához is vezet [Sassone-Corsi et al., Oncogene 5, 427-431 (1990); Houslay, Eur. J. Biochem., 195, 9-27 (1991)]. A crosstalk jelenség fiziológiailag szignálintegrációhoz, illetve szignálhálózat kialakulásához vezet abból a célból, hogy a különböző

HU 220 345 Β jelátvivő utak kommunikációja biztosított legyen, illetve, hogy a szignálok bősége álljon rendelkezésre. Crosstalk végbemehet a jelátvivő utak különböző szintjein. A sejtek kóros elváltozásainak egyik oka lehet, ha e kölcsönhatásokban zavar lép fel, például, ha egy meghatározott receptor fiziológiai értelemben nem korrekt módon reagál egy effektor rendszerrel.

A citokinreceptorok azok közé a receptorok közé tartoznak, amelyek nem kapcsolódnak G-proteinhez. Ezekről feltételezik, hogy több olyan jelátvivő úthoz kapcsolódnak, amelyek ugyancsak különböző receptorokat fednek le, és így a sejten belül sokszoros crosstalk alakul ki.

A citokinek fontos szerepet játszanak az immunreakciók és gyulladásos reakciók koordinációjában (limfokinek és monokinek), a vírusfertőzésekkel szembeni védekezésben (interferonok) és a hematopoézisben (telepstimuláló faktorok=„colony stimulating factors”=CSF). Ezek szabályozzák a proliferációt, a differenciálódást és nagyszámú sejtfunkciót a hematopoetikus, limfoid vagy más szervrendszereken belül. Minden egyes citokin különböző sejttípusokra fejti ki hatását úgy, hogy a citokin termelősejtek és azok a sejtek, amelyeket a citokinek szabályoznak, komplex intercelluláris hálózatot képeznek, amelyben a citokinek szinergetikus módon vagy ellenirányban hatnak. Egy citokin biológiai aktivitásának a spektruma többek között különböző olyan sejttípusok sokaságától függ, amelyek specifikus receptorokat fejeznek ki a citokin számára. Az interleukin-3 (IL-3) és a granulocita-makrofágtelep-stimuláló faktor (GM-CSF) például pleiotróp faktorok, amelyek multipotens hematopoetikus sejteket stimulálnak, valamint több hematopoetikus sejtvonal előalakját is stimulálják. Az interleukin-5-nek (IL—5) ezzel szemben nagyon csekély a hatóterülete, mindenekelőtt eozinofil előalakokra hat [Miyajima et al., Annu. Rév. Immunoi., 10, 295-311 (1992)].

Proteinszerkezetük analízise kimutatta, hogy minden citokinreceptor membránhoz kötött glikoprotein, amelyek egy extracelluláris N-terminális doménből, egyetlen transzmembrán doménből és egy citoplazmatikus doménből állnak. Az extracelluláris domének több közös szerkezeti elemet tartalmaznak, és ezek alapján a citokinreceptorok több olyan receptorgéncsaládba oszthatók be, amelyeknek a tagjai valószínűleg közös génektől származnak [Gillis, Current Opinion in Immunology 3, 315-319 (1991)]. Az IL-5-receptor-gén a hematopoetin receptorgéncsaládhoz tartozik. Ennek a családnak a tagjai jellemzően állandó ciszteinmaradékokat tartalmaznak, amelyek egy vagy több másolatban fordulnak elő az extracelluláris doménekben. Ezenkívül egy triptofán-szerin-X-triptofán-szerin elemet (ahol X bármilyen aminosav lehet) tartalmaznak, amely az extracelluláris doménekben gyakran a transzmembrán domének közelében helyezkedik el. Végül ennek a családnak a receptorai a 3-as típusú fibronektinkötő elemből egy vagy több másolatot tartalmaznak az egész extracelluláris dómén mentén elszórva (Gillis, 1991).

A hematopoetin receptorcsaládhoz tartoznak még az IL-5-receptoron (mindkét alegység) kívül az IL-3,

IL-6 és GM-CSF mindkét alegysége, az IL-4, IL-7, eritropoetin (EPO) és „leukémiagátló faktor” (leukémia inhibitory factor=LIF) receptorok, az IL-2-receptor βalegysége, valamint a növekedési hormonok (GH) receptorai, a prolaktin és G-CSF.

Az IL-5 receptor egy specifikus citokinkötő doméneket tartalmazó α-alegységből és egy β-alegységből áll. Ez utóbbi járul hozzá e receptor IL-5-höz való erős affinitásához, amely a jelátvitelhez szükséges. Mind a humán IL-5-recptor α-alegységét [Tavemier et al., Cell 66, 1175-1184 (1991); Murata et al., J. Exp. Med., 175, 341-351 (1992)] és β-alegységét (Tavernier et al., 1991), mind az egér-IL-5 receptor a-alegységét [Takaki et al., EMBO J., 9, 4367-4374 (1990)] és β-alegységét [Devos et al., EMBO J., 10, 2133-2137 (1991)]; Takaki et al., EMBO J., 10, 2 833-2 838 (1991)] kódoló-DNS-eket klónozták. Az IL-5, IL-3 és GM-CSF receptorai azonos β-alegységet tartalmaznak [Kitamura et al., International Immunology 3, 571-577 (1991); Tavemier et al. 1991]. Ha egy sejten a három receptor közül egynél több fejeződik ki, akkor receptorszinten a citokinek között crosstalk alakulhat ki.

A növekedési faktorok - mint az EGF (epidémiái growth factor) vagy PDGF (piatelet derived growth factor) - receptoraival ellentétben a citokinreceptorok alegységei nem tartalmaznak intrinsic tirozin-kinázaktivitást. Kimutatták azonban, hogy az IL-5-, IL-3-, illetve GM-CSF receptorok megfelelő ligandumaik által történő stimulálása bizonyos sejtproteinek gyors tirozin foszforilációját indukálja [Koyasu et al., EMBO J„ 6, 3979-3984 (1987); Isfort et al., J. Bioi. Chem., 263, 19 203-19 209 (1988); Morla et al., Mól. Cell. Bioi., 8, 2 214-2 218 (1988); Murata et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 173, 1102-1108 (1990)]. Azonosítottak egy olyan tirozinkinázt, amely GM-CSF-fel való stimulálás után a receptor β-alegységéhez kapcsolódik [Hanazono et al., EMBO J., 12, 1 641-1 646 (1993)]. A GM-CSF által indukált jelátvitelnél végbemenő további folyamat a p21^ras [Satoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3 314-3 318 (1991) és J. Bioi. Chem., 267, 2 537-2 541 (1992)] és a c-raf [Caroll et al., J. Bioi. Chem., 265, 19 812-19 817 (1990)] aktiválásán kívül kimutattak egy proteinkináz-C-aktiválást [Whetton et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85, 3284-3288 (1988)], továbbá kimutattak egy „mitogenactivated protein” (MAP)-kinázok által történő foszforilálást [Welham and Schrader, J. Immunoi., 149, 2 772-2 783 (1992). Ezeknek a folyamatoknak a pontos sorrendje azonban az összes jelátviteli kaszkádon belül mégis mindeddig ismeretlen maradt.

Azokat a géneket, amelyek a citokinreceptorok stimulálását követően a jelátviteli mechanizmus komponensei által indukálódnak, még távolról sem azonosították. Ennélfogva az ilyen gének promotereinek szabályozóelemeiről is keveset tudunk. Az lL-6-receptor stimulálása például egy speciális DNS-kötő protein, az NF-IL-6 aktiválásához vezet, amely a célgének promoter szakaszában az IL-6-ért felelős elemekhez való kötődés révén a gének expresszióját idézi elő, és ezáltal IL-6-függő

HU 220 345 Β biológiai hatásokat közvetít [Akira et al., EMBO J., 9, 1897-1906 (1990)]. A c-fos proto-onkogént, amely a promoter szakaszban több indukálható szekvenciaelemet tartalmaz [Verma und Sassone-Corsi, Cell 51, 513-514 (1987)], az IL-2, IL-3 és EPO indukálja, amikor is az indukcióban többek között a c-fos promoterben lévő „serum responsive element” (SRE) is részt vesz [Hatakeyama et al., Cell 59, 837-845 és Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2 022-2 026 (1992)].

Az IL-5 receptort ligandumával - interleukin-5tel (IL—5-tel) - való kötődése aktiválja. Az IL-5 egy peptid hormon, amelyet T-sejtek és hízósejtek állítanak elő, és lényeges funkciója az eozinofilek végső differenciálódásánál van.

Az IL-5-receptorhoz kapcsolódó jelátvivő utakról majdnem semmit sem tudunk. Néhány, eddig nem azonosított sejtprotein foszforilációja (Murata et al., 1990) nem olyan folyamat, amely révén az IL-5 receptor stimulálása által kiváltott jelátvitel felderíthető lenne. Minthogy a három citokinnek, az IL-5-nek, IL-3-nak és GM-CSF-nek különböznek a biológiai funkciói, lehetséges, hogy a β-alegységen kívül, amely mindhárom receptorban azonos, a receptorok citokinspecifikus aalegységei is szerepet játszanak az intracelluláris jelátvitel indukciójában, főként a citokinspecifikus jelátvitelek és funkciók indukciójában [Tominaga et al., BioEssays 14, 527-533 (1992)]. Az IL-3 receptor, illetve GM-CSF receptor aktiválása által kiváltott jelátviteli folyamatokról való ismeretek tehát nem teszik lehetővé, hogy egyértelmű következtetéseket vonjunk le az IL-5 receptorhoz kötött jelátvivő utakra vonatkozóan. Minthogy olyan géneket sem azonosítottak, amelyek az IL-5 receptor stimulálása után indukálódnak, így olyan szabályozóelemekről sem tudunk semmit, amelyek az ilyen gének promoter szakaszaiban fordulnak elő, és amelyek az IL-5 receptor aktiválódása révén megindított jelátvivő utakkal reagálnának.

A ligandumával való kötődés révén aktiválódott IL-5 receptort különböző olyan betegségekkel hozták összefüggésbe, amelyek eozinofiliával, azaz a vérben az eozinofilek felszaporodásával járnak. Ide számíthatók autoimmun betegségek, transzplantátumkiiökődések, allergiás betegségek, bizonyos paraziták által okozott betegségek és asztmatikus betegségek. Az ilyenfajta betegségek okainak gyógyítására javasolt kezdeményezések eddig egyrészt abból álltak, hogy az IL-5 receptor oldható α-alegységét mint antagonistát alkalmazták (492 214 számú európai szabadalmi bejelentés), másrészt, hogy az IL-5 kristályszerkezetéből kiindulva antagonisták vagy agonisták ésszerű tervezését kezdeményezték [Milbum et al., Natúré 363, 172-176 (1993)].

A legutóbbi időben olyan szűrővizsgálatokat fejlesztettek ki, amelyek kóros állapotok kezeléséhez olyan gyógyszerek kidolgozását teszik lehetővé, amelyek meghatározott receptorra, illetve receptorszubtípusra specifikusak, és amelyek ennélfogva specifikusan befolyásolják a receptorfüggő jelátvivő utat. Ezek az eljárások azon az elven alapulnak, hogy bizonyos anyagoknak a receptorfüggő jelátvivő útra kifejtett moduláló hatása a gének expresszióján keresztül mutatható ki:

A King és munkatársai által leírt [Science 250, 121-123 (1990)] assay-rendszer egy olyan jelátvivő út befolyásolásán alapul, amelyet a Saccaromyces cerevisiae G-proteinnel kapcsolódó feromonreceptorai használnak, amikor az élesztősejtben egy agonistaként ható vegyületnek az élesztősejtbe transzfektált receptorhoz való kötődésekor létrejött reakcióját mérik kolorimetriásan.

Montmayeur és Borelli [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3135-3139 (1991] egy olyan assay-t írtak le, amely az adenilátcikláz jelátvivő útnak a G-proteinhez kapcsolódó receptorok (szerzők D₂-receptorokat és a βadrenerg-receptort használták) aktiválása által történő befolyásolásán alapul.

Himmler és munkatársai [Journal of Receptor Research 13, 79-94 (1993)] funkciós tesztet dolgoztak ki, amelyben a receptorkapcsolatnak (humán dopamin Dl- és D5-receptor) a cAMP jelátvivő útra gyakorolt hatását egy riportergén transzkripciós aktiválásán keresztül mérték.

Az eddig ismert assay-k olyan gének expressziójának mérésére korlátozódtak, amelyeket a cAMP - a G-proteinnel kapcsolódó receptorok jelátvivő útjának egyik messengere - szabályoz.

A találmánynak ezzel szemben az volt a feladata, hogy olyan anyagok azonosítására alkalmas szűrővizsgálati eljárást bocsásson rendelkezésre, amelyek egy olyan IL-5 receptorfüggő jelátvivő utat modulálnak, amelynek a mechanizmusa és messengerei csak nagyon kevéssé ismertek. A találmány segítségével egy olyan eljárás valósítható meg, amely automatizálható és magas teljesítményénél fogva alkalmas az anyagok szűrésére, és lehetővé teszi komplex anyagkeverékek - ilyenek a szervezetek kivonatai - tartalmi vizsgálatát farmakológiailag hatásos anyagokra.

Az IL-5 receptor modulálásával, gyakran aktiválásával járó betegségek terápiájában alkalmazható gyógyszerek kifejlesztéséhez olyan anyagok azonosítása képezi a kiindulási pontot, amelyek az IL-5 receptorfüggő jelátvivő utat, elsősorban az IL-5 antagonistákat képesek modulálni.

A találmány keretében bemutatjuk, hogy azokban a sejtekben, amelyek az IL-5 receptor funkciójához szükséges szerkezeti elemeket tartalmazzák, valamint az IL-5 receptorfüggő jelátvivő út alkotórészeit kifejezik (az ilyen sejteket a következőkben az egyszerűség kedvéért „működőképes IL-5-receptor-kifejező sejtednek nevezzük), és amelyeket szabályozó-DNS-elemet tartalmazó riportergén-szerkezettel transzformáltunk, a riportergén-szerkezet az IL-5 receptor aktiválása által - ligandumával való kötődés után - indukálódik.

Ez az eredmény, az IL-5 receptorfüggő jelátvivő útról alkotott csekély ismeretek miatt meglepő volt, különösen, hogy azt még előre meg sem lehetett jósolni, hogy fog-e, illetve, hogy az eddig vizsgált szabályozóDNS-elemek közül melyik fog reagálni az IL-5 receptor által megindított jelátvivő út egy messengerére.

A találmány egy olyan anyag meghatározására alkalmas eljárásra vonatkozik, amely moduláló hatást fejt ki az emberi vagy állati sejtben egy receptorfüggő

HU 220 345 Β jelátvivő útra. Az eljárás azzal jellemezhető, hogy az anyagnak az IL-5 receptor aktiválása által kiváltott jelátvivő út egy alkotórészére kifejtett moduláló hatását a következőképpen határozzuk meg: emlőssejteket, amelyek:

a) egy riportergént és egy olyan szabályozószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amely az IL-5 receptorhoz kapcsolódó jelátvivő út egy vagy több második messengerének koncentrációváltozására úgy reagál, hogy a riportergén-expresszióját a messenger koncentrációváltozása modulálja, továbbá, a szóban forgó emlőssejteket, amelyek

b) a működőképes interleukin-5 receptort fejezik ki, a tesztanyaggal inkubáljuk, a riportergéntermék koncentrációját mérjük, és megvizsgáljuk, hogy vajon a tesztanyag megállapított hatása szelektív-e az IL-5 receptorfüggő jelátvivő útra.

„Interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő út” meghatározás alá esik a találmány szerint egy olyan interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő mechanizmus is, amely adott esetben több jelátvivő útból áll.

A .jelátvivő út alkotórészei” meghatározás magában foglalja a jelátvivő út mechanizmusaiban részt vevő molekulákat, beleértve magát az IL-5 receptort, illetve alegységeit.

Ha az IL-5-függó jelátvivő út inhibitorait keressük, a tesztanyagokat antagonista hatásuk szempontjából vizsgáljuk. Ekkor a tesztanyagokat az IL-5-tel együtt hozzuk össze a sejtekkel, amikor is általában az IL-5öt a tesztanyaggal egyidejűleg vagy ez után visszük a sejtekre.

Azt a rekombináns DNS-t, amely a második messengerek változására reagál, és amely e találmány tárgyát is képezi, a következőkben „szenzor-DNS”-nek nevezzük. Riportergénnek nevezünk egy gént, ha expressziós terméke kimutatható, és mennyisége egy olyan szignál segítségével mérhető, amely koncentrációjával arányos.

A szenzor-DNS-sel transzformált, IL-5 receptort kifejező sejteket a következőkben „tesztsejtek”-nek nevezzük; ezek a sejtek szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmányi leírásban „IL-5 receptor” alatt a működőképes IL-5 receptort értjük és ez a meghatározás - adott esetben - az előforduló IL-5 receptoraltípusokra is érvényes. „Működőképes receptor” alatt ebben a leírásban egyrészt a természetben előforduló IL-5 receptort értjük, amely azonos fajból származó a- és βalegységekből áll, továbbá a tesztsejtekben - elsősorban humán sejtekben - lévő IL-5 receptor különböző fajból származó a- és β-alegységeinek működőképes kombinációját, például a humán receptor a-alegységének és az egérreceptor β-alegységének a kombinációját vagy fordítva. Ennek a meghatározásnak az értelmében működőképes receptorról beszélünk, ha egy sejtben, amelyben egy β-alegység természetesen együttműködik egy másik receptor, például az IL-3 vagy a GM-CSF receptor α-alegységével, vagy az IL-5 receptor α-alegységét a sejtbe bevezetjük és kifejeződésre késztetjük, amikor is ez az α-alegység ebben az esetben is származhat más fajból, amennyiben a jelátvivő út megindítása szempontjából a két alegység funkcionális együttműködése biztosított.

A rekombináns DNS-t, amely egy vagy több IL-5 receptoralegység-kódoló szekvenciát (szekvenciákat) tartalmaz, a következőkben „receptor-DNS”-nek nevezzük.

A tesztsejtek előállításához szolgáló kiindulási sejtek céljára olyan sejtek felelnek meg, amelyek a teljes, működőképes IL-5 receptort már endogén tartalmazzák, másrészt olyan sejtek is, amelyek a szenzor-DNS indukciójához szükséges, receptorhoz kapcsolódó jelátvivő utak alkotórészeit tartalmazzák. Nem követelmény az ilyen sejtek alkalmassága szempontjából, hogy ezek már eleve a teljes IL-5 receptort vagy alegységei közül csak egyet is kifejezzenek. Egy vagy mindkét alegység hiánya esetén a sejteket a szenzor-DNS-en kívül a hiányzó receptoralegység(ek)et kódoló szekvenciával is transzformálhatjuk.

A találmány egyik kiviteli alakjában a tesztsejtet egy olyan sejtből állítjuk elő, amely a működőképes IL-5 receptorhoz szükséges mindkét alegységet természetszerűen kifejezi.

A találmány egy további kiviteli alakjában a tesztsejtet egy olyan kiindulási sejtből vezetjük le, amely csak a β-alegységet fejezi ki, és ebben az esetben a sejtet a szenzor-DNS-en kívül egy olyan plazmiddal transzformáljuk, amely IL-5 receptor α-alegységet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

A találmány egy másik kiviteli alakjában a tesztsejthez használt kiindulási sejt a természetben sem α-, sem β-IL-ő receptoralegységet nem tartalmaz. Ebben az esetben a sejtet mindkét DNS-szekvenciával transzformálnunk szükséges, melyeket vagy együtt egy plazmid tartalmazhat, vagy külön plazmidok hordozhatnak.

Ha emberek kóros állapotának kezeléséhez bizonyos anyagokat farmakológiai hatásuk szempontjából kell vizsgálnunk, előnyös, ha a receptor-DNS humán IL-5-receptor-kódoló szekvenciát tartalmaz. (A találmány szerinti eljárás elsősorban olyan anyagok keresésére szolgál, amelyek emberek kóros állapotának kezelésére alkalmasak. Az eljárás azonban olyan anyagok szűrésére is alkalmazható, amelyek állatok kezelésére is használhatók; ebben az esetben a megfelelő állati IL-5 receptort alkalmazzuk).

A tetsztsejtek előállításához előnyösen aszerint választjuk ki a sejteket, hogy ezek olyan anyagokkal való stimulálás után amelyek IL-5 receptorfüggően növelik a második messengerek koncentrációját, a riportergén erős expresszióját mutassák fel. Ezt célszerűen úgy ellenőrizzük, hogy azokat a sejteket, amelyek működőképes IL-5 receptort fejeznek ki, szenzor-DNS-sel transzformáljuk, és a riportertermék koncentrációját a receptor IL-5-tel való stimulálása után meghatározzuk.

Tesztsejtekhez kiindulási sejtekként különösen olyan sejtek jönnek számításba, amelyekről tudjuk, hogy IL-5 receptort vagy egy olyan receptort fejeznek ki, amely β-alegységet tartalmaz, illetve olyan sejtek, amelyekről származásuk alapján, illetve a szervezetben

HU 220 345 Β kifejtett funkciójuk alapján feltételezhető, hogy a kérdéses receptor egyikét kifejezik, ilyenek főként a hematopoetikus sejtek előalakjai. A receptor expresszióját adott esetben kötési vizsgálattal és/vagy proliferációs vizsgálattal igazoljuk, amelyben a sejtek növekedését a megfelelő ligandumok (IL-5, IL-3 vagy GM-CSF) jelenlétében határozzuk meg.

Alkalmas kiindulási sejtek például a csontvelősejtek közül izoláltfaktor-függő sejtvonalak; az ilyenfajta - β-alegységet kifejező - sejtvonalak előállítását például Dexter és munkatársai [J. Exp. Med., 152, 1 036-1 047 (1980)] egérsejtekre írták le. A találmány kidolgozása során egy ilyen egérsejtvonal sejtjeit az egér-IL-5 receptor α-alegységével transzformáltuk, és ezeket a sejteket használtuk tesztsejtekként. Alkalmas tesztsejtek például az IL-5-függő hematopoetikus sejtek, például ilyen a Kitamura és munkatársai által leírt [J. Cell. Physiolog. 140, 323-334 (1989) és International Immunology 3, 571-577 (1991)] TF-1 sejtvonal.

Azokban a sejtekben, amelyekben mindkét alegység egér eredetű, például az lH3-egér-sejtvonal, innen az a- és adott esetben a β-alegység is kiiktatható homológ rekombináció révén és a megfelelő humán szekvenciával lehet ezeket helyettesíteni.

Kiindulási sejtekként alapvetően tetszés szerinti fajból származó emlőssejtek jönnek számításba, ugyanakkor előnybe helyezzük a humán sejteket. A nem emberi eredetű sejtek közül előnyösen olyanokat használunk, amelyek humán IL-5-receptor-DNS-sel (β- és/vagy aalegység) vannak transzformálva.

Egy sejt tesztsejthez való találmány szerinti alkalmasságának további feltétele a stabilitása. A sejtek stabilitását (életképesség, idegen DNS stabil integrációja a genomba) úgy teszteljük, hogy hosszabb időn át a tesztsejtekkel azonos feltételek mellett végzünk velük vizsgálatokat, és a mérési eredmények reprodukálhatóságát ellenőrizzük.

Előnyös, ha a szenzor-DNS-t egy olyan plazmid hordozza, amely egy alkalmas gazdaszervezetben - előnyösen E. coliban - nagy másolatszámmal sokszorozódik. A plazmid emlőssejtekbe való transzfekciója, majd a gazda genomjába való integrációja után, lehetővé teszi egy riportergén-expresszióját, szabályozóelemek szabályozása alatt. Előnyös, ha itt ingázó vektorról (shuttle-vector) van szó, amely a riportergénhez (szenzor-DNS) egy expressziós kazettát tartalmaz és szelekciós markért az emlőssejtekhez, továbbá legalább egy replikációs kezdőpontot és egy markert az E. coliban való szaporodás és szelekció végett.

Állandó sejtvonalak előállításához, amelyek a szenzor-DNS-t genomjukba stabilan integráltan tartalmazzák, a vektor egy domináns szelekciós markert tartalmaz. Meghatározott szelekciós marker alkalmazása nem döntő, alkalmas például a neomicin-foszfotranszferáz gén (neo), amely a geneticin (G-148) antibiotikum ellen kölcsönöz rezisztenciát [Southern and Berg, J. Mól. Appl. Gén., 1, 327 (1982)], a DHFR gén (dihidrofolátreduktáz) a DHRF-hiányos sejtek számára, a xantinguanin-foszforibozil transzferáz gén (gpt), amely mikofenolsavak ellen kölcsönöz rezisztenciát [Mulligan and

Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2 072-2 076 (1981)] vagy a hidromicin-B-foszfotranszferáz gén [hph; Gritz and Davies, Gene 25, 179-188 (1983)]. A szelekciósmarker-génhez promoterként használható például a korai SV40 promoter, a citomegalovírus-promoter (CMW-promoter), a Herpes simplex vírus timidin-kináz génjének promotere (TK-promoter) és a Rous Sarcoma vírus (RSV) hosszú ismétlődő végszakasza (LTR). A plazmidokat előnyösen úgy szerkesztjük, hogy az egyes fontos elemeket - ilyen a riportergén, a riportergén promotere, a szelekciós marker szabályozószekvenciái - egyszerű módon ki tudjuk cserélni vagy meg tudjuk változtatni, hogy az esetleges megváltozott igényeknek, amelyek a speciális alkalmazásból adódnak, például egy másik sejtvonal használata esetén, megfeleljenek. Az ilyen műveletek például abból állnak, hogy a promoter(ek) vagy a riportergén elé sokszoros klónozóhelyeket építünk be, hogy lehetővé tegyük a szabályozó- és a promotert moduláló szekvenciák, illetve a különböző riportergének klónozását.

Egy alkalmas riportergén kiválasztásánál abból indulunk ki, hogy előnyösen nem radioaktív, nagy érzékenységű automatizált assay-t tegyen lehetővé.

A találmány szerint alapjában véve minden olyan riportergént használhatunk, amelyek ezeknek a feltételeknek megfelelnek:

Az alkalikus foszfatázt kemiluminiszkáló szubsztrátum alkalmazása esetén nagy érzékenységgel mérhetjük, bár az a hátránya, hogy ezt az enzimet sok emlőssejt fejezi ki viszonylag erősen. Ezért riportergén gyanánt általában csak olyan sejtvonalaknál jönnek számításba, amelyek ezt az enzimet nem, vagy csak gyengén fejezik ki.

A β-galaktozidáz gén és a β-glukuronidáz gén expressziós terméke a megfelelő metil-umbelliferilgalaktozidot, illetve - glukuronidot fluoreszkáló csoportok képződése mellett hasítja. Ez az enzimreakció fluoreszcens-assay segítségével követhető [Wieland et al., Árztl. Láb. 31, 203-214 (1985); Kricka, Analyt. Biochem., 175, 14-21 (1988)].

A kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) expressziója ugyan viszonylag érzékenyen kimutatható, a vizsgálatnak azonban az a hátránya, hogy radioaktív és nehezen automatizálható [Hartmann; Bio Tec., 5, 40-45 (1991)].

A találmány szerint, riportergénként a Photinus pyralis - luciferáz kódológén használatát tartjuk előnyösnek [De Wet et al., Mól. Cell. Bioi., 7, 725-737 (1987)]. Ennek az enzimnek az az előnye, hogy szubsztrátumával, a luciferinnel ATP hozzáadása mellett, nagy kihozatallal termel bioluminiszcenciát, ami automatizálható módszerek segítségével mérhető, és hogy ezt az enzimet emlőssejtek endogén nem termelik. A luciferáznak ezenkívül viszonylag rövid az in vivő felezési ideje, és még magas koncentrációkban sem toxikus [Hartman, 1991; Brasier et al., Bio Techniques 7, 1 116-1 122(1989)].

A szenzor-DNS szerkesztésekor a riportergént olyan promoterek szabályozása alá helyezzük, amelyek modulálható szabályozóelemeket tartalmaznak, például

HU 220 345 Β

TRE és/vagy CRE és/vagy SRE és/vagy GRE elemeket. Minthogy az IL-5 receptor jelátvivő utak részletei pontosan nem ismertek, a legalkalmasabb szenzorDNS-szerkezeteket előkísérletekben empirikusan határozzuk meg. E kísérletekben egy olyan sejtet, amely működőképes IL-5 receptort fejez ki, különböző szenzor-DNS-szerkezetekkel ideiglenesen transzformálunk, amikor is egyrészt a riportergénre tekintettel, másrészt a szabályozószekvenciákra tekintettel változtathatjuk, és a riportergéntermék mérésekor ennek érzékenységét vizsgáljuk olyan módon, hogy miután a receptort egy agonistával - előnyösen IL-5-tel - stimuláltuk, a riportergéntermék koncentrációját megmérjük. A szenzor-DNS-ben szabályozószekvenciaként minden olyan DNS-elem megfelel, amely a promoter aktiválását előidézi, mint például a TRE, CRE, GRE vagy SRE elemek közül kiválasztott elem, vagy olyan elemek, amelyek ezeknek az elemeknek a kombinációját tartalmazzák. Két vagy több ilyen elemet tartalmazó szenzorDNS több jelátvivő út aktiválását egymással párhuzamosan ellátja. A tesztsejt kialakításához aszerint választjuk meg a szenzor-DNS-t, hogy az adott sejtrendszerben a riportergén lehető legerősebb indukálhatósága valósuljon meg. A szabályozópromoter-szakasz lehet természetben előforduló promoterszakasz, de mesterségesen is előállítható.

Adott esetben egy olyan gén teljes promoterét használjuk, amely több második messengerrel indukálható, például ilyen az ICAM-1 gén (intercelluláris adhéziós molekula-1) vagy a c-fos gén 5’-szabályozószekvenciája. Egy IL-5 receptor aktiválásra reagáló természetes promotert, amely sok szabályozóelemet tartalmaz, például az ICAM-1 promotert, amely többek között a TRE, NKKB, SP1 és AP2 elemeket tartalmazza [Voraberger et al., J. Immunoi., 147, 2777 (1991)] vagy a c-fos promotert, amely többek között a CRE- és SRE elemeken kívül „SIF-E elem”-nek és „AP,-szerű elem”-nek nevezett szabályozószekvenciákat tartalmazza [Hipskind und Nordheim, J. Bioi. Chem., 266, 19 583-19 592 (1991)], olyan szempontból vizsgálhatunk, hogy melyik eleme felelős az aktiválásért. Ekkor úgy járhatunk el, hogy olyan mesterséges promoterszekvenciákat, amelyek a természetes promoterrel szemben különböző mutációkat és/vagy deléciókat tartalmaznak, aktiválhatóságra vizsgálunk. Az ilyen vizsgálatok eredményéből kiindulva a promotert, kívánt esetben, tovább optimalizálhatjuk, azaz például a mérvadónak azonosított elemet, illetve elemeket, több másolatban alkalmazzuk.

Adott esetben az ismert természetes vagy szintetikus promotereket úgy módosíthatjuk, hogy a promoterfúnkcióhoz szükséges minimálszekvenciára rövidítjük.

Egy szenzor-DNS szerkesztésénél, amelyben a riportergént nem természetes promoter irányítja, célszerűen gyenge promoterelemeket - egy vagy több elemet - például TRE és/vagy CRE és/vagy SRE és/vagy GRE szabályozóelemet kapcsolunk a promoter elé, amelyek azt modulálják. A szakemberek jól ismerik az egyes emlőssejtekhez megfelelő szabályozószekvenciákat. A kiválasztást elsősorban az idevágó szakirodalom alapján tehetjük meg [például: Landschulz et al., Science 240, 1 759-1 764 (1988); Tumer und Tjian, Science 243, 1 689-1 694 (1989)], az alkalmasságot, illetve az optimalizációt a fent előadott, egyszerűen elvégezhető ideiglenes transzfekciós kísérletekkel állapíthatjuk meg. Alkalmas promoterek például a következők: β-globin-promoter és TK-promoter.

A szenzor-DNS-ben lévő szabályozószekvenciák (beleértve a határolószekvenciákat is) kiválasztásánál irodalomból ismert olyan elemekből (például TRE vagy CRE elemek; Montminy et al., 1990; Deutsch et al., 1988) indulunk ki, amelyeket egy adott sejtrendszerben végzett előkísérletekben riportergén-érzékenységgel kimutatható indukálhatóság szempontjából alkalmasságukra megvizsgáltunk. Megfelelő TRE elemek határszekvenciáikat is beszámítva - például a szomatosztatin szekvenciák, „vazoaktív intesztinális peptidek”, citomegalovírus enhancer, marha-leukémiavírus hosszú ismétlődő végszakasz (Bovine Lukemia Vírus - Long Terminál Repeat=BLV LTR) (CRE elemek), illetve ICAM-1, kollagenáz, parathyreoid hormon (TREelemek). Amennyiben a természetes szekvenciák elemei nem tartalmaznak valódi konszenzusszekvenciákat, akkor - amennyiben ilyenekre szükség van, vagy kívántak - ezeket, és adott esetben a szomszédos szekvenciákat is, egy vagy több nukleotid cseréjével meg lehet változtatni.

A szabályozóelemek és az ezeket határolószekvenciák előállíthatok szintetikus úton, de lehetnek természetes eredetűek.

Abból a célból, hogy egy második messengemek a riportergén-expresszióra kifejtett moduláló hatását megerősítsük, adott esetben egy olyan szerkezetet használunk, amely több homológ vagy heterológ szabályozószekvenciát tartalmaz tandem elrendezésben. A szerkezet egyes elemeinek az elrendezésénél az elemek egymástól való távolságát úgy választjuk meg, hogy a transzkripciós faktoroknak az elemekhez való kötődése biztosított legyen. A szabályozóelemek egymástól való optimális távolságát, amelynek a meghatározásánál a térbeli elrendeződés is megfontolandó, előkísérletekben, empirikusan határozzuk meg, és adott esetben más olyan szabályozó-DNS-elemektől való távolságukat is, amelyek befolyásolhatják a transzkripciót, például a TATA-box-tól való távolságot. Több szabályozószekvencia esetén az elemek és/vagy a határolószekvenciák vagy azonosak, vagy legalábbis részben különbözőek lehetnek, ez utóbbi kiviteli forma a tandem-szerkezetnél előnyös. A szabályozóelemet határolószekvenciák közül - amelyekről megállapították, hogy ugyancsak befolyásolják az elemek szabályozótulajdonságait azokat tartjuk előnyösnek, főként ezek közvetlen környezetében, amelyek a speciális szabályozóelemet a természetben is körülveszik (Monminy et al., 1990; Deutsch et al., 1988). A szekvenciát, illetve elrendezését empirikusan állapítjuk meg.

Adott esetben a szenzor-DNS-elemeit és a szelekcióhoz használt marker gént két külön plazmid tartalmazza, ezek közül az egyik a riportergén-szerkezetet (az

HU 220 345 Β expressziószabályozó szekvenciát is beleértve, amely a szabályozószekvenciát tartalmazza) a másik pedig a szelekciós markergén-szerkezetet tartalmazza. (Alkalmas szelekciós markergén-szerkezetek például a következő plazmidok: pRSVneo, pSV2neo, pRSVgpt, pSV2gpt, amelyeknek a felépítése az idevágó kézikönyvekben - például: Cloning Vectors: Chapter VIII (kiadó Pouwells, Enger-Valk, Brammer, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1985) - megtalálható). Külön plazmidok használata esetén a sejteket mindkét plazmiddal kotranszfektáljuk, és a markerre szelektáljuk. A szelekciós marker jelenlétéből arra lehet következtetni, hogy a sejtek a riportergén-szerkezetet is tartalmazzák, mivel ismert, hogy két olyan gén kotranszformációja, amelyek fizikailag egymással össze nem kötött DNS-szegmentumokon helyezkednek el, gyakran mindkét kotranszformált gén expressziójához vezet [Winnacker, Gene und Klone; Eine Einführung in die Gentechnologie; VCH Verlagsges. Weinheim, 1985; 264. oldal],

A teszteljárásban bevezetendő mérési előírás szempontjából célszerű, ha a mérési szignál maximális változása és normálértéke közötti viszonyt optimalizáljuk, előnyösen a szenzor-DNS szerkezetének megváltoztatása révén, például a promoterelrendezés szerkezeti megváltoztatásával. Előnyös, ha a háttér szignál eléggé alacsony, hogy a riportergén-expresszió indukcióját nagy érzékenységgel lehessen észlelni, másrészt elég magas ahhoz, hogy a kimutathatósági határt, tekintettel a negatív kontrollra, meg lehessen állapítani.

A receptor-DNS-szerkezetre lényegében ugyanazok a megfontolások érvényesek, mint a szenzor-DNS szerkezetére, azzal a különbséggel, hogy a receptorszekvenciá(ka)t egy erős, konstitutív promoter szabályozása alá kell helyezni. A receptor-DNS-ek hagyományos molekuláris biológiai módszerek segítségével állíthatók elő, például úgy, hogy IL-5 receptort kifejező sejtekből származó RNS-készítményből kiindulva, reverz-transzkriptáz PCR segítségével cDNS-t állítunk elő, amikor is a primereket a közölt szekvencia (szekvenciák) alapján szerkesztjük meg, és a terméket megfelelő vektorba klónozzuk. A cDNS-t egy cDNS-gyűjteményből is sokszorozhatjuk, PCR segítségével.

A receptor-DNS esetében is, adott esetben, külön plazmidok - amelyekkel a sejteket transzformáljuk tartalmazzák a receptoralegységet kódoló szekvenciát és a domináns szelekciós markert.

A sejtek transzfekcióját a szenzor-, illetve receptorDNS-sel a szokásos transzfekciós módszerekkel végezzük [lásd például: Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7 161 (1984); Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7 413-7 417 (1987)]. Előnyösen alkalmazhatók az elektroporációs, a kalcium-foszfát-precipitációs és a lipofekciós módszerek.

Az IL-5 receptorhoz való tesztanyag szelektivitásának ellenőrzésére további kontrollkísérletekben, célszerűen más receptorok részére állítunk elő tesztsejteket, és ezeket az anyaggal kezeljük. Ha egy anyag csak az IL-5 receptort befolyásolhatja specifikusan - ilyen eset áll fenn általában egy gyógyszer specificitása vonatkozásában - akkor az anyag csak ezt az egy receptort modulálhatja.

A kontrollsejtek a kontrollreceptort elvileg vagy endogén tartalmazhatják, vagy pedig a sejteket ezzel a receptorral transzformálhatjuk. Ha az IL-5-receptortesztsejthez használt szenzor-DNS-t e receptornak egy agonista - például IL-5 - által történő stimulációja ugyancsak mérhető módon indukálja, az IL-5-receptor-tesztsejt kontrolisejtként alkalmas, ha a kontrollreceptort kódoló szekvenciát endogén tartalmazza, vagy pótlólag a sejtet ezzel transzformáltuk. (Kontrollreceptorok alatt azokat a receptorokat is értjük - ilyen például az IL-3 receptor - amelyek az IL-5 receptorral közös β-alegységet tartalmazzák). Ilyen esetben ugyancsak kontrollsejtekként alkalmazhatók azok a sejtek, amelyek ezt a szenzor-DNS-t és a kontrollreceptort jóllehet nem az IL-5 receptort - tartalmazzák. Ha ellenben az IL-5-receptor-tesztsejthez használt szenzorDNS-t a kontrollreceptor stimulusa nem indukálja, empirikusan kell egy alkalmas szenzor-DNS-t meghatározni, amikor is a szakirodalomból (például: Montminy et al., 1990; Deutsch et al., 1988) ismert olyan elemekből indultunk ki, amelyeknek előkísérletekben vizsgáltuk meg az alkalmasságát abból a szempontból, hogy az adott sejtrendszerben a riportergén érzékenyen kimutatható indukálhatósággal rendelkezik-e. Ezután a szenzor-DNS-t a kontrollreceptort kódoló szekvenciával együtt - amennyiben ez endogén nincs jelen - a sejtbe transzformáljuk.

Az anyag moduláló hatásának a szelektivitását az interleukin-5-függő jelátvivő útra előnyösen úgy ellenőrizzük, hogy azonos feltételek mellett olyan kontrolisejtekre visszük fel, amelyek egy kontrollreceptort fejeznek ki, és amelyek egy olyan szenzor-DNS-sel vannak transzformálva, amelynek a szabályozószekvenciája nemcsak az interleukin-5 receptorra, hanem a kontrollreceptor aktiválására is reagál, továbbá, hogy az interleukin-5 receptort kifejező sejtekben a riportergéntermék koncentrációját a kontrollsejtekével hasonlítjuk össze.

A sejtek receptor-DNS-sel való transzformálása után a pozitív kiónokat, például kötési vizsgálatok segítségével - amelyekben ismert radioaktívjelzett agonistákat és antagonistákat alkalmazunk - a receptor expressziószintjére vizsgáljuk.

Scatchard-blotok (Humán Pharmacology Molecular-To-Clinical, Chapter 2; Sites of Action: Receptors; kiadó Wingard., L. B., Brody, T. M., Lamer, J. und Schwartz, A., Mosby Year-Book Inc., St. Louis, 1991) segítségével határozhatjuk meg a sejtenként! receptorszámot, molekulában kifejezve.

A stabil, receptor-DNS-t tartalmazó sejtek közül előnyösen egy olyan receptorszámmal rendelkező kiónt választunk, amely lehetőleg megfelel a fiziológiai receptorkoncentrációnak. (Ha a receptorszám túl magas, olyan eset fordulhat elő, hogy nem specifikus kötés jöhet létre, vagy a specifikus kötésen kívül alakul ki nem specifikus kötés, miáltal adott esetben más effektor rendszerek is aktiválódnak. Ha a receptorszám túl alacsony, adott esetben a szignál lesz túl alacsony ahhoz, hogy mérhető legyen.)

HU 220 345 B „Moduláló” hatás alatt egy IL-5 receptorfüggő jelátvivő útra gyakorolt agonista vagy antagonista hatást értünk.

Az olyan anyagokat, amelyek tesztvizsgálatokban gátlóhatást fejtenek ki az IL-5 receptorfiiggő riportergén-expresszióra, az eljárás egy további lépésében arra vizsgálhatjuk, hogy vajon gátolják-e az IL-5-fiiggő sejtproliferációt. Egy ilyen eljárásban meghatározzuk az anyagnak a sejtek proliferációjára gyakorolt gátlóhatását, amikor is úgy járunk el, hogy a sejteket, amelyek más növekedési faktoroknak megfelelő receptoraik mellett működőképes IL-5 receptort fejeznek ki, és amelyeknek a növekedése az IL-5 jelenlététől vagy legalábbis egy ilyen receptor ligandumától, például az IL—5-től függ, csak IL-5-tel és másik menetben az IL-5-tel és a vizsgálandó anyaggal inkubáljuk, majd mindkét reakcióelegyben megmérjük a proliferációt.

Proliferációs assay-kból nagy választék áll rendelkezésre, például amelyek 96 tartályos mikrotitráló lemezeken végezhetők el, és egyszerű módon automatizálhatok. Vannak assay-k például, amelyek a [³H]-timidinvagy a bróm-dezoxi-uridin- (BrdUrd-) beépülés mérésén alapulnak (a BrdUrd-beépülés például fluoreszceinnel jelzett anti-BrdUrd antitesttel való kötődés révén mérhető.)

A proliferációs assay-k elve olyan színezékek mérésén is alapulhat, amelyek megfelelő szubsztrátumok sejtenzimekkel való reakciója révén keletkeznek. Egy ezen elv alapján kidolgozott módszer a kereskedelemből beszerezhető tetrazolium-só-módszer (MTTmódszer), amelyben egy tetrazolium-sónak dehidrogenázzal való reakciója során keletkező formazánszínezék koncentrációját méijük spektrofotometriásán.

Proliferációs assay-hez alkalmas sejtek például az IL-5-függő hematopoetikus sejtek, ilyenek például a Kitamura és munkatársai által 1989-ben és 1991-ben leírt TF-1 sejtvonal sejtjei.

Természetes vagy szintetikus anyagok potenciális farmakológiai hatását a találmány szerinti eljárás segítségével vizsgálhatjuk. A vizsgálandó anyagok lehetnek például tiszta anyagok vagy anyagkeverékek (például növényi kivonatok, fermentlevelek, stb.). A tiszta anyagok közül elsősorban az alacsony molekulatömegű szintetikus szerves vegyületek tartanak számot érdeklődésre. Szűrővizsgálatok segítségével kiszűrendő anyagoknak számítanak lényegében a következők: a receptor ligandumkötő helyéhez kötődő anyagok, az alloszterikus hatású anyagok, például, amelyek a ligandumkötő hely vonatkozásában nem kompetitív módon hatnak. Ezek az anyagok vagy peptid, vagy nem peptid természetű anyagok lehetnek.

Ezeket az anyagokat célszerűen sorozathígításban visszük a sejtekre, hogy lehetőleg széles koncentrációtartományt fogjunk át. Az inkubációs időt empirikusan állapítjuk meg úgy, hogy például az adott tesztsejteket ismert receptoragonistákkal kezeljük, és meghatározzuk azt az időpontot, amikortól a riportergén-expresszió indukciója reprodukálhatóan mérhető. Az inkubációs időt általában erre az időpontra állítjuk be, ami általában legalább 1 órát tesz ki. A sejtszám elsősorban a mérési szignál kimutatási határához és a sejtek növekedési fokához igazodik, az alsó határt ezenkívül az a technikai lehetőség határozza meg, hogy a sejteket hogyan tudjuk egyenletesen elosztani a tesztegységekben. A 96 tartályos mikrotitráló lemezek használata esetén a sejtszám körülbelül 1 OOO-től 100 000-ig teljed tesztegységenként, azonban a mérési szignál megfelelő érzékenysége és a sejtek pontos eloszthatósága esetén kisebb is lehet. A növekedési fok, amelyre a sejteket beállítjuk, a kiindulási sejt típusának specifikus tulajdonságaitól fiigg, egyébként elsősorban a mindenkori receptor határozza meg (a különböző receptorokat ugyanaz az effektor rendszer a növekedési fok alapján különbözőképpen, illetve különböző erősséggel aktiválhatja); a növekedési fokot és a sejtszámot ezért előkísérletekben ugyancsak empirikusan határozzuk meg, amikor is a riportergén-expresszió kinetikáját különböző növekedési fokú előzetes tesztsejtekben és tesztsejtekben határozzuk meg.

A találmányi leírásban bemutatjuk, hogy az IL-5 receptort kifejező sejtek, amelyeket szenzor-DNS-sel transzformáltunk, az IL-5 receptor természetes ligandumának, azaz IL-5-nek a hozzáadására úgy reagálnak, hogy a riportergén expressziója indukálódik. (Egyrészt olyan egérsejteket vizsgáltunk, amelyek a β-alegységet természetes módon fejezik ki és amelyeket pótlólag α-alegységgel transzformáltunk, másrészt humán sejteket is, amelyek a működőképes IL-5 receptorhoz szükséges mindkét alegységet kifejezték.) Az alkalmazott szenzor-DNS szabályozóelemként a humán ICAM-1 gén - amely többek között egy TRE elemet tartalmaz - 1,3 kb méretű 5’-szabályozó szakaszát vagy a humán c-fos gén - amely többek között egy TRE, egy CRE és egy SRE elemet tartalmaz 0,756 kb méretű 5’-szabályozó szakaszát tartalmazta. Ha ezeket a sejteket, amelyek endogén IL-3 és GM-CSF receptorokat tartalmaznak, IL-3-mal, vagy GM-CSF-fel stimuláltuk, a riportergén expressziójának indukciója szintén mérhető volt. A kontrolisejtekben, amelyek az IL-5 receptor α-alegységének (amely a ligandumnak a receptorhoz való kötődését közvetíti) a hiányáig azonosak voltak az előzőleg használt sejtekkel, a riportergén epresszióját IL-3-mal vagy GM-CSF-fel való kezeléssel szintén lehetett indukálni, de IL-5-kezeléssel nem.

A találmány segítségével érzékeny és sokoldalú funkciós eljárást bocsátunk rendelkezésre olyan anyagok felkutatásához, amelyek IL-5 receptorfüggő módon egy vagy több jelátvivő utat a sejtben specifikusan befolyásolnak. A találmány szerinti eljárás segítségével felderített anyagok olyan betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerek kifejlesztéséhez szolgálnak vezéranyagok gyanánt, amelyek az IL-5 receptor, illetve a hozzá kapcsolódó jelátvivő út hiányos működésével vannak kapcsolatban, és amelyeket a továbbiakban egy második szűréssel - például antagonisták esetében egy proliferációs vizsgálatban, sejtvonalak vagy primer sejtek alkalmazásával, végül állatkísérlettel kiegészítve - közelebbről is vizsgálhatunk farmakológiai tulajdonságaikra nézve. A szükséges állatok szá9

HU 220 345 B ma a találmány szerinti eljárás beiktatása révén jelentősen csökkenthető.

A találmány szerinti eljárás ezenkívül azzal az eredménnyel jár, hogy automatizálható, azaz a sejttenyésztő tartályok, például a 96 tartályos mikrotitráló lemezek töltését, a tesztanyagot tartalmazó oldatok letöltését, az inkubációs és mosási lépéseket, valamint a mérést például luciferáz riportergéntermék esetében luminométerrel - robotkészülékekkel végezhetjük el. A találmány szerinti eljárás tehát nagy teljesítményű szűrőprogram megvalósítására alkalmas, azaz ilyen módon például hetenként 2000 anyag, illetve anyagkeverék vizsgálható meg.

A találmány szerinti eljárással lehetővé válik, hogy alloszterikusan ható anyagokat és a ligandumkötő hely vonatkozásában nem kompetitív hatású anyagokat is kimutathassunk.

A találmány szerinti eljárás révén továbbá lehetővé válik olyan receptorok klónozása, amelyeknek a farmakológiái vagy biokémiai vizsgálatát elvégeztük és ligandumait ismerjük. Ebben az esetben cDNS- vagy genomiális gyűjteményekből indulunk ki, és az innen kapott anyaggal transzformáljuk a megfelelő sejtvonalakat. A receptor expresszióját egy riportergén expressziója révén észlejük, miután a receptort egy ligandummal való kötődése aktiválta.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.

1. ábra: pBHlucl.3 szenzor-DNS-plazmid, amely az

ICAM-1 gén promoter szakaszát tartalmazza.

2. ábra: pBHfosluci szenzor-DNS-plazmid, amely a c-fos gén promoter szakaszát tartalmazza.

3. ábra: a pBHlucl.3 és a pBHfosluci indukciója receptorstimulációval 1H3 sejtekben.

4. ábra: a pBHlucl.3 indukciója receptorstimulációval egér-FDC-Pl sejtekben.

5. ábra: a pBHlucl.3 indukciója receptorstimulálással humán TF-1 sejtekben.

6. ábra: TF-1 sejtek proliferációjának indukciója receptorstimulálással.

1. példa

Riporterplazmidok előállítása második messengerekkel szabályozható elemekkel (szenzor-DNS).

a) a pBHlucl.3 plazmid szerkesztése.

Az ICAM-1 intercelluláris adhéziós molekulát meghatározó humán gén 1,3 kb méretű 5'-határszakaszának klónozása és deléciós analízise kimutatta, hogy ez a fragmentum i) az A549 tüdőkarcinóma-sejtvonalban (ATCC CCL 185) TPA-val indukálható, és ii) hogy egy TGATTCA DNS-szekvenciával rendelkező TPA reszponzív elemet (TRE) tartalmaz (Voraberger et al., 1991). A pBHlucl.3 plazmid (1. ábra) tartalmazza az ICAM-1 gén 1,3 kb hosszú szabályozószakaszát, amely a luciferáz gén elé van bekötve. Előállítását Vorabergerék írták le 1991-ben.

b) A pBHfosluci plazmid szerkesztése.

A pBHfosluci plazmid luciferáz gént tartalmaz a humán c-fos gén promoterének szabályozása alatt. A cfos gén különböző szabályozóelemeket, például TRE,

CRE elemeket és SRE elemet tartalmaz. A pfosCAT plazmidból egy fragmentumot izoláltunk, amely a c-fos promotert öleli fel (-711-től +45-ig terjedő szakasz) [Schönthal et al., Cell 54, 325-334 (1988)], amelyet beklónoztunk a pBHluescriptSK (Stratagene) vektorba, és a pBHluc szerkezetet (Voraberger et al., 1991) a luciferáz gén elé építettük be.

A pfosCAT plazmidot (Schönthal et al., 1988) Xbal-gyel és HindlII-mal hasítjuk. A c-fos promotert tartalmazó 756 bp méretű fragmentumot izoláljuk, és az Xbal-gyel és HindlII-mal hasított pBluescript vektorba ligáljuk. Az E. coli-sejtek transzformálása után kapott plazmidok közül egyet pBSfos-nak neveztünk. A pBSfos plazmidot Xbal-gyel hasítottuk, majd a plazmid-DNS végeit Klenow-enzim és a négy dNTP hozzáadása révén tompa („blunt”) végekké alakítottuk, végül Sall-gyel hasítottuk. A Sall/blunt fragmentumot, amely a c-fos promotert tartalmazta, izoláltuk. A pBHluc plazmidot (Voraberger et al., 1991) HindlIImal hasítottuk, a DNS-végeket tompa végekké alakítottuk, majd Sall-gyel hasítottuk. A c-fos promotert tartalmazó így hasított vektort a Sall/blunt fragmentummal ligáltuk. Az E. coli-sejtek transzformálása után kapott plazmid pBHfosluci elnevezést kapott.

2. példa

A szenzor-DNS receptorközvetített indukciója

Annak bemutatása érdekében, hogy olyan sejtekben, amelyek IL-5 receptort fejeznek ki, a receptor egy agonista hatású anyaggal való stimulálása után a szenzor-DNS indukálódik, egy egér- és egy humán sejtvonalat ideiglenesen szenzor-DNS-sel (pBHluc 1.3 vagy pBHfosluci) transzfektáltunk:

FDC-P1 sejtekből - csontvelősejtekből elkülönített faktorfuggő sejtvonal (Dexter et al., 1980 - egér1H3 sejteket állítottunk elő egér-IL-5 receptor aalegységével való transzformáció révén, a következőképpen: egér-IL-5 receptor α-alegységét (Takaki et al., 1990) kódoló cDNS-t szintetizáltunk reverz transzkriptáz - PCR reakcióban [Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8 998-9 002 (1988)] olyan RNS használatával, amelyet BCL1 sejtvonalból - 5Blb klón (ATCC TIB 197) - izoláltunk. Az alkalmazott primerek a következők voltak: MF71 (1. számú szekvencia) (5’-TCGGCTACCATGGTGCCTGTG-3’) és MF73 (2. számú szekvencia) (5’-ATGGCAAAATGCCATCAAAACGTG-3’); ezek a szekvenciák a receptor-aalegységet (Takaki et al., 1990) kódoló szakaszt határolják. (A szekvencia-jegyzőkönyvben ezeket az oligodezoxiribonukleotidokat „cDNS”-eket adjuk meg.) Az 1272 bp méretű PCR terméket a pUC19 plazmid (Pharmacia) Smal hasítási helyére szubklónoztuk. A kódolószekvenciát BamHI-gyel és EcoRI-gyel hasítottuk ki, és az ugyanezen enzimekkel hasított pcDNAI expressziós plazmidba (Invitrogen) építettük be. A linearizált plazmid 25 pg-jával 4χ10^{1 * * * * * 7} FDC-P1 sejtet transzfektáltunk elektroporáció segítségével (300 V, 960 pF; BioRad Gene Pulser). Az IL-5 receptort kifejező sejteket RPMI 1640 táptalajon - egér IL-5-tel kiegészítve - szelektáltuk.

HU 220 345 Β

Ennélfogva az 1H3 sejtek, ellentétben az FDC-P1 sejtekkel, amelyek csak IL-5 receptor βalegységet fejeznek ki, működőképes IL-5 receptort (a- plusz β-alegység) fejeznek ki. Az 1H3 sejteknek és az FDC-P1 sejteknek endogén IL-3 és GM-CSF receptoraik vannak. A β-alegység az IL-5-, IL-3- és GM-CSF-receptomál azonos.

A TF-1 humán sejtvonal egy eritroleukémiás beteg csontvelősejtjeiből származik Kitamuráék leírása (1989) szerint. A sejtek működőképes IL-5, IL-3 és GM-CSF receptorokat fejeznek ki, és proliferációjuk a három hematopoetikus növekedési faktor egyikének jelenlététől függ (Kitamura et al., 1989,1991).

Az 1H3, illetve TF-1 sejtek szenzor-DNS-sel való transzfekciója után egy nappal a sejteket faktormentes táptalajban tartottuk mintegy 12 óra hosszat, és ezután a receptorspecifikus IL-5 ligandummal kezeltük. Az 1H3 sejtek negatív kontrolljaként ugyanezt a kísérletet egér-FDC-Pl sejtekkel is elvégeztük, amelyek nem fejeznek ki működőképes IL-5 receptort. További kontrollkísérletekben az 1H3, FDC-P1, illetve TF-1 sejteket IL-5 helyett IL-3-mal vagy GM-CSF-fel kezeltük.

a) A pBHlucl.3 és pBHfosluci plazmidok indukálása receptorstimulációval 1H3 sejtekben.

A működőképes IL-5 receptort kifejező 1H3 sejtvonalat 10% hőinaktivált fetális borjúszérumot (FCS) és 1% egér-tonicitáskiegészítőt (1 M nátrium-klorid, 0,1 M nátrium-piruvát, 11,3 M monotio-glicerin) tartalmazó RPMI 1640 táptalajban (GIBCO) körülbelül 500 egység/ml IL-5 (rekombináns IL-5) hozzáadása mellett, 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben tenyésztjük. Egy-egy transzfekcióhoz körülbelül 3xl0⁷ sejtet centrifugálunk 5 percig 1 000 fordulat/perc mellett, és 200 pl táptalajban - amely az összes kiegészítőt tartalmazza - reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 10⁷ sejtre számítva 15 pg plazmidDNS-t adunk, majd a térfogatot 400 pl-re töltjük fel komplett táptalajjal. A sejteket BioRad Gene Pulser készülékben 300 V (áramlöket) és 960 pF mellett elektroporációval transzfektáljuk, és ezután friss, komplett táptalajban IL-5 hozzáadásával egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A következő napon a sejteket 5 percig 1 000 fordulat/perc mellett lecentrifugáljuk, és IL-5-mentes komplett táptalajjal kétszer mossuk. A sejteket IL-5 mentes komplett táptalajban reszuszpendáljuk, és egy éjszakán át tovább inkubáljuk. Az indukcióhoz a sejteket újból lecentrifugáljuk, majd 60 ml faktormentes táptalajban reszuszpendáljuk, és a szuszpenziót három szövettenyésztő palackba osztjuk el egyenlően. Az egyik palack sejtjeit nem indukáljuk, és a luciferáz-assay időpontjáig faktormentes táptalajban tartjuk (negatív kontroll), a másik két palackhoz 1 000 egység/ml IL-5-öt, illetve IL-3-at adunk. A sejteket 8 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd lecentrifugáljuk, és PBS-sel mossuk. A sejteket ezután 500 pl Lyse-Assay pufferben [25 mM tricin, 0,5 mM EDTA, 0,54 mM nátrium-tripolifoszfát, 6,5 mM ATP, 16,3 mM magnézium-szulfát - víz (1/7), 0,1% Triton X-100,0,05 mM luciferin; pH 7,8] vesszük fel. A reakcióelegy 400 pl-éhez 20 pl luciferint (1 mM) adunk és Luminometer Lumat 9501 készülékben (Berthold) mérjük. A kísérlet eredményét a 3. ábrán mutatjuk be. Látható, hogy mindkét szenzor-szerkezet - pBHlucl.3 és pBHfosluci - IL-5 révén több mint tízszeres mértékben indukálható. A sejtek IL-3-mal való stimulálása az endogén IL-3 receptorok révén ugyancsak mindkét szenzorszerkezet indukcióját eredményezi.

b) A pBHlucl.3 indukálása receptorstimulálással FDC-P1 sejtekben.

Az FDC-P1 sejtvonalat (Dexter et al., 1980) RPMI 1640 táptalajban (GIBCO) - ugyanazon adalékanyagokkal kiegészítve, mint amit a) alatt az 1H3 sejteknél leírtunk - tenyésztjük, azonban IL-5 helyett körülbelül 500 egység/ml IL-3 hozzáadása mellett. Körülbelül 4 χ 10⁷ sejtet - mint a)-nál leírtuk, elektroporációval 15 pg pBHlucl.3 DNS/10⁷ sejt mennyiségű plazmiddal transzfektálunk. A sejteket inkubáljuk, és IL-3-mentes táptalajban tartjuk. A sejteket négy szövettenyésztő palackba osztjuk el egyenlően. Az egyik palackban lévő sejteket a luciferáz-assay kivételéig faktormentes táptalajban tartjuk (negatív kontroll), a három másik palackot 1 000 egység/ml IL-5, IL-3, illetve GM-CSF-fel kezeljük. Nyolc órás inkubálás után - mint a) alatt leírtuk - elvégezzük a luciferáz-assay-t. A kísérlet eredményét a 4. ábrán mutatjuk be. A szenzor-DNS pBHlucl.3 az FDC-P1 sejtekben, amelyek csak IL-5 receptor βalegységet fejeznek ki, és a ligandumkötő a-alegység hiányzik belőlük, IL-5-tel nem indukálható. Ezzel ellentétben a sejtek IL-3-mal vagy GM-CSF-fel való kezelése - mint az 1H3 sejtekben - a jelen lévő endogén IL-3 és GM-CSF receptorok stimulációján keresztül a szenzor-DNS indukációjához vezet.

c) A pBHfosluci indukálása receptorstimulálással TF-1 sejtekben.

A TF-1 sejtvonalat 10% hőinaktivált fetális botjúszérummal (FCS) kiegészített RPMI 1640 táptalajban, amelyhez 1 ng/ml IL-3-at adtunk, 37 °C-on, 5% széndioxid-tartalmú légtérben tenyésztjük. Egy-egy transzfekcióhoz körülbelül 3xl0⁷ sejtet használunk; a sejteket 5 percig 1 000 fordulat/perc mellett centrifugáljuk, és 200 pl táptalajban, mely minden adalékot tartalmaz, reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 10⁷ sejtre számítva 15 pg plazmid-DNS-t adunk, majd a térfogatot 400 pl-re töltjük fel komplett táptalajjal. A sejteket BioRad Gene Pulser készülékben 280 V (áramlöket) és 980 pF mellett elektroporációval transzfektáljuk, ezután friss, komplett táptalajban, IL-3 hozzáadásával egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A következő nap a sejteket 1 000 fordulat/perc mellett 5 percig centrifugáljuk, és IL-3 mentes komplett táptalajjal kétszer mossuk. A sejteket faktormentes komplett táptalajban reszuszpendáljuk, és egy éjszakán át tovább inkubáljuk. Az indukcióhoz a sejteket újból lecentrifugáljuk, 60 ml faktormentes táptalajban reszuszpendáljuk, és négy szövettenyésztő palackba osztjuk el egyenlően. Az egyik palack sejtjeit nem indukáljuk, és a luciferáz-assay időpontjáig faktormentes táptalajban tartjuk (negatív kontroll). A másik három palackhoz körülbelül 10 ng/ml IL-5-öt, illetve 1 ng/ml IL-3-at, illetve 100 ng/ml

HU 220 345 Β

GM-CSF-et mérünk. A sejteket 8 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd lecentrifugáljuk, és PBS-ben mossuk. A sejteket ezután 500 μΐ Lyse-Assay pufferben [25 mM tricin, 0,5 mM EDTA, 0,54 mM nátrium-tripolifoszfát, 6,5 mM DTT, 16,3 mM magnézium-szulfát - víz (1/7), 0,1% Triton X-100, 1,2 mM ATP, 0,05 mM luciferin; pH 7,8] vesszük fel. A reakcióelegy 400 μΐ-éhez 20 μΐ luciferint (1 mM) adunk, és Luminometer Lumat 9 501 készülékben (Berthold) mérjük. A kísérlet eredményét az 5. ábrán mutatjuk be. Az ábrán látható, hogy a pBHfosluci szenzorszerkezet IL-5-tel, valamint IL-3-mal és GM-CSF-fel egyaránt indukálható.

d) A TF-1 sejtek proliferációjának indukálása receptorstimulálással.

Annak bemutatása céljából, hogy a TF-1 sejtek amelyek IL-5 receptort fejeznek ki - receptoruknak egy agonistaként ható anyaggal való stimulálása után proliferálnak, a sejteket 96 tartályos mikrotitráló lemezekre oltjuk. Két lemezre tartályonként 100 μΐ 2% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 táptalajban 3 χ 10⁷ sejtet mérünk be. Minden lemezen három tételt IL-5 nélkül inkubálunk (negatív kontrollok), három-három tételt pedig 0,001%, 0,01%, illetve 0,1% rekombináns humán IL-5 hozzáadásával. Az első lemezen lévő tételekhez 48 órás 37 °C-on való inkubálás után, a második lemezen lévő tételekhez 72 órás 37 °C-on való inkubálás után tartályonként 1 pCi [6-³H]-timidin-t (Amersham) adunk, és mindegyiket további 12 órán át inkubáljuk. A lemezeket ezután -20 °C-on tároljuk a timidinbeépülés méréséig. A mérést Packard FilterMate Cell Harvester és TopCount Microplate Scintillation Counter készülék segítségével végezzük el. Az eredmény a 6. ábrán látható. A timidinbeépülés a legmagasabb IL-5koncentrációnál (0,1%) az IL-5-mentes táptalaj kontrollsejtjeinek értékeihez képest 48 órás inkubációs idő után 8,1-szeres, és 72 órás inkubációs idő után 8,7szeres értéket adott.

SZEKVENCIAJEGYZÉK Az 1. számú szekvencia adatai

I. A szekvencia jellemzői

(A) hosszúság:	21 bázispár
(B) típus:	nukleinsav
(C) száltípus:	egyszálú
(D) topológia:	lineáris
II. A molekula típusa:	cDNS
IV. Antiszensz-e?	nem
IX. Sajátosságok:
(A) név/jel:	5’UTR
(B) helyzet:	1...21
XI. Az 1. számú szekvencia leírása:
TCGGCTACCA TGGTGCCTGT
A 2. számú szekvencia adatai
I. A szekvencia jellemzői
(A) hosszúság:	24 bázispár
(B) típus:	nukleinsav
(C) száltípus:	egyszálú
(D) topológia:	lineáris
II. A molekula típusa:	cDNS
IV. Antiszensz-e?	nem

IX. Sajátosságok:

(A) név/Jel: 5’UTR (B) helyzet: 1...24

XI. A 2. számú szekvencia leírása:

ATGGCAAAAT GCCATCAAAA CGTG 24

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás valamely anyag receptorfüggő jelátvivő útra kifejtett moduláló hatásának meghatározására emberi vagy állati sejtben, azzal jellemezve, hogy meghatározzuk az anyag moduláló hatását az interleukin-5 receptor aktiválása által kiváltott jelátvivő út egy alkotórészére úgy, hogy olyan emlőssejteket inkubálunk a vizsgálandó anyaggal,

a) amelyek egy riportergént és egy olyan szabályozószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amely az interleukin-5 receptorfuggő jelátvivő út egy vagy több másodlagos messengerének koncentrációváltozására úgy reagál, hogy a riportergén expresszióját egy messenger koncentrációváltozása modulálja, és továbbá,

b) amelyek működőképes interleukin-5 receptort fejeznek ki, majd mérjük a riportergén termékét, és megvizsgáljuk, hogy a tesztanyag megállapított hatása szelektív-e az interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő útra, amikor az anyagot azonos feltételek mellett olyan kontrollemlőssejtekkel hozzuk össze, amelyek egy, az interleukin-5 receptortól eltérő kontrollreceptort fejeznek ki, és amelyek olyan rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amely a riportergént és egy, a kontrollreceptor-függő jelátvivő út egy másodlagos messengerének koncentrációváltozására reagáló szabályozószekvenciát tartalmaz, majd összehasonlítjuk a riportergéntermék koncentrációját az interleukin-5 receptor kifejező sejtekben és a kontrolisejtekben.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgált anyagot az interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő útra kifejtett antagonista hatására vizsgáljuk úgy, hogy interleukin-5-öt is adunk a sejtekhez.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyek működőképes interleukin-5 receptort a természetben kifejeznek.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyek a természetben csak az interleukin-5 receptor β-alegységet fejezik ki, és amelyek olyan rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amely az interleukin-5 receptor a-alegységét kódoló szekvenciát tartalmazza, és így a sejtek működőképes interleukin-5 receptort fejeznek ki.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns DNS-sel transzformált sejteket használunk, amelyek az interleukin-5 receptor aalegységét és β-alegységét kódoló szekvenciákat tartalmazzák, és így a sejtek működőképes interleukint fejeznek ki.
6. A 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyekben az a12

HU 220 345 Β alegységet és a β-alegységet kódoló DNS-szekvenciák két külön plazmidon helyezkednek el,
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyek működőképes humán interleukin-5 receptort fejeznek ki.
8. Az 1 -6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyek működőképes egérinterleukin-5 receptort fejeznek ki.
9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyek olyan működőképes interleukin-5 receptort fejeznek ki, amelynek α-alegysége és β-alegysége különböző fajokból származik.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyekben az aalegység humán eredetű.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyekben az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS szabályozószekvenciaként a cfos gén promoterét tartalmazza.
12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyekben az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS szabályozószekvenciaként az ICAM-1 gén promoterét tartalmazza.
13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket használunk, amelyekben az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS riportergénként luciferáz gént tartalmaz.
14. A 2-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tesztanyagot antagonista hatására vizsgáljuk úgy, hogy azokat a sejteket, amelyek más növekedési faktorok receptorai mellett a működőképes interleukin-5 receptort is kifejezik, és növekedésük legalább egy ilyen receptor ligandumának jelenlététől függ, egyrészt csak interleukin-5-tel, másrészt interleukin-5-tel és a tesztanyaggal együtt inkubáljuk, majd a két sejttenyészet proliferációját összehasonlítjuk.
15. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyag interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő útra kifejtett moduláló hatásának szelektivitását úgy ellenőrizzük, hogy az anyagot azonos körülmények között olyan kontrollemlóssejtekkel hozzuk össze, amelyek egy interleukin-5 receptortól eltérő kontrollreceptort fejeznek ki, és amelyek az 1. igénypont a) pontjában meghatározott olyan rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amelynek szabályzószekvenciája nemcsak az interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő út, hanem a kontrollreceptor-függő jelátvivő út egy vagy több másodlagos messengerének koncentrációváltozására is reagál, majd összehasonlítjuk a riportergéntermék koncentrációját az interleukin-5 receptort kifejező sejtekben és a kontrolisejtekben.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kontrollemlőssejteket alkalmazunk, amelyekben a kontrollreceptor az interleukin-3 receptor.
17. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejteket is inkubálunk azonos körülmények között a vizsgálandó anyaggal, amelyek az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, és amelyek nem fejeznek ki működőképes interleukin-5 receptort, és mérjük a riportergéntermék koncentrációját.
18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szűrővizsgálatként alkalmazzuk, amelyben a vizsgálandó anyag számos anyag egyike, amelyeket előre meghatározott számú emlőssejttel, előre meghatározott körülmények között inkubálunk, méljük a riportergéntermék koncentrációját, és ellenőrizzük az anyagok szelektivitását az interleukin-5függő jelátvivő útra.
19. Emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy a) egy riportergént és egy olyan szabályozószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amely egy, az interleukin-5 receptorfüggő jelátvivő út egy vagy több másodlagos messengerének koncentrációváltozására reagál, és b) az interleukin-5 receptor aalegységét vagy α-alegységét és β-alegységét kódoló rekombináns DNS-sel vannak transzformálva úgy, hogy működőképes interleukin-5 receptort fejeznek ki.
20. A 19. igénypont szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy humán sejtek.
21. A 19. igénypont szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy egérsejtek.
22. A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy természetes állapotban csak az interleukin-5 receptor β-alegységét fejezik ki, és olyan rekombináns DNS-sel vannak transzformálva, amely az α-alegységet kódoló szekvenciát tartalmazza.
23. A 22. igénypont szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az α-alegység más fajból származik.
24. A 22. igénypont szerinti humán sejtek, azzal jellemezve, hogy humán α-alegységet kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel vannak transzformálva.
25. A 22. igénypont szerinti egérsejtek, azzal jellemezve, hogy egér α-alegységet kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel vannak transzformálva.
26. A 19-25. igénypontok bármelyike szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS szabályozószekvenciaként a c-fos gén promoterét tartalmazzák.
27. A 19-25. igénypontok bármelyike szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS szabályozószekvenciaként az ICAM-1 gén promoterét tartalmazzák.
28. A 19-27. igénypontok bármelyike szerinti emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont a) pontjában meghatározott rekombináns DNS riportergénként a luciferáz gént tartalmazzák.