JP2001521757A - フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸分子および長鎖イヌリンの製造方法 - Google Patents
フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸分子および長鎖イヌリンの製造方法Info
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-
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Abstract
(57)【要約】
フルクトシルトランスフェラーゼの酵素活性を有する蛋白質をコードする核酸分子について記載する。これらの酵素はフルクトシルトランスフェラーゼ（FFT）である。さらに、本発明の核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、特に形質転換された植物細胞、植物組織および、それらから再生可能で前述のFFTを発現する植物について記載する。さらに、前述の蛋白質、宿主、特に植物細胞および／またはそれらにより産生されるFFTを用いることによる、長鎖イヌリンを製造するための方法を記載する。
Description
【０００１】 本発明は、フルクトシルトランスフェラーゼ（FFT）の酵素活性を有する蛋白 質をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、このような核酸分子を含むベ
クター、ならびに該核酸分子によって形質転換された宿主細胞、特に植物細胞、
植物組織および植物にも関する。さらに、FFTをコードする核酸分子の導入によ って長鎖イヌリンを合成するトランスジェニック植物の製造法を記載する。本発
明はまた、FFTを製造するための方法および様々な宿主生物、特に植物における 長鎖イヌリンの製造に関し、また本発明のFFTを用いて長鎖イヌリンを製造する ためのインビトロでの方法にも関する。本発明はさらに、本発明の宿主細胞と、
本発明の方法によって得られるイヌリンにも関する。
クター、ならびに該核酸分子によって形質転換された宿主細胞、特に植物細胞、
植物組織および植物にも関する。さらに、FFTをコードする核酸分子の導入によ って長鎖イヌリンを合成するトランスジェニック植物の製造法を記載する。本発
明はまた、FFTを製造するための方法および様々な宿主生物、特に植物における 長鎖イヌリンの製造に関し、また本発明のFFTを用いて長鎖イヌリンを製造する ためのインビトロでの方法にも関する。本発明はさらに、本発明の宿主細胞と、
本発明の方法によって得られるイヌリンにも関する。
【０００２】 水溶性の直線状ポリマーは、例えば水系の粘度を上げるため、界面活性剤とし
て、懸濁化剤として、または沈降を早めるため、および水を複合化するだけでな
く結合させるためといった様々な適用が可能である。例えばフルクトシル多糖と
いった糖類を基にするポリマーは、生体分解性であるため特に興味深い原料であ
る。
て、懸濁化剤として、または沈降を早めるため、および水を複合化するだけでな
く結合させるためといった様々な適用が可能である。例えばフルクトシル多糖と
いった糖類を基にするポリマーは、生体分解性であるため特に興味深い原料であ
る。
【０００３】 工業生産および処理用の再生原料としての適用とは別に、フルクトシルポリマ
ーは、例えば甘味料といった食品添加物としても考えられる。様々な用途のため
に、異なる鎖長のポリマーが必要とされる。食品加工業においては短鎖および中
鎖ポリマーが特に好ましいが、界面活性剤の産生などの工業的用途には重合度（
DP）の高いポリマーが必要である。
ーは、例えば甘味料といった食品添加物としても考えられる。様々な用途のため
に、異なる鎖長のポリマーが必要とされる。食品加工業においては短鎖および中
鎖ポリマーが特に好ましいが、界面活性剤の産生などの工業的用途には重合度（
DP）の高いポリマーが必要である。
【０００４】 これまでは、細菌由来のフルクトシルトランスフェラーゼが発現される、植物
中で長鎖フルクタン多糖を製造する方法のみが記載されている。ほとんどの細菌
フルクトシルトランスフェラーゼは、多くのβ-2,1-分枝を有するβ-2,6連結フ ルクトシルポリマーのレバンを合成する。その多くの分枝のために、レバンを工
業加工する際には決定的不都合があり、したがって工業原料としてはイヌリンに
比べてかなり重要性が低い。これまで、その遺伝子産物がイヌリン合成に関与す
る細菌遺伝子は一つだけ、すなわちミュータンス連鎖球菌（Streptococcus muta
ns）由来のftf遺伝子だけが知られている。遺伝子が以前に遺伝子操作されてい れば、その遺伝子を植物中で発現することは、原理的には可能である。しかし、
トランスジェニック植物から得られるイヌリンの収量は非常に低いため、トラン
スジェニック植物の経済的利用は論外である。
中で長鎖フルクタン多糖を製造する方法のみが記載されている。ほとんどの細菌
フルクトシルトランスフェラーゼは、多くのβ-2,1-分枝を有するβ-2,6連結フ ルクトシルポリマーのレバンを合成する。その多くの分枝のために、レバンを工
業加工する際には決定的不都合があり、したがって工業原料としてはイヌリンに
比べてかなり重要性が低い。これまで、その遺伝子産物がイヌリン合成に関与す
る細菌遺伝子は一つだけ、すなわちミュータンス連鎖球菌（Streptococcus muta
ns）由来のftf遺伝子だけが知られている。遺伝子が以前に遺伝子操作されてい れば、その遺伝子を植物中で発現することは、原理的には可能である。しかし、
トランスジェニック植物から得られるイヌリンの収量は非常に低いため、トラン
スジェニック植物の経済的利用は論外である。
【０００５】 さらに、キクイモ（Helianthus tuberosus）由来のフルクトシルトランスフェ
ラーゼを発現するトランスジェニック植物を製造する方法が公知である。トラン
スジェニック植物においてこれらの遺伝子を発現させると、DP＝6からDP＝10の 平均的重合度のイヌリンが製造される。この程度の重合度のポリマーは長鎖イヌ
リンとは呼ばないと考えられる。平均DP＝6からDP＝10のイヌリンはほとんどの 工業的用途に不適切である。
ラーゼを発現するトランスジェニック植物を製造する方法が公知である。トラン
スジェニック植物においてこれらの遺伝子を発現させると、DP＝6からDP＝10の 平均的重合度のイヌリンが製造される。この程度の重合度のポリマーは長鎖イヌ
リンとは呼ばないと考えられる。平均DP＝6からDP＝10のイヌリンはほとんどの 工業的用途に不適切である。
【０００６】 植物における長鎖イヌリンの経済的製造法または長鎖イヌリン製造のための酵
素の合成方法が公知である。
素の合成方法が公知である。
【０００７】 PCT/US89/02729に、トランスジェニック植物細胞、具体的にはトランスジェニ
ック植物の果実における炭水化物ポリマー、特にデキストランまたはポリフルク
トースの合成の可能性が記載されている。このように改変された植物を産生する
ために、微生物、特にアエロバクター・レバニクム（Aerobacter levanicum）、
唾液連鎖球菌（Streptococcus salivarius）および枯草菌（Bacillus subtilis ）由来のレバンスクラ−ゼ、またはリゥコノストック・メゼンテロイデス（Leuc
onostoc mesenteroides）由来のデキストランスクラーゼの使用が推奨されてい る。活性酵素の生成またはレバンもしくはデキストランの生成、あるいはトラン
スジェニック植物の産生についてはいずれも記載されていない。PCT/EP93/02110
は、グラム陰性細菌エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）由来の レバンスクラーゼのIsc遺伝子を発現するトランスジェニック植物製造法を開示 している。これらの植物は高分子で分枝度の高いレバンを産生する。PCT/NL93/0
0279は、枯草菌由来sacB遺伝子またはミュータンス連鎖球菌由来ftf遺伝子を含 むキメラ遺伝子を有する植物の形質転換について記載している。sacB遺伝子を発
現するトランスジェニック植物は分枝レバンを産生する。ftf遺伝子を発現する 植物は高分子イヌリンを合成する。しかし、収量は非常に低く、経済的利用は論
外である。PCT/NL96/00012は、炭水化物ポリマーを合成する酵素をコードするDN
A配列、ならびにこれらのDNA配列を用いたトランスジェニック植物の製造につい
て開示している。開示された配列はキクイモ由来のものである。PCT/NL96/00012
によれば、開示された配列をツクバネアサガオおよびジャガイモのフルクタン特
性を改変するために用いることができるが、キクイモ自体のフルクタン特性を改
変するために用いることもできる。トランスジェニック植物においてSSTおよびF
FT遺伝子を発現するとき、イヌリンを産生することが可能である。しかし、イヌ
リンの平均重合度はDP＝6からDP＝10の範囲である。高分子イヌリンの産生は、P
CT/NL96/00012に記載の方法では不可能である。PCT/EP97/02195は、イヌリンを 産生するトランスジェニック植物をミュータンス連鎖球菌由来のftf遺伝子を用 いて製造する方法を記載している。高分子イヌリンの収量は、PCT/NL93/00279に
記載の植物の場合と同様に低い。DE19708774.4は、フルクトシルポリメラーゼ活
性を示す酵素を用いた短鎖イヌリンの製造について記載している。短鎖イヌリン
をトランスジェニック植物において製造することができる。短鎖イヌリンの収量
は高く、ジャガイモでは収量は細胞のショ糖含有量に対応する。しかし、長鎖イ
ヌリンの製造については記載されていない。
ック植物の果実における炭水化物ポリマー、特にデキストランまたはポリフルク
トースの合成の可能性が記載されている。このように改変された植物を産生する
ために、微生物、特にアエロバクター・レバニクム（Aerobacter levanicum）、
唾液連鎖球菌（Streptococcus salivarius）および枯草菌（Bacillus subtilis ）由来のレバンスクラ−ゼ、またはリゥコノストック・メゼンテロイデス（Leuc
onostoc mesenteroides）由来のデキストランスクラーゼの使用が推奨されてい る。活性酵素の生成またはレバンもしくはデキストランの生成、あるいはトラン
スジェニック植物の産生についてはいずれも記載されていない。PCT/EP93/02110
は、グラム陰性細菌エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）由来の レバンスクラーゼのIsc遺伝子を発現するトランスジェニック植物製造法を開示 している。これらの植物は高分子で分枝度の高いレバンを産生する。PCT/NL93/0
0279は、枯草菌由来sacB遺伝子またはミュータンス連鎖球菌由来ftf遺伝子を含 むキメラ遺伝子を有する植物の形質転換について記載している。sacB遺伝子を発
現するトランスジェニック植物は分枝レバンを産生する。ftf遺伝子を発現する 植物は高分子イヌリンを合成する。しかし、収量は非常に低く、経済的利用は論
外である。PCT/NL96/00012は、炭水化物ポリマーを合成する酵素をコードするDN
A配列、ならびにこれらのDNA配列を用いたトランスジェニック植物の製造につい
て開示している。開示された配列はキクイモ由来のものである。PCT/NL96/00012
によれば、開示された配列をツクバネアサガオおよびジャガイモのフルクタン特
性を改変するために用いることができるが、キクイモ自体のフルクタン特性を改
変するために用いることもできる。トランスジェニック植物においてSSTおよびF
FT遺伝子を発現するとき、イヌリンを産生することが可能である。しかし、イヌ
リンの平均重合度はDP＝6からDP＝10の範囲である。高分子イヌリンの産生は、P
CT/NL96/00012に記載の方法では不可能である。PCT/EP97/02195は、イヌリンを 産生するトランスジェニック植物をミュータンス連鎖球菌由来のftf遺伝子を用 いて製造する方法を記載している。高分子イヌリンの収量は、PCT/NL93/00279に
記載の植物の場合と同様に低い。DE19708774.4は、フルクトシルポリメラーゼ活
性を示す酵素を用いた短鎖イヌリンの製造について記載している。短鎖イヌリン
をトランスジェニック植物において製造することができる。短鎖イヌリンの収量
は高く、ジャガイモでは収量は細胞のショ糖含有量に対応する。しかし、長鎖イ
ヌリンの製造については記載されていない。
【０００８】 植物におけるイヌリンの合成が徹底的に試験されている（PollocKおよびChatt
erton、フルクタンス（Fructans）、植物の生化学（The Biochemistry of Plant
s）第14巻（1988）、Academic Press、109〜140ページ）。しかし、植物中で天 然に生じるイヌリンは短鎖フルクタンで、最大重合度はおよそDP＝35である（Po
llocKおよびChatterton、1988、上記）。植物におけるフルクタンの合成および 代謝は、少なくとも三つの酵素の活性に基づく。すなわち、三糖ケストースを生
成するショ糖依存的ショ糖-フルクトシルトランスフェラーゼ（SST）、DP＝3の 最小重合度フルクタン分子（ケストース）のフルクトシル残基をショ糖およびよ
り高分子のフルクタンに転換するフルクタン依存的フルクタン-フルクトシルト ランスフェラーゼ（FFT）、ならびにフルクタン分子からフルクトース残基を除 去するフルクタンエキソヒドロラーゼ（FEH）である。様々な植物種におけるイ ヌリンの平均分子量の差、例えばタマネギ（Allium cepa）の場合には約2x103で
キクイモの場合には5x103といった差が、それらのSST、FFTまたはFEHの異なる特
性に基づいているのかどうかは不明である。
erton、フルクタンス（Fructans）、植物の生化学（The Biochemistry of Plant
s）第14巻（1988）、Academic Press、109〜140ページ）。しかし、植物中で天 然に生じるイヌリンは短鎖フルクタンで、最大重合度はおよそDP＝35である（Po
llocKおよびChatterton、1988、上記）。植物におけるフルクタンの合成および 代謝は、少なくとも三つの酵素の活性に基づく。すなわち、三糖ケストースを生
成するショ糖依存的ショ糖-フルクトシルトランスフェラーゼ（SST）、DP＝3の 最小重合度フルクタン分子（ケストース）のフルクトシル残基をショ糖およびよ
り高分子のフルクタンに転換するフルクタン依存的フルクタン-フルクトシルト ランスフェラーゼ（FFT）、ならびにフルクタン分子からフルクトース残基を除 去するフルクタンエキソヒドロラーゼ（FEH）である。様々な植物種におけるイ ヌリンの平均分子量の差、例えばタマネギ（Allium cepa）の場合には約2x103で
キクイモの場合には5x103といった差が、それらのSST、FFTまたはFEHの異なる特
性に基づいているのかどうかは不明である。
【０００９】 このため、植物におけるイヌリン合成に関する現在の知識から見て、それを用
いることによって植物中で経済的に興味が持てる量の高分子イヌリンを合成する
ことができる、適当なDNA配列を同定することは不可能である。
いることによって植物中で経済的に興味が持てる量の高分子イヌリンを合成する
ことができる、適当なDNA配列を同定することは不可能である。
【００１０】 したがって、本発明の根底にある技術的問題は、長鎖イヌリンを生成すること
ができる遺伝的に改変された生物、特に植物の産生を可能にする核酸分子および
方法を提供することである。
ができる遺伝的に改変された生物、特に植物の産生を可能にする核酸分子および
方法を提供することである。
【００１１】 この課題は特許請求の範囲において特徴づけられる態様を提供することにより
解決される。
解決される。
【００１２】 従って、本発明はFFTの酵素活性を有するタンパク質をコードし、且つ下記の(
a)〜(e)からなる群より選択される核酸分子に関する： （a）配列番号：2および配列番号：4に示しているアミノ酸配列を含むタンパク 質をコードする核酸分子、 （b）配列番号：1または配列番号:3に示しているヌクレオチド配列または対応す
るリボヌクレオチド配列を含む核酸分子、 （c）（a）または（b）に述べられている核酸分子の相補鎖に、ストリンジェン トな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および （d）（a）、（b）または（c）のヌクレオチド配列の断片を含む核酸分子。
a)〜(e)からなる群より選択される核酸分子に関する： （a）配列番号：2および配列番号：4に示しているアミノ酸配列を含むタンパク 質をコードする核酸分子、 （b）配列番号：1または配列番号:3に示しているヌクレオチド配列または対応す
るリボヌクレオチド配列を含む核酸分子、 （c）（a）または（b）に述べられている核酸分子の相補鎖に、ストリンジェン トな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および （d）（a）、（b）または（c）のヌクレオチド配列の断片を含む核酸分子。
【００１３】 本発明の文脈において、フルクトシルトランスフェラーゼ（FFT）はフルクト ースユニット間のβ-2,1-グリコシド結合および／またはβ2,6-グリコシド結合 の生成を触媒することができる蛋白質である。これにより転移されるフルクトシ
ル残基は、1-ケストースから誘導することもでき、またはフルクタンポリマーか
ら誘導することもできる。本発明に関連して、高分子フルクタンは、その分子が
平均で20よりも多く、好ましくは25よりも多く、さらに好ましくは少なくとも32
のフルクトシル残基を含むポリマーである。さらに、高分子フルクタンは好まし
くはその分子が平均で3000未満、より好ましくは300未満、特に好ましくは100未
満のフルクトシル残基を含むポリマーである。フルクトシル残基はβ-2,1結合ま
たはβ-2,6結合のいずれによってグリコシド結合されていてもよい。イヌリンの
場合、残基は一般にβ-2,1グリコシド結合によって連結されている。程度は低い
がβ-2,6結合も生じることがあり、特に5%未満、好ましくは3%未満、より好まし
くは1.5%未満、最も好ましくは0.5%未満で生じる。フルクトシルポリマーはその
末端に、グルコースのC-1水酸基およびフルクトシル残基のC-2水酸基を介して連
結されるグルコース残基を有していてもよい。この場合、ショ糖分子もフルクト
シルポリマーに含まれる。
ル残基は、1-ケストースから誘導することもでき、またはフルクタンポリマーか
ら誘導することもできる。本発明に関連して、高分子フルクタンは、その分子が
平均で20よりも多く、好ましくは25よりも多く、さらに好ましくは少なくとも32
のフルクトシル残基を含むポリマーである。さらに、高分子フルクタンは好まし
くはその分子が平均で3000未満、より好ましくは300未満、特に好ましくは100未
満のフルクトシル残基を含むポリマーである。フルクトシル残基はβ-2,1結合ま
たはβ-2,6結合のいずれによってグリコシド結合されていてもよい。イヌリンの
場合、残基は一般にβ-2,1グリコシド結合によって連結されている。程度は低い
がβ-2,6結合も生じることがあり、特に5%未満、好ましくは3%未満、より好まし
くは1.5%未満、最も好ましくは0.5%未満で生じる。フルクトシルポリマーはその
末端に、グルコースのC-1水酸基およびフルクトシル残基のC-2水酸基を介して連
結されるグルコース残基を有していてもよい。この場合、ショ糖分子もフルクト
シルポリマーに含まれる。
【００１４】 驚くことに、本発明の核酸分子が形質転換植物において発現される際に、多量
の高分子イヌリンが生成される。植物中で生成されたイヌリンは明らかにDP＝20
よりも高い平均重合度を示す。キクイモ由来の類似の酵素がトランスジェニック
植物における平均重合度DP＝20未満のイヌリン合成に関与している（PCT/NL96/0
0012）ため、このことは予期しないことであった。
の高分子イヌリンが生成される。植物中で生成されたイヌリンは明らかにDP＝20
よりも高い平均重合度を示す。キクイモ由来の類似の酵素がトランスジェニック
植物における平均重合度DP＝20未満のイヌリン合成に関与している（PCT/NL96/0
0012）ため、このことは予期しないことであった。
【００１５】 本発明の核酸分子は、DNA分子であってもRNA分子であってもよい。対応するDN
A分子は、例えばゲノムまたはcDNA分子である。本発明の核酸分子は、天然原料 、好ましくはチョウセンアザミから単離することができ、または公知の方法によ
り合成することもできる。
A分子は、例えばゲノムまたはcDNA分子である。本発明の核酸分子は、天然原料 、好ましくはチョウセンアザミから単離することができ、または公知の方法によ
り合成することもできる。
【００１６】 従来の分子生物学的方法（例えば、Sambrook et al., 1989,「分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」,第二版 、Cold Sprin Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと
）により、様々な突然変異体を本発明の核酸分子に導入することが可能であり、
それによりおそらく改変された生物特性を有するタンパク質が合成される。これ
に関して一方では、コーディングDNA配列の5'または3'末端における進行性の欠 失によって核酸分子が産生される、欠失変異体を産生することが可能である。こ
れらの核酸分子はそれに対応して短縮された蛋白質の合成を引き起こす。核酸配
列の5'末端におけるこのような欠失によって、例えば酵素の液胞中への転流の原
因となるアミノ酸配列（移行ペプチド）を同定することができる。これにより、
対応する配列が除去されたためにもはや液胞内にはなく、細胞質ゾル内に配置さ
れるか、または他のシグナル配列が付加されたために他の区画内に配置される、
酵素の標的を定めた産生が可能となる。
グ：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」,第二版 、Cold Sprin Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと
）により、様々な突然変異体を本発明の核酸分子に導入することが可能であり、
それによりおそらく改変された生物特性を有するタンパク質が合成される。これ
に関して一方では、コーディングDNA配列の5'または3'末端における進行性の欠 失によって核酸分子が産生される、欠失変異体を産生することが可能である。こ
れらの核酸分子はそれに対応して短縮された蛋白質の合成を引き起こす。核酸配
列の5'末端におけるこのような欠失によって、例えば酵素の液胞中への転流の原
因となるアミノ酸配列（移行ペプチド）を同定することができる。これにより、
対応する配列が除去されたためにもはや液胞内にはなく、細胞質ゾル内に配置さ
れるか、または他のシグナル配列が付加されたために他の区画内に配置される、
酵素の標的を定めた産生が可能となる。
【００１７】 他方では、アミノ酸配列の改変が、例えば酵素活性または酵素の制御に影響を
およぼす位置で、点変異を誘発することも考えられる。この様式で、例えば改変
されたKm値を示す、またはアロステリック制御もしくは共有結合修飾などの細胞
内で起こる制御メカニズムの対象となることがもはやない変異体を産生すること
ができる。
およぼす位置で、点変異を誘発することも考えられる。この様式で、例えば改変
されたKm値を示す、またはアロステリック制御もしくは共有結合修飾などの細胞
内で起こる制御メカニズムの対象となることがもはやない変異体を産生すること
ができる。
【００１８】 さらに、基質または生成物特異性が改変された変異体を産生することができる
。さらに、活性-温度特性が改変された変異体を産生することができる。
。さらに、活性-温度特性が改変された変異体を産生することができる。
【００１９】 原核細胞における組換えDNAの操作において、本発明の核酸分子またはこれら の分子の部分を、DNA配列の組換えによって突然変異誘発または配列改変を生じ うるプラスミドに挿入することができる。
【００２０】 標準的方法（Sambrookら、1989、分子クローニング：実験の手引き（Molecula
r Cloning: A laboratory manual）、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory P
ress、NY、USA参照）を用いて、塩基置換を実施することもでき、または天然も しくは合成による配列を付加することもできる。DNA断片を互いに連結するため に、アダプターまたはリンカーを断片に結合してもよい。さらに、適当な制限酵
素切断部位を提供する、または余分のDNAもしくは制限酵素切断部位を除去する 操作を用いることもできる。挿入、欠失または置換を利用することができる場合
は、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーションを用
いてもよい。解析方法として通常は、配列解析、制限解析またはさらなる生化学
-分子-生物学的方法を利用する。
r Cloning: A laboratory manual）、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory P
ress、NY、USA参照）を用いて、塩基置換を実施することもでき、または天然も しくは合成による配列を付加することもできる。DNA断片を互いに連結するため に、アダプターまたはリンカーを断片に結合してもよい。さらに、適当な制限酵
素切断部位を提供する、または余分のDNAもしくは制限酵素切断部位を除去する 操作を用いることもできる。挿入、欠失または置換を利用することができる場合
は、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーションを用
いてもよい。解析方法として通常は、配列解析、制限解析またはさらなる生化学
-分子-生物学的方法を利用する。
【００２１】 本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、例えばSa
mbrookら、分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A laborator
y manual）、第2版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spr
ing Harbor、NY、に記載されているとおり、通常の条件下、好ましくはストリン
ジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件の一例は、50%ホルムアミド、5xSSC、5xデンハーツ
（Denhardt）溶液、40mMリン酸ナトリウムpH6.8、0.5%（w/v）BSA、1%（w/v）SD
S、0.1mg/mlニシン精子DNA中、42℃でのハイブリダイゼーションである。通常の
非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、前述の条件下である
が、50%の代わりに30%ホルムアミドを用いる条件下でのハイブリダイゼーション
である。ストリンジェントな条件の場合の洗浄条件は、好ましくは60℃で0.5xSS
C/0.5%SDSであり、非ストリンジェント条件の場合は、好ましくは56℃で2xSSC/0
.5%SDSである。
mbrookら、分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A laborator
y manual）、第2版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spr
ing Harbor、NY、に記載されているとおり、通常の条件下、好ましくはストリン
ジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件の一例は、50%ホルムアミド、5xSSC、5xデンハーツ
（Denhardt）溶液、40mMリン酸ナトリウムpH6.8、0.5%（w/v）BSA、1%（w/v）SD
S、0.1mg/mlニシン精子DNA中、42℃でのハイブリダイゼーションである。通常の
非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、前述の条件下である
が、50%の代わりに30%ホルムアミドを用いる条件下でのハイブリダイゼーション
である。ストリンジェントな条件の場合の洗浄条件は、好ましくは60℃で0.5xSS
C/0.5%SDSであり、非ストリンジェント条件の場合は、好ましくは56℃で2xSSC/0
.5%SDSである。
【００２２】 本発明の分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えばチョウセンアザミなど
の対応する生物から作製されたゲノムまたはcDNAライブラリーから単離すること
ができる。
の対応する生物から作製されたゲノムまたはcDNAライブラリーから単離すること
ができる。
【００２３】 このような核酸分子は、本発明の分子もしくはこれらの分子の部分、または場
合によりこれらの分子の逆相補体を用いることによって、例えば標準的方法（例
えば、Sambrookら、1989、分子クローニング：実験の手引き（Molecular Clonin
g: A laboratory manual）、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、NY参照）にしたがってのハイブリダイゼーションによって同
定および単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして、例え
ば配列番号：1もしくは配列番号：3に示される核酸配列またはその部分を正確に
または基本的に提示する核酸分子を用いることができる。ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いる断片は、通常の合成法を用いて産生され、その配列が本
発明の核酸分子の配列と基本的に類似の合成断片でもよい。
合によりこれらの分子の逆相補体を用いることによって、例えば標準的方法（例
えば、Sambrookら、1989、分子クローニング：実験の手引き（Molecular Clonin
g: A laboratory manual）、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、NY参照）にしたがってのハイブリダイゼーションによって同
定および単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして、例え
ば配列番号：1もしくは配列番号：3に示される核酸配列またはその部分を正確に
または基本的に提示する核酸分子を用いることができる。ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いる断片は、通常の合成法を用いて産生され、その配列が本
発明の核酸分子の配列と基本的に類似の合成断片でもよい。
【００２４】 本発明の核酸分子にハイブリダイズする分子は、本発明の蛋白質をコードする
前述の核酸分子の断片、誘導体および対立変異型も含む。「断片」とは、本発明
の蛋白質をコードするのに十分な長さを有する核酸分子の一部分であると考えら
れる。この文脈において、「誘導体」という用語は、これらの分子の配列が前述
の核酸分子の配列と一つまたは複数の位置で異なることを意味する。しかし、誘
導体はこれらの配列に対して高度の相同性を示す。相同性とは、少なくとも40% の配列同一性、特に少なくとも60%、好ましくは80%よりも高く、最も好ましくは
90%よりも高い同一性を意味する。これらの核酸分子によってコードされる蛋白 質は、配列番号：2に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは85%、 特に好ましくは90%よりも高く、より好ましくは95%よりも高く、さらにより好ま
しくは97%よりも高く、最も好ましくは99%よりも高い配列同一性を示す。前述の
核酸分子からの逸脱は、例えば、欠失、置換、挿入および／または組換えにより
生じうる。
前述の核酸分子の断片、誘導体および対立変異型も含む。「断片」とは、本発明
の蛋白質をコードするのに十分な長さを有する核酸分子の一部分であると考えら
れる。この文脈において、「誘導体」という用語は、これらの分子の配列が前述
の核酸分子の配列と一つまたは複数の位置で異なることを意味する。しかし、誘
導体はこれらの配列に対して高度の相同性を示す。相同性とは、少なくとも40% の配列同一性、特に少なくとも60%、好ましくは80%よりも高く、最も好ましくは
90%よりも高い同一性を意味する。これらの核酸分子によってコードされる蛋白 質は、配列番号：2に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは85%、 特に好ましくは90%よりも高く、より好ましくは95%よりも高く、さらにより好ま
しくは97%よりも高く、最も好ましくは99%よりも高い配列同一性を示す。前述の
核酸分子からの逸脱は、例えば、欠失、置換、挿入および／または組換えにより
生じうる。
【００２５】 前述の分子と相同で、これらの分子の誘導体である核酸分子は通常、これらの
分子の変種で、同じ生物学機能を有する改変体を意味する。これらは天然の変種
、例えば他の生物由来の配列、または突然変異でもよく、これらの突然変異は天
然に生じるものでもよく、または標的突然変異誘発によって誘導されたものでも
よい。さらに、これらの変種は合成により生成された配列でもよい。対立変異型
は、天然の変異型または合成もしくは組換えにより生成された変異型のいずれで
もよい。
分子の変種で、同じ生物学機能を有する改変体を意味する。これらは天然の変種
、例えば他の生物由来の配列、または突然変異でもよく、これらの突然変異は天
然に生じるものでもよく、または標的突然変異誘発によって誘導されたものでも
よい。さらに、これらの変種は合成により生成された配列でもよい。対立変異型
は、天然の変異型または合成もしくは組換えにより生成された変異型のいずれで
もよい。
【００２６】 本発明の核酸分子の様々な変異型によってコードされる蛋白質は、酵素活性、
分子量、免疫学的反応性もしくは配座またはゲル電気泳動における可動性、クロ
マトグラフィ的特性、沈降係数、溶解性、分光学的性質、安定性、至適pH、至適
温度などの物理的特性といった一定の共通する特徴を示す。
分子量、免疫学的反応性もしくは配座またはゲル電気泳動における可動性、クロ
マトグラフィ的特性、沈降係数、溶解性、分光学的性質、安定性、至適pH、至適
温度などの物理的特性といった一定の共通する特徴を示す。
【００２７】 一つの好ましい態様において、本発明の核酸配列はチョウセンアザミ（Cynara scolymus）のものである。
【００２８】 本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。これらは好まし
くはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子技術に
おいて一般的な他のベクターである。
くはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子技術に
おいて一般的な他のベクターである。
【００２９】 本発明のベクター中で、本発明の核酸分子は好ましくは、原核および／または
真核細胞中の翻訳可能RNAの転写および合成を確実にする調節エレメントに機能 的に連結されている。
真核細胞中の翻訳可能RNAの転写および合成を確実にする調節エレメントに機能 的に連結されている。
【００３０】 本発明の発現ベクターによれば、様々な宿主生物、特に細菌、真菌、藻類、動
物細胞ならびに好ましくは植物細胞および植物などの原核または真核細胞中での
長鎖イヌリンの産生が可能になる。好ましい宿主生物は、特に例えばサッカロミ
セス・セレビジエ（S. cerevisiae）などの酵母、およびストレプトコッカス・ サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ブルガリア菌（Lactobacillu
s bulgaricus）、乳連鎖球菌（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカス・
クレモリス（S. cremoris）、アシドフィルス菌（Lactobacillus acidophilus）
およびリゥコノストック・クレモリス（Leuconostoc cremoris）などの乳酸菌で
ある。コードされる酵素はおそらく、長鎖イヌリン産生のために宿主生物外でも
用いることができる。植物細胞が特に好ましい。
物細胞ならびに好ましくは植物細胞および植物などの原核または真核細胞中での
長鎖イヌリンの産生が可能になる。好ましい宿主生物は、特に例えばサッカロミ
セス・セレビジエ（S. cerevisiae）などの酵母、およびストレプトコッカス・ サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ブルガリア菌（Lactobacillu
s bulgaricus）、乳連鎖球菌（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカス・
クレモリス（S. cremoris）、アシドフィルス菌（Lactobacillus acidophilus）
およびリゥコノストック・クレモリス（Leuconostoc cremoris）などの乳酸菌で
ある。コードされる酵素はおそらく、長鎖イヌリン産生のために宿主生物外でも
用いることができる。植物細胞が特に好ましい。
【００３１】 様々な発現システムに関する調査が、例えばMethods in Enzymology 153（198
7）、385〜516、Bitterら（Methods in Enzymology 153（1987）、516〜544）、
Sawersら、Applied Microbiology and Biotechnology 46（1996）、1〜9、Billm
ann-Jacobe、Current Opinion in Biotechnology 7（1996）、500〜504、Hockne
y、Trends in Biotechnology 12（1994）、456〜463、およびGriffithsら、Meth
ods in Molecular Biology 75（1997）、427〜440に見いだされる。酵母の発現 システムは、Hensingら、Antonie van Leuwenhoek 67（1995）、261〜279、Buss
ineauら、Developments in Biological Standardization 83（1994）、13〜19、
Gellissenら、Antonie van Leuwenhoek 62（1992）、79〜93、Fleer、Current O
pinion in Biotechnology 3（1992）、486〜496、Vedvick、Current Opinion in
Biotechnology 2（1991）、742〜745、およびBuckholz、Bio/Technology 9（19
91）、1067〜1072に記載されている。発現ベクターは先行技術において多数記載
されている。選択された宿主において確実に複製するための選択マーカー遺伝子
および複製開始点とは別に、これらは転写のために通常は細菌またはウイルスプ
ロモーターと、ほとんどの場合、終止コドンを含む。プロモーターと終止コドン
との間には、少なくとも一つの制限酵素切断部位または一つのポリリンカーがあ
り、これによりコーディングDNA配列を挿入することができる。選択された宿主 生物中で作用する場合、対応する遺伝子の転写を自然に制御するDNA配列をプロ モーター配列として用いることができる。この配列は他のプロモーター配列と交
換することもできる。遺伝子の構成的発現を引き起こすプロモーター、ならびに
下流遺伝子発現の標的を定めた調節を可能にする誘導プロモーターも利用するこ
とができる。これらの性質を備えた細菌およびウイルスプロモーター配列が、先
行技術において広く記載されている。微生物（大腸菌、サッカロミセス・セレビ
ジエなど）における発現の調節配列が、先行技術において十分に記載されている
。下流遺伝子の特に強い発現を可能にするプロモーターは、例えば、T7プロモー
ター（Studierら、Methods in Enzymology 185（1990）、60〜89）、lacuv5、tr
p、trp-lacUV5（DeBoerら、RodriguezおよびChamberlin編、プロモーター、構造
と機能（Promotors, Structure and Function）；Praeger、ニューヨーク（1982
）、462〜481；DeBoerら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA（1983）、21〜25）、λp
1、rac（Borosら、Gene 42（1986）、97〜100）である。通常、蛋白質の量は微 生物の増殖周期において対数期の中程から終わりにかけて最高となる。このため
、蛋白質の合成には好ましくは誘導プロモーターを用いる。これらを用いること
により構成プロモーターに比べてより高収量の蛋白質が得られることが多い。強
度の構成プロモーターを用いると、クローニングした遺伝子の永続的転写および
翻訳を介して、他の本質的な細胞機能のためのエネルギー損失がしばしば起こり
、細胞の増殖速度を低下させる（Bernard R. Glick、Jack J. Pasternak、Molek
ulare Biotechnologie（1995）、Spektrum Akademischer Verlag GmbH、Heiderb
erg Berlin Oxford、p.342）。したがって、最適量の蛋白質を得るために、二段
階の方法がよく用いられる。最初に、宿主細胞を至適条件下で相対的に高い細胞
密度に達するまで培養する。第二段階では、用いたプロモーターの種類に応じて
転写を誘導する。この状況において、ラクトースまたはIPTG（＝イソプロピル- β-D-チオガラクトピラノシド）によって誘導されるtacプロモーターが特に適し
ている（deBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80（1983）、21〜25）。転写 の終止コドンも先行技術において記載されている。
7）、385〜516、Bitterら（Methods in Enzymology 153（1987）、516〜544）、
Sawersら、Applied Microbiology and Biotechnology 46（1996）、1〜9、Billm
ann-Jacobe、Current Opinion in Biotechnology 7（1996）、500〜504、Hockne
y、Trends in Biotechnology 12（1994）、456〜463、およびGriffithsら、Meth
ods in Molecular Biology 75（1997）、427〜440に見いだされる。酵母の発現 システムは、Hensingら、Antonie van Leuwenhoek 67（1995）、261〜279、Buss
ineauら、Developments in Biological Standardization 83（1994）、13〜19、
Gellissenら、Antonie van Leuwenhoek 62（1992）、79〜93、Fleer、Current O
pinion in Biotechnology 3（1992）、486〜496、Vedvick、Current Opinion in
Biotechnology 2（1991）、742〜745、およびBuckholz、Bio/Technology 9（19
91）、1067〜1072に記載されている。発現ベクターは先行技術において多数記載
されている。選択された宿主において確実に複製するための選択マーカー遺伝子
および複製開始点とは別に、これらは転写のために通常は細菌またはウイルスプ
ロモーターと、ほとんどの場合、終止コドンを含む。プロモーターと終止コドン
との間には、少なくとも一つの制限酵素切断部位または一つのポリリンカーがあ
り、これによりコーディングDNA配列を挿入することができる。選択された宿主 生物中で作用する場合、対応する遺伝子の転写を自然に制御するDNA配列をプロ モーター配列として用いることができる。この配列は他のプロモーター配列と交
換することもできる。遺伝子の構成的発現を引き起こすプロモーター、ならびに
下流遺伝子発現の標的を定めた調節を可能にする誘導プロモーターも利用するこ
とができる。これらの性質を備えた細菌およびウイルスプロモーター配列が、先
行技術において広く記載されている。微生物（大腸菌、サッカロミセス・セレビ
ジエなど）における発現の調節配列が、先行技術において十分に記載されている
。下流遺伝子の特に強い発現を可能にするプロモーターは、例えば、T7プロモー
ター（Studierら、Methods in Enzymology 185（1990）、60〜89）、lacuv5、tr
p、trp-lacUV5（DeBoerら、RodriguezおよびChamberlin編、プロモーター、構造
と機能（Promotors, Structure and Function）；Praeger、ニューヨーク（1982
）、462〜481；DeBoerら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA（1983）、21〜25）、λp
1、rac（Borosら、Gene 42（1986）、97〜100）である。通常、蛋白質の量は微 生物の増殖周期において対数期の中程から終わりにかけて最高となる。このため
、蛋白質の合成には好ましくは誘導プロモーターを用いる。これらを用いること
により構成プロモーターに比べてより高収量の蛋白質が得られることが多い。強
度の構成プロモーターを用いると、クローニングした遺伝子の永続的転写および
翻訳を介して、他の本質的な細胞機能のためのエネルギー損失がしばしば起こり
、細胞の増殖速度を低下させる（Bernard R. Glick、Jack J. Pasternak、Molek
ulare Biotechnologie（1995）、Spektrum Akademischer Verlag GmbH、Heiderb
erg Berlin Oxford、p.342）。したがって、最適量の蛋白質を得るために、二段
階の方法がよく用いられる。最初に、宿主細胞を至適条件下で相対的に高い細胞
密度に達するまで培養する。第二段階では、用いたプロモーターの種類に応じて
転写を誘導する。この状況において、ラクトースまたはIPTG（＝イソプロピル- β-D-チオガラクトピラノシド）によって誘導されるtacプロモーターが特に適し
ている（deBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80（1983）、21〜25）。転写 の終止コドンも先行技術において記載されている。
【００３２】 対応する蛋白質をコードするDNAによる宿主細胞の形質転換は一般に、Sambroo
kら（分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Cou
rse Manual）、第2版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニュー
ヨーク）などに記載の標準的方法を用いて実施することができる。宿主細胞の培
養は、特にpH値、温度、塩濃度、エアリング、抗生物質、ビタミン、微量成分な
どを考慮して、用いた宿主細胞それぞれの要求に対応する栄養培地中で行う。
kら（分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Cou
rse Manual）、第2版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニュー
ヨーク）などに記載の標準的方法を用いて実施することができる。宿主細胞の培
養は、特にpH値、温度、塩濃度、エアリング、抗生物質、ビタミン、微量成分な
どを考慮して、用いた宿主細胞それぞれの要求に対応する栄養培地中で行う。
【００３３】 宿主細胞によって産生された酵素の精製は、沈降、イオン交換クロマトグラフ
ィ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過、HPLC逆相クロマトグラフィなど
の通常の精製法を用いて実施することができる。
ィ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過、HPLC逆相クロマトグラフィなど
の通常の精製法を用いて実施することができる。
【００３４】 宿主細胞中で発現されたDNAを改変することによって、一定の性質により培地 から容易に単離することができるポリペプチドを宿主細胞中で産生することがで
きる。したがって、さらなるポリペプチド配列との融合蛋白質として発現される
蛋白質を発現する可能性があり、その特有の結合特性によってアフィニティクロ
マトグラフィによる融合蛋白質の単離が可能となる（例えば、Hoppら、Bio/Tech
nology 6（1988）、1204〜1210；Sassenfeld、Trends Biotechnol. 8（1990）、
88〜93）。
きる。したがって、さらなるポリペプチド配列との融合蛋白質として発現される
蛋白質を発現する可能性があり、その特有の結合特性によってアフィニティクロ
マトグラフィによる融合蛋白質の単離が可能となる（例えば、Hoppら、Bio/Tech
nology 6（1988）、1204〜1210；Sassenfeld、Trends Biotechnol. 8（1990）、
88〜93）。
【００３５】 植物細胞における発現のためには、パタチンB33プロモーターの調節エレメン トが好ましい。他の好ましいプロモーターは、35S CaMVプロモーターおよびサッ
カロミセス・セレビジエ由来アルコール脱水素酵素のプロモーターである。
カロミセス・セレビジエ由来アルコール脱水素酵素のプロモーターである。
【００３６】 本発明のベクターは、宿主生物中でベクターを安定化させるさらなる機能ユニ
ット、例えばサッカロミセス・セレビジエにおける安定化のための細菌複製開始
点または2-ミクロン-DNAを有していてもよい。さらに、ベクターはアグロバクテ
リアT-DNAの左右の末端配列を含んでいてもよく、これによって植物ゲノム中へ の安定な組込みが可能となる。
ット、例えばサッカロミセス・セレビジエにおける安定化のための細菌複製開始
点または2-ミクロン-DNAを有していてもよい。さらに、ベクターはアグロバクテ
リアT-DNAの左右の末端配列を含んでいてもよく、これによって植物ゲノム中へ の安定な組込みが可能となる。
【００３７】 本発明のベクターは、アグロバクテリア由来オクトピンシンターゼ遺伝子のタ
ーミネーターなどの、機能的ターミネーターをさらに含みうる。
ーミネーターなどの、機能的ターミネーターをさらに含みうる。
【００３８】 もう一つの態様において、本発明の核酸分子は本発明のベクター内の核酸分子
と連結されており、該核酸分子は酵素を様々な細胞区画に誘導するための機能的
シグナル配列をコードする。この改変は例えば、高等植物のアポプラストに分泌
するためのN-末端シグナル配列の付加でもよい。しかし、コードされたFFTへの シグナル配列の融合を引き起こすいかなる他の改変も、本発明の対象である。本
発明のベクターに含まれる核酸分子は、分泌を引き起こすアミノ酸配列をコード
する配列を特に含んでいてもよい。この状況において、好ましくはクレブシエラ
・オキシトカ由来α-CGTアーゼのシグナルペプチドM5A1（Fiedlerら、J. Mol. B
iol. 256（1996）、279〜291）または遺伝子バンクアクセッション番号X86014の
配列のヌクレオチド11529〜11618によってコードされるシグナルペプチドを利用
する。
と連結されており、該核酸分子は酵素を様々な細胞区画に誘導するための機能的
シグナル配列をコードする。この改変は例えば、高等植物のアポプラストに分泌
するためのN-末端シグナル配列の付加でもよい。しかし、コードされたFFTへの シグナル配列の融合を引き起こすいかなる他の改変も、本発明の対象である。本
発明のベクターに含まれる核酸分子は、分泌を引き起こすアミノ酸配列をコード
する配列を特に含んでいてもよい。この状況において、好ましくはクレブシエラ
・オキシトカ由来α-CGTアーゼのシグナルペプチドM5A1（Fiedlerら、J. Mol. B
iol. 256（1996）、279〜291）または遺伝子バンクアクセッション番号X86014の
配列のヌクレオチド11529〜11618によってコードされるシグナルペプチドを利用
する。
【００３９】 特に好ましい態様において、本発明はプラスミドp35-csFFTおよびp33-csFFTに
関し、その構築を実施例に記載する（図2および4）。
関し、その構築を実施例に記載する（図2および4）。
【００４０】 さらなる態様において、本発明は、本発明の、または宿主細胞から誘導された
核酸分子またはベクターを一時的または持続的に含む宿主細胞に関する。この状
況において、宿主細胞はインビトロで組換えDNAを取り込むことができ、また該 当する場合には本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質を合成することが
できる生物である。宿主細胞は原核細胞でもよく、また真核細胞でもよい。これ
らは特に微生物でもよい。本発明の状況において、これらは例えばSchlegel「Al
lgemeine Mikrobiologie」（George Thieme Verlag（1985）、1〜2）に定義され
ているすべての細菌および原生生物である。原核宿主生物に関して、ビフィドバ
クテリアなどの一定のヒト腸管微生物の増殖に対し、イヌリンのプラスの影響が
首尾よく示されていることに留意されたい。ビフィドバクテリアは健康的効果が
あるとされている（例えば、Gibsonら、Int. Sugar J. 96（1994）、381〜386；
Roberfroidら、J. of Nutrition 128（1998）、11〜19参照）。腫瘍抑制作用も 議論されている（例えば、Reddyら、Carcinogenesisb 18（1997）、1371〜1374 ；Singhら、Carcinogenesisb 18（1997）、833〜841参照）。このため、食品加 工業における使用には酵母（パン）または乳酸菌（ヨーグルト、バターミルクな
ど）などの本発明の宿主細胞が適している。
核酸分子またはベクターを一時的または持続的に含む宿主細胞に関する。この状
況において、宿主細胞はインビトロで組換えDNAを取り込むことができ、また該 当する場合には本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質を合成することが
できる生物である。宿主細胞は原核細胞でもよく、また真核細胞でもよい。これ
らは特に微生物でもよい。本発明の状況において、これらは例えばSchlegel「Al
lgemeine Mikrobiologie」（George Thieme Verlag（1985）、1〜2）に定義され
ているすべての細菌および原生生物である。原核宿主生物に関して、ビフィドバ
クテリアなどの一定のヒト腸管微生物の増殖に対し、イヌリンのプラスの影響が
首尾よく示されていることに留意されたい。ビフィドバクテリアは健康的効果が
あるとされている（例えば、Gibsonら、Int. Sugar J. 96（1994）、381〜386；
Roberfroidら、J. of Nutrition 128（1998）、11〜19参照）。腫瘍抑制作用も 議論されている（例えば、Reddyら、Carcinogenesisb 18（1997）、1371〜1374 ；Singhら、Carcinogenesisb 18（1997）、833〜841参照）。このため、食品加 工業における使用には酵母（パン）または乳酸菌（ヨーグルト、バターミルクな
ど）などの本発明の宿主細胞が適している。
【００４１】 特に好ましい態様において、本発明の宿主細胞はショ糖依存的ショ糖-フルク トシルトランスフェラーゼ（SST）をコードする遺伝子をさらに含む。このよう な配列は、例えば、チョウセンアザミ（ドイツ特許出願DE-A119708774）、キク ニガナ（Cichorium intibus）（de Halleuxら、Plant Physiol. 113（1997）、1
003〜1013）、キクイモ（国際公開公報第96/21023号）およびタマネギ（Vijnら 、Plant Physiol. 117（1998）、1507〜1513）から単離された。
003〜1013）、キクイモ（国際公開公報第96/21023号）およびタマネギ（Vijnら 、Plant Physiol. 117（1998）、1507〜1513）から単離された。
【００４２】 本発明は特に、本発明の核酸分子によって形質転換された、あるいは本発明の
ベクターシステムもしくは誘導体またはその部分を含むトランスジェニック植物
に関する。これらは本発明のベクターシステム、誘導体またはベクターシステム
の部分の導入によって、長鎖イヌリン産生のための酵素を合成することができる
。本発明の細胞は好ましくは、導入された本発明の核酸分子が形質転換細胞に関
して異種である、すなわちこれらの細胞中で天然には発生しないか、またはゲノ
ム内のそれぞれ天然に発生する配列とは異なる位置に配置されていることを特徴
とする。さらに、このような本発明のトランスジェニック植物細胞は好ましくは
SSTをコードするDNA配列を含む。
ベクターシステムもしくは誘導体またはその部分を含むトランスジェニック植物
に関する。これらは本発明のベクターシステム、誘導体またはベクターシステム
の部分の導入によって、長鎖イヌリン産生のための酵素を合成することができる
。本発明の細胞は好ましくは、導入された本発明の核酸分子が形質転換細胞に関
して異種である、すなわちこれらの細胞中で天然には発生しないか、またはゲノ
ム内のそれぞれ天然に発生する配列とは異なる位置に配置されていることを特徴
とする。さらに、このような本発明のトランスジェニック植物細胞は好ましくは
SSTをコードするDNA配列を含む。
【００４３】 本発明はさらに、本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質、ならびにそ
れらを製造する方法であって、本発明の宿主が該蛋白質の合成を可能にする条件
下で培養される方法に関する。続いて蛋白質を、培養された細胞および／または
培地から単離する。本発明はさらに、本発明の宿主細胞から、または本発明の方
法によって得られるFFTに関する。
れらを製造する方法であって、本発明の宿主が該蛋白質の合成を可能にする条件
下で培養される方法に関する。続いて蛋白質を、培養された細胞および／または
培地から単離する。本発明はさらに、本発明の宿主細胞から、または本発明の方
法によって得られるFFTに関する。
【００４４】 本発明はさらに、本発明の核酸分子、それに相補的な分子、またはこのような
分子の部分に特にハイブリダイズする核酸分子に関する。これらは好ましくはヌ
クレオチドが少なくとも10個、特に少なくとも15個、特に好ましくは少なくとも
50個の長さのオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、例え
ば、PCR反応のプライマーとして用いることができる。これらはまた、アンチセ ンス構築物またはリボザイムをコードするDNA分子の成分でもありうる。
分子の部分に特にハイブリダイズする核酸分子に関する。これらは好ましくはヌ
クレオチドが少なくとも10個、特に少なくとも15個、特に好ましくは少なくとも
50個の長さのオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、例え
ば、PCR反応のプライマーとして用いることができる。これらはまた、アンチセ ンス構築物またはリボザイムをコードするDNA分子の成分でもありうる。
【００４５】 本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターの植物細胞、植物組織および
植物への導入を含む、トランスジェニック植物細胞、植物組織および植物の製造
法にも関する。
植物への導入を含む、トランスジェニック植物細胞、植物組織および植物の製造
法にも関する。
【００４６】 これまでは通常の方法、例えば育種法では不可能であったが、本発明の核酸分
子を提供することにより、組換えDNA法を用いて様々な生物、特に植物中で長鎖 イヌリンを産生することが可能である。本発明のFFTの活性を上げることにより 、例えば本発明の核酸分子を過剰発現させることにより、または細胞特異的調節
メカニズムの影響をもはや受けず、且つ／もしくはその活性に関して明らかな温
度依存性を示す突然変異体を提供することにより、組換えDNA法を用い、それに 対応して改変された植物の収量を上げることが可能である。
子を提供することにより、組換えDNA法を用いて様々な生物、特に植物中で長鎖 イヌリンを産生することが可能である。本発明のFFTの活性を上げることにより 、例えば本発明の核酸分子を過剰発現させることにより、または細胞特異的調節
メカニズムの影響をもはや受けず、且つ／もしくはその活性に関して明らかな温
度依存性を示す突然変異体を提供することにより、組換えDNA法を用い、それに 対応して改変された植物の収量を上げることが可能である。
【００４７】 したがって、対応するFFTの活性を増強するために、または通常はこの酵素を 発現しない細胞中にこれを導入するために、本発明の核酸分子を植物細胞中で発
現させることが可能である。さらに、細胞特異的調節メカニズムの影響をもはや
受けないか、または改変された温度依存性、基質または生成物特異性を示す本発
明のFFTを得るために、当業者には公知の方法にしたがって本発明の核酸分子を 改変することが可能である。
現させることが可能である。さらに、細胞特異的調節メカニズムの影響をもはや
受けないか、または改変された温度依存性、基質または生成物特異性を示す本発
明のFFTを得るために、当業者には公知の方法にしたがって本発明の核酸分子を 改変することが可能である。
【００４８】 この目的のために、当業者は様々な植物形質転換システムを利用することがで
きる。したがって、植物細胞を形質転換するためのT-DNAの使用が熱心に調査さ れ、EP-A-120516；Hoekema：The Binary Plant Vector System、Offsetdrukkeri
j Kanters B.V.、Alblasserdam（1985）、第V章、Fraley、Crit. Rev. Plant. S
ci.、4、1〜46およびAn、EMBO J. 4（1985）、277〜287に記載されている。
きる。したがって、植物細胞を形質転換するためのT-DNAの使用が熱心に調査さ れ、EP-A-120516；Hoekema：The Binary Plant Vector System、Offsetdrukkeri
j Kanters B.V.、Alblasserdam（1985）、第V章、Fraley、Crit. Rev. Plant. S
ci.、4、1〜46およびAn、EMBO J. 4（1985）、277〜287に記載されている。
【００４９】 DNAを植物細胞に移入するために、植物外植片をアグロバクテリウム・ツメフ ァシエンス（Agrobacteriumtumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネ
ス（Agrobacterium rhizogenes）と適当に共培養することができる。感染植物材
料（例えば、葉、茎分節、根の断片であるが、プロトプラストまたは浮遊培養し
た植物細胞も）から、形質転換細胞の選別のために抗生物質またはバイオザイド
（biozide）を含みうる適当な培地中で完全な植物を次いで再生する事ができる 。次いで、このようにして得られた植物を、導入したDNAが存在するか否かにつ いて調べることができる。バイオリスティック法を用いることにより、またはプ
ロトプラストを形質転換することにより外来DNAを導入するための他の可能性は 、当業者には公知である（例えば、Willmitzer, L.、1993 Transgenic Plants.
Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise（H.J. Rehm、G. Reed
、A. Puhler、P. Stadler編）、第2巻、627〜659、VCH Weinheim-New York-Base
l-Cambridge参照）。
ス（Agrobacterium rhizogenes）と適当に共培養することができる。感染植物材
料（例えば、葉、茎分節、根の断片であるが、プロトプラストまたは浮遊培養し
た植物細胞も）から、形質転換細胞の選別のために抗生物質またはバイオザイド
（biozide）を含みうる適当な培地中で完全な植物を次いで再生する事ができる 。次いで、このようにして得られた植物を、導入したDNAが存在するか否かにつ いて調べることができる。バイオリスティック法を用いることにより、またはプ
ロトプラストを形質転換することにより外来DNAを導入するための他の可能性は 、当業者には公知である（例えば、Willmitzer, L.、1993 Transgenic Plants.
Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise（H.J. Rehm、G. Reed
、A. Puhler、P. Stadler編）、第2巻、627〜659、VCH Weinheim-New York-Base
l-Cambridge参照）。
【００５０】 単子葉植物の形質転換のための別のシステムは、バイオリスティック法を用い
た形質転換、電気的または化学的に誘導したDNAのプロトプラストへの取り込み 、部分的に透過性にされた細胞の電気穿孔法、DNAの花序へのマクロ注入、膨脹 を用いたDNAの小胞子および前胚へのミクロ注入である。（例えば、Lusardi、Pl
ant J. 5（1994）、571〜582；Paszkowski、Biotechnology 24（1992）、387〜3
92参照）。
た形質転換、電気的または化学的に誘導したDNAのプロトプラストへの取り込み 、部分的に透過性にされた細胞の電気穿孔法、DNAの花序へのマクロ注入、膨脹 を用いたDNAの小胞子および前胚へのミクロ注入である。（例えば、Lusardi、Pl
ant J. 5（1994）、571〜582；Paszkowski、Biotechnology 24（1992）、387〜3
92参照）。
【００５１】 アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いたTi-プラスミド-ベクターシス
テムによる双子葉植物の形質転換は十分に確立された方法ではあるが、より最近
の研究により、アグロバクテリウムに基づくベクターによる形質転換が単子葉植
物の場合にも使用できることが明らかにされている（Chanら、Plant Mol. Biol.
22（1993）、491〜506；Hieiら、Plant J. 6（1994）、271〜282；Bytebierら 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（1987）、5345〜5349；Raineriら、Bio/Tech
nology 8（1990）、33〜38；Gouldら、Plant Physiol. 95（1991）、426〜434；
Mooneyら、Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25（1991）、209〜218；Liら、Pla
nt Mol. Biol. 20（1992）、1037〜1048）。
テムによる双子葉植物の形質転換は十分に確立された方法ではあるが、より最近
の研究により、アグロバクテリウムに基づくベクターによる形質転換が単子葉植
物の場合にも使用できることが明らかにされている（Chanら、Plant Mol. Biol.
22（1993）、491〜506；Hieiら、Plant J. 6（1994）、271〜282；Bytebierら 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（1987）、5345〜5349；Raineriら、Bio/Tech
nology 8（1990）、33〜38；Gouldら、Plant Physiol. 95（1991）、426〜434；
Mooneyら、Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25（1991）、209〜218；Liら、Pla
nt Mol. Biol. 20（1992）、1037〜1048）。
【００５２】 前述の形質転換システムの三つ、すなわち植物組織の電気穿孔法、プロトプラ
ストの形質転換および再生可能な組織および細胞への粒子射撃法によるDNA移入 は、過去に様々なタイプの穀類について確立されている（総説：Jahneら、Euphy
tica 85（1995）、35〜44）。対応する文献において、コムギの形質転換が様々 な様式で記載されている（総説：Maheshwariら、Critical Reviews in Plant Sc
ience 14 (2)（1995）、149〜178）。
ストの形質転換および再生可能な組織および細胞への粒子射撃法によるDNA移入 は、過去に様々なタイプの穀類について確立されている（総説：Jahneら、Euphy
tica 85（1995）、35〜44）。対応する文献において、コムギの形質転換が様々 な様式で記載されている（総説：Maheshwariら、Critical Reviews in Plant Sc
ience 14 (2)（1995）、149〜178）。
【００５３】 本発明の核酸分子を植物中で発現させるとき、合成された蛋白質を植物細胞の
いかなる所望の区画にも配置させることは原理的には可能である。特定の区画へ
の配置を達成するために、液胞内への配置を確実にする配列を欠失させなければ
ならず、残りのコード領域を任意に、それぞれの区画内の配置を確実にするDNA 配列に連結しなければならない。このような配列は当技術分野において公知であ
る（例えば、Braun、EMBO J. 11（1992）、3219〜3227；Wolter、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 85（1988）、846〜850；Sonnewald、Plant J. 1（1991）、95〜1
06；Rocha-Sosa、EMBO J. 8（1989）、23〜29参照）。
いかなる所望の区画にも配置させることは原理的には可能である。特定の区画へ
の配置を達成するために、液胞内への配置を確実にする配列を欠失させなければ
ならず、残りのコード領域を任意に、それぞれの区画内の配置を確実にするDNA 配列に連結しなければならない。このような配列は当技術分野において公知であ
る（例えば、Braun、EMBO J. 11（1992）、3219〜3227；Wolter、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 85（1988）、846〜850；Sonnewald、Plant J. 1（1991）、95〜1
06；Rocha-Sosa、EMBO J. 8（1989）、23〜29参照）。
【００５４】 本発明はまた、本発明の核酸分子の一つまたは数個を用いて形質転換されたト
ランスジェニック植物細胞、植物組織または植物、ならびにこのようにして形質
転換された細胞から誘導されたトランスジェニック植物細胞にも関する。このよ
うな細胞は、本発明の核酸分子の一つまたは数個を含み、それにより、これ／こ
れらは好ましくは植物細胞中の転写を確実にする調節DNAエレメント、特にプロ モーターに連結されている。このような細胞は、細胞中で天然には生じない本発
明の核酸分子を少なくとも一つ含むという点で、またはこのような分子が細胞の
ゲノム内の天然には生じない部位、すなわちもう一つのゲノム環境で組み込まれ
るという点で、天然の植物細胞と異なっている。1-ケストースはFFTの天然の基 質で、それ自体ショ糖依存的ショ糖フルクトシルトランスフェラーゼ（SST）の ショ糖との反応中に生成するため、本発明の核酸分子、ベクターまたはFFTとは 別にSSTを提供することは特に有利で、おそらく必須である。したがって、好ま しい態様において、本発明はショ糖依存的ショ糖フルクトシルトランスフェラー
ゼ（SST）をコードする遺伝子をさらに含むトランスジェニック植物細胞、植物 組織または植物に関する。これらは例えば、キクニガナ、キクイモ、もしくはダ
リアなどのすでに天然にSSTを発現する植物もしくは植物細胞、または組換えDNA
法を用いてSSTをコードするDNA配列が導入された植物であってもよい。前記配列
は、独立して、または本発明の核酸分子もしくはベクターと同時に導入されたも
のでもよい。
ランスジェニック植物細胞、植物組織または植物、ならびにこのようにして形質
転換された細胞から誘導されたトランスジェニック植物細胞にも関する。このよ
うな細胞は、本発明の核酸分子の一つまたは数個を含み、それにより、これ／こ
れらは好ましくは植物細胞中の転写を確実にする調節DNAエレメント、特にプロ モーターに連結されている。このような細胞は、細胞中で天然には生じない本発
明の核酸分子を少なくとも一つ含むという点で、またはこのような分子が細胞の
ゲノム内の天然には生じない部位、すなわちもう一つのゲノム環境で組み込まれ
るという点で、天然の植物細胞と異なっている。1-ケストースはFFTの天然の基 質で、それ自体ショ糖依存的ショ糖フルクトシルトランスフェラーゼ（SST）の ショ糖との反応中に生成するため、本発明の核酸分子、ベクターまたはFFTとは 別にSSTを提供することは特に有利で、おそらく必須である。したがって、好ま しい態様において、本発明はショ糖依存的ショ糖フルクトシルトランスフェラー
ゼ（SST）をコードする遺伝子をさらに含むトランスジェニック植物細胞、植物 組織または植物に関する。これらは例えば、キクニガナ、キクイモ、もしくはダ
リアなどのすでに天然にSSTを発現する植物もしくは植物細胞、または組換えDNA
法を用いてSSTをコードするDNA配列が導入された植物であってもよい。前記配列
は、独立して、または本発明の核酸分子もしくはベクターと同時に導入されたも
のでもよい。
【００５５】 トランスジェニック植物細胞および植物組織は、当業者には公知の方法を用い
て、完全な植物に再生させることができる。本発明のトランスジェニック植物細
胞を再生させることによって得られる植物も、本発明の対象である。本発明のさ
らなる対象は、前述のトランスジェニック植物細胞を含む植物である。トランス
ジェニック植物細胞は、原理的にはいかなる所望の植物種、すなわち単子葉植物
ならびに双子葉植物であってもよい。これらは好ましくは有用植物、特にコメ、
トウモロコシ、テンサイ、サトウキビもしくはジャガイモなどのショ糖含有植物
、野菜（例えば、トマト、ニンジン、ニラネギ、キクニガナ等）、牧草、サツマ
イモ、コムギ、オオムギ、セイヨウアブラナまたはダイズである。
て、完全な植物に再生させることができる。本発明のトランスジェニック植物細
胞を再生させることによって得られる植物も、本発明の対象である。本発明のさ
らなる対象は、前述のトランスジェニック植物細胞を含む植物である。トランス
ジェニック植物細胞は、原理的にはいかなる所望の植物種、すなわち単子葉植物
ならびに双子葉植物であってもよい。これらは好ましくは有用植物、特にコメ、
トウモロコシ、テンサイ、サトウキビもしくはジャガイモなどのショ糖含有植物
、野菜（例えば、トマト、ニンジン、ニラネギ、キクニガナ等）、牧草、サツマ
イモ、コムギ、オオムギ、セイヨウアブラナまたはダイズである。
【００５６】 本発明はまた、実、種、塊茎、根茎、実生、挿し木、カルス、細胞培養物など
の本発明の植物の繁殖材料および収穫産物にも関する。
の本発明の植物の繁殖材料および収穫産物にも関する。
【００５７】 本発明のさらなる対象は、本発明の宿主細胞、特にトランスジェニック植物細
胞、植物組織、植物、ならびに繁殖材料および収穫産物から得られる長鎖イヌリ
ンである。
胞、植物組織、植物、ならびに繁殖材料および収穫産物から得られる長鎖イヌリ
ンである。
【００５８】 もう一つの態様において、本発明は下記の段階を含む長鎖イヌリンを製造する
ための方法に関する： （a）宿主細胞、特に本発明の植物細胞、植物組織または植物を、FFTの産生と、
選択的には外部から供給された、1-ケストースまたは等価な基質の長鎖イヌリン
への変換とを可能にする条件下で培養する段階と、 （b）このようにして産生されたイヌリンを培養した宿主細胞、特に植物細胞、 組織もしくは植物から、または培地から回収する段階。
ための方法に関する： （a）宿主細胞、特に本発明の植物細胞、植物組織または植物を、FFTの産生と、
選択的には外部から供給された、1-ケストースまたは等価な基質の長鎖イヌリン
への変換とを可能にする条件下で培養する段階と、 （b）このようにして産生されたイヌリンを培養した宿主細胞、特に植物細胞、 組織もしくは植物から、または培地から回収する段階。
【００５９】 さらなる態様において、本発明は下記の段階を含む長鎖イヌリンを製造するた
めの方法に関する： （a）1-ケストースまたは等価な基質を本発明のFFTと、長鎖イヌリンへの変換を
可能にする条件下で接触させる段階と、 （b）このようにして産生されたイヌリンを回収する段階。
めの方法に関する： （a）1-ケストースまたは等価な基質を本発明のFFTと、長鎖イヌリンへの変換を
可能にする条件下で接触させる段階と、 （b）このようにして産生されたイヌリンを回収する段階。
【００６０】 様々な原料、特に植物細胞からのイヌリンの回収は、例えばGibsonら、Int. S
ugar J. 96（1994）、381〜486；Baxa、Czech J. Food Sci. 16（1998）、72〜7
6；EP-A-787745；De Leenheer、Carbohydr. Org. Raw Mater. III、Workshop（1
996）、Meeting Date 1994、67〜92、Verlag VCH Weinheim、Germanyおよびロシ
ア特許RU2001621C1に記載されている。
ugar J. 96（1994）、381〜486；Baxa、Czech J. Food Sci. 16（1998）、72〜7
6；EP-A-787745；De Leenheer、Carbohydr. Org. Raw Mater. III、Workshop（1
996）、Meeting Date 1994、67〜92、Verlag VCH Weinheim、Germanyおよびロシ
ア特許RU2001621C1に記載されている。
【００６１】 本発明はさらに、基質であるショ糖と本発明のSSTおよびFFTからの酵素の組み
合わせを用いることによって、長鎖イヌリンを製造するためのインビトロでの方
法に関する。さらなる態様において、本発明はフルクトシルオリゴマーおよび本
発明のFFTを含む混合物を用いることによって、イヌリンを製造するためのイン ビトロでの方法に関する。この状況において、フルクトシルオリゴマーは、DPが
約2〜7のフルクトースユニットを含み、グルコース残基をその末端に示しうるオ
リゴマーである。本発明の方法を実施するとき、好ましくは組換えによって製造
された蛋白質を用いる。本発明の状況において、これらはそれぞれの蛋白質をコ
ードするDNA配列を宿主細胞に導入し、そこで発現させることによって産生され た蛋白質である。この蛋白質は続いて宿主細胞および／または培地から回収する
ことができる。宿主細胞は、好ましくは上で定義した本発明の宿主細胞である。
本発明の方法の好ましい態様において、分泌された蛋白質は上清から得られるた
め、細胞を破壊する、または蛋白質をさらに精製する必要がないように、組換え
によって産生され、宿主細胞によって培地中に分泌された酵素を用いる。培地の
残渣を除去するために、透析、逆浸透、クロマトグラフィ法などの通常の処理法
を用いることができる。培地中に分泌された蛋白質の濃縮にも同じ事があてはま
る。微生物による蛋白質の分泌は、通常はN末端シグナルペプチド（シグナル配 列、リーダーペプチド）によって仲介される。このシグナル配列を有する蛋白質
は微生物の細胞膜を透過しうる。蛋白質の分泌は、このシグナル配列をコードす
るDNA配列を対応する酵素をコードする領域に連結することによって達成できる 。好ましくは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来のα-CGT
アーゼのシグナルペプチドM5A1（Fiedlerら、J. Mol. Biol. 256（1996）、279 〜291）、または遺伝子バンクにアクセッション番号X86014で登録された配列の ヌクレオチド11529〜11618によってコードされるシグナルペプチドを利用する。
合わせを用いることによって、長鎖イヌリンを製造するためのインビトロでの方
法に関する。さらなる態様において、本発明はフルクトシルオリゴマーおよび本
発明のFFTを含む混合物を用いることによって、イヌリンを製造するためのイン ビトロでの方法に関する。この状況において、フルクトシルオリゴマーは、DPが
約2〜7のフルクトースユニットを含み、グルコース残基をその末端に示しうるオ
リゴマーである。本発明の方法を実施するとき、好ましくは組換えによって製造
された蛋白質を用いる。本発明の状況において、これらはそれぞれの蛋白質をコ
ードするDNA配列を宿主細胞に導入し、そこで発現させることによって産生され た蛋白質である。この蛋白質は続いて宿主細胞および／または培地から回収する
ことができる。宿主細胞は、好ましくは上で定義した本発明の宿主細胞である。
本発明の方法の好ましい態様において、分泌された蛋白質は上清から得られるた
め、細胞を破壊する、または蛋白質をさらに精製する必要がないように、組換え
によって産生され、宿主細胞によって培地中に分泌された酵素を用いる。培地の
残渣を除去するために、透析、逆浸透、クロマトグラフィ法などの通常の処理法
を用いることができる。培地中に分泌された蛋白質の濃縮にも同じ事があてはま
る。微生物による蛋白質の分泌は、通常はN末端シグナルペプチド（シグナル配 列、リーダーペプチド）によって仲介される。このシグナル配列を有する蛋白質
は微生物の細胞膜を透過しうる。蛋白質の分泌は、このシグナル配列をコードす
るDNA配列を対応する酵素をコードする領域に連結することによって達成できる 。好ましくは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来のα-CGT
アーゼのシグナルペプチドM5A1（Fiedlerら、J. Mol. Biol. 256（1996）、279 〜291）、または遺伝子バンクにアクセッション番号X86014で登録された配列の ヌクレオチド11529〜11618によってコードされるシグナルペプチドを利用する。
【００６２】 本発明の方法で用いる酵素は別法として、微生物を用いるのではなく、蛋白質
の発現を誘導するインビトロでの転写および翻訳システムを用いて産生すること
ができる。特に好ましい本発明の態様において、FFTは植物の葉組織のプロトプ ラストから産生される。
の発現を誘導するインビトロでの転写および翻訳システムを用いて産生すること
ができる。特に好ましい本発明の態様において、FFTは植物の葉組織のプロトプ ラストから産生される。
【００６３】 本発明はさらに、宿主細胞、特に本発明の植物細胞、植物組織もしくは植物か
ら、または本発明の植物および植物細胞の繁殖材料もしくは収穫産物から生成す
ることができるイヌリン、あるいは本発明の前述の方法の一つによって得ること
ができるイヌリンに関する。好ましくはこのイヌリンを、水系の粘度を増大させ
るための界面活性剤を産生するため、洗剤として、懸濁化剤として、沈降速度を
高めるため、水を複合または結合するために用いることができる。
ら、または本発明の植物および植物細胞の繁殖材料もしくは収穫産物から生成す
ることができるイヌリン、あるいは本発明の前述の方法の一つによって得ること
ができるイヌリンに関する。好ましくはこのイヌリンを、水系の粘度を増大させ
るための界面活性剤を産生するため、洗剤として、懸濁化剤として、沈降速度を
高めるため、水を複合または結合するために用いることができる。
【００６４】 これらまたはその他の態様が開示されており、当業者には明白である。これら
は本発明の説明および実施例に含まれる。前述の方法、手段または使用の一つに
関し、本発明の趣旨において適用可能なさらなる文献を先行技術から、例えば公
共の図書館から、または電子的手段を利用することにより、入手することができ
る。例えばインターネットを介して、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubM
ed/medline.htmlのアドレスから接続できる「Medline」などの公共のデータベー
スがこの目的に有用である。さらなるデータベースおよびアドレスは当業者には
公知で、インターネット、例えばhttp://www.lycos.comのアドレスから利用する
ことができる。生物工学の特許または特許出願に関する資源および情報の調査が
、Berks、TIBTECH 12（1994）、352〜364に記載されている。
は本発明の説明および実施例に含まれる。前述の方法、手段または使用の一つに
関し、本発明の趣旨において適用可能なさらなる文献を先行技術から、例えば公
共の図書館から、または電子的手段を利用することにより、入手することができ
る。例えばインターネットを介して、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubM
ed/medline.htmlのアドレスから接続できる「Medline」などの公共のデータベー
スがこの目的に有用である。さらなるデータベースおよびアドレスは当業者には
公知で、インターネット、例えばhttp://www.lycos.comのアドレスから利用する
ことができる。生物工学の特許または特許出願に関する資源および情報の調査が
、Berks、TIBTECH 12（1994）、352〜364に記載されている。
【００６５】 実施例により本発明を例示する。
【００６６】 実施例１：チョウセンアザミ（Cynara scolymus）由来フルクトシルトランスフ ェラーゼをコードするcDNAの同定、単離および特徴分析 全RNAをチョウセンアザミの花托から単離した（Sambrookら、1989、分子クロ ーニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第2版 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USA）。ポ
リ(A)＋mRNAをmRNA単離システムのPolyATract（Promega Corporation、米国ウィ
スコンシン州マディソン）を用いて単離した。相補的DNA（cDNA）をこのRNA5μg
から、Stratagene（ハイデルベルグ）のZAP-cDNA合成キットを製造業者の指示ど
おりに用いて産生し、2x106の独立の組換えファージクローンを得た。増幅したc
DNAライブラリーを、チョウセンアザミ由来SSTのcDNAに対応する32P標識したDNA
断片（DE19708774.4に記載のプラスミドpCy21のNot I断片）を用いて、ストリン
ジェンシーが低い条件下で標準的方法によりスクリーニングした。チョウセンア
ザミ由来SSTの配列がDE19708774.4に記載されている。陽性クローンを高ストリ ンジェンシー下でSSTプローブを用いてスクリーニングした。このスクリーニン グ中に陽性反応を示したクローンは明らかにSST cDNAであるため、破棄した。残
りのクローンから、標準的ルーチン法で単離したプラスミドDNAを制限酵素NotI を用いて切断することにより、cDNAインサートを単離し、ベクターpA7中にクロ ーニングした。NotI断片の粘着性末端をT4ポリメラーゼを用いて埋めた。続いて
、この断片をpA7のSmaI切断部位にライゲートした。ベクターpA7は、ポリリンカ
ーのEcoRIとSacI部位との間にカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター
のインサート（Gardner、Nucleic Acids Res. 9（1981）、2871〜2888によりヌ クレオチド7146〜7464）を含むpUC18（Yanish-Perron、Gene 33（1985）、103〜
119）の誘導体である。35Sプロモーターとは別に、pA7は、プラスミドpAGV 40（
Herrera-Estrella、Nature 303（1983）、209〜213）からPvu II-Hind III断片 として単離され、Pvu II部位にSph Iリンカーを付加した後ポリリンカーのSphI とHind III部位との間にクローニングされた、TiプラスミドpTi ACH 5（Gielen 、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT-DNAの第3遺伝子のポリアデニル化シグナ ル、ヌクレオチド11749〜11939を含む。
リ(A)＋mRNAをmRNA単離システムのPolyATract（Promega Corporation、米国ウィ
スコンシン州マディソン）を用いて単離した。相補的DNA（cDNA）をこのRNA5μg
から、Stratagene（ハイデルベルグ）のZAP-cDNA合成キットを製造業者の指示ど
おりに用いて産生し、2x106の独立の組換えファージクローンを得た。増幅したc
DNAライブラリーを、チョウセンアザミ由来SSTのcDNAに対応する32P標識したDNA
断片（DE19708774.4に記載のプラスミドpCy21のNot I断片）を用いて、ストリン
ジェンシーが低い条件下で標準的方法によりスクリーニングした。チョウセンア
ザミ由来SSTの配列がDE19708774.4に記載されている。陽性クローンを高ストリ ンジェンシー下でSSTプローブを用いてスクリーニングした。このスクリーニン グ中に陽性反応を示したクローンは明らかにSST cDNAであるため、破棄した。残
りのクローンから、標準的ルーチン法で単離したプラスミドDNAを制限酵素NotI を用いて切断することにより、cDNAインサートを単離し、ベクターpA7中にクロ ーニングした。NotI断片の粘着性末端をT4ポリメラーゼを用いて埋めた。続いて
、この断片をpA7のSmaI切断部位にライゲートした。ベクターpA7は、ポリリンカ
ーのEcoRIとSacI部位との間にカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター
のインサート（Gardner、Nucleic Acids Res. 9（1981）、2871〜2888によりヌ クレオチド7146〜7464）を含むpUC18（Yanish-Perron、Gene 33（1985）、103〜
119）の誘導体である。35Sプロモーターとは別に、pA7は、プラスミドpAGV 40（
Herrera-Estrella、Nature 303（1983）、209〜213）からPvu II-Hind III断片 として単離され、Pvu II部位にSph Iリンカーを付加した後ポリリンカーのSphI とHind III部位との間にクローニングされた、TiプラスミドpTi ACH 5（Gielen 、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT-DNAの第3遺伝子のポリアデニル化シグナ ル、ヌクレオチド11749〜11939を含む。
【００６７】 チョウセンアザミ由来cDNAを含むpA7誘導体を用いて、タバコプロトプラスト をNegrutiu（Plant Mol. Biol. 8、（1987）、363〜373）の方法にしたがって形
質転換した。形質転換したプロトプラストをK3培地（NagyおよびMaliga、Z. Pfl
anzenphysiologie 78（1976）、453〜455）中、25℃で2日間、暗所で培養した。
続いて、細胞抽出物を凍結と解凍を繰り返すことにより得た。抽出物をオリゴフ
ルクタン（1-ケストース67.5%、ナイストース28.4%、フルクトシルナイストース
3.6%、ショ糖0.5%）と共に28℃で12時間インキュベートし、続いてHPLCで解析し
た。HPLC解析は、CarboPac PA 100アニオン交換カラムをDionex DX-300勾配溶出
クロマトグラフィシステム（Dionex、米国カリフォルニア州サニーベール）に接
続して実施した。糖モノマー、オリゴマーおよびポリマーをパルス電流測定法に
よって検出した。このための検出器調製は次のとおりであった：T1＝0.48秒；T2 ＝0.12秒；T3＝0.12秒；E1＝0.05V；E2＝0.65V；E3＝-0.95V；感度＝0.1μC；積
算＝0.28〜0.48秒；溶出液A＝0.15MNaOH；溶出液B＝1M NaAc/0.15M NaOH；勾配 ：100%Aを10分；0%Bから100%Bまでの直線的増加を2分；100%Bを2分；0%Aから100
%Aまでの直線的増加を2分；Aを5分。試料を脱塩し、濾過（microcon 10、amicon
、米国ベバリー）した後に用いた。流速は1ml/分であった。少数の抽出物中に高
分子イヌリンが認められた（図1参照）。
質転換した。形質転換したプロトプラストをK3培地（NagyおよびMaliga、Z. Pfl
anzenphysiologie 78（1976）、453〜455）中、25℃で2日間、暗所で培養した。
続いて、細胞抽出物を凍結と解凍を繰り返すことにより得た。抽出物をオリゴフ
ルクタン（1-ケストース67.5%、ナイストース28.4%、フルクトシルナイストース
3.6%、ショ糖0.5%）と共に28℃で12時間インキュベートし、続いてHPLCで解析し
た。HPLC解析は、CarboPac PA 100アニオン交換カラムをDionex DX-300勾配溶出
クロマトグラフィシステム（Dionex、米国カリフォルニア州サニーベール）に接
続して実施した。糖モノマー、オリゴマーおよびポリマーをパルス電流測定法に
よって検出した。このための検出器調製は次のとおりであった：T1＝0.48秒；T2 ＝0.12秒；T3＝0.12秒；E1＝0.05V；E2＝0.65V；E3＝-0.95V；感度＝0.1μC；積
算＝0.28〜0.48秒；溶出液A＝0.15MNaOH；溶出液B＝1M NaAc/0.15M NaOH；勾配 ：100%Aを10分；0%Bから100%Bまでの直線的増加を2分；100%Bを2分；0%Aから100
%Aまでの直線的増加を2分；Aを5分。試料を脱塩し、濾過（microcon 10、amicon
、米国ベバリー）した後に用いた。流速は1ml/分であった。少数の抽出物中に高
分子イヌリンが認められた（図1参照）。
【００６８】 実施例２：プラスミドpCy3のcDNAインサートの配列解析 プロトプラスト解析で、高分子イヌリンの合成を仲介したpA7誘導体（pCy3） からのcDNAインサートを、ジデオキシヌクレオチド法（Sanger、Proc. Natl. ac
ad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5467）を用いて配列決定した。クローンpCy3 のインサートは長さ2073bpのDNAである。ヌクレオチド配列を配列番号：1に示し
ている。対応するアミノ酸配列を配列番号：2に示している。配列番号：3は配列
番号：1の変異型で、配列番号：1によってコードされるものと同じ蛋白質をコー
ドする。
ad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5467）を用いて配列決定した。クローンpCy3 のインサートは長さ2073bpのDNAである。ヌクレオチド配列を配列番号：1に示し
ている。対応するアミノ酸配列を配列番号：2に示している。配列番号：3は配列
番号：1の変異型で、配列番号：1によってコードされるものと同じ蛋白質をコー
ドする。
【００６９】 配列解析およびすでに報告されている配列との比較により、配列番号：1に示 される配列は新規で、他の生物由来のFFTに対する相同性を示すコード領域を含 むことが明らかにされた。
【００７０】 実施例３：プラスミドp35-csFFTの合成とジャガイモゲノムへのプラスミドの組 込み プラスミドp35-csFFT（図2）はバイナリーベクターpBin19（Bevan、Nucl. Aci
ds Res. 12（1984）、8711、Becker、Nucl. Acids Res. 18（1990）、203にした
がって改変）内に三つの断片A、BおよびCを含む。
ds Res. 12（1984）、8711、Becker、Nucl. Acids Res. 18（1990）、203にした
がって改変）内に三つの断片A、BおよびCを含む。
【００７１】 断片Aは、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーターを含む。
これはpBin19-HygのポリリンカーのEcoRIとSacI部位との間のインサートとして ヌクレオチド7146〜7464（Gardner、Nucleic Acids res. 9（1981）、2871〜288
8）を含む。
これはpBin19-HygのポリリンカーのEcoRIとSacI部位との間のインサートとして ヌクレオチド7146〜7464（Gardner、Nucleic Acids res. 9（1981）、2871〜288
8）を含む。
【００７２】 断片Bは配列番号：1の配列のヌクレオチド1〜2073を含む。断片Bは、ベクター
pBK-CMVの中のEcoRI部位にEcoRI/Not Iリンカー配列を介して挿入されており、 このベクターからNot I断片として得られた。断片Cは、プラスミドpAGV 40（Her
rera-Estrella、Nature 303（1983）、209〜213）からPvu II-Hind III断片とし
て単離され、Pvu II部位にSph Iリンカーを付加した後ポリリンカーのSphIとHin
d III部位との間にクローニングされた、TiプラスミドpTi ACH 5（Gielen、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT-DNAの第3遺伝子のポリアデニル化シグナル、ヌ クレオチド11749〜11939を含む。
pBK-CMVの中のEcoRI部位にEcoRI/Not Iリンカー配列を介して挿入されており、 このベクターからNot I断片として得られた。断片Cは、プラスミドpAGV 40（Her
rera-Estrella、Nature 303（1983）、209〜213）からPvu II-Hind III断片とし
て単離され、Pvu II部位にSph Iリンカーを付加した後ポリリンカーのSphIとHin
d III部位との間にクローニングされた、TiプラスミドpTi ACH 5（Gielen、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT-DNAの第3遺伝子のポリアデニル化シグナル、ヌ クレオチド11749〜11939を含む。
【００７３】 プラスミドp35-csSSTをアグロバクテリアに導入し（HofgenおよびWillmitzer 、Nucleic Acids Res. 16（1988）、9877）、続いて前述の標準的方法にしたが い、アグロバクテリウムが仲介する遺伝子移入によりジャガイモ（植物）中に導
入した。前記ジャガイモ（植物）をチョウセンアザミ由来SST（ドイツ特許出願D
E-A119708774参照）をコードするDNA配列で形質転換し、ジャガイモは35Sプロモ
ーターの制御下でこれらの配列を発現する。完全な植物が形質転換細胞から再生
された。再生された植物の葉から抽出物を得、フルクトシルポリマーの有無に関
して調べた。解析を実施例1に記載のとおりに実施した。このベクターシステム で形質転換した一連の植物の葉を解析することにより、高分子イヌリンの発生が
明らかに証明され、これはp35-csFFTに含まれるチョウセンアザミ由来FFT遺伝子
の発現によるものであった（図3参照）。
入した。前記ジャガイモ（植物）をチョウセンアザミ由来SST（ドイツ特許出願D
E-A119708774参照）をコードするDNA配列で形質転換し、ジャガイモは35Sプロモ
ーターの制御下でこれらの配列を発現する。完全な植物が形質転換細胞から再生
された。再生された植物の葉から抽出物を得、フルクトシルポリマーの有無に関
して調べた。解析を実施例1に記載のとおりに実施した。このベクターシステム で形質転換した一連の植物の葉を解析することにより、高分子イヌリンの発生が
明らかに証明され、これはp35-csFFTに含まれるチョウセンアザミ由来FFT遺伝子
の発現によるものであった（図3参照）。
【００７４】
【表Ｉ】チョウセンアザミSSTおよびFFT遺伝子を発現するトランスジェニックジャガイモ 塊茎のイヌリン含有量解析
【００７５】 実施例４：プラスミドp33-csFFTの産生とジャガイモゲノムへのプラスミドの組 込み プラスミドp33-csFFT（図4）は、断片AがCaMVの35Sプロモ−ターの代わりにジ
ャガイモ由来パタチン遺伝子b33のB33プロモーターを含む以外は、プラスミドp3
5-csFFTと全く同じである。これは、pBin19-HygのポリリンカーのEcoRIとSacI部
位の間に挿入された、パタチン遺伝子b33のDraI断片（-1512位から+14位）（Roc
ha-Sosa、EMBO J. 8（1989）、23〜29）を含む。プラスミドp33-csFFTのサイズ はおよそ14kbである。プラスミドp33-csSSTを、実施例3に記載のとおり、アグロ
バクテリウムが仲介する遺伝子移入によってジャガイモ（植物）中に導入した。
前記ジャガイモ（植物）をチョウセンアザミ由来SST（ドイツ特許出願DE-A11970
8774参照）をコードするDNA配列で形質転換し、ジャガイモは35Sプロモーターの
制御下でこれらの配列を発現した。完全な植物が形質転換細胞から再生された。
このベクターシステムで形質転換した一連の植物の葉を解析することにより、高
分子イヌリンの発生が明らかに証明され、これはp33-csFFTに含まれるチョウセ ンアザミ由来FFT遺伝子の発現によるものであった（図5参照）。
ャガイモ由来パタチン遺伝子b33のB33プロモーターを含む以外は、プラスミドp3
5-csFFTと全く同じである。これは、pBin19-HygのポリリンカーのEcoRIとSacI部
位の間に挿入された、パタチン遺伝子b33のDraI断片（-1512位から+14位）（Roc
ha-Sosa、EMBO J. 8（1989）、23〜29）を含む。プラスミドp33-csFFTのサイズ はおよそ14kbである。プラスミドp33-csSSTを、実施例3に記載のとおり、アグロ
バクテリウムが仲介する遺伝子移入によってジャガイモ（植物）中に導入した。
前記ジャガイモ（植物）をチョウセンアザミ由来SST（ドイツ特許出願DE-A11970
8774参照）をコードするDNA配列で形質転換し、ジャガイモは35Sプロモーターの
制御下でこれらの配列を発現した。完全な植物が形質転換細胞から再生された。
このベクターシステムで形質転換した一連の植物の葉を解析することにより、高
分子イヌリンの発生が明らかに証明され、これはp33-csFFTに含まれるチョウセ ンアザミ由来FFT遺伝子の発現によるものであった（図5参照）。
【配列表】
【図１】 全プロトプラスト抽出物のHPLC解析を示す図である。プロトプラ
ストを様々なベクターで形質転換した：A：CaMV 35Sプロモーターと融合したコ ード領域を含まないベクターpA7を用いて形質転換を実施した。B：CaMV 35Sプロ
モーターと融合したチョウセンアザミ由来フルクタン：フルクタン-フルクトシ ルトランスフェラーゼのコード領域を含むベクターpA7-csFFTを用いて形質転換 を起こした。C：CaMV 35Sプロモーターとの融合体としてのキクイモ由来フルク タン：フルクタン-フルクトシルトランスフェラーゼのコード領域を含むベクタ ーpA7-htFFTを用いて形質転換を実施した。解析前に、全プロトプラスト抽出物 をフルクトシルオリゴマー混合物中でそれぞれ12時間インキュベートした。解析
を実施例1に記載のとおりに実施した。
ストを様々なベクターで形質転換した：A：CaMV 35Sプロモーターと融合したコ ード領域を含まないベクターpA7を用いて形質転換を実施した。B：CaMV 35Sプロ
モーターと融合したチョウセンアザミ由来フルクタン：フルクタン-フルクトシ ルトランスフェラーゼのコード領域を含むベクターpA7-csFFTを用いて形質転換 を起こした。C：CaMV 35Sプロモーターとの融合体としてのキクイモ由来フルク タン：フルクタン-フルクトシルトランスフェラーゼのコード領域を含むベクタ ーpA7-htFFTを用いて形質転換を実施した。解析前に、全プロトプラスト抽出物 をフルクトシルオリゴマー混合物中でそれぞれ12時間インキュベートした。解析
を実施例1に記載のとおりに実施した。
【図２】 プラスミドp35-csFFTの構造を示す図である。
【図３】 構築物p35-csFFTにより形質転換されたトランスジェニック植物 のHPLC解析を示す図である。解析により、チョウセンアザミ由来のSSTならびにF
FTを発現するトランスジェニック植物（35S-SST/FFT 22/19）において長鎖イヌ リン分子が生成されたことが示されている。
FTを発現するトランスジェニック植物（35S-SST/FFT 22/19）において長鎖イヌ リン分子が生成されたことが示されている。
【図４】 プラスミドp33-csFFTの構造を示す図である。
【図５】 構築物p33-csFFTにより形質転換されたトランスジェニック植物 のHPLC解析を示す図である。解析により、チョウセンアザミ由来のSSTならびにF
FTを発現するトランスジェニック植物（B33-SST/FFT 47）において長鎖イヌリン
分子が生成されたことが示されている。
FTを発現するトランスジェニック植物（B33-SST/FFT 47）において長鎖イヌリン
分子が生成されたことが示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD12 CD14 4B024 AA03 AA08 BA10 BA79 CA02 DA01 EA04 FA02 GA17 4B050 CC03 DD13 LL04 LL05 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA02 CA22 CA29 CA53 CA57 4C090 AA04 BA43 BC01 CA41 DA03 DA04 DA26
Claims (26)
- 【請求項１】 高分子フルクタンポリマーの合成につながるフルクトシルト
ランスフェラーゼ（FFT）の酵素活性を有する蛋白質をコードする核酸分子であ って、平均で20よりも多いフルクトシル残基を含み、 （a）配列番号：2および配列番号：4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコ ードする核酸分子と、 （b）配列番号：1もしくは配列番号：3に示されるヌクレオチド配列または対応 するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子と、 （c）（a）または（b）に記載の核酸分子の相補鎖にストリンジェントな条件下 でハイブリダイズする核酸分子と、 （d）（a）、（b）または（c）のヌクレオチド配列の断片を含む核酸分子とから
なる群より選択される核酸分子。 - 【請求項２】 DNA分子である、請求項１記載の核酸分子。
- 【請求項３】 cDNA分子である、請求項２記載の核酸分子。
- 【請求項４】 RNA分子である、請求項１記載の核酸分子。
- 【請求項５】 チョウセンアザミ由来である、請求項１〜４のいずれか一項
記載の核酸分子。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター
。 - 【請求項７】 核酸分子が、原核および／または真核細胞中の翻訳可能RNA の転写および合成を確実にする調節エレメントに機能的に連結されている、請求
項６記載のベクター。 - 【請求項８】 調節エレメントがパタチンB33プロモーターまたはCaMV 35S プロモーターに由来する、請求項７記載のベクター。
- 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸分子もしくは請求項
６〜８のいずれか一項記載のベクターにより形質転換された宿主細胞またはその
ような細胞に由来する宿主細胞。 - 【請求項１０】 ショ糖依存的ショ糖フルクトシルトランスフェラーゼ（SS
T）をコードする遺伝子をさらに含む、請求項９記載の宿主細胞。 - 【請求項１１】 FFTの製造方法であって、請求項９記載の宿主細胞がFFTの
合成を可能にする条件下で培養され、且つFFTが培養された細胞および／または 培地から単離される方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸分子によってコー
ドされるか、または請求項１１記載の方法によって製造されるFFT。 - 【請求項１３】 請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸分子またはその相
補鎖に特異的にハイブリダイズする核酸分子。 - 【請求項１４】 請求項９または１０記載の形質転換された宿主細胞、特に
トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織およびトランスジェ
ニック植物を製造するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項記載の
核酸分子または請求項６〜８のいずれか一項記載のベクターの、宿主細胞、植物
細胞、植物組織または植物への導入を含む方法。 - 【請求項１５】 形質転換された宿主細胞、トランスジェニック植物細胞、
植物組織または植物であって、請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸分子もし
くは請求項６〜８のいずれか一項記載のベクターを含むか、もしくは請求項１４
記載の方法によって得られる、またはこのような細胞、組織もしくは植物に由来
する細胞、組織または植物。 - 【請求項１６】 ショ糖依存的ショ糖フルクトシルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子をさらに含む、請求項１５記載の形質転換された宿主細胞、トラ
ンスジェニック植物細胞、植物組織または植物。 - 【請求項１７】 請求項１５または１６記載の植物細胞または植物組織を含
む植物。 - 【請求項１８】 有用植物である、請求項１５〜１７のいずれか一項記載の
植物。 - 【請求項１９】 有用植物がショ糖含有植物である、請求項１８記載の植物
。 - 【請求項２０】 請求項１５または１６記載の植物細胞を含む、請求項１５
〜１９のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。 - 【請求項２１】 請求項１５または１６記載の植物細胞を含む、請求項１５
〜１９のいずれか一項記載の植物の収穫産物。 - 【請求項２２】 下記の段階を含む長鎖イヌリンを製造するための方法： （a）請求項１５もしくは１６記載の形質転換された宿主細胞、トランスジェニ ック植物細胞もしくは植物組織、または請求項１５〜１９のいずれか一項記載の
植物を、FFTの産生と、選択的には外部から供給された、1-ケストースまたは等 価な基質の長鎖イヌリンへの変換とを可能にする条件下で培養する段階と、 （b）このようにして産生されたイヌリンを培養細胞、組織もしくは植物から、 または培地から回収する段階。 - 【請求項２３】 下記の段階を含む長鎖イヌリンを製造するための方法： （a）1-ケストースまたは等価な基質を請求項１２記載のFFTと、長鎖イヌリンへ
の変換を可能にする条件下で接触させる段階、および （b）このようにして産生されたイヌリンを回収する段階。 - 【請求項２４】 長鎖イヌリンを製造するためのインビトロでの方法であっ
て、基質であるショ糖がSSTおよびFFTを含む酵素の組み合わせによって長鎖イヌ
リンに変換される方法。 - 【請求項２５】 請求項１５もしくは１６記載の宿主細胞、植物細胞もしく
は植物組織から、請求項１５〜１９のいずれか一項記載の植物から、請求項２０
記載の繁殖材料から、もしくは請求項２１記載の収穫産物から、または請求項２
２〜２４のいずれか一項記載の方法によって得られる長鎖イヌリン。 - 【請求項２６】 水系における粘度を増大させるための界面活性剤を製造す
るため、洗剤として、懸濁化剤として、沈降速度を高めるため、且つ水を複合化
または結合するための請求項２５記載のイヌリンの使用。
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| DE19749122.7 | 1997-11-06 | ||
| PCT/EP1998/007115 WO1999024593A1 (en) | 1997-11-06 | 1998-11-06 | Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin |
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|---|---|---|---|
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| EP1346032A2 (de) * | 2000-12-21 | 2003-09-24 | Südzucker Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von kohlenhydraten |
| EP1597978A1 (en) | 2004-05-17 | 2005-11-23 | Nutricia N.V. | Synergism of GOS and polyfructose |
| AR052059A1 (es) | 2004-12-21 | 2007-02-28 | Bayer Cropscience Gmbh | Plantas de cana azucarera con contenido incrementado de carbohidratos de almacenamiento |
| FR2888971B1 (fr) * | 2005-07-20 | 2007-11-02 | Nicolas Bara | Procede d'identification sequentielle d'echantillons |
| CN101432313B (zh) * | 2006-04-28 | 2013-08-07 | 拜尔作物科学股份公司 | 极长链菊粉 |
| CN101432314B (zh) * | 2006-04-28 | 2011-10-12 | 拜尔作物科学股份公司 | 链长极高的菊粉 |
| WO2007128559A2 (en) * | 2006-04-28 | 2007-11-15 | Bayer Cropscience Ag | Inulin of very high chain length |
| MX2008013706A (es) * | 2006-04-28 | 2008-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Inulina de cadena muy larga. |
| CL2007003743A1 (es) * | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| CL2007003744A1 (es) | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| WO2008110280A2 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Bayer Cropscience Ag | Phenoxy-substitutierte phenylamidin-derivativen und deren verwendung als fungiziden |
| EP1969934A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969931A1 (de) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| US9199922B2 (en) | 2007-03-12 | 2015-12-01 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Dihalophenoxyphenylamidines and use thereof as fungicides |
| EP1969929A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| WO2008110281A2 (de) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Bayer Cropscience Ag | 3,4-disubstituierte phenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide |
| WO2008128639A1 (de) * | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide |
| DE102007045956A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-09 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045922A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045953B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045919B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045920B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Synergistische Wirkstoffkombinationen |
| EP2090168A1 (de) | 2008-02-12 | 2009-08-19 | Bayer CropScience AG | Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| EP2072506A1 (de) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Bayer CropScience AG | Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2168434A1 (de) | 2008-08-02 | 2010-03-31 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| EP2321262A1 (de) | 2008-08-14 | 2011-05-18 | Bayer CropScience AG | Insektizide 4-phenyl-1h-pyrazole |
| DE102008041695A1 (de) | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Bayer Cropscience Ag | Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| EP2201838A1 (de) | 2008-12-05 | 2010-06-30 | Bayer CropScience AG | Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2198709A1 (de) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge |
| US9763451B2 (en) | 2008-12-29 | 2017-09-19 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Method for improved use of the production potential of genetically modified plants |
| EP2223602A1 (de) | 2009-02-23 | 2010-09-01 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen |
| EP2204094A1 (en) | 2008-12-29 | 2010-07-07 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction |
| EP2039770A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| EP2039772A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction |
| EP2039771A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| EP2227951A1 (de) | 2009-01-23 | 2010-09-15 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren |
| JP5592398B2 (ja) | 2009-01-28 | 2014-09-17 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲー | 殺菌剤ｎ−シクロアルキル−ｎ−二環式メチレン−カルボキサミド誘導体 |
| AR075126A1 (es) | 2009-01-29 | 2011-03-09 | Bayer Cropscience Ag | Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas |
| CN102317259B (zh) | 2009-02-17 | 2015-12-02 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌n-(苯基环烷基)羧酰胺，n-(苄基环烷基)羧酰胺和硫代羧酰胺衍生物 |
| EP2218717A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-18 | Bayer CropScience AG | Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives |
| TW201031331A (en) | 2009-02-19 | 2010-09-01 | Bayer Cropscience Ag | Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance |
| EP2232995A1 (de) | 2009-03-25 | 2010-09-29 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| US9012360B2 (en) | 2009-03-25 | 2015-04-21 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Synergistic combinations of active ingredients |
| US8846567B2 (en) | 2009-03-25 | 2014-09-30 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations having insecticidal and acaricidal properties |
| BRPI0924839B1 (pt) | 2009-03-25 | 2018-03-20 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Combinações de substâncias ativas com propriedades inseticidas e acaricidas, seus usos e método para o controle de praga animais |
| EP2410849A1 (de) | 2009-03-25 | 2012-02-01 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften |
| AP3073A (en) | 2009-03-25 | 2014-12-31 | Bayer Cropscience Ag | Active ingredient combinations with insecticidal and acaricidal properties |
| EP2239331A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-13 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| BRPI1015543A8 (pt) | 2009-05-06 | 2016-05-24 | Bayer Cropscience Ag | Compostos de ciclopentanodiona e seu uso como inseticidas, acaricidas e/ou fungicidas. |
| AR076839A1 (es) | 2009-05-15 | 2011-07-13 | Bayer Cropscience Ag | Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas |
| EP2251331A1 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-17 | Bayer CropScience AG | Fungicide pyrazole carboxamides derivatives |
| EP2255626A1 (de) | 2009-05-27 | 2010-12-01 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| HUE042069T2 (hu) | 2009-06-02 | 2019-06-28 | Bayer Cropscience Ag | Fluopiram alkalmazása sclerotina-fajok kontrollálására |
| JP5642786B2 (ja) | 2009-07-16 | 2014-12-17 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | フェニルトリアゾール類を含む相乗的活性化合物組み合わせ |
| WO2011015524A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide heterocycles derivatives |
| EP2292094A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-09 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EP2343280A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-07-13 | Bayer CropScience AG | Fungicide quinoline derivatives |
| BR112012012340A2 (pt) | 2009-12-28 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Ag | composto, composição fungicida e método para o controle de fungo fitopatogênico de culturas |
| CN105399666A (zh) | 2009-12-28 | 2016-03-16 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-杂环衍生物 |
| CN102724879B (zh) | 2009-12-28 | 2015-10-21 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| EA022553B1 (ru) | 2010-01-22 | 2016-01-29 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Применение комбинации биологически активных веществ, набор и средство, содержащие комбинацию биологически активных веществ, для борьбы с вредителями животного происхождения и способ улучшения использования продукционного потенциала трансгенного растения |
| WO2011107504A1 (de) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Bayer Cropscience Ag | Fluoralkyl- substituierte 2 -amidobenzimidazole und deren verwendung zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| JP2013523795A (ja) | 2010-04-06 | 2013-06-17 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 植物のストレス耐性を増強させるための４−フェニル酪酸及び／又はその塩の使用 |
| AU2011237909B2 (en) | 2010-04-09 | 2015-08-20 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of derivatives of the (1-cyanocyclopropyl)phenylphosphinic acid, the esters thereof and/or the salts thereof for enhancing the tolerance of plants to abiotic stress |
| WO2011134911A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| BR112012027558A2 (pt) | 2010-04-28 | 2015-09-15 | Bayer Cropscience Ag | ''composto da fórmula (i), composição fungicida e método para o controle de fungos fitogênicos de colheitas'' |
| CN102985419A (zh) | 2010-04-28 | 2013-03-20 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-杂环衍生物 |
| MX2012013897A (es) | 2010-06-03 | 2012-12-17 | Bayer Cropscience Ag | N[(het)ariletil)]pirazol (tio)carboxamidas y sus analogos heterosustituidos. |
| UA110703C2 (uk) | 2010-06-03 | 2016-02-10 | Байєр Кропсайнс Аг | Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду |
| ES2532971T3 (es) | 2010-06-03 | 2015-04-06 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-[(het)arilalquil)]pirazol (tio)carboxamidas y sus análogos heterosustituidos |
| WO2011154158A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| JP6092100B2 (ja) | 2010-06-09 | 2017-03-08 | バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｖ． | 植物ゲノム工学に一般的に使用されるヌクレオチド配列において植物ゲノムを改変するための方法および手段 |
| US9173399B2 (en) | 2010-07-20 | 2015-11-03 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Benzocycloalkenes as antifungal agents |
| WO2012028578A1 (de) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Bayer Cropscience Ag | Substituierte anellierte pyrimidinone und dihydropyrimidinone |
| EP2460406A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops |
| WO2012038480A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Bayer Cropscience Ag | Use of biological or chemical control agents for controlling insects and nematodes in resistant crops |
| KR101871525B1 (ko) | 2010-10-07 | 2018-06-26 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | 테트라졸릴옥심 유도체 및 티아졸릴피페리딘 유도체를 포함하는 살진균제 조성물 |
| MX2013004286A (es) | 2010-10-21 | 2013-06-05 | Bayer Ip Gmbh | 1(heterociclico carbonil) piperidinas. |
| BR112013009580B1 (pt) | 2010-10-21 | 2018-06-19 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Composto de fómrula (i), composição fungicida e método para controlar fungos fitopatogênicos |
| CA2815117A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-10 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-hetarylmethyl pyrazolylcarboxamides |
| JP2013543858A (ja) | 2010-11-15 | 2013-12-09 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | ５−ハロゲノピラゾール（チオ）カルボキサミド類 |
| WO2012065944A1 (en) | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Bayer Cropscience Ag | N-aryl pyrazole(thio)carboxamides |
| EP2640707B1 (en) | 2010-11-15 | 2017-03-15 | Bayer Intellectual Property GmbH | 5-halogenopyrazolecarboxamides |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| KR20130123416A (ko) | 2010-12-01 | 2013-11-12 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 작물에서 선충류를 구제하고 수확량을 증가시키기 위한 플루오피람의 용도 |
| JP2014502611A (ja) | 2010-12-29 | 2014-02-03 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 殺菌剤ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体 |
| EP2474542A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-07-11 | Bayer CropScience AG | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2471363A1 (de) | 2010-12-30 | 2012-07-04 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| EP2494867A1 (de) | 2011-03-01 | 2012-09-05 | Bayer CropScience AG | Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden |
| EP2683239A1 (en) | 2011-03-10 | 2014-01-15 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds |
| WO2012123434A1 (en) | 2011-03-14 | 2012-09-20 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| CN103517900A (zh) | 2011-04-08 | 2014-01-15 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| AR085568A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas |
| EP2511255A1 (de) | 2011-04-15 | 2012-10-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate |
| AR090010A1 (es) | 2011-04-15 | 2014-10-15 | Bayer Cropscience Ag | 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento |
| AR085585A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas |
| EP2699093B1 (en) | 2011-04-22 | 2015-11-04 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations comprising a carboximide derivative and a fungicidal compound |
| EP2718443B1 (en) | 2011-06-06 | 2017-11-29 | Bayer CropScience NV | Methods and means to modify a plant genome at a preselected site |
| CN103957711A (zh) | 2011-07-04 | 2014-07-30 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 取代的异喹啉酮、异喹啉二酮、异喹啉三酮和二氢异喹啉酮或其各自的盐作为活性剂对抗植物非生物胁迫的用途 |
| EP2549788B1 (en) | 2011-07-22 | 2016-10-12 | Thales | A method for managing single channel spatial reuse in the presence of potentially disruptive nodes in a mobile ad-hoc network |
| US9265252B2 (en) | 2011-08-10 | 2016-02-23 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| US20140206726A1 (en) | 2011-08-22 | 2014-07-24 | Juergen Benting | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| CN103890181A (zh) | 2011-08-22 | 2014-06-25 | 拜尔作物科学公司 | 修饰植物基因组的方法和手段 |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| US20140221210A1 (en) | 2011-09-09 | 2014-08-07 | Peter Dahmen | Acyl-homoserine lactone derivatives for improving plant yield |
| EP2755949B1 (en) | 2011-09-12 | 2015-10-21 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicidal 4-substituted-3-{phenyl[(heterocyclylmethoxy)imino]methyl}-1,2,4-oxadizol-5(4h)-one derivatives |
| EA029850B9 (ru) | 2011-09-16 | 2018-12-28 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Применение изоксадифен-этила или изоксадифена для повышения урожайности растений |
| JP6100265B2 (ja) | 2011-09-16 | 2017-03-22 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 植物収量を向上させるためのフェニルピラゾリン−３−カルボン酸化合物の使用 |
| CN103929956B (zh) | 2011-09-16 | 2017-02-22 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 酰基磺酰胺用于改善植物产量的用途 |
| BR112014006940A2 (pt) | 2011-09-23 | 2017-04-04 | Bayer Ip Gmbh | uso de derivados de ácido 1-fenilpirazol-3-carboxílico 4-substituído como agentes contra estresse abiótico em plantas |
| CN103842507A (zh) | 2011-10-04 | 2014-06-04 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 通过抑制酵母氨酸脱氢酶基因控制真菌和卵菌的RNAi |
| WO2013050324A1 (de) | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b) |
| JP2014533666A (ja) | 2011-11-21 | 2014-12-15 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 殺菌剤ｎ−［（トリ置換シリル）メチル］−カルボキサミド誘導体 |
| CN105906567B (zh) | 2011-11-30 | 2019-01-22 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌的n-二环烷基和n-三环烷基(硫代)羧酰胺衍生物 |
| AU2012357896B9 (en) | 2011-12-19 | 2016-12-15 | Bayer Cropscience Ag | Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops |
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| HUE036328T2 (hu) | 2012-02-22 | 2018-06-28 | Bayer Cropscience Ag | Fluopirám alkalmazása fabetegségek leküzdésére szõlõn |
| PT2819518T (pt) | 2012-02-27 | 2017-12-11 | Bayer Ip Gmbh | Combinações de compostos activos contendo uma tiazoilisoxazolina e um fungicida |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| JP2015517996A (ja) | 2012-04-12 | 2015-06-25 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | 殺真菌剤として有用なｎ−アシル−２−（シクロ）アルキルピロリジンおよびピペリジン |
| WO2013156560A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
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| US9375005B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-06-28 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| EP2871958A1 (en) | 2012-07-11 | 2015-05-20 | Bayer CropScience AG | Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress |
| WO2014037340A1 (de) | 2012-09-05 | 2014-03-13 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung substituierter 2-amidobenzimidazole, 2-amidobenzoxazole und 2-amidobenzothiazole oder deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| MX381528B (es) | 2012-10-19 | 2025-03-12 | Bayer Cropscience Ag | Método para mejorar la tolerancia al estrés abiótico en plantas usando derivados de carboxamida o tiocarboxamida. |
| WO2014060518A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Bayer Cropscience Ag | Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives |
| JP6153619B2 (ja) | 2012-10-19 | 2017-06-28 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | カルボキサミド誘導体を含む活性化合物の組み合わせ |
| BR112015008798B1 (pt) | 2012-10-19 | 2020-03-17 | Bayer Cropscience Ag | Método para o tratamento de plantas contra fungos fitopatogênicos resistentes a um fungicida SDHI |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| WO2014079957A1 (de) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Bayer Cropscience Ag | Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion |
| PL2925134T3 (pl) | 2012-11-30 | 2020-06-29 | Bayer Cropscience Ag | Trójskładnikowe mieszaniny grzybobójcze |
| EA201890495A3 (ru) | 2012-11-30 | 2019-01-31 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Тройные фунгицидные и пестицидные смеси |
| WO2014083031A2 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary pesticidal and fungicidal mixtures |
| CA2892702A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| CA3082683A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal mixtures |
| EP2740720A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| US20150305334A1 (en) | 2012-12-05 | 2015-10-29 | Bayer Cropscience Ag | Use of substituted 1-(aryl ethynyl)-, 1-(heteroaryl ethynyl)-, 1-(heterocyclyl ethynyl)- and 1-(cycloalkenyl ethynyl)-cyclohexanols as active agents against abiotic plant stress |
| EP2740356A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate |
| WO2014090765A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Bayer Cropscience Ag | Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| CN104995174A (zh) | 2012-12-19 | 2015-10-21 | 拜耳作物科学股份公司 | 二氟甲基-烟酰-四氢萘基胺 |
| WO2014135608A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-12 | Bayer Cropscience Ag | Fungicidal 3-{phenyl[(heterocyclylmethoxy)imino]methyl}-heterocycle derivatives |
| BR112015025006A2 (pt) | 2013-04-02 | 2017-10-10 | Bayer Cropscience Nv | engenharia genômica alvejada em eucariontes |
| KR20150142014A (ko) | 2013-04-12 | 2015-12-21 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | 신규 트리아졸 유도체 |
| CN105283449A (zh) | 2013-04-12 | 2016-01-27 | 拜耳作物科学股份公司 | 新的三唑硫酮衍生物 |
| US20160058001A1 (en) | 2013-04-19 | 2016-03-03 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| JP2016519687A (ja) | 2013-04-19 | 2016-07-07 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | バイナリー殺虫または農薬混合物 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| US9770022B2 (en) | 2013-06-26 | 2017-09-26 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| MX2016000141A (es) | 2013-07-09 | 2016-03-01 | Bayer Cropscience Ag | El uso de piridonacarboxamidas seleccionadas o sales de las mismas como sustancias activas contra el estres abiotico de las plantas. |
| TW201609661A (zh) | 2013-12-05 | 2016-03-16 | 拜耳作物科學公司 | Ｎ－環烷基－ｎ－｛［２－（１－經取代環烷基）苯基］亞甲基｝－（硫代）甲醯胺衍生物 |
| EP3077377B1 (en) | 2013-12-05 | 2020-01-22 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| AR101214A1 (es) | 2014-07-22 | 2016-11-30 | Bayer Cropscience Ag | Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas |
| CN104145825B (zh) * | 2014-09-04 | 2016-04-13 | 东莞市睿绅生物技术有限公司 | 朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法 |
| AR103024A1 (es) | 2014-12-18 | 2017-04-12 | Bayer Cropscience Ag | Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas |
| US10214510B2 (en) | 2015-04-13 | 2019-02-26 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-N-(biheterocyclylethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| WO2016205749A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| US11306337B2 (en) | 2015-11-12 | 2022-04-19 | Ctc—Centro De Tecnologia Canavieira S.A. | Polypeptides having hydrolytic activity on 1-kestose in the presence of sucrose but lacking sucrase (invertase) activity, polynucleotides encoding same and methods of producting and using same in industrial sucrose production from 1-kestose |
| EP3490379A1 (en) | 2016-07-29 | 2019-06-05 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants |
| US20190281828A1 (en) | 2016-09-22 | 2019-09-19 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Novel triazole derivatives |
| BR112019005668A2 (pt) | 2016-09-22 | 2019-06-04 | Bayer Ag | novos derivados de triazol |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| CN106617081B (zh) * | 2016-09-26 | 2020-08-04 | 江南大学 | 长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用 |
| BR112019008455A2 (pt) | 2016-10-26 | 2019-07-09 | Bayer Cropscience Ag | uso de piraziflumida para o controle de sclerotinia spp. em aplicações de tratamento de semente |
| MX2019006738A (es) | 2016-12-08 | 2019-08-22 | Bayer Cropscience Ag | Uso de insecticidas para el control de gusanos. |
| EP3332645A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-13 | Bayer Cropscience AG | Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| WO2018108627A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| US11591601B2 (en) | 2017-05-05 | 2023-02-28 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes |
| WO2018213726A1 (en) | 2017-05-18 | 2018-11-22 | The Broad Institute, Inc. | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| WO2019025153A1 (de) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| US11618896B2 (en) | 2017-09-21 | 2023-04-04 | The Broad Institute, Inc. | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| EP3728575A4 (en) | 2017-12-22 | 2021-11-24 | The Broad Institute, Inc. | CAS12B SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED DNA BASE EDITING |
| US10968257B2 (en) | 2018-04-03 | 2021-04-06 | The Broad Institute, Inc. | Target recognition motifs and uses thereof |
| EP3802521A1 (de) | 2018-06-04 | 2021-04-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole |
| AU2019406778A1 (en) | 2018-12-17 | 2021-07-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof |
| WO2021061910A1 (en) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Production of oligosaccharides |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL100908A0 (en) * | 1991-02-22 | 1992-11-15 | Salk Inst Biotech Ind | Invertase genes and their use |
| US6025542A (en) * | 1992-12-28 | 2000-02-15 | Stichting Scheikundig Onderzoek In Nederland | Method for obtaining transgenic plants showing a modified fructan pattern |
| DE4316425C2 (de) * | 1993-05-17 | 1998-05-20 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung von langkettigem Inulin, das so hergestellte Inulin sowie dessen Verwendung |
| PT795018E (pt) * | 1995-01-06 | 2007-12-21 | Plant Res Int Bv | Sequências de adn codificando enzimas de síntese de polímeros de hidratos de carbono e método para a produção de plantas transgénicas |
| DE19617687C2 (de) * | 1996-05-03 | 2000-11-16 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen |
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