JP2002316945A - 抗−血小板由来成長因子抗体を含んで成る医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 動物における血管形成、血管内膜切除又はバ
イパスの手術後の再狭窄を阻止するための新規な組成物
の提供。 【解決手段】 抗−血小板由来成長因子抗体（抗PDGF抗
体）を含んで成る、哺乳動物における血管形成、血管内
膜切除又はバイパスの手術後の再狭窄を阻止するための
組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物における
血管の損傷後の狭窄を阻止する方法およびそれらの方法
において有用な組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】血管壁の平滑筋細胞(SMC) の増殖は、ア
テローム性動脈硬化症における血管の病変の形成または
血管の損傷に対する応答において重要な事象である。ア
テローム性動脈硬化症の処置は、血管形成、血管内膜切
除およびバイパスの手術、アテローム性動脈硬化症のプ
ラークをカテーテル挿入により圧縮または除去する (血
管形成) か、あるいは動脈壁から切開によりストリッピ
ング除去する (血管内膜切除) か、あるいは閉塞部位の
近接または基部の静脈または動脈を吻合することによっ
てバイパスする (バイパス) 外科的手順によりブロック
された血管の清浄化を包含する。これらの手順は血管の
内皮を除去し、下に横たわる内膜層を混乱させ、そして
中間の SMCを死亡させる。この損傷に引き続いて中間の
SMCが増殖しそして内膜の中に移動し、これは特徴的に
損傷後の最初の数週内に起こりそして上に横たわる内皮
層が再び確立されるとき停止する。

【０００３】血管形成、血管内膜切除またはバイパスの
手術により処置される患者の30％〜40％またはそれ以上
において、血栓症および／または内膜の中の SMCの増殖
は血管の再閉塞およびその結果の血管形成、血管内膜切
除またはバイパスの手順の失敗を引き起こす。手術後の
血管のこの閉鎖は再狭窄として知られている。SMC の増
殖の同様なプロセスは、また、血管の移植片が動脈壁
に、ならびに器官の移植片とともに、外科的に接合され
る肛門周囲の口における血管の移植片において観察さ
れ、そして移植片の拒絶反応に寄与することがある。

【０００４】成長因子、例えば、血小板由来成長因子
(PDGF) はアテローム性動脈硬化症の班の発生において
ある役割を演ずることが仮定された (Rossら、Cell, 4
6：155-169, 1986 に概観されている）。PDGFは、ヒト
およびヒト以外の霊長類のアテローム性動脈硬化症にお
いて発生する病変のすべての段階におけるマクロファー
ジ内で検出された (Rossら、Science , 248 ：1009−10
12。1990) 。プラークの形成について提案された１つの
メカニズムは、 SMCの成長を刺激する成長因子の、内皮
の露出の部位における、血小板による解放である (Ross
およびGlomset, N.Eng. J. Med. , 295 ：369-377, 42
0−425, 1976 ；Ross, Arterosclerosis ,１：293-311,
1981)。

【０００５】Mooreら (Thrombos. Haemostas. (Stuttg.
) 35：70, 1976) およびFriedmanら、J. Clin. Inves
t., 60：1191−1201, 1977) は、身体に導入されたカテ
ーテルの損傷のモデルを使用して、抗血小板血清の投与
により誘発された延長された血小板減少症によるウサギ
の動脈中の実験的に誘発された内膜の病変の形成を報告
した。また、SMCはそれら自体PDGFを生成することがで
き、PDGFはオートクリンのメカニズムを通して病変の発
生を刺激することが仮定された(Ross ら、前掲；Walker
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83：7311−7315,198
6) 。

【０００６】Fingerleら (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 86：8412−8416,1989)は、血小板減少症のラットに
おける内膜の病変の形成を研究し、そして血小板はバル
ーンの損傷後の初期の SMCの増殖においてある役割を演
じないが、内膜の中への SMCの移動を調節することがあ
ると結論した。現在、血小板は、PDGF、形質転換性成長
因子のアルファおよびベータ(TGFαおよび TGFβ) 、イ
ンスリン様成長因子(IGF−I)および血小板誘導内皮細胞
成長因子を包含する、ある数の成長因子を解放すること
が知られている。しかしながら、特定の１または２以上
のミトゲンが動脈の病変の発生の原因となることを証明
する直接の証拠は存在しなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】血管形成、血管内膜切
除またはバイパスの手術による処置によるアテローム性
動脈硬化症のプラークの除去は制限された効能を有し、
そして再狭窄のための有効な処置は開発されてきていな
い。したがって、この分野において、血管の損傷、例え
ば、バルーンカテーテル挿入、血管内膜切除またはバイ
パスの手術後に、ならびに血管の移植片および器官の移
植片の中の血管の狭窄を減少または防止する方法が要求
されている。本発明はこのような方法を提供し、そして
他の関係する必要性を満足する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、血管形成、血
管内膜切除、バイパスの手術（動脈のバイパスの手術を
包含する）またはアテローム性動脈硬化症のプラークを
血管から除去する他の手順を包含する、血管の狭窄を阻
止する方法を提供する。これらの方法は、一般に、有糸
分裂誘発および／または平滑筋細胞の移動を阻止するた
めに十分な量の抗成長因子抗体を哺乳動物に投与するこ
とを含んでなる。好ましい実施態様の範囲内において、
抗体は抗線維芽細胞成長因子抗体または抗血小板由来成
長因子抗体である。モノクローナル抗体は好ましい。

【０００９】関係する面において、本発明は、哺乳動物
に再狭窄を阻止するために十分な量の抗成長因子抗体を
投与することを含んでなる、哺乳動物における血管形
成、血管内膜切除およびバイパスの手術後の再狭窄を阻
止する方法を提供する。抗線維芽細胞成長因子抗体およ
び抗血小板由来成長因子抗体を使用することができる。
１つの態様において、抗体は血管形成、血管内膜切除お
よびバイパスの手術の前に投与する。他の態様におい
て、抗体は血管形成、血管内膜切除およびバイパスの手
術に引き続いて投与する。なおいずれの場合において
も、抗成長因子抗体のパネル、例えば、血小板由来成長
因子のAA,ABおよびBBのイソ型を中和することができる
抗体のパネルを使用する。

【００１０】本発明の他の面は、抗線維芽細胞成長因子
抗体を哺乳動物に血管形成、血管内膜切除およびバイパ
スの手術の前に再狭窄を阻止するために十分な量で投与
し、そして抗血小板由来成長因子抗体を哺乳動物に血管
形成、血管内膜切除およびバイパスの手術に引き続いて
再狭窄を阻止するために十分な量で投与する、血管形
成、血管内膜切除およびバイパスの手術後の再狭窄を阻
止する方法を提供する。本発明のこれらおよび他の面
は、次の詳細な説明および添付図面を参照すると明らか
となるであろう。

【００１１】

【発明の実施の形態】前述したように、血管の再狭窄は
血管形成、血管内膜切除またはバイパスの手術を実施し
た患者において普通の問題である。再狭窄は外科的手順
により損傷された領域における血管の平滑筋細胞の増殖
（有糸分裂）および移動の両者を包含するプロセスを経
て進行すると信じられる。

【００１２】本発明は、塩基性線維芽細胞成長因子（塩
基性FGF またはbFGF) 、酸性線維芽細胞成長因子 (酸性
FGF またはaFGF) および／または血小板由来成長因子
（PDGF）の使用により血管の狭窄を阻止する方法を提供
する。ここにおいて使用するとき、「血管の狭窄」は、
細胞の移動および／または有糸分裂のための内膜の厚さ
増加による血管の部分的または完全な遮断を意味する。
狭窄の阻止は、細胞の移動、細胞の有糸分裂、または両
者を減少または防止することによって、狭窄のプロセス
を妨害することを包含すると理解されるであろう。抗成
長因子抗体の治療的使用が血管の平滑筋細胞(SMC) の移
動および／または有糸分裂を減少することによって、血
管の狭窄を阻止することができることを、本発明者らは
発見した。

【００１３】本発明の範囲内の有用な抗体は、免疫化お
よび精製の普通の手順により製造することができる。簡
単に述べると、精製された成長因子は動物、例えば、マ
ウス、ラット、ウサギまたはヤギに免疫反応を引き起こ
すために十分な量で投与される。成長因子をアジュバン
ト、例えば、フロインドアジュバントと組み合わせて免
疫応答を増強することが好ましい。成長因子の単一の投
与は動物において抗原の生産を誘発するために十分であ
ることがあるが、一般に、大量の初期の注射を投与し、
次いで１または２以上の促進剤の注射を数週〜数カ月の
期間にわたって行うことが好ましい。参照、例えば、Hu
rrell, J. G. R. 編、モノクローナルハイブリドーマ抗
体：技術および応用 (Monoclonal Hydoma Antibodies：
Techniquse and Applications) , CRC Press Inc.、フ
ロリダ州ボカレイトン、1982 (これをここに引用によっ
て加える) 。

【００１４】次いで配合を動物から集め、そして凝固さ
せ、そして抗体を普通の技術、例えば、塩の沈澱、イオ
ン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィーま
たは高性能液体クロマトグラフィーを使用して血清から
単離する。免疫化において使用する成長因子は天然源か
ら調製されるか、あるいは普通の方法、例えば、Raines
およびRoss (J. Biol. Chem., 257 ：5154−5160, 198
2), Antoniades (米国特許第 4,479,896号), Murrayら
(米国特許第 4,801,542号、米国特許第 4,845,075号お
よび米国特許第 4,889,919号) 、Bohlenら (FEBS Lett
, 185 ：177-181,1985), Barr(WO 90／05184), Fidde
sら(WO 87／01728)およびMascatelliら (欧州特許 (EP)
第 226,181号)(それらをここに引用によって加える)
により記載された方法に従い遺伝子操作された細胞から
調製される。別法において、精製された成長因子は商業
的供給会社から入手することができる (例えば、Genzym
e Corp. 、マサチュセッツ州ボストン； Collaborative
Reseach、マサチュセッツ州ベッドフォード) 。

【００１５】本発明の１つの態様において、モノクロー
ナル抗体を使用する。モノクローナル抗体はポリクロー
ナル抗血清に比較して生産が容易でありかつ治療的投与
量が少ないという利点を提供する。なぜなら、所望の特
異性をもつ抗体のみを使用するからである。モノクロー
ナル抗体を生産する方法はこの分野においてよく知られ
ておりそして、例えば、KohlerおよびMilstein (Natur
e, 256 ：495, 1975 ：Eur.J. Immunol. , ６：511-51
9, 1976)により開示されている。また、参照、Hurrel,
J. G. R.編、モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術
および応用（Monoclonal Hydoma Antibodies：Techniqu
se andApplications) , CRC Press Inc.、フロリダ州ボ
カレイトン、1982。当業者は理解するように、抗体断
片、例えば、Fab断片をまた使用できる。

【００１６】一般に、患者と同系であるか、あるいは同
系の一定領域を含有する抗体を使用することが好まし
い。この理由で、遺伝子操作した抗体を一般にヒトの処
置において使用する。組み換えヒト抗体またはヒト化さ
れたヒト以外の (すなわち、キメラ) 抗体を生産する方
法は、 Cabillyら (米国特許第 4,816,567号) 、Robins
onら(WO 87／02671)およびNeumaier(WO 90／00616) (こ
れらをここに引用によって加える) により開示されてい
る。簡単に述べると、ヒトの一定領域の遺伝子を適当な
ヒトまたはヒト以外の変動性の領域の遺伝子に接合す
る。

【００１７】次いで接合した遺伝子を宿主細胞の中にト
ランスフェクションし、これらの細胞を普通の手順に従
い培養する。別法において、モノクローナル抗体を生産
する細胞をクローニングしたヒトの一定領域の遺伝子で
トランスフェクションし、そしてキメラの抗体遺伝子を
相同性の組み換えにより発生させる。こうして、構造体
の有意の部分がヒトであるモノクローナル抗体をアセン
ブリングし、これによりヒトの患者への多数回の投与に
いっそう適当な抗体を得ることができる。

【００１８】本発明において、中和性抗体を使用するこ
とが好ましい。「中和性抗体」は、ここにおいて使用す
るとき、in vitro試験系において抗原の生物学的活性の
本質的にすべてをブロックするために十分な抗体の量を
表示する。適当なin vitro試験系は、なかでも、有糸分
裂誘発アッセイおよびリセプター結合アッセイを包含す
る。例えば、200 μｇ／mlのここに記載するポリクロー
ナル抗PDGFIgG は、２ng／mlのPDGFの二量体の形態の各
々のミトゲンおよび化学走性の活性をブロックすること
ができる。当業者は理解するように、所定量の抗原を中
和するために必要な抗体の量は、抗体の特異性および親
和性のような因子に依存するであろう。

【００１９】PDGFはその成分の鎖（Ａ鎖およびＢ鎖とし
て知られている）の３つの可能な二量体の組み合わせ
（イソ型）の混合物であるので、本発明において使用す
る抗PDGF抗体は好ましくはすべての３つのイソ型（AA,
BBおよびAB) を中和することができる抗体のパネルであ
る。モノクローナル抗体は好ましい。イソ型特異的抗PD
GFモノクローナル抗体をつくる方法はHartら (米国特許
出願第07／139,960 号；Biochemistry, 29：166-172, 1
990)により開示されている。イソ型特異的抗PDGFモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション (American TypeC
ulture Collection) 米国マリイランド州ロックビレ
に、受け入れ番号HB9610, HB9611, HB9612およびHB9613
で受託された。

【００２０】抗FGF 抗体および抗PDGF抗体は、組み合わ
せであるか、あるいはオーバーラップするか、あるいは
順次のスケジュールで投与することができる。組み合わ
せで使用するとき、抗体は一般に手術の前に投与しそし
て手術後数時間〜数日の間隔で１〜２週またはそれ以上
の過程にわたって続ける。多くの場合において、病院に
いるとき毎日添加し、次いで外来患者の処置の期間の間
に頻度が低いボーラスの注射を行うことが好ましいであ
ろう。別法において、抗FGF 抗体を、手術の前に、単独
であるいは抗PDGF抗体と組み合わせて投与し、そして患
者を前述したように手術後抗PDGF抗体で処置する。

【００２１】抗体の投与量は、前述したように、中和の
基準に基づいて選択する。投与量のレベルは、血液から
の抗体のクリアランスの決定後、中和のデータから計算
する。一般に、解放された成長因子を中和するために十
分な抗体の循環するレベルを維持するという目標をもっ
て、投与量は選択される。一般に、投与量は約20μｇ〜
600mg またはそれ以上の抗体／kgの患者の体重、好まし
くは 0.1mg〜20mg／kg、より好ましくは約１mg〜10mg／
kgの範囲である。２またはそれ以上の抗体を組み合わせ
て投与する場合、多少より高い投与量を必要とすること
がある。

【００２２】本発明において使用するために、抗成長因
子抗体を普通の手順に従い注射可能な組成物に配合し、
そして無菌の容器の中に包装する。抗体を適当な希釈
剤、例えば、無菌の生理食塩水または無菌の水と組み合
わせることができる。抗体の組成物は、さらに、担体、
安定剤および賦形剤、例えば、糖（例えば、マンニトー
ル）またはアルブミンを含有することができる。別法に
おいて、抗体は凍結乾燥した形態で提供し、そして使用
前に適当な希釈剤の中で再構成することができる。これ
らの組成物は単一のまたは多数の投与形態で、例えば、
密封したアンプルまたはバイアルの形態で包装すること
ができる。パッケージは１つの抗体、抗体の混合物（例
えば、抗PDGFおよび抗bFGF）または個々の抗体の組み合
わせを別々の容器または隔室の中に含有することができ
る。

【００２３】血管の移植片における狭窄を阻止するため
に、抗成長因子抗体を移植片にそれらの一定領域を通し
て共有結合するか、あるいは遅く解放性の配合物で移植
片の中に組み込むことができる。次の実施例によって、
本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限
定しない。

【００２４】実施例実施例１． 雄のニュージーランドウサギ（体重３kg）を
組み換えヒトbFGF（医薬の等級；Synergen, Inc.、コロ
ラド州ボウルダー、から入手した）で免疫化した。免疫
化は 120μｇのbFGFをフロインドアジュバント (Sigma
Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）と組み合わせ
て皮内注射することによって実施した。促進剤の免疫化
(60μｇのbFGF、皮内) を３週後に与え、そして内膜血
清を最初の免疫化後５週に得た。内膜血清の IgG分画を
プロテインＧセファロース（Sepharose)(Pharmacia LK
B、スウェーデン国ウップサラ) を使用するクロマトグ
ラフィーにより得た。免疫前の血清は免疫化前のウサギ
から得た。

【００２５】抗bFGFIgG の特異性を有糸分裂誘発アッセ
イにおいて３Ｔ３−Ｄ１細胞（スイスマウス３Ｔ３の線
維芽のサブクローン）について試験した。細胞を４×10
⁴ 細胞／ウェルの密度で24ウェルのトレーの中で10％の
仔ウシ血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地中で
プレートした。３日後、細胞はコンフルエンスに到達
し、そして追加の２日間 0.5％の仔ウシ血清を含有する
培地中のインキュベーションにより休止の状態にした。
組み換えPDGF−BB (Murrayら、米国特許第 4,845,075
号、引用によってここに加える、に本質的に開示されて
いるように酵母菌の中で調製した）、 EGF (培養等級；
Collaborative Research、マサチュセッツ州ベッドフォ
ード）およびbFGFを37℃において 100μｇ／mlの抗bFGF
IgG または免疫前のIgG と10分間前インキュベーション
した。

【００２６】次いで、休止の細胞を５ngの成長因子また
は５％の仔ウシ血清の存在下に20時間インキュベーショ
ンした。細胞の DNA（１μCi／ml、１×10⁵ 細胞／ウェ
ル）の中への〔 ³Ｈ〕−チミジン（6.7mCi／mmol, DuPo
nt−New England Nuclear)の組み込みを、２時間のパル
ス後、液体シンチレーションカウンターの中で測定し
た。図１に示すように、抗bFGFIgG はbFGFのミトゲン作
用を中和したが、PDGF、EGFまたは仔ウシ血清に対する
ミトゲン応答を有意に減少しなかった。この抗体は、ま
た、イムノブロットアッセイにおいて酸性線維芽細胞成
長因子と交差反応を示さず、そして露出された動脈への
初期の血小板の付着に対する作用をもたなかった。

【００２７】雄のスプレイク−ダウレイ (Spraque-Dawl
ey) ラット (月齢 3.5、体重 350〜400 ｇ) をタイラー
・ラボラトリーズ (Tyler Laboratories)(ワシントン州
ベレブエ) から入手した。動物を0.06mg／kgのフェンタ
ニル(Innovar-Ver, Pitman-Moore、イリノイ州ムンデリ
エン) の初期の筋肉内注射で麻酔し、そして必要に応じ
て追加の注射を行った。末端の左の総および外部の頸動
脈を首の中線の創傷を通して露出した。Fingerleら (Ar
teriosclerosis, 10：1082,1990) および Lindnerら (L
ab. Invest., 61：556, 1989)により本質的に記載され
ているように、フィラメントのループを使用して、左総
頸動脈から内皮を取り出した。

【００２８】モノフィラメントの縫合糸のループを、ポ
リエチレンのチューブから作られたトロカールを経て、
左の外部の頸動脈の中に導入した。この装置をトロカー
ルを通して総頸動脈の中に押し込み、次いで一定回転で
頸動脈に沿って着実に引き戻した。抗bFGF抗体 (10mg／
動物）を尾静脈を経て投与した。フィラメントのループ
で露出後５分に、同一の動脈のバルーンカテーテルの露
出を本質的にClowesら(Lab. Invest., 49：327, 1983)
記載されているように実施した。

【００２９】２つのフレンチバルーンカテーテルを外部
の頸動脈を通して導入し、そして生理食塩水で十分に拡
張したバルーンで総頸動脈を３回通過させて、わずかの
抵抗を発生させそして頸動脈それ自体の拡張を生成し
た。外部の頸動脈をカテーテルの除去後結紮し、そして
創傷を閉じた。手術後、抗bFGF抗体(2.5mg／動物）の５
回の追加の静脈内注射を４時間の間隔で実施した。対照
動物は、合致する濃度の非免疫 IgGを同一回数注射する
以外、同一の方法で処置した。

【００３０】バルーンカテーテルの損傷後24, 32および
40時間に、すべての動物をトリチウム化チミジン (50μ
Ci／100 ｇ体重) を注射した。注射後41時間に、動物を
灌流−固定した。簡単に述べると、動物を麻酔し、そし
てナトリウムペントバルビタールの注射により殺した。
カテーテルを頸動脈の中に入れ、そして動物をリンゲル
乳酸塩溶液で灌流し、次いでカコジレート緩衝液中の２
％のグルタルアルデヒド、１％のパラホルムアルデヒド
で生理学的圧力で５分間固定した。

【００３１】露出した頸動脈を切除し、そしてさらに灌
流に使用したのと同一の固定液の中の浸漬により固定し
た。組織の試料を断面切片標本作製のためにパラフィン
の中に埋め込んだ。１μｍの断面切片をコダックNTB 乳
剤の中に浸漬し、４℃で２週間貯蔵し、そしてコダック
Ｄ19現像剤で現像した。これらの条件下に、バックグラ
ウンドは無視できた。油浸漬下に細胞を計数することに
よってチミジンの指数を決定した。図２に示すように、
中間の SMCの増殖は抗bFGF抗体を与えた動物において有
意に減少した(1.5％／対照における 7.6％) 。

【００３２】実施例２．バルーンカテーテルの損傷を実
施例１に記載するようにラットにおいて誘発した。動物
の各々に10mgの抗bFGFIgG または非免疫IgGを手術前に
１回注射した。手術後の抗体の投与を省略した。すべて
の他の手順は実施例１に記載するように実施した。図１
に示すように、中間の SMCの増殖は損傷前の抗bFGF抗体
の１回の注射により減少した(1.4％／対照における16.8
％) 。

【００３３】実施例３．ヤギの抗血清を精製したヒトPD
GFに対してレイズさせた（RainesおよびRoss、前掲) 。
ほぼ75μｇの６回の注射を２週の間隔で与えた。初期の
注射は完全フロインドアジュバントを使用して実施し、
そして引き続く注射は不完全フロインドアジュバントを
使用して実施した。すべての注射は10〜15部位に皮下的
に与えた。最初の陽性の出血は最初の注射後３月であっ
た。抗体は動物の血漿瀉血により大量の抗体の頻繁な収
集を可能とし、そして血小板からの内因性PDGFの解放を
防止することによって得た。

【００３４】これらの研究において使用した抗体のすべ
ては 350μｇのPDGFの追加の注射後に獲得し、これによ
り血清力価の５〜20倍の増加を生じた。動物の典型的な
力価は、１：320 の血漿の希釈で３Ｔ３細胞上の２ng／
mlの精製したPDGFのミトゲン活性を除去した。血漿の18
％の硫酸ナトリウムの沈澱および引き続くDEAE−セファ
ロースのクロマトグラフィーにより、IgG 分画を得た。
同一手順により、正常のヤギIgG を調製した。両者の調
製物のタンパク質濃度を Lowryら (J. Biol. Chem., 19
3 ：265,1951) の方法により決定した。

【００３５】３つの異なる方法を使用して抗PDGF抗体の
特異性を評価した；インスリン、 EGF、血小板因子４、
β−トロンボグロブリン、 FGF、TGF −βおよび TGF−
αを包含する、 ¹²⁵Ｉ−試験物質の免疫沈澱；インスリ
ン、 EGF、 FGFおよび IGF−１を使用する実施例１に記
載するような３Ｔ３細胞上の試験試料のミトゲン活性の
阻止；および種特異性を評価するPDGF競争活性の阻止、
ここにおいてPDGFラジオリセプターのアッセイにおいて
ほぼ75％の競争を生じた血清濃度 (Bowen-PopeおよびRo
ss, Methods Enzymol., 109 ：69-100, 1985、に本質的
に記載されているように実施した）を、３Ｔ３細胞への
添加前に、 400μｇ／mlの抗PDGFIgG と37℃において１
時間前インキュベーションした。抗PDGFは二量体の形態
のPDGFのみを免疫沈澱させ、そして二量体の形態のPDGF
のミトゲン活性のみを中和した。ヒト、ブタ、イヌ、ウ
マ、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギおよびヒト以外
の霊長類からの血清中のPDGF競争活性は抗PDGFにより完
全に中和された。

【００３６】抗PDGFはラットの全血の血清の中に存在す
るPDGF結合競争活性を50μｇ／mlにおいて完全に中和し
た（図３）。ラットの全血の血清(WBS) の中のPDGF結合
活性を、標的細胞としてヒト包皮線維芽（SK５細胞）お
よび標準としてPDGF−ABを使用するラジオリセプターア
ッセイにより評価した (Bowen-PopeおよびRoss, Method
s Enzymol., 109 ：69, 1985) 。一定量のラットWBS(25
容量％、これは 2.5ngのPDGF−BB／mlに等しい) を、ラ
ジオリセプターアッセイによる評価前に、増加する濃度
の抗PDGFとインキュベーションした。¹²⁵ Ｉ標識したPD
GF−ABの特異的結合を各試料について決定し、そしてデ
ータを抗PDGFIgG の不存在下にラットWBS の中のPDGF競
争活性の中和％として表した。

【００３７】さらに、抗PDGFはラット平滑筋細胞による
PDGF誘発〔 ³Ｈ〕チミジンの組み込みを実質的に防止
し、そしてラット血小板解放物質のミトゲン活性の50％
を阻止した(Fernsら、Am. J. Pathol., 138：1045, 19
91) 。抗PDGFは、また、精製したPDGFへのラット頸動脈
平滑筋細胞の化学走性を阻止し、そしてラット血小板解
放物質の中の化学走性活性の大部分を阻止した (図
４）。対照的に、対照の培地、非免疫IgG およびPDGF−
AAは化学走性活性を示さなかった (図４)。

【００３８】抗体の in vivoの投与量レベルを決定する
ために、抗PDGFのクリアランスを評価した。酵素結合免
疫収着アッセイ(ELISA) により決定した抗PDGFで処置し
たラットにおける血漿抗体濃度は、30時間後に、50％だ
け減少し、そして抗PDGFIgGの毎日の腹腔内投与 (60mg
／100 ｇ体重) は実験の９日の期間の間1000μｇ／mlの
血漿濃度を維持した。これらの濃度において、血小板の
計数および補体レベルへの有意な効果は存在せず、そし
てラット血小板解放物質へのin vitro 化学走性は完全
に阻止された（図４）。

【００３９】月齢４〜５のホモ接合体のヌードラット
（ほぼ 200ｇの体重) を、ナショナル・インスチチュー
ツ・オブ・ヘルス (マリイランド州ベセスダ) から入手
し、そして病原体不含の設備の中に収容した。ヤギ抗PD
GFまたは非免疫ヤギIgG を、手術の前日に、腹腔内注射
により投与した。 600mg／100 ｇ体重の抗体投与量は、
投与後24時間に1.5 〜２mg／mlの抗体レベルを活性化す
るために十分であった。手術の日に、動物をケタミンお
よびロンプン（Rompun) を使用して麻酔し、そして両者
の総頸動脈に２フレンチ塞栓切除カテーテルを使用して
バルーンカテーテルを挿入した。手術の手順の間および
殺すとき血液試料を採って、各動物における抗体の循環
する血液レベルを決定した。

【００４０】動物を手術後８日に殺した。殺す前の17,
９および１時間に、動物に〔 ³Ｈ〕−チミジン（50μCi
／100 ｇ) を注射して、増殖する内膜および中間の細胞
を標識した。殺すとき、動物をケタミンおよびロンプン
で麻酔した。血液を抗体レベルのために採り、そして動
物にエバンスブルーを注射した。10〜15分後、頸静脈を
灌流のために分離し、カニューレを腹大動脈の中に導入
した。動物に致死的投与量のナトリウムペントバルビタ
ールを注射し、次いでリンゲル乳酸塩溶液で灌流し、そ
して４％のパラホルムアルデヒドでin situ 固定した。
両者の頸動脈を３つのセグメントに分割し、病変の均一
性を評価できるようにした。

【００４１】バルーンカテーテルの脱内皮前後の抗PDGF
の投与は、新内膜の厚さおよび細胞含量を減少した（図
５）。各実験群における19匹の動物の新内膜の定量的映
像分析は、抗PDGFの投与が新内膜の面積の40.9％の減少
を生じたことを証明した (Ｐ＜0.01、両側検定による）
（図６）。

【００４２】実施例４．抗ヒトPDGFポリクローナル抗体
を、実施例３に一般に記載するようにして得た。簡単に
述べると、ヤギをフロインド不完全アジュバントの中に
乳化した古くなったヒト血小板（RainesおよびRoss、前
掲) から精製したPDGFで免疫化し、そして２週毎に３カ
月間皮下投与した。いったん力価が確立されたとき、不
完全フロインドアジュバント中のPDGFの周期的促進で毎
週血漿瀉血により血漿を集めた。硫酸ナトリウムの沈澱
およびDEAE−セファセル(Sephasel)(Pharmacia、ニュー
ジャージイ州ピスカタウェイ) のカラムクロマトグラフ
ィーにより、濃縮された IgG分画を調製した。0.01Ｍの
リン酸塩緩衝液(pH6.8) で溶離して、精製された IgGを
得た。

【００４３】プールした空隙体積および pH6.8の洗浄液
を限外濾過 (PM−10, Amicon Corp.、マサチュセッツ州
デンバース) により濃縮しそして Lowryら (J. Biol.Ch
em., 193 ：265, 1951)の方法により決定して、ほぼ60
〜90mg／mlのタンパク質濃度にリン酸塩緩衝液に対して
透析した。ウシ血清アルブミンを標準として使用し、そ
して補正係数を免疫グロブリンについて適用した（Klos
seら、Clin. Chim. Acta, 32：321 , 1971)。使用前、
IgGを0.22μｍのフィルター(Millipore、マサチュセッ
ツ州ベドフォード) を通して滅菌濾過し、そして４℃で
貯蔵した。非免疫ヤギIgG を同一方法に従い、商業的に
入手可能なヤギ血漿を使用して調製した。抗体の特異性
を実施例３に記載するのと同一方法で評価し、同一の結
果が得られた。

【００４４】ホモ接合体のヌードラット（nu／nu) (Fer
nsら、Am. J. Path.,138 ：1045,1991)をナショナル・
インスチチューツ・オブ・ヘルス (マリイランド州ベセ
スダ)における育種コロニーから入手し、そして病原体
不含の設備の中に収容した。動物が20〜24の週齢(250〜
350 ｇ) になったとき、単一投与量の抗PDGF抗体 (60mg
／100 ｇ体重) を動物に腹腔内投与した。次いで、ほぼ
0.38％のクエン酸ナトリウム (最終濃度) を含有する管
の中に種々の時間に血液試料を抜き出した。血漿を分離
し、そして ELISAにより分析するまで−20℃で貯蔵し
た。

【００４５】マイクロタイタープレート (96ウェル、Nu
nc) を10ngのPDGF−AB／ウェルで18時間の間コーティン
グした。 PBS中の２％のウシ血清アルブミン（Sigma Ch
emical Co.、ミゾリー州セントルイス）／0.2 ％のツイ
ーン20で37℃において１時間の間ブロッキングすること
によって、非特異的タンパク質結合を減少した。標準お
よび試料の希釈物を、ラット血漿誘導血清および PTB(P
BS中の0.05％のツイーン20／0.2 ％のウシ血清アルブミ
ン) の１：16混合物の中で調製した。既知濃度の抗PDGF
IgG の試料または標準の100 μｌのアリコートを、ウェ
ルの中で37℃において90分間インキュベーションした。

【００４６】プレートを洗浄緩衝液 (0.05％のツイーン
20／0.9 ％のNaCl) の中で５回洗浄し、次いで PTB中の
100 μｌ／ウェルの１：1000ビオチニル化抗ヤギ IgG
(TagoDiagnsotics、カリフォルニア州バーリンゲイム)
と37℃において60分間インキュベーションした。結合し
ない二次抗体を洗浄緩衝液の中ですすぎ、次いでアビジ
ン／ビオチニル化ペルオキシダーゼとインキュベーショ
ンすることによって除去した。基質（ｏ−フェニレンジ
アミン、Sigma Chemical Co.) を0.05Ｍのクエン酸塩／
0.1ＭのNa₂HPO₄ (pH5.0) 中に溶解し、そして室温にお
いて15分間インキュベーションした。この反応を４Ｎ硫
酸の添加により停止させ、そして反応生成物の吸収を 4
90nmにおいて読んだ。

【００４７】腹腔内注射した抗PDGFIgG はほぼ24時間の
半減期を有した (図７）；ピークのレベルは投与後10時
間に得られた。この研究に含めたすべての動物は頸動脈
の損傷および殺す時間に1000μｇ／mlを越える抗PDGFの
血漿レベルを有した；大部分は2000μｇ／mlより大きい
レベルを有した。手術および殺す時間における血小板の
計数は抗PDGF抗体の処置により影響を受けなかった。ク
リアランスのデータに基づいて、抗体の毎日の腹腔内注
射は、ラットの血清の中に含有されるPDGFの作用を実質
的に防止するために必要なレベルよりほぼ10〜20倍高く
抗体レベルを維持することが発見された。

【００４８】抗体のプライミング投与後のほぼ18時間
に、ラットを腹腔内投与のキシラジン(Rompun, Miles L
aboratory Inc.、シャウニー、KA；40mg／kg）およびケ
タミン(Vetalar、ニュージャージイ州パーク−デイビ
ス；10mg／kg）で麻酔し、そして右頸動脈の分岐を近正
中の切開で露出させた。内皮をナイロンのフィラメント
で除去した(Fingerle ら、Arteriosclerosis, 10：108
2, 1989) 。血液試料を手術中に採り、0.38％のクエン
酸ナトリウムで凝固防止し、そして血漿を1000×ｇの遠
心により分離するまで氷上に保持し、そして−20℃で貯
蔵した。

【００４９】この試料を ELISA法を使用する手術の時に
おける血漿抗PDGFレベルの決定のために使用した。バル
ーンカテーテルの脱内皮後、皮膚および深い筋膜を金属
のクリップで閉じた。次いで各動物にさらに抗PDGF（ｎ
＝19) または非免疫IgG(ｎ＝16) を手術後に注射し、次
いで殺すまで毎日注射した。細胞を標識するために、殺
す17、９および１時間前に、各動物に60μCi／100 ｇの
³Ｈ−チミジン(New England Nuclear、マサチュセッツ
州ボストン) を注射した。

【００５０】手術後８日に、動物をキシラジンおよびケ
タミンで麻酔した。両者の頸静脈を露出させ、そして近
正中の腹の切開を実施して、カニューレの挿入のための
大動脈をアクセスした。血漿抗PDGF免疫グロブリンのレ
ベルの決定および血小板の計数のために、カニューレか
ら血液試料を採った。次いでカニューレを灌流装置に接
続した。動物に致死的投与量のナトリウムペントバルビ
タールを与え、頸静脈を切断し、そして動物を流出液が
透明となるまで 120mgHgの圧力においてリンゲル乳酸塩
溶液で灌流した。次いでこれを等張PBS(pH7.4)の中で４
％のパラホルムアルデヒドと交換し、これを同一圧力に
おいて15分間灌流した。 in situ固定後、頸動脈を分離
し、そして付着脂肪および結合組織を切除した。中央の
頸動脈セグメントをパラフィンの中に埋め込んだ。

【００５１】頸動脈の５ミクロンの切片をNTP-２写真乳
剤(Kodak、ニューヨーク州ロチェスター) の中に浸漬し
た (Clowesら、Lab. Invest.、49：327, 1983)。オート
ラジオグラフを14日間４℃において光を通さない箱の中
で露出し、次いでコダックＤ−19現像液を使用して現像
し、そしてコダックの急速定着液で定着した。細胞核を
ヘマトキシリンで染色した。核より上の５個より多い銀
粒子をもつ細胞は陽性と考えた。各頸動脈の２レベルか
らの二重反復実験の切片を油浸漬下にツアイス・アキソ
スコップ (Zeiss Axioskop) 顕微鏡を使用して100 ×の
倍率で検査した。ほぼ 600個の細胞／壁の隔室が、標識
した細胞の固体数の決定のために計数された。

【００５２】内膜および中間の断面積を、ライツ(Leit
s) の顕微鏡 (25×の対物レンズ、ディジタル化パッド
およびIBM PC, Vids−Ｖソフトウェア (Ai Cambridge、
英国パプワース) をもつ、を装備した) から成る映像分
析システムを使用して測定した。群の平均の比較をマン
−ウィトネイ (Mann-Whitney) Ｕ検定により実施した。
損傷後８日に、ナイロンフィラメントのループによる頸
動脈の損傷は厚くなった内膜を生じ、これは（対照動物
において）頸動脈の合計の断面積のほぼ１／５を構成し
た。新内膜の細胞性および内膜：中間の断面積は、対照
動物に比較して抗PDGF抗体処置した動物（図８および図
９）において、それぞれ、33.2％ｏ（ｐ＜0.025)および
33.8％（ｐ＜0.025)だけ減少した。

【００５３】ループの損傷は新内膜細胞において顕著な
増殖の応答を誘発した。損傷後８日に、内膜細胞のほぼ
30％はチミジンで標識された。この時までに、中間の細
胞の増殖はほぼ２％に低下した。内膜の厚さ増加および
細胞性へのその作用と対照的に、抗PDGF抗体は内膜およ
び中間の細胞の増殖に有意の作用をもたなかった（図１
０）。

【００５４】実施例５．正常の雄のスプレイク−ダウレ
イ（Spraque-Dawley) ラットをエーテルで麻酔しそし
て、正常のヤギ IgGまたはヤギ抗PDGFIgG を有するリン
酸塩緩衝液(PBS)で腹腔内注射した。投与の体積は９ml
／kgであり、そして IgGの投与量は 600mg／kgであっ
た。抗PDGFおよび正常の IgGの両者は実施例３および４
に記載するように調製した。最初の注射後24時間に、動
物をケタミン／キシラジンで麻酔し、そして両者総頸動
脈を生理食塩水充填した、サイズ２のフレンチバルーン
カテーテルの３回通過により損傷した。 PBSおよび IgG
の他の注射をカテーテル挿入直後に与えた。

【００５５】それ以上の注射をカテーテル挿入後１，２
および３日にエーテル麻酔下に与えた。カテーテル挿入
第４日に、動物をナトリウムペントバルビタールの注射
により殺し、次いでリンゲル緩衝液で灌流して放血し
た。左総頸動脈を生化学的分析のために取り出した。右
総頸動脈を 120mmHgにおいてカイ(Chi) 固定液 (リン酸
塩緩衝液中の２％のグルタルアルデヒド、１％のパラホ
ルムアルデヒド）で灌流した。この血管は前向きの走査
型電子顕微鏡検査のために調製した。

【００５６】別の手順において、正常のスプレイク−ダ
ウレイ(Spraque-Dawley)ラットをケタミン／キシラジン
で麻酔し、そして両者総頸動脈をフィラメントのループ
のカテーテルを使用して内皮露出した。 PBS、ウサギ抗
塩基性 FGF IgG、または正常のウサギIgG を1.34ml／ラ
ットの投与体積で静脈内注射した； IgGの投与量は10mg
／ラットであった。抗塩基性IgG および正常のウサギIg
G の両者は実施例１に記載するようにして調製した。注
射後５分に、両者の総頸動脈を生理食塩水充填した、サ
イズ２のフレンチバルーンカテーテルの３回通過により
再び損傷した。

【００５７】さらに PBS、抗塩基性FGF および正常のIg
G(0.67ml／ラット；５mgの IgG／ラット）をカテーテル
挿入後１，２および３日にエーテル麻酔下に注射した。
カテーテル挿入第４日に、動物をナトリウムペントバル
ビタールの注射により殺し、次いでリンゲル緩衝液で灌
流して放血した。左総頸動脈を生化学的分析のために取
り出した。右総頸動脈を 120mmHgにおいてカイ(Chi) 固
定液 (リン酸塩緩衝液中の２％のグルタルアルデヒド、
１％のパラホルムアルデヒド）で灌流した。この血管は
前向きの走査型電子顕微鏡検査のために調製した。

【００５８】上の手順からの血管を縦方向に開き、そし
てテフロン（登録商標）のカード上のピンで取り出し
た。それらをエタノール系列を通して脱水し、次いで臨
界点ドライヤーの中で二酸化炭素の臨界点において乾燥
した。乾燥した標本をアルミニウムのスタブにコロイド
状銀ペーストで取り付けた。金／パラジウムでスパッタ
ーコーティングした後、標本を JEOL35C走査型電子顕微
鏡の中で15kVの加速電圧および86倍の倍率で検査した。

【００５９】目盛り付きのグリッドを有するアセテート
のシートを顕微鏡のスクリーン上に配置した。グリッド
の各正方形は、標本上の4133μｍ² に相当する、81mm²
の面積を有した。標本の合計の面積および内膜の平滑筋
細胞で占有された面積を正方形を計数することによって
決定した。平滑筋細胞の移動の程度を、平滑筋細胞によ
り占有された合計の内膜面積の百分率として表す。結果
を表１および表２に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】表１に示すように、 PBSと正常の IgGの群
の間に有意差は存在しないが、抗PDGFIgG を使用する処
置は移動の程度を79.0％（ｐ＜0.01) だけ減少した。

【００６２】

【表２】

【００６３】表２に示すように、 PBSと正常の IgG処置
群の間に有意差は存在しないが、抗PDGFIgG を使用する
処置は平滑筋細胞の移動の程度を80.3％（ｐ＜0.01) だ
け減少した。以上から理解されるように、本発明の特定
の実施態様を例示の目的で記載したが、種々の変更を本
発明の精神および範囲から逸脱しないでなすことができ
る。したがって、本発明は添付する請求の範囲による以
外は限定されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、５ngの各bFGF, PDGF−BBおよび EGF、
および仔ウシ血清 (５％）に対して応答する３Ｔ３−Ｄ
１細胞の増殖への抗bFGF抗体の作用を示す。

【図２】図２は、抗bFGF抗体または対照（非免疫）抗体
で処置した動物においてバルーンカテーテルの露出後41
時間における、中間の平滑筋細胞の複製を示す。データ
は平均＋／−SEM を表す。

【図３】図３は、ラットの全血血清の中のPDGF活性への
ヤギ抗PDGFの作用を示すグラフである。結果は三重反復
実験の決定についての平均＋／−SEM として表されてい
る。

【図４】図４は、ラットの血小板の解放物質の化学走性
的応答の抗PDGFIgG 阻止を示すグラフである。試料は次
のように識別する：（１)，PDGF−AA (５ng／ml）；
（２），PDGF−BB (10ng／ml）；（３），TGF −β(300
pg／ml）；（４），bFGF(500pg／ml）；（５)、ラット
の血小板の解放物質 (RPR)；（６）， RPR＋500 μｇの
抗PDGF／ml；（７）， RPR＋１mgの抗PDGF／ml；
（８）、非免疫 IgG (１mg／ml）；および（９）、対照
培地。結果は緩衝液の対照より上の細胞の移動における
倍数増加（平均＋／−SEM)として表す。

【図５】図５は、バルーンカテーテルの損傷後８日にお
ける内膜の平滑筋細胞の蓄積の阻止を比較して示す１対
の写真である。パネルＡは非免疫ヤギの IgGを使用する
処置を表す；パネルＢは抗PDGFIgG を使用する処置を表
す。

【図６】図６は、バルーンカテーテルの損傷後の内膜の
平滑筋細胞の蓄積への非免疫 IgGおよび抗PDGFIgG の作
用を示すグラフである。測定は内膜の断面積について実
施し、そして結果を平均＋／−SEM として表す。

【図７】図７は、単一の腹腔内注射の投与（60mg／100
ｇ体重) 後にヌードラットの血漿からの抗PDGFIgG のク
リアランスを示す勾配である。

【図８】図８は、ヌードラットの右頸動脈のフィラメン
トのループの損傷に対する内膜および中間の応答への抗
PDGFの作用を示し、内膜−培地の断面積への作用を描写
する。

【図９】図９は、ヌードラットの右頸動脈のフィラメン
トのループの損傷に対する内膜および中間の応答への抗
PDGFの作用を示し、内膜の細胞性への作用を描写する。

【図１０】図１０は、ヌードラットの右頸動脈のフィラ
メントのループの損傷に対する内膜および中間の応答へ
の抗PDGFの作用を示し、Ｈ−チミジンの組み込みおよび
オートラジオグラフィーにより測定した損傷後８日にお
ける内膜および中間の増殖への作用を描写する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レイディ，マイケル エー. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，エイティセカンド ノースイース ト 508 (72)発明者 レインズ，エレイン ダブリュ. アメリカ合衆国，ワシントン 98146，シ アトル，ショアウッド ドライブ サウス ウエスト 12153 (72)発明者 リンドナー，ボルクハード アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル，トゥエンティシックスス アベニ ュ ノースウエスト 8315 (72)発明者 ファーンズ，ゴードン エー．エー. イギリス国，エセックス シーエム14 ４ エスユー，ブレントウッド，ウエスタン ロード 55 (72)発明者 ジャクソン，クリストファー イギリス国，ケント シーゼット13 ９ジ ェイアール，サンドウィッチ，セント ジ ョージズ ロード ４ Ｆターム(参考） 4C085 AA14 BB11 CC04 DD22 DD23 DD33 DD34 EE06 FF24

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗−血小板由来成長因子抗体（抗PDGF抗
   体）を含んで成る、哺乳動物における血管形成、血管内
   膜切除又はバイパスの手術後の再狭窄を阻止するための
   組成物。
2. 【請求項２】 前記抗PDGF抗体が、PDGFのAA、AB及びBB
   イソタイプを中和することができるものである、請求項
   １に記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記抗体がモノクローナル抗体である、
   請求項１又は２に記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記組成物が前記抗PDGF抗体のパネルか
   らなる、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
5. 【請求項５】 抗−血小板由来成長因子抗体（抗PDGF抗
   体）を含んで成る、平滑筋細胞の移動又は有糸分裂を阻
   止するための組成物。
6. 【請求項６】 前記抗PDGF抗体が、PDGFのAA、AB及びBB
   イソタイプを中和することができるものである、請求項
   ５に記載の組成物。
7. 【請求項７】 前記抗体がモノクローナル抗体である、
   請求項５又は６に記載の組成物。
8. 【請求項８】 前記組成物が前記抗PDGF抗体のパネルか
   らなる、請求項５〜７の何れか１項に記載の組成物。