JP2002509728A

JP2002509728A - 病原体誘導性プロモーター

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Publication number: JP2002509728A
Application number: JP2000541316A
Authority: JP
Inventors: マールテンヘンドリックストイフェル，; イェローメヒューベルティーナヘンリキュスフェクトルクステルス，; ランベルトゥスヘンリキュスシモンス，
Original assignee: シンジェンタモーヘンビー．ブイ．
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2002-04-02
Also published as: CN1295621A; WO1999050428A3; BR9909360A; AU3419099A; CA2324969A1; CO4820447A1; PL343636A1; AR015255A1; WO1999050428A2; PE20000357A1; MA24792A1; US6465636B1; ZA200005113B; EP1062356A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物のヘキソースオキシダーゼの発現を正確に駆動する、病原体誘導性プロモーター、特に、ＨｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓおよびＬａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａから単離され得る、病原体誘導性プロモーター、より具体的には、通常、それぞれヘキソースオキシダーゼＭＳ５９およびＷＬ６４の発現を駆動する調節領域である病原体誘導性プロモーターを記載する。これらの病原体誘導性プロモーターが抗病原体タンパク質の発現または過感受性応答を誘発し得るタンパク質の発現を駆動するキメラ構築物もまた、特許請求される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、病原体誘導性プロモーターの分野、およびこのプロモーターを含む
キメラＤＮＡ配列、特に植物の生物工学の領域に関する。

【０００２】（背景技術）誘導性プロモーターは、インデューサーへの暴露に応答して、所定の遺伝子に
より産生される遺伝子産物の量を増大し得る任意のプロモーターを含む。インデ
ューサーの非存在下において、このＤＮＡ配列は転写されない。代表的には、特
異的に誘導性プロモーターに結合し転写を活性化する因子は、不活性形態で存在
し、これは次いで、このインデューサーにより直接的または間接的に活性形態に
変換される。このインデューサーは、タンパク質、代謝物（糖、アルコールなど
）、増殖レギュレーター、除草剤、またはフェノール性化合物のような化学的因
子、あるいは熱、塩、創傷、毒素エレメントなどによって直接的に課される生理
的ストレス、あるいは間接的に病原体または疾患因子（例えば、ウイルス）の作
用を介するものであり得る。誘導性プロモーターを含む植物細胞は、細胞にイン
デューサーを外部的に適用することによって（例えば、噴射、灌水（ｗａｔｅｒ
ｉｎｇ）、加熱、または類似の方法によって）、インデューサーに暴露され得る
。誘導性プロモーターは、当業者に公知であり、そして目的の遺伝子の発現を駆
動するために使用されるものがいくつか存在する。誘導性プロモーターの例とし
ては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの誘導性７０ｋＤ熱シ
ョックプロモーター（Ｆｒｅｅｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ
．１９、２９７〜３２３）およびエタノールにより誘導されるアルコールデヒド
ロゲナーゼプロモーター（Ｎａｇａｏ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｍｉｆｌｉｎ，Ｂ．Ｊ．（
編）ＯｘｆｏｒｄＳｕｒｖｅｙｓｏｆＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、第３巻、３８４〜４３８貢、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、１９８６）が挙げられる。単純な化学物質により誘導
可能であるプロモーターについての例は、ＷＯ９０／０８８２６、ＷＯ９３
／２１３３４、ＷＯ９３／０３１２９４およびＷＯ９６／３７６０９に記載
されるプロモーターである。

【０００３】誘導性のプロモーターの重要なサブクラスは、病原体の感染の際に植物におい
て誘導されるプロモーターである。病原体誘導性プロモーターの例としては、ジ
ャガイモから入手可能なＰＲＰ１プロモーター（ｇｓｔ１プロモーターとも呼ば
れる）（ＭａｒｔｉｎｉＮ．（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２
６３、１７９〜１８６）、Ｆｉｓ１プロモーター（ＷＯ９６／３４９４９）、
Ｂｅｔｖ１プロモーター（Ｓｏｗｏｂｏｄａ，Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌ
ｌａｎｄＥｎｖ．１８、８６５〜８７４、１９９５）、Ｖｓｔ１プロモータ
ー（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆＨｏｈ
ｅｎｈｅｉｍ、１９９４；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．らＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．３４、４１７〜４２６、１９９７）、セスキテルペンシクラーゼプロモー
ター（Ｙｉｎ，Ｓ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１５、４３７〜４５１
、１９９７）およびｇｓｔＡ１プロモーター（Ｍａｕｃｈ，Ｆ．およびＤｕｄｌ
ｅｒ，Ｒ．、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０２、１１９３〜１２０１、１９
９３）が述べられ得る。これらのプロモーターのいくつかの欠点は、それらがま
た構成的に活性であること、またはそれらが特定の型の病原体に反応しないこと
である。さらに、病原体の感染後非常にすぐ（すなわち、できるだけ短い誘導時
間で）発現を調節するプロモーターを有することは利点である。

【０００４】従って、先行技術の不都合を克服する、病原体誘導性であるプロモーターにつ
いての必要性がなお存在する。

【０００５】（発明の要旨）本発明者らは、ここで、植物中に再導入された場合に会合したＤＮＡ配列の病
原体誘導性転写を促進し得る、ヘキソースオキシダーゼをコードする植物遺伝子
の上流調節領域であるＤＮＡフラグメントを見出した。好ましくは、このような
フラグメントは、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓから入手可能である。上
記のＤＮＡフラグメントは、具体的には、ヘキソースオキシダーゼをコードする
遺伝子の上流調節領域（ＭＳ５９として呼ばれる）であり、より具体的には、配
列番号１５に示される１〜１８８９のヌクレオチド配列を包含する点で特徴付け
られる。

【０００６】本発明の部分はまた、植物中に再導入された場合に会合したＤＮＡ配列の病原
体誘導性転写を促進し得る、Ｌａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａから入手可能である
ＤＮＡフラグメントであり、具体的には、ヘキソースオキシダーゼをコードする
遺伝子の上流調節領域であるＤＮＡフラグメントである（ＷＬ６４として呼ばれ
る）（配列番号１８）。

【０００７】本発明にはまた、植物中に再導入される場合に会合したＤＮＡ配列の病原体誘
導性転写を促進し得る、任意の上記に従うＤＮＡフラグメントの部分または改変
体が含まれる。

【０００８】本発明の実施態様は、転写の指向性において、上記のＤＮＡフラグメントのい
ずれか１つに従うＤＮＡフラグメントおよびその転写制御下で発現されかつ天然
には上記ＤＮＡフラグメントの転写制御下ではないＤＮＡ配列を含む、キメラＤ
ＮＡ配列である。好ましい実施態様は、この発現されるＤＮＡ配列が抗病原体タ
ンパク質の産生を生じるようなキメラＤＮＡ配列であり、これは、好ましくは、
シチナーゼ、グルカナーゼ、オスモチン、マガイニンス（ｍａｇａｉｎｉｎｓ）
、レクチンス（ｌｅｃｔｉｎｓ）、サッカリドオキシダーゼ、シュウ酸オキシダ
ーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の毒素、Ｍｉｒａｂ
ｉｌｉｓｊａｌａｐａ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓ
ｓｉｃａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄａｈｌｉａ、Ｃｎｉｃ
ｕｓ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ、Ｃｌｉｔｏｒｉａ、Ａｌｌｉｕｍ種子、Ａｒａｌｉａ
およびＩｍｐａｔｉｅｎｓから単離された抗真菌タンパク質、ならびにアルブミ
ン型タンパク質（例えば、チオニン、ナピン、オオムギのトリプシンインヒビタ
ー、穀物のグリアジンおよびコムギαアミラーゼ）からなる群から選択される。

【０００９】本発明のキメラＤＮＡ配列の別の実施態様は、この発現されるＤＮＡ配列が過
感受性応答を誘導し得るタンパク質の産生を生じるキメラＤＮＡ配列であり、こ
れは、好ましくは、トマト由来のＣＦおよびＰｔｏタンパク質、Ｃｌａｄｏｓｐ
ｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ由来のａｖｒタンパク質、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓまたはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のエリシター（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）タン
パク質からなる群から選択される。

【００１０】本発明のさらなる部分は、好ましくは、上記ＤＮＡフラグメントの制御下で発
現されるＤＮＡ配列の挿入のための制限エンドヌクレアーゼについての少なくと
も１つの認識部位を有する、上記のキメラＤＮＡ配列を含むレプリコンである。
そのようなレプリコンを含む微生物、ゲノム中に取り込まれた上記に従うキメラ
ＤＮＡ配列を有する植物細胞、および上記の細胞から本質的になる植物がまた、
本発明において含まれる。このような植物は、好ましくは、双子葉類植物である
。種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉および木部から選択される上記の植物の
部分もまた、本発明の部分を形成する。

【００１１】本発明のなお別の実施態様は、植物において病原体誘導性プロモーターを促進
し得るホモログを同定するための、上記のようなＮＤＡフラグメントの使用であ
る。

【００１２】さらに、植物を形質転換するための、本発明に従うキメラＤＮＡ配列の使用お
よびハイブリッド調節ＤＮＡ配列を作製するための、本発明に従うＤＮＡフラグ
メントの部分または改変体の使用は、本発明の部分である。

【００１３】本発明の別の目的は、植物に病原体抵抗性を付与するための、上記のようなキ
メラＤＮＡ配列の使用である。

【００１４】（発明の詳細な説明）本発明の主要な局面は、植物中に天然に存在し、かつヘキソースオキシダーゼ
をコードする発現を駆動する調節配列である。詳細には、この領域は、Ｈｅｌｉ
ａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓおよび／またはＬａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａ中、
特にそれぞれＭＳ５９遺伝子（配列番号１５）またはＷＬ６４遺伝子（配列番号
１７）の５’（上流）領域に生じる。これらの遺伝子は、ヘキソースオキシダー
ゼをコードし、これは、（真菌）病原体に対して毒性であることが見出されてお
り、そして、ＷＯ９８／１３４７８（本明細書によって参考として援用する）に
開示される。病原体感染の際に、これらの遺伝子が高度に発現され、このことが
病原体誘導能の指標であることが見出されている。病原体誘導性プロモーターは
、生物工学的耐性操作において大きな価値がある。

【００１５】本発明は特に、ヒマワリにおけるヘキソースオキシダーゼの発現を駆動するプ
ロモーター（「ｍｓ５９」と表す）に関して例示されるが、このｍｓ５９に相同
な遺伝子を駆動する全てのプロモーターは、ｍｓ５９のプロモーターとおよそ同
一である特性（すなわち、病原体感染（好ましくは真菌感染）によって誘導され
る発現活性）を有すると考えられる。相同な遺伝子のプロモーターは、特に病原
体による誘導に関連した類似の特性を共有することが、一般的に知られている。
これらの例は、病原性に関連するタンパク質オスモチンの発現を駆動するプロモ
ーター（ジャガイモのタンパク質オスモチン（Ｚｈｕら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓ
ｉｏｌ．１０８．９２９−９３７，１９９５）、タバコのタンパク質オスモチン
（Ｌｉｕら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，１０１５−１０２６，１９
９５）およびトマトのタンパク質オスモチン（Ｒｕｉｚ−Ｍｅｄｒａｎｏら、Ｐ
ｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０，１１９９−１２０２、１９９２）における
、病原体によるその誘導能は確立されている）；およびＰＲ−１０群の遺伝子の
発現を駆動するプロモーター（そのジャガイモのｐＳＴＨ−２プロモーター（Ｍ
ａｔｔｏｎ，Ｄ．Ｐ．およびＢｒｉｓｓｏｎ，Ｎ，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃ
ｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃ．２，３２５−３３１，１９８９）、Ａｓｐａｒａｇ
ｕｓｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓのＡｏＰＲ−１プロモーター（Ｗａｒｎｅｒら、
ＴｈｅＰｌａｎｔＪ．３，１９１−２０１，１９９３）およびＢｅｔｕｌａ
ｖｅｒｒｕｃｏｓａのＢｅｔｖ１プロモーター（Ｓｗｏｂｏｄａら、Ｐｌ
ａｎｔ，Ｃｅｌｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．１８，８６５−８７４，１９９５）は、
病原体誘導性であることが示されている）である。

【００１６】本明細書において、用語「調節配列」および「プロモーター」は、交換可能に
使用される。

【００１７】本発明は、とりわけ、本発明に従う調節配列を含むキメラＤＮＡ配列を提供す
る。発現キメラＤＮＡ配列は、自然界に天然には見出されないＤＮＡ配列を含む
任意のＤＮＡ配列を含むことを意味するべきである。例えば、キメラＤＮＡは、
調節領域を含むＤＮＡを含むことを意味するべきであり、この領域は、この植物
ゲノムが通常その天然の染色体領域中のこの調節領域のコピーを含むという事実
に関わらず、植物ゲノムにおける非天然の位置で病原体誘導性である。同様に、
この調節領域は、天然には見出されない植物ゲノムに取り込まれ得るか、または
天然に見出されないレプリコンもしくはベクター（例えば、細菌プラスミドまた
はウイルスベクター）に取り込まれ得る。キメラＤＮＡは、宿主中で複製可能な
ＤＮＡ分子に限定されるべきではないが、例えば、本発明に従う調節領域に物理
的に連結された特定のアダプター配列（ａｄａｐｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）に
よって、レプリコンに連結され得るＤＮＡを含むこともまた意味するべきである
。この調節領域は、その天然の下流オープンリーディングフレームに連結されて
いても、されていなくてもよい。

【００１８】その発現が本発明の病原体誘導性調節領域によって駆動される遺伝子のオープ
ンリーディングフレームは、ゲノムライブラリーに由来し得る。この後者におい
て、ゲノムライブラリーは、本発明に従うタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを構成するエキソンを分離する１つ以上のイントロンを含み得
る。このオープンリーディングフレームはまた、１つの連続的なエキソンによっ
てコードされ得るか、または本発明に従うタンパク質をコードするｍＲＮＡに対
するｃＤＮＡによってコードされ得る。本発明に従うキメラＤＮＡ配列はまた、
１つ以上のイントロンが人為的に除去されているかまたは付加されている配列を
含む。これらの改変体の各々は、本発明に包含される。

【００１９】宿主細胞中で発現可能であるために、本発明に従う調節領域は通常、選択され
た宿主細胞中で発現され得る任意の遺伝子に適切に由来し得る転写開始領域、な
らびにリボソーム認識および接続のための翻訳開始領域とともに提供される。真
核生物細胞において、発現カセットは通常、上記のオープンリーディングフレー
ムの下流に位置する転写終結領域をさらに含み、このことは、転写が終結し、そ
して一次転写産物のポリアデニル化が生じることを可能にする。さらに、コドン
使用頻度は、選択される宿主の受容されたコドン使用頻度に適合され得る。さら
に、しばしば、シグナル配列がコードされ、この配列は、遺伝子発現産物の細胞
下区画への標的化を担う。選択された宿主細胞におけるキメラＤＮＡ構築物の発
現を支配する原理は一般的に、当業者に理解され、そして発現性キメラＤＮＡの
構築は、現在、原核生物または真核生物である宿主細胞の任意の選別について慣
用的である。

【００２０】キメラＤＮＡ配列が宿主細胞で維持されるために、キメラＤＮＡは、通常、認
識されそして選択された宿主細胞によって複製されるＤＮＡに連結された、本発
明に従うキメラＤＮＡ配列を含むレプリコンの形態で提供される。従って、この
レプリコンの選択は、選択される宿主細胞によってほとんど決定される。特定の
選択される宿主に適切なレプリコンの選択を支配するような原理は、十分に当業
者の分野内である。

【００２１】特別な型のレプリコンは、それ自体またはその一部が別の宿主細胞（例えば、
植物細胞）に転移されて、それにより本発明に従うオープンリーディングフレー
ムをこの植物細胞に同時転移することが可能であるレプリコンである。このよう
な能力を有するレプリコンは、本明細書中ではベクターという、このようなベク
ターの例は、Ｔｉプラスミドベクターであり、これは、適切な宿主（例えば、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中に存在する場合、それ
自体の一部（いわゆる、Ｔ領域）を植物細胞に転移し得る。異なる型のＴｉプラ
スミドベクター（ＥＰ０１１６７１８Ｂ１を参照のこと）は、現在、キ
メラＤＮＡ配列を、そのゲノム中にこのキメラＤＮＡを安定に取り込む新たな植
物が生成され得る植物細胞（または、プロトプラスト）に転移するために慣用的
に使用さていれる。Ｔｉプラスミドベクターの特に好ましい形態は、（ＥＰ０
１２０５１６Ｂ１およびＵＳ４，９４０，８３８）に請求されるような
いわゆるバイナリベクターである。本発明に従うＤＮＡを植物宿主に導入するた
めに使用され得る他の適切なベクターは、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭ
Ｖ）および一本鎖ウイルス、ジェミニウイルスなどから誘導可能なウイルスベク
ター（例えば、非組み込み植物ウイルスベクター）から選択され得る。このよう
なベクターの使用は、特に、植物宿主を安定に形質転換することが困難である場
合に有利であり得る。これは、木本植物質種（ｗｏｏｄｙｓｐｅｃｉｅｓ）、
特に樹木およびつる植物の場合である。

【００２２】表現「そのゲノム中に本発明に従うキメラＤＮＡ配列を取り込む宿主細胞」は
、細胞、ならびにこのような細胞を含む多細胞生物、または本質的にこのような
細胞からなる多細胞生物を含むことが意味されるべきであり、この細胞は、この
キメラＤＮＡをそのゲノム中に安定に取り込み、それによりキメラＤＮＡを維持
し、そして好ましくはこのようなキメラＤＮＡのコピーを子孫細胞に有糸分裂ま
たは減数分裂を通じて伝達する。本発明の好ましい実施態様に従って、植物が提
供され、この植物は本質的に、上記のキメラＤＮＡの１つ以上のコピーをそのゲ
ノム中に取り込む細胞、およびコピー（単数または複数）をその子孫に（好まし
くは、メンデル様式で）伝達し得る細胞からなる。いくつかまたは全ての植物細
胞における本発明に従うキメラＤＮＡの転写および翻訳により、上記の調節領域
を含むこれらの細胞は病原体の攻撃に応答し、従って、この調節領域の制御下で
オープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質を産生する。本
発明の特定の実施態様において、このタンパク質は、病原体感染に対する抵抗性
を付与し得る抗病原性タンパク質である。

【００２３】当業者に周知のように、植物遺伝子の調節領域は、遺伝子発現に関して興味深
い特性を有する個別の小領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）からなる。本明細書中で意
味されるような小領域の例は転写のエンハンサーであるが、サイレンサーでもあ
る。これらのエレメントは、一般的な（構成的な）方法で、または組織特異的な
様式で作動し得る。欠失は、本発明に従う調節ＤＮＡ配列で生成され得、そして
そのサブフラグメントは、関連ＤＮＡの発現パターンについて試験され得る。そ
のように得られる様々なサブフラグメント（またはその組み合わせさえ）は、病
原体抵抗性を操作する方法、または植物における異種ＤＮＡの発現を含む他の適
用において有用であり得る。機能的小領域を同定するための本発明に従うＤＮＡ
配列の使用、および植物における遺伝子発現を促進または抑制するための続くそ
のサブ配列の使用はまた、本発明に包含される。

【００２４】転写終結領域の必要性に関する場合、一般に、このような領域は植物細胞にお
ける転写の信頼性および効率を増強すると考えられている。それゆえ、その使用
は、本発明の状況において強く好ましい。

【００２５】本発明に従うＩＣＳ調節領域と組み合わせて使用され得るタンパク質の例とし
ては、以下：

【００２６】

【化１】から入手可能なβ−１，３−グルカナーゼおよびキチナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｍｇｉｅｎｓｉｓから単離されたマガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）
、レクチン、毒素、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ（ＥＰ０５７６４
８３）およびＡｍａｒａｎｔｈｕｓ（ＥＰ０５９３５０１およびＵＳ５，
５１４，７７９）から単離された抗真菌タンパク質、アルブミン型タンパク質（
例えば、チロシン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、オオムギトリプシンインヒビター、
穀類グリアジンおよび小麦αアミラーゼ、ＥＰ０６０２０９８）、Ｒａｐ
ｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄ
ａｈｌｉａ、Ｃｎｉｃｕｓ、ＬａｔｈｙｒｕｓおよびＣｌｉｔｏｒｉａから単離
されたタンパク質（ＥＰ０６０３２１６）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｂｒｉｚ
ａ、Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ、Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ、ＢａｐｔｉｓｉａおよびＭ
ｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓから単離されたタンパク質（ＰＣＴ／ＧＢ９３／０２１７
９）、シュウ酸オキシダーゼ（ＥＰ０６３６１８１およびＥＰ０６７
３４１６）、サッカリドオキシダーゼ（ＰＣＴ／ＥＰ９７／０４２９３）、Ａ
ｌｌｉｕｍ種子から単離された抗菌タンパク質（ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１６３６
）、ＡｒａｌｉａおよびＩｍｐａｔｉｅｎｓ由来のタンパク質（ＰＣＴ／ＧＢ９
５／００５０９）、ＨｅｕｃｈｅｒａおよびＡｅｓｃｕｌｕｓ由来のタンパク質
（ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２７６６）、上記のタンパク質の変異体ペプチド（ＰＣ
Ｔ／ＧＢ９６／０３０６５およびＰＣＴ／ＧＢ９６／０３０６８）などが挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００２７】誘導性プロモーターの別の使用は、遺伝子対遺伝子（ｇｅｎｅｆｏｒｇｅ
ｎｅ）抵抗性相互作用において役割を果たすタンパク質を駆動することである（
例えば、ＷＯ９１／１５５８５に記載される）。このようなタンパク質は、例え
ば、Ｋａｒｒｅｒ，Ｅ．Ｅ．ら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６，６８１
−６９０，１９９８）に開示されるような植物タンパク質、活性化ｎｄｒ１、活
性化ｅｄｓ１および活性化Ｘａ２１、トマト由来のＣｆタンパク質、ＢＳ３タン
パク質およびＰｔｏタンパク質、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ由
来のＲｐｍ１およびＲｐｓ２タンパク質、タバコ由来のＮ遺伝子、Ｃｌａｄｏｓ
ｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ由来のａｖｒエリシタータンパク質、Ｘａｎｔｈｏ
ｍｏｎａｓ由来のａｖｒＢｓ３、Ｅｒｗｉｎｉａ由来のハーピン（ｈａｒｐｉｎ
）、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のａｖｒＰｔｏタンパク質である。

【００２８】本発明の実際の適用性は、特定の植物種に限定されない。いくつかの形態の病
原体攻撃を受ける任意の植物種は、本発明に従うキメラＤＮＡ配列を用いて形質
転換され得、調節領域が病原体感染により誘導されることを可能にし、それによ
り、植物の細胞のいくらかまたは全てで産生される抗病原性タンパク質の産生を
誘発する。

【００２９】本発明の実施態様のいくつかは、例えば、いくつかの植物種が今のところ遺伝
的形質転換を実行可能でないので、現在実施可能ではないかもしれないが、この
ような植物種における本発明の実施は、単に時間の問題であって原理の問題では
ない。なぜなら、このような遺伝的形質転換に対する従順性は、それ自体が本発
明の実施態様を強調することに関連しないからである。

【００３０】植物種の形質転換は、現在、印象的な数の植物種（双子葉植物および単子葉植
物の両方を含む）に対して慣用的である。原則的には、細胞が全植物に再生可能
である限りは、任意の形質転換方法を使用して、本発明に従うキメラＤＮＡを適
切な祖先細胞に導入し得る。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリ
エチレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２９６，７２
−７４，１９８２；ＮｅｇｒｕｔｉｕＩ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ
．８，３６３−３７３，１９８７）、プロトプラストのエレクトロポレーション
（ＳｈｉｌｌｉｔｏＲ．Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．３，１０９９−１
１０２，１９８５）、植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａ
ｙＡ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２，１７９−１８５，１９８６
）、様々な植物材料のＤＮＡ（またはＲＮＡコートされた）粒子ボンバードメン
ト（ＫｌｅｉｎＴ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２７，７０，１９８７）、（非
組み込み）ウイルスを用いる感染などから適切に選択され得る。本発明に従う好
ましい方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介ＤＮＡ移入を含む。特に好まし
いのは、ＥＰＡ１２０５１６および米国特許第４，９４０，８３８号に開
示される、いわゆるバイナリベクター技術の使用である。

【００３１】トマトの形質転換は、好ましくは、本質的にＶａｎＲｏｅｋｅｌら（Ｐｌａ
ｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１２，６４４−６４７，１９９３）に記載される通り
に行なわれる。ジャガイモの形質転換は、好ましくは、本質的にＨｏｅｋｅｍａ
ら（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７，２７３−２
７８，１９８９）に記載される通りに行われる。一般的には、形質転換の後、植
物細胞または群化細胞（ｃｅｌｌｇｒｏｕｐｉｎｇ）は、本発明に従うタンパ
ク質をコードする核酸配列とともに同時移入された、植物で発現可能な遺伝子に
よってコードされる１つ以上のマーカーの存在について選択され、その後形質転
換した材料は、全植物に再生される。

【００３２】遺伝子形質転換はいくらかより困難であると考えられるが、単子葉植物は形質
転換に従順であり、そして稔性のトランスジェニック植物は、形質転換された細
胞または胚、あるいは他の植物材料から再生され得る。現在、単子葉植物の形質
転換に好ましい方法は、胚、外植片または懸濁細胞の微粒子銃、ＤＮＡの直接取
り込みまたはエレクトロポレーションである（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕ
ｒｅ３３８，２７４−２７６，１９８９）。トランスジェニックトウモロコシ
植物は、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（除草剤フォスフィ
ノスリシンを不活化する酵素）をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇ
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｂａｒ遺伝子を、トウモロコシ懸濁培養物の胚形成細胞
に、微粒子銃によって導入することにより得られている（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍ
ｍ，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２，６０３−６１８，１９９０）。遺伝物質の、他
の単子葉作物（例えば、コムギおよびオオムギ）のアリューロン（ａｌｅｕｒｏ
ｎｅ）プロトプラストへの導入が報告されている（Ｌｅｅ，ＰｌａｎｔＭｏｌ
．Ｂｉｏｌ．１３，２１−３０，１９８９）。コムギ植物は、胚形成懸濁培養物
から、胚形成懸濁培養物の樹立のための古いコンパクトな根粒状胚形成カルス組
織のみを選択することによって再生された（Ｖａｓｉｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．８，４２９−４３４，１９９０）。これらの作物についての形質転換系との
組みあわせは、本発明の単子葉植物への応用を可能にする。

【００３３】単子葉植物（コメおよびトウモロコシのような商業的に重要な作物を含む）は
また、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＤＮＡ移入が容易にできる（ＷＯ９
４／００９７７；ＥＰ０１５９４１８Ｂ１；ＧｏｕｌｄＪら、Ｐｌａ
ｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５，４２６−４３４，１９９１を参照のこと）。

【００３４】ＤＮＡ移入および再生に続いて、推定的に、形質転換植物を、例えば、サザン
分析を用いて、本発明に従うキメラＤＮＡの存在について、コピー数および／ま
たはゲノム組織を評価し得る。さらに、またはあるいは、新たに導入されたＤＮ
Ａの発現レベルは、ノーザンおよび／またはウエスタン分析（当業者に周知の技
術）を用いて、保証され得る。最初の分析（これは任意である）の後、新たに導
入された本発明に従うキメラＤＮＡの所望のコピー数および発現レベルを示す形
質転換植物は、病原体に対する抵抗性のレベルについて試験され得る。あるいは
、選択された植物は、別の回の形質転換に供されて、抵抗性レベルを増強するた
め、または抵抗性を幅広くするために、例えば、さらなる遺伝子を導入され得る
。

【００３５】他の評価としては、野外条件下での病原体抵抗性の試験、稔性のチェック、収
率、および他の特徴が挙げられ得る。このような試験は、現在、当業者によって
慣用的に実施されている。

【００３６】このような評価に続いて、形質転換植物は直接生長され得るが、通常は、新た
な変種の育種またはハイブリッドの作製などにおける親系統として使用され得る
。

【００３７】１つより多いキメラ遺伝子を構成的に発現し得るトランスジェニック植物を得
るために、以下を含む多数の代替物が利用可能である：Ａ．選択マーカー遺伝子に物理的に結合した多数の改変遺伝子を有するＤＮＡ（
例えば、バイナリベクターにおけるＴ−ＤＮＡ）の使用。この方法の利点は、キ
メラ遺伝子が物理的に結合されており、それゆえ単一のメンデルの遺伝子座とし
て移動することである。Ｂ．各々が１つ以上のキメラ遺伝子（好ましくは、選択マーカー遺伝子に結合さ
れている）を予め発現し得るトランスジェニック植物の、別の選択マーカーに結
合した１つ以上のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物由来の花粉を用い
る他花受粉。後は、この交配によって得られる種子は、おそらく、２つの選択マ
ーカーの存在に基づいて、またはキメラ遺伝子自体の存在に基づいて選択され得
る。選択された種子から得られた植物は、後に、さらなる交配のために使用され
得る。原則として、キメラ遺伝子は、単一の遺伝座上にはなく、それゆえ、この
遺伝子は、独立した遺伝子座として分離し得る。Ｃ．各々が１つ以上のキメラ遺伝子および選択マーカーを有する多数の複数のキ
メラＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）の使用。同時形質転換の頻度が高いなら
ば、１つのみのマーカーに基づく選択で十分である。他の場合、１つより多いマ
ーカーに基づく選択が好ましい。Ｄ．第１、第２（など）のキメラ遺伝子を予め含有するトランスジェニック植物
の、新たなキメラＤＮＡ（選択マーカー遺伝子を必要に応じて含む）との連続的
形質転換。方法Ｂにおけるように、キメラ遺伝子は、原則として、単一の遺伝子
座上になく、それゆえ、キメラ遺伝子は、独立した遺伝子座として分離し得る。
Ｅ．上記のストラテジーの組み合わせ。

【００３８】実際のストラテジーは、親系統の目的のようにおそらく容易に決定されるが（
直接的な生長、育種プログラムにおける使用、ハイブリッドを産生するための使
用）、記載の発明に関しては重要ではないようないくつかの考慮に依存し得る。

【００３９】この状況において、キメラＤＮＡを予め含有する植物が、本発明に従ってさら
なるキメラＤＮＡを導入するための適切な遺伝的バックグラウンドを形成し得る
（例えば、抗病原体物質の産生を増強し、それにより、抵抗性レベルを増強する
ために）。調節ＤＮＡフラグメントと組み合わせて適切に使用され得るタンパク
質に対応する他の遺伝子のクローニング、およびこの遺伝子を比較的過剰に発現
し得るトランスジェニック植物の獲得、ならびに植物における病原体抵抗性にお
けるそれらの効果の評価は、現在、当業者の範囲内である。

【００４０】病原体に対する改善された抵抗性を有する植物は、野外で、温室で、または室
内で、またはどこでも生長し得る。植物またはその食用部分は、動物食餌または
ヒト消費のために使用され得るか、または食品、餌、または他の目的のために、
任意の形態の農業または産業において処理され得る。農業は、園芸、樹木栽培、
花卉栽培などを含むことが意味されるべきである。本発明に従う植物材料からの
利点を受け得る産業としては、製薬産業、紙およびパルプ製造産業、糖製造産業
、餌および食品産業、酵素製造業などが挙げられるがこれらに限定されない。本
発明に従う植物またはその一部の利点は、殺生物剤処理の必要性を減少すること
であり、従って材料コスト、労働力、および環境汚染を低減させるか、またはこ
のような植物の産物（例えば、果実、種子など）の有効期間を延長する。本発明
の目的のための植物は、光合成が可能で、そしていくつかの形態の病原体攻撃を
受ける多細胞生物を意味するべきである。それらは少なくとも、被子植物および
裸子植物、単子葉植物および双子葉植物を含むべきである。

【００４１】（実施例１）（ヒマワリ植物におけるｍｓ５９メッセンジャーの誘導）７〜８週齢のヒマワリ植物（ＨｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓｃｖＺ
ｅｂｕｌｏｎ）の葉を、５ｍＭのサリチル酸（ＳＡ）での５回の噴霧、１ｍＭの
サリチル酸での１回の噴霧、０．１ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）で１回、１ｍＭ
のＡＣＣ（植物ホルモンエチレンの前駆体である１−アミノシクロプロパン−１
−カルボン酸）で１回、または傷つけ（ｗｏｕｎｄｉｎｇ）により、誘導した。
葉のサンプルを、誘導２４時間後（１ｍＭＳＡ、０．１ｍＭＪＡ、１ｍＭ
ＡＣＣおよび傷つけ）、および誘導５日後（５ｍＭＳＡ）の葉から収集した。
コントロールサンプルを非誘導性の植物における誘導後２４時間で採取した。

【００４２】（実施例２）（ヒマワリ葉組織からのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成）全ＲＮＡは、温フェノール法を用いて１０ｇの葉材料から抽出し、そしてＱｉ
ａｇｅｎＲＮＡ緩衝液セットおよびｔｉｐ−１００カラム（ＱｉａｇｅｎＧ
ｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。混入したＤＮＡを、ＤｎａｓｅＩ
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）処理を用いて分解した。

【００４３】ｃＤＮＡは、製造業者により記載されたように、１μｇの全ＲＮＡ、１μｌの
オリゴ（ｄＴ）_12-18プライマー（５００μｇ／ｍｌ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｉｐｔＩＩＲＴＲＮＡｓｅＨ^-逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて調製した。

【００４４】（実施例３）（ｍｓ５９のＰＣＲＭＩＭＩＣの構築および競合的ＲＴ−ＰＣＲによるサン
プルの分析）ｍｓ５９の転写レベルを、競合的ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて決定した。この技
術においては、ｃＤＮＡ標的と人工的ＰＣＲＭＩＭＩＣ（模倣物）との間の競
合が、転写レベルの定量化を可能にする（ＰａｕｌＤ．Ｓｉｅｂｅｒｔおよび
ＪａｍｅｓＷ．Ｌａｒｒｉｃｋ（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ３５９、５５７
〜５５８）。

【００４５】ＰＣＲＭＩＭＩＣの構築のために、以下プライマーを開発した；

【００４６】

【数１】プライマーＦＲ−ｐＵＣ−２０８およびＦＲ−ｐＵＣ−２０９を用い、ＰＣＲ（
９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１０サイクル）により、プラスミドｐＵ
Ｃ１８由来の３８７ｂｐのフラグメント（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．
，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ３３
，１０３〜１１９）を増幅した。このＰＣＲ産物１μｇを、ＰＣＲによりプライ
マーＦＲ−ＭＳ５９−４７およびプライマーＦＲ−ＭＳ５９−７７を用いて増幅
し、大量のＰＣＲＭＩＭＩＣを作製した（９５℃１分、５５℃１分、７２℃２
分を３０サイクル）。

【００４７】プライマーＦＲ−ＭＳ５９−４７およびＦＲ−ＭＳ５９−７７は、ｍｓ５９
ｃＤＮＡ由来の３１２ｂｐのバンドを増幅し、そのため、これは２％アガロース
ゲル上で分離した場合、３８７ｂｐのＭＩＭＩＣから容易に識別し得る。ＰＣＲ
ＭＩＭＩＣ希釈物を、キャリアとして０．２μｇ／μｌのグリコーゲンを含有
するＨ₂Ｏ中に１００ｎｇ／μｌ〜０．０１ａｇ／μｌの範囲で作製した。

【００４８】

【表１】このｃＤＮＡサンプルを、競合的ＲＴ−ＰＣＲにおいて分析した。従って、２
μｌのサンプルを、１μｌの希釈されたＰＣＲＭＩＭＩＣと０．５ｍｌ試験管
中で合わせた（量；０．１ｐｇ、１０ｆｇ、１．０ｆｇ、０．１ｆｇ、１０ａｇ
および１．０ａｇ）。

【００４９】ｃＤＮＡおよびＭＩＭＩＣの増幅を、１０μＭのプライマーＦＲ−ＭＳ５９−
４７およびＦＲ−ＭＳ５９−７７、０．５μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ、１×ＰＣ
Ｒ緩衝液、ＭｇＣｌ₂ならびに２．５単位の組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて実行し、そして９５℃１分、５５℃１分、７２℃
２分の３５サイクルの処理をさせた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離
し、そして臭化エチジウムを用いた染色およびＵＶ照射器により可視化した。

【００５０】（実施例４）（異なる真菌を用いるヒマワリ植物における感染アッセイ）真菌の感染を、７〜８週齢の植物で実施した。植物に真菌が浸透し得るように
葉に小さいカットを作製した上に、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａの胞子
懸濁液、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｈｅｌｉａｔｈｉ（ＰＨ９９０５）菌糸フラグメ
ント懸濁液、またはＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの菌
糸フラグメント懸濁液の小滴（１５〜２０μｌ）を置くことにより、葉に接種し
た。真菌の感染は、１８℃および高い相対湿度（±９０％）で処理させた。感染
の部位を囲む葉のディスク（直径＝１３ｍｍ）を接種のおよそ４日後に回収した
。最初の小さい葉のディスクの穴のまわりに、さらに２５ｍｍの環を回収した。
葉のディスクをまた、コントロールとして、カットする葉のまわりの非感染の葉
において回収した。

【００５１】（実施例５）（ヒマワリ葉組織からのポリＡ⁺ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成）ポリＡ⁺ＲＮＡをＱｕｉｃｋｐｒｅｐＭｉｃｒｏｍＲＮＡ精製キット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗ
ｅｄｅｎ）を用いて１００ｍｇの葉組織から回収した。ｍＲＮＡの相対量を、Ｕ
Ｖ照射器上に、１０μｌのサンプルを４μｌの１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを用
いてスポットすることによる核酸の可視化を用いて決定した。

【００５２】等量のポリＡ⁺ＲＮＡ（±１００ｎｇ）を用いて、ｃＤＮＡを、製造業者により記載されたように、２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲＴＲＮＡ
ｓｅＨ^-逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および１μｌのオリゴ（ｄＴ）_12-18 プライマー（５００μｇ／ｍｌ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて合成した。

【００５３】（実施例６）（競合的ＲＴ−ＰＣＲによるサンプルの分析）異なるｃＤＮＡサンプルを実施例３に記載のように分析した。

【００５４】

【表２】（実施例７）（ヒマワリｇａｐＣＰＣＲＭＩＭＩＣの構築および競合的ＲＴ−ＰＣＲ
によるサンプルの分析）ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製物の質に対する内部コントロールとして、本発
明者らは、実施例４、５、および６に記載されるのと同じサンプルを用いるハウ
スキーピング遺伝子ＧａｐＣ上の競合的ＲＴ−ＰＣＲを含んだ。ＰＣＲＭＩＭ
ＩＣの構築のために、以下のプライマーを開発した；

【００５５】

【数２】プライマーＦＲ−ｐＵＣ−２２４およびＦＲ−ｐＵＣ−２２５を用い、ＰＣＲ（
９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１０サイクル）により、プラスミドｐＵ
Ｃ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅ
ｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ３３，１０３〜１１９）由来の５２７
ｂｐのフラグメントを増幅した。このＰＣＲ産物１μｇを、ＰＣＲによりプライ
マーＦＲ−ｇａｐＣ−２１１およびプライマーＦＲ−ｇａｐＣ−２１２を用いて
増幅し、大量のＰＣＲＭＩＭＩＣを作製した（９５℃１分、５５℃１分、７２
℃２分を３０サイクル）。

【００５６】プライマーＦＲ−ｇａｐＣ−２１１およびＦＲ−ｇａｐＣ−２１２は、ｇａｐ
ＣｃＤＮＡ由来の４７０ｂｐのバンドを増幅し、そのため、これは２％アガロ
ースゲル上で分離した場合、５２７ｂｐのＭＩＭＩＣから容易に識別し得る。Ｐ
ＣＲＭＩＭＩＣ希釈物を、キャリアとして０．２μｇ／μｌのグリコーゲンを
含有するＨ₂Ｏ中に１００ｎｇ／μｌ〜０．０１ａｇ／μｌの範囲で作製した。

【００５７】このｃＤＮＡサンプルは、競合的ＲＴ−ＰＣＲにおいて分析された。従って、
それぞれのサンプルの２μｌを、１μｌの希釈されたＰＣＲＭＩＭＩＣと０．
５ｍｌ試験管中で組み合わせた（量；０．１ｐｇ、１０ｆｇ、１．０ｆｇ、０．
１ｆｇ、１０ａｇおよび１．０ａｇ）。ｃＤＮＡおよびＭＩＭＩＣの増幅を、１
０μＭのプライマーＦＲ−ｇａｐＣ−２１１およびＦＲ−ｇａｐＣ−２１２、０
．５μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液、ＭｇＣｌ₂ならびに２．５単位の組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて実行し
、そして９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分の３５サイクルの処理をさせた。
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、そして臭化エチジウムを用いた染
色およびＵＶ照明器により可視化した。

【００５８】

【表３】この結果は、ＲＮＡの質およびｃＤＮＡの調製物がこれらの真菌感染により影響
されないことを示す。植物病原体および環境性ストレス因子によるＧａｐＣメッ
センジャーの誘導は、以前にＬａｘａｌｔら（１９９６）ＰｌａｎｔＭｏｌ．
Ｂｉｏｌ．３０：９６１〜９７２に記載された。

【００５９】（実施例８）（ヒマワリゲノムからのｍｓ５９プロモーターの単離）ｍｓ５９プロモーターの単離のために、ゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢ抽出手順を
用いてヒマワリ葉から単離した。約１０μｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｂｓｐ
ＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｌａＩＶ、ＨｐｈＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、３７℃で１６時間消化した。これらの制限部位は
、全て、ｍｓ５９のｃＤＮＡの最初の部分に位置する。消化混合物を１容量のフ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ、Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて抽出し、そして、０．１容量の３ＭＮａＡｃ（ｐ
Ｈ＝５．２）および２．５容量の９６％エタノールを用いて沈殿させた。このＤ
ＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、次いでこのペレットを５０μｌの蒸
留水に溶解した。それぞれのサンプルの２５μｌを０．７％のアガロースゲル上
で４０ボルトで１６時間分離した。このＤＮＡを０．４ＭのＮａＯＨを用いるサ
ザンブロットを用いてナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺、ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）に転写した。このブロットは、プローブとして³²Ｐ−
ｄＣＴＰで標識した３２０ｂｐフラグメント（ＡＴＧ開始コドンからＢｓｐＨ
Ｉ部位まで）を用いてハイブリダイズした（１６時間、６５℃）。次いで、この
ブロットを６５℃で０．２×ＳＳＣのストリンジェンシーで洗浄した。サザンブ
ロットの結果を表４に挙げる。

【００６０】消化混合物の残りの２５μｌを、ＤＮＡフラグメントの環状化が刺激されたよ
うな方法でライゲーションした。これを、１×Ｔ４ライゲーション緩衝液中の３
００μｌの（大）容量のＤＮＡおよび５ワイス（ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を、１６℃で１６時間ライゲーションするこ
とにより実施した。再度、この混合物を、フェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコールを用いて抽出し、そしてエタノールで沈殿させ、そしてこのＤＮＡ
ペレットを５０μｌのＨ₂Ｏに溶解した。

【００６１】プライマーを、ｃＤＮＡの最初の部分（ＡＴＧ開始コドンと用いられる最初の
制限部位（ＢｓｐＨＩ）との間）中に設計し、そして外向きにした。プライマーＦＲ−ＭＳ５９−１１（配列番号９）５’ＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧ
ＧＴＴＴＧＴＧＧＣ３’およびＦＲ−ＭＳ５９−４９（配列番号１０）５
’ＣＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＧＴＴＧ３’
を、ＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）２０
０μＭｄＮＴＰ’ｓおよび１０μＭのそれぞれのプライマーを用いる１μｌ
のライゲーション混合物上におけるＰＣＲ反応に用いた。ポリメラーゼ混合物を
９４℃で１分間、活性化し、続いて９４℃３０秒、５５℃１分および６８℃３分
の増幅の３５サイクルを行った。このＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析
し、特定のバンドは検出され得なかった。従って、上記のように、ただしここで
は、最初のＰＣＲ回からＰＣＲ産物の１μｌを用いる、ネスト化された（ｎｅｓ
ｔｅｄ）プライマーＦＲ−ＭＳ５９−３４（配列番号１１）５’ＡＣＧＴＡＧ
ＡＴＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣ３’およびＦＲ−ＭＳ
５９−５０（配列番号１２）５’ＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧ
ＡＧＡＣ３’を用いてネスト化ＰＣＲを実施した。１％アガロースゲル上のＰ
ＣＲ産物の分析後、非常に特異的な単一のバンドを検出した。逆ＰＣＲの結果を
表４に列挙する。

【００６２】

【表４】１．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩｉＰＣＲバンドをゲルから単離し、そして末
端のＤＮＡ配列を自動ＤＮＡシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）でプライマーＦＲ−ＭＳ５９−３４およびプライマーＦＲ−ＭＳ５９−５
０を用いて決定した。

【００６３】ＤＮＡ配列に基づき、新しいプライマーをヒマワリゲノムからのｍｓ５９プロ
モーター領域の増幅のために設計した。プライマーＦＲ−ＭＳ５９−２２６（配
列番号１３）５’ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＡＣＧＡＴ
ＣＣ３’は、下流に指向され、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に重複するｍｓ５９プ
ロモーター領域の上流部分に位置する。プライマーＦＲ−ＭＳ５９−２２７（配
列番号１４）５’ＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧ
ＣＧ３’は、ＡＴＧ開始コドンをスパンニングするＮｃｏＩ制限部位を導入する
ＡＴＧ翻訳開始に重複するｍｓ５９プロモーター／リーダーのほとんどの下流部
位でアニーリングし得る。上流ＨｉｎｄＩＩＩ部位〜ＮｃｏＩ部位への完全
なプロモーターフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号１５、ヌクレオチド１〜１
８８９）を自動ＤＮＡ配列解析（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用
いて決定した。

【００６４】ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および両方のプライマ
ーを用いて、ｍｓ５９プロモーター領域をヒマワリゲノムＤＮＡから増幅した。
１．９ｋｂのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩを用いて消化し、
そしてこれもＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化された多コピークローニ
ングベクターにライゲーションした。このプロモーターを、ｐＭＯＧ１３６７を
生じる制限部位ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ＧＵＳイントロンレポ
ーター遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：３９０
１〜３９０７）、続いてポリアデニル化に必要な配列を含む（Ａｎら、１９８９
、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１、１１５〜１２２）、ジャガイモプロテイナーゼイ
ンヒビターＩＩ遺伝子の３’非翻訳領域（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら、１９８７、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、７４４〜７４８）に融合
した。次いで、制限部位ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに隣接するキメラ
遺伝子全体を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＭＯＧ８０
０（このプラスミドの詳細については、ＷＯ９７／４２３２６の実施例を参照
のこと）にトランスファーした。

【００６５】得られたバイナリベクターｐＭＯＧ１３６８を、標的作物ジャガイモおよびト
マトの形質転換のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
のＥＨＡ１０５株に導入し、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉ
ａｎａの形質転換のためにＭＯＧ１０１株に導入し、そしてＢｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓの形質転換のためにＭＯＧ３０１株に導入した。

【００６６】（実施例９）（ｐＭＯＧ１３６８のジャガイモｃｖＫａｒｄａｌへの形質転換）ｐＭＯＧ１３６８を実質的にＨｏｅｋｅｍａらによって記載されたようにジャ
ガイモに形質転換した。（ＨｏｅｋｅｍａＡら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ７、２７３〜２７８、１９８９）。簡略にいえば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎ
ｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍｃｖ．Ｋａｒｄａｌ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍＥＨＡ１０５株ｐＭＯＧ１３６８を用いて形質転換した。基本培養培地
は、ＭＳ塩（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１４、４７３）、Ｒ３ビタミン（Ｏｏｍｓら（１９８７）
Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７３、７４４）、３０ｇ／ｌスクロース、
最終ｐＨ５．８（ＫＯＨで調節）の０．５ｇ／ｌＭＥＳからなるＭＳ３０Ｒ３
培地（必要な場合、８ｇ／ｌのＤａｉｃｈｉｎ寒天で凝固させた）であった。Ｓ
ｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍｃｖ．Ｋａｒｄａｌの塊茎を、皮むきし、
そして表面を９６％エタノール中で５秒間燃やすことで滅菌した。この炎を滅菌
水中で消し、そして約２ｍｍ厚さの切片に切断した。ディスクを維管束組織から
くり抜き、そしてバイナリベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＥＨＡ
１０５の１〜５×１０⁸細菌／ｍｌを含むＭＳ３０Ｒ３培地中で２０分間インキュベートした。塊茎のディスクをＭＳ３０Ｒ３培地を用いて洗浄し、そして凝
固した培養後培地（ＰＭ）へ移した。ＰＭは、３．５ｍｇ／ｌゼアチンリボシ
ドおよび０．０３ｍｇ／ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）を補充したＭ３０Ｒ３培地
からなった。２日後、ディスクを、２００ｍｇ／ｌセフォタキムおよび１００
ｍｇ／ｌバンコマイシンを有する新鮮なＰＭ培地に移した。３日後、塊茎ディ
スクを、２５０ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｌカナマイシン
を有するＰＭ培地からなる出芽誘導培地（ＳＩＭ）に移した。４〜８週間後、
ディスクから現われる出芽を切り取り、そして根付き培地（１００ｍｇ／ｌセ
フォタキム、５０ｍｇ／ｌバンコマイシンおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを
有するＭＳ３０Ｒ３−培地）に入れた。この出芽を、分裂組織の切断により無菌
的に増殖した。

【００６７】（実施例１０）（トランスジェニックジャガイモ植物におけるプロモーター機能の試験）ｐＭＯＧ１３６８ｍｓ５９プロモーター−ＧＵＳ構築物を保有するトランス
ジェニックジャガイモ植物をインビトロで管に成長させ、そしてＧＵＳ遺伝子の
発現についてアッセイした。この目的のために、葉、茎および根のサンプルを採
取し、そして染色した（結果は、表５）。ＧＵＳ発現レベルを、０から５のスケ
ールで可視的に決定した。ここで０は、発現検出不能、そして５は、本発明者ら
が、まれなタバコ３５Ｓ−ＧＵＳ−トランスジェニック（９６３０６系統）のト
ランスジェニック植物の葉で観察した最高レベルのＧＵＳである。この植物の葉
からのサンプルを、内部参照のためにすべての実験に含んだ。

【００６８】

【表５】同齢のインビトロ植物の選択物を、ジャガイモ胴枯病を引き起こす真菌Ｐｈｙ
ｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓで感染した。高濃度の真菌胞子を含む
水の小滴を葉の表面に適用した。この感染を９６時間、室温で進行させた。疾患
症状を示した葉を上記の植物から除き、そして組織化学ＧＵＳ分析によりＧＵＳ
遺伝子の発現について染色した（Ｇｏｄｄｉｊｎら、ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏ
ｕｒｎａｌ（１９９３）４（５）：８６３〜８７３）。発現を、真菌感染から生
じた病変において、第一ゾーン（感染部位のすぐまわりの領域）において、そし
て葉の未感染の部分（バックグラウンド）においてモニターした。

【００６９】

【表６】プロモーター能力をまた、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓを用いる感染の前および後
、完全に生長したジャガイモ植物の葉において試験した。接種前、葉を取り外し
、そしてＧＵＳの発現について染色した。次いで、この植物に５×１０⁵胞子／ｍｌの胞子懸濁液を用いて噴霧し、そして感染を４日間（９６時間）発展させた
。再度、葉を取り外し、そしてＧＵＳの発現について染色した。この結果を表７
に列挙する。発現を、病変、第一ゾーンおよびバックグラウンド領域においてモ
ニターした。

【００７０】

【表７】この結果は、ｍｓ５９プロモーターが真菌感染に反応することを示した。誘導
された発現のレベルは、むしろ低く、そしてある場合には検出レベル未満であり
得る。これは、検出可能な誘導性ＧＵＳ発現の低頻度を説明する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、（ゲノム）ｍｓ５９遺伝子およびプロモーター領域の模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クステルス，イェローメヒューベルティーナヘンリキュスフェクトルオランダ国エヌエル−2406 ファオカーアルプヘンアー／デーレイン，ファザントストラート 32 (72)発明者シモンス，ランベルトゥスヘンリキュスオランダ国エヌエル−1187，ヴェーエルアムステルフェーン，アンネデフリースラーン 20 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AD04 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD14 4B024 AA07 BA12 CA06 DA01 EA05 FA02 FA10 GA11 HA01 4B065 AA11X AA88X AA88Y AC10 BA02 CA24 CA31 CA44 CA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘキソースオキシダーゼをコードする植物遺伝子の発現を天
然に駆動するＤＮＡ配列であって、植物中に再導入された場合に会合したＤＮＡ
配列の病原体誘導性転写を促進し得る、ＤＮＡ配列。
【請求項２】ＤＮＡ配列がＨｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓから入手
可能であるという点で特徴付けられる、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】ＤＮＡ配列がＬａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａから入手可能で
あるという点で特徴付けられる、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】ＤＮＡ配列が配列番号１５に示されるヘキソースオキシダー
ゼをコードする遺伝子の上流調節領域であるという点で特徴付けられる、請求項
２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】ＤＮＡ配列が配列番号１８に示されるヘキソースオキシダー
ゼをコードする遺伝子の上流調節領域であるという点で特徴付けられる、請求項
３に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】ＤＮＡ配列が配列番号１５に示される１〜１８８９のヌクレ
オチド配列を含むという点で特徴付けられる、請求項４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】植物中に再導入される場合に会合したＤＮＡ配列の病原体誘
導性転写を促進し得る、請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列の部分
または改変体。
【請求項８】キメラＤＮＡ配列であって、転写の指向性において、（ｉ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列；および（ｉｉ）その転写制御下で発現されかつ天然には該ＤＮＡ配列の転写制御下でな
い、ＤＮＡ配列、を包含する、キメラＤＮＡ配列。
【請求項９】前記発現されるＤＮＡ配列が抗病原体タンパク質の産生を生
じる、請求項８に記載のキメラＤＮＡ配列。
【請求項１０】前記病原体タンパク質が、シチナーゼ、グルカナーゼ、オ
スモチン、マガイニンス、レクチンス、サッカリドオキシダーゼ、シュウ酸オキ
シダーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の毒素、Ｍｉｒ
ａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄａｈｌｉａ、Ｃｎ
ｉｃｕｓ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ、Ｃｌｉｔｏｒｉａ、Ａｌｌｉｕｍ種子、Ａｒａｌ
ｉａおよびＩｍｐａｔｉｅｎｓから単離された抗真菌タンパク質、ならびにチオ
ニン、ナピン、オオムギのトリプシンインヒビター、穀物のグリアジンおよびコ
ムギαアミラーゼのようなアルブミン型タンパク質、からなる群から選択される
、請求項９に記載のキメラＤＮＡ配列。
【請求項１１】前記発現されるＤＮＡ配列が過感受性応答を誘導し得るタ
ンパク質の産生を生じ、該タンパク質が、好ましくはトマト由来のＣｆ、Ｂｓ３
およびＰｔｏタンパク質、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ由来のＲ
ｐｍ１およびＲｐｍ２、タバコ由来のＮタンパク質、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ
ｆｕｌｖｕｍ由来のａｖｒタンパク質、Ｅｒｗｉｎｉａ由来のハーピンおよび
ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のエリシタータンパ
ク質（ａｖｒＢｓ３、ａｖｒＲｐｍ１、ａｖｒＲｐｔ２）からなる群から選択さ
れる、請求項８に記載のキメラＤＮＡ配列。
【請求項１２】請求項８〜１１のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ配列
を含む、レプリコン。
【請求項１３】転写の指向性において請求項１〜７のいずれか１項に記載
のＤＮＡ配列、および該ＤＮＡ配列の制御下で発現されるＤＮＡ配列の挿入のた
めの制限エンドヌクレアーゼについて少なくとも１つの認識部位を包含する、レ
プリコン。
【請求項１４】請求項１２または１３のいずれか１項に記載のレプリコン
を含む、微生物。
【請求項１５】請求項８〜１１のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ配列
をゲノム中に組み込まれた植物細胞。
【請求項１６】本質的に請求項１５に記載の細胞からなる、植物。
【請求項１７】双子葉類植物である、請求項１６に記載の植物。
【請求項１８】ゲノム中に少なくとも１つのキメラＤＮＡ配列のさらなる
コピーが挿入されている植物の部分であって、該植物の部分が、請求項１６また
は１７に記載の植物から得られる、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉および
木部から選択される、植物の部分。
【請求項１９】植物において病原体誘導性転写を促進し得るホモログを同
定するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列の使用。
【請求項２０】植物を形質転換するための、請求項８〜１１のいずれか１
項に記載のキメラＤＮＡ配列の使用。
【請求項２１】ハイブリッド調節ＤＮＡ配列を作製するための、請求項７
に記載の部分または改変体の使用。
【請求項２２】植物に病原体抵抗性を付与するための、請求項９〜１１の
いずれか１項に記載のキメラＤＮＡ配列の使用。