JP2002522043A

JP2002522043A - ポリオールからのポリヒドロキシアルカノエートの産生

Info

Publication number: JP2002522043A
Application number: JP2000563821A
Authority: JP
Inventors: フランクスクラリー，; オリバーピー．ピープルズ，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-08-04
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2002-07-23
Anticipated expiration: 2019-08-04
Also published as: ATE385521T1; DE69938105D1; US20040023347A1; US8114643B2; US8609378B2; CA2339351C; ES2302386T3; EP1105514A1; EP1975236A3; WO2000008198A1; CA2339351A1; US6329183B1; JP5042407B2; AU5337299A; EP1105514B1; US6576450B2; US20020142406A1; MXPA01001111A; AU752513B2; US20050239179A1

Abstract

(57)【要約】ＰＨＡの産生のために有用である酵素を発現する生物が提供される。いくつかの場合において、１つ以上のこれらの遺伝子は、宿主生物に対してネイティブであり、そして残りは、導入遺伝子から提供される。これらの生物は、３−ヒドロキシプロピオネートまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーを組み込むポリ（３−ヒドロキシポリアルカノエート）ホモまたはコポリマーを産生し、ここで、３−ヒドロキシプロピオネートおよび３−ヒドロキシバレレート単位は、ジオールの変換を触媒する酵素から誘導される。使用され得る適切なジオールとしては、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、およびグリセロールが挙げられる。正常な細胞代謝からグリセロールを得るための生化学経路もまた記載される。ＰＨＡポリマーは容易に回収され、そしてポリマーとして、または化学中間体の範囲についての開始物質として産業的に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、一般的に、細菌酵素の遺伝子操作によるポリヒドロキシアルカノエ
ートの産生の分野にある。

【０００２】多数の微生物は、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）
ポリマーの細胞内リザーバーを蓄積する能力を有する。ＰＨＡは、広範な範囲の
産業的適用および生物医学的適用を有する、生分解性かつ生体適合性の熱可塑性
材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、ＣＨＥＭＴＥ
ＣＨ２６，３８−４４）。ＰＨＡは、多数の異なる発酵プロセスを使用して産
生され得、そして広範な抽出技術を使用して回収され得る（Ｂｒａｕｎｅｇｇら
、１９９８、Ｊ．Ｂｏｉｔｅｃｈｎｏｌ．６５：１２７−１６１；Ｃｈｏｉおよ
びＬｅｅ，１９９９に概説される）。植物作物はまた、植物油に沿った原価構造
を提供するこれらのポリマーを産生するため、そして石油ベースのポリマーとの
価格競合性を指向するために遺伝子操作されている（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰ
ｅｏｐｌｅｓ，１９９６、ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６，３８−４４：Ｐｏｉｒｉｅ
ｒ，Ｙ．１９９９、ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８１−１８５
頁）。ＰＨＡは、ＰＨＡシンターゼ酵素の作用によって形成される。ポリマー鎖
が成長するにつれて、不溶性顆粒を形成する。次いで、ＰＨＡは回収され得、次
いで、化学物質に変換される得か、または回収プロセスの間に化学物質に変換さ
れ得る（Ｍａｒｔｉｎら、ＰＣＴＷＯ９７／１５６８１）。それゆえ、それら
のポリマーとしての能力に加えて、ＰＨＡは、微生物系および植物作物系の両方
において、新たな化学を貯蔵するための独特の機構を示す。

【０００３】３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）（特にＰＨＢＶ）を含有するＰＨＡコポ
リマーは、広範に記載されている。多くの野生型微生物は、３ＨＶ含有ＰＨＡを
産生し得る。ＰＨＢＶは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を用いて、グルコースおよびプロ
ピオネートから、ならびにグルコースおよびイソブチレートから、商業的に産生
されている（Ｈｏｌｍｅｓらに対する米国特許第４，４７７，６５４号）。多数
の他の微生物およびプロセスが、当業者に公知である（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１
９９８、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６５：１２７−１
６１）。ポリ（３ＨＶ）ホモポリマーは、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖ
ｉｏｌａｃｅｕｍを用いて、バレレートから産生されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｅ
ｃｈｅｌら、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．３９：４４３−４４９）。３ＨＶ単位を含有するＰＨＡもまた、組換え微生物
を使用して合成されている。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＰＨＡ生合成遺伝子を保有
するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを使用して、グルコースおよびプロピオ
ネートまたはバレレートのいずれかから（Ｓｌａｔｅｒら、１９９２、Ａｐｐｌ
．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−１０９４）ならびに
グルコースおよびバリンまたはトレオニンのいずれかから（Ｅｓｃｈｅｎｌａｕ
ｅｒら、１９９６、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１９：１２１−
１３０）、ＰＨＢＶが産生されている。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＰＨＡ生合成遺
伝子を保有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａを使用して、グルコース
およびプロピオネートからＰＨＢＶが産生されている（Ｚｈａｎｇら、１９９４
、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５
）。ＡｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅのＰＨＡ生合成遺伝子を保有するＲ．ｅ
ｕｔｒｏｐｈａを使用して、奇数の炭素数のアルカン酸からポリ（３ＨＶ−ｃｏ
−３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｐ）が産生された（Ｆｕｋｕｉら、１９９７、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１０９３−１０９７）。

【０００４】３−ヒドロキシプロピオネート単位を含有するＰＨＡコポリマーもまた、記載
されている。Ｈｏｌｍｅｓら（米国特許第４，４７７，６５４号）は、グルコー
スおよび３−クロロプロピオネートまたはアクリレートのいずれかからポリ（３
ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を合成するために、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ
を使用した。Ｄｏｉら（１９９０、Ｅ，Ａ，Ｄａｗｅｓ（編）、ＮｏｖｅｌＢ
ｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ，Ｋｌｕｗ
ｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎ
ｄｓ，３７−４８頁）は、３−ヒドロキシプロピオネート、１，５−ペンタンジ
オール、１，７−ヘプタンジオール、または１，９−ノナンジオールからポリ（
３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ）を合成するために、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａを使用した。
ＨｉｒａｍｉｔｓｕおよびＤｏｉ（１９９３、Ｐｏｌｙｍｅｒ３４：４７８２−
４７８６）は、スクロースおよび３−ヒドロキシプロピオネートからポリ（３Ｈ
Ｐ−ｃｏ−３ＨＢ）を合成するために、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓを
使用した。Ｓｈｉｍａｍｕｒａら（１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２
７：４４２９−４４３５）は、３−ヒドロキシプロピオネートおよび３−ヒドロ
キシブチレートまたはスクロースのいずれかからポリ（３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ）
を合成するために、Ａ．ｌａｔｕｓを使用した。これらのコポリマーに組み込ま
れた３−ヒドロキシプロピオネートの最高レベルは、８８モル％であった（Ｓｈ
ｉｍａｍｕｒａら、１９９４、同書）。組換え３ＨＰ含有ＰＨＡプロデューサー
は、当該分野では記載されていない。

【０００５】トランスジェニック作物種においてこれらのポリマーを産生し得ることが、経
済的に所望される。植物の産生のための方法は、以下に記載されている：米国特
許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；同第５，５０２，
２７３号；同第５，５３４，４３２号；同第５，６０２，３２１号；同第５，６
１０，０４１号；同第５，６５０，５５５号；同第５，６６３，０６３号；ＷＯ
９１００９１７、ＷＯ９２１９７４７、ＷＯ９３０２１８７、ＷＯ９３０２１９
４、およびＷＯ９４１２０１４、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：５２０−５２３、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、
Ｃｈｅｍｔｅｃｈ２６，３８−４４（これらの教示は、本明細書中に参考として
援用される）。この目的を達成するために、微生物由来のＰＨＡポリメラーゼを
コードする遺伝子または１つより多いサブユニットを有するＰＨＡポリメラーゼ
の場合には複数の遺伝子を、植物細胞に移入して、ＰＨＡポリメラーゼ酵素の適
切なレベルの産生を得ることが必要である。さらに、さらなるＰＨＡ生合成遺伝
子（例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクタ
ーゼ遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、また
はＰＨＡポリメラーゼ酵素についての基質を合成するために必要な酵素をコード
する他の遺伝子）を提供する必要性があり得る。多くの場合において、異なる植
物組織またはオルガネラにおける発現を制御することが所望される。植物組織ま
たはオルガネラにおける発現を制御するための方法は、当該分野で公知であるｓ
（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４；１２９
３−１２９９；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ，１９９５、
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ、
および「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳ
ｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９６、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ
，Ｊ．編、ＪｈｏｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（本明細
書中で参考として援用される））。

【０００６】細菌発酵系における種々の異なるコポリマーの産生のための方法は公知であり
、そして植物におけるＰＨＡの産生は達成されているが、細菌において可能な範
囲のコポリマーは、植物において達成されていない。トランスジェニック植物に
おいて異なるコポリマーを産生し得ること、およびトランスジェニック植物によ
って利用される基質に関してさらなる選択肢を有することは利点である。

【０００７】それゆえ、本発明の目的は、植物におけるＰＨＡの産生のための方法および試
薬を提供することである。

【０００８】本発明のさらなる目的は、単一の糖およびアルコールを基質として使用してＰ
ＨＡを産生するための方法および試薬を提供することである。

【０００９】本発明のなおさらなる目的は、ＰＨＢおよびＰＨＶＢとは異なるコポリマーの
産生のための方法および試薬を提供することである。

【００１０】（発明の要旨）ＰＨＡの産生のために有用である、グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデ
ヒドラターゼアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ
、βケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＡシンターゼ
、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３
−ホスファターゼのような酵素を発現する生物が提供される。いくつかの場合に
おいて、１つ以上のこれらの遺伝子は、宿主生物に対してネイティブであり、そ
して残りは、導入遺伝子から提供される。これらの生物は、３−ヒドロキシプロ
ピオネートモノマーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーを組み込むポリ（
３−ヒドロキシポリアルカノエート）ホモポリマーまたはコポリマーを産生し、
ここで、３−ヒドロキシプロピオネートおよび３−ヒドロキシバレレート単位は
、ジオールの変換を触媒する酵素から誘導される。使用され得る適切なジオール
としては、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、およびグリ
セロールが挙げられる。正常な細胞代謝からグリセロールを得るための生化学経
路もまた記載される。ＰＨＡポリマーは容易に回収され、そしてポリマーとして
、または１，３−プロパンジオール、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、ア
クリル、マロン酸、エステルおよびアミンを含む化学中間体の範囲についての開
始物質として産業的に有用である。

【００１１】（発明の詳細な説明）新たな代謝経路は、１，２−プロパンジオールからの３−ヒドロキシバレレー
ト単位を含むＰＨＡ、およｇび１，３−プロパンジオールまたはグリセロールか
らの３−ヒドロキシプロピオネート単位を含むＰＨＡの産生のために開発されて
きた。グリセロールの場合、グリセロールは、微生物に摂食され得るか、または
中心代謝中間体から産生され得るかのいずれかである。これらのモノマーおよび
その重合をもたらすこれらの新規な代謝経路の鍵となる酵素成分は、図１に示さ
れる。

【００１２】１，２−プロパンジオールおよびグリセロールは、高濃度でさえ多くの微生物
に対して毒性ではない安価な基質である。１，３−プロパンジオールは、再生可
能資源から産生され得る（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎｏｆ１，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ」、ＵｎｉｔｅｄＥｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇＩＩｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｌｍａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９
９８年１０月２７日）にて提示された）。１，２−プロパンジオールは、プロピ
レングリコールの産生からの産業廃棄物の流れに存在する。グリセロールもまた
、多数の微生物および植物作物における代謝から得られ得る。多くの場合、これ
らは、一般的に多くの微生物に対して低濃度で毒性になる有機酸と比較して、発
酵のための優れた供給材料である。３−ヒドロキシプロピオン酸は化学的に安定
ではなく、それゆえ、商業的に利用可能ではない。

【００１３】（操作される微生物）１つの実施態様において、図１に例示される全体の経路のための遺伝子は、産
生生物に導入される。天然にはＰＨＡを産生しない微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）が使用され得る。多数の組換えＥ．ｃｏｌｉＰＨＢ
産生系が記載されている（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅ
ｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。ビシナルジオールデヒドラターゼ（天然に、
グリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換し得る生物（例えば
、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来）をコードする遺伝子は
、この宿主に導入される。１，２−プロパンジオールの場合、ビシナルジオール
デヒドラターゼは、基質をプロピオンアルデヒドに変換し、これは、必要に応じ
て、外因性アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル−ＣｏＡシンセター
ゼの補助を伴って、微生物の内因性代謝によってプロピオニル−ＣｏＡに変換さ
れ得る。プロピオンアルデヒドに対する増加した耐性を有する株を変異誘発しそ
して選択することは有用であり得る。次いで、プロピオニル−ＣｏＡは、アセチ
ル−ＣｏＡとの縮合において、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼによって受容され
、従って、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡが形成され得る。ケトアシル−Ｃｏ
Ａチオラーゼはまた、アセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させ、よれに
よって、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを形成する。３−ヒドロキシバレリル
−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの両方は、組換え宿主において
発現されるような様々なＰＨＡシンターゼによって受容され、それゆえ、ＰＨＢ
Ｖは、組換え宿主によって合成される。

【００１４】上記の宿主はまた、増殖中または別々の増殖期の後のいずれかに、１，３−プ
ロパンジオールまたはグリセロールを摂食し得、そして３ＨＰポリマーが、その
細胞内に蓄積される。Ｅ．ｃｏｌｉは、補酵素Ｂ−１２を新たに合成せず、それ
ゆえ、補酵素Ｂ−１２たはＥ．ｃｏｌｉが補酵素Ｂ−１２に変換し得る前駆体（
例えば、ビタミンＢ−１２）もまた、摂食されるはずである。グリセロールの場
合、ビシナルジオールデヒドラターゼは、基質を、３−ヒドロキシプロピオンア
ルデヒドに変換し、これは、必要に応じて、外因性アシル−ＣｏＡトランスフェ
ラーゼまたはアシル−ＣｏＡシンセターゼの補助を伴って、微生物の内因性代謝
によって３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに変換され得る。次いで、３−ヒ
ドロキシプロピオニル−ＣｏＡは、ＰＨＡシンターゼによってＰ３ＨＰに重合さ
れ得る。３ＨＰに加えてヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマー単位もまた、ポリマ
ーに組み込まれ得る。例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼおよびレダクター
ゼが発現される場合、３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシプロピオ
ネートのコポリマーが形成され得る。

【００１５】炭水化物供給材料から直接３ＨＰポリマーを産生するために、Ｅ．ｃｏｌｉは
さらに、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール
−３−ホスファターゼを発現するように操作される。このような組換えＥ．ｃｏ
ｌｉ株およびその構築のための方法は、当該分野で公知である（Ａｎｔｏｎ，Ｄ
．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ１，３−ｐｒｏｐａ
ｎｄｉｏｌ」、ＵｎｉｔｅｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ
ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＩＩｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
，Ｅｌｍａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９８年１０月２７日）で提示；ＰＣＴＷ
Ｏ９８／２１３３９）。

【００１６】別の実施態様において、ビシナルジオールデヒドラターゼを天然に含む組換え
微生物が使用され得る。このような微生物の１つの例は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｏｘｙｔｏｃａであるが、上記のようにいくつかの他の微生物が存在する。こ
の実施態様において、外因性ビシナルジオールデヒドラターゼが、別の生物から
移入される必要はない。しかし、この微生物を変異誘発し、そいて好気性増殖中
にこのデヒドラターゼを発現する変異体を選択することもまた有用であり得るか
、または好気性条件下でその遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。一般
的には、１つ以上の補酵素Ｂ−１２依存性ビシナルジオールデヒドラターゼを含
む生物が補酵素Ｂ−１２を新たに合成し得る場合であり、そして補酵素Ｂ−１２
またはその密接に関連する前駆体を培養の任意の部分に添加する必要がない場合
である。この場合では、ＰＨＡシンターゼまたは全体のＰＨＢ生合成経路および
必要に応じて外因性アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＣｏＡシンセターゼが、この
微生物に導入される。これを行うための技術は、当該分野で周知である（例えば
、Ｄｅｎｎｉｓら、１９９８、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ６４：１７７−１８６）。炭水化物供給物から直接３ＨＰポリマーを産生す
るために、この株はさらに、上記のように、グリセロール−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−ホスファターゼを発現するように操作
される。

【００１７】別の実施態様において、ＰＨＡを天然に産生する生物が使用され得る。このよ
うな生物の例としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｇ
ｅｎｅｓｌａｔｕｓおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｏｒが挙げられるが、当業者に
は多くの他の生物が周知である（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊｏｕｎｒｎ
ａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６５：１２７−１６１）。ジオールデ
ヒドラターゼの導入は、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ（１９８９、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６４、５２９８−１５３０３）によって記載されるよう
な標準的な技術を用いて達成される。これらの場合、生物を変異させ、そして３
−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに対する増加した耐性について選択すること
が有用であり得る。ＰＨＡを産生する生物は、補酵素Ｂ−１２を新たに合成する
能力において変化し、それゆえ補酵素Ｂ−１２またはその生物が補酵素Ｂ−１２
に変換し得る前駆体が適切に添加される。次いで、ＰＨＢＶは、１，２−プロパ
ンジオールおよび少なくとも１つの他の供給材料を摂食することによって産生さ
れる。ＰＨＢＰは、１，３−プロパンジオールまたはグリセロールおよび１つの
他の供給材料（例えば、グリセロール）を摂食することによって産生される。炭
水化物供給材料から直接３ＨＰポリマーを産生するために、この株はさらに、上
記のように、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロ
ール−３−ホスファターゼを発現するように操作される。これらの生物における
Ｐ３ＨＰホモポリマーの産生についての利点である変異を利用することは有用で
あり得る。特異的変異としては、β−ケトチオラーゼ遺伝子および／またはアセ
トアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を不活性化することが挙げられる。これ
らの遺伝子は一般的に周知であり、そして利用可能または単離可能であるので、
遺伝子破壊は、例えば、Ｓｌａｔｅｒら、１９９８（Ｊ．Ｂｉｃｔｅｒｉｏｌ．
）によって記載されるように、容易に行われ得る。

【００１８】ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）およびそのコポリマーの産生の実行は
また実施例に記載されるような細菌に限定されない。同じ遺伝子が真核生物細胞
（酵母および植物を含むがこれらに限定されない）に導入され得、これはまた、
細菌のように、ジヒドロキシアセトンホスフェートのような解糖中間体を産生し
、そこから、グリセロールおよび最終的にはポリ（３−ヒドロキシプロピオネー
ト）が誘導され得る。

【００１９】（基質の利用のための遺伝子）本明細書中に記載されるような使用に適切な組換えＰＨＡ手順を開発するため
の遺伝子および技術は、一般的に、当業者に公知である（Ｍａｄｉｓｏｎおよび
Ｈｕｉｓｍａｎ，１９９１、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３；ＰＣＴＷＯ９
９／１４３１３（これらは、本明細書中で参考として援用される））。中心代謝
中間体からグリセロールを介してポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の産生
を実行する必要がある遺伝子の全てはクローニングされており、そして遺伝子操
作可能な形態で利用可能であるので、プラスミドにより運ばれた遺伝子および組
み込まれた遺伝子の任意の組み合わせが使用され得、それゆえ、この経路の実行
は、本明細書中に概説されるスキームに制限されない。多くの異なる実行は、当
業者に明らかである。

【００２０】グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３０）およびジオールデヒド
ラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８）は、細菌のいくつかの種に見出される個別の
補酵素Ｂ−１２要求性酵素である。しばしば、グリセロールデヒドラターゼは、
グリセロールにおける嫌気性増殖の間に誘導され、そしてジオールデヒドラター
ゼは、グリセロールまたは１，２−プロパンジオールのいずれかにおける嫌気性
増殖の間に誘導される（ＦｏｒａｇｅおよびＦｏｓｔｅｒ，１９７９、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ５６９：２４９−２５８）。これらのデヒド
ラターゼは、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの形成、お
よび１，２−プロパンジオールからプロピオンアルデヒドの形成を触媒する。こ
れらのアルデヒドは、通常、デヒドロゲナーゼによって対応するアルコールに変
換される。１つまたは両方のデヒドラターゼを含む生物は、代表的には、グリセ
ロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドまたは１，３−プロパンジオール
に変換し得る。この能力で有名な細菌種としては、以下が挙げられる：Ｋｌｅｂ
ｉｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｅｋｓｔｒａら、１９８７、
Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：２６８−２７５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｏｘｙｔｏｃａ（Ｈｏｍａｎｎら、１９９０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１２１−１２６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（Ｈｏｍａｎｎら、１９９０、同書）、およびＣｉｔｒ
ｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ（Ｂｏｅｎｉｇｋら、１９９３、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４５３−４５７）。しかし
、多くの他の例が一般的に公知である。両方のデヒドラターゼは、３つのサブユ
ニットから形成され、その各々は、他の酵素のその対応物に相同である。

【００２１】グリセロールおよびジオールデヒドラターゼ（これはまた、一般的に、この点
から、「ビシナルジオールデヒドラターゼ」と称される）の基質範囲はグリセロ
ールおよびおよび１，２−プロパンジオールに限定されない。Ｂａｃｈｏｖｃｈ
ｉｎら（１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６：１０８２−１０９２）は、
例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ酵素によって受容される基質としては、以下
が挙げられることを実証した：グリセロール、（Ｒ）−１，２−プロパンジオー
ル、（Ｓ）−１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、チオグリセロー
ル、３−クロロ−１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、２，３
−ブタンジオール、イソブチレングリコール、および３，３，３−トリフルオロ
−１，２−プロパンジオール。全ての場合において、この反応の産物は、基質の
水分子の効果的除去によって形成されるアルデヒドまたはケトンである。

【００２２】ホスホグリセレートを通して糖からグリセロールを天然に産生する生物として
は、以下が挙げられる：

【００２３】

【数１】これらの生物の多くにおいて、グリセロールは、ジヒドロキシアセトンホスフェ
ート（グリセロール経路の中間体）から誘導されることが公知である。Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉは、通常、ほとんどの糖で増殖させた場合には、有意
な量ではグリセロールを合成しない（ＢａｌｄｏｍａおよびＡｇｕｉｌａｒ，Ｊ
．Ｂｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：４１６、１９８８）。しかし、グルコースのよう
な一般的な糖からグリセロールを形成し得るトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株
が、例えば、ＰＣＴＷＯ９７／２０２９２に記載されている。

【００２４】糖からグリセロールの産生（ＷＯ９８／２１３３９）、グリセロールから１，
３−プロパンジオールの産生（ＷＯ９６／３５７９６、ＷＯ９８／２１３３９）
、および糖から１，３−プロパンジオールの産生のための遺伝子操作された系が
記載されている。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＡＲ
１（ジヒドロキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ）遺伝子およびＧＰＰ
２（ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートホスファターゼ）遺伝子を発現する
Ｅ．ｃｏｌｉは、グルコースで増殖させた場合に、培地中に高濃度のグリセロー
ルを蓄積することが示された（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ１，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ」、ＵｎｉｔｅｄＥ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇＩＩｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｌｍａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ（
１９９８年１０月２７日）に提示）。

【００２５】（発現の調節）前述の実施態様のいずれかにおいて、ビシナルジオールデヒドラターゼの発現
を制御することによって、または補酵素Ｂ−１２の利用能を制御することによっ
て、産生されるポリマーの組成を制御することが可能である。デヒドラターゼ活
性が高くなるにつれて、基質利用能またはデヒドラターゼの下流の酵素活性のよ
うな別の要因が限定される点まで、より活性化されたモノマーが、その活性の結
果として誘導される。様々な生物における遺伝子発現（および、従って、酵素活
性）の調節のための方法は、当業者に周知である。ビシナルジオールデヒドラタ
ーゼ活性の制御のためのさらなる方法は、微生物に対する補酵素Ｂ−１２の利用
能の調節である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの多くの株は、例えば、補
酵素Ｂ−１２を新たに合成できず、それゆえ、活性について補酵素Ｂ−１２に依
存する組換えビシナルジオールデヒドラターゼは、補酵素Ｂ−１２またはビタミ
ンＢ−１２のような適切な前駆体が培地に付加される限りは、これらの株におい
て活性ではない。ＰＨＡ合成遺伝子およびビシナルジオールデヒドラターゼを保
有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株において、補酵素Ｂ−１２を添加し
ないと、例えば１，２−プロパンジオールが培地中に存在してもＰＨＢのみが合
成されることが見出されている。同じ培地における同じ株の培養への１μＭの補
酵素Ｂ−１２の添加は、実施例で議論されるように、ＰＨＢＶの形成をもたらす
。Ｓｋａｌｙら（１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
６４：９８−１０５）は、増加した濃度の補酵素Ｂ−１２が約２０ｎＭの濃度ま
で培地中に提供され、その後１，２−プロパンジオールの収量が増加しなかった
ので、トランスジェニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが、グリセロール
から増加したレベルの１，３−プロパンジオールを合成したことを見出した。そ
れゆえ、０〜２０ｎＭの濃度の補酵素Ｂ−１２は、１，２−プロパンジオールを
含有する培地中で培養された、ＰＨＡ合成遺伝子およびビシナルジオールデヒド
ラターゼ遺伝子を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおけるＰＨＢＶ
組成を制御するために、使用され得る。同じ基本的な前提は、ポリ（３−ヒドロ
キシプロピオネート）がグリセロールから誘導されることについて真実である。
この細胞は、ビシナルジオールデヒドラターゼが存在しない場合に、コモノマー
の存在下でＰＨＡ（例えば、ＰＨＢ）を生成し得る。ポリマー組成を制御するた
めの補酵素Ｂ−１２の使用は、補酵素Ｂ−１２を新たに合成できない任意の微生
物で達成され得る。このような生物としては、この能力を天然に欠く生物（例え
ば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）およびこの能力を天然に保有するが化
学変異誘発の使用によってかまたはトランスポゾン変異誘発のようなこの能力を
失わせる遺伝的方法によって変異されている生物（例えば、Ｋｌｅｂｉｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。

【００２６】いくつかの生物の場合において、いくつかの遺伝子は、宿主染色体に取り込ま
れ得、他の遺伝子は、プラスミドに提供され得る。いくつかの場合において、適
合可能なプラスミド系は、例えば、１つのプラスミドによってコードされる経路
のいくつかの工程および第２のプラスミドによってコードされる他の工程ととも
に使用され得る。この２つのアプローチの組み合わせもまた使用され得る。

【００２７】（基質）上記で議論したように、ＰＨＡを生成するために使用され得る基質としては、
グリセロールおよびグルコースが挙げられる。多数の他の基質は、グリセロール
またはグルコースに加えて、首尾よく使用され得る。他の基質の例としては、デ
ンプン、スクロース、ラクトース、フルクトース、キシロース、ガラクトース、
コーン油、ダイズ油、獣脂、トール油、脂肪酸またはそれらの組み合わせが挙げ
られる。

【００２８】本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。

【００２９】（実施例１．グルコースおよび１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶ産生
）プラスミドｐＦＳ４４Ｃを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株ＭＢＸ７
６９（Ｈｕｉｓｍａｎら、ＰＣＴＷＯ９９／１４３１３）（これは、Ｚｏｏｇ
ｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡ合成遺伝子（アセトアセチル−ＣｏＡ
チオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼ）
を発現する）を使用して、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからＰＨ
ＢＶを合成した。プラスミドｐＦＳ４４ｃ（図２に模式的に示される）は、ｐＴ
Ｃ５３から単離された、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅグリセロ
ールデヒドラターゼをコードする遺伝子（ｄｈａＢ）（Ｓｋｒａｌｙら、１９９
８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８〜１０５）、
およびｐＣＫ３から単離された、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＫｌｕｙｖｅｒｉ
４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｈｂ
ｃＴ）（ＳｅｕｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１〜８８０）（両方とも、ｔｒｃプロモーターの制
御下の１つのオペロン内）を含む。ｐＦＳ４４Ｃはまた、ｌａｃリプレッサー遺
伝子（ｌａｃＩ）、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、および複製起点（Ｏ
ＲＩ）（全てベクターｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＬａＪｏｌｌａ
、Ｃａｌｉｆ）に由来する）を含む。

【００３０】これらの細胞を、２５ｇ／ｍＬのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ，Ｍｉｃｈ．）および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む、１００ｍＬの培
地中で予め培養した。これらを、この培地から遠心分離（２０００×ｇ、１０分
）によって取り出し、そして１００ｍＬの培地（１リットル当たり：５ｇＬＢ
ブロス粉末；５０ｍｍｏｌリン酸カリウム、ｐＨ７；１０ｇ１，２−プロパン
ジオール；２ｇグルコース；１μｍｏｌ補酵素Ｂ−１２；１００μｇアン
ピシリン；および０．１ｍｍｏｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を含む）中に再懸濁した。これらの細胞を、２２５ｒｐｍにて
３０℃で４８時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、こ
れらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で１回洗浄し、そして凍結
乾燥した。

【００３１】補酵素Ｂ−１２を添加しなかったことを除いて、同じ実験を並行して行った。
各フラスコからの約２５ｍｇの凍結乾燥した細胞塊を、２ｍＬの混合液（内部標
準物として添加された２ｍｇ／ｍＬの安息香酸とともに、（容量で）９０％１
−ブタノールおよび１０％濃塩酸を含む）中での１１０℃で３０時間の同時の
抽出およびブタノール溶解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に供した。得られた混合
液の水溶性成分を、３ｍＬの水での抽出によって除去した。有機層（２ｍＬ／分
の全体的な流速にて１：５０分割比での１μＬ）を、以下の温度プロフィール（
８０℃で２分；１分で１０℃から２５０℃；２５０℃で２分）を用いて、ＳＰＢ
−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍＩＤ；０．２
５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）上にて分析
した。ポリマー中の３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシバレレート
（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）単位の存在について試験するために使
用される標準物は、ＰＨＢＶ（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．；Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）であった。添加された補酵素Ｂ−１２を用いる実
験におけるポリマーは、６０．９％の乾燥細胞重量を示し、そしてこれは、９７
．４％の３−ヒドロキシブチレート単位および２．６％の３−ヒドロキシバレレ
ート単位から構成された。

【００３２】この実験から得られた上清は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
によって０．４１ｇ／Ｌのプロパノールを含むことが見出され、このことは、グ
リセロールデヒドラターゼが機能的であったことを示す。補酵素Ｂ−１２を添加
していない実験におけるポリマーは、５６．７％の乾燥細胞重量を示し、そして
これは、ＰＨＢホモポリマーであった。この実験から得られた上清は、プロパノ
ールを含まなかった。ＨＰＬＣ分析を、０．６ｍＬ／分の流速および５０℃のカ
ラム温度で、移動相として硫酸（ｐＨ２）を用いたＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７
Ｈカラムを使用して実行した。検出は、屈折率および紫外線吸収の両方によって
であった。

【００３３】（実施例２．唯一の炭素源としての１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶ
および増殖）ＭＢＸ１８４は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３２７を生成するために、１，２−
ＰＤでの増殖について選択した。ＭＢＸ１３２７を、ＭＢＸ１１６４由来のＰＨ
Ｂ遺伝子ＡＢＣ５ＫＡＮを用いて形質導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３２９を
生成した。ＭＢＸ１１６４は、ＭＢＸ２４７：：ＡＢＣ５ＫＡＮである。ＭＢＸ
２４７は、標準的な手順（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ａｓｈｏｒｔｃｏｕｒｓｅ
ｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９２、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ）によって、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソ
グアニジン（ＮＴＧ）で変異誘発され、かつ唯一の炭素源として１，２−プロパ
ンジオールを用いて増殖する能力についてスクリーニングされたＬＪ５２１８（
ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮｕｎｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１９８４Ｅ．ｃｏｌｉｇｅ
ｎｅｔｉｃｓｔｏｃｋｃｅｎｔｅｒＣＧＳＣ６９６６）である。この能
力を有するＥ．ｃｏｌｉ株およびこのような株を作製するための方法は、以前に
記載されている（Ｓｒｉｄｈａｒａら、１９６９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９
３：８７）。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３２９は、唯一の炭素源として１，２−プ
ロパンジオールを用いて増殖する能力およびアセチル−ＣｏＡを生成する炭素源
からＰＨＢを合成する能力の両方を有する。

【００３４】プラスミドｐＦＳ４４Ｃを保有するＭＢＸ１３２９（図２に示される）を、培
地（１リットル当たり：６．２５ｇＬＢブロス粉末；３．５ｇリン酸アンモ
ニウムナトリウム；７．５ｇ二塩基性リン酸カリウム・３水和物；３．７ｇ
一塩基性リン酸カリウム；０．１２ｇ硫酸マグネシウム；２．７８ｍｇ硫酸
鉄（ＩＩ）・７水和物；１．９８ｍｇ塩化マンガン（ＩＩ）・四水和物；２．
８１ｍｇ硫酸コバルト（ＩＩ）・７水和物；１．４７ｍｇ塩化カルシウム・
２水和物；０．１７ｍｇ塩化銅（ＩＩ）・２水和物；０．２９ｍｇ塩化亜鉛
（ＩＩ）・７水和物；１０ｍｇチミン；１０ｇ１，２−プロパンジオール；
５０ｎｍｏｌ補酵素Ｂ−１２；１００μｇアンピシリン；および０．０５ｍ
ｍｏｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む）
中にて増殖させた。総容量は、２５０ｍＬエルレンマイアーフラスコにおいて５
０ｍＬであった；接種物は、２５ｇ／ＬＬＢブロス粉末および１００μｇ／ｍ
Ｌアンピシリンにおける０．５ｍＬの一晩の培養物であった。これらの細胞を、
この培地中で、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした
。これらを、この培地から遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によって取り出し
、水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。

【００３５】細胞内ポリマー含量を、実施例１のようにブタノール溶解によって分析した。
これらの細胞は、９．８の光学密度（６００ｎｍにて）まで増殖し、そして乾燥
細胞重量の６％のＰＨＢＶを含んだ。このポリマー自体は、２．５％の３−ヒド
ロキシバレレート単位および９７．５％の３−ヒドロキシブチレート単位から構
成された。

【００３６】（実施例３．１，３−プロパンジオールからのポリ（３−ヒドロキシプロピオ
ネート）およびグリセロールからの１，３−プロパンジオール）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株ＭＢＸ１８４（これは、ｆａｄＲ遺伝子
を欠損し、かつ構成的にａｔｏＣ遺伝子を発現する）を使用して、グリセロール
から１，３−プロパンジオールを、および１，３−プロパンジオールからポリ（
３−ヒドロキシプロピオネート）を合成した。両方の例において、これらの細胞
は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅグリセロールデヒドラターゼ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ４−ヒドロキシブチリル−Ｃｏ
Ａトランスフェラーゼ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａＰＨＡ
シンターゼをコードする遺伝子（全て、ｔｒｃプロモーターの制御下の１つのオ
ペロン内）を含むプラスミドｐＦＳ４５（図３に模式的に示される）を保有した
。グリセロールが１，２−プロパンジオールの代わりに存在したことを除いて、
これらの細胞を、実施例１に記載されるように培養した。

【００３７】ＨＰＬＣ分析は、補酵素Ｂ１２含有培地中の細胞が、１．３ｇ／Ｌの１，３−
プロパンジオールを合成したが、補酵素Ｂ−１２を含まない培地中の細胞が１，
３−プロパンジオールを全く合成しないことを示した。１，３−プロパンジオー
ルが１，２−プロパンジオールの代わりに存在し、かつ補酵素Ｂ−１２が添加さ
れないことを除いて、実施例１の方法を使用して、この同じ株もまた培養した。

【００３８】凍結乾燥した細胞塊を、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を定量するた
めのβ−プロピオラクトンのさらなる標準物とともに、実施例１のようにＧＣに
よって分析した。これらの細胞は、ＧＣ分析によって、７．８％の乾燥細胞重量
でポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）ホモポリマーを含むことが示された。
グリセロールからのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の合成は、多くの微
生物に非常に有毒である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの蓄積のために生
じなかったようであった（Ｄｏｂｒｏｇｏｓｚら、１９８９、Ｗｅｎｎｅｒ−Ｇ
ｒｅｎＩｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．５２：２８３〜２９２）。この毒性は、少
なくとも２つの様式において、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの蓄積を阻
止することによって扱われ得る：１）１．３−プロパンジオール産生生物（例え
ば、上記の生物）由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼもまた
、発現され得る、そして２）グリセロールデヒドラターゼが存在する場合に、１
，３−プロパンジオールの観察された形成を担うＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ由来の未同定の内因性デヒドロゲナーゼの活性は、グリセロールおよび補酵
素Ｂ−１２の両方の存在下で十分に増殖する、グリセロールデヒドラターゼを発
現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞をスクリーニングすることによっ
て増大され得る。第２のアプローチは、例えば、変異誘発されたＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉを、ｐＦＳ４５のようなプラスミドを用いて形質転換するこ
とによって達成され得、その結果、この変異誘発は、グリセロールデヒドラター
ゼ遺伝子、続いてグリセロールおよび補酵素Ｂ−１２を含有する培地の富化に影
響しなかった。

【００３９】（実施例４．グリセロールからのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））実施例３における２つの経路（グリセロールから１，３−プロパンジオールお
よび１，３−プロパンジオールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））を
、同じ組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおいて活性化した。Ｚｏｏｇ
ｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡ生合成遺伝子ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、お
よびｐｈａＣを安定に発現するＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ８２０を、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフ
ェラーゼならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のグリセロ
ールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコ
ードする遺伝子（ｔｒｃプロモーター制御下）を含むプラスミドｐＦＳ４７Ａ（
図４に模式的に示される）を用いて形質転換した。ＰＦＳ４７Ａを、プラスミド
ｐＦＳ１６（ｐＦＳ４７Ａの前駆体）から以下の通りに構築した：Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉｏｒｆＺ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して、プラスミドｐＣＫ３（ＳｅｕｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓ
ｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１〜８８０）か
らＰＣＲによって増幅した：

【００４０】

【化１】ｏｒｆＺＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ（これは、ＡｖｒＩＩと適合性である）およ
びＳａｌＩで消化されているｐＴｒｃＮにライゲーションした。

【００４１】これらの細胞を、２５ｇ／ＬのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ
、Ｍｉｃｈ．）および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む、１００ｍＬの培地
中にて予め培養した。これらを、遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によりこの
培地から取り出し、そして１００ｍＬの培地（１リットル当たり：２．５ｇＬ
Ｂブロス粉末；５０ｍｍｏｌリン酸カリウム、ｐＨ７；５ｇの基質（グリセロ
ール；１，２−プロパンジオール；または１，３−プロパンジオール）；２ｇ
グルコース；５ｎｍｏｌ補酵素Ｂ−１２；１００μｇアンピシリン；および
０．１ｍｍｏｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
を含む）中に再懸濁した。これらの細胞を、２２５ｒｐｍにて３０℃で４８時間
振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のよ
うに遠心分離によって取り出し、水で１回洗浄し、そして凍結乾燥した。

【００４２】凍結乾燥した細胞塊を、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を定量するた
めのβ−プロピオラクトンのさらなる標準物とともに、実施例１のようにＧＣ分
析によって分析した。グリセロールおよび１，３−プロパンジオール中で培養さ
れた細胞は、両方とも、３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシプロピ
オネート単位のコポリマーを含み、そして１，２−プロパンジオール中で培養さ
れた細胞は、３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシバレレート単位の
コポリマーを含んだ。乾燥細胞重量の百分率としてのポリマーの組成および量を
、表１に示す。グリセロールで培養された細胞は、１，３−プロパンジオールで
培養された細胞よりもポリマーを合成したが、３−ヒドロキシプロピオネート単
位の百分率は、グリセロールで培養された細胞においてよりも小さかった。これ
らの差異は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドが有毒であり、かつこれがグ
リセロールデヒドラターゼによってグリセロールから生じるよりも１，３−プロ
パンジオールオキシドレダクターゼによって１，３−プロパンジオールからより
迅速におそらく生じるという事実によって説明され得る。３−ヒドロキシプロピ
オンアルデヒドの毒性は、細胞の調子（従って、全体的なポリマー含量）に負の
影響を与えるが、グリセロールからのその形成は、必要な中間体が３−ヒドロキ
シプロピオンアルデヒドまたは１，３−プロパンジオールであるかに関わらず、
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ形成に必要である。

【００４３】（表１．種々の基質において培養されたＭＢＸ８２０/ｐＦＳ４７Ａによって
産生されたポリマー）

【００４４】

【表１】（実施例５．補酵素Ｂ−１２のバリエーションによるポリマー組成の制御）（濃度）ビシナルジオールデヒドラターゼは、活性が補酵素Ｂ−１２に依存するので、
そしてグリセロールからの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡまたは１，２−
プロパンジオールからのプロピオニル−ＣｏＡの形成は、デヒドラターゼ活性に
依存するので、いずれかの場合におけるこのコポリマーの組成は、デヒドラター
ゼに対する補酵素Ｂ−１２の利用能のバリエーションによって制御され得る。こ
の例において、このことを、プラスミドｐＦＳ４７Ａを保有するＥ．ｃｏｌｉ株
ＭＢＸ８２０がＰＨＡを産生していた培地に添加された補酵素Ｂ−１２濃度のバ
リエーションによって達成した。

【００４５】これらの細胞を、２５ｇ／ＬのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ
、Ｍｉｃｈ．）および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む、１００ｍＬの培地
中にて予め培養した。これらを、遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によりこの
培地から取り出し、そして１００ｍＬの培地（１リットル当たり：２．５ｇＬ
Ｂブロス粉末；５０ｍｍｏｌリン酸カリウム、ｐＨ７；１０ｇの基質（グリセ
ロールまたは１，２−プロパンジオール）；２ｇグルコース；１００μｇア
ンピシリン；０．１ｍｍｏｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）；および０、５、２０、または５０ｎｍｏｌ補酵素Ｂ−１２を含
む）中に再懸濁した。これらの細胞を、２２５ｒｐｍにて３０℃で７２時間振盪
しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように
遠心分離によって取り出し、水で１回洗浄し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥さ
れた細胞塊を、実施例４の通りに、ＧＣ分析によって分析した。

【００４６】表２は、この様式において産生されたＰＨＡの量および組成を示す。補酵素Ｂ
−１２の非存在は、基質がグリセロールまたは１，２−プロパンジオールである
かに関わらず、ＰＨＢのみの合成を生じた。グリセロールは、最終の光学密度お
よびポリマー含量によって示される通り、デヒドラターゼ活性の非存在下でＰＨ
Ａ形成により適していた。これは、おそらくＥ．ｃｏｌｉが好気性条件下で炭素
源およびエネルギー源としてグリセロールを利用し得るからであるが（Ｌｉｎ，
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：５３５、１９７６）、一般にこの
ことは、１，２−プロパンジオールに関しては当てはまらない（Ｂａｌｄｏｍａ
およびＡｇｕｉｌａｒ、同書）。補酵素Ｂ−１２がグリセロールで培養された細
胞に漸増量で添加される場合、ポリマー中の３−ヒドロキシプロピオネート単位
の百分率は、増加し、一方、全体的なポリマー含量は、減少する。この減少は、
おそらく、細胞の調子の減少を生じる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒
性に起因する。補酵素Ｂ−１２が、１，２−プロパンジオールで培養された細胞
に漸増量で添加される場合、３−ヒドロキシバレレート単位は、ポリマー中に取
り込まれるが、ポリマー中の３−ヒドロキシバレレートの百分率は、グリセロー
ル実験において３−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率が増加したのと同程
度に増加しない。このことは、補酵素Ｂ−１２の濃度が数ナノモル濃度にさえ達
した場合に、補酵素Ｂ−１２の濃度が、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ合成に
対して律速ではないこと、および他のいくつかの因子が律速となることを示す。

【００４７】この例は、補酵素Ｂ−１２依存性デヒドラターゼの使用に由来するＰＨＡの組
成が、デヒドラターゼに利用可能に作製された補酵素Ｂ−１２の濃度を変動させ
ることによって制御され得ることを実証する。制御が実行され得る程度は、使用
されるジオール基質に依存する。このことは、他の基質を超える特定の基質につ
いてのビシナルジオールの好ましさに起因し得、そしてＰＨＡ形成に対して活性
化されたモノマーとして働くジオールから誘導されたアルデヒドをアセチルＣｏ
Ａに導く宿主代謝の休止に依存し得る（表２．種々の補酵素Ｂ−１２の濃度を有する培地において、ＭＢＸ８２０／
ｐＦＳ４７Ａによってグリセロールおよび１，２−プロパンジオールから産生さ
れるポリマーの組成）

【００４８】

【表２】 ^a光学密度^b ３−ヒドロキシブチレート単位^c ３−ヒドロキシバレレート単位^d ３−ヒドロキシプロピオネート単位^e 乾燥細胞重量の百分率。

【００４９】（実施例６．中心代謝中間体からのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の
産生）実施例１〜５は、グリセロールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を
得ることが可能であること、ならびに上記のように、トランスジェニック生物お
よび非トランスジェニック生物の両方において、中心代謝中間体からグリセロー
ルを産生することが可能であることを実証する。従って、２つの経路の組合せは
、中心代謝中間体からのポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）の合成を可能に
する。これらの経路は、上記の実施例に記載されるように、グリセロール産生宿
主中にポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）合成遺伝子を導入することによっ
てか、あるいはグリセロールからポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）を既に
合成し得る宿主中にグリセロール合成遺伝子を導入することによってのいずれか
と組み合わされ得る。

【００５０】前者の場合、ビシナルジオールデヒドラターゼ、ＰＨＡシンターゼ、ならびに
必要に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、１，３−プロパンジオールオキシ
ドレダクターゼ、およびヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコード
する遺伝子を、中心代謝中間体からグリセロールを産生し得る宿主中に発現させ
る。このような宿主の例は、上記のような、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅＤＡＲ１（ジヒドロオキシアセトンホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ）遺伝子およびＧＰＰ２（ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートホスフ
ァターゼ）遺伝子（Ａｎｔｏｎ，Ｄ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎｏｆ１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ」、ＵｎｉｔｅｄＥｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇＩＩｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｅｌｍａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９８
年１０月２７日；ＰＣＴＷＯ９８／２１３３９）を発現するＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉの多くの株は、１，３−プロパンジオ
ールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒトロゲナーゼ酵素活性を天然に
発現するが、それらのレベルは、必要に応じて、これらの機能を行う酵素の変異
誘発または望ましい過剰発現によって増強され得る。必要なさらなる遺伝子は、
ｔｒｃプロモーターの制御下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ由
来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；Ｚｏｏｇｌｏｅａ
ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡシンターゼ；ならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のグリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパン
ジオールオキシドレダクターゼを含む、ｐＦＳ４８Ｂのようなプラスミドに導入
され得る。これらの遺伝子のうちのいずれかまたは全てはまた、当業者に周知の
標準的な技術を使用して、染色体中への組み込みによって導入され得る。

【００５１】同様に、ＤＡＲ１およびＧＰＰ遺伝子は、上記のポリ（３−ヒドロキシプロピ
オネート）を既に合成し得る宿主（例えば、ＭＢＸ８２０／ｐＦＳ４７Ａ）中に
導入され得る。ＤＡＲ１およびＧＰＰ２遺伝子は、ｐＦＳ４７Ａと適合性のプラ
スミド（ｐＦＳ４７Ａとともに同時に維持され得るプラスミド）に導入され得る
か、またはそれらは、染色体中に組み込まれ得る。ＭＢＸ８２０は、アセトアセ
チル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ、およ
びＰＨＡシンターゼを安定に発現し、それによってポリ（３−ヒドロキシブチレ
ート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート）を合成し得る。ホモポリマーのポ
リ（３−ヒドロキシプロピオネート）が所望される場合、３つの全てのＰＨＢ生
合成遺伝子ではなくＰＨＡシンターゼのみを発現する株が、使用され得る。

【００５２】グルコースからのＰＨＰの生合成の経路を実証するために、プラスミドｐＭＳ
１５（図６に模式的に示される）を、ｔｒｃプロモーターからのオペロンとして
以下の遺伝子を発現するように構築した：Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ由来のＰＨＢ
シンターゼ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトラ
ンスフェラーゼ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来のグリセロールデヒドラターゼ、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＤＡＲ１遺伝子、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＧ
ＰＰ２およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の１，３−プロパノールオキシドレ
ダクターゼ。

【００５３】プラスミドｐＦＳ５５１を、ＤＡＲ１およびＧＰＰ２のＰＣＲ産物をｐＴｒｃ
Ｎに一度にライゲーションすることによって構築した。ＤＡＲ１遺伝子を、以下
のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム
ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した：

【００５４】

【化２】ＧＰＰ２遺伝子を、同じ様式で以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して
増幅した：

【００５５】

【化３】各遺伝子に対するＰＣＲを、以下を含む５０μＬの反応容量において、ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ
．）を用いて実行した：１０ユニットのｐｆｕポリメラーゼ、製造業者により提
供される１×反応緩衝液、５０ｐｍｏｌの各プライマー、約２００ｎｇのＳ．ｃ
ｅｒｅｂｉｓｉａｅゲノムＤＮＡ、および２００μＭの各ｄＮＴＰ。この反応の
温度プロフィールは、以下の通りであった：（９４℃で１分；５５℃で２分；７
２℃で３分）を２７サイクル、次いで７２℃で２分。反応混合液が９４℃に達す
るまで、Ｐｆｕポリメラーゼを添加しなかった。

【００５６】ＰＣＲ産物を、１％の低融点アガロースゲルから精製し、そして対応する部位
がプライマーの５’末端に含まれている制限酵素（ＤＡＲ１についてはＢａｍＨ
ＩおよびＮｏｔＩ、ＧＰＰ２についてはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ）で消化した。
ベクターｐＴｒｃＮは、ＮｃｏＩ部位を欠くように改変されたｐＴｒｃ９９ａの
バージョンである（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｌａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ｐ
ＴｒｃＮを、ＤＡＲ１の挿入のために、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、および仔牛腸ア
ルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．
）で切断し、ＧＰＰ２の挿入のためにＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、およびＣＩＡＰで切
断した。ライゲーションを、製造業者により提供される使用説明書に従って、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ、Ｍａｓｓ．）で実行した。このライゲーションの産物は、ｐＦＳ４９（ＤＡ
Ｒ１）およびｐＦＳ５０（ＧＰＰ２）であった。１つのプラスミドに両方の遺伝
子を構築するために、ｐＦＳ４９をＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで切断し、そしてｔ
ｒｃプロモーターおよびＤＡＲ１を含む２．３−ｋｂフラグメントを、同じ２つ
の酵素およびＣＩＡＰで消化されているｐＦＳ５０にライゲーションした。得ら
れたプラスミドは、ｔｒｃプロモーターの制御下のオペロンＤＡＲ１−ＧＰＰ２
を含み、ｐＦＳ５１と命名した。

【００５７】プラスミドｐＭＳ１５を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１８４（図６に模式的に示
される）を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンもまた含む５０ｍＬのＬＢ培地中で
３７℃にて、２００ｍＬの四角のボトル中で一晩増殖させた。これらの細胞を、
２０００×ｇの１０分間の遠心分離によってこの培養物から取り出し、そしてこ
れらの細胞を、５０ｍＬのグルコース培地中に再懸濁し、そして２００ｒｐｍで
振盪しながら３０℃で７２時間インキュベートした。グルコース培地は、１リッ
トル当たり：６．２５ｇＬＢ粉末；１００μｇアンピシリン；２０ｇグル
コース；５０ｍｍｏｌリン酸カリウム、ｐＨ７；１０μｍｏｌイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；および０、１０、または１０
０ｎｍｏｌ補酵素Ｂ−１２を含んだ。インキュベーションの後に、これらの細
胞を、２０００×ｇでの１０分間の遠心分離により培地から取り出し、水で１回
洗浄し、そして再度、遠心分離し、次いで凍結乾燥した。

【００５８】凍結乾燥された細胞塊のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析は、以下を示し
た：１０ｎＭの補酵素Ｂ−１２を用いた実験において、ポリ（３ＨＰ）は、乾燥
細胞重量の０．１１％であり；１００ｎＭの補酵素Ｂ−１２を用いた実験におい
て、ポリ（３ＨＰ）は、乾燥細胞重量の０．１３％であり；そして補酵素Ｂ−１
２を用いない実験において、ポリ（３ＨＰ）は、検出されなかった。３ＨＰ以外
のポリマー成分は、いずれの場合も見出されなかった。ＧＣ分析を、以下の通り
に実施した：１５〜２０ｍｇの凍結乾燥された細胞塊を、内部標準物として添加
された２ｍｇ／ｍＬの安息香酸とともに、（容量で）５０％の１，２−ジクロロ
エタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃縮した塩酸を含む、２ｍ
Ｌの混合液中で、１００℃にて３時間、同時に抽出およびプロパノール溶解に供
した。得られた混合液の水溶性成分を、３ｍＬの水を用いる抽出によって除去し
た。有機層（２ｍＬ／分の全体的な流速にて１：５０分割比での１μＬ）を、以
下の温度プロフィール（８０℃で２分；１分で１０℃から２５０℃；２５０℃で
２分）を用いて、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．
３２ｍｍＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔ
ｅ，Ｐａ．）上にて分析した。３ＨＰ残基の存在について試験するために使用さ
れた標準物は、β−プロピオラクトンであった。ポリ（３ＨＰ）およびβ−プロ
ピオラクトンの両方は、プロパノール溶解に供した場合に、３−ヒドロキシプロ
ピオネートの１−プロピルエステルを生じた。

【００５９】（実施例７．中心代謝中間体からのＰＨＢＶ）上記のように、他の炭素源（例えば、グルコース）を必要に応じて添加して、
１，２−プロパンジオールからＰＨＢＶを得ることが可能であり、そしてトラン
スジェニック生物および非トランスジェニック生物の両方において、中心代謝中
間体から１，２−プロパンジオールを産生することが可能である（Ｃａｍｅｒｏ
ｎら、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４１１６〜１２５）。
従って、２つの経路の組合せは、中心代謝中間体からのＰＨＢＶの合成を可能に
する。これらの経路は、上記の実施例に記載されるように、１，２−プロパンジ
オール産生宿主中にＰＨＢＶ合成遺伝子を導入することによってか、または１，
２−プロパンジオールからＰＨＢＶを既に合成し得る宿主中に１，２−プロパン
ジオール合成遺伝子を導入することによってのいずれかで組み合わされ得る。

【００６０】前者の場合、ビシナルジオールデヒドラターゼ、ＰＨＡシンターゼ、３−ケト
アシルＣｏＡチオラーゼおよび３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ、ならびに必
要に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、１−プロパンジオールオキシドレダ
クターゼ、およびヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺
伝子を、中心代謝中間体から１，２−プロパンジオールを産生し得る宿主中に発
現させる。このような宿主の例は、上記のような、ラットレンズ（ｌｅｎｓ）ア
ルドースレダクターゼを発現するか、またはＥ．ｃｏｌｉグリセロールデヒドロ
ゲナーゼを過剰発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌ
ｉの多数の株は、１−プロパノールオキシドレダクターゼ酵素活性、アルデヒド
デヒドロゲナーゼ酵素活性、およびプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ酵
素活性を天然に発現するが、それらのレベルは、必要に応じて、これらの機能を
行う酵素の変異誘発または所望の過剰発現によって増強され得る。必要なさらな
る遺伝子は、プラスミドにより運ばれた（ｐｒａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）遺伝子
として導入され得るか、または染色体中に組み込まれ得るか、あるいはこれらの
２つのアプローチの組合せが使用され得る。例えば、ｐＦＳ４８Ｂのようなプラ
スミドは、ｔｃｒプロモーターの制御下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙ
ｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；Ｚｏｏｇ
ｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡシンターゼならびにＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のグリセロールデヒドラターゼおよび１，３−
プロパンジオールオキシドレダクターゼを含み、当業者に周知の標準的な技術を
使用して、染色体中中へのＰＨＢ合成遺伝子の組み込みと組み合せて使用され得
る。

【００６１】同様に、ラットレンズアルドースレダクターゼまたはＥ．ｃｏｌｉグリセロー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子は、上記の、ＰＨＢＶ合成が既に可能な宿主（例えば
、ＭＢＸ７６９／ｐＦＳ４４Ｃ）中に導入され得る。さらなる改善は、Ｃａｍｅ
ｒｏｎら、１９９８（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４１１６〜１２５
）により示唆されるような、メチルグリオキサール合成遺伝子の過剰発現から生
じ得る。ラットレンズアルドースレダクターゼまたはＥ．ｃｏｌｉグリセロール
デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｐＦＳ４４Ｃと適合性のプラスミド（ｐＦＳ４４Ｃ
と同時に維持され得るプラスミド）上に導入され得るか、または、それらは、染
色体中に組み込まれ得る。

【００６２】（実施例８．３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の同
定）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｌｄＨ遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫから入手可能であ
る。この遺伝子を、実施例６に記載されるアプローチおよび以下のプライマーを
使用して、ＰＣＲ増幅の後にクローニングベクターｐＳＥ３８０のＡｃｃ６５Ｉ
およびＮｏｔＩ部位中にクローニングした：

【００６３】

【化４】得られた組換えプラスミドｐＡＬＤＨを、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中に導入し
、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中にて３７℃
で増殖させた。翌日に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌを、
１００μｌの一晩の培養物に接種し、そして６００ｎｍの吸光度が０．５に達す
るまで増殖させた。６００ｎｍの吸光度が０．５に達した時点で、ｔｒｃプロモ
ーターを、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、そして３７℃でさらに３時間インキュベ
ートした。これらの細胞を回収し、洗浄し、そして０．１ＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ
ｐＨ８．０中に再懸濁し、そして超音波処理により溶解した。これらの細胞溶
解物を、補因子としてＮＡＤおよびＮＡＤＰの両方を用いて３−ヒドロキシプロ
ピオンアルデヒドを使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性についてアッセ
イした。アッセイを、ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄダイオードアレイ分光光
度計を使用して実行した。酵素反応を、１．５ｍｌのＵＶキュベットで、以下を
含む溶液中で実行した：０．１ＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＮ
ＡＤまたはＮＡＤＰ、６ｍＭジチオスレイトールおよび最終容量１ｍｌまでの
粗細胞抽出物。混合液を、１ｍＭ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを添加
することによって反応を開始する前に２０秒インキュベートし、そして反応を３
４０ｎｍでモニターした。この溶解物は、ベクターのみを使用して調製されたコ
ントロールサンプル中に存在しないＮＡＤが補因子である場合に、有意な３−ヒ
ドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示した（１．３５μモル
／分／ｍｇタンパク質）。従って、ａｌｄＨ遺伝子は、先の実施例に記載される
株における３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を増大さ
せるために使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、グリセロール−３−Ｐからの３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの産生
のフローチャートである。

【図２】図２は、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）および４−ヒドロキシブチ
リル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈｂｃＴ）をコードするプラスミド構築物ｐ
ＦＳ４４Ｃの模式図である。

【図３】図３は、ｄｈａＢ、ｈｂｃＴおよびｐｈａＣをコードするプラスミド構築物ｐ
ＦＳ４５の模式図である。

【図４】図４は、ｄｈａＴ、ｄｈａＢおよびｈｂｃＴをコードするプラスミド構築物ｐ
ＦＳ４７Ａの模式図である。

【図５】図５は、ｄｈａＴ、ｄｈａＢ、ｈｂｃＴおよびｐｈａＣをコードするプラスミ
ド構築物ｐＦＳ４８Ｂの模式図である。

【図６】図６は、ｄｈａＴ、ＤＡＲ１−ＧＰＰ２（ＤＡＲ１、ジヒドロキシアセトンホ
スフェートデヒドロゲナーゼ；およびＧＰＰ２、ｓｎ−グリセロール−３−ホス
フェートホスファターゼ）、ｄｈａＢ、ｈｂｃＴおよびｐｈａＣをコードするプ
ラスミド構築物ｐＭＳ１５の模式図である。

【図７】図７は、ＧＰＰ２およびＤＡＲ１をコードするプラスミド構築物ｐＦＳ５１の
模式図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年８月２３日（２０００．８．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】トランスジェニック作物種においてこれらのポリマーを産生し得ることが、経
済的に所望される。植物の産生のための方法は、以下に記載されている：米国特
許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；同第５，５０２，
２７３号；同第５，５３４，４３２号；同第５，６０２，３２１号；同第５，６
１０，０４１号；同第５，６５０，５５５号；同第５，６６３，０６３号；ＷＯ
９１００９１７、ＷＯ９２１９７４７、ＷＯ９３０２１８７、ＷＯ９３０２１９
４、およびＷＯ９４１２０１４、Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：５２０−５２３、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６、
Ｃｈｅｍｔｅｃｈ２６，３８−４４。この目的を達成するために、微生物由来の
ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子または１つより多いサブユニットを有す
るＰＨＡポリメラーゼの場合には複数の遺伝子を、植物細胞に移入して、ＰＨＡ
ポリメラーゼ酵素の適切なレベルの産生を得ることが必要である。さらに、さら
なるＰＨＡ生合成遺伝子（例えば、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセ
チル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフ
ェラーゼ遺伝子、またはＰＨＡポリメラーゼ酵素についての基質を合成するため
に必要な酵素をコードする他の遺伝子）を提供する必要性があり得る。多くの場
合において、異なる植物組織またはオルガネラにおける発現を制御することが所
望される。植物組織またはオルガネラにおける発現を制御するための方法は、当
該分野で公知であるｓ（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，１９８９、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２４４；１２９３−１２９９；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌ
ａｎｔｓ，１９９５、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，
Ｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
ＮｅｗＹｏｒｋ、および「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９６、Ｏｗｅｎ，Ｍ．
Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、ＪｈｏｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．Ｅ
ｎｇｌａｎｄ）。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】（基質の利用のための遺伝子）本明細書中に記載されるような使用に適切な組換えＰＨＡ手順を開発するため
の遺伝子および技術は、一般的に、当業者に公知である（Ｍａｄｉｓｏｎおよび
Ｈｕｉｓｍａｎ，１９９１、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３；ＰＣＴＷＯ９
９／１４３１３）。中心代謝中間体からグリセロールを介してポリ（３−ヒドロ
キシプロピオネート）の産生を実行する必要がある遺伝子の全てはクローニング
されており、そして遺伝子操作可能な形態で利用可能であるので、プラスミドに
より運ばれた遺伝子および組み込まれた遺伝子の任意の組み合わせが使用され得
、それゆえ、この経路の実行は、本明細書中に概説されるスキームに制限されな
い。多くの異なる実行は、当業者に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19）Ａ (72)発明者ピープルズ，オリバーピー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02474，アーリントン，ラドクリフロード 27 Ｆターム(参考） 2B030 AB04 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA03 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 4B064 AD83 CA02 CA11 CA19 CC24 CD05 CD11 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 BA25 BB06 BD36 CA12 CA44 CA54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリヒドロキシアルカノエートを産生するための方法であっ
て、以下の工程：ビシナルジオールヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル
−ＣｏＡシンターゼβケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、グリセロール−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選択
される酵素を発現する、遺伝子操作された生物を提供する工程；該生物によって発現される酵素によって、３−ヒドロキシプロピオネートモノ
マーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーに変換され得るジオールを提供す
る工程；ならびに３−ヒドロキシプロピオネートまたは３−ヒドロキシバレレートが、重合され
てポリヒドロキシアルカノエートを形成するモノマーに変換される条件下で、該
生物を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記生物が細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記生物が植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記生物が、１つ以上の前記酵素をコードするプラスミドで
遺伝子操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記生物が、前記酵素をコードする遺伝子を染色体へ組み込
むために遺伝子操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記ジオールが、１，２−プロパンジオール、１，３−プロ
パンジオール、およびグリセロールからなる群より選択される、請求項１に記載
の方法。
【請求項７】前記デヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよび
ジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】モノマーに変換される前記ジオールが、３−ヒドロキシプロ
ピオネートモノマーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマーからなる群より選
択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】請求項１に記載の方法であって、アルデヒドデヒドロゲナー
ゼおよび１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼからなる群より選択さ
れる酵素をコードする遺伝子を提供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】ポリヒドロキシアルカノエートを生成するための系であっ
て、ビシナルジオールデヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシ
ル−ＣｏＡシンターゼβケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ
、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、グリセロール−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−３−ホスファターゼからなる群より選
択される酵素を発現するように遺伝子操作される生物を包含し、ここで、該生物が、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する、３
−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは３−ヒドロキシバレレートモノマー
に、ジオールを変換し得る、系。
【請求項１１】前記生物が細菌である、請求項１０に記載の系。
【請求項１２】前記生物が植物である、請求項１０に記載の系。
【請求項１３】前記生物が、１つ以上の前記酵素をコードするプラスミド
で遺伝子操作される、請求項１０に記載の系。
【請求項１４】前記生物が、前記酵素をコードする遺伝子を染色体へ組み
込むために遺伝子操作される、請求項１０に記載の系。
【請求項１５】補酵素Ｂ−１２をさらに包含する、請求項１０に記載の系
。
【請求項１６】前記ビシナルジオールデヒドラターゼが、グリセロールデ
ヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項
１０に記載の系。
【請求項１７】アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび１，３−プロパンジオ
ールオキシドレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子を
さらに含む、請求項１０に記載の系。