JP2003192931A - 非対称ベンゾキサンテン染料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光染料として有用な種類の非対称ベンゾキ
サンテン染料を提供すること。 【解決手段】 次式： 【化４１】 を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物であって、
Ｙ_１およびＹ_２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミ
ニウム、またはアミンである。Ｒ_１〜Ｒ_８は、別個に、
水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低
級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、ア
ミド、ニトリル、アルコキシ、連結基またはそれらの組
合せである。そしてＲ_９は、アセチレン、アルカン、ア
ルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せ
であり、この置換フェニルは、以下の構造： 【化４２】 を有し、Ｘ_１は、カルボン酸またはスルホン酸であり；
Ｘ_２およびＸ_５は、別個に、水素、塩素、フッ素、また
は低級アルキルであり；そしてＸ_３およびＸ_４は、別個
に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、
スルホン酸、または連結基である、化合物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】（発明の分野）本発明は、一
般に、分子プローブとして有用な蛍光染料化合物に関す
る。より詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用
な非対称ベンゾキサンテン染料に関する。

【０００２】

【従来の技術】（発明の背景）生物学的分析物の非放射
性検出は、現在の分析バイオテクノロジーにおいて、重
要な技術である。放射性標識の必要性をなくすことによ
り、安全性が高まり、試薬廃棄物の環境上の影響が著し
く低下し、その結果、分析コストが低減される。このよ
うな非放射性検出方法を使用する方法の例には、ＤＮＡ
配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラー
ゼ鎖反応生成物の検出、イムノアッセイなどが包含され
る。

【０００３】多くの用途では、混合物中の複数の空間的
に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多
重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮ
Ａ配列決定法などが必要である。複数座のＤＮＡプロー
ブアッセイの場合には、多色検出を提供することによ
り、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験
プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの
製造が促進される。自動化したＤＮＡ配列決定の場合に
は、多色標識化により、単一ラインの４個の塩基全ての
分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力
が増え、レーン間の電気泳動の可動性の変化に付随した
不確実性がなくなる。

【０００４】多重検出では、特に、電気泳動分離および
酵素処理が必要な分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）に対
して、染料標識の選択について、非常に多くの厳しい制
約が課せられている。第１に、有機蛍光染料の典型的な
発光バンドの半値幅は、約４０〜８０ナノメーター（ｎ
ｍ）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源に
より制限されるので、その発光スペクトルが分光的に分
解される一連の染料を見つけるのは困難である。１組の
染料に関連して、本明細書中で使用する「スペクトル分
解」との用語は、これらの染料の蛍光発光バンドが充分
に異なること、すなわち、充分に重なりがないことを意
味し、個々の染料が結合している試薬（例えば、ポリヌ
クレオチド）が、米国特許第４，２３０，５５８号、第
４，８１１，２１８号またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１
〜７６ページ、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８５）に記述の系によって例示されるよ
うに、例えば、バンドパスフィルターおよび光電子増倍
管、帯電カップルド装置（ｃｈａｒｇｅｄ−ｃｏｕｐｌ
ｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）、および分光器のシステムを使用
する標準的な光検出システムを用いて、個々の染料によ
り発生する蛍光信号を基準にして、識別できることを意
味する。第２に、たとえ、非重複発光スペクトルを有す
る染料を見出しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、
そのセットは、依然として、適当ではない。例えば、Ｄ
ＮＡ配列決定の場合には、試料の充填を多くしても、低
い蛍光効率を補填できない（Ｐｒｉｎｇｌｅら、ＤＮＡ
Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ Ｎｅｗｓｌｅｔｔ
ｅｒ、１：１５〜２１（１９８８））。第３に、数個の
蛍光染料を同時に使用するとき、これらの染料の吸収バ
ンドが広範囲に分離するために、同時励起が困難とな
る。第４に、これらの染料の電荷、分子サイズおよび立
体配座は、そのフラグメントの電気泳動可動性に悪影響
を与えてはならない。最後に、これらの蛍光染料は、こ
れらのフラグメントを製造するかまたは操作するのに使
用する化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、
緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合
性でなければならない。

【０００５】これらの厳しい制約のために、多色用途
（特に、４色ＤＮＡ配列決定の領域）で使用できる蛍光
染料のセットは、少数発見されているにすぎない（例え
ば、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、１１３；２３９９〜２４１２（１９８
５）；Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：３３
６〜３４１（１９８７）；およびＣｏｎｎｅｌｌら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５：３４２〜３４８（１９
８７））。図１は、２種のローダミンベースの染料であ
るＴＡＭＲＡ（２２）およびＲＯＸ（２６）および２種
のフルオレセインベースの染料であるＨＥＸ（２３）お
よびＮＡＮ（２４）を含めて、５５０ｎｍを超えると発
光する長波長標識として使用される蛍光キサンテン染料
の例を示す。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、複数
の空間的に重複した分析物の同時検出に有用な種類の非
対称ベンゾキサンテン染料であって、上記制約を満た
し、４８０ｎｍと５５０ｎｍの間の波長を有する励起光
を照射したとき、５５０ｎｍを超える蛍光発光最大を与
えるものを提供することにある。

【０００７】本発明の他の目的は、複数の空間的に重複
した分析物の同時検出に有用な種類の非対称ベンゾキサ
ンテン染料であって、上記制約を満たし、その蛍光特性
が、種々の位置における置換基の操作により調整できる
ものを提供することにある。

【０００８】本発明のさらに他の目的は、本発明の非対
称ベンゾキサンテン染料の合成に有用な方法および中間
体化合物を提供することにある。

【０００９】本発明のさらに他の目的は、本発明の非対
称ベンゾキサンテン染料で標識化したヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドを提供することにある。

【００１０】本発明のさらに他の目的は、本発明の非対
称ベンゾキサンテン染料を含むホスホロアミデート化合
物を提供することにある。

【００１１】本発明のさらに他の目的は、本発明の非対
称ベンゾキサンテン染料を使用して、ＤＮＡ配列決定法
を含めたフラグメント解析法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】第１の局面では、本発明
の上述の目的および他の目的は、次式を有する非対称ベ
ンゾキサンテン染料化合物により、達成される：

【００１３】

【化３】 ここで、Ｙ_１およびＹ_２は、別個に、ヒドロキシル、酸
素、イミニウム、またはアミンである。Ｒ_１〜Ｒ_８は、
別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アル
ケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニ
ウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基またはそ
れらの組合せである。そしてＲ_９は、アセチレン、アル
カン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれら
の組合せであり、この置換フェニルは、以下の構造を有
する：

【００１４】

【化４】 ここで、Ｘ_１は、カルボン酸またはスルホン酸であり；
Ｘ_２およびＸ_５は、別個に、水素、塩素、フッ素、また
は低級アルキルであり；そしてＸ_３およびＸ_４は、別個
に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、
スルホン酸、または連結基である。

【００１５】第２の局面では、本発明は、次式を有する
ホスホロアミダイト化合物を包含する：

【００１６】

【化５】 ここで、Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒ
ｍ）であり；Ｙは、連結基であり；Ｂ_１は、亜リン酸エ
ステル保護基であり；Ｂ_２、およびＢ_３は、別個に、低
級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子
を有する低級アリール、アリールアルキル、および１０
個までの炭素原子を含有するシクロアルキルであり；そ
してＤは、上記非対称ベンゾキサンテン染料化合物であ
る。ＹおよびＤは、連結基およびその相補官能基（ｃｏ
ｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔ
ｙ）の反応により形成した連結基を介して結合されてお
り、このような連結基は、Ｒ_１〜Ｒ_９位置のうちの１つ
で、染料Ｄに結合している。

【００１７】第３の局面では、本発明は、次式を有する
ホスホルアミダイト化合物を包含する：

【００１８】

【化６】 ここで、Ｂ_１は、亜リン酸エステル保護基であり、Ｂ_２
およびＢ_３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、
１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アリ
ールアルキル、および１０個までの炭素原子を含有する
シクロアルキルであり；Ｂ_５は、酸切断可能なヒドロキ
シル保護基であり；Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そ
してＤは、上記染料化合物である。Ｂがプリンまたは７
−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまた
は７−デアザプリンのＮ^９−位置にて結合しており、Ｂ
がピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンの
Ｎ^１−位置にて結合している。ＢおよびＤは、連結基お
よびその相補官能基の反応により形成した連結基を介し
て結合されており、このような連結基は、Ｒ_１〜Ｒ_９位
置の１個で、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場
合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合してお
り、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、
この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そし
てＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリ
ミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂ
は、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、および
７−デアザグアノシンからなる群から選択される。

【００１９】第４の局面では、本発明は、上記非対称ベ
ンゾキサンテン染料の合成で中間体として有用な化合物
を包含し、このような化合物は、次式を有する：

【００２０】

【化７】 ここで、Ｒ_３〜Ｒ_７は、上で記述のものと同じであり、
そしてＹ_２は、ヒドロキシルまたはアミンである。本局
面の特に好ましい実施形態では、Ｒ_３は、フッ素であ
り、そしてＹ_２は、ヒドロキシルである。

【００２１】第５の局面では、本発明は、本発明の上記
非対称ベンゾキサンテン染料で標識化したヌクレオチド
を包含し、このヌクレオチドは、次式を有する：

【００２２】

【化８】 ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミ
ジンヌクレオチド塩基である；Ｗ_１およびＷ_２は、別個
に、ＨまたはＯＨである；Ｗ_３は、ＯＨ、

【００２３】

【化９】 であり、そしてＤは、本発明の染料化合物である。Ｂが
プリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、
このプリンまたはデアザプリンのＮ^９−位置にて結合し
ており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピ
リミジンのＮ^１−位置にて結合している。ＢおよびＤを
連結している連結基は、Ｒ_１〜Ｒ_９位置のうちの１つ
で、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連
結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７
−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デ
アザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリ
ミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５
−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシ
ル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシン
からなる群から選択される。

【００２４】第６の局面では、本発明は、次式を有する
ヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチドを包含
する：

【００２５】

【化１０】 ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリ
ミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ_１は、ＨまたはＯＨ
であり；Ｚ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ_４、およびＮｕｃで
あり、ここで、「Ｎｕｃ」は、ヌクレオチドを意味す
る。このヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホジエステ
ル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの５’
−位置に結合している；Ｚ_３は、Ｈ、ＨＰＯ_３およびそ
れらのホスフェートアナログ、およびＮｕｃからなる群
から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシド
は、ホスホジエステル連結基により連結されており、こ
の連結基は、Ｎｕｃの３’−位置に結合している；そし
てＤは、本発明の染料化合物である。ＨＰＯ_３のホスフ
ェートアナログには、非架橋酸素を非酸素部分（例え
ば、イオウ、アミノ、アニリデート、アニリンチオエー
トなど）で置き換えたアナログが挙げられる。Ｂがプリ
ンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、この
プリンまたはデアザプリンのＮ^９−位置にて結合してお
り、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミ
ジンのＮ^１−位置にて結合している。ＢおよびＤを連結
している連結基は、Ｒ_１〜Ｒ_９位置の１個で、Ｄに結合
している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、この
プリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリ
ンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの
７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである
場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結
合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、
デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から
選択される。

【００２６】第７の局面では、本発明は、本発明の染料
を用いたポリヌクレオチド配列決定方法を包含する。こ
の方法は、第１、第２、第３、および第４のクラスのポ
リヌクレオチドの混合物を以下のように形成する工程を
包含する：第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’
−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識
化されている；第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、
３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標
識化されている；第３のクラスの各ポリヌクレオチド
は、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染
料で標識化されている；そして第４のクラスの各ポリヌ
クレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有
し、第４染料で標識化されている。この方法では、第１
染料、第２染料、第３染料、または第４染料の１種以上
は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料である。これ
らの染料の他のものは、それらが、この非対称ベンゾキ
サンテン染料からおよび互いから分光的に分解可能なよ
うに、選択される。上記混合物を形成した後、このポリ
ヌクレオチドは、電気泳動的に分離され、それにより、
類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドが形成され
る。次に、これらのバンドは、これらの染料に蛍光を起
こすことができる照射ビームで照射される。最後に、こ
れらのポリヌクレオチドのクラスは、各バンド中の標識
化ポリヌクレオチドの蛍光スペクトルにより、同定され
る。

【００２７】第８の局面では、本発明は、本発明の染料
化合物を使用するフラグメント解析方法を包含する。こ
の局面の方法は、以下の工程を包含する：標識化ポリヌ
クレオチドフラグメントを形成する工程であって、この
フラグメントが、本発明の染料化合物で標識化されてい
る、工程；この標識化ポリヌクレオチドフラグメント
を、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；およびこ
の分離プロセスに引き続いて、この標識化ポリヌクレオ
チドフラグメントを検出する工程。１つの局面におい
て、本発明は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン染
料化合物：

【００２８】

【化１１】 を提供し、ここで、Ｙ_１およびＹ_２は、別個に、ヒドロ
キシル、酸素、イミニウムおよびアミンからなる群から
選択され；Ｒ_１〜Ｒ_８は、別個に、水素、フッ素、塩
素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スル
ホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニ
トリル、低級アルコキシ、連結基およびそれらの組合せ
からなる群から選択され；そしてＲ_９は、アセチレン、
低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、置換
フェニル、複素環芳香族およびそれらの組合せからなる
群から選択され、この置換フェニルは、以下の構造を有
し：

【００２９】

【化１２】 ここで、Ｘ_１〜Ｘ_５は、別個に、水素、塩素、フッ素、
低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ_２Ｏ
Ｈ、または連結基である。

【００３０】１つの実施形態において、上記の化合物
は、Ｙ_１およびＹ_２の１個が、酸素であり得、そして他
が、ヒドロキシルであり得る。

【００３１】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ_１は、カルボン酸、スルホン酸、および−ＣＨ_２ＯＨ
からなる群から選択され得；Ｘ_２およびＸ_５は、別個
に、水素、塩素、フッ素、および低級アルキルからなる
群から選択され得；そしてＸ_３およびＸ_４は、別個に、
水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スル
ホン酸、および連結基からなる群から選択され得る。

【００３２】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ_２およびＸ_５が、塩素であり得る。

【００３３】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ_１が、カルボン酸であり得る。

【００３４】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ_３またはＸ_４の一方が、連結基であり得、そして他方
が、水素であり得る。

【００３５】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ_１またはＸ_５の一方が、カルボン酸、スルホン酸、お
よび−ＣＨ_２ＯＨからなる群から選択され得る。

【００３６】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｒ_１〜Ｒ_３の１個が、フッ素であり得る。好ましい実施
形態において、上記の化合物は、Ｒ_３が、フッ素であり
得る。

【００３７】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_１は、塩素であり得；Ｒ
_３は、フッ素であり得；Ｒ_２、およびＲ_４〜Ｒ_８は、水
素であり得；そしてＲ_９は、置換フェニルであり得、こ
こで、Ｘ_１は、カルボキシルであり得、Ｘ _２およびＸ_５
は、塩素であり得、そしてＸ_３およびＸ_４の一方は、カ
ルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。

【００３８】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_１およびＲ_３は、フッ素
であり得；Ｒ_２、およびＲ_４〜Ｒ_８は、水素であり得；
そしてＲ_９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ
_１は、カルボキシルであり得、Ｘ _２およびＸ_５は、塩素
であり得、そしてＸ_３およびＸ_４の一方は、カルボキシ
ルであり得、そして他方は、水素であり得る。

【００３９】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_１は、メトキシであり
得、Ｒ_２は、塩素であり得、Ｒ_３は、フッ素であり得；
Ｒ_４〜Ｒ_８は、水素であり得；そしてＲ_９は、置換フェ
ニルであり得、ここで、Ｘ_１は、カルボキシルであり
得、Ｘ _２およびＸ_５は、塩素であり得、そしてＸ_３およ
びＸ_４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方
は、水素であり得る。

【００４０】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_３は、フッ素であり得；
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_４〜Ｒ_８は、水素であり得；そし
てＲ_９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ_１は、カ
ルボキシルであり得、Ｘ _２およびＸ_５は、塩素であり
得、そしてＸ_３およびＸ_４の一方は、カルボキシルであ
り得、そして他方は、水素であり得る。

【００４１】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_１〜Ｒ_８は、水素であり
得；そしてＲ_９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ
_１は、カルボキシルであり得、Ｘ _２およびＸ_５は、塩素
であり得、そしてＸ_３およびＸ_４の一方は、カルボキシ
ルであり得、そして他方は、水素であり得る。

【００４２】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_１は、塩素であり；Ｒ_２
〜Ｒ_８は、水素であり得；そしてＲ_９は、置換フェニル
であり得、ここで、Ｘ_１は、カルボキシルであり得、Ｘ
_２およびＸ_５は、塩素であり得、そしてＸ_３およびＸ_４
の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素
であり得る。

【００４３】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_１およびＹ_２の一方は、酸素であり得、そして他方
は、ヒドロキシルであり得；Ｒ_１は、メトキシであり；
Ｒ_２は、塩素であり得；Ｒ_３〜Ｒ_８は、水素であり得；
そしてＲ_９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ
_１は、カルボキシルであり得、Ｘ _２およびＸ_５は、塩素
であり得、そしてＸ_３およびＸ_４の一方は、カルボキシ
ルであり得、そして他方は、水素であり得る。

【００４４】別の局面において、本発明は、次式を有す
るホスホルアミダイト化合物：

【００４５】

【化１３】 を提供し、ここで、Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃ
ｅｒ ａｒｍ）であり；Ｙは、連結基であり；Ｂ_１は、
亜リン酸エステル保護基であり；Ｂ_２およびＢ_３は、別
個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および
１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからな
る群から選択され；そしてＤは、上記の染料化合物であ
る；ここで、ＹおよびＤは、Ｒ_１〜Ｒ_９位置のうち１つ
で染料Ｄに結合した連結基を介して、連結されている。

【００４６】１つの実施形態において、上記の化合物
は、Ｂ_２およびＢ_３は、一緒になって、その主鎖に５個
までの炭素原子を含み、かつ全体で１０個までの炭素原
子を含有するアルケン鎖であり得、この鎖の両末端の原
子価結合は、この窒素原子に結合されており得るか；あ
るいはＢ_２およびＢ_３は、窒素原子と一緒になって、飽
和窒素複素環を形成し得、これは、窒素、酸素、および
イオウからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子
を含有し得る。好ましい実施形態において、上記の化合
物は、Ｂ_１は、メチル、β−シアノエチル、または４−
ニトロフェニルエチルからなる群から選択され得；Ｂ_２
およびＢ_３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イ
ソブチル、およびｓｅｃ−ブチルからなる群から選択さ
れ得；そしてＢ_２およびＢ_３は、一緒になって、モルホ
リノであり得る。

【００４７】別の実施形態において、上記の化合物は、
ＸおよびＹが、一緒になって、以下の式であり得、ここ
で、ｎが、２〜１０の範囲であり得る：

【００４８】

【化１４】 。

【００４９】別の実施形態において、上記の化合物は、
ＸおよびＹが、一緒になって、以下の式であり得、ここ
で、ｎが、２〜１０の範囲であり得る：

【００５０】

【化１５】 。

【００５１】別の局面において、本発明は、次式を有す
るホスホロアミダイト化合物：

【００５２】

【化１６】 を提供し、ここで：Ｂ_１は、亜リン酸エステル保護基で
あり；Ｂ_２、およびＢ_３は、別個に、低級アルキル、低
級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を
含有するシクロアルキルからなる群から選択され；Ｂ_５
は、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり；Ｂは、ヌ
クレオチド塩基であり；そしてＤは、上記の染料化合物
である；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンで
ある場合、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザ
プリンのＮ^９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジン
である場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ^１−位
置にて結合している；ここで、ＢおよびＤは、Ｒ_１〜Ｒ
_９位置のうち１つでＤに結合した連結基により、連結さ
れている；そしてここで、Ｂがプリンである場合、この
連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが
７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−
デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピ
リミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの
５−位置にて結合している。

【００５３】１つの実施形態において、上記の化合物
は、上記連結基が、以下の式であり得る：

【００５４】

【化１７】 。

【００５５】別の実施形態において、上記の化合物は、
上記連結基が、以下であり得る

【００５６】

【化１８】 。

【００５７】別の実施形態において、上記の化合物は、
上記連結基が、以下であり得る：

【００５８】

【化１９】 。

【００５９】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデ
アザグアノシンからなる群から選択され得る。

【００６０】別の局面において、本発明は、次式を有す
る化合物：

【００６１】

【化２０】 を提供し、ここで：Ｒ_３は、フッ素、塩素、スルホネー
ト、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、およ
び連結基からなる群から選択され；Ｒ_４〜Ｒ_７は、別個
に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケ
ン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アミド、ニ
トリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から
選択され；そしてＹ_２は、ヒドロキシルおよびアミンか
らなる群から選択される。

【００６２】１つの実施形態において、上記の化合物
は、Ｒ_３が、フッ素であり得る。

【００６３】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_２が、ヒドロキシルであり得る。

【００６４】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｒ_３が、塩素であり得る。

【００６５】別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ_２が、アミンであり得る。

【００６６】別の局面において、本発明は、次式を有す
る標識化ヌクレオチド：

【００６７】

【化２１】 を提供し、ここで：Ｂは、７−デアザプリン、プリン、
またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｗ_１および
Ｗ_２は、別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択さ
れ；Ｗ_３は、ＯＨ、

【００６８】

【化２２】 からなる群から選択され；Ｄは、上記の染料化合物であ
り；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである
場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンの
Ｎ^９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場
合、その糖部分は、このピリミジンのＮ^１−位置にて結
合している；ここで、ＢおよびＤを連結している連結基
は、Ｒ_１〜Ｒ_９位置のうちの１つで、Ｄに結合してい
る；そしてここで、Ｂがプリンである場合、この連結基
は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デ
アザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザ
プリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジ
ンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位
置に結合している。

【００６９】１つの実施形態において、上記の標識化ヌ
クレオチドは、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデ
ニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され
得る。

【００７０】別の実施形態において、上記の標識ヌクレ
オチドは、上記連結基が、以下の式であり得る：

【００７１】

【化２３】 。

【００７２】別の実施形態において、上記の標識化ヌク
レオチドは、Ｗ_１およびＷ_２の両方が、Ｈであり得、そ
してＷ_３が、以下の式であり得る：

【００７３】

【化２４】 。

【００７４】別の実施形態において、上記の標識化ヌク
レオチドは、Ｗ_１が、Ｈであり得、Ｗ_２が、ＯＨであり
得、そしてＷ_３が、以下の式であり得る：

【００７５】

【化２５】 。

【００７６】別の局面において、本発明は、次式を有す
るヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチド：

【００７７】

【化２６】 を提供し、ここで：Ｂは、７−デアザプリン、プリン、
またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ_１は、Ｈ
またはＯＨからなる群から選択され；Ｚ_２は、Ｈ、Ｏ
Ｈ、ＨＰＯ_４、およびＮｕｃからなる群から選択され、
ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエ
ステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの
５’−位置に結合している；Ｚ_３は、Ｈ、ＨＰＯ_３、ホ
スフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択さ
れ、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホ
ジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕ
ｃの３’−位置に結合している；そしてＤは、上記の染
料化合物である；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザ
プリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデ
アザプリンのＮ^９−位置にて結合しており、Ｂがピリミ
ジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ^１
−位置にて結合している；ここで、ＢおよびＤを連結し
ている連結基は、Ｒ_１〜Ｒ_９位置のうちの１つで、Ｄに
結合している；ここで、Ｂがプリンである場合、この連
結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７
−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デ
アザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリ
ミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５
−位置に結合している。

【００７８】１つの実施形態において、上記の標識化ポ
リヌクレオチドは、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザ
アデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択
され得る。

【００７９】別の実施形態において、上記の標識化ポリ
ヌクレオチドは、上記連結基が、以下の式であり得る：

【００８０】

【化２７】 。

【００８１】別の局面において、本発明は、以下の工程
を包含する、ポリヌクレオチド配列決定方法を提供す
る：第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌク
レオチドの混合物を以下：この第１のクラスの各ポリヌ
クレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有
し、第１染料で標識されており；この第２のクラスの各
ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを
含有し、第２染料で標識されており；この第３のクラス
の各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノ
シンを含有し、第３染料で標識されており；そしてこの
第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデ
オキシチミジンを含有し、第４染料で標識されており；
ここで、この第１染料、この第２染料、この第３染料、
またはこの第４染料のうちの１種は、上記の非対称ベン
ゾキサンテン染料であり；この染料の他のものは、この
非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから、分光
的に分解可能である、ように形成する工程；このポリヌ
クレオチドを電気泳動的に分離し、それにより、同様に
サイズ分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成する
工程；このバンドを、この染料が蛍光を発するのを引き
起こすことができる照射ビームで照射する工程；ならび
にこのバンド中のこのポリヌクレオチドのクラスを、こ
の染料の蛍光スペクトルにより同定する工程。

【００８２】１つの実施形態において、上記のポリヌク
レオチド配列決定方法は、上記染料の他のものが、６−
カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４，７，
２’，７’−テトラクロロフルオレセイン、および６−
カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサ
クロロフルオレセインからなる群から選択され得る。

【００８３】別の局面において、本発明は、以下を包含
する、フラグメント解析方法を提供する：標識化ポリヌ
クレオチドフラグメントを形成する工程であって、この
フラグメントが、上記の染料化合物で標識化されてい
る、工程；この標識化ポリヌクレオチドフラグメント
を、サイズ依存性（ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）分
離プロセスに供する工程；およびこの分離プロセスに引
き続いて、この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを
検出する工程。

【００８４】１つの実施形態において、上記のフラグメ
ント解析方法は、上記サイズ依存性分離プロセスが、電
気泳動であり得、そして上記検出する工程が、蛍光によ
って検出する工程であり得る。

【００８５】

【発明の実施の形態】（発明の要旨）本発明は、蛍光染
料として有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料を本
発明者が発見したことに関する。

【００８６】本発明の染料は、特に、多色蛍光ベースの
ＤＮＡ配列決定の領域において、複数の空間的に重複し
た分析物の同時検出に使用する現在利用可能な染料より
も、少なくとも７個の重要な利点を提供する。第１に、
本発明の染料は、所望のスペクトル特性を有する現在利
用可能な染料よりも、ＤＮＡ合成条件に対して、ずっと
安定である。このＤＮＡ合成条件に対する高い安定性に
より、自動化ＤＮＡ合成技術（例えば、標識化ＰＣＲプ
ライマー、ＤＮＡ配列決定プライマーおよびオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションプローブ）を用いて、
標識化オリゴヌクレオチド試薬をずっと容易に調製する
ことが可能となる。第２に、本発明の染料は、約５５０
ｎｍを超える波長範囲で以前に使用されているフルオレ
セインベースの染料よりも、著しく光安定性である。第
３に、本発明の染料は、青い「肩部」のある吸収スペク
トルを有し、それにより、ジベンゾキサンテン染料また
はローダミンベースの染料よりも短い波長で、この染料
のより効率的な励起が可能となる。第４に、本発明の非
対称ベンゾキサンテン染料は、分光的に類似のローダミ
ンベースの染料よりも著しく高い量子収量を有する。第
５に、本発明の染料の高い量子収量と相まって、典型的
な光源による高い励起効率により、この染料は、所望の
スペクトル特性を有する現在利用可能な染料よりも、著
しく明るくなる。ＤＮＡ配列決定用途（この場合、分析
物の量は、電気泳動負荷因子により制限され、その全蛍
光は、数百の空間的に分離された種に分配されている）
の状況では、明度は、特に重要である。本明細書中で使
用する「明度」とは、最終的な蛍光発光強度に対する、
吸光係数および蛍光量子収量を合わせた効果を意味す
る。この蛍光標識の明度を高くすることにより、より大
きく数の少ないフラグメントが容易に検出でき、この電
気泳動に充填する必要がある試料が少なくなり、それに
より、優れた電気泳動解像度が得られる。さらに、これ
らの分析物の高い明度は、高い信号：ノイズ比に寄与
し、空間的かつ分光的に近接した種の改良された解析を
生じる。第６に、本発明の染料の非対称性により、この
染料の置換基Ｒ _１〜Ｒ_９、特に、そのレゾルシノール誘
導部分の置換基Ｒ_１〜Ｒ_３を変えることにより、これら
の染料の発光スペクトルの調整が可能となる。対称ベン
ゾキサンテン化合物では、１個の等価の置換基位置だけ
が利用可能であり、それにより、この染料のスペクトル
調整に利用できる自由度が大きく制限される。第７に、
本発明の染料は、安定なホスホロアミダイト誘導体に容
易に転化され、これは、標識化オリゴヌクレオチドの自
動化化学合成に使用できる。

【００８７】本発明のこれらの目的および他の目的、特
徴および利点は、以下の記載、図面、および添付の請求
の範囲を参照すると、よく理解される。 （好適な実施形態の詳細な説明）本発明のある好ましい
実施形態を、ここで、詳細に言及する。本発明は、その
好ましい実施形態に関連して記述されているものの、そ
れらは、本発明をこれらの実施形態に限定する意図はな
いことが分かる。逆に、本発明は、添付の請求の範囲で
規定した本発明の範囲内に含まれ得る代替、改良および
等価物を含むことを意図している。

【００８８】一般に、本発明は、蛍光染料として有用な
新規なクラスの非対称ベンゾキサンテン化合物、このよ
うな染料を合成するための方法および中間体、このよう
な染料を分子標識として使用する試薬、およびこのよう
な染料および試薬を分析生物工学の領域で使用する方法
を包含する。本発明の化合物は、多色蛍光ＤＮＡ配列決
定およびフラグメント解析の領域で、特に用途が見出さ
れている。

【００８９】（Ｉ．非対称ベンゾキサンテン染料化合
物）第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一
般構造を有する新規なクラスの非対称ベンゾキサンテン
染料化合物を包含する。（本明細書中で提供した全ての
分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それ
らの全ての共鳴構造およびプロトン付加状態を含むこと
を意図している）。

【００９０】

【化２８】 式１ 式Ｉでは、Ｙ_１およびＹ_２は、独立して、ヒドロキシ
ル、酸素、アミンまたはイミニウムである。Ｙ_１がヒド
ロキシルであり、そしてＹ_２が酸素のとき、この化合物
は、フルオレセインに類似しており、これに対して、Ｙ
_１がアミンであり、そしてＹ_２がイミニウムのとき、こ
の化合物は、ローダミンに類似している。好ましくは、
Ｙ_１は、ヒドロキシルであり、そしてＹ_２は、酸素であ
る。

【００９１】Ｒ_１〜Ｒ_９部分は、この分子の基底状態お
よび励起状態の電子構造を変えることにより、この染料
の種々の特性を調節するのに使用される置換基である。
特に、Ｒ_１〜Ｒ_９部分を変えることは、この化合物のス
ペクトル特性、化学的安定性および光安定性に影響を与
える。置換基Ｒ_１〜Ｒ_３およびＲ_９は、式Ｉの化合物の
特性を規定する際に、特に重要である。例えば、Ｒ_１〜
Ｒ_３位の１つにフッ素原子を配置すると、化学的安定性
および光安定性が高まること、およびＲ_９が置換フェニ
ルなら、置換基Ｘ_２およびＸ_５を塩素にすることによ
り、より狭い発光バンドが生じることが観察されてい
る。（置換基Ｘ_２およびＸ_５の定義については、以下を
参照）。

【００９２】好ましくは、置換基Ｒ_１〜Ｒ_８は、水素、
フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アル
キン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、
アミド、ニトリル、アリール、低級アルコキシ、連結
基、またはそれらの組合せであり、本明細書中で使用す
る「連結基」との用語は、試薬に結合した「相補官能
性」と反応できる官能性を意味し、このような反応は、
この染料をこの試薬に連結する「結合」を形成する。本
開示の次の節では、特定の連結基、相補官能性および結
合について、さらに詳しく述べる。好ましくは、Ｒ
_１は、低級アルコキシ、塩素、フッ素または水素であ
る；Ｒ_２は、低級アルキル、フッ素または塩素である；
そしてＲ_３は、低級アルキルまたはフッ素である。より
好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３の１個は、フッ素で
ある。特に好ましい実施形態では、少なくともＲ_３は、
フッ素である。

【００９３】本明細書中で使用する「低級アルキル」と
の用語は、１個〜８個の炭素原子を含有する直鎖および
分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓ
ｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルな
ど）を表わす。「低級置換アルキル」とは、電子吸引性
置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホなど）
を含む低級アルキルを表わす。「低級ハロアルキル」と
は、１個またはそれ以上のハロゲン原子置換基（通常、
フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）を有する低級
置換アルキルを表わす。「低級アルケン」とは、１個〜
８個の炭素原子を含有する炭化水素であって、ここで、
その炭素−炭素結合の１個またはそれ以上が二重結合で
あり、ここで、その非二重結合炭素が、低級アルキルま
たは低級置換アルキルを包含するものを表わす。「低級
アルキン」とは、１個〜８個の炭素原子を含有する炭化
水素であって、ここで、１個またはそれ以上の炭素が三
重結合で結合しており、ここで、その非三重結合炭素
が、低級アルキルまたは低級置換アルキルを包含するも
のを表わす。「スルホネート」とは、３個の酸素原子に
結合したイオウ原子を含有する部分を意味し、これに
は、それらのモノ塩およびジ塩が含まれる（例えば、ス
ルホン酸ナトリウム、スルホン酸カリウム、スルホン酸
二ナトリウムなど）。「アミノ」とは、２個の水素原
子、低級アルキル部分またはそれらの任意の組合せに結
合した窒素原子を含有する部分を意味する。「アミド」
とは、酸素原子に二重結合しアミノ部分に単結合した炭
素原子を含有する部分を意味する。「ニトリル」とは、
窒素原子に三重結合した炭素原子を含有する部分を意味
する。「低級アルコキシ」とは、酸素原子に単結合した
低級アルキルを含有する部分を意味する。「アリール」
とは、単一または複数のフェニルまたは置換フェニル
（例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフ
ェニルなど）を意味する。

【００９４】好ましくは、Ｒ_９は、アセチレン、低級ア
ルキル、低級アルケン、シアノ、フェニルまたは置換フ
ェニル、複素環式芳香族、またはそれらの組合せであ
り、この置換フェニルは、以下の構造を有する：

【００９５】

【化２９】 ここで、Ｘ_１〜Ｘ_５は、別個に、水素、塩素、フッ素、
低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ
または連結基である。本明細書中で使用する「複素環式
芳香族」との用語は、その環式構造の一部としてヘテロ
原子を有する芳香族部分（例えば、ピロール、フラン、
インドールなど）を意味する。好ましくは、Ｘ_１は、カ
ルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ_２ＯＨである；Ｘ_２
およびＸ_５は、別個に、水素、塩素、フッ素または低級
アルキルである；そしてＸ_３およびＸ_４は、別個に、水
素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホ
ン酸または連結基である。より好ましくは、Ｘ_２および
Ｘ_５は、塩素である。さらに別の好ましい実施形態で
は、Ｘ_３またはＸ_４の１個は、連結基である。好ましく
は、Ｘ_１は、カルボン酸である。本発明の染料化合物を
含むホスホロアミダイト化合物を形成するのに特に適切
なさらに別の好ましい実施形態では、Ｘ_１またはＸ_５の
１個は、環状エステルまたは環状エーテルを形成できる
部分（例えば、カルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ_２
ＯＨ）、またはスピロ環系（すなわち、両方の環に共通
の１個の炭素原子を有する二環式化合物、例えば、スピ
ロ［４，５］デカン）を形成するいずれかの他の基であ
る。

【００９６】好ましくは、本発明の連結基は、その相補
官能性がアミンであるときは、イソチオシアネート、ス
ルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルア
ミン、スクシンイミジルエステル、または他の活性カル
ボキシレートである。好ましくは、この連結基は、その
相補官能性がスルフヒドリルであるときは、マレイミ
ド、ハロアセチルまたはヨードアセトアミドである。
Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｉ
ｎｃ．（１９９２）を参照せよ。特に好ましい実施形態
では、この連結基は、アミン相補官能性と反応する活性
化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル
であり、ここで、この活性化ＮＨＳエステルを形成する
には、カルボキシレート連結基を含む本発明の染料は、
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドと反応させて、ＮＨＳエステルを形成す
る。図３を参照せよ。

【００９７】本発明の非対称ベンゾキサンテン染料化合
物を合成するには、いくつかの可能な一般化した方法が
使用でき、その４つは、図１１を参照して、本明細書中
で記述する。図１１で経路Ａとして表わされる第一の好
ましい方法では、化合物２７は、酸触媒および熱の存在
下にて、１，３−ジヒドロキシまたは１，３−アミノヒ
ドロキシベンゼン誘導体２８および１，３−ジヒドロキ
シまたは１，３−アミノヒドロキシナフタレン誘導体２
９と、それぞれ同じ当量を使用して反応させ、非対称染
料化合物３０が得られる。好ましくは、化合物２７は、
環状または直鎖無水物（例えば、ＬＶＧは、ＯＣＯＲ_９
である）；エステル（例えば、ＬＶＧは、ＯＲであり、
ここで、Ｒは、低級アルキル、フェニルまたはスルホネ
ートである）；または酸塩化物（例えば、ＬＶＧは、塩
素または他のハロゲンである）である。

【００９８】図１１で経路Ｂとして表わされる別の好ま
しい合成方法では、化合物２７は、２当量の１，３−ジ
ヒドロキシベンゼン誘導体（すなわち、Ｙ_１は、ヒドロ
キシである）または１，３−アミノヒドロキシベンゼン
誘導体（すなわち、Ｙ_１は、アミノである）２８と反応
させて、対称キサンテン染料３１が得られる。化合物３
１は、次いで、塩基加水分解により分解されて、中間体
ベンゾイル縮合生成物３２が形成される。縮合生成物３
２は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて、化合物２
９と反応させて、非対称染料３０が得られ、ここで、２
９は、Ｙ_２がヒドロキシのとき、１，３−ジヒドロキシ
ナフタレンであり、またはＹ_２がアミノのとき、１，３
−アミノヒドロキシナフタレンである。

【００９９】さらに、図１１の経路Ｃとして表わされる
第三の一般化した合成方法では、化合物２７は、熱と共
に、１当量の２８と反応させ、中間体ベンゾイル縮合生
成物３２が得られる。化合物３２は、次いで、酸触媒お
よび熱の存在下にて、２９と反応させ、非対称染料３０
が得られる。

【０１００】図１１で経路Ｄとして表わされる第四の一
般化した方法では、酸触媒および熱の存在下にて、同じ
当量の化合物３３、化合物２８および化合物２９を反応
させ、非対称キサントン中間体３４が得られる。好まし
くは、３３は、カーボネート（例えば、ＬＶＧは、ＯＲ
であり、ここで、Ｒは、好ましくは、低級アルキルまた
はフェニルである）；またはホルメート（例えば、ＬＶ
Ｇは、ハロゲンおよびＯＲであり、ここで、Ｒは、好ま
しくは、低級アルキルまたはフェニルである）である。
化合物３４は、次いで、アニオン性有機金属Ｒ_９誘導体
（例えば、Ｒ_９Ｌｉ、Ｒ_９ＭｇＸであり、ここで、Ｘ
は、ハライド（例えば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）などである）
と反応させ、非対称染料３０が得られる。

【０１０１】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の特に好まし
い非対称染料化合物の一組の合成を示す。この合成で
は、１，３−ジヒドロキシナフタレン誘導体（例えば、
１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ｂ）または２−フ
ルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ））
は、１当量の無水フタル酸誘導体（例えば、無水３，６
−ジクロロトリメリト酸（１０ａ））および１当量のレ
ゾルシノール誘導体（１１ａ、１１ｂ、１１ｃまたは１
１ｄ）と反応させ、そしてアルゴン下にて、正味の有機
酸（例えば、ＭｅＳＯ_３Ｈ）中で１６時間加熱される。
この粗染料は、次いで、氷／水混合物への添加により沈
殿され、そして濾過により単離される。この粗染料は、
次いで、分取薄層クロマトグラフィーにより、異性体１
および２にさらに精製される。

【０１０２】この非対称ベンゾキサンテン染料の非置換
誘導体（Ｒ_２および／またはＲ_３は、Ｈである）は、ハ
ロゲン化試薬（例えば、市販の陽性フッ素（ｐｏｓｉｔ
ｉｖｅ ｆｌｕｏｒｉｎｅ）源、ＮａＯＣｌ、ＮａＯＨ
／Ｂｒ_２、ＮａＯＨ／Ｉ_２）とさらに反応させて、１０
％ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃでの抽出仕上げ、Ｎａ_２ＳＯ _４
での乾燥、濾過および真空中での濃縮後に、定量的にハ
ロゲン化した誘導体（例えば、Ｒ_２＝Ｒ_３＝Ｃｌ、Ｂ
ｒ、ＩまたはＦである）を生成し得る。図２Ｂ中の挿入
図を参照のこと。

【０１０３】（ＩＩ．置換ナフタレン中間体）第二の局
面では、本発明は、主題発明の非対称ベンゾキサンテン
化合物の合成に有用な新規な中間体化合物を包含し、こ
のような中間体は、すぐ下の式ＩＩに示す一般構造を有
する。特に、本発明の中間体化合物は、２−置換非対称
ベンゾキサンテン化合物の２位にて、置換基（例えば、
ハロゲン原子）の位置選択的含入を伴う非対称ベンゾキ
サンテン化合物の合成を可能にし、この場合、この２位
は、式Ｉおよび式ＩＩの化合物では、Ｒ_３位置に対応す
る。

【０１０４】

【化３０】 式ＩＩ 式ＩＩの構造において、置換基Ｒ_３〜Ｒ_７は、上記式Ｉ
の構造において、同じ番号を付けた置換基に対応し、そ
してＹ_２は、ヒドロキシルまたはアミンである。好まし
くは、Ｒ_３は、フッ素であり、そしてＹ_２は、ヒドロキ
シルである。

【０１０５】図１２は、本発明の置換ナフタレン中間体
の合成について、３つの別の一般化した合成スキームを
示す。図１２で経路Ａとして示す第一の方法では、置換
エステルエノレート誘導体３５は、例えば、ＣＯ_２の自
発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、活性
化ホモフタル酸エステル誘導体３６と反応させて、β−
ケトエステル誘導体３７が得られる。好ましくは、化合
物３５では、Ｒ’は、水素、カルボキシレートまたはハ
ロゲンであり、そしてＲは、低級アルキルである。好ま
しくは、化合物３６では、ＬＶＧは、ハロゲン、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド、フェノキシド、ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールまたはカルボキシレートである。化合
物３７は、次いで、塩基触媒および熱の存在下にて環化
されて、置換１，３−ナフタレンジオール３８（すなわ
ち、Ｙ_２は、ＯＨである）が得られる。

【０１０６】図１２にて経路Ｂとして示す第二の好まし
い合成方法では、化合物３５は、例えば、ＣＯ_２の自発
損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、活性化
フェニルアセテート誘導体３９（ここで、ＬＶＧは、経
路Ａにおいて、化合物３６について上で記述のものと同
じである）と反応させて、β−ケトエステル誘導体４０
が得られる。化合物４０は、次いで、酸触媒および熱の
存在下にて環化されて、置換１，３−ナフタレンジオー
ル３８（すなわち、Ｙ_２は、ＯＨである）が得られる。

【０１０７】経路Ｃとして示す第三の好ましい合成方法
では、化合物３５は、例えば、ＣＯ _２の自発損失により
（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、シアノフェニルア
セテート誘導体４１（ここで、ＬＶＧは、経路Ａにおい
て、化合物３６について上で記述のものと同じである）
と反応させて、β−ケトエステル誘導体４２が得られ
る。化合物４２は、次いで、塩基触媒および熱の存在下
にて環化されて、置換１−アミノ−３−ヒドロキシナフ
タレン３８（すなわち、Ｙ_２は、ＮＨ_２である）が得ら
れる。

【０１０８】（ＩＩＩ．染料化合物を使用する試薬）他
の局面では、本発明は、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン
染料化合物で標識した試薬を包含する。本発明の試薬
は、事実上、本発明の染料が結合できるいずれのもので
もよい。好ましくは、この染料は、この試薬に共有結合
される。試薬には、タンパク質、ポリペプチド、多糖
類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、
脂質、固体支持体、有機および無機重合体、およびそれ
らの組合せおよび集合（例えば、染色体、核、生存細胞
（例えば、細菌、他の微生物、哺乳類細胞、組織）な
ど）が挙げられる。

【０１０９】（Ａ．ヌクレオチド試薬）本発明の好まし
い種類の試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料
を含有するヌクレオチドおよびヌクレオシドを包含す
る。このようなヌクレオシド試薬は、酵素合成により形
成した標識ポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ増幅、サ
ンガー型ポリヌクレオチド配列決定およびニック翻訳反
応の文脈で使用されるヌクレオチド三リン酸）の文脈
で、特に有用である。

【０１１０】本明細書中で使用する「ヌクレオシド」と
は、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮ
Ａ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａ
ｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２）に記述の
ように、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシル
形態を含めて、その１’位でペントースに結合したプリ
ン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基
（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、
チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）から
なる化合物を意味する。本明細書中で使用する「ヌクレ
オチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル
（例えば、三リン酸エステル）を意味し、ここで、最も
一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位に結
合した水酸基である。ヌクレオシドに関する「アナロ
グ」には、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８０）により一般的に記述のように、変
性塩基部位および／または変性糖部位を有する合成ヌク
レオシドが挙げられる。「標識ヌクレオシド」との用語
は、結合を介して式Ｉの染料化合物に共有結合したヌク
レオシドを意味する。

【０１１１】本発明の好ましいヌクレオチドは、式ＩＩ
Ｉで以下に示されており、ここで、Ｂは、ヌクレオチド
塩基（例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニンお
よびデアザグアノシン）である。

【０１１２】

【化３１】 式ＩＩＩ Ｗ_１およびＷ_２は、別個に、ＨまたはＯＨである。Ｗ_３
は、ＯＨ、

【０１１３】

【化３２】 であり、これには、もし存在するなら、会合対イオン
（例えば、Ｈ、Ｎａ、ＮＨ _４など）が含まれる。Ｄは、
式Ｉの染料化合物である。特に好ましい１実施形態で
は、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＩＩ．１に示
した構造を有するジデオキシヌクレオチド三リン酸であ
る（もし存在するなら、会合対イオンを含めて）。

【０１１４】

【化３３】 式ＩＩＩ．１ 式ＩＩＩ．１に示したもののような標識ジデオキシヌク
レオチドは、サンガー型ＤＮＡ配列決定法において、鎖
停止剤として、特定の用途が見出されている。第二の特
に好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチドは、以
下の式ＩＩＩ．２に示した構造を有するデオキシヌクレ
オチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオ
ンを含めて）。

【０１１５】

【化３４】 式ＩＩＩ．２ 式ＩＩＩ．２に示したもののような標識デオキシヌクレ
オチドは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応において、ポリ
メラーゼ伸長産物を標識する手段として、特定の用途が
見出されている。

【０１１６】Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのと
き、その糖部分は、プリンまたはデアザプリンのＮ^９−
位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部
分は、ピリミジンのＮ^１−位にて結合している。

【０１１７】ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ_１〜
Ｒ_９位の１つで、Ｄに結合している。好ましくは、この
結合は、Ｒ_１〜Ｒ_３では結合していない。本発明の染料
が、無水トリメリト酸から合成されるなら、Ｒ_９は、好
ましくは、置換フェニルであり、この結合は、この置換
フェニルのＸ_３またはＸ_４位の１つで、この染料に結合
しており、他の位置は、水素原子である。

【０１１８】Ｂがプリンのとき、ＢおよびＤを結合して
いる結合は、プリンの８−位に結合しており、Ｂが７−
デアザプリンのとき、結合は、７−デアザプリンの７−
位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、結合は、ピ
リミジンの５−位にて結合している。

【０１１９】ヌクレオシド標識化は、公知の結合、連結
基および関連する相補官能性を用いて、非常に多くの公
知のヌクレオシド標識化技術のいずれかを使用して、達
成できる。この染料およびヌクレオシドを結合する結合
は、（ｉ）オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定で
あり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼ
ーションを妨害せず、（ｉｉｉ）適切な酵素（例えば、
ポリメラーゼ、リガーゼなど）と相溶性であり、そして
（ｉｖ）この染料の蛍光を消失させてはならない。

【０１２０】好ましくは、この染料は、ピリミジン塩基
の５−炭素および７−デアザプリン塩基の７−炭素に共
有結合される。本発明で使用できる数個の適当な塩基標
識化操作が報告されている（例えば、

【０１２１】

【表１】 従って、これらの参考文献の内容は、本明細書中で参考
として援用されている。

【０１２２】好ましくは、この結合は、アセチレン性ア
ミド結合またはアルケン性アミド結合であり、この染料
とヌクレオチド塩基との間の結合は、この染料の活性化
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと、
ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルケニルアミ
ノ誘導体化塩基とを反応させることにより、形成され
る。より好ましくは、得られた結合は、３−（カルボキ
シ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノ−１−プ
ロピン−１−イルである（式ＩＩＩ．３）。本発明の染
料をヌクレオシド塩基に結合するための数個の好ましい
結合は、式ＩＩＩ．３、式ＩＩＩ．４および式ＩＩＩ．
５にて、以下に示す。

【０１２３】

【化３５】 アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、Ｈｏ
ｂｂｓら、ヨーロッパ特許出願第８７３０５８４４．０
号およびＨｏｂｂｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５
４：３４２０（１９８９）に教示され、その内容は、本
明細書中で参考として援用されている。要約すると、こ
のアルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適当なハ
ロジデオキシヌクレオシド（通常、Ｈｏｂｂｓら（前
出）により教示されるように、５−ヨードピリミジンお
よび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオ
シド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、アルゴンを
フラッシュして空気を取り除き、無水ＤＭＦを添加し、
続いて、アルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰ
ｄ（０）を添加することにより、形成される。この反応
混合物は、数時間、または薄層クロマトグラフィーがハ
ロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌し得
る。未保護のアルキニルアミンを使用するとき、このア
ルキニルアミノヌクレオシドは、この反応混合物を濃縮
し、そして水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用
いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、カッ
プリング反応で生成したヒドロハライドを中和すること
により、単離できる。保護アルキニルアミンを使用する
とき、この反応混合物には、メタノール／塩化メチレン
を添加し得、続いて、重炭酸塩形態の強塩基性アニオン
交換樹脂を添加し得る。次いで、このスラリーは、約４
５分間撹拌し得、濾過し得、樹脂は、追加のメタノール
／塩化メチレンで洗浄し得る。合わせた濾液は濃縮し
得、そしてメタノール−塩化メチレン勾配を用いたシリ
カゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し
得る。トリホスフェートは、標準的な方法により得られ
る。

【０１２４】（Ｂ．ホスホロアミダイト試薬）他の好ま
しい種類の試薬には、本発明の非対称ベンゾキサンテン
染料を含有するホスホロアミダイト化合物が包含され
る。このようなホスホロアミダイト試薬は、本発明の非
対称ベンゾキサンテン染料で標識したポリヌクレオチド
の自動化化学合成に、特に有用である。このようなホス
ホロアミダイト化合物は、ヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドの５’−水酸基と反応させたとき、亜リン酸エ
ステルリンカーを形成し、これは、次に、酸化されて、
リン酸エステルリンカーが得られる（例えば、米国特許
第４，４５８，０６６号および第４，４１５，７３２
号；両特許は、本明細書中で参考として援用されてい
る）。

【０１２５】（１．非ヌクレオチドホスホロアミダイト
試薬）：一般に、１局面では、本発明のホスホロアミダ
イト試薬は、すぐ下の式ＩＶの構造を有する：

【０１２６】

【化３６】 式ＩＶ ここで、Ｘは、スペーサーアームである；Ｄは、式Ｉの
非対称ベンゾキサンテン染料またはそれらの保護誘導体
である；Ｙは、この染料上の連結基を用いて形成した結
合である；Ｂ_１は、亜リン酸エステル保護基であり、そ
してＢ_２およびＢ _３は、別個に、低級アルキル、低級ア
ルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリー
ル、アラルキル、または１０個までの炭素原子を含有す
るシクロアルキルである。式ＩＶで示した非ヌクレオチ
ドホスホロアミダイトは、ヌクレオチドの糖部分を介し
て、化学的に合成したポリヌクレオチドの５’−末端を
標識するのに、特によく適合する。

【０１２７】スペーサーＸおよび結合Ｙは、種々の形態
をとり得るが、しかしながら、構造Ｘ−Ｙは、（ｉ）Ｄ
ＮＡ合成条件に対して安定であり、（ｉｉ）オリゴヌク
レオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せず、そし
て（ｉｉｉ）それが結合する染料の蛍光を消失させては
ならない（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号、
第５，２５８，５３８号、および第４，７５７，１４１
号、第５，２１２，３０４号；全ての特許は、本明細書
中で参考として援用されている）。

【０１２８】好ましくは、Ｘは、線状または環状の低級
アルキル、線状または環状の置換低級アルキル、ポリエ
チレンオキシド、１個と８個の間の炭素原子を有する低
級アリール、ペプチド、またはポリエーテルである。好
ましくは、結合Ｙは、アミド、スルホンアミド、尿素、
ウレタンまたはチオ尿素である。特に好ましい実施形態
では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸ
は、式ＩＶ．１の以下の構造を有する線状アルキルであ
る：

【０１２９】

【化３７】 式ＩＶ．１ ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より
好ましくは、２〜６である。第二の特に好ましい実施形
態では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸ
は、式ＩＶ．２で以下に示す構造を有する線状ポリエチ
レンオキシドである：

【０１３０】

【化３８】 式ＩＶ．２ ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より
好ましくは、２〜６である。

【０１３１】好ましくは、Ｂ_２およびＢ_３は、一緒にな
って、その主鎖に５個までの炭素原子および全体で１０
個までの炭素原子を含有するアルキル鎖を形成し、この
鎖の両方の末端原子価結合は、窒素原子に結合されてい
る。他方、Ｂ_２およびＢ_３は、窒素原子と一緒になっ
て、飽和窒素複素環を形成し、これは、窒素、酸素およ
びイオウからなる群から選択した１個またはそれ以上の
ヘテロ原子を含有する。好ましくは、Ｂ_２およびＢ
_３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル
またはｓｅｃ−ブチルであり、そしてＢ_２およびＢ
_３は、一緒になって、モルホリノである。

【０１３２】Ｂ_１は、ホスホロアミダイトが結合したポ
リヌクレオチドの不要な伸長を防止する亜リン酸エステ
ル保護基である。Ｂ_１は、ポリヌクレオチド合成条件に
対して安定であるが、このポリヌクレオチドまたは染料
の完全性に悪影響を及ぼさない試薬を用いて、このポリ
ヌクレオチド生成物から除去できる。好ましくは、Ｂ _１
は、メチル、β−シアノエチルまたは４−ニトロフェニ
ルエチルである。Ｂ_２およびＢ_３は、別個に、イソプロ
ピル、ｔ−ブチル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルで
あり、そしてＢ_２およびＢ_３は、一緒になって、モルホ
リノである。

【０１３３】ＹおよびＤを結合する結合は、Ｒ_１〜Ｒ_９
位の１つで、Ｄに結合している。好ましくは、この結合
は、Ｒ_１〜Ｒ_３では結合していない。本発明の染料が、
無水トリメリト酸から合成されるとき、Ｒ_９は、好まし
くは、置換フェニルであり、そして結合は、この置換フ
ェニルのＸ_３またはＸ_４位の１つで、この染料に結合し
ている。

【０１３４】このようなホスホロアミダイト化合物は、
公知の方法により合成できる。一般に、合成は、以下の
ように進行する。この染料のフェノール性ヒドロキシル
は、ＤＮＡ合成脱保護剤（例えば、アンモニア、エタノ
ールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合
物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：
２：１）混合物）で除去できる染料保護基で保護される
（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号を参照せ
よ；その内容は、本明細書中で参考として援用されてい
る）。そのように保護した染料は、この染料の「保護誘
導体」と呼ばれる。好ましい保護基には、安息香酸また
はピバル酸のエステルが挙げられる。この保護染料の連
結基（例えば、カルボン酸）は、次いで、例えば、カル
ボジイミドで活性化され、そしてＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）または他の非プロトン性溶媒中に
て、アルコールリンカー誘導体（例えば、アミノアルコ
ール（例えば、エタノールアミン、ヘキサノールアミン
など））と反応させて、遊離アルコール官能性（例え
ば、アルコール−アミド誘導体）を有する保護染料が生
じる。この遊離アルコールは、次いで、触媒量のテトラ
ゾールジイソプロピルアミンを含有するアセトニトリル
中にて、標準操作を用いて、ホスフィチル化剤（例え
ば、ジ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホ
スフィン）と反応させて、ホスホロアミダイトが生じる
（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号）。

【０１３５】（２．ヌクレオチドホスホルアミダイト試
薬）：一般に、第二の局面では、本発明のホスホルアミ
ダイト剤は、すぐ下の式Ｖの構造を有する：

【０１３６】

【化３９】 式Ｖ ここで、Ｂ_１〜Ｂ_３は、上で記述のものと同じである。
Ｂ_５は、水素またはヒドロキシル保護基であり、Ｂは、
ヌクレオチド塩基であり、そしてＤは、式Ｉの非対称ベ
ンゾキサンテン染料またはそれらの保護誘導体である。
式Ｖのようなヌクレオチドホスホルアミダイトは、化学
的に合成したポリヌクレオチドの内部標識化に特によく
適合する。

【０１３７】Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのと
き、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ
^９−位にて結合している。他方、Ｂがピリミジンのと
き、その糖部分は、このピリミジンのＮ^１−位にて結合
している。ＢおよびＤは、連結基およびその相補官能性
の反応により形成した結合により結合されており、染料
とヌクレオチド塩基との間のこのような結合は、上で詳
細に記述されている。Ｂがプリンなら、その結合は、こ
のプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリ
ンなら、その結合は、この７−デアザプリンの７−位に
結合している。Ｂがピリミジンなら、その結合は、この
ピリミジンの５−位にて結合している。

【０１３８】Ｂ_５は、一般に、水素または酸切断可能な
ヒドロキシル保護基を表わす。好ましくは、Ｂ_５は、ト
リフェニルメチルラジカルおよびその電子供与性置換し
た誘導体であり、この場合、本明細書中で使用する「電
子供与性」との用語は、それが一部をなす分子内におい
て、近接原子に原子価電子を放出するという置換基の傾
向を表わし、すなわち、それは、近接原子に関して、電
子的に正である。好ましくは、電子供与性置換基には、
アミノ、低級アルキル、１個と８個の間の炭素原子を有
する低級アリール、低級アルコキシなどが挙げられる。
さらに好ましくは、この電子供与性置換基は、メトキシ
である。代表的なトリチルには、４，４’−ジメトキシ
トリチル、すなわち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメ
チル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニル
メチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチルなどが挙
げられる。これらのトリチルおよび他のトリチルの結合
条件および切断条件は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａ
ｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（ＪｏｈｎＷｉｌ
ｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）に見出される。

【０１３９】一般に、本発明のヌクレオチドホスホルア
ミダイトは、以下のようにして合成できる。その５’−
ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基およびその塩基上
に保護相補的官能性を有するヌクレオシドは、この相補
的官能性だけを暴露するように、選択的に脱保護され
る。次に、（上記のようにして）保護した染料は、連結
基をその反応形状に転化することにより、活性化され
る。この染料の活性化連結基は、次いで、このヌクレオ
シドの相補的官能性と反応されて、この染料の５’−ヒ
ドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロ
キシル上）およびフェノール基上に保護基を有する染料
標識ヌクレオシドが形成される。この染料標識ヌクレオ
シドは、次いで、上記のホスフィチル化剤と反応され
て、このヌクレオチドホスホルアミダイトが生成され
る。

【０１４０】その相補的官能性がアミンでありかつ連結
基がカルボキシルである好ましい方法では、この合成
は、以下のようにして進行する。その５’−ヒドロキシ
ル上にヒドロキシル保護基（例えば、トリチル基）を有
し、その塩基上に保護アミノ−窒素相補的官能性を有す
る保護ヌクレオシドは、そのアミンを暴露するように選
択的に脱保護され、このような選択的脱保護は、その保
護５’−ヒドロキシル部分を脱保護することなく、その
アミノ官能性のみを脱保護するように供される。（上記
のように）保護した染料は、カルボキシ連結基を、ジシ
クロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスク
シンイミドを用いて、そのＮＨＳエステルに転化するこ
とにより、活性化される。このＮＨＳエステルは、この
ヌクレオシドのアミノ基と反応されて、この染料の５’
−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒ
ドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する
染料標識ヌクレオシドが形成される。次いで、この染料
標識ヌクレオシドは、上記のホスフィチル化剤と反応さ
れる。

【０１４１】（Ｃ．ポリヌクレオチド試薬）本発明のさ
らに他の好ましい種類の試薬には、本発明の非対称ベン
ゾキサンテン染料で標識したポリヌクレオチドが包含さ
れる。このような標識ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列
決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションプローブなどを含めた非常に
多くの状況で、有用である。

【０１４２】本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオ
チド」または「オリゴヌクレオチド」は、天然または変
性ヌクレオシドモノマーの線状ポリマーを意味し、これ
には、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオシ
ド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形状など
が含まれる。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホス
ホジエステル結合により連結されており、本明細書中で
使用する用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエ
ステル結合またはそれらのアナログを意味し、これに
は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロ
アニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホロア
ミデートなどが含まれ、これは、会合した対イオンが存
在するなら、このような対イオン（Ｈ、ＮＨ_４、Ｎａな
ど）を含む。このポリヌクレオチドの大きさは、数個
（例えば、８個〜４０個）のモノマー単位から、数千個
のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ＡＴ
ＧＣＣＴＧ」のような一連の文字で表わされるときは、
常に、このヌクレオチドは、他に指示がなければ、５’
→３’の順序で左から右に配列されており、「Ａ」は、
デオキシアデノシンを表わし、「Ｃ」は、デオキシシチ
ジンを表わし、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表わ
し、そして「Ｔ」は、チミジンを表わすことが分かる。

【０１４３】本発明の標識ポリヌクレオチドには、次式
を有するヌクレオチドが挙げられる：

【０１４４】

【化４０】 式ＶＩ ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミ
ジンヌクレオチド塩基である。Ｚ_１は、ＨまたはＯＨで
ある。Ｚ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ_４およびＮｕｃであ
り、ここで、Ｎｕｃは、ヌクレオシドまたはポリヌクレ
オチドを意味する。式ＶＩのヌクレオシドおよびＮｕｃ
は、ホスホジエステル結合により連結され、この結合
は、Ｎｕｃの５’−位に結合している。Ｚ_３は、Ｈ、Ｈ
ＰＯ_３またはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃおよびこの
ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結され
ており、この結合は、Ｎｕｃの３’−位に結合してい
る。そしてＤは、式Ｉの染料化合物である。塩基Ｂは、
本発明のヌクレオチドホスホルアミダイト試薬について
記述のようにして、この糖部分および染料化合物に結合
される。ここで定義されるように、式ＶＩの標識ヌクレ
オチドは、５’−末端ヌクレオチド、３’−末端ヌクレ
オチド、またはポリヌクレオチドのいずれかの内部ヌク
レオチドであり得る。

【０１４５】好ましい１実施形態では、本発明の標識ポ
リヌクレオチドには、供与体染料と受容体染料との間
で、蛍光エネルギーの移動が起こるように配置した複数
の染料が挙げられる。このような複数染料ポリヌクレオ
チドは、分光調整可能な配列決定プライマーとして（例
えば、Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９２：４３４７〜４３５１（１９９５））
およびハイブリダイゼーションプローブとして（例え
ば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、２１：３７６１〜３７６６（１９９３））、
用途が見出されている。

【０１４６】標識ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ
ポリメラーゼまたはリガーゼを用いて、酵素的に合成す
るか（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２４、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８１））または例えば、
ホスホルアミダイト法、亜リン酸トリエステル法などに
よる化学合成によるか（例えば、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９９０））いずれかにより、合成できる。
標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使
用して、酵素合成中に導入してもよく、または上記の標
識非ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホルアミダイ
トを用いて、化学合成中に導入してもよく、または合成
に引き続いて導入してもよい。

【０１４７】一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵
素合成により製造されるなら、以下の操作が使用でき
る。テンプレートＤＮＡが変性され、このテンプレート
ＤＮＡに、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールさ
れる。この反応系に、デオキシヌクレオチド三リン酸
（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含め
て）が添加され、この場合、このデオキシヌクレオチド
の１個の少なくとも断片は、上記の本発明の染料化合物
で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条
件下にて、ポリメラーゼ酵素は活性である。ポリメラー
ゼ鎖合成中に、この標識デオキシヌクレオチドの混入に
より、標識ポリヌクレオチドが形成される。別の酵素的
合成法では、１個のプライマーの代わりに２個のプライ
マーが使用され、１個のプライマーは、この標的の＋
（プラス）鎖に相補的であり、他は、この標的の−（マ
イナス）鎖に相補的であり、このポリメラーゼは、熱安
定性ポリメラーゼであり、その反応温度は、変性温度と
延長温度の間で反復され、それにより、ＰＣＲによっ
て、標識成分が標的配列へと急激に合成される（例え
ば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））。

【０１４８】標識ポリヌクレオチドは、ホスホルアミダ
イト法を用いて、化学的に合成できる。このホスホルア
ミダイト法によりポリヌクレオチドを形成するのに使用
される化学の詳細な説明は、例えば、

【０１４９】

【表２】 に提供されている。従って、これらの参考文献の各内容
は、本明細書中で参考として援用されている。

【０１５０】ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイ
ト法は、その効率および急速なカップリングおよび出発
物質の安定性のために、好ましい方法である。この合成
は、固体支持体に結合した成長ポリヌクレオチド鎖を用
いて行われ、その結果、過剰の試薬は、液相にあるの
で、濾過により容易に除去でき、それにより、サイクル
間の精製工程の必要性がなくなる。

【０１５１】以下は、このホスホルアミダイト法を用い
る、典型的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡
単に記述する。まず、保護ヌクレオチドモノマーを含め
た固体支持体は、酸（例えば、トリクロロ酢酸）で処理
されて、５’−ヒドロキシル保護基が除去され、このヒ
ドロキシルは、引き続くカップリング反応のために、遊
離される。次いで、この反応系に、保護ホスホルアミダ
イトヌクレオシドモノマーおよび弱酸（例えば、テトラ
ゾール）を同時に添加することにより、活性化中間体が
形成される。この弱酸は、このホスホルアミダイトの窒
素にプロトンを付加して、反応性中間体を形成する。ヌ
クレオシド付加は、３０秒以内に完結する。次に、ヌク
レオシド付加を受けなかったいずれかのポリヌクレオチ
ド鎖を停止するキャップ化工程が行なわれる。キャップ
化は、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾ
ールを用いて行われる。このインターヌクレオチド結合
は、次いで、好ましい酸化剤としてのヨウ化物および酸
素供与体としての水を用いる酸化により、この亜リン酸
エステルから、より安定なホスホジエステルに転化され
る。酸化後、このヒドロキシル保護基は、プロトン酸
（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）で除去
され、このサイクルは、鎖の延長が完結するまで、繰り
返される。合成後、このポリヌクレオチド鎖は、塩基
（例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミ
ン）を用いて、この支持体から切断される。この切断反
応はまた、いずれのリン酸エステル保護基（例えば、シ
アノエチル）も除去する。最後に、この塩基の環外アミ
ン上の保護基およびこの染料上のヒドロキシル保護基
は、塩基中にて、このポリヌクレオチド溶液を高温（例
えば、５５℃）で処理することにより、除去される。

【０１５２】このホスホルアミダイトヌクレオシドモノ
マーのいずれかは、上記の染料標識したホスホルアミダ
イトであり得る。このヌクレオチドの５’−末端位置が
標識されているなら、この最終縮合工程中に、本発明の
標識した非ヌクレオチドホスホルアミダイトを使用して
もよい。このオリゴヌクレオチドの内部位置が標識され
るなら、いずれかの縮合工程中に、本発明の標識ヌクレ
オチドホスホルアミダイトが使用できる。

【０１５３】合成に引き続いて、このポリヌクレオチド
は、非常に多くの位置で標識でき、これらの位置には、
５’−末端（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｃｈ
ａｐｔｅｒ ８、ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９９１）および
Ｏｒｇｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ １１（１８）：６５１３（１９８３）；米国
特許第５，１１８，８００号；これらの内容は、本明細
書中で参考として援用されている）；ホスホジエステル
骨格（例えば、同書、Ｃｈａｐｔｅｒ ９）；３’−末
端（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２５３−６２
５９、および米国特許第５，４０１，８３７号および第
５，１４１，８１３号；両方の特許の内容は、本明細書
中で参考として援用されている）が含まれる。オリゴヌ
クレオチド標識化操作の総説については、Ｒ．Ｈａｕｇ
ｌａｎｄ ｉｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｓｔｅｉｎｅｒ編、Ｐｌｅ
ｍｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８３）を参照のこと。

【０１５４】１つの好ましい合成後化学標識化法では、
オリゴヌクレオチドは、以下のようにして標識化され
る。カルボキシ連結基を含む染料は、無水酢酸エチル中
にて、室温で３時間にわたり、およそ１当量の１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびおよそ３当量の
ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによ
り、そのｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転化
される。この反応混合物は、５％ ＨＣｌで洗浄され、
硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、そして固形物
になるまで濃縮され、この固形物は、ＤＭＳＯに再懸濁
される。このＤＭＳＯ染料ストックは、次いで、過剰で
（１０〜２０倍）、ｐＨ ９．４にて、０．２５Ｍ重炭
酸塩／炭酸塩緩衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴ
ヌクレオチドに添加され、そして６時間反応される（例
えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。この染料標
識したオリゴヌクレオチドは、緩衝液（例えば、０．１
Ｍトリエチルアミン酢酸塩（ＴＥＡＡ））で溶出するサ
イズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、
未反応染料から分離される。この粗標識オリゴヌクレオ
チドを含有する画分は、勾配溶離液を使用する逆相ＨＰ
ＬＣにより、さらに精製される。 （ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）本
発明の染料および試薬は、蛍光検出を使用するいずれか
の方法（特に、複数の空間的に重複した分析物の同時検
出を必要とする方法）によく適合される。本発明の染料
および試薬は、生化学分離操作（例えば、電気泳動）を
受けるポリヌクレオチドの種類を同定するのに、特によ
く適合され、この場合、類似の物理化学的特性（例え
ば、サイズ、コンホメーション、電荷、疎水性など）を
有する標的物質のバンドまたはスポットが、線状または
平面状の配列において存在する。ここで使用する「バン
ド」との用語は、類似のまたは同一の物理化学的な特性
を基準にして、いずれかの空間的な配置または集塊を含
む。通常、バンドは、染料−ポリヌクレオチド複合体の
電気泳動による分離において、生じる。

【０１５５】ポリヌクレオチドの分類は、種々の状況に
おいて生じ得る。「フラグメント解析」法または「遺伝
解析」法と呼ぶ好ましいカテゴリーの方法では、標識プ
ライマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート定方
向酵素的合成（例えば、結合またはポリメラーゼ定方向
プライマー伸長による）により、標識ポリヌクレオチド
断片が生じる。これらの断片は、サイズ依存性分離プロ
セス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に
かけられる。分離した断片は、この分離に引き続いて、
例えば、レーザー誘発した蛍光により、検出される。特
に好ましい実施形態では、複数の種類のポリヌクレオチ
ドが同時に分離され、異なる種類のものは、分光学的に
分析可能な標識により、識別される。

【０１５６】このようなフラグメント解析の１方法は、
増幅断片長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として知られてい
るが、ＰＣＲにより増幅した増幅断片長の多型現象（す
なわち、制限断片長の多型現象）に基づいている。種々
のサイズのこれらの増幅断片は、系統による次の突然変
異遺伝子のための連結マーカーとして役立つ。増幅断片
が、染色体上の突然変異遺伝子に近づくほど、この結合
の相関が高くなる。多く遺伝的疾患に対する遺伝子は、
同定されていないので、これらの結合マーカーは、疾患
のリスクまたは起源を評価するのに役立つ。このＡｍｐ
ＦＬＰ方法では、このポリヌクレオチドは、標識ポリヌ
クレオチドＰＣＲプライマーを用いることにより、また
はＰＣＲ中の標識ヌクレオチド三リン酸を使用すること
により、標識できる。

【０１５７】ニック（ｎｉｃｋ）翻訳として知られてい
るような他のフラグメント解析では、二本鎖ＤＮＡ分子
内の未標識ヌクレオシド三リン酸を標識したものに置き
換えるために、反応が使用される。デオキシリボヌクレ
アーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）処理により生じる「ニッ
ク」によって、未標識ＤＮＡ内に、遊離の３’−水酸基
が作られる。ＤＮＡポリメラーゼＩは、次いで、このニ
ックの３’−ヒドロキシル末端への標識ヌクレオチドの
付加を触媒する。同時に、この酵素の５’−〜３’−エ
クソヌクレアーゼ活性は、このニックの５’−ホスホリ
ル末端からこのヌクレオチド単位を取り除く。最初に切
開したヌクレオチドの位置には、遊離の３’−ＯＨを有
する新しいヌクレオチドが取り込まれ、このニックは、
３’方向に沿って、１ヌクレオチド単位だけシフトす
る。この３’シフトの結果、既存の未標識ヌクレオチド
の除去を伴って、新しく標識したヌクレオチドのＤＮＡ
への連続付加が生じる。このニック翻訳したポリヌクレ
オチドは、次いで、分離プロセス（例えば、電気泳動）
を用いて分析される。

【０１５８】他の代表的なフラグメント解析法は、可変
数のタンデム繰り返し、すなわち、ＶＮＴＲを基準にし
ている。ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接した複数コピー
を含有する二本鎖ＤＮＡの領域であり、繰り返し単位の
数は、可変である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例には、ｐＹＮ
Ｚ２２、ｐＭＣＴ１１８およびＡｐｏ Ｂがある。ＶＮ
ＴＲ法のサブセットには、微小サテライト繰り返しまた
は短タンデム繰り返し（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２
個〜４個の塩基）繰り返し配列により特徴付けられるＤ
ＮＡのタンデム繰り返しの検出を基準にしている。ヒト
にて最も豊富に点在した繰り返しＤＮＡファミリーの１
つには、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレ
オチド繰り返しファミリー（これはまた、（ＣＡ）ｎジ
ヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）であ
る。ヒトのゲノムには、５０，０００個〜１００，００
０個程度の（ＣＡ）ｎ繰り返し領域があると考えられ、
典型的には、１ブロックあたり、１５個〜３０個の繰り
返しを有する。これらの繰り返し領域の多くは、長さが
多様であり、従って、有用な遺伝子マーカーとして供さ
れ得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法では、
染料標識ＰＣＲプライマーを用いることにより、ポリヌ
クレオチド断片に標識が導入される。

【０１５９】特に好ましいフラグメント解析法では、本
発明に従って確認した種類のものは、４個の可能な末端
塩基と分光学的に分析可能な染料のセットのメンバーと
の間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチドに
よって規定される。このようなセットは、市販の分光光
度計を用いて、発光および吸収バンド幅を測定すること
により、本発明の染料から容易に組み立てられる。さら
に好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖停
止法の状況にて、種類が生じ、最も好ましくは、この鎖
停止法、すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定またはサ
ンガー配列決定の状況において、種類が生じる。この方
法は、配列が決定されるべき一本鎖または二本鎖ＤＮＡ
テンプレートを用いた、インビボでのＤＮＡポリメラー
ゼによるＤＮＡ合成を包含する。合成は、このテンプレ
ートにオリゴヌクレオチドプライマーがアニールする１
個の部位だけで、開始される。この合成反応は、連続Ｄ
ＮＡ伸長を支持しないヌクレオチド類似物の含入によ
り、停止される。この鎖停止ヌクレオチド類似物には、
２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸
（ｄｄＮＴＰ）があり、これは、３’から５’へのＤＮ
Ａ鎖の伸長に必要な３’−ＯＨ基がない。適切な割合の
ｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン
酸）および４個のｄｄＮＴＰの１個を使用すると、酵素
触媒した重合は、このｄｄＮＴＰが含入できる各部位
で、鎖集団の断片において、停止される。各反応に対し
て、標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰを使用するな
ら、この配列情報は、高分解能電気泳動による分離後、
蛍光により検出できる。この鎖停止法では、本発明の染
料は、配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチ
ドのいずれかに結合できる。染料は、例えば、Ｆｕｎｇ
ら、米国特許第４，７５７，１４１号（その内容は、本
明細書中で参考として援用されている）での教示に従っ
て、このプライマーの５’末端にて；プライマーの塩基
にて；または例えば、Ｈｏｂｂｓら、ヨーロッパ特許出
願第８７３０５８４４．０号（その内容は上述され、本
明細書中で参考として援用されている）に開示のアルキ
ニルアミノ連結基を介して、ジデオキシヌクレオチドの
塩基にて、相補的官能基と連結できる。

【０１６０】上記フラグメント解析法のそれぞれでは、
標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動操作に
より、分離される（例えば、

【０１６１】

【表３】 好ましくは、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜
２０重量％の間の濃度（重量対容量）を有する架橋また
は非架橋ポリアクリルアミドである。さらに好ましく
は、このポリアクリルアミド濃度は、約４〜８重量％の
間である。好ましくは、ＤＮＡ配列決定の状況では、特
に、この電気泳動マトリックスは、鎖分離または変性剤
（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含有する。この
ようなマトリックスを構築する詳細な操作は、

【０１６２】

【表４】 により示されている。従って、これらの参考文献の内容
は、本明細書中で参考として援用されている。特定の分
離における最適なポリマー濃度、ｐＨ、温度、使用する
変性剤の濃度などは、多くの要因に依存し、これらに
は、分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組
成、それらが一本鎖か二本鎖か、およびその情報が電気
泳動により追究される分類の性質が含まれる。従って、
本発明の適用には、特定の分離のための条件を最適化す
る標準予備試験が必要な場合がある。例によれば、約２
０個〜３００個の間の塩基範囲のサイズのオリゴヌクレ
オチドは、以下のマトリックスにおいて、本発明に従っ
て分離され、そして検出される：１９部：１部のアクリ
ルアミド：ビスアクリルアミドから製造した６％ポリア
クリルアミドであって、ｐＨ ８．３のトリス−ボレー
トＥＤＴＡ緩衝液中で形成したもの。

【０１６３】電気泳動分離に引き続いて、染料−ポリヌ
クレオチド複合体は、この染料標識ポリヌクレオチドか
らの蛍光発光を測定することにより、検出される。この
ような検出を行うために、この標識ポリヌクレオチド
は、標準的な手段、例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レ
ーザーなどにより照射される。好ましくは、この照射手
段は、４８８ｎｍと５５０ｎｍの間の波長の照射ビーム
を有するレーザーである。さらに好ましくは、この染料
−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー（特
に、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍの発光系列のアルゴン
イオンレーザー）、または５３２ｎｍの発光系列のネオ
ジム固相ＹＡＧレーザーにより発生したレーザー光によ
って、照射される。いくつかのアルゴンイオンレーザー
が市販されており、これらは、これらの系列で、同時に
レーザーとして使える（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ、Ｌｔ
ｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）のＭｏｄｅ
ｌ ２００１など）。次いで、光感受性検出器（例え
ば、光電子増倍管、荷電結合素子など）により、その蛍
光が検出される。

【０１６４】

【実施例】本発明は、以下の実施例を考慮することによ
り、さらに明確となるが、これらの実施例は、単に、本
発明の例示であることを意図し、いずれの点でも、本発
明の範囲を限定しない。

【０１６５】他に指示がなければ、全てのケミカルは、
Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手し、購入した状態で
使用した。３−フルオロレゾルシノール（１１ａ）は、
文献の操作（Ｐｅｒｋｉｎ、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏ
ｃ． １１０：１６５８−１６６６ （１９８０））に
従って、２，４−ジメトキシアニリンから合成した。２
−クロロ−４−メトキシレゾルシノール（１１ｃ）は、
米国特許第４，３１８，８４６号に従って、３−ヒドロ
キシ−４−メトキシベンズアルデヒドから合成した。
３，６−ジクロロトリメリト酸は、米国特許第４，３１
８，８４６号に従って合成し、そして純粋な無水酢酸中
で４時間還流してその冷却混合物をジエチルエーテルで
沈殿させることにより、その無水物１０ａに転化した。
フルオロマロン酸水素エチルは、文献（Ｏｒｇ． Ｓｙ
ｎ． Ｃｏｌｌ． ４：４１７−４１９ （１９６
３））に従って、フルオロマロン酸ジエチルから合成し
た。トリブチルホスホニウム−フルオロ酢酸エチル（１
９）は、文献（Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３０：６１１３
（１９８０））に従って、合成した。２−フルオロ−
１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）は、本明細書
開示に記述のようにして、合成した。乾燥ジクロロメタ
ン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）は、使用前に、水素化カルシウム上
で蒸留し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、水素化ア
ルミニウムリチウム（ＬＡＨ）上で蒸留した。無水エタ
ノールは、購入した状態で使用するか、またはナトリウ
ム上の蒸留により乾燥し、そして活性化モレキュラーシ
ーブ上で保存した。乾燥酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）は、
ＭｇＳＯ_４で予備乾燥した後、Ｐ_２Ｏ_５上で蒸留した。
乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、硫酸マグネシ
ウムで予備乾燥した後、蒸留し、そして活性化モレキュ
ラーシーブ上で保存した。全ての反応は、乾燥アルゴン
下にて、無水条件で行った。反応は、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）（シリカゲル６０、Ａ_２５４）により
モニターした。フラッシュクロマトグラフィーは、シリ
カゲル６０（２００〜４００メッシュ、Ｂａｘｔｅｒ）
上で行った。「１」および「２」で明示される純粋な異
性体を得るための非対称ベンゾキサンテン染料の最終精
製は、シリカゲル６０ ＰＴＬＣプレート（ＥＭ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）上の予備ＴＬＣでＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯ
Ｈ：ＡｃＯＨ（７：３：０．１）で溶出して行った。純
粋な染料異性体は、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ
（７：３：０．１）を使用してＴＬＣ上に単一斑点を作
り、そして短波長および長波長ＵＶ照射で視覚化するこ
とにより、同定した。異性体２は、通常媒体および逆層
媒体の両方でより遅く処理した。中間体生成物は、Ｖａ
ｒｉａｎ ３００ ＭＨｚＮＭＲによる^１ＨＮＭＲスペ
クトルにより同定した。精製した染料の吸収スペクトル
は、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５１Ａダイ
オードアレイ分光光度計で記録し、蛍光発光スペクトル
は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ ５０−Ｂ発光分
光光度計で記録した。染料標識オリゴヌクレオチドのＨ
ＰＬＣ精製は、２チャンネルのＰＥ １０２２積分計に
接続されたＰＥＬＣ ２４０蛍光検出器およびＰＥＬＣ
２９５ ＵＶ／ＶＩＳ検出器に接続されたＰｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ ２００シリーズのポンプで行った。染
料標識オリゴヌクレオチドの精製および同定に使用され
る緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、トリエチル
アンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）が挙げられる。緩
衝液は、１０倍溶液として０℃で保存し、そして使用前
に新しく希釈する。ＨＰＬＣ精製は、逆相ＲＰ−１８カ
ラムを使用した。

【０１６６】（実施例１） （非対称ベンゾキサンテンの合成）１，３−ジヒドロキ
シナフタレン誘導体（例えば、１，３−ジヒドロキシナ
フタレン９ｂまたは２−フルオロ−１，３−ジヒドロキ
シナフタレン９ａ）（０．２モル）と、１．１当量の無
水フタル酸誘導体３，６−ジクロロトリメリト酸無水物
１０ａおよび１当量のレゾルシノール誘導体１１（０．
２モル）、（所望の最終生成物によって１１ａ、１１
ｂ、１１ｃまたは１１ｄ）とを反応させることにより、
図２Ａおよび２Ｂの化合物１〜７を合成し、そしてアル
ゴン下、１１０℃で、純粋なＭｅＳＯ_３Ｈ（３ｍｌ）中
１６時間加熱した。この粗染料（１０ａを使用する反応
における位置（ｒｅｇｉｏ）異性体の混合物）を、氷／
水混合物への添加により沈殿させ、そして濾過により単
離した。この粗染料を、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ：酢酸
（７０：３０：１）の混合物で溶出する調製薄層クロマ
トグラフィーにより、２種の異性体１および２に精製し
た。

【０１６７】図２Ｂの差込図は、染料５の異性体２につ
いて示した非対称ベンゾキサンテン染料のＲ_２および／
またはＲ_３が非置換の（Ｒ_２＝Ｒ_３＝Ｈ）誘導体が、さ
らに、ハロゲン化試薬（ＮａＯＣｌ、ＮａＯＨ／Ｂ
ｒ_２、ＮａＯＨ／Ｉ_２）と０℃で３時間、反応し、続い
て１０％ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃでの抽出処理、Ｎａ_２Ｓ
Ｏ _４での乾燥、濾過および真空中での濃縮で、そのハロ
ゲン化誘導体（例えば、８（Ｒ_２＝Ｒ_３＝Ｃｌ、Ｂｒ、
Ｉ、Ｆ））を定量的に生成することを示している。 （実施例２） （染料標識オリゴヌクレオチドの合成）本発明の染料標
識オリゴヌクレオチドの合成を、図３を参照して記述す
る。Ｃｌ−ＦＬＡＮ、染料２を、乾燥酢酸エチル中に
て、室温で３時間にわたって、１．２当量の１，３−ジ
シクロヘキシルカルボジイミドおよび３当量のｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドと反応させることにより、そのｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル１２に転化した。
この反応混合物を５％ ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシ
ウム上で乾燥し、濾過し、そして固形物になるまで濃縮
し、これを、ＤＭＳＯ中に再懸濁した（１０ｍｇの染料
／５０μＬのＤＭＳＯ）。このＤＭＳＯ染料ストック
（５〜１０μＬ）を、ｐＨ ９．４にて、０．２５Ｍ重
炭酸塩／炭酸塩緩衝液中、アミノヘキシル誘導化−２１
Ｍ１３オリゴヌクレオチドプライマー（１×１０
^−３Ｍ）に、過剰に（１０〜２０倍）添加し、そして６
時間反応させた。アミノヘキシル誘導化プライマーは、
最終サイクルにＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２を用いた自動固
相ＤＮＡ合成により、調製した（ＰＥ ｐ／ｎ ４００
８０８）。染料標識オリゴヌクレオチドは、０．１モル
のトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）で溶出する
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通すことにより、
未反応染料から分離した。粗標識オリゴヌクレオチドを
含有するフラクションは、ＲＰ−１８クロマトグラフィ
ーカラムを用い、２５分間かけて、０．１ Ｍ ＴＥＡ
Ａ中８％〜２５％ ＡｃＣＮの勾配溶出を使用した逆相
ＨＰＬＣにより、精製した。この純粋な染料標識オリゴ
ヌクレオチド１３は、凍結乾燥で固形物にし、そして１
×ＴＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）に再懸濁した。この染料
標識オリゴヌクレオチドの濃度は、添加物根絶係数（ａ
ｄｄｉｔｉｖｅ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ）がＴに対して６，６５０、Ｃに対して７，
３５０、Ｇに対して１１，７５０およびＡに対して１
４，９００であると仮定して、２６０ｎｍでのＵＶ吸収
により決定し、２６０ｎｍでの染料吸収の相対寄与を、
同じ緩衝液中で測定した遊離染料のスペクトルから決定
した。 （実施例３） （実施例２のＴＡＭＰＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ
（２）標識オリゴヌクレオチドの励起スペクトルの比
較）１×ＴＢＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で各染料につい
て、励起スペクトルを記録した。染料は、等モル濃度
（約１×１０^−６Ｍ）で存在していた。各染料につい
て、その発光強度を、λ_ｍａｘＥｍで記録した。図４
は、４８８ｎｍでの励起について、Ｃｌ−ＦＬＡＮの相
対励起効率は、ＴＡＭＲＡ染料のそれのおよそ２．５倍
であるのに対して、５１４ｎｍでの励起については、Ｃ
ｌ−ＦＬＡＮの相対励起効率は、ＴＡＭＲＡ染料のそれ
のおよそ１．５倍であることを示している。 （実施例４） （実施例２のＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ
（２）標識オリゴヌクレオチドの量子収率の比較）図５
は、各染料の吸収最大で励起したＴＡＭＲＡ（２２）標
識−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドおよびＣｌ−ＦＬＡ
Ｎ（２）標識−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドの蛍光発
光強度の発光スペクトルを示す。オリゴヌクレオチドは
実施例２中のように調製された。このデータは、ＴＡＭ
ＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドと比較して、Ｃｌ
−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドでは６０％よ
り多い量子収率を示している。スペクトルは、各標識オ
リゴヌクレオチドについて、同じλ_ｍａｘＡｂｓ（０．
０５）となる濃度で、１×ＴＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で
記録した。発光スペクトルは、各染料のλ_ｍａｘＡｂｓ
での照射により、各染料について記録した。 （実施例５） （Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）およびＴＡＭＲＡ（２２）標識
オリゴヌクレオチドのモル発光強度の比較）１×ＴＥ緩
衝液（ｐＨ８．４）に溶解した等モル濃度（約１×１０
^−６Ｍ）のＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチド
およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの
発光スペクトルを、各オリゴヌクレオチドを４８８ｎｍ
および５１４ｎｍで照射し、そしてこのスペクトルに付
加することにより測定し、複数ラインのアルゴンレーザ
ーの照射を概算した。図６は、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標
識オリゴヌクレオチドの蛍光強度が、ＴＡＭＲＡ（２
２）標識オリゴヌクレオチドの蛍光強度の２倍以上であ
ることを明らかにしている。 （実施例６） （多重染料標識オリゴヌクレオチドセット）Ｃｌ−ＦＬ
ＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチド−２１Ｍ１３配列プ
ライマーの長波長蛍光発光を、６−ＦＡＭ、ＴＥＴおよ
びＨＥＸ ２３染料で標識した−２１Ｍ１３配列プライ
マーからの発光と比較した。ここで、６−ＦＡＭは、６
−カルボキシフルオレセインを示し、「ＴＥＴ」は、６
−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフル
オレセインを示し、そして「ＨＥＸ」は、６−カルボキ
シ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフ
ルオレセインを示す。上記の実施例２のように、プライ
マーを標識した。その励起波長は４９０ｎｍであった。
発光スペクトルは、１×ＴＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で測
定し、そして同じ強度（約１×１０^−６Ｍ）に規格化し
た。図７は、このＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌク
レオチドの発光スペクトルの５７３ｎｍ発光最大ピーク
および狭い幅によって、このＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識
オリゴヌクレオチドが、このセット内の他の３種の染料
の発光スペクトルから、スペクトル的に分離されている
ことを示す。このスペクトルの分離は、ＦＡＭ、ＴＥＴ
およびＨＥＸ標識オリゴヌクレオチドを含む染料セット
のＣｌ−ＦＬＡＮ（２）非対称ベンゾキサンテン染料と
の適合を示している。 （実施例７） （２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン中間
体の合成）図８参照。市販の無水ホモフタル酸（１４）
（１００ｇｍ）を、酸触媒下（ＴＦＡ ０．５ｍＬ）、
エタノール（３００ｍＬ）と反応させ、還流３時間、固
形物への濃縮およびトルエンから再結晶し、中間体エチ
ルエステル１５（収率９５％）を生成した。次いで、中
間体１５（１０ｇｍ）を、１．１当量の塩化オキサリル
とＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）中、室温で４時間、反応
させ、高真空下、室温で濃縮し、粗固形物として、酸塩
化物１６（収率８０％）を生成した。粗生成物１６をＴ
ＨＦ中に懸濁させ、そして以下の二つの方法のいずれか
により、フルオロ酢酸エステル等価物と反応させて、化
合物２０を生成した。

【０１６８】方法Ａ：フルオロ酢酸エチルのカリウム塩
（１７）（３当量）（ＴＨＦ中、０℃で、フルオロ酢酸
エチルおよびカリウムｔ−ブトキシドの反応により生
成）またはフルオロマロン酸水素エチルのマグネシウム
塩（１８）（１．５当量）（−６０℃で、臭化イソプロ
ピルマグネシウム（２当量）およびフルオロマロン酸水
素エチルの反応により生成）を１６のＴＨＦ懸濁液に徐
々に添加し、そして０℃で６時間反応させた。反応系
を、５％ ＨＣｌの添加によりクエンチし、ＥｔＯＡｃ
で抽出し（３回）、有機層を乾燥し、濃縮し、そして得
られた粗混合物を、ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２６：４〜Ｃ
Ｈ_２Ｃｌ_２ １００％の勾配溶出液を使用したフラッシ
ュクロマトグラフィーにより精製し、化合物２０（収率
３５〜５０％）を得た。

【０１６９】方法Ｂ：リンイリド１９を、−７０℃で、
１６のＴＨＦ懸濁液に徐々に添加し、次いで、室温まで
暖め、そして１６時間反応させた。この反応系を、５％
ＮａＨＣＯ_３の添加によりクエンチし、そして６時間
撹拌した。この反応系をＴＨＦ／水で抽出し（３回）、
そして生成物を方法Ａと同様に単離して、中間体２０
（収率＞５０％）を生成した。精製した２０を、塩基触
媒下（ＮａＯＥｔ ２当量）、分子内環化して、環状中
間体２１を得、これを、インサイチュで脱カルボキシル
化して、２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレ
ン（９ａ）（収率５０％）を得た。他方、この環状中間
体２１は、ＴＨＦ中、カリウムｔ−ブトキシドを使用す
ると、単離でき（収率＞８０％）、そして２−フルオロ
−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）に脱カルボ
キシル化できる。 （実施例８） （非対称ベンゾキサンテン化合物２を使用したＤＮＡ配
列決定）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｙｓｔ
８００ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ
ｓｔａｔｉｏｎ（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ
（ＰＥ））を用いて、自動サイクル配列決定を行った。
以下に記載のように６−ＦＡＭ（Ｃ末端停止剤）、ＴＥ
Ｔ（Ａ末端停止剤）、ＨＥＸ（Ｇ末端停止剤）またはＣ
ｌ−ＦＬＡＮ２（Ｔ末端停止剤）で標識した同一の−２
１ Ｍ１３プライマーを使用し、４個の別個のサンガー
配列決定反応を行った。４個の反応物の混合物を充填し
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ３
７７ ＤＮＡ配列決定器および付随のデータ分析ソフト
ウェアにより、データを得た。

【０１７０】サイクル配列決定反応は、３．０２プラッ
トホームソフトウェアを用いたＣａｔａｌｙｓｔ ８０
０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓｔ
ａｔｉｏｎで行った。このＣａｔａｌｙｓｔは、１００
ｎｇ／μＬの濃度でｐＧＥＭ３Ｚ＋テンプレートＤＮＡ
０．６μＬ、および以下で規定したプレミックス１．
９μＬを分配するように、プログラム化した。配列決定
データは、５％のＬｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒゲル（ＦＭＣ
ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉ
ｎｅ）を用いて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ３７７ ＤＮ
Ａ配列決定器で作成した。４個の配列決定プレミックス
のそれぞれは、表Ｉで、以下に規定される。

【０１７１】

【表５】 サイクル配列決定は、上記のテンプレートおよびプレミ
ックスの混合物で行った。このＣａｔａｌｙｓｔのサイ
クル条件は、以下のようであった：９６℃で２０秒間の
１サイクル；９４℃で２０秒間、５５℃で４０秒間およ
び６８℃で６０秒間の１５サイクル；および９４℃で２
０秒間および６８℃で６０秒間の１５サイクル。

【０１７２】熱サイクルに続いて、４個の別個の反応物
を濃厚緩衝液（８３％ ＤＭＳＯ／２５ｍＭ ＥＤＴＡ
／８ｍｇ／ｍｌ Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ）中で混合
し、そして標準Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌｏａｄ法（ｖ ２．
０２ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｍａｎｎｕａｌ、ＰＥ）を用
いて濃縮した。濃縮試料２ｍＬを、３７７配列決定器の
ウェルに充填し、操作し、そしてｖｅｒｓｉｏｎ １．
１ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。塩基２３３と
２６３との間の配列を、図９に示す。 （実施例９） （Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）、ＨＥＸおよびＴＥＴ標識プラ
イマーを用いて標識し、ＲＯＸ標識内部サイズ標準で同
時に分離したマイクロサテライトフラグメント）染料標
識プライマーを用いたヒトＣＥＰＨ族ＤＮＡの４個の座
のＰＣＲ反応を、以下に記載するように行った。これら
のＰＣＲ生成物をプールし、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７^ＴＭ ＤＮＡ配列
決定器（ＰＥ）にて、電気泳動で分離した。各染料標識
フラグメントピークの独特の蛍光シグナルを、Ｇｅｎｅ
Ｓｃａｎ^ＴＭ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
ｖ． ２．０．２（ＰＥ）を用いて分析した。図１０を
参照すると、赤色のピーク（Ｒと表示）は、ＲＯＸ（２
６）標識した内部標準フラグメントに対応し、青色のピ
ーク（Ｂと表示）は、ＴＥＴ標識フラグメントに対応
し、緑色のピーク（Ｇと表示）は、ＨＥＸ標識フラグメ
ントに対応し、そして黒色のピーク（Ｋと表示）は、Ｃ
ｌ−ＦＬＡＮ（２）標識フラグメントに対応する。

【０１７３】これらのＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラー（ＰＥ）で行っ
た。以下のカクテルを使用して、各染料標識プライマー
について、別の反応を行った：

【０１７４】

【表６】 これらの混合物を、以下のサイクル条件を用いて、増幅
した：９５℃で５分間の１サイクル；９４℃で１５秒
間、５５℃で１５秒間および７２℃で３０秒間の１０サ
イクル；８９℃で１５秒間、５５℃で１５秒間および７
２℃で３０秒間の２０サイクル；および７２℃で１０分
間の１サイクル。

【０１７５】これらの増幅ＰＣＲ生成物を、Ｃｌ−ＦＬ
ＡＮ（２）およびＴＥＴ標識ＰＣＲ生成物（０．５μ
Ｌ）を各ＨＥＸ標識ＰＣＲ生成物１．０μＬと混合する
ことによりプールし全体の比がＣｌ−ＦＬＡＮ：ＨＥ
Ｘ：ＴＥＸ（１：２：１）からなる混合染料標識フラグ
メントを得た。プールしたＰＣＲフラグメントを、ホル
ムアミド２．５μＬ、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ（５０
ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔ
ｒａｎ）０．５μＬのおよびＳｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒ
ｄ（ＧＳ−３５０ ＲＯＸ、ＰＥ ｐ／ｎ ４０１７３
５）０．５μＬからなる充填カクテルと混合した。プー
ルした混合物を９５℃で５分間変性し、次いで、ＰＥ
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ ３７７ ＤＮＡ配列決定器の
１ゲル列に充填した。これらのフラグメントを電気泳動
で分離し、そして以下の特性を有するアクリルアミドゲ
ルを用いて検出した：厚さ０．２０ｍｍ、アクリルアミ
ド４．２５％（ｗｔ）、アクリルアミド／ビスアクリル
アミド１９：１（ｗｔ／ｗｔ）、３４ウェルの四角い目
の細かい篩、１０ＸＴＢＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ ８９ｍ
Ｍ、ホウ酸８９ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）（ｐＨ ８．
３）。この器具は、Ｆｉｌｔｅｒ Ｗｈｅｅｌ Ａおよ
びＧＳ ３６Ｄ−２４００ Ｍｏｄｕｌｅ（これは、以
下の操作パラメーターを有する）を用いて操作した：Ｅ
Ｐ電圧 ３０００Ｖ、ＥＰ電流６０．０ｍＡ、ＥＰ電力
２００Ｗ、ゲル温度５１℃およびレーザー出力４０ｍ
Ｗ。 （実施例１０） （本発明のローダミン染料、キサンテン染料および非対
称キサンテン染料のスペクトル特性、光安定性および化
学安定性の比較）以下の表ＩＩは、本発明の非対称ベン
ゾキサンテン染料および他のスペクトル的に類似のキサ
ンテン染料およびローダミンベース染料の種々のスペク
トル特性および化学特性を要約し、そして比較する。

【０１７６】

【表７】 この表で示した染料の構造については、図１および２を
参照せよ。全てのデータは、純粋な染料異性体２につい
て報告している。全ての発光スペクトルを、室温で、λ
_ｍａｘＡｂｓ（約１×１０^−６Ｍ）で吸光度０．０５を
有する染料溶液にて、１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ ８．
４）で記録した。λ_ｍａｘＡｂｓで初期１吸収単位に
て、等容量のこれらの染料に対して、光分解速度を決定
し、そして１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）中、３５
℃で、等しい高強度の白色光照射下にて、等容量で、ペ
アで操作した。アリコートの吸収スペクトルを１時間間
隔で取り出し、λ_ｍａｘＥｍでの強度を一次指数曲線に
適合させて、染料損失速度ｔ_{１ ／２}を決定した。ほぼ等
しい濃度で、染料の５１４ｎｍ励起を用いて、λ_ｍａｘ
Ｅｍでの相対明度を決定した。（λ_ｍａｘＡｂｓ＝０．
０５）。ＮＨ_４ＯＨ安定性測定については、染料はほぼ
同じ濃度の濃水酸化アンモニウムに希釈し（λ_{ｍ ａｘ}Ａ
ｂｓ＝１）、そして密封バイアルにて、６０℃で２０時
間インキュベートした。アリコートの吸収スペクトルを
１時間間隔で取り出し、λ_ｍａｘＥｍでの強度を一次指
数曲線に適合させて、染料分解に対するｔ_１／２を決定
した。

【０１７７】全ての文献および特許出願の内容は、各個
々の文献または特許出願の内容が具体的かつ独立して参
考として援用されているのと同じ程度まで、本明細書中
で参考として援用されている。

【０１７８】化学および生化学の当業者は、その好まし
い実施形態において、それらの教示から逸脱することな
く、多くの改良が可能であることを、充分に理解してい
る。このような改良の全ては、以下の請求の範囲の範囲
内に包含されることを意図している。

【０１７９】

【発明の効果】本発明により、蛍光染料として有用な種
類の非対称ベンゾキサンテン染料が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、長波長標識（すなわち、５５０ｎｍを
超えると発光する標識）として以前に使用されている種
々の蛍光染料の構造を示す。

【図２Ａ】図２Ａは、本発明の非対称ベンゾキサンテン
染料の好ましい合成を描写する。

【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の非対称ベンゾキサンテン
染料の好ましい合成を描写する。

【図３】図３は、本発明の染料で標識化したオリゴヌク
レオチドの好ましい合成を示す。

【図４】図４は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬ
ＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの励起スペ
クトルを示す。

【図５】図５は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬ
ＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの量子収量
の比較を示す。

【図６】図６は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬ
ＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの等モル発
光強度の比較を示す。

【図７】図７は、４プレックス（ｐｌｅｘ）のセットの
染料標識化ＤＮＡ配列決定プライマーのメンバーの蛍光
発光スペクトルを示す。

【図８】図８は、本発明の２−フルオロ−１，３−ジヒ
ドロキシナフタレン中間体の合成を示す。

【図９】図９は、本発明の染料化合物で標識化したオリ
ゴヌクレオチド配列決定プライマーを使用したＤＮＡ配
列決定実験の結果を示す。

【図１０】図１０は、本発明の染料化合物で標識化した
オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用したマイク
ロサテライト分析の結果を示す。

【図１１】図１１は、本発明の非対称ベンゾキサンテン
染料の合成の４個の好ましい合成経路を示す。

【図１２】図１２は、本発明の１−置換３−ヒドロキシ
ナフタレン中間体の合成の３個の好ましい合成経路を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 スティーブン エム． メンチェン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536, フレモント， バンダ ウェイ 768 (72)発明者 ペーター ディー． セイセン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94080 −1618， サウス サンフランシスコ， クラレモント アベニュー 114 (72)発明者 ケビン エム． ヘネシー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403, サン マテオ， 29ティーエイチ アベ ニュー 687 (72)発明者 バージン シー． ファーニス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94402, サン マテオ， パーム アベニュー 1217 (72)発明者 ジョアン ハウザー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94610, オークランド， ワーフィールド ナン バー204 1001 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA05 CA06 CA09 HA08 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR08 QR13 QR14 QR32 QR38 QR41 QR42 QR58 QR62 QR66 QS16 QS25 QS28 QS34 QS39 QX02 4H006 AA01 AB84 FC54 FE13 FE73 FE74 4H056 BA02 BB05 BB14 BC01 BD01 BD03 BF07 BF07E BF09F BF11E BF34 FA08

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式： 【化１】 を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物であって、
   ここで、 Ｙ_１およびＹ_２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミ
   ニウムおよびアミンからなる群から選択され；Ｒ_１〜Ｒ
   _８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低
   級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、
   アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキ
   シ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択さ
   れ；そしてＲ_９は、アセチレン、低級アルキル、低級ア
   ルケン、シアノ、フェニル、複素環式芳香族、および以
   下の構造： 【化２】 を有する置換フェニルからなる群より選択され、 ここで、 Ｘ_１〜Ｘ_５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アル
   キル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、または
   連結基であり、 ここで、この連結基は、イソチオシアネート、スルホニ
   ルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、
   スクシンイミジルエステル、活性カルボキシレート、マ
   レイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドおよび活
   性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからなる
   群より選択される、化合物。
2. 【請求項２】 次式を有するホスホロアミダイト化合物
   であって： 【化１００】 ここで、 Ｘは、線状低級アルキル、環状低級アルキル、線状置換
   低級アルキル、環状置換低級アルキル、ポリエチレンオ
   キシド、１個と８個との間の炭素原子を有する低級アリ
   ール、ペプチドおよびポリエーテルからなる群より選択
   される、スペーサーアームであり；Ｙは、アミド、スル
   ホンアミド、尿素、ウレタンおよびチオ尿素からなる群
   より選択される、結合であり；Ｂ_１は、亜リン酸エステ
   ル保護基であり；Ｂ_２およびＢ_３は、別個に、低級アル
   キル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭
   素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択さ
   れ；そしてＤは、請求項１に記載の染料化合物であり；
   ここで、ＹおよびＤは、Ｒ_１〜Ｒ_９位のうち１つで染料
   Ｄに結合した結合を介して、連結されている、化合物。
3. 【請求項３】 次式を有するホスホロアミダイト化合物
   であって： 【化１０１】 ここで：Ｂ_１は、亜リン酸エステル保護基であり；
   Ｂ_２、およびＢ_３は、別個に、低級アルキル、低級アル
   ケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有す
   るシクロアルキルからなる群から選択され；Ｂ_５は、ト
   リフェニルメチルラジカル、トリフェニルメチルラジカ
   ルの電子供与性置換誘導体、ビス（ｐ−アニシル）フェ
   ニルメチル、モノメトキシトリフェニルメチル、α−ナ
   フチルジフェニルメチルおよびトリ（ｐ−メトキシフェ
   ニルメチル）からなる群より選択される、酸切断可能な
   ヒドロキシル保護基であり、この電子供与性置換基は、
   アミノ、低級アルキル、１個と８個との間の炭素原子を
   有する低級アリール、低級アルコキシおよびメトキシか
   らなる群より選択され；Ｂは、ヌクレオチド塩基であ
   り；そしてＤは、請求項１に記載の染料化合物であり；
   ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場
   合、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリン
   のＮ^９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである
   場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ^１−位置にて
   結合しており；ここで、ＢおよびＤは、Ｒ_１〜Ｒ_９位置
   のうち１つでＤに結合した結合により、連結されてお
   り；そしてここで、Ｂがプリンである場合、この結合
   は、このプリンの８−位にて結合しており、Ｂが７−デ
   アザプリンである場合、この結合は、この７−デアザプ
   リンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンで
   ある場合、この結合は、このピリミジンの５−位にて結
   合している、化合物。
4. 【請求項４】 次式を有する化合物であって： 【化１０２】 ここで：Ｒ_３は、フッ素、塩素、スルホネート、アミ
   ノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基
   からなる群から選択され；Ｒ_４〜Ｒ_７は、別個に、水
   素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級
   アルキン、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、
   低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択さ
   れ、この連結基は、イソチオシアネート、スルホニルク
   ロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スク
   シンイミジルエステル、活性カルボキシレート、マレイ
   ミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドおよび活性化
   Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからなる群よ
   り選択され；そしてＹ_２は、ヒドロキシルおよびアミン
   からなる群から選択され、 ただし、Ｙ_２がヒドロキシルである場合、Ｒ_３はアミド
   ではない、化合物。
5. 【請求項５】 次式を有する標識ヌクレオチドであっ
   て： 【化１０３】 ここで：Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリ
   ミジンヌクレオチド塩基であり；Ｗ_１およびＷ_２は、別
   個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；Ｗ_３は、
   ＯＨ、 【化１０４】 からなる群から選択され；Ｄは、請求項１に記載の染料
   化合物であり；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプ
   リンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデア
   ザプリンのＮ^９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジ
   ンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ^１−
   位置にて結合しており；ここで、ＢおよびＤを連結して
   いる結合は、Ｒ_１〜Ｒ_９位置のうちの１つで、Ｄに結合
   しており；そしてここで、Ｂがプリンである場合、この
   結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−
   デアザプリンである場合、この結合は、この７−デアザ
   プリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジン
   である場合、この結合は、このピリミジンの５−位に結
   合している、標識ヌクレオチド。
6. 【請求項６】 次式を有するヌクレオチドを含有する標
   識ポリヌクレオチドであって： 【化１０５】 ここで：Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリ
   ミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ_１は、ＨおよびＯＨ
   からなる群から選択され；Ｚ_２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰ
   Ｏ_４、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、
   Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結
   合により連結され、このホスホジエステル結合は、Ｎｕ
   ｃの５’−位に結合しており；Ｚ_３は、Ｈ、ＨＰＯ_３、
   ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択
   され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホス
   ホジエステル結合により連結され、このホスホジエステ
   ル結合は、Ｎｕｃの３’−位に結合しており；そしてＤ
   は、請求項１に記載の染料化合物であり；ここで、Ｂが
   プリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分
   は、このプリンまたはデアザプリンのＮ^９−位置にて結
   合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分
   は、このピリミジンのＮ^１−位置にて結合しており；こ
   こで、ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ_１〜Ｒ_９位
   置のうちの１つで、Ｄに結合しており；そしてここで、
   Ｂがプリンである場合、このＢおよびＤを連結している
   結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−
   デアザプリンである場合、このＢおよびＤを連結してい
   る結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合してお
   り、そしてＢがピリミジンである場合、このＢおよびＤ
   を連結している結合は、このピリミジンの５−位に結合
   している、標識ポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチド配列決定方法であっ
   て：第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌク
   レオチドの混合物を以下：この第１のクラスの各ポリヌ
   クレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有
   し、第１染料で標識されており；この第２のクラスの各
   ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを
   含有し、第２染料で標識されており；この第３のクラス
   の各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノ
   シンを含有し、第３染料で標識されており；そしてこの
   第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデ
   オキシチミジンを含有し、第４染料で標識されており；
   ここで、この第１染料、この第２染料、この第３染料、
   またはこの第４染料のうちの１種は、請求項１に記載の
   非対称ベンゾキサンテン染料であり；この染料の他のも
   のは、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互い
   から、分光的に分解可能である、ように形成する工程；
   このポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それによ
   り、同様にサイズ分類されたポリヌクレオチドのバンド
   を形成する工程；このバンドを、この染料が蛍光を発す
   るのを引き起こすことができる照射ビームで照射する工
   程；ならびにこのバンド中のこのポリヌクレオチドのク
   ラスを、この染料の蛍光スペクトルにより同定する工
   程、を包含する方法。
8. 【請求項８】 以下を包含する、フラグメント解析方
   法：標識ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程
   であって、このフラグメントが、請求項１に記載の染料
   化合物で標識されている、工程；この標識ポリヌクレオ
   チドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供す
   る工程；およびこの分離プロセスに引き続いて、この標
   識ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。