JP2003512602A - α２δ−１サブユニット結合リガンドのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 可溶性α₂δ-1サブタイプポリペプチドに結合するリガンドをスクリーニングするための方法。本願発明はまた、その方法を実施するための組成物及びキット、並びにそれを使用して選択し、同定したリガンドにも関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、可溶性分泌型大脳皮質電圧依存性カルシウムチャネルα₂δサブユ
ニットポリペプチド、特にカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットが結合する
リガンドをスクリーニングする方法に関するものである。

【０００２】 （発明の背景） ギャバペンチン（1-aminoethyl-cyclohexane acetic acid）は現在てんかん
の治療用に市販されている。しかし、この化合物はまた痛みや不安の治療にも有
用であることが認められている。

【０００３】 最近の報告では、ギャバペンチンと電圧依存性カルシウムテャネル（VDCC）の
α₂δサブユニットとの相互作用が示されている。しかし、α₂δサブユニットに
おけるギャバペンチンの相互作用がその臨床的有用性と関係があっても、電気生
理学的試験結果はVDCCにおけるギャバペンチンの作用に関するデータと矛盾する
ものである。しかし、抗痙攣薬の原型のどれも、α₂δ-1サブユニットに結合し
た［³H］ギャバペンチンを置換することが出来なかった。

【０００４】 α₂δサブユニットに結合するリガンドをスクリーニングするために使用し得
るアッセイに、最も頻繁にα₂δサブユニットの原料として使用されているのは
ブタの膜抽出物である。そのようなアッセイには著しい不便がある。第一に、ア
ッセイ物質が膜抽出物であるため、一つのアッセイ試薬から次へと、特にサブタ
イプに関して、タンパク質組成を正確に測定することが非常に困難である。また
、アッセイ試薬の中に種々の不純物が存在するので、小さなプレートアッセイで
は問題となる。さらに、タンパク質調製品が均一でないので、標的タンパク質及
びアッセイプレートとの相互作用がしばしば一定でない。このことが、ハイスル
ープット様式にアッセイを効率化することをほとんど不可能にしている。

【０００５】 （発明の要約） 本発明者らは、電圧依存性カルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットポリペプ
チド（以降、α₂δ-1サブユニットポリペプチド）の可溶性分泌型を、α₂δ-1サ
ブユニットに結合するリガンドのスクリーニングアッセイに使用し得ることを発
見した。

【０００６】 α₂δサブユニット上の[³H]ギャバペンチン結合サイトの正確な位置及び配置
は現在のところ分かっていない。さらに、最近ブタのα₂δ-1サブユニットをコ
ードしている配列の短縮実験から、[³H]ギャバペンチンに結合するタンパク質に
はC-末端領域に近いアミノ酸が必要であることが示された。このため、ブタのα ₂ δ-1サブユニットの短縮型をスクリーニングアッセイに使用することは、先行
技術として公開あるいは示されてもいない、その理由は、アッセイ環境中で結合
能力の適切なレベルに到達できるか否かに関わっているからである。

【０００７】 本発明のアッセイは相当重要なものである、なぜなら、リコンビナント可溶性
分泌型α₂δ-1サブユニットポリペプチドをハイスループットα₂δ-1リガンドス
クリーニングに使用できることを確認したからである。また、α₂δ-1サブタイ
プに特異的に結合するリガンドの研究をするには、ブタ膜抽出物によるスクリー
ニングアッセイよりも優れた有用性を提供する。タンパク質には、精製をしやす
くしまた確認のための目印を付けた抗体を使用できる、タグを付けることが出来
る。

【０００８】 タンパク質のC-末端に6Hisタグを付加することが、α₂δに対する[³H]ギャバ
ペンチン結合能に影響するか否か、明らかでなかった。

【０００９】 また、α₂δのC-末端に付けた6Hisは、Ni NTAクロマトグラフィーマトリック
ス（精製用）及びSPAビーズまたはNiフラッシュプレートウエル表面（アッセイ
用）との相互作用に適するのか否か、明らかでなかった。

【００１０】 本発明は、カルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットに結合するリガンドのス
クリーニング法に関するものである。 本発明は、下記の段階を含む： 可溶性分泌型リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットポリペ
プチドを下記と接触させる： 関心のリガンド；及び α₂δ-1サブユニットに結合する標識化合物；及び 可溶性分泌型-α₂δ-1サブユニットに対する標識化合物の結合のレベルを測定
する。

【００１１】 本発明は、また生物学的活性生産物、特に患者の神経系に作用する生産物、を
スクリーニングする方法にも関するものであり、下記の段階を含んでいる： 可溶性分泌型リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットポリペ
プチドを下記と接触させる： 候補生産物；及び α₂δ-1サブユニットに結合する標識化合物；及び 可溶性分泌型-α₂δ-1サブユニットに対する標識化合物の結合のレベルを測定
する。

【００１２】 本発明は、またカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットに結合するリガンド
をスクリーニングするキットにも関するものである。 このキットは下記を含む： 可溶性分泌型リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットポリペ
プチド；及び α₂δ-1サブユニットに結合する標識化合物。

【００１３】 本発明は、またカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットに結合するリガンド
をスクリーニングするキットまたは方法、生物学的活性生産物、特に患者の神経
系機能に作用する生産物、をスクリーニングする方法に関するものでもあり、上
記キットまたは方法が下記の化合物の少なくとも一つを含むことが特徴である： 1) 可溶性でその由来である全長あるいは野生型のα₂δサブユニットの機能的
性質を維持しているカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 2) その由来である全長あるいは野生型のα₂δサブユニットが哺乳動物起源で
ある、1)と同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 3) 哺乳動物起源がヒト、ブタ、ラットあるいはマウス起源である、2)と同じ
カルシウムチャネルα₂δサブユニット。 4) 哺乳動物起源がヒト起源である、3)と同じカルシウムチャネルα₂δサブユ
ニット。 5) その由来である全長あるいは野生型のα₂δサブユニットが大脳皮質に自然
に発現している、上記1)〜4)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサ
ブユニット。 6) その由来である全長あるいは野生型のα₂δサブユニットが電圧依存性であ
る、上記1)〜5)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 7) α₂δサブユニットが切断されている、上記1)〜６)のいずれか一つと同じ
カルシウムチャネルα₂δサブユニット。 8) α₂δサブユニットが切断されて別々のα₂及びδペプチドになっている、
上記1)〜7)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 9) α₂及びδペプチドがジスルフィド架橋されている、8)と同じカルシウムチ
ャネルα₂δサブユニット。 10) α₂δサブユニットが切断されていない、上記1)〜６)のいずれか一つと同
じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 11) 精製あるいは単離されていることが特徴である、上記1)〜10)のいずれか
一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 12) その由来である全長あるいは野生型のα₂δサブユニットが自然にプロセ
ッシングを受けているのと同様にプロセッシングを受けていることが特徴である
、上記1)〜11)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 13) バキュロウイルス/昆虫細胞発現系によって生産し得ることが特徴である
、上記1)〜12)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 14) バキュロウイルス/昆虫細胞発現系によって生産されることが特徴である
、上記1)〜13)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 15) δペプチドがその由来である完全δペプチドのリガンド相互作用部分を少
なくとも含むことが特徴である、上記1)〜14)のいずれか一つと同じカルシウム
チャネルα₂δサブユニット。 16) その由来である完全なδペプチドに関してC-末端短縮があり、この短縮が
短縮δペプチドを可溶化するのに充分なものであることが特徴である、上記1)〜
15）のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 17) α₂ペプチドがその由来である完全α₂ペプチドのリガンド相互作用部分を
少なくとも含むことが特徴である、上記1)〜16）のいずれか一つと同じカルシウ
ムチャネルα₂δサブユニット。 18) リガンドがギャバペンチン、L-ノルロイシン、L-アロ−イソロイシン、L-
メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、スペルミンまたはL-フェ
ニルアラニンであることが特徴である、上記15)あるいは17)のいずれか一つと同
じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 19) そのα₂ペプチドが、少なくとも元の完全α₂ペプチドのリガンド相互作用
部分を含み、δペプチドが少なくとも元の完全δペプチドのリガンド相互作用部
分を含み、そしてδペプチドが上記カルシウムチャネルを不溶化している元の完
全δペプチドの膜貫通ドメインの一部を含まないδペプチドであることが特徴で
ある、上記1)〜18)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット
。 20) それが由来する、または起源である全長または野生型α₂δサブユニット
がα₂δ-1、α₂δ-2、α₂δ-3またはα₂δ-4であることが特徴である、上記1)〜
19)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 21) それが由来する、または起源である全長または野生型α₂δサブユニット
がSEQ ID N°20のアミノ酸配列を持つことが特徴である、上記1)〜20)のいずれ
か一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 22) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°4、SEQ ID
N°5あるいは SEQ ID N°6を含むか、またはから構成されていることが特徴であ
る、上記20)または21)と同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 23) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°20のアミノ
酸番号340及びアミノ酸番号1062の間で構成される領域を含むか、またはから構
成されていることが特徴である、上記20)〜22)のいずれか一つと同じカルシウム
チャネルα₂δサブユニット。 24) それが由来する、または起源である全長または野生型α₂δサブユニット
がSEQ ID N°21のアミノ酸配列を持っている、上記1)〜20)のいずれか一つと同
じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 25) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°10、SEQ ID
N°11あるいは SEQ ID N°12を含むまたは構成とすることが特徴である、上記2
0)または24)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 26) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°20のアミノ
酸番号306及びアミノ酸番号1019の間で構成される領域を含むまたは構成とする
ことが特徴である、上記20)、24）または25)のいずれか一つと同じカルシウムチ
ャネルα₂δサブユニット。 27) それが由来する、または起源である全長または野生型α₂δサブユニット
がSEQ ID N°55のアミノ酸配列を持っている、上記1)〜20)のいずれか一つと同
じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 28) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°53、SEQ ID
N°54あるいは SEQ ID N°55を含むまたは構成とすることが特徴である、上記2
0)または27)と同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 29) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°55のアミノ
酸番号302及びアミノ酸番号1050の間で構成される領域を含むまたは構成とする
ことが特徴である、上記20)、27）または28)のいずれか一つと同じカルシウムチ
ャネルα₂δサブユニット。 30) それが由来する、または起源である全長または野生型α₂δサブユニット
がSEQ ID N°33またはSEQ ID N°44のアミノ酸配列を持っている、上記1)〜20)
のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 31) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°34、SEQ ID
N°35 、SEQ ID N°36、 SEQ ID N°41、 SEQ ID N°42あるいは SEQ ID N°43
を含むまたは構成とすることが特徴である、上記20)または30)と同じカルシウム
チャネルα₂δサブユニット。 32) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°33またはSE
Q ID N°44のアミノ酸番号302及びアミノ酸番号1018の間で構成される領域を含
むまたは構成とすることが特徴である、上記20)、30）または31)のいずれか一つ
と同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 33) プロッセシングを受けていない型のアミノ酸配列がSEQ ID N°33またはSE
Q ID N°44のアミノ酸番号302及びアミノ酸番号1018の間で構成される領域を含
むことが特徴である、上記20)、30）または31)のいずれか一つと同じカルシウム
チャネルα₂δサブユニット。 34) そのα₂ペプチドがSEQ ID N°33またはSEQ ID N°44のアミノ酸番号302か
らアミノ酸番号946または997の間で構成される領域を含み、そしてδペプチドが
SEQ ID N°33またはSEQ ID N°44のアミノ酸番号984からアミノ酸番号1018の間
で構成される領域を含むことが特徴である、上記20)、30）、31) 、32)または33
)のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 35) そのα₂ペプチド及びδペプチドが、上記1)〜34)のいずれか一つと同じカ
ルシウムチャネルα₂δサブユニットのα₂ペプチド及びδペプチドそれぞれと99
％、98％、97％、96％または95％相同あるいは一致していることが特徴である、
カルシウムチャネルα₂δサブユニット。 36) そのヌクレオチド配列が、上記1)〜35)のいずれか一つと同じカルシウム
チャネルα₂δサブユニットをコードしているヌクレオチド配列を含むことが特
徴である核酸分子。 37) そのヌクレオチド配列が、上記1)〜35)のいずれか一つと同じカルシウム
チャネルα₂δサブユニットのα₂ペプチドまたはδペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列を含むことが特徴である核酸分子。 38) 上記36)または37)あるいは下記39)と同じ核酸分子とストリンジェントな
（stringent）条件でハイブリダイズする核酸分子。 39) SEQ ID N°1、 SEQ ID N°2、 SEQ ID N°3、 SEQ ID N°7、 SEQ ID N
°8、 SEQ ID N°9、 SEQ ID N°13、 SEQ ID N°14、 SEQ ID N°15、 SEQ ID
N°30、 SEQ ID N°31、 SEQ ID N°32、 SEQ ID N°38、 SEQ ID N°39、 SEQ
ID N°40、 SEQ ID N°50、 SEQ ID N°51、あるいは SEQ ID N°52を含む上記3
6)〜38)のいずれか一つと同じ核酸分子。 40) 上記36)〜39)のいずれか一つと同じ核酸分子を発現することが出来るベク
ター。 41) 上記36)〜39)のいずれか一つと同じ核酸分子を含む発現ベクター。 42) バキュロウイルスベクターである、上記40)または41)と同じベクター。 43) 上記36)〜39)いずれか一つと同じ核酸分子を含む細胞。 44) 上記40)、41)または42)と同じベクターを含む細胞。 45) 哺乳動物細胞または昆虫細胞である、43)または44)と同じ細胞。 46) 上記7)〜9)のいずれかと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット及び
上記10)と同じカルシウムチャネルα₂δサブユニットを含む組成物。 47) タグが付けられているか標識されていることが特徴である、上記1)〜35)
のいずれか一つと同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 48) タグが付けられているか標識されていることが特徴である、上記36)〜39)
のいずれか一つと同じ核酸分子。 49) δペプチドのC-末端にタグを付けたことが特徴である、47)と同じカルシ
ウムチャネルα₂δサブユニット。 50) δペプチドのC-末端部分をコードする核酸分子領域の末端にタグを付けた
ことが特徴である、48)と同じ核酸分子。 51) 6ヒスチジン残基タグでタグを付けたことが特徴である、47)または49)と
同じカルシウムチャネルα₂δサブユニット。 52) 6ヒスチジン残基タグでタグを付けたことが特徴である、48)または50)と
同じ核酸分子。

【００１４】 本発明は、また上記1)〜52)のいずれか一つと同じ化合物を使用するスクリー
ニングアッセイにも関するものである。このスクリーニングアッセイは、望まし
くは、SPAアッセイ、フラッシュプレート（Flashplate）アッセイ、ニッケルフ
ラッシュプレートアッセイ、フィルター結合（binding）アッセイあるいは小麦
胚芽レクチンフラッシュプレートアッセイである。

【００１５】 本発明は、また上記1)〜52)のいずれか一つと同じ化合物を使用したスクリー
ニングアッセイを、カルシウムチャネルα₂δサブユニットのリガンドとカルシ
ウムチャネルα₂δサブユニットの結合または相互作用を検出あるいは測定する
ために使用することに関係している。関心がある特異的リガンドは、ギャバペン
チン、L-ノルロイシン、L-アロ-イソロイシン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-
イソロイシン、L-バリン、スペルミンまたはL-フェニルアラニンである。

【００１６】 上記スクリーニングアッセイあるいは使用法は望ましくはSPAアッセイ、フラ
ッシュプレートアッセイ、ニッケルフラッシュプレートアッセイ、フィルターバ
インディングアッセイあるいは小麦胚芽レクチンフラッシュプレートアッセイで
ある。

【００１７】 本発明は、またカルシウムチャネルα₂δサブユニットのリガンドとカルシウ
ムチャネルα₂δサブユニットの結合または相互作用を検出あるいは測定するた
めの、1)〜52)のいずれか一つの化合物を含む、キットにも関係している。関心
がある特異的リガンドは、ギャバペンチン、L-ノルロイシン、L-アロ-イソロイ
シン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、スペルミンまた
はL-フェニルアラニンである。

【００１８】 上記発明のキットは、SPAアッセイ、フラッシュプレートアッセイ、ニッケル
フラッシュプレートアッセイ、フィルターバインディングアッセイあるいは小麦
胚芽レクチンフラッシュプレートアッセイに使用することが出来る。

【００１９】 本発明のアッセイ及びキットに関して、イミダゾールの使用には大きな利点が
ある、なぜならリガンドとレセプター間の相互作用の可能性を増加させるからで
ある。本発明のSPAアッセイにおけるイミダゾールの望ましい範囲は、約1 mＭ〜
約50 mＭの間である。本発明のフラッシュプレートアッセイにおけるイミダゾー
ルの望ましい範囲は約1 mＭ〜約20 mＭの間である。

【００２０】 本発明のアッセイ及びキットに関して、ウシ血清アルブミン（BSA）の使用に
は大きな利点がある、なぜならアッセイ及びキットに使用した化合物を安定化さ
せ、それゆえ大規模スクリーニング、特にハイスループット（high-throughput
）スクリーニング方式を可能にするからである。望ましいBSAの範囲は約0.025%
及び約0.05%の間である。

【００２１】 本発明のアッセイ及びキットに使用されあるいは含まれる上記化合物の大きな
利点は、均質な物質として得られそして使用できることである。

【００２２】 本発明のアッセイ及びキットに使用されあるいは含まれる上記化合物のその他
の大きな利点は、DNAリコンビナント技術により大量に得ることが出来ることで
ある。これらの化合物を生産するもっとも望ましいシステムは、生産物を高収率
で得ることができるバキュロウイルス/昆虫細胞システムである。上記キット及
びアッセイの詳細な態様はこの申請書の以下の部分、特に例の中に、詳しく記述
する。

【００２３】 本発明は、医薬品あるいは医薬品開発用のリードとして使用するために上記ス
クリーニング方法またはキットを使用して、単離され、同定されあるいは選択さ
れた、生産物またはリガンドに帰する。上記に指摘したように、この化合物は、
てんかん、痛み及び不安を含む神経系の疾患を治療するのに潜在的な有用性を有
している。

【００２４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、可溶性分泌型α₂δサブユニットポリペプチド、特にカルシウムチ
ャネルα₂δ-1サブユニットポリペプチド、が結合するリガンドをスクリーニン
グする方法に関するものである。ここに使用されている用語α₂δサブユニット
ポリペプチドは、特にジスルフィド共有結合により、互いに付着または会合した
、2種のポリペプチド（α₂とδ）を含む構造を指すことを意図している。さらに
特異的には、標的のα₂δサブユニット結合サイトは、望ましくは[³H]ギャバペ
ンチン結合サイトである。本発明の方法における種々のパラメーターは以下に詳
細に記述する。

【００２５】Ａ−可溶性分泌型リコンビナントα₂δ-1サブユニットポリペプチド α₂δ-1サブユニットの可溶性分泌型をコードするいくつかのヌクレオチド配
列が本発明の関係において使用し得る。望ましい可溶性分泌型α₂δ-1サブユニ
ットポリペプチドは真核生物α₂δ-1サブユニットから由来し、より望ましくは
マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシあるいはその他及びヒトのα₂δ-1サブユ
ニット由来である。最も望ましいのは、ヒトまたはブタα₂δ-1サブユニットか
ら由来する可溶性分泌型α₂δ-1サブユニットポリペプチドである。

【００２６】 より特異的には、選択されたヌクレオチド配列は、SEQ ID N°33または SEQ I
D N°44のアミノ酸1からアミノ酸985及び1087の間まで、望ましくはアミノ酸985
及び1085の間まで、より望ましくはアミノ酸985及び1078の間まで、最も望まし
くはアミノ酸985及び1064、1059または1044の間までを含むポリペプチドと、少
なくとも80%、望ましくは90%、より望ましくは95%、そして最も望ましくは98ま
たは99%のアミノ酸が一致する分泌型可溶性ポリペプチドをコードしている。

【００２７】 特別の態様では、選択されたヌクレオチド配列は、SEQ ID N°33または SEQ I
D N°44のアミノ酸1からアミノ酸1008及び1087の間まで、特に1018及び1078の間
まで、特異的には1043及び1078の間まで、を含むポリペプチドと少なくとも80%
、望ましくは90%、より望ましくは95%、そして最も望ましくは98または99%のア
ミノ酸が一致する分泌型可溶性ポリペプチドをコードしている。

【００２８】 より特異的には、選択されたヌクレオチド配列は、SEQ ID N°33または SEQ I
D N°44のアミノ酸1からアミノ酸985及び1054の間、望ましくは985及び1059の間
、最も望ましくは1019及び1044の間、を含むポリペプチドと少なくとも80%、望
ましくは90%、より望ましくは95%、そして最も望ましくは98または99%のアミノ
酸が一致する分泌型可溶性ポリペプチドをコードしている。

【００２９】 膜固定構造を持たず、機能的[³H]ギャバペンチン結合サイトを持つ可溶性分泌
型ポリペプチドを生産するα₂δ-1サブユニットcDNAの最適な欠失を決めるため
に、発明者らは、いくつかのヒトあるいはブタのα₂δ-1サブユニットcDNA欠失
変異体発現をテストした。しかし、α₂δ-1サブユニット配列の種を超えた極め
て本質的な類似性が認められ、下記の解説は他の真核動物種、特にラット、マウ
スあるいはウサギのような哺乳動物に適用することが出来る。公共のデーターベ
ースで入手できるそれらのα₂δ-1サブユニット配列は、ヒト及びブタのα₂δ-1
サブユニット配列と極めて本質的な類似性を共有している。そのため、発明者ら
は、ブタ及びヒトの可溶性でしかもギャバペンチン結合性を維持しているα₂δ-
1サブユニットを生産するための修飾が可能な、α₂δ-1における領域の同定と性
質解析に成功したことは、この技術の熟練者にとっては他種のα₂δ-1ポリペプ
チドの修飾が可能である。他種のα₂δ-1におけるこの修飾サイトの例を図14に
示した。

【００３０】 発明者らは、ブタα₂δ-1サブユニットcDNA欠失操作により、天然タンパク質
のアミノ酸967から1091までをコードするヌクレオチド配列が得られることを発
見した。他方、溶解性を達成するのに必要な欠失は、SEQ ID N°33の配列のアミ
ノ酸1064から1091をコードするヌクレオチドの周辺にあるらしい。これに関連し
て、アミノ酸1064から1091までをコードする配列を除いた欠失変異体cDNAを使用
して発現した変異体ポリペプチドは、可溶型及び膜結合型の両者があり、これら
は[³H]ギャバペンチン及び/または誘導体あるいはpregabalin及びgabapentoids
のような化合物に対して野生型タンパク質と類似した結合性を有していた。さら
に、アミノ酸1085から1091をコードするヌクレオチド配列を除いた欠失変異体cD
NAを使用して発現した変異体ポリペプチドは、膜に固定する性質を回復する。ま
た、SEQ ID N°33または SEQ ID N°44のアミノ酸1037から1091またはアミノ酸1
019から1091をコードするヌクレオチド配列を除いた欠失変異体cDNAを使用して
発現した変異体ポリペプチドは、可溶型である。

【００３１】 発明者らは、天然配列に可及的に近似し、それゆえ天然の折り畳み方、したが
って[³H]ギャバペンチン結合性により類似している、可溶性分泌型α₂δ-1サブ
ユニットポリペプチドは、SEQ ID N°33または 44のアミノ酸配列がアミノ酸列9
85-1091から1074-1091を欠失したタンパク質に相当するものであると、確信して
いる。熟練した科学者であれば、このアミノ酸列の中から最適変異タンパク質を
まったく容易に決めることが出来る。

【００３２】 本発明はそれゆえ特に、可溶性分泌型α₂δ-1サブユニットポリペプチドが望
ましくは、SEQ ID N°33または SEQ ID N°44のアミノ酸1からアミノ酸985及び1
054の間、望ましくは985及び1059の間、最も望ましくは1019及び1064の間、を含
むポリペプチドと少なくとも80%一致するポリペプチドである、スクリーニング
アッセイに関するものである。本発明に使用し得るα₂δ-1サブユニットポリペ
プチドは、SEQ ID N°34、35、36、37、41、42及び43のポリペプチドであり、 S
EQ ID N°33及び SEQ ID N°44のポリペプチドが最も望ましい。

【００３３】 本発明の最初の望ましい態様において、α₂δ-1サブユニットポリペプチドは
アッセイに使用される前に精製されている。精製段階は、この明細書の例に示さ
れているが、熟練者にはよく知られているいくつかの精製技術を使用して実施す
ることが出来る。

【００３４】 ある例では、精製の前にα₂δ-1サブユニットポリペプチドにタグを付ける必
要がある。タグはほとんどの場合ポリペプチドを発現するのに必要なヌクレオチ
ド配列のなかにコードされる。そのようなタグの例としては、C-myc, FLAGをコ
ードしている配列に限定することなく、ヒスチジン残基の連続、ヘマグルチンA,
V5, XpressあるいはGSTなどがある。これらのタグのほとんどは、例えばPCR
増幅プライマーの一つの中に解読配列を取り込むPCR増幅により、配列の中に直
接取り込むことができる。しかし、タグは、ポリペプチド配列をコードする核酸
配列の5'あるいは3'末端にタグ分子をコードする適切な核酸配列を共有結合する
するというような、他の方法によっても導入すことができる。GSTの場合が該当
する。タグはポリペプチド配列のいずれかの末端に付け得ることに注意しなけれ
ばならない。さらに、ある場合には、必要な時にはタグ配列を除去できるように
タグとポリペプチド配列の切断サイトに挿入するのが有利である。したがって、
本発明の本発明の第一の目的は、C-myc, FLAG，ヒスチジン残基連続、ヘマグル
チンA, V5, XpressあるいはGSTタグを、α₂δ-1の精製及びスクリーニングに
使用することである。望ましくは、SEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、37
または38のα₂δ-1の精製及びスクリーニングに、C-myc, FLAG，ヒスチジン残
基連続、ヘマグルチンA, V5, XpressあるいはGSTタグを使用すること。より望
ましくは、ヒスチジン残基連続を、SEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、37
または38のα₂δ-1の精製及びスクリーニングに使用すること、さらに望ましい
のは、6ヒスチジン残基連続をSEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、37また
は38のα₂δ-1の精製及びスクリーニングに使用すること、そして最も望ましい
のは、C-末端6ヒスチジン残基タグをSEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、3
7または38のα₂δ-1の精製及びスクリーニングに使用すること。

【００３５】 本発明の第二の（secont）目的は、C-myc, FLAG，ヒスチジン残基連続、ヘマ
グルチンA, V5, XpressあるいはGSTタグをコードする核酸を、発現したα₂δ-
1の精製及びスクリーニングに使用することである。望ましくは、C-myc, FLAG
，ヒスチジン残基連続、ヘマグルチンA, V5, XpressあるいはGSTタグをコード
する核酸を、SEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、37または38の発現したα ₂ δ-1の精製及びスクリーニングに使用すること。より望ましくは、ヒスチジン
残基連続タグをコードする核酸を、SEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、37
または38の発現したα₂δ-1の精製及びスクリーニングに使用すること、さらに
望ましくは、6ヒスチジン残基連続タグ配列をコードする核酸配列（sewuence）
を、SEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36、37または38の発現したα₂δ-1の
精製及びスクリーニングに使用すること、そして最も望ましくは、6ヒスチジン
残基タグをコードするC-末端核酸配列をSEQ ID N°30、31、32、33、34、35、36
、37または38の発現したα₂δ-1の精製及びスクリーニングのために使用するこ
と。

【００３６】 その他の場合には、ポリペプチドにタグをつけることは必要ない。例えば、特
異的モノクロナール抗体を固定したアフィニティーカラムを使用してタンパク質
を精製することが出来る。

【００３７】 発明の二番目の態様では、α₂δ-1サブユニットポリペプチドは部分的に精製
されるだけである。例えば、イオン交換樹脂クロマトグラフィーカラムのような
適切なクロマトグラフィーマトリックスを使用して、混入している他のタンパク
質と一緒に精製されることがある。このような場合には、関心の求めるポリペプ
チドにタグを付ける必要はない。

【００３８】 発明者らが意図する最も望ましい態様は、精製され、タグを付けられたα₂δ-
1サブユニットポリペプチドの使用に関するものである。特に望ましいタグは、2
〜10、望ましくはSEQ ID N°37のポリペプチドの中に組み込んである6ヒスチジ
ン残基をコードするヌクレオチド配列である。

【００３９】 ポリペプチドは、熟練者によく知られている種々のベクターシステムを使用し
て、適切な宿主細胞のなかで対応する核酸分子の発現により調製することが出来
る。適する細胞の典型例は、バクテリア、酵母、哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む
）、昆虫細胞などのような原核細胞及び真核細胞である。ベクターは、プラスミ
ド、ウイルス、エピソーム、ファージなどである。例に示されているように、ポ
リペプチドは例えばバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞内で核酸の発
現により生産することができる。

【００４０】 本発明のカルシウムチャネルα₂δを発現する最も望ましいシステムはバキュ
ロウイルス/昆虫細胞システムである。この発現システムは可溶型のみを生産し
、昆虫細胞は接着せずに培養できるので使用が容易であり、そして生産収率が高
い。したがって、このシステムは本発明のカルシウムチャネルα₂δの大量生産
を可能にし、そのためスクリーニング、特にハイスループットスクリーニングの
ためのこの目標化合物調製に特別適している。

【００４１】 本発明のスクリーニングアッセイにおいて後に使用されるα₂δ-1サブユニッ
トポリペプチドに関して、いくつかの可能性を熟練者に公開する。

【００４２】 最初にそして望ましい態様において、α₂δ-1サブユニットポリペプチドは上
記に言及したタグの中から選択されたタグ分子を含んでいる。そのようなタグの
ついたポリペプチドは、SPAあるいはフラッシュプレートアッセイにおいて特に
有用である。望ましいタグは上記に言及したヒスチジン残基をコードするヌクレ
オチド配列である。

【００４３】 二番目の態様において、α₂δ-1サブユニットポリペプチドはタグなしで使用
することが出来る。例えば、小麦胚芽レクチンでコートしたビーズあるいはプレ
ートを使用したSPAあるいはフラッシュプレートアッセイにおける例がこれに当
たる。この態様においては、α₂δ-1サブユニットポリペプチドの炭水化物分子
が小麦胚芽レクチンでコートしたビーズあるいはプレートに直接結合するので、
タグは必要ない。

【００４４】Ｂ−α₂δ-1サブユニットポリペプチドに結合する標識化合物 α₂δ-1結合サイトが [³H]ギャバペンチン結合サイトである場合には、使用し
得る望ましい標識化合物は勿論ギャバペンチンそれ自身である。しかし、ギャバ
ペンチンはこの関係で使用し得る唯一の標識化合物ではない。事実、ブタシナプ
スプラズマ大脳皮質膜における飽和結合分析はL-ロイシンの存在下に行われ、ア
ミノ酸と[³H]ギャバペンチン結合サイトの競合的相互作用を生じ、[³H]ギャバペ
ンチンのそのサイトに対する結合親和性が著しく減じること、が既に示されてい
た。発明者らは、この競合的相互作用は、下記表に列記した全てのアミノ酸に当
てはまると確信している。 （表１） ブタ大脳皮質の[³H]ギャバペンチンサイトに対する、選択されたアミノ酸（IC₅₀ ＜500nＭ）の結合親和性化合物 IC₅₀ (nＭ)算術平均（N=3）±標準誤差 ギャバペンチン 42.1±5.5 L-ノルロイシン 23.6±6.7 L-アロ−イソロイシン 32.8±6.0 L-メチオニン 49.6±10.0 L-ロイシン 61.3±20.9 L-イソロイシン 68.8±1.9 L-バリン 330 ± 18 L-フェニルアラニン 351 ± 89

【００４５】 したがって、ギャバペンチンの代わりに、これらの高親和性リガンドの市販標
識型を使用することが可能である。[³H]L-ロイシンの有用性は、フィルターバイ
ンディングアッセイ及びフラッシュプレートアッセイ方式において例示された。
発明者らは、バインディングアッセイにおいて多分500nＭ以下で親和性を示す標
識アミノ酸及びその他の化合物は、ギャバペンチンの代わりに使用できると確信
している。

【００４６】 標識に関して、本発明の関係ではいくつかの態様が使用され得る。望ましい
標識は勿論放射能標識であり、そのリストはこの明細書のなかで提供される。

【００４７】 本発明の一つの目的は、α2δ-1に結合するリガンドをスクリーニングするた
めに、α2δ-1のギャバペンチン結合サイトに対して500nm以下の親和性を有する
標識化合物を使用することである、望ましくは標識したギャバペンチン、L-ノル
ロイシン、L-アロ-イソロイシン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン
、L-バリンまたはL-フェニルアラニン、より望ましくは標識ギャバペンチンを使
用することである。

【００４８】Ｃ-アッセイ様式及び条件 本発明の方法を実施するためにいくつかのアッセイ様式を使用することが出来
る。望ましいアッセイ様式は、シンチレーションプロキシミティーアッセイ（SP
A）あるいはフラッシュプレートアッセイのようなシンチレーションアッセイで
ある。本技術分野の熟練者に良く知られている、フィルターバインディングアッ
セイ及び遠心アッセイのような、その他の様式も本発明において考慮されている
。

【００４９】 SPA及びフラッシュプレートアッセイは本発明にとって望ましいアッセイ様式
である。これらのアッセイの詳細を下記に提供する。

【００５０】シンチレーションアッセイ様式 シンチレーションアッセイ技術は、シンチレーションビーズ（SPAアッセイ用
）あるいはプレート（フラッシュプレートアッセイ用）の使用を包含している。
SPAビーズは通常セリウム処理イットリウムイオンシリカ（y2SiO5:Ce）またはポ
リビニルトルエン（PVT）いずれかから製造され、PPOのような有機発光体を含有
している。広く使用されているプレートはNiキレートフラッシュプレートのよう
なものであるが、その他のフラッシュプレートも使用することが出来る。

【００５１】 アッセイは通常、水性環境に容易に発散される低エネルギー放射をする³H、^{12 5} I、¹⁴C、³⁵Sまたは³³Pのような放射性アイソトープを使用して、バッファー水
溶液中で行われる。例えば、³Hによって放射された電子はわずか6keVの平均エネ
ルギーしか持たずまた水中では非常に短い到達距離（-1〜tm）である。もしこれ
らのアイソトープで標識された分子がビーズあるいはプレートの表面に結合する
と、直接にかあるいは予めビーズまたはフラッシュプレートに結合させた他の分
子と相互作用するかして、放射線が発光体を活性化し、光を発する。発せられた
光の量は、ビーズに結合した標識分子の量に比例し、簡便に液体シンチレーショ
ン（LS）カウンターで測定できる。もし標識分子がビーズまたはフラッシュプレ
ートに結合しなければ、その放射エネルギーはビーズに到達する前に周囲の水性
溶媒に吸収され、光を発しない。したがって、結合したリガンドは発光信号を生
じるが、遊離リガンドは生じない、そして、通常の放射性リガンドバインディン
グアッセイの特徴である時間を浪費する分離工程が必要でなくなる。このアッセ
イに必要な操作は、優れた精度及び再現性をもたらすわずかな簡単なピペッティ
ング段階に簡略化される。

【００５２】 本発明に関してSPA及びフラッシュプレートアッセイを実施する条件は以下に
示す。

【００５３】シンチレーションアッセイ条件 1）SPAアッセイ 放射性リガンドが可溶性分泌型α₂δ-1サブユニットポリペプチドに結合する
条件を最適化するために、最初はSPAアッセイの検討が行われる。Amershamビー
ズを使用した典型的SPAアッセイにおいて放射性リガンド結合を最適化するため
に変化させることができるパラメーターは、アッセイ温度、α₂δ-1サブユニッ
トポリペプチドの放射性リガンド及びSPAビーズとの相互作用、放射性リガンド
の濃度並びにｐH変動などである。

【００５４】 アッセイが行われる温度は、1〜30℃まで変えることが出来る。望ましい温度
は18〜23℃の範囲であり、21℃が最も望ましい温度である。α₂δサブユニット
ポリペプチドとSPAビーズの相互作用はポリペプチドの濃度を調節すること、及
びこの相互作用に適する試薬を導入することにより最適化することが出来る。50
mgのAmershamビーズを使用したときは、α₂δ-1サブユニットポリペプチド濃度
はウエル当たり0.1〜10 pmolesまで変えてよいが、最適な濃度は一般的にウエル
当たり約5〜6 pmolesである。

【００５５】 α₂δ-1サブユニットポリペプチド及び放射性リガンド並びにAmersham SPAビ
ーズの相互作用を支援する試薬に関して、発明者らは、α₂δ-1サブユニットポ
リペプチドが6ヒスチジン残基を含むアミノ酸配列でタグされている場合には、
イミダゾールがその目的に有効に使用できることを発見した。さらに重要なこと
は、イミダゾールが放射性リガンドのα₂δ-1サブユニットポリペプチドへの結
合を促進することである。

【００５６】 放射性リガンドの結合を促進するために使用されるイミダゾールの最適濃度は
、アッセイに使用されたα₂δ-1サブユニットポリペプチドの濃度によって変化
する。例えば、α₂δ-1サブユニットポリペプチドの容量が約20μl（0.6 pmol/u
l濃度のα₂δ-1サブユニットポリペプチド）である時は、10〜50 ｍＭの範囲の
イミダゾール濃度が使用され、10〜30 ｍＭの範囲の濃度が望ましい。最も望ま
しいイミダゾール濃度は20 ｍＭである。イミダゾールのような他の化合物も放
射性リガンドの結合促進に使用出来ることは注意すべきである。さらに、pH変動
は放射性リガンド結合に影響し得るが、α₂δ-1サブユニットポリペプチドの構
造配置に影響するので、pH変動については綿密に監視しなければならない。放射
性リガンド結合を促進するのにイミダゾールの使用は望ましいものではあるが、
この技術の熟練者は、イミダソールの使用が望ましいものであるが絶対必要なも
のではないことを知っている。

【００５７】 放射性リガンドの濃度は、アッセイ液中に存在するα₂δ-1サブユニットポリ
ペプチドとの関係において評価される。一般的に、放射性リガンドの濃度は1 n
Ｍ〜100 nＭまで変動する。望ましい[³H]ギャバペンチン濃度は約5〜20 nＭであ
り、最も望ましいのは約10 nＭである。[³H]ギャバペンチンと同程度の親和性を
有する他の放射性リガンドの濃度は、やはり約5〜20 nＭの範囲内にあるはずで
ある。

【００５８】 最適の放射性リガンドの結合条件が決定したら、テストするリガンドを放射性
リガンドの置換程度を評価するためにアッセイ液に加える。アッセイ液中に加え
るテストリガンドの濃度は、通常0.1 nＭ〜約100 μＭまで変動する。ハイスル
ープットスクリーニングアッセイにおける出発点としては、望ましいテストリガ
ンド濃度は約10 μＭである。そして、ヒット数により、低下あるいは増加させ
る。

【００５９】 Amersham SPAビーズを使用した典型的なSPAアッセイのために評価した、上記
で説明したパラメーターは、例えば異なるタイプのSPAビーズを使用した場合な
どには、熟練者により調節することが出来ることは、注意すべきである。

【００６０】2）フラッシュプレートアッセイ SPAと同様に、放射性リガンドがα₂δ-1サブユニットポリペプチドに結合する
条件を最適化するためにフラッシュプレートを検討する。NEN Niキレートフラ
ッシュプレートまたは小麦胚芽レクチンフラッシュプレートを使用する典型的フ
ラッシュプレートアッセイにおいて放射性リガンド結合を最適化するために、変
化させることが出来るパラメーターは、やはり温度、放射性リガンド及びフラッ
シュプレート両者とのα₂δ-1サブユニット相互作用、放射性リガンド濃度並び
にpH変化である。

【００６１】 アッセイが実施される温度は1〜30℃まで変化し得る。望ましい温度範囲は18
〜23℃までの範囲であり、最も望ましい温度は21℃である。

【００６２】 α₂δ-1サブユニットポリペプチドとフラッシュプレートの相互作用は、ポリ
ペプチドの濃度調節及びこの相互作用を円滑に進める試薬の導入によって最適化
することが出来る。標準のNEN Niキレートフラッシュプレートを使用した場合
には、α₂δ-1サブユニットポリペプチドの容量は通常0.6 pmol/μl濃度のα₂δ
-1サブユニットポリペプチド0.5及び20μlの間で変化する。公表されているNEN
プレートの最大結合容量はウエル当たり約6 pmolであるから、発明者らは、α₂
δ-1サブユニットポリペプチドの最適濃度は多分ウエル当たり約5 pmol, 8μl
周辺と考える。

【００６３】 放射性リガンド結合を促進するのにイミダゾールの使用は望ましいものではあ
るが、この技術の熟練者は、イミダソールの使用が望ましいものであるが絶対必
要なものではないことを知っている。

【００６４】 α₂δ-1サブユニットポリペプチド及び放射性リガンド並びにフラッシュプレ
ートの間の相互作用を円滑にする試薬に関して、発明者らは、α₂δ-1サブユニ
ットポリペプチドが6ヒスチジン残基を含むアミノ酸配列でタグされている場合
には、イミダゾールがその目的に有効に使用できることを発見した。また、イミ
ダゾール濃度が本質的にα₂δ-1サブユニットポリペプチドと放射性リガンドの
結合を促進することも発見した。放射性リガンド結合を促進するために使用され
る最適イミダゾール濃度は、アッセイに使用されるα₂δ-1サブユニットポリペ
プチドの濃度によって変化する。例えば、α₂δ-1サブユニットポリペプチドの
容量が約10μl（0.6 pmol/μl濃度のα₂δ-1サブユニットポリペプチド）の場合
、最適イミダゾール濃度は1及び20 ｍＭの間で変化することが出来、約10 ｍＭ
の濃度が望ましい。既に述べたように、ヒスチジンのような他の化合物及びpH変
化は放射性リガンド結合促進に使用することが出来る。

【００６５】 放射性リガンドの濃度は、アッセイ液中に存在するα₂δ-1サブユニットポリ
ペプチドの濃度との関係で評価される。一般的に、放射性リガンドの濃度は1 n
Ｍ〜100 nＭまで変化する。望ましい[³H]ギャバペンチン濃度はやはり約5〜20 n
Ｍ、最も望ましい濃度は約10 nＭである。望ましい[³H]ロイシン濃度はやはり約
5〜20 nＭ、最も望ましい濃度は約10 nＭである。[³H]ギャバペンチン及び[³H]
ロイシンに近い親和性を有する他の放射性リガンドの濃度はやはり約5〜20 nＭ
の範囲にあるはずであるということは言及すべきことである。

【００６６】 至適のリガンド結合条件が決定したら、放射性リガンドの置換レベルを測定す
るために、アッセイ液の中にテストリガンドを導入することが出来る。アッセイ
液の中に導入するテストリガンドの濃度は、通常0.1 nＭ〜100μＭまで変化する
。約10μＭの望ましいテストリガンド濃度は、通常ハイスループットスクリーニ
ングアッセイにおける開始点である。次いで、得られたヒット数に応じて、増減
する。

【００６７】 発明者らは、特殊な放射性リガンド、[³H]ギャバペンチン、の(Ｓ+)-3-イソブ
チルギャバ、(Ｒ-)−3-イソブチルギャバ及びギャバペンチンによる置換を試験
した。データは下記の例に示すが、このアッセイはハイスループット競合試験に
使用できることが明らかである。

【００６８】例1 SEQ ID N°37の推定可溶性ブタα₂δ-1欠失変異体をコードするヌクレオチド
配列の構築a)プライマーデザイン PCRプライマーは、SEQ ID N°37の可溶性ブタα₂δ-1欠失変異体を発現するた
め、下記のようにデザインした： 5'PCRプライマー：これは解読配列に先行するKOZAK翻訳開始共通配列に工作さ
れるようにデザインされた(Kozak JBC 266 19867-19870)。 3'PCRプライマー：これは解読配列の望む位置に6ヒスチジン残基に続く終止コ
ドンに工作するようにデザインされた。終止コドンに加えて、α₂δ-1プライマ
ーはEco RI制限サイトも含んでいる。

【００６９】 各プライマー配列の中の目立つ領域を「タグ」（tagged）領域という；鋳型に
存在しない配列の追加。プライマーは、注文生産により Perkin Elmer Applied
Biosystems UKからABI純度で供給され、凍結乾燥され、次いで 10mＭ TE.中に15
μＭ濃度に懸濁した。JB197 and 198は 5'リン酸基を付けずに供給した: 5' primer JB189 (5'-TCGCCACCATGGCTGCTGGCTGCCTGCTG-3', SEQ ID N°20) 3' primer JB195 (5'-TCGGAATTCCTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGAAACACCACCACAGTCG
GT-3', SEQ ID N°21)。b) α₂δ-1欠失変異体を発生するためのPCRプロトコール 1)pcDNA3-porcine-α₂δ-（＋）PCRテンプレートの発生 オリゴdT-プライムλgt10ブタ大脳皮質cDNAライブラリーを、プローブとして
ウサギ骨格筋α₂δクローンの2,381-bpHindIII fragment（解読配列268-2649）
を使用して、ECL（Amersham）によりスクリーニングした。正挿入を確認し、pB-
PC-α₂δ-1.1を発生するために、pBluescript-SK-(+)にサブクローンした。クロ
ーンは、クローンの一端にある、ミトコンドリアCオキシダーゼに非常に高い相
同性を有している、711-bpストレッチ（stretch）以外は、両方の鎖に配列した
。α₂δコード領域はヒト神経α₂δ配列の3'領域と相同であったが、5'コード配
列の926bpを欠失していた。失われた配列は、ブタ大脳皮質から調製した全RNAを
使用して5'-RACEにより得た。RACEは、知られているα₂δ配列（ウサギ（access
ion no.Ｍ21948）,ラット（accession number Ｍ86621）, ヒト（accession
no.Ｍ76559））に特有のBgl Iサイトにわたって実施した。 5'-RACE生産物から由来した配列は、cDNAの5'非翻訳末端に特異なプライマー（J
B042, 5'-GGGGATTGATCTTCGATCGCG-3'; SEQ ID N°18）のデザインに使用した。
次いで、PCRはJB042及びBgl Iサイトの下流プライマー（JB040, CTGAGATTTGGGG
TTCTTTGG, SEQ ID N°19)を使用してPfu DNAポリメラーゼにより行った。 PCR生成物をEco RIリンカー (5'-GGAATTCC-3')に連結し、次いでEco RI及び B
gl Iで消化した。1,564-bpフラグメント (α₂δcDNAの5' 部分)をゲル精製した
。

【００７０】 同様に、pB-PC-α₂δ-1.1を Bgl I及び Eco RIで消化した後、2,303-bpフラグ
メント (α₂δcDNAの3'部分)を単離した。α₂δcDNAの2個のフラグメントをEcoR
I-消化 pcDNA3にスリーウエイ連結（three-way ligation）した。クローンは、
サイトメガロウイルスプロモーター(pcDNA3-PC-α₂δ-(+))に関して正方向の全
長α₂δ配列により取出した。

【００７１】 2)PCRプロトコール 「下」及び「上」とラベルを付けた2種の混合液を作製するために次の試薬を加
えた。

【００７２】下 μl 10x Pfu DNAポリメラーゼバッファー 25 10mＭ dNTP's 5 100ng/μl pcDNA3-ブタ-α₂δ-(+) 10 15μＭ JB189 8.5 15μＭ JB195 8.5 水 193

【００７３】上 μl 10x Pfu DNAポリメラーゼバッファー 25 水 220 2.5units/μl Pfu DNAポリメラーゼ 5

【００７４】 50μlの下バッファーを0.5mlエッペンドルフ試験管のそれぞれに加えた。試験
管を2分間80℃に加熱し、次いで4℃に冷却した。50μlの上バッファーを各試験
管に加えた。次いで、試験管をRobo-Cycler上で次の条件でサイクルした：98^oC
/ 1分30秒、次いで98^oC / 45秒、54^oC / 2分、72^oC / 6minを20回、次いで72^oC
/ 20分、次いで4^oCを維持。

【００７５】 3228bpPCR生成物を、次いでQIAquick PCR精製カラム (Qiagen)で精製し、61μ
lの水で溶出した。溶出したDNAに次の試薬を加えた：0.7μl 10mＭ ATP、 7μl
10xポリヌクレオチドキナーゼバッファー、 1μl 1unit/μlポリヌクレオチドキ
ナーゼ。

【００７６】 上記5'リン酸化反応を37℃、1時間インキュベートした。反応を65℃、10分間
でインキュベートして停止した。次いで、3228bp 5'リン酸化PCR生成物を、QIA
EX (Qiagen) ビーズを使用した1% 寒天ゲルで精製し、〜50μlに溶出した。

【００７７】例2 例1のPCRフラグメントのバキュロウイルス転位ベクターpFastBaclへのクロー
ニング 例1のPCR生成物（6Hisタグ付きブタα₂δ-1b：SEQ ID No9をコードした3228bp
JB189/195由来PCR生成物）を、 the Rapid DNA ligation kit (Roche Diagnosti
cs)を使用しXL1-blue (α₂δ-1b) E. Coli細胞を形質転換して、 Stu I 消化
し、子ウシ小腸ホスファターゼで脱リン酸化し、フェノールクロロホルムで抽出
し、そしてWIAEXゲル精製したpFastBac1 (Life Technologies) 中にクローン化
した。

【００７８】a) 正リコンビナントのスクリーニング 平滑末端連結によってPCR生成物がクローン化されたとすると、pFastBac1中の
ポリヒドリンプロモーターに関して正の（positive）方向に連結した遺伝子を持
つリコンビナントを選ぶためのスクリーニングが必要になる。これは、コロニー
ミニカルチャー及び1％TAEアガロースゲル上の分析により調製される miniprep
DNA (Qiagen miniprep kit)の限定消化によって達成できた。正クローンは下記
の消化パターンにより同定した：

【００７９】 pFastBac1中の SEQ ID N°9 miniprep DNA上で実施した Eco RI消化 予測断片 (bp) 正方向にクローンしたPCR生成物 4773及び3230 逆方向にクローンしたPCR生成物 7989及び 14

【００８０】b)選択されたクローンの配列分析 このクローン用に1正クローンが選択され、求める構築(QIAGEN maxi kit)のプ
ラスミドDNAストックを作るために使用された。配列確認反応は、 Big Dye term
inator sequencing kitを用いて行い、 ABI 310 Prism Genetic Analyzerにかけ
た。両コード鎖の配列分析はオリゴヌクレオチドプライマー配列選択を使用して
実施し、下記の結果を得た： pFBac-Porcine-s-α₂δ-1-Δ1064-1091-6His配列分析の結果、挿入配列は、5'
PCRプライマー（JB189）の5'末端から2塩基の欠失を除いては、SEQ ID No 37の
ポリペプチドをコードする核酸に対応することが確認された。この2塩基の欠失
は、KOZAK翻訳開始サイト共通配列(GCCACC)は欠失の直後から始まっているので
、遺伝子の5'末端に対する影響はない。

【００８１】例3 SEQ ID N°9のα₂δ-1欠失変異体を発現するためのバキュロウイルスバンクを
確立するためのプロトコール 本質的に、バキュロウイルスバンクを確立するのに使用されるプロトコールは
、the Life Technologies Bac-to Bac(登録商標)バキュロウイルス発現システム
マニュアル（baculovirus expression systems manual）に要約されているもの
である。

【００８２】a)DH10Bac E Coli細胞の転位 SEQ ID No 37のブタα₂δ-1欠失変異体をコードするヌクレオチド配列を含む
リコンビナントpFastBac1構築の1 ng (5μl)を100μlの氷上で解凍したDH10Bac
細胞に加えた。細胞は試験管を軽くたたいて穏やかに混合し、次いで30分間氷上
でインキュベートし、次いで42℃水浴中45秒間インキュベーションすることによ
り熱ショック処理をした。混合物を氷上で2分間冷却し、次いでS.O.C.液900μl
を加えた。混合物を振とう培養器（200rpm）に37℃で4時間かけた。細胞は系統
希釈（10^-1〜10^-3まで10倍希釈）し、各希釈の10μlを50μg/mlカナマイシン、
7μg/mlゲンタマイシン、 10μg/mlテトラサイクリン、 100μg/ml Bluo-gal及
び40μg/ml IPTGを含むLB寒天プレートに加えた。青色及び白色の分離したコロ
ニーが識別できるようになるまで、プレートを37℃で1〜3日間培養した。

【００８３】b)リコンビナントDNAの分離 白色コロニー（リコンビナントbacmidを含有）を取出し、24時間（定常期まで
）37℃で50μg/mlカナマイシン、 7μg/mlゲンタマイシン及び10μg/mlテトラサ
イクリンを含むLB２ml中で振とう（200rpm）培養した。培養液1.5mlをミクロ遠
沈管に移し、1分間14,000×gで遠心分離した。上清を除き、細胞を 0.3ml of 15
mＭ Tris-HCl (pH8.0)に緩和に懸濁し、 10mＭ EDTA, 100μg/ml RNase A. 0.3m
l of 0.2N NaOH, 1% SDSを加え、そして混合物を22℃で5分間インキュベーショ
ンした。次いで0.3mlの3Ｍ酢酸カリウム（pH5.5）を加え、検体を10分間氷上に
置いた。14,000×gで10分間遠心分離した後、上清をイソプロパノール0.8mlが入
った試験管に移し、混合し、10分間氷上に置き、次いで14,000×gで10分間遠心
分離した。上清を捨て、ペレットを0.5mlの70％エタノールで洗い、次いで14,00
0×gで5分間遠心分離した。この70％エタノール洗浄を繰り返し、上清を除き、
室温で10分間ペレットを空気乾燥した。ペレットは最終的に40μlのTEに再懸濁
した。

【００８４】c) sf9細胞へリコンビナントbacmid DNAの移入 6-ウエル組織培養プレートに、35mmウエル当たり0.9×10⁶ sf9細胞（0.3×10 ⁶ cell/mlの継代培養からログフェーズに成長した細胞）を50units/mlペニシリ
ン及び50μg/mlストレプトマイシン を含有する Sf-900 II SFM液 2ml中にまい
た。細胞は27℃で1時間接着させた。上記のように調製されたbacmid DNA（5μl
）を、6μlの CELLFECTINを含有するSf-900 II SFM液の200μlに加え、混合し、
次いで室温で45分間インキュベーションした。細胞を一度抗生物質を含まないSf
-900 II SFM液 2mlで洗い、次いでSf-900 II SFM液0.8mlをlipid-DNA複合体の入
った各チューブに加えた。細胞から洗浄バッファーを除き、細胞の上に希釈した
lipid-DNA複合体の1mlを重層した。細胞を27℃で5時間培養し、その後遺伝子導
入混合物を除去し、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンを含
む Sf-900 II SFM液2mlを加えた。次いで細胞を72時間培養した。

【００８５】 72時間培養後、細胞から液を除去し、500×gで5分間遠心分離した。上清は新
しい試験管に移した、これにはP0 bankとしてラベルを貼り、暗所4℃で保存した
。P1 bankは、約5×10⁶ cell/ml〜 2×10⁶cell/mlの継代sf9細胞（250ml Erlenm
eyerフラスコ中100ml）により調製し、上記で得られたP0 bankの0.5mlを加えた
。細胞は次いで27℃で4日間振とう（200rpm）培養した。無菌状態で、培養混合
物は500×gで10分間遠心分離し、上清0.2μＭを濾過した（P1 bank）。P2 bank
は、上記のように2×10⁶cell/mlに継代した400ml培養（１L Erlenmeyerフラスコ
）につき2mlのP1 bankを加えることにより調製した。培養は上記のように4日間
インキュベートし、上清を回収し、P1 bankについて記述したように濾過した。
上清を集め、等分し（10ml）4℃で保存した。

【００８６】例4 タンパク質発現 Sf-900 II SFM液中で約5×10⁶ cell/ml〜 2×10⁶cell/mlの継代sf9細胞に、適
切なウイルスバンクのウイルスを100mlの細胞当たり0.1ml加えた（1L Erlenmeye
rフラスコ中400ml）。細胞を27℃で4-5日間110rpmで振とう培養した。タンパク
質の発現は、抗penta-Hisモノクロナール抗体（Qiagen）を用いてSDS-PAGE及びW
esternブロッティングにより確認し、培養上清及び細胞分解物に検出した。

【００８７】例5 SEQ ID N°37のα₂δ-1欠失変異体の精製 SEQ ID N°37のα₂δ-1欠失変異体は細胞分解物から下記に要約される精製法
にしたがって精製した： 培養を6,000×gで10分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレット重量を測
定し、20mＭ Tris pH8.0、100mＭKCl、1% P40-Nonidet (100ml/20g湿細胞)に再
懸濁した。プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma, Cat# P8849)、1ml/L、
を混合物に加えた。溶液を10分間攪拌し、次いで1時間4℃、30,000×gで遠心分
離した。上清は約300mlに濃縮し（30ｋDaカットオフ）、次いで1時間100,000×g
で遠心分離した。

【００８８】 可溶性タンパク質を含有する上清は、1:3に 10mＭ Tris-HCl pH8.0 (平衡バッ
ファー) で希釈し、そして予め平衡させた Q-Sepharoseカラム (2.5cm内径 x 30
cm高)にかけ、流量 900ml/hで流した。安定したA_280nmベースラインが得られる
まで平衡バッファーで洗浄した後、タンパク質は 20mＭ Tris-HCl pH8.0、0.5Ｍ
KCl、10mＭイミダゾールで溶出した。

【００８９】 溶出液は、20mＭ Tris pH8.0、0.5Ｍ KCl、10mＭイミダゾールで予め平衡化し
たNi-NTA (Qiagen) カラム (2.5cm内径 x 6cm高)にかけ、 流量 2 ml/minで流し
た。カラムを順次バッファー A (20mＭ Tris pH8.0、 0.5Ｍ KCl、20mＭイミダ
ゾール)、 バッファー B (100mＭ Tris-HCl pH8.0、 1Ｍ KCl), そして再びバ
ッファー Aで洗浄した。溶出はバッファー C (20mＭ Tris-HCl pH8.0、100mＭ
KCl、0.5Ｍイミダゾール)で行った。Ni-NTA溶出液（〜50ml）は〜2mlに濃縮し
（30kDaカットオフ）、1ml/minの流量で、 10mＭ HEPES、pH7.4、150mＭ NaClで
平衡化した FPLC Superdex-200カラムにかけ、 0.2mlずつ分取した。SEQ ID No
37のポリペプチドを含むフラクションを集めた。図1に示すように、タンパク質
プロフィール及び関係する[³H]ギャバペンチン結合活性は、〜130kDaバンド（α ₂ δ）を平行エリューションした銀染色SDS-PAGEゲル（Sephadex-200のNi NTA負
荷後）と共に[³H]ギャバペンチン結合活性及びA_280nmプロフィールを示した。

【００９０】例6 可溶性ブタα₂δ-1b-6Hisに対する[³H]ギャバペンチン結合のSPAアッセイ アッセイは21℃で実施した。アッセイ成分は下記の順に加えた（全ての試薬は
10mＭ HEPES、pH7.4、21℃、で希釈して、96ウエルOptiplateに）： 25μl 種々の濃度のイミダゾール（1Ｍストック pH8.0から希釈、アッセイの 詳細を参照） 50μl 10mＭ HEPES pH 7.4 25μl (50mg) SPAビーズ (Amersham) 100μl 例5から得たSEQ ID No 9のs-α₂δ-1b-6His(2μlタンパク質を100μl に希釈) 25μl 放射性リガンド ([³H]ギャバペンチン)。

【００９１】 放射性リガンドを加えた直後に、optiplateをPackard Top Count scintillati
on counterにのせ、結合タイムコースを追跡した。タンパク質の6HisタグとSPA
ビーズの特異的相互作用を最適化するために最初はアッセイにイミダゾールを使
用した。イミダゾール自身（100 mＭまで）はフィルトレーションアッセイにお
いて、[³H]ギャバペンチン結合に対して影響しなかった（n=1）。

【００９２】 図2に示したように、α₂δ-1b-6Hisに対する[³H]ギャバペンチンの特異的結合
はイミダゾールにより促進された。試験された最適濃度は50mＭであった。〜2時
間後に平行に達した。

【００９３】例7 可溶性ブタα₂δ-1b-6His（SEQ ID No 37）に対する[³H]ギャバペンチン結合
のNiフラッシュアッセイ アッセイは21℃で、96-ウエルNEN Niキレートフラッシュプレート中最終容量2
50μlで実施した。アッセイ成分は下記の順に加えた（全ての試薬は10mＭ HEPE
S、pH7.4、21℃、で希釈）： 25μl 10mＭ HEPES pH7.4 25μl 種々の濃度ノイミダゾール（1Ｍストック pH8.0から希釈、アッセイの 詳細を参照） 75μl 10mＭ HEPES pH 7.4 100μl 例5から得たs-α₂δ-1b-6His (2μlタンパクを100μlに希釈) 25μl 放射性リガンド ([³H]ギャバペンチン)

【００９４】 放射性リガンドを加えた直後に、フラッシュプレートをPackard Top Count sc
intillation counterにのせ、結合タイムコースを追跡した。「[³H]フラッシュ
プレート」プログラム（cpm）を活性の監視に使用した。イミダゾールは、タン
パク質の6Hisタグと最初Niフラッシュプレートの特異な相互作用を最適化するた
めにアッセイに使用した。イミダゾール自身は（100mＭまで）フィルトレーショ
ンアッセイにおいて[³H]ギャバペンチン結合に影響しなかった（ｎ＝1）。

【００９５】 図3に示すように、α₂δ-1b-6Hisに対する[³H]ギャバペンチンの特異的結合は
イミダゾールにより促進された。初めて、試験した濃度から、最良の濃度は10m
Ｍであることが判明した。 特異的結合をα₂δ-1b-6Hisの種々の容量で、10mＭイミダゾールの存在下、10
時間にわたって測定した。結果は図4に示した、そして〜3時間で平衡に達した。
特異的結合は、タンパク質の容量の増加にしたがって直線的に8μlまで増加し、
その後は多分アッセイウエル中のNiキレートの能力を超えたようである（図5参
照）。公表されているNENプレートの最大結合能力は６pmol/wellである。精製α ₂ δ-1b-6Hisの濃度は〜0.6pmol/μl、8μlで5 pmol/ウェルである。

【００９６】 飽和実験を、[³H]ギャバペンチン濃度〜1から350ｎＭの範囲の重複12ポイント
データで実施した。データはWindows（登録商標）用KEL-RADLIGを使用して解析
した。結果を下記表2に示した。 （表2） 飽和実験

【００９７】例8 可溶性ブタα₂δ-1b-6Hisに対する[³H]ロイシン結合のNiフラッシュプレート
アッセイ [³H]ギャバペンチンを25μl（10.1nＭ）の[³H]ロイシンで置き換えた以外は、
例2に記載した手順を繰り返した、図8に示すように、[³H]ロイシンは可溶性α₂
δ-1b-6Hisに対して高い親和性で結合する。このことは、[³H]ギャバペンチンの
代わりに[³H]ロイシンの市販品をアッセイに使用できることを示している。

【００９８】例9 ブタα₂δ-1b-6His（SEQ ID No 9）に対する[³H]ギャバペンチン、(S+)-3-イ
ソブチルGABA及び（R-）-3-イソブチルGABAの競合結合を調べるNiフラッシュア
ッセイ アッセイは21℃で96-ウエルNEN Niキレートフラッシュプレート中最終容量25
0μlで実施した。ウエルは「総」及び「非特異的」の両者ようにセットアップし
た。特異的結合は、「総」結合値の平均から「非特異的」結合値の平均を差し引
いた残値と定義される。アッセイ成分は下記の順に加える（全ての試薬は10mＭ
HEPES(pH7.4、21℃)）： 25μl 10mＭ HEPES pH7.4又はHEPES中適切な濃度の試験化合物 25μl 25μl 200 mＭノイミダゾール（1ＭストックpH8.0から希釈、 アッセイの詳細を参照） 総結合 75μl 10mＭ HEPES pH 7.4 特異的結合 50μl 10mＭ HEPES pH 7.4及び25μl 100μＭ(S+)-3-イソブチル GABA 100μl s-α₂δ-1b-6His (2μlタンパク質^*を100μlに希釈) 25μl 放射性リガンド ([³H]ギャバペンチンまたは[³H]ロイシン
)^* α₂δ-１-6Hisの原料はFPLC Superdex-200ゲル濾過により精製したものである
（例5参照）。

【００９９】 放射性リガンドを加えた直後に、フラッシュプレートをPackard Top Count sc
intillation counterにのせ、結合タイムコースを追跡した。アッセイまでのイ
ンキュベーション時間は3時間である。「[³H]フラッシュプレート」プログラム
（cpm）を活性の監視に使用した。特異的結合は「トータル」値の〜98％であっ
た。イミダゾールをタンパク質の6HisタグとNiフラッシュプレートの特殊な相互
作用を至適化するために使用した。イミダゾール自身は（100mＭまで）フィルト
レーションアッセイにおいて[³H]ギャバペンチン結合に影響しなかった（n=1）
。

【０１００】 確立しているフィルターバインディング方法により新規のアッセイ技術を検証
するために、競合試験をフラッシュプレート法とフィルターバインディング法で
比較した。

【０１０１】 GraphPad Prism softwareを競合曲線の作成及びIC₅₀と傾斜角の算出に使用し
た。この試験ではテスト化合物の半対数希釈段階に対する12ポイントの競合曲線
を使用した。結果として、下記の表3にIC50値を示し、図9に-0.9〜1.3の範囲の
曲線傾斜を示した。アッセイに使用した[³H]ギャバペンチン濃度は10-13nＭの範
囲内であった。

【０１０２】 （表3） 競合試験 GraphPad Prism softwareを競合曲線の作成及びIC₅₀と曲線傾斜角の算出に使
用した。この試験ではテスト化合物の半対数希釈段階に対する10ポイントの競合
曲線を使用した。 IC₅₀値は次式にしたがってKi値（表に示した）に変換した： Ki=IC₅₀/（1+［L］/K_D） 使用したK_D値は表1に示したその平均値であった。 アッセイに使用した[³H]ギャバペンチン濃度は10-13nＭの範囲内であり、上記
のKi値を計算する目的の実験毎に測定した。 曲線傾斜はすべて-0.9〜1.3の範囲内であった。

【０１０３】例10 SEQ ID No 9のリコンビナントポリペプチドに対する[³H]ギャバペンチン結合
のフィルターバインディングアッセイ アッセイは21℃において、96-ディープウエルプレート上最終容量250μlで実
施した。アッセイ成分は（全ての試薬は10mＭ HEPES(pH7.4、21℃)）： 25μl テスト化合物 200μl SEQ ID No 9のポリペプチド (3μlタンパク質を200μlに希釈) 25μl 放射性リガンド（[³H]ギャバペンチン(65Ci/mmole)）

【０１０４】 プレートを室温で1時間インキュベートし、次いで 0.3% polyethylenimineに
予め浸した96-ウエル GF/B Unifilter plates上に濾過した。フィルターは、3x1
ml 50mＭ Tris-HCl (pH 7.4 at 4⁰C)で洗い、終夜乾燥した。Scintillant (Micr
oscint O, 50μl)を加え、Packard Top Count scintillation counterを使用し
てカウントした。特異的結合は「総」値の〜98％ であった。 [³H]ギャバペンチ
ン飽和試験において、得られた K_D (nＭ) は約 10.62であった。

【０１０５】例11 種々のアッセイ様式を使用したSEQ ID No 37のリコンビナントポリペプチドに
対する[³H]ギャバペンチンの結合 この例は、種々のアッセイ様式を使用して、本発明のスクリーニング方法を例
示する。 a) タンパク質ストックの調製 細胞を 1x10⁶ cells/mlで感染させた以外は、例4に記載したようにタンパク質
を発現させた。細胞は20リッターApplikon培養器（18L培溶液量）中で培養した
。培養は、27℃及び60％dO₂（100%dO₂とは、細胞を除いた液が27℃で空気で飽和
した時の[O₂]のこと）を維持し、125rpmの船舶用プロペラで攪拌した。タンパク
質の発現にはSf-900 II SFM (LTI Inc) あるいは ESF-921 (Expression Systems
Inc.)液を使用した。

【０１０６】 b) 細胞培養上清から s-α₂δ-1b-6Hisタンパク質の精製： 回収日（ウイルス感染後4-7日）に細胞培養は9,000×gで20分間遠心分離し、
細胞性の残渣を除き、30ｋDaカットオフ再生セルロースカセットを装着したpell
icon垂直流濾過システムを使用して上清を約3リッターに濃縮した。濃縮された
検体を9,000×gで20分間再度遠心分離し、2倍量の 10mＭ Tris pH9.0で希釈した
。希釈した検体を Q-sepharose FFカラム (5cm内径 x 50cm高さ)に10ml/minの流
量でかけ、 20mＭ Tris-HCl (pH8.0)で洗浄し、 20mＭ Tris-HCl (pH8.0), 0.5
Ｍ KCl, 10mＭイミダゾールで溶出した。

【０１０７】 溶出液は、次いで 20mＭ Tris (pH8.0), 0.1Ｍ KCl, 10mＭイミダゾールで予
め平衡させたNi-superflow (Qiagen)カラム(2.5cm内径 x 6cm高さ)に10ml/minの
流量でかけた。カラムは順次バッファー A (20mＭ Tris（ pH8.0）, 0.5Ｍ KCl,
20mＭイミダゾール)、バッファーB（ 20mＭ Tris-HCl (pH8.0), 1Ｍ KCl）、そ
して再度バッファー Aで流量 10ml/minで洗浄した。溶出は、 バッファー C (20
mＭ Tris-HCl (pH8.0), 100mＭ KCl, 0.5Ｍ Imidazole)を20mＭ Tris-HCl (pH8.
0), 100mＭ KClに対して 2ml/minの流量でグラディエントして行った(5カラム容
量以上)。グラディエント溶出のフラクションは[³H]ギャバペンチンバインディ
ング活性を調べ、活性フラクションを集め、4℃において4回（それぞれ24時間）
10mＭ HEPES, 150mＭ NaClに対して 1:60 (サンプル:透析液)の比で透析した。
透析後、以下に述べるアッセイに使用するために、分割し、凍結した。

【０１０８】 c) フィルター、小麦胚芽レクチン及びNiキレートアッセイのためのタンパク質
カクテルの調製(容量は μl): カクテル x1 x23 s-α₂δ-1b-6His HBS s-α₂δ-1b-6His HBS 0μl 0 75 0 1,725 1μl 1 74 23 1,702 2μl 2 73 46 1,679 4μl 4 71 92 1,633 α₂δ-1タンパク質は上記で作成した分割由来である。

【０１０９】 d) フィルター及び小麦胚芽レクチンフラッシュプレートアッセイ 試薬を下記の順序で、96-ウエル小麦胚芽レクチンフラッシュプレートあるい
は96-ディープウエルプレートの各ウエルに加える。条件は、テストするタンパ
ク質の4容量それぞれについて、「総」及び「非特異的」結合(総結合の場合は20
μl H₂Oを加えそして非特異的結合の測定には100μＭ (S+)-3-イソブチルGABA 2
0μlを加えた)を3回測定して決めた。

【０１１０】 ウエル当たりの組成: 100μＭ (S+)-3-イソブチル GABA / H₂O 20μl *100nＭ [³H]ギャバペンチン 20μl 235mＭ HEPES (pH7.3) 85μl s-α₂δ-2-6His (0,1,2または4μl-x23カクテル) 75μl *各ウエルに加えた20μlの[³H]ギャバペンチン分割ストックは液体β-scintilla
tion counter (Beckman LS 5000TD)でカウントし、各ウエルに入れた[³H]ギャバ
ペンチンの実際の濃度を測定した。この実験については、この値は10.8nＭと算
出された。

【０１１１】 小麦胚芽フラッシュプレートは、 Packard Top Count Microplate scintillat
ion counterで、連続サイクル条件の下にカウントした。プレートをカウントデ
ィレイ及びカウント時間1分の「[³H]フラッシュプレート」プログラムでカウン
トした。小麦胚芽レクチンアッセイのデータは「特異的」結合としてプロットし
た（すなわち、「総」−「非特異的」結合）、図10参照。

【０１１２】 フィルターアッセイでは、ディープウエルプレート中の結合反応は1時間22℃
に置いた後、1mlの 4^oC 50mＭ Tris (pH 7.4 at 4^oC)で3回洗い、0.3% Polyethy
lenemineに 4^oCで1時間予め浸した 96-well GF/Bフィルタープレートの上に濾過
した。22^oCで終夜乾燥した後、45μlの Microscint-O (Packard)を各フィルター
ウエルに加え、プレートをシールし、Packard Top Count Microplate Scintilla
tion counterによりカウントディレイ及びカウント時間1分の「[³H]Microscint
」プログラム でカウントした。「総」及び「非特異的」結合の平均を図11に示
した。

【０１１３】 e）ニッケルフラッシュプレートアッセイ 2.35x ニッケルフラッシュプレートバッファー: 4.7ml 1Ｍ HEPES (pH7.3) 0.118ml 10% BSA (Sigma A7906, Fraction V (98%), Lot 57H1088) 水溶液 1.175ml 0.2Ｍイミダゾール pH7.3 (NaOH) 14.007ml 水

【０１１４】 ウエル当たりの組成: 100μＭ (S+)-3-イソブチルギャバ / H₂O 20μl *100nＭ [³H]ギャバペンチン 20μl 2.35xニッケルフラッシュプレートバッファー 85μl s-α₂δ-1b-6His (0,1,2or4μl x23カクテル) 75μl *各ウエルに加えた20μlの[³H]ギャバペンチン分割ストックは液体β-scintilla
tion counter (Beckman LS 5000TD)でカウントし、各ウエルに入れた[³H]ギャバ
ペンチンの実際の濃度を測定した。この実験については、この値は10.8nＭと算
出された。

【０１１５】 ニッケルフラッシュプレートは、 Packard Top Count Microplate scintillat
ion counterで、連続サイクル条件の下にカウントした。プレートをカウントデ
ィレイ及びカウント時間1分の「[³H]フラッシュプレート」プログラムでカウン
トした（図12）。

【０１１６】 f)考察 この例は、アッセイの安定性が長時間（少なくとも100時間）にわたっている
ことを示しており、これはアッセイ様式を大規模スクリーニングに使用する場合
には重要である。事実、そのような安定性はカウンターの中にプレートを積み重
ねることを可能にする（理想的にはシグナル安定性を個々のプレートを通して確
認するために試験化合物ウエルに沿って適切な管理をする）。 この例は、小麦胚芽レクチンフラッシュプレートアッセイを、1次アッセイまた
はNiフラッシュプレートアッセイあるいは本発明の他の様式を使用して同定また
は選択されたリガンドを改良するための2次スクリーニングに使用できることを
示している。

【０１１７】 （参考文献） - Perez-Reyes, E., and Schneider, T. (1994) Drug Dev. Res. 33, 295-318 - Catterall, W. A. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 493-531 - Birnbaumer, L., Campbell, K. P., Catterall, W. A., Harpold, M. M., Hof
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【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Superdex-200クロマトグラフィーで精製したSEQ ID No37のアミノ酸配列を持
つリコンビナントポリペプチドの、Ni-NTA上のエレクトロン（electron）前と後
における、溶出プロフィールを示す。

【図２】 本発明のSPAアッセイの態様におけるイミダゾール濃度の最適化を示す。アミ
ノ酸配列SEQ ID No9（ s-α₂δ-1b-6His）のリコンビナントポリペプチド（20μ
l）に対する[³H]ギャバペンチン（18.4nＭ）結合のSPAアッセイ。

【図３】 本発明のフラッシュプレートアッセイの態様におけるイミダゾールの最適化を
示す。アミノ酸配列SEQ ID No37（ s-α₂δ-1b-6His）のリコンビナントポリペ
プチド（10μl）に対する[³H]ギャバペンチン（14nＭ）結合のSPAアッセイ。

【図４】 種々の濃度のアミノ酸配列SEQ ID No37（ s-α₂δ-1b-6His）のリコンビナン
トポリペプチドに対する[³H]ギャバペンチン（13nＭ）結合のフラッシュプレー
トにおける時間経過を示す。

【図５】 3時間インキュベーション後のフラッシュプレートアッセイにおけるアミノ酸
配列SEQ ID No37のリコンビナントポリペプチドの結合能力を示す。

【図６】 インキュベーション3時間後にアッセイした、アミノ酸配列SEQ ID No37のリコ
ンビナントポリペプチドの一定量を使用して[³H]ギャバペンチン結合を最大にす
るのに必要な最適イミダゾール濃度を示す。

【図７】 アミノ酸配列SEQ ID No37の精製リコンビナントポリペプチドに対する[³H]ギ
ャバペンチン飽和結合の、インキュベーション3時間後にアッセイした、フラッ
シュプレートアッセイを示す。

【図８】 インキュベーション3時間後にアッセイした、アミノ酸配列SEQ ID No37の精製
リコンビナントポリペプチドに対する[³H]ロイシン（10.1nＭ）結合ウインドウ
（window）を最大にするのに必要なイミダゾール濃度を最適化するフラッシュプ
レート時間経過を示す。

【図９】 インキュベーション3時間後にアッセイした、フラッシュプレートアッセイ様
式における3化合物の競合曲線を示す。

【図１０】 小麦胚芽レクチンフラッシュプレートアッセイにおける、s-α₂δ-1b-6Hisに
対する[³H]ギャバペンチン結合の用量依存性を示す。非特異的結合のレベルは、
アッセイしたタンパク質の容量あるいは時間経過を測定した点に関係無く、低く
（約50-70cpm）安定している。ウインドウ(window)は15時間のタイムポイント(2
4時間毎にウインドウの約10%)からほんの僅か減少したが長時間比較的安定して
いる。

【図１１】 α₂δ-1に対する[³H]ギャバペンチン結合の用量依存性及びアッセイしたタン
パク質容量に無関係な非特異的結合（約30-60cpm）の一定低レベル維持を示す。

【図１２】 ニッケルフラッシュアッセイにおけるα₂δ-1に対する[³H]ギャバペンチン結
合の用量依存性を示す。非特異的結合のレベルは、アッセイしたタンパク質の容
量あるいは時間経過を測定した点に関係無く、低く（約70-100cpm）安定してい
る。安定したウインドウ（window）は少なくとも50時間の間維持された（時間経
過の〜20及び70時間の間）。

【図１３】 α2δ-1/[3H]ギャバペンチン結合アッセイの安定性を示す。各ウエルは3重複
して実施し、200μlの：0.1Ｍ HEPES pH7.3、0.5mＭイミダゾール、種々の濃度
のBSAフラクションV(0，0.025，0.05，0.25，0.5及び1％)。

【図１４】 α₂δ-1スプライスアイソフォームbの4種変異体におけるα₂δ-1欠失領域のア
ミノ酸配列の例である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブラウン、ジェイソン、ピーター イギリス国 ケンブリッジシャー、ケンブ リッジ、ステイプルフォード、 チャーチ ストリート ９ (72)発明者 ディッサナヤケ、ヴィサカ スリランカ国 コロンボ、フィフス レイ ン 91 (72)発明者 スマン − ショウハン、ニルマラ イギリス国 ケンブリッジシャー、シック ス マイル ボトム、 ロンドンロード、 ロウアー ヘアー パーク ２ (72)発明者 ギー、ニコラス、スティーブン イギリス国 エセックス、スタンステッ ド、レインフォード ロード 30 Ｆターム(参考） 2G045 BB05 BB10 BB14 BB20 BB46 BB50 CB01 DA36 FB02 FB08 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA02 HA11 HA17 4C206 FA45 NA14 ZA01 ZC41

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大脳皮質電圧依存性カルシウムチャネルα₂δ-1サブユニッ
   トに結合するリガンドのスクリーニング方法であって 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットポリペ
   プチドを関心のあるリガンド、及び、α₂δ-1サブユニットと結合する標識化合
   物と接触させ；及び α₂δ-1サブユニットに対する標識化合物の結合レベルを測定することより成
   る上記方法。
2. 【請求項２】 生物学的に活性な生産物、特に患者の神経系機能に作用する
   生産物のスクリーニング方法であって 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サブユニットポリペ
   プチドを候補生産物、及び、α₂δ-1サブユニットと結合する標識化合物と接触
   させ；及び 分泌型可溶性α₂δ-1サブユニットに対する標識化合物の結合レベルを測定す
   ることより成る上記方法。
3. 【請求項３】 方法がSPAアッセイである請求項1または2に記載の方法。
4. 【請求項４】 方法がフラッシュプレートアッセイである請求項1または2に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 フラッシュプレートアッセイが小麦胚芽レクチンフラッシュ
   プレートアッセイ様式である請求項1、2または4に記載の方法。
6. 【請求項６】 方法がフィルター結合アッセイである請求項1または2に記載
   の方法。
7. 【請求項７】 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サ
   ブユニットポリペプチドが、SEQ ID N°33または SEQ ID N°44のアミノ酸1から
   アミノ酸1008及び1087の間まで、望ましくはアミノ酸1018及び1078の間まで、最
   も望ましくはアミノ酸1043及び1078の間までを含むポリペプチドと、少なくとも
   80%のアミノ酸が一致するポリペプチドから選択される請求項1または2に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1サ
   ブユニットポリペプチドがSEQ ID N°34、35，36、37、41、42及び43から成る群
   から、最も望ましくは SEQ ID N°37及び SEQ ID N°43のポリペプチドから選択
   される請求項1または2に記載の方法。
9. 【請求項９】 α₂δ-1サブユニットポリペプチドがSEQ ID N°34、35，36
   、37、41、42及び43のいずれかと少なくとも80％のアミノ酸配列が一致する請求
   項1または2に記載の方法。
10. 【請求項１０】 α₂δ-1の精製及びスクリーニングのための、C-myc、FLAG
    、ヒスチジン残基の連結、ヘマグルチンA、V5、XpressまたはGSTタグの使用。
11. 【請求項１１】 SEQ ID N°30、31、32、33、34、35，36、37及び38のα₂
    δ-1の精製及びスクリーニングのための、C-myc、FLAG、ヒスチジン残基の連結
    、ヘマグルチンA、V5、XpressまたはGSTタグの使用。
12. 【請求項１２】 SEQ ID N°30、31、32、33、34、35，36、37及び38のα₂
    δ-1の精製及びスクリーニングのための、ヒスチジン残基連結タグの使用。
13. 【請求項１３】 SEQ ID N°30、31、32、33、34、35，36、37及び38のα₂
    δ-1の精製及びスクリーニングのための、6ヒスチジン残基連結タグの使用。
14. 【請求項１４】 精製及びスクリーニングのための、SEQ ID N°30、31、32
    、33、34、35，36、37及び38のα₂δ-1 C-末端6ヒスチジン残基連結タグの使用
    。
15. 【請求項１５】 発現されたα₂δ-1の精製及びスクリーニングのための、C
    -myc、FLAG、ヒスチジン残基の連結、ヘマグルチンA、V5、XpressまたはGSTタグ
    をコードする核酸の使用。
16. 【請求項１６】 SEQ ID N°30、31、32、33、34、35，36、37及び38の発現
    されたα₂δ-1の精製及びスクリーニングのための、C-myc、FLAG、ヒスチジン残
    基の連結、ヘマグルチンA、V5、XpressまたはGSTタグをコードする核酸の使用。
17. 【請求項１７】 SEQ ID N°30、31、32、33、34、35，36、37及び38の発現
    されたα₂δ-1の精製及びスクリーニングのための、ヒスチジン残基連結タグを
    コードする核酸の使用。
18. 【請求項１８】 SEQ ID N°30、31、32、33、34、35，36、37及び38の発現
    されたα₂δ-1の精製及びスクリーニングのための、6ヒスチジン残基連結タグを
    コードする核酸配列の使用。
19. 【請求項１９】 精製及びスクリーニングのための、SEQ ID N°30、31、32
    、33、34、35，36、37及び38の発現されたα₂δ-1の6ヒスチジン残基をコードす
    る核酸配列のC-末端部分の使用。
20. 【請求項２０】 α2δ-1に結合するリガンドをスクリーニングするための
    、α2δ-1のギャバペンチン結合サイトに対して500nm以下の親和性を有する標識
    化合物の使用。
21. 【請求項２１】 標識化合物が、標識されたギャバペンチン、L-ノルロイシ
    ン、L-アロ-イソロイシン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バ
    リンまたはL-フェニルアラニンから選択される請求項20記載の使用。
22. 【請求項２２】 アッセイが1〜30℃の間で実施される請求項1または2に記
    載のスクリーニング方法。
23. 【請求項２３】 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δ-1
    サブユニット、及び、α₂δ-1サブユニットに結合する標識化合物より成る、大
    脳皮質電圧依存性カルシウムチャネルα₂δ-1に結合するリガンドのスクリーニ
    ングのためのキット。
24. 【請求項２４】 標識化合物が請求項20または21に記載の標識化合物のいず
    れか一つから選択される請求項23記載のキット。
25. 【請求項２５】 大脳皮質電圧依存性カルシウムチャネルα₂δ-1に結合す
    るリガンドのスクリーニング方法であって 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δサブユニットを関心の
    リガンド、及び、α₂δサブユニットに結合する標識化合物と接触させ；及び α₂δサブユニットに対する標識化合物の結合のレベルを測定することより成
    る上記方法。
26. 【請求項２６】 生物学的活性生産物、特に患者の神経系機能に作用する生
    産物のスクリーニング方法であって 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δサブユニットポリペプ
    チドを候補生産物、及び、α₂δサブユニットに結合する標識化合物と接触させ
    ；及び 分泌型可溶性α₂δサブユニットに対する標識化合物の結合のレベルを測定す
    ることより成る上記方法。
27. 【請求項２７】 方法がSPAアッセイである請求項25または26に記載の方法
    。
28. 【請求項２８】 方法がフラッシュプレートアッセイである請求項25または
    26に記載の方法。
29. 【請求項２９】 分泌型可溶性リコンビナントカルシウムチャネルα₂δサ
    ブユニット、及び、α₂δサブユニットに結合する標識化合物より成る、大脳皮
    質電圧依存性カルシウムチャネルα₂δサブユニットに結合するリガンドのスク
    リーニングのためのキット。
30. 【請求項３０】 標識化合物が請求項20または21に記載の標識化合物のいず
    れか一つから選択される請求項29記載のキット。