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JP2011506387A - 抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

β-アミロイドペプチド、特にヒトβ-アミロイドペプチドに結合する抗原結合タンパク質; 増加したβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物によって特徴付けられる疾患または障害、特にアルツハイマー病、および増加したβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物によって特徴付けられる眼または視神経に影響する疾患または障害、例えば加齢性黄斑変性および緑内障型疾患およびβ-アミロイド依存的白内障形成を、該抗原結合タンパク質を用いて治療する方法; 該抗原結合タンパク質を含む医薬組成物; および製造方法を提供する。

Description

発明の属する分野
本発明は、β-アミロイドペプチド、特にヒトβ-アミロイドペプチドに結合する抗原結合タンパク質(抗体を含む)に関する。また、本発明は、β-アミロイドペプチド、特にヒトβ-アミロイドペプチドに結合する抗原結合タンパク質を用いて、β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物の増加によって特徴付けられる疾患または障害、特にアルツハイマー病、ならびに加齢性黄斑変性、緑内障型疾患およびβ-アミロイド依存的白内障形成を含む、β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物の増加によって特徴付けられる眼または視神経に影響する疾患または障害を、治療する方法に関する。本発明の他の態様は以下の説明から明らかになる。
発明の背景
アルツハイマー病(AD)は加齢性認知低下の最も一般的な原因であり、世界中で1200万人以上の人が罹患している(Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Suppl 1055-1057)。最初期の該疾患は、認知低下ならびに言語および行動欠損を伴う進行性の記憶喪失によって特徴付けられる。疾患の後期には、患者は包括的な健忘症を発症し、非常に低下した運動機能を有する。典型的に、診断後9年で死が生じ、他の症状、典型的に肺炎を伴うことがよくある(Davis K.L. and Samules S.C. (1998) in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J. and Coyle J.T. (McGraw-Hill, New York pp267-316))。現行の治療は対症アプローチであり、認知障害の軽減および進行性の病因に伴う行動徴候の改善に重点を置いている。実際、これらの治療は、短命の認知的利益しか提供せず、その認知障害のレベルは2年までしか持続しないことが報告される。疾患の進行を遅くし、場合により停止させる疾患修飾性治療の可能性は大きい。そのようなアプローチは、患者および、重要なことに、その介護人の生活の質に根本的で持続した改善をもたらし、ならびにこの疾患の莫大なトータル保健医療コストを減少させる。
アルツハイマー病の臨床診断は、現在、アルツハイマー病の可能性(possible or probable Alzheimer's disease)の診断を導くフィジカルテストおよびメンタルテストの組み合わせに基づくが、診断バイオマーカーおよび画像診断が研究中である(Sonnen et al. (2007) Expert Rev Neurotherapeutics 7(8): 1021-1028; Lockhart et al (2007) Brain 130: 2607-2615)。死後に、十分に特徴付けられた脳の神経学的特徴によって疾患が確認され、該特徴には、実質プラークおよび脳血管でのAβの沈着、神経原線維変化の神経細胞内形成、特定の脳領域でのシナプス喪失およびニューロン亜集団の喪失が含まれる(Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl 53: 141-145)。
多数の遺伝的、組織学的および機能的証拠は、β-アミロイドペプチド(Aβ)がアルツハイマー病の進行の鍵であることを示唆する(Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766)が、最近は、検死で観察された実際のAβ沈着物が認知低下の真の原因であるどうかはあまりはっきりしなくなっている(Ferreira ST (2007) Life 59(4-5): 332-345)。Aβは、BACE1として知られるアスパルチルプロテアーゼ酵素(β-セクレターゼ、Asp2またはメマプシン-2としても知られる)によるβ-アミロイド前駆タンパク質(APPとしても知られる)の切断によって生産されることが知られている(De Strooper, B. and Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472)。実質沈着および血管沈着に加え、可溶性オリゴマー型のAβがADの発症に寄与すると想定されており、それらはまずシナプスの機能を損なわせることによってニューロンの機能に影響する(Lambert et. al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95 : 6448-6453; Kayed et al (2003) Science 300:486-489; Cheng et al (2007) J Biol Chem 282(33):23818-23828; Ferreira et al (2007) Life 59:332-345)。不溶性アミロイドプラークはADの早期および軽度認知障害(MCI)において見出されるが、これらの個体では可溶性Aβ凝集物(オリゴマーまたはAβ由来拡散性リガンド(ADDL)と称されることもある)のレベルも増加し、かつ可溶性Aβレベルは、アミロイドプラークと相関するより、神経原線維変性、およびシナプスマーカーの喪失とよく相関する(Naslund et. al. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19)。さらに、これらのオリゴマーは原繊維形成へ向かう途中の前駆体であり、その除去または中和は毒性効果および原繊維形成を妨げる(Ferreira ST (2007) Life 59(4-5): 332-345; Gong Y (2003) PNAS 100:10417-10422)。これらの知見にもかかわらず、高アミロイド形成性Aβ42およびアミノ末端切断型Aβx-42はびまん性プラークおよび老人斑の両者において見出される主要なAβ種であり(Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016)、Aβ42の相対レベルはADのバイオマーカーであるだけでなく、アミロイドプラークになるAβ凝集の重要な調節因子でもあると思われる。Aβ42はin vitroで他のAβ型より容易に凝集することが示されており(Jarrett, JT (1993) Biochemistry.32: 4693-4697)、そのようにAβ42はADの病理発生における開始分子(initiating molecule)であると示唆されている(Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292)。Aβ42は、通常、APP代謝の微量産物であるが、その生産の小さい変化はAβ沈着に関する大きい影響と関連し、したがってAβ42単独の減少がADの有効な治療方法であると想定されている(Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292; Levites et al (2007) J Clin Invest. 116(1):193-201)。これを支持して、アミロイド前駆タンパク質(APP)およびプレセニリン遺伝子の突然変異は、主に、Aβ42の相対レベルを増加させ、したがってアルツハイマー病(AD)の発症までの時間を短くすることが報告されている(Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:67-99)。しかし、アミロイド沈着の速度がトータルアミロイドレベル、異化作用および、年齢およびADで見出される高アミロイドレベルによって負の影響を受けることが示されているCNSからのAβクリアランスの効率にも依存することが強調されるべきである(Deane et al (2005) J Neurosci 25(50):11495-11503; Wang et al (2006) Drug Discovery Today 11(19/20): 931-938)。この点において、中枢神経系(CNS)と血漿との間のAβの輸送が脳アミロイドレベルの調節において主要な役割を果たし(Shibata, et al (2000) J Clin Invest 106 : 1489-1499)、AβはLRP-1等の輸送機構によってCNSから血漿に高速で輸送され、AβはRAGEに結合することによって血漿からCNSに高速で輸入される(Zlokovic BV (2004) J Neurochem 89: 807-811)ことがますます明らかになっている。したがって、Aβペプチドでの活性ワクチン接種または、末梢Aβに結合し、したがって血漿、CSFおよびCNS間の動的平衡を変化させる特異的Aβ抗体の受動的投与が開発中である。実際、現在、これらの両アプローチがAβレベルを低下させ、Aβ病状を減少させ、かつ、ある場合には、アミロイド症の種々のトランスジェニックモデルにおいて認知的利益を提供できることを示している多数の研究が存在する。また、数少ない研究が高等種で行われている(Lemere, CA (2004) Am J Pathology 165: 283-297; Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18 : 44:46)。
アミロイド沈着の動物モデルは、突然変異ヒト導入遺伝子をマウスで過剰発現させることによって作製されている。単一のヒトAPP導入遺伝子を過剰発現するマウスは典型的に脳プラーク様β-アミロイド沈着物を12月齢から発症し(Games D. et al., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99-102))、突然変異ヒトAPPおよびプレセニリン-1 (PS-1)導入遺伝子の両者を有するマウスは典型的に脳プラーク様β-アミロイド沈着物を2月齢で早くも発症する(Kurt M.A. et al., (2001) Exp.Neurol. 171: 59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244)。使用された種々のトランスジェニックマウスモデルにおけるこれらのかなりの生物学的差異は、異なるアプローチの薬理学および効率を比較することを困難にしている。この分野で、β-アミロイドおよびその種々の型を標的にする免疫療法が実際にどのように機能するかについて現実的な統一見解は存在しない。異なる結合特性を有する異なる抗体はそれらの動物モデルにおいて様々な結果を示す可能性が非常に高い。また、抗体は複数の機構によって作用する可能性があり、報告されている様々な作用様式は相互に排他的ではないというのが合理的と思われる(Levites et al (2007) J Clin Invest. 116(1):193-201)。
クリニックでの脳アミロイドを標的にする最初の免疫療法は活性ワクチンであるElan/WyethのAN-1792であった。この治療は髄膜脳炎と一致する臨床徴候の発生にしたがって終結した。亜群分析では、治療が認知機能の低下を遅くすることが示唆された(Nature Clin Pract Neurol (2005) 1:84-85)。また、患者の死後分析では、プラーククリアランスの証拠が示された(Gilman S. et al, (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562)。
受動的モノクローナル抗体であるBapineuzumab (AAB-001, Elan/Wyeth)が開発中である。
増加したβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物によって特徴付けられる他の疾患または障害には、軽度認知障害(Kelley BJ (2007) Neurologic Clinics 25 (3), 577-609)、オランダ型のβ-アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、脳β-アミロイド血管障害および種々のタイプの退行性痴呆、例えばパーキンソン病、進行性核上麻痺、皮質基底変性(cortical basal degeneration)およびびまん性ルイス体型のアルツハイマー病(diffuse Lewis body type of Alzheimer's disease)と関連しているもの(Mollenhauer B (2007) J Neural Transm e-published 23 Feb 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5:655-60)、ダウン症候群(Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254:22-7)、加齢性黄斑変性(AMD) (Johnson LV et al (2002) PNAS USA 99: 11830-11835; Anderson DH et al (2004) Exp Eye Res 78: 243-256)、「緑内障型」疾患(Guo L et al (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:13444-13449)およびAβ依存的白内障形成(Goldstein LE et al (2003) Lancet 361: 1258-1265; Li G et al (2003) Mol Vision 9: 179-183)が含まれる。
加齢性黄斑変性(AMD)は先進国における失明の主要原因である。2つの主要なAMDの臨床像が存在する。萎縮性(非滲出型(dry)) AMDは網膜色素上皮(RPE)および視神経網膜(neuroretina)の変性によって特徴付けられる。早期の萎縮性AMDはRPE細胞層の下にドルーゼの形成を伴う。早期萎縮性AMDは末期疾患に進行しうる。末期疾患では、RPEは完全に変性し、斑の領域中に境界のはっきりしたRPE萎縮領域、「地図状萎縮(geographic atrophy)」を形成する。この型の疾患では、RPEの変性は黄斑性桿体および錐体の二次死を生じさせ、これらの場合、これは重度の加齢性視力喪失を生じさせる。ある割合のAMD患者は該疾患の異なる型または追加の合併症と見なしうるものを発症する。AMD患者の約10〜20%は脈絡膜血管新生(CNV)を発症する。これが生じると、疾患の型は「滲出型(wet) AMD」として知られ、これはいくつかの最も重度の視力喪失と関連しうる。滲出型AMDでは、新規脈絡膜血管はブルック膜の割れ目を通して成長し、RPEおよび視神経網膜内およびRPEおよび視神経網膜の下に増殖する。典型的な場合、萎縮性AMDは滲出型の発症前に眼で発症するが、まれな場合には、萎縮型の事前の発症の不存在下で血管新生型が発症しうる。両疾患型において、光受容細胞の死に起因して視力喪失が生じるが、滲出型AMDでは、CNV中に形成された漏出性血管からの内部出血も視力喪失の原因になる。AMDの治療に関して、滲出型AMDのいくつかの態様に対処する新規治療、特にVEGF (血管内皮増殖因子)またはVEGF受容体シグナル伝達経路を阻害する種々の分子によってCNVからの漏出性血管出血を減少させる新規治療の開発にいくらかの進歩がある。しかし、現在、非常に広く認められる萎縮型AMDの治療についての決定的な手段も、早期の非滲出型AMDから地図状萎縮または滲出型AMDへの進行を予防する決定的な手段も存在しない(Petrukhin K (2007) Expert Opin Ther Targets 11: 625-639)。
RPEでのAβの生産を生じさせる厳密な機構およびAβがAMDに影響するように作用する厳密な機構または機構群は完全には理解されていないが、Aβに結合しかつ潜在的に中和するかまたは単に除去する物質によるAβの排除は、AMDでのドルーゼ(drusen)を排除し、AMDでの補体活性化を減少させ、RPE萎縮を減少させ、かつRPEでのVEGF発現の誘導およびドルーゼ周囲の高レベルのその局在化を潜在的に減少させる候補経路を提供することが証拠によって示唆される。したがって、そのような治療は、AMDに起因する視力の喪失および地図状萎縮および/または滲出型AMDへの進行を予防し、遅延させ、減弱し、または回復させる手段を提供することができる。これは、RPEの周囲環境のAβ含有ドルーゼおよび/または局所Aβのレベルを減少させ、それによって早期および後期のAMDの両者に干渉し、視力の喪失を引き起こす原因となる細胞の減退を治療することができる。
いくつかの最近公開されたデータは、AMDの発生における補体タンパク質とアミロイドベータの相互作用を明らかにしている(Wang, J. et al., (2008) J. Immunol. 181: 16651-6)。アミロイドベータは、因子HとともにC3b型からその不活性型iC3bへの補体タンパク質C3の崩壊に関与する補助因子である補体因子Iに結合することが示されている(Wang, J. et al., 2008)。最近公開されたin vitro研究から得られた結果は、アミロイドベータが、網膜下組織での低グレードの慢性炎症を生じさせる補体因子Iの機能をブロックすることによってドルーゼ内の補体系を活性化し; ゆえにAMDの発症に関連する4因子: 炎症、補体活性化、アミロイドベータ沈着およびドルーゼを関連付けるという仮説を支持することが示唆された(Wang, J. et al., 2008)。補体因子Iに対する結合に関して補体因子Hと潜在的に拮抗することによる代替補体経路の活性化でのアミロイドベータの影響に関するそのような直接証拠は以前に提供されていない(Wang, J. et al., 2008)。
「緑内障型疾患」は、眼の視神経への損傷を生じさせ、失明を生じさせうる一群の疾患に関して使用される用語である。それは、眼内圧(IOP)の増加および視力の低下によって最終的に引き起こされる、世界中の失明の主要な原因である。IOPとこれが網膜神経節細胞(RGC)のアポトーシスをどのように導くかとの関連はあまり理解されていない。高IOPは単独でアポトーシスを誘発することができる(Cordeiro M F et al (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13352-13356; Quigley H A et al (1995) Invest Ophtalmol Visual Sci 36:774-786)が、本来、それは視覚ニューロンの細胞死の唯一の原因ではない。さらに、眼圧低下剤での治療にしたがうIOPの正常化後でさえ視力が悪化し続けることが観察されている(Oliver JE et al (2002) Am J Ophthamol 133:764-772)。
最近、β-アミロイドの潜在的な細胞傷害効果と緑内障でのRGCのアポトーシスを関連付ける報告がなされている(McKinnon SJ et al (2002) Invest Ophtamol Visual Sci 43:1077-1087)。緑内障の動物モデルで、RGCにおいてカスパーゼ-3プロテアーゼが活性化され、それがカスパーゼ-3によるアミロイド前駆タンパク質(APP)の異常なプロセシングを導き、β-アミロイドを含む潜在的に有毒なAPP断片が生じることが示されている(McKinnon et al (2002); Cheung ZH et al (2004) Mol Cell Neurosci 25:383-393)。他の細胞のうち、RGCはAPPを発現することが示されており、したがってこれはβ-アミロイドの妥当な供給源であると思われる。高レベルのAPPおよび高レベルのβ-アミロイドはともにカスパーゼ-3の活性化に関与するとされているが、これは主にin vitro系で観察されている。緑内障でもRGC中のAPPレベルが増加し、ゆえに正のフィードバック機構でさらに多数のβ-アミロイドの生成に寄与するかどうかは明らかでない。さらについ最近、緑内障のラットモデルにおけるRGCのアポトーシスへのβ-アミロイドの関与が示唆されている(Guo et al (2007))。β-アミロイドまたはβ-アミロイド生産を標的にするいくつかの物質が試験され、それらはin vivoで網膜神経節細胞死の減少を示し、全3種の治療が一緒に使用された場合に軽度の増強効果の可能性を有した。最大の効果は抗β-アミロイド抗体を使用することによって観察され、全3種の物質を一緒に用いた場合に観察された効果にほぼ匹敵した。
RGCでのβ-アミロイドの生産およびIOPとの関連を生じさせる厳密な機構は完全には理解されていないが、β-アミロイドに結合しかつ潜在的に中和するかまたは単に除去する物質によるβ-アミロイドの排除は、緑内障でのRGCのアポトーシスを妨げる経路候補を提供し、したがって緑内障における視力の喪失を遅延させ、減弱し、または回復させる手段を提供することが証拠によって示唆される。これは、RGCおよび周囲環境でのβ-アミロイドのレベルを低下させ、それにより視力の喪失を引き起こす原因となる細胞の減退に対処することができる。
β-アミロイドは他の眼疾患において役割を果たし、とりわけAD患者で観察されるものにおいて核上性白内障の形成と関連付けられており、Aβ生成およびプロセシング経路の成分はレンズ中に存在する(Goldstein LE, et al., (2003); Li G, et al., (2003))。したがって、AMDおよび緑内障型疾患での介入に関する上記治療アプローチはAβ依存的白内障形成の予防に適用可能である。
WO 2008/110885は、アミロイド-βペプチドを標的にするインヒビターで眼疾患を治療する方法に関する。特に、25-34および40を含むと思われるAβ1-40上のエピトープに結合する抗体6Gが開示されている。
発明の要旨
本発明の一態様では、β-アミロイドの残基28〜35を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する治療用抗原結合タンパク質を提供する。
特定の実施形態では、治療用抗原結合タンパク質は、β-アミロイドの残基28〜34を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する。
さらに具体的な実施形態では、治療用抗原結合タンパク質は、β-アミロイドの残基28〜33を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する。
本発明の別の実施形態では、β-アミロイドの残基28〜35の領域内のβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する治療用抗原結合タンパク質を提供する。
本発明の別の実施形態では、β-アミロイドの残基28〜33、28〜34または28〜35からなるβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する治療用抗原結合タンパク質を提供する。
本発明の一実施形態では、結合のためにβ-アミロイドの残基32および33を必要とする治療用抗原結合タンパク質を提供する。
本発明の一実施形態では、治療用抗原結合タンパク質は抗体もしくはその抗原結合断片および/またはそれらの誘導体である。
本発明の一実施形態では、β-アミロイドペプチドに結合しかつ以下のCDR:
CDRH1: VYYVH (配列番号１)
CDRH2: RIDPENGETIYTPKFQD (配列番号２)
CDRH3: SGY (配列番号３)

CDRL1: RSSKSLLHRNGITYLY(配列番号４)
CDRL2: QMSNLAS (配列番号５)
CDRL3: AQNLELWT (配列番号６)
を含む、抗体もしくはその抗原結合断片および/またはそれらの誘導体等の抗原結合タンパク質である治療用抗原結合タンパク質を提供する。
本発明の別の実施形態では、β-アミロイドペプチドに特異的に結合しかつ上記配列の変異体であるCDRを含む抗体またはその抗原結合断片等の抗原結合タンパク質を提供する。
CDR変異体は、CDRの1〜数個のアミノ酸の欠失または置換によるか、またはCDRへの1〜数個のアミノ酸の付加または挿入によるか、またはその組み合わせによるCDRアミノ酸配列の部分的改変を含む。CDR変異体は、CDRのアミノ酸配列中の1、2、3、4、5または6個のアミノ酸置換、付加または欠失を含有してよい。CDR変異体は、CDRのアミノ酸配列中の1、2または3個のアミノ酸置換、挿入または欠失を含有してよい。アミノ酸残基の置換は保存的置換であってよく、例えば、1個の疎水性アミノ酸を代替の疎水性アミノ酸の代わりに用いることであってよい。例えばロイシンはバリン、またはイソロイシンと置換することができる。
変異体CDRを含む抗原結合タンパク質は、上で考察されたCDRを含む抗原結合タンパク質と同一または類似の機能的特性を有する。したがって、変異体CDRを含む抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載のCDRと同一または類似の結合親和性で同一の標的タンパク質またはエピトープに結合する。
典型的な抗体は6F6マウスモノクローナル抗体である。本発明の一実施形態では、6F6の上で特定されるCDRを含むヒト化またはキメラ抗体を提供する。例えば、キメラ抗体は6F6マウス抗体の可変領域、すなわち配列番号１９(VH)および配列番号２１(VL)を含んでよい。マウス6F6に基づくヒト化抗体の例は配列番号２７を有する重鎖および配列番号２８を有する軽鎖を含む抗体である。
本明細書の全体にわたって、用語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」は、Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987に記載されるKabatナンバリング系にしたがう。したがって本発明では以下のようにCDRを定義する。
CDR: 残基
CDRH1: 31-35
CDRH2: 50-65
CDRH3: 95-97
CDRL1: 24-34
CDRL2: 50-56
CDRL3: 89-97
IGHV1-24 (配列番号１３)はVH CDRの移植に好適なアクセプターフレームワークであるヒト生殖細胞系配列である。特定の態様では、ヒトアクセプター重鎖フレームワークはIGHV1-24由来である。本発明の代替の実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、その全長(CDR配列を除く)にわたってマウス6F6重鎖可変配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するヒト重鎖可変領域配列を含む。
アミノ酸および核酸配列に関して、用語「同一の」または「配列同一性」とは、適切な挿入または欠失を伴って最適にアライメントされかつ比較された場合の2アミノ酸または2核酸配列間の同一性の程度を示す。あるいは、実質的同一性は、選択的ハイブリダイゼーション条件下でDNAセグメントが該ストランドの相補鎖にハイブリダイズした場合に存在する。2配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数(すなわち%同一性=同一の位置の数/位置の総数x100)であり、2配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れる。2配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は下記のように数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
2ヌクレオチド配列間の同一性パーセントはGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用し、NWSgapdna.CMPマトリックスおよびギャップウェイト40、50、60、70、または80および長さウェイト1、2、3、4、5、または6を使用して決定することができる。2ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))を使用し、PAM120ウェイト残基テーブル、ギャップ長さペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用して決定することもできる。さらに、2アミノ酸配列間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムを使用し、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ギャップウェイト16、14、12、10、8、6、または4および長さウェイト1、2、3、4、5、または6を使用して決定することができる。
一例として、ポリヌクレオチド配列は、記載される参照ポリヌクレオチド配列と同一であり、すなわち100%同一であるか、またはそれは参照配列と比較された場合に特定の整数までのヌクレオチド改変を含み、例えば少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99%同一であってよい。そのような改変は、少なくとも1つのヌクレオチド欠失、置換(トランジションおよびトランスバージョンを含む)、または挿入からなる群から選択され、該改変は参照ヌクレオチド配列の5'または3'末端位置、またはそれらの末端位置間のどこかに存在してよく、参照配列のヌクレオチド中で個別に点在しているかまたは参照配列内の1個以上連続した基中である。ヌクレオチド改変の数は、参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数を、該当する同一性パーセントのパーセント数値(100によって除算されている)によって乗算し、該積を参照ポリヌクレオチド配列中の該ヌクレオチド総数から減算することによって決定され、すなわち:
nn < xn - (xn・y)であり、
式中、nnはヌクレオチド改変の数であり、xnは参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数であり、yは50%で0.50、60%で0.60、70%で0.70、75%で0.75、80%で0.80、85%で0.85、90%で0.90、95%で0.95、98%で0.98、99%で0.99または100%で1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xnとyの整数でない積はすべて、最も近い整数に切り捨てられた後にxnから減算される。
同様に、ポリペプチド配列は、本明細書中に記載のポリペプチド参照配列と同一であり、すなわち100%同一であるか、またはそれは参照配列と比較された場合に、%同一性が100%未満であるように特定の整数までのアミノ酸改変を含み、例えば少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99%同一であってよい。そのような改変は、少なくとも1つのアミノ酸欠失、置換(保存的および非保存的置換を含む)、または挿入からなる群から選択され、該改変は参照ポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のどこかに存在してよく、参照配列のアミノ酸中で個別に点在しているかまたは参照配列内の1個以上連続した基中である。所定の%同一性に関するアミノ酸改変の数は、本明細書中に記載のポリペプチド参照配列によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数を、該当する同一性パーセントのパーセント数値(100によって除算されている)によって乗算し、そして該積をポリペプチド参照配列中の該アミノ酸総数から減算することによって決定され、すなわち:
na < xa - (xa・y)であり、
式中、naはアミノ酸改変の数であり、xaはポリペプチド配列中のアミノ酸の総数であり、yは50%で0.50、60%で0.60、70%で0.70、75%で0.75、80%で0.80、85%で0.85、90%で0.90、95%で0.95、98%で0.98、99%で0.99、または100%で1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xaとyの整数でない積はすべて、最も近い整数に切り捨てられた後にxaから減算される。
同一性%は配列の長さにわたってよい。
完全V領域を構築するために、生殖細胞系によってコードされるV遺伝子IGHV1-24にフレームワーク4を付加する必要がある。好適なフレームワーク4配列には、ヒトJH4ミニ遺伝子によってコードされるもの(Kabat):
YFDYWGQGTLVTVSS (配列番号１５)
が含まれる。
当業者は、生殖細胞系V遺伝子およびJ遺伝子が重鎖CDR3の全体をコードする配列を含まないことを認識している。しかし、本発明の抗体では、ドナー免疫グロブリンによって重鎖CDR3全体が提供される。したがって、VH遺伝子、例えばIGHV1-24、JHミニ遺伝子、例えばJH4、および重鎖CDRセット、例えば配列番号１、配列番号２および配列番号３の組み合わせ(成熟した完全に再配置された重鎖可変領域を模倣する様式で組み立てられる)は本発明の重鎖可変領域を規定するために十分である。
IGKV2-28 (配列番号１６)はヒト生殖細胞系配列であり、VL CDRの移植に好適なアクセプターフレームワークである。特定の態様では、ヒトアクセプター軽鎖フレームワークはIGKV2-28由来である。本発明の代替の実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、その全長(CDR配列を除く)にわたってマウス6F6軽鎖可変配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するヒト軽鎖可変領域配列を含む。
完全V領域を構築するために、生殖細胞系によってコードされるV遺伝子IGKV2-28にフレームワーク4を付加する必要がある。好適なフレームワーク4配列には、ヒトJK-1ミニ遺伝子によってコードされるもの(Kabat):
WTFGQGTKVEIK (配列番号１８)
が含まれる。
当業者は、生殖細胞系V遺伝子およびJ遺伝子が軽鎖CDR3の全体をコードする配列を含まないことを認識する。しかし、本発明の抗体では、ドナー免疫グロブリンによって該CDR3配列が提供される。JK-1ミニ遺伝子残基の最初の2残基はCDR3領域内に入る。JK-1ミニ遺伝子では、これらの残基は軽鎖CDRL3 (配列番号６)の最後の2残基と同一である。したがって、VL遺伝子、例えばIGKV2-28、FR4、例えばJK-1、および軽鎖CDRセット、例えば配列番号４、配列番号５および配列番号６の組み合わせ(成熟した完全に再配置された軽鎖可変領域を模倣する様式で組み立てられる)は本発明の軽鎖可変領域を規定するために十分である。
本発明の特定の実施形態では、ヒトアクセプター重鎖フレームワークはIGHV1-24およびJH4ミニ遺伝子由来であり、かつヒトアクセプター軽鎖フレームワークはIGKV2-28およびJK-1ミニ遺伝子由来であり、それは配列番号１９の配列を有するドナーVHドメインおよび配列番号２１の配列を有するVLドメイン中で見出される対応する残基に基づくアミノ酸残基の1つ以上の置換を場合により含有し、該置換はβ-アミロイドペプチドに関するドナー抗体の結合親和性のすべてまたは実質的にすべてを維持する。「実質的にすべての結合親和性」とは、治療用抗体がドナー抗体と比較して多くとも5倍、より具体的には2倍の結合親和性の低下しか有さないことを意味する。
本発明のさらに具体的な実施形態では、IGHV1-24およびJH4由来のヒトアクセプター重鎖フレームワークは以下の残基(またはその保存的置換)から選択される1個以上、例えば1〜15個、より具体的には2〜15個のアミノ酸残基置換を有する。
Figure 2011506387
さらに具体的な実施形態では、IGHV1-24およびJH4由来のヒトアクセプター重鎖フレームワークは以下の残基(またはその保存的置換基)を含む。
Figure 2011506387
本発明のさらに具体的な実施形態では、IGKV2-28およびJK-1由来のヒトアクセプター軽鎖フレームワークは以下の残基(またはその保存的置換)から選択される1個以上、例えば1〜4個、より具体的には2個のアミノ酸残基置換を有する。
Figure 2011506387
本発明のさらに具体的な実施形態では、IGKV2-28およびJK-1由来のヒトアクセプター軽鎖フレームワークは以下の残基(またはその保存的置換基)を含む。
Figure 2011506387
本発明の一実施形態では、配列番号２４に記載の配列を有するVHドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号２６に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号２４に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号２６に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号５９に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６１に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６３に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６５に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号５９に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６１に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６３に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６５に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号５９に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６１に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６３に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号６５に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体を提供する。
抗体重鎖可変領域は、配列番号２４、５９、６１、６３、または６５のいずれか1つに対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する。抗体軽鎖可変領域は、配列番号２６、６７、６９、または７１のいずれか1つに対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する。
本発明の一実施形態では、配列番号２７に記載の配列を有する重鎖を含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖を含む治療用抗体を提供する。
本発明の一実施形態では、配列番号２７に記載の配列を有する重鎖および配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖を含む治療用抗体を提供する。
重鎖可変領域のいずれかを好適なヒト定常領域と組み合わせることができる。軽鎖可変領域のいずれかを好適な定常領域と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、本発明の治療用抗原結合タンパク質は、(a) 古典的経路による補体の活性化の機能; および(b) 抗体依存性細胞性細胞障害を媒介する機能を本質的に欠いている抗体またはその断片および/または誘導体である。
本発明の別の態様では、本発明の治療用抗原結合タンパク質または治療用抗体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の別の態様では、β-アミロイドペプチド関連疾患に罹患しているヒト患者の治療方法であって、本発明の治療用抗原結合タンパク質または治療用抗体の治療有効量を該患者に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の一実施形態では、β-アミロイドペプチド関連疾患はアルツハイマー病である。本発明の別の実施形態では、β-アミロイドペプチド関連疾患疾患は、高いβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物によって特徴付けられる眼または視神経に影響する疾患または障害である。特に、β-アミロイドペプチド関連疾患は加齢性黄斑変性(AMD)、緑内障またはβ-アミロイド依存的白内障形成である。
本発明の別の実施形態では、補体経路、特に代替補体経路のインヒビター、例えば、他の抗補体アプローチを除外することなく: 補体因子H (CFH)またはその断片、可溶性補体受容体1、(sCR1)またはその断片、可溶性細胞膜補因子タンパク質(MCP)およびその断片、可溶性崩壊促進因子(DAF)およびその断片と組み合わせて治療用抗原結合タンパク質を投与する。この関連で、補体経路インヒビターは、補体経路、特に代替補体経路の活性を負に調節するように作用する分子である。
本発明の別の実施形態では、補体経路アクチベータのインヒビター、特に代替補体経路アクチベータのインヒビター、例えば、他の阻害アプローチまたは他の補体経路標的を除外することなく: 補体因子D (CFD)または補体因子B (CFB)活性を中和するための抗体または抗体断片、例えばドメイン抗体と組み合わせて治療用抗原結合タンパク質を投与する。補体成分C3の13残基ペプチドインヒビター、コンプスタチン、および抗C5a補体成分抗体、pexelizumabも、本発明の関連の範囲内で補体経路アクチベータのインヒビターであるとみなされる。一般に、補体経路アクチベータのインヒビターは、所定の補体アクチベータの生物学的活性をある程度阻害またはアンタゴナイズして、その効果が補体経路、特に代替補体経路の活性を負に調節するようにする物質である。
補体を標的にする治療アプローチは最近レビューされており(Ricklin, D & Lambris, J. (2007) Nature Biotechnology 25:1265-75 (参照によりその全体がここに組み入れられる))、該文献中に記載の抗補体経路アプローチはすべて、潜在的に、治療アプローチを提供するために抗アミロイドベータ抗体と組み合わせて使用することできる。考慮される抗補体アプローチには、: (i) プロテアーゼインヒビター、例えば補体因子Dインヒビター、(ii) 可溶性補体調節因子、例えば可溶性切断型補体受容体1、(iii) 治療用抗体、例えば補体因子DまたはBに対する治療用抗体、(iv) 補体成分インヒビター、例えばC5インヒビター、および(v) 受容体アンタゴニスト、例えば小分子C5a受容体アンタゴニストが含まれる。
補体経路インヒビター、または補体経路アクチベータのインヒビターを本発明の治療用抗原結合タンパク質と同時に、または連続して、別々に、または時差様式で投与してよい。
また、本明細書中で規定される治療用抗原結合タンパク質および補体経路インヒビターまたは補体経路アクチベータのインヒビターを含む医薬組成物を提供する。
また、β-アミロイドペプチド関連疾患の治療のための医薬の製造における、本発明の治療用抗原結合タンパク質または治療用抗体の使用を提供する。
また、β-アミロイドに対する、例えば上記β-アミロイドの残基28〜35を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープに対する第1の特異性と補体経路のアクチベータに対する第2の特異性とを有する二重特異性抗体またはその二重特異性断片を提供する。
また、β-アミロイドペプチド関連疾患の治療に使用するための本発明の抗原結合タンパク質、本発明の抗体、または本発明の二重特異性抗体もしくはその二重特異性断片を提供する。
本発明の別の実施形態では、配列番号１９の配列を有するマウスVHドメインおよび配列番号２１の配列を有するマウスVL ドメインを含む抗体またはその断片を提供する。
本発明の別の実施形態では、配列番号１９の配列を有するVHドメインを含む抗体重鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチド、特に配列番号２０のポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の実施形態では、配列番号２１の配列を有するVLドメインを含む抗体軽鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチド、特に配列番号２２のポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一態様では、ELISAアッセイにおいて、β-アミロイドに対する結合に関して、配列番号２７に記載の配列を有する重鎖および配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖を含む抗体と競合する抗原結合タンパク質を提供する。
当業者は、抗原結合タンパク質(抗原結合タンパク質A)が、配列番号２７に記載の配列を有する重鎖および配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖を含む抗体(抗体B)と、特異的結合部位(β-アミロイド)に関して競合するために、抗原結合タンパク質Aは該アッセイにおいて効果を有するために十分な量で存在しなければならないことを認識する。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質Aおよび抗体Bは等モル量で存在する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質Aの存在は、ELISAアッセイにおいて、β-アミロイドへの抗体Bの結合を10%、20%、30%、40%または50%を超えて減少させる。別の実施形態では、ELISAアッセイにおいてβ-アミロイドをイムノアッセイプレートに結合させる。別の実施形態では、抗原結合タンパク質Aは、プレートに結合しているβ-アミロイドに対する抗体Bの結合を減少させるが、非β-アミロイド特異的コントロールはそうではない。
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２７および配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のポリペプチドを含む重鎖および軽鎖を含む治療用抗体であり、該抗体はβ-アミロイドに結合する。好ましい実施形態では、該抗体は、β-アミロイドの残基28〜35を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する。
本発明の別の態様では、表面プラズモン共鳴によって測定された場合にβ-アミロイドの残基24〜35 (配列番号１０)または28〜39 (配列番号１１)を含むC末端ビオチニル化β-アミロイドペプチドに結合する抗原結合タンパク質を提供し、該ペプチドはストレプトアビジンセンサーチップに結合している。
本発明の別の態様では、β-アミロイドに特異的に結合し、かつβ-アミロイドの28〜35領域中の少なくとも1個の残基を結合に必要とする抗原結合タンパク質、特にモノクローナル抗体またはその断片を提供する。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、さらに、β-アミロイドの28〜35領域中の該少なくとも1個の残基に対する少なくとも1個のフランキング残基または構造上隣接する残基を結合に必要とする。したがって、抗原結合タンパク質は、独立して、β-アミロイドの28、29、30、31、32、33、34および35からなる群から選択される1、2、3、4、5またはそれ以上の残基、およびフランキング残基または構造上隣接する残基を必要とする。
当業者は、例えばELISAアッセイでアラニン置換スキャニングを使用して、そのような抗原結合タンパク質を容易に特定することができる。この点において、抗原結合タンパク質がβ-アミロイドの28〜35領域中の残基、またはフランキング残基もしくは構造上隣接する残基を結合に必要とするか否かは、β-アミロイドの該残基をアラニンで独立して置換し、アラニン置換β-アミロイドペプチドに対する抗原結合タンパク質の結合親和性を野生型β-アミロイドに対する抗原結合タンパク質の結合親和性と比較することによって決定することができる。β-アミロイドの28〜35領域中の残基が必要とされるか否かは、野生型β-アミロイドペプチドと比較されたアラニン置換β-アミロイドペプチドに対する抗原結合タンパク質の結合親和性の減少によって定められ、該減少はBiacoreまたはELISA親和性測定によって測定された場合に1、2、3、4または5倍を超える。
さらに、この関連での構造上隣接する残基は、問題の残基に三次元空間で接近し、かつ抗原結合タンパク質が結合する残基である。当業者は、抗原エピトープが線状または非線状ペプチド配列であってよいことを認識する。後者の非線状の場合、残基はペプチド鎖の異なる領域由来であるが、それらは抗原の三次元構造において接近している。そのような構造上隣接する残基は、コンピュータモデリングプログラムによって、またはX線結晶構造解析等の当技術分野において公知の方法によって得られる三次元構造によって決定することができる。
本発明の別の態様では、本発明の抗体の製造方法であって、宿主細胞中で抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法を提供する。
本発明の別の態様では、配列番号２４に記載の配列を有するVH鎖を含む治療用抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の態様では、配列番号２６に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の態様では、配列番号２７に記載の配列を有する治療用抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の態様では、配列番号２８に記載の配列を有する治療用抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明のさらに具体的な実施形態では、配列番号２９に記載の配列を含む、治療用抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別のさらに具体的な実施形態では、配列番号３０に記載の配列を含む、治療用抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
図１は、6F6抗体または6E10 (ヒトAβ1-16に特異的な抗体; 市販の試薬、Eurogentec)および5G5 (Aβ1-42に特異的な抗体; 自家試薬)を使用する種々の型のベータアミロイドのウエスタンブロット検出を示す。 図２は、平均値±平均の標準誤差として表される皮質(ortical)プラーク面積%で表される17mg/kgまたは33mg/kg 6F6での治療後のトランスジェニックhAPPマウスの皮質および海馬の脳切片中のプラーク量(plaque load)を示す棒グラフを示す。 図３は、平均値±平均の標準誤差として表されるmm2あたりのプラーク数で表される17mg/kgまたは33mg/kg 6F6での治療後のトランスジェニックhAPPマウスの皮質および海馬の脳切片中のプラーク量を示す棒グラフを示す。 図４は、老齢CFH -/- マウスの網膜中のアミロイドベータの検出を示す。 図５は、老齢CFH -/- マウスの網膜中のアミロイドベータに対する6F6の交差反応性を示す。
発明の詳細な説明
1. 抗原結合タンパク質
本明細書中で使用される用語「抗原結合タンパク質」とは、以下でさらに考察されるように、抗体、抗体断片および他のタンパク質構築物、例えばドメイン、特にβ-アミロイドに結合可能なものを表す。
1.1 無傷の抗体
本発明の抗原結合タンパク質は「無傷(intact)の抗体」であってよい。本発明の抗原結合タンパク質には、抗体またはその抗原結合断片および/または誘導体である治療用抗体が含まれる。無傷の抗体は、通常、少なくとも2つの重鎖および2つの軽鎖を含むヘテロ多量体の糖タンパク質である。IgMを除いて、無傷の抗体は、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖からなる約150KDaのヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的に、各軽鎖は1つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でジスルフィド結合の数は変動する。また、各重鎖および軽鎖は鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に可変ドメイン(VH)を有し、いくつかの定常領域が続く。各軽鎖は可変ドメイン(VL)およびその他方の端の定常領域を有し; 軽鎖の定常領域は重鎖の第1の定常領域と並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダと称される2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ヒト抗体を5つの異なるクラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに割り当てることができる。IgGおよびIgAはサブクラス、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4; ならびにIgA1およびIgA2にさらに細分することができる。種変異体は、少なくともIgG2a、IgG2bを有するマウスおよびラットで存在する。抗体の可変ドメインは抗体に結合特異性を与え、相補性決定領域(CDR)と称される特定の可変性を示す特定の領域を有する。可変領域の、より保存されている部分はフレームワーク領域(FR)と称される。無傷の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、3つのCDRによって連結された4つのFRを含む。各鎖中のCDRはFR領域によって密接してまとめられ、他方の鎖由来CDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)への関与、Fcγ受容体への結合を介する食作用、新生児Fc受容体(FcRn)を介する半減期/クリアランス速度および補体カスケードのC1q成分を介する補体依存性細胞傷害等の種々のエフェクター機能を示す。ヒトIgG2定常領域は、古典的経路によって補体を活性化するかまたは抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を本質的に欠いていることが報告されている。IgG4定常領域は、古典的経路によって補体を活性化する能力を欠き、かつ抗体依存性細胞性細胞傷害を弱くしか媒介しないことが報告されている。これらのエフェクター機能を本質的に欠いている抗体は、「非溶解性(non-lytic)」抗体と称される。
1.1.1 ヒト抗体
本発明の抗原結合タンパク質はヒト抗体であってよい。ヒト抗体は当業者に公知のいくつかの方法によって製造することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス-ヒトヘテロミエローマセルラインを使用するハイブリドーマ法によって作製することができる。Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984)およびBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)を参照のこと。代替法には、ファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用が含まれ、それらはともに、ヒトV領域レパートリーを利用する(Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23を参照のこと)。
マウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置換されているいくつかのトランスジェニックマウス系統が現在利用可能である(Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156を参照のこと)。抗原チャレンジ時に、そのようなマウスはヒト抗体のレパートリーを生産可能であり、そのレパートリーから目的の抗体を選択することができる。
特に注目すべきはTrimeraTM系(Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161を参照のこと)(該系では、ヒトリンパ球を放射線照射マウスに移植する)、選択リンパ球抗体系(Selected Lymphocyte Antibody System)(SLAM, Babcook et al, PNAS (1996) 93:7843-7848を参照のこと)(該系では、ヒト(または他の種の)リンパ球を、効果的に、大規模なプールされたin vitro抗体産生手順およびその後のデコンビュレート(deconvulated)された限界希釈および選択手順にかける)、およびXenomouse IITM (Abgenix Inc)である。MorphodomaTMテクノロジーを使用する代替アプローチはMorphotek Incから入手可能である。
ファージディスプレイテクノロジーを使用してヒト抗体(およびその断片)を製造することができる。McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990)およびGriffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260を参照のこと。この技術では、抗体Vドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばM13またはfdのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上で機能的抗体断片として(通常ヘルパーファージの支援を受けて)ディスプレイする。抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。ファージディスプレイ技術を使用して、上記疾患または障害に罹患した個体から、あるいは免疫されていないヒトドナーから採取されたヒトB細胞から作製されたライブラリーから抗原に特異的な抗体を選択することができる(Marks; J.Mol.Biol. 222,581-597, 1991を参照のこと)。Fcドメインを含む無傷のヒト抗体が所望である場合、所望の定常領域を含みかつ安定な発現セルラインを確立している哺乳類発現ベクターにファージディスプレイされた誘導体断片を再クローニングすることが必要である。
親和性成熟の技術を使用して結合親和性を向上させてもよい。これは、例えば、連続的にHおよびL鎖V領域を天然に存在する変異体で置換し、向上した結合親和性に基づいて選択することによって達成することができる(Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)。この技術の変法、例えば「エピトープインプリンティング」もまた現在利用可能である(WO 93/06213, Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993))。つい最近、親和性成熟された抗体は、例えば誤りがちのRNAレプリカーゼを使用することによるV領域またはCDRのランダム突然変異誘発およびその後の、これらのライブラリーからのリボソームディスプレイ選択技術による選択によって得られている(Kopsidas G BMC Biotechnology. 7:18, 2007)。
1.1.2 キメラおよびヒト化抗体
本発明の抗原結合タンパク質は「キメラ」または「ヒト化」抗体であってよい。ヒト疾患または障害の治療での無傷の非ヒト抗体の使用は、現在十分に確立されている潜在的免疫原性の問題を、特に抗体の反復投与時に伴う: すなわち、患者の免疫系は、非ヒトの無傷の抗体を非自己として認識し、中和応答を開始する。完全なヒト抗体(上記)を開発することに加えて、これらの問題を克服するために長年にわたって種々の技術が開発されており、一般に、免疫された動物、例えばマウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を取得する際の相対的容易さを保持しながら、無傷の治療用抗体中の非ヒトアミノ酸配列の組成を減らすことを含む。これを達成するために広く2つのアプローチが使用されている。第1のアプローチはキメラ抗体であり、キメラ抗体は、一般に、ヒト定常領域に融合された非ヒト(例えばマウス等のげっ歯類)可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変領域内に位置するため、キメラ抗体は抗原に関するその結合親和性を保持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、したがって上記のようにエフェクター機能を実施することができる。キメラ抗体は典型的に組換えDNA法を使用して製造される。抗体をコードするDNA (例えばcDNA)を、慣用の手順を使用して(例えば本発明の抗体のHおよびL鎖可変領域をコードする遺伝子、例えば上記配列番号１９および２１のDNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)単離し、シークエンシングする。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの典型的供給源として有用である。単離されたら、DNAを発現ベクターに入れ、次いで該発現ベクターを、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない宿主細胞、例えばE.Coli、COS細胞、CHO細胞、PerC6細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトして抗体の合成を達成する。ヒトLおよびH鎖のコード配列を、対応する非ヒト(例えばマウス) HおよびL定常領域の代わりに使用することによってDNAを改変してよい。例えばMorrison; PNAS 81, 6851 (1984)を参照のこと。ゆえに、本発明の別の実施形態では、ヒト定常領域(恐らくIgGアイソタイプ、例えばIgG1の定常領域)に融合された、配列番号１９の配列を有するVHドメインおよび配列番号２１の配列を有するVLドメインを含むキメラ抗体を提供する。
第2のアプローチは、抗体の非ヒト部分が可変領域のヒト化によって減少しているヒト化抗体の作製を含む。2つのヒト化技術が人気を得ている。第1の技術はCDR移植によるヒト化である。CDRは、抗体のN末端の近くにループを形成し、それらは、フレームワーク領域によって提供される骨格にマウントされた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、トポグラフィーによっておよびそのCDR表面の化学的特性によって主に規定される。これらの特徴は、ひいては、個々のCDRのコンフォメーションによって、CDRの相対的配置によって、およびCDRを構成する残基の側鎖の性質および配置によって決定される。非ヒト(例えばマウス)抗体(「ドナー」抗体)のCDRのみを、好適なヒトフレームワーク(「アクセプターフレームワーク」)および定常領域に移植することによって免疫原性の大きな低下を達成することができる(Jones et al (1986) Nature 321,522-525およびVerhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536を参照のこと)。しかし、CDR移植は、本質的に、抗原結合特性の完全な保持をもたらさず、重大な抗原結合親和性を回収しようとする場合、ヒト化分子中でドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基を保存する(「復帰突然変異」と称されることもある)必要があることがよく見出される(Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502を参照のこと)。この場合、ヒトフレームワーク(FR)を提供するために、非ヒトドナー抗体に対して最大配列ホモロジー(典型的に60%以上)を示すヒトV領域をデータベースから選択することができる。ヒトFRの選択はヒトコンセンサスまたは個別のヒト抗体から行うことができる。必要であれば、CDRコンフォメーションを保存するために、ドナー抗体由来の重要な残基をヒトアクセプターフレームワーク内に代用する。抗体のコンピュータモデリングを使用して、そのような構造上重要な残基の特定を支援することができる。WO99/48523を参照のこと。
あるいは、ヒト化は「ベニアリング(veneering)」の処理によって達成することができる。固有のヒトおよびマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計解析では、ヒトおよびマウス抗体において露出残基の厳密なパターンが異なり、ほとんどの個々の表面位置は少数の異なる残基に関して強い優先性を有することが示された(Padlan E.A. et al; (1991) Mol.Immunol.28, 489-498およびPedersen J.T. et al (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照のこと)。したがって、ヒト抗体で通常見出される露出残基と異なるフレームワーク領域中の露出残基を置換することによって非ヒトFvの免疫原性を低下させることが可能である。タンパク質抗原性は表面到達性と相関しうるため、表面残基の置換は、マウス可変領域をヒト免疫系に対して「不可視」にするために十分である(Mark G.E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134も参照のこと)。このヒト化手順は「ベニアリング」と称される。その理由は、抗体の表面だけが改変され、支持残基は元のままであるからである。さらに代替のアプローチには、WO04/006955に記載のアプローチおよびHumaneeringTM (Kalobios)の手順が含まれる。該手順は細菌発現系を活用し、ヒト生殖細胞系に近い配列の抗体を生産する(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego,California)。
用語「由来(derived)」は、それが物質の物理的起源であるという意味での供給源を規定するだけでなく、該物質と構造的に同一であるが参照供給源を起源としない物質をも規定するとされることが当業者には明らかである。ゆえに「ドナー抗体中に見出される残基」は、必ずしも、ドナー抗体から精製されたことを必要としない。
特定のアミノ酸置換が「保存的」であるとみなされることが当技術分野において十分に認識される。アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられ、本発明の治療用抗体のすべてまたは実質的にすべての結合親和性を維持するグループ内の置換は保存的置換とみなされる。以下の表1を参照のこと。
Figure 2011506387
1.1.3 多重および二重特異性抗体
本発明の抗原結合タンパク質は多重特異性であってよく、すなわち2種以上の抗原に結合してよい。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体誘導体であり、二重特異性抗体もまた本発明の部分を形成する。そのような抗体の製造方法は当技術分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は2つの免疫グロブリンH鎖-L鎖ペアの共発現に基づき、該2つのH鎖は異なる結合特異性を有する。Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829およびTraunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659を参照のこと。HおよびL鎖のランダムな組み合わせのせいで、10種の異なる抗体構造の候補混合物が得られ、そのうち1種のみが所望の結合特異性を有する。代替アプローチでは、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域の少なくとも部分、CH2およびCH3領域を含む重鎖定常領域に融合させるステップを含む。融合物の少なくとも一方に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有するCH1領域を有することが好ましい。これらの融合物、および所望であればL鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、次いで好適な宿主生物内に共トランスフェクトする。しかし、2つまたは全3つの鎖のコード配列を1発現ベクター内に挿入することが可能である。好ましい1アプローチでは、二重特異性抗体は、一方のアームの第1の結合特異性を有するH鎖および他方のアームの第2の結合特異性を提供するH-L鎖ペアから構成される。WO94/04690を参照のこと。また、Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986を参照のこと。
治療用タンパク質の脳への送達は血液脳関門(BBB)の存在によって阻止されており、眼と血流の間には、類似の血液網膜関門が存在する。本発明の抗原結合タンパク質、例えば本発明の抗体または本発明の抗体断片をBBB等の生物学的障壁を横切って送達することが所望である場合、必要であればそのような送達を増強する種々のストラテジーが提唱されており、血液網膜関門の横断を可能にするために類似のストラテジーが適用可能である。
血液から必要な栄養分および因子を得るために、BBBは、循環血液から脳へ化合物を輸送するいくつかの特定の受容体を有する。インスリン(Duffy KR et al (1989) Brain Res. 420:32-38を参照のこと)、トランスフェリン(Fishman JB et al (1987) J.Neurosci 18:299-304を参照のこと)およびインスリン様成長因子1および2 (Pardridge WM (1986) Endocrine Rev.7:314-330およびDuffy KR et al (1986) Metabolism 37:136-140を参照のこと)等のいくつかの化合物が受容体を介するトランスサイトーシスによってBBBを横切ることが研究で示されている。ゆえにこれらの分子の受容体は、いわゆる「誘導(vectored)」抗体を使用して本発明の治療用抗体が脳にアクセスするための潜在的手段を提供する(Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321を参照のこと)。例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体は脳実質内に動的に輸送されることが示されている(Friden PM et al (1991) PNAS 88:4771-4775およびFriden PM et al (1993) Science 259:373-377を参照のこと)。ゆえに、1つの候補アプローチは、第1の特異性が、上記β-アミロイドの残基28〜35を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを標的にし、かつ第2の特異性が、BBBに位置する輸送受容体を標的にし、例えば第2の特異性がトランスフェリン輸送受容体を標的にする、上記のような二重特異性抗体または二重特異性断片を製造することである。
本発明によって想定される他の二重特異性抗体には、β-アミロイドに対する第1の特異性および補体経路のアクチベータ、例えば、他のものを除外することなく、補体因子D等の補体因子、に対する第2の特異性をその活性を阻害することを目的として有する二重特異性抗体またはその二重特異性断片が含まれる。
本発明の多重特異性抗原結合タンパク質には、β-アミロイド、例えば上記β-アミロイドの残基28〜35を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープに対する第1の特異性、BBBまたは血液-網膜関門に位置する輸送受容体に対する第2の特異性、および補体経路のアクチベータに対する第3の特異性を有するタンパク質が含まれる。
1.2 抗体断片および、ドメイン等の他のタンパク質構築物
本発明の特定の実施形態では、抗原結合断片である治療用抗体を提供する。そのような断片は無傷および/またはヒト化および/またはキメラ抗体の機能的抗原結合断片であってよく、例えば上記抗体のFab、Fd、Fab'、F(ab')2、Fv、ScFv断片であってよい。定常領域を欠いている断片は、古典的経路によって補体を活性化する能力または抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を欠いている。伝統的にそのような断片は、無傷の抗体のタンパク質分解による消化によって、例えばパパイン消化によって製造される(例えばWO 94/29348を参照のこと)が、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接製造してもよい。ScFvの製造に関しては、Bird et al; (1988) Science, 242, 423-426を参照のこと。さらに、下記のような種々の工学技術を使用して抗体断片を製造することができる。
Fv断片は、Fab断片より低い、その2つの鎖の相互作用エネルギーしか有さないようである。VHおよびVLドメインの会合を安定化するために、それらはペプチド(Bird et al, (1988) Science 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883)、ジスルフィド架橋(Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367)および「ノブ・イン・ホール(knob in hole)」突然変異(Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788)で連結されている。ScFv断片は当業者に周知の方法によって製造することができる。Whitlow et al (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105およびHuston et al (1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217を参照のこと。ScFvはE.Coli等の細菌細胞で製造することができるが、より典型的には、真核細胞で製造する。ScFvの不都合の1つは生成物の一価性(monovalency)であり、それは、多価結合に起因する高いアビディティーを妨げ、かつ半減期が短い。これらの問題を克服する試みには、化学カップリング(Adams et al (1993) Can.Res 53, 4026-4034およびMcCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314)によって、または対になっていないC末端システイン残基を含有するScFvの自発的部位特異的二量体化(Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204を参照のこと)によって追加のC末端システインを含有するScFVから製造される二価(ScFv')2が含まれる。あるいは、ペプチドリンカーを3〜12個の範囲の残基に短くして「ダイアボディ(diabodies)」を形成させることによってScFvに多量体を形成させることができる。Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448を参照のこと。リンカーを縮小することによって、さらに、ScFV三量体(「トリアボディ(triabodies)」, Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433を参照のこと)および四量体(「テトラボディ(tetrabodies)」, Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168を参照のこと)を得ることができる。二価ScFV分子の構築は、「ミニ抗体(miniantibodies)」(Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584を参照のこと)および「ミニボディ(minibodies)」(Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061を参照のこと)を形成するためのタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によって達成することもできる。2つのScFv単位を第3のペプチドリンカーによって連結することによってScFv-Sc-Fvタンデム((ScFV)2)を製造してもよい。Kurucz et al (1995) J.Immol.154, 4576-4582を参照のこと。二重特異性ダイアボディは、別の抗体のVLドメインに短いリンカーによって連結された1抗体由来のVHドメインからなる2つの単鎖融合産物の非共有結合性の会合によって製造することができる。Kipriyanov et al (1998), Int.J.Can 77,763-772を参照のこと。そのような二重特異性ダイアボディの安定性は、上記のようなジスルフィド架橋または「ノブ・イン・ホール」突然変異の導入によってまたは、2つのハイブリッドScFv断片がペプチドリンカーによって連結されている単鎖ダイアボディ(ScDb)の形成によって増強することができる。Kontermann et al (1999) J.Immunol.Methods 226 179-188を参照のこと。四価二重特異性分子は、例えばScFv断片をIgG分子のCH3ドメインまたはFab断片にヒンジ領域を介して融合させることによって入手可能である。Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163を参照のこと。あるいは、四価二重特異性分子は二重特異性単鎖ダイアボディの融合によって作製されている(Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94を参照のこと。ヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフを含有するリンカーでのScFv-ScFvタンデム(DiBiミニ抗体, Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49を参照のこと)または分子内対形成を妨げる向きで4つの抗体可変ドメイン(VHおよびVL)を含む単鎖分子(タンデムダイアボディ(tandem diabody), Kipriyanov et al, (1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56を参照のこと)の二量体化によって、より小さい四価二重特異性分子を形成させることもできる。二重特異性F(ab')2断片は、Fab'断片の化学カップリングによってまたはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる(Shalaby et al, (1992) J.Exp.Med. 175, 217-225およびKostelny et al (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553を参照のこと)。また、単離されたVHおよびVLドメインも利用可能である。US 6, 248,516; US 6,291,158; US 6, 172,197を参照のこと。
フレーズ「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、異なるV領域またはドメインと無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH, VHH, VL)を表す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインを伴う形態(例えばホモ-またはヘテロ-多量体)で存在してよく、その場合、該他の領域またはドメインは単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない(すなわち、その場合、免疫グロブリン単一可変ドメインが追加の可変ドメインとは無関係に抗原に結合する)。「ドメイン抗体」または「dAb」は、該用語が本明細書中で使用されるように、抗原に結合可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインはヒト抗体可変ドメインであってよいが、(例えばWO 00/29004で開示されるように)げっ歯類、テンジクザメ(nurse shark)およびラクダ科(Camelid) VHH dAb等の他の種由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダ科VHHは、天然に軽鎖を欠いている重鎖抗体を生産する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのようなVHHドメインは、当技術分野において利用可能な標準的技術にしたがってヒト化することができ、そのようなドメインは、依然として、本発明の「ドメイン抗体」であるとみなされる。本明細書中で使用されるように"VHにはラクダ科VHHドメインが含まれる。
抗原結合断片は、ドメイン等の非抗体タンパク質骨格上での1つ以上のCDRの配置を用いて提供してもよい。ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合することができる。これは上記のようにドメイン抗体であるか、または、天然リガンド以外の抗原への結合を達成するためにタンパク質工学に付されている、CTLA-4、リポカリン(lipocalin)、SpA、Affibody、アビマー(avimer)、GroEl、トランスフェリン、GroESおよびフィブロネクチン/アドネクチン(adnectin)からなる群から選択される骨格の誘導体であるドメインであってよい。
この関連で、用語「ドメイン」とは、残りのタンパク質とは無関係の三次構造を有するフォールディングしたタンパク質構造を表す。一般に、ドメインはタンパク質の個別の機能的特性に関与し、多くの場合、残りタンパク質および/または残りのドメインの機能喪失を伴うことなく、他のタンパク質に対して付加、除去または転移させることができる。「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含むフォールディングしたポリペプチドドメインである。したがって、それには、完全抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメイン、例えば、1つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換されている改変された可変ドメイン、または切断されているか、もしくはNもしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに完全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持するフォールディングした可変ドメイン断片が含まれる。
1.3 ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は誘導体であり、それもまた、本発明の実施形態を形成する。ヘテロコンジュゲート抗体は2つの、共有結合によって連結された、任意の好都合な架橋方法を使用して形成された抗体から構成される。US 4,676,980を参照のこと。
1.4 他の改変
抗体のFc領域と種々のFc受容体(FcγR)との間の相互作用は抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられ、該エフェクター機能には、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)、補体の固定、食作用および抗体の半減期/クリアランスが含まれる。所望のエフェクター特性に応じて本発明の抗体のFc領域への種々の改変を実行することができる。特に、(a) 古典的経路による補体の活性化の機能; および(b) 抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する機能を本質的に欠いているヒト定常領域には、IgG4定常領域、IgG2定常領域および、EP0307434 (WO8807089)、EP 0629 240 (WO9317105)およびWO 2004/014953で開示される例えば位置234、235、236、237、297、318、320および/または322での突然変異のような特定の突然変異を含有するIgG1定常領域が含まれる。重鎖定常領域のCH2ドメイン内の残基235または237での突然変異(Kabatナンバリング; EU Index系)は、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIII結合への結合を減少させ、したがって抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を減少させることが別途記載されている(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168)。さらに、いくつかの報告では、補体依存性細胞傷害(CDC)の漸加または媒介にこれらの残基のいくつかが関与することも記載されている(Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168)。したがって、補体媒介性およびFcγR媒介性の両効果を減少させるために、残基235および237はともにアラニン残基に突然変異させられている(Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48; およびWO9958679)。これらの定常領域を含む抗体は「非溶解性」抗体と称される。
サルベージ受容体結合エピトープを抗体に組み込んで血清半減期を増加させることができる。US 5,739,277を参照のこと。
5種の現在認識されているヒトFcγ受容体、FcγR (I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaおよび新生児FcRnが存在する。Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604では、共通セットのIgG1残基はすべてのFcγRの結合に関与するが、FcγRIIおよびFcγRIIIはこの共通セットの外部の異なる部位を利用することが示された。1群のIgG1残基: Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297およびPro-239は、アラニンに改変された場合にすべてのFcγRに対する結合を減少させた。すべてはIgG CH2ドメイン中にあり、CH1およびCH2を連結するヒンジ付近でクラスターを形成している。FcγRIは共通セットのIgG1残基のみを結合に利用するが、FcγRIIおよびFcγRIIIは共通セットに加えて別の残基と相互作用する。いくつかの残基の改変はFcγRII (例えばArg-292)またはFcγRIII (例えばGlu-293)のみに対する結合を減少させた。いくつかの変異体はFcγRIIまたはFcγRIIIに対する結合の向上を示したが、他の受容体への結合には影響しなかった(例えばSer-267AlaはFcγRIIに対する結合を向上させたが、FcγRIIIに対する結合は影響を受けなかった)。他の変異体はFcγRIIまたはFcγRIIIに対する向上した結合を示し、他の受容体に対する結合は減少した(例えば、Ser-298AlaはFcγRIIIに対する結合を向上させ、かつFcγRIIに対する結合を減少させた)。FcγRIIIaでは、最良の結合を示すIgG1変異体はSer-298、Glu-333およびLys-334でのアラニン置換の組み合わせを有した。新生児FcRn受容体は、IgG分子の分解からの保護およびゆえに血清半減期および組織を横切るトランスサイトーシスの向上に関与すると考えられる(Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57およびGhetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766を参照のこと)。ヒトFcRnと直接相互作用することが決定されているヒトIgG1残基には、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435が含まれる。
本発明の治療用抗体は任意の上記定常領域の改変を包含してよい。
特定の実施形態では、治療用抗体は、(a) 古典的経路による補体の活性化の機能; および(b) 抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する機能を本質的に欠いている。さらに具体的な実施形態では、本発明は、半減期/クリアランスおよび/またはエフェクター機能、例えばADCCおよび/または補体依存性細胞傷害および/または補体溶解を改変するための上で詳述される残基変化の任意の1つ(またはそれ以上)を有する本発明の治療用抗体を提供する。
本発明の別の態様では、治療用抗体は235 (例えばL235A)および237 (例えばG237A)(Kabatで概説されるEUスキームにしたがうナンバリング)位でのアラニン(または他の崩壊性)置換を有するアイソタイプヒトIgG1の定常領域を有する。
本発明の他の誘導体には、本発明の抗体のグリコシル化変異体が含まれる。定常領域中の保存された位置での抗体のグリコシル化は、上記のような抗体機能、特にエフェクター機能性に対して顕著な影響を有することが知られている。例えばBoyd et al (1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318を参照のこと。1つ以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失または修飾されている本発明の治療用抗体のグリコシル化変異体が想定される。アスパラギン-X-セリンまたはアスパラギン-X-スレオニンモチーフの導入は炭水化物部分の、酵素による取り付けのための潜在的部位を創出し、したがって抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876では、ベータ-1, 4-ガラクトシルトランスフェレース(beta-1, 4-galactosyltransferace)および/またはアルファ, 2,3シアリルトランスフェラーゼを使用する再ガラクトシル化および/または再シアリル化の処理によってTNFR-IgGイムノアドヘシンの末端シアリル化(sialyation)を増加させた。末端シアリル化の増加は免疫グロブリンの半減期を増加させると考えられる。典型的に、抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、グリコフォームの混合物として天然に生産される。この混合物は、抗体が真核生物、特に哺乳類細胞中で生産される場合に特に明らかである。特定のグリコフォームを製造する種々の方法が開発されている。Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727を参照のこと。ゆえに、本発明は、本明細書中に記載の複数の治療用抗体(IgGアイソタイプ、例えばIgG1の抗体であってよい)であって、該抗体の特定数(例えば7以下、例えば5以下、例えば2または1つ)のグリコフォーム(群)を含む複数の治療用抗体に関する。
また、本発明の誘導体には、非タンパク質性(non-proteinaeous)ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンにカップリングされた本発明の治療用抗体が含まれる。PEGに対するタンパク質のコンジュゲーションは、タンパク質の半減期を長くし、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を減少させるための確立された技術である。異なる分子量およびスタイル(直鎖または分岐)を有するペグ化の使用が無傷の抗体ならびにFab'断片を用いて調査されている。Koumenis I.L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95を参照のこと。特定の実施形態は、PEGにカップリングされている、(a) 古典的経路による補体の活性化のエフェクター機能; および(b) 抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介するエフェクター機能を有さない本発明の抗原結合断片(例えばFab断片またはscFv)を含む。
2. 製造方法
本発明の抗体はトランスジェニック生物、例えばヤギ(Pollock et al (1999), J.Immunol.Methods 231:147-157を参照のこと)、ニワトリ(Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55を参照のこと)、マウス(Pollock et al同書を参照のこと)または植物(Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590を参照のこと)中で製造することができる。抗体は化学合成によって製造してもよい。しかし、本発明の抗体は、典型的に、当業者に周知の組換え細胞培養テクノロジーを使用して製造される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞中でのさらなる増殖または発現のためにプラスミド等の複製可能ベクターに挿入する。有用な発現系の1つはグルタミン酸合成酵素系(Lonza Biologicsによって販売されている系等)であり、特に該系では、宿主細胞はCHOまたはNS0である(下記参照のこと)。抗体をコードするポリヌクレオチドは慣用の手順(例えばオリゴヌクレオチドプローブ)を使用して容易に単離およびシークエンシングすることができる。使用することができるベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体(minichromsomes)が含まれ、それらのうちプラスミドが典型的な実施形態である。一般に、そのようなベクターはさらに、発現を容易にするよう、軽鎖および/または重鎖ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシグナル配列、複製開始点、1種以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列を含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを別々のベクターに挿入して、同一の宿主細胞内に(例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入によって)同時にまたは逐次導入するか、または、所望であれば、重鎖および軽鎖をともに同一のベクターに挿入した後にそのような導入を行うことができる。
遺伝暗号の縮重のせいで、本発明のポリペプチドをコードする本明細書中で開示されるポリヌクレオチドの代替ポリヌクレオチドもまた利用可能であることが当業者には自明である。
2.1 シグナル配列
本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体は、成熟タンパク質のN末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として製造することができる。該シグナル配列は宿主細胞によって認識およびプロセシングされるべきである。原核宿主細胞では、該シグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンIIリーダーであってよい。酵母の分泌では、該シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダーであってよい。例えばWO90/13646を参照のこと。哺乳類細胞系では、ウイルス分泌性リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルおよびネイティブの免疫グロブリンシグナル配列(例えばヒトIg重鎖)が利用可能である。典型的に、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにリーディングフレーム(読み枠)でライゲートされる。
2.2 複製開始点
複製開始点は当技術分野において周知であり、ほとんどのグラム陰性菌に好適なpBR322、ほとんどの酵母に関する2μプラスミドおよびほとんどの哺乳類細胞に関する種々のウイルス起点、例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVがある。一般に、SV40複製開始点成分は完全な(integrated)哺乳類発現ベクターには必要とされない。しかしSV40 oriを含ませてよい。その理由は、それが初期プロモータを含有するからである。
2.3 選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、(a) 抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、または(b) 栄養要求性欠損を補完するかもしくは複合培地中で利用可能でない栄養分を供給するか、または(c) 両者の組み合わせのタンパク質をコードする。選択スキームは、ベクターまたはベクター群を含有しない宿主細胞の成長を停止させることを含む。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子でうまく形質転換された細胞は、例えば、共送達された選択マーカーによって付与された薬剤耐性のおかげで生存する。一例はDHFR選択系であり、該系では、DHFR陰性宿主株において形質転換体を作製する(例えばPage and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68を参照のこと)。この系では、DHFR遺伝子を本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体のポリヌクレオチド配列と共送達し、そしてDHFR陽性細胞をヌクレオシド離脱によって選択する。必要であれば、DHFRインヒビターであるメトトレキセートも、DHFR遺伝子増幅での形質転換体の選択に用いられる。本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体のコード配列またはその機能的誘導体にDHFR遺伝子を作動可能に連結することによって、DHFR遺伝子の増幅に伴って目的の所望の抗原結合タンパク質、例えば抗体の配列の増幅が生じる。CHO細胞はこのDHFR/メトトレキセート選択に特に有用なセルラインであり、DHFR系を使用して宿主細胞を増幅および選択する方法は当技術分野において十分に確立されている。Kaufman R.J. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621を参照のこと。レビューに関しては、Werner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug.を参照のこと。追加の例はグルタミン酸合成酵素発現系である(Bebbington et al Biotechnology 1992 Vol 10 p169)。酵母での使用に好適な選択遺伝子はtrp1遺伝子である; Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979を参照のこと。
2.4 プロモーター
本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体を発現するために好適なプロモーターは、該抗原結合タンパク質、例えば抗体をコードするDNA/ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。原核生物の宿主のためのプロモーターには、phoAプロモーター、ベータ-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばTacが含まれる。酵母細胞での発現に好適なプロモーターには、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド(glyceralderhyde) 3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが含まれる。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび、窒素代謝またはマルトース/ガラクトース利用に関与する酵素が含まれる。
哺乳類細胞系での発現のためのプロモーターには、RNAポリメラーゼIIプロモーター、例えばウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス(例えばアデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(特に前初期遺伝子プロモーター)、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターおよび初期または後期シミアンウイルス40および非ウイルスプロモーター、例えばEF-1アルファ(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322が含まれる。プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。
2.5 エンハンサー要素
適切な場合には、例えば高等真核生物(eukaroytics)での発現に関して、上記プロモーター中に位置することが見出されるものの代わりにまたはそれらに加えて追加のエンハンサー要素を含ませることができる。好適な哺乳類のエンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオニン(metallothionine)およびインスリン由来のエンハンサー要素が含まれる。あるいは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー要素、例えばSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスIgG2a遺伝子座を使用することができる(WO04/009823を参照のこと)。そのようなエンハンサーは典型的にプロモーターの上流部位でベクター上に位置するが、他の場所、例えば非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に位置することもできる。エンハンサーの選択および位置は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。
2.6 ポリアデニル化/終結
真核生物の系では、本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体をコードするポリヌクレオチドにポリアデニル化シグナルを作動可能に連結する。そのようなシグナルは典型的にオープンリーディングフレームの3'に置かれる。哺乳類の系では、シグナルの非限定的な例には、成長ホルモン、伸長因子-1アルファおよびウイルス(例えばSV40)遺伝子またはレトロウイルス長末端反復配列由来のものが含まれる。酵母の系では、ポリデニル化(polydenylation)/終結シグナルの非限定的な例には、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)およびアルコールデヒドロゲナーゼ1 (ADH)遺伝子由来のものが含まれる。原核生物の系では、ポリアデニル化シグナルは典型的に必要とされず、代わりに、より短くてより限定されたターミネーター配列を用いることが通常である。ポリアデニル化/終結配列の選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。
2.7 収率を高めるための他の方法/要素
上記のものに加えて、収率を高めるために用いることができる他の特徴には、クロマチン再構築要素、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が含まれる。その本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体のコドン使用を宿主細胞のコドンバイアスに適合するように改変して、転写物および/または生成物収率を増加させるようにすることができる(例えばHoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24)。コドンの選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。
2.8 宿主細胞
本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体をコードするクローニングまたは発現ベクターに好適な宿主細胞は、原核(prokaroytic)細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。好適な原核細胞には、真正細菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア(Escherichia)、例えばE.Coli (例えばATCC 31,446; 31,537; 27,325)、エンテロバクター(Enterobacter)、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella) プロテウス(Proteus)、サルモネラ(Salmonella)、例えばSalmonella typhimurium、セラチア(Serratia)、例えばSerratia marcescansおよびシゲラ(Shigella)ならびにバシラス(Bacilli)、例えばB.subtilisおよびB.licheniformis (DD 266 710を参照のこと)、シュードモナス(Pseudomonas)、例えばP.aeruginosaおよびストレプトマイセス(Streptomyces)が含まれる。酵母宿主細胞のうち、Saccharomyces cerevisiae、schizosaccharomyces pombe、クルイベロミセス(Kluyveromyces)(例えばATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500)、ヤロウイア(yarrowia)(EP402, 226)、Pichia Pastoris (EP183, 070, Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照のこと)、カンジダ(Candida)、Trichoderma reesia (EP244, 234)、ペニシリン(Penicillin)、トリポクラジウム(Tolypocladium)およびアスペルギルス(Aspergillus)宿主、例えばA.nidulansおよびA.nigerもまた想定される。
原核宿主細胞および酵母宿主細胞は本発明によって具体的に想定されるが、典型的には、本発明の宿主細胞は脊椎動物細胞である。好適な脊椎動物宿主細胞には、哺乳類細胞、例えばCOS-1 (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651)、ヒト胎性腎系統293、、PerC6 (Crucell)、ベビーハムスター腎細胞(BHK) (ATCC CRL.1632)、BHK570 (ATCC NO: CRL 10314)、293 (ATCC NO.CRL 1573)、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO (例えばCHO-K1, ATCC NO: CCL 61, DHFRマイナスCHOセルライン、例えばDG44 (Urlaub et al, Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12 pp555-566)、特に懸濁培養に適合させたそれらのCHOセルライン、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞(ATCC CRL-1587)、HELA細胞、イヌ腎細胞(ATCC CCL 34)、ヒト肺細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばNS0 (US 5,807,715を参照のこと)、Sp2/0、Y0が含まれる。
ゆえに本発明の一実施形態では、本明細書中に記載の治療用抗体の重鎖および/または軽鎖をコードするベクターを含む安定に形質転換された宿主細胞を提供する。典型的にそのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第1のベクターおよび該重鎖をコードする第2のベクターを含む。
そのような宿主細胞は、本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体の品質、機能および/または収率を改変するようさらに操作するかまたは作り変えてもよい。非限定的な例には、特定の修飾(例えばグリコシル化)酵素およびタンパク質フォールディングシャペロンの発現が含まれる。
2.9 細胞の培養方法
本発明の治療用抗原結合タンパク質、例えば抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は当業者に公知の任意の方法によって培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、振とうフラスコ、ローラーボトル、ウェーブリアクター(例えばwavebiotech.comのSystem 1000)または中空繊維系で培養することができるが、攪拌タンクリアクターまたはバッグリアクター(例えばWave Biotech, Somerset, New Jersey USA)を特に懸濁培養に使用することが大量生産には好ましい。典型的に、例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断インペラー(low shear impellers)を使用して攪拌タンカーをエアレーションに合わせて改造する。バブルカラムおよびエアリフトリアクターでは、空気または酸素気泡での直接エアレーションを使用することができる。宿主細胞を無血清培地で培養する場合、エアレーションプロセスに起因する細胞損傷の防止を支援するためにpluronic F-68等の細胞保護剤をこれに補充することができる。宿主細胞の特徴に応じて、足場依存性セルラインの増殖基質としてマイクロキャリアを使用するか、または細胞を懸濁培養(典型的である)に適合させることができる。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養では、種々の操作様式、例えばバッチ、流加式、反復バッチプロセシング(Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109を参照のこと)、拡張バッチプロセスまたは潅流培養を利用することができる。組換え的に形質転換された哺乳類宿主細胞をウシ胎児血清(FCS)を含む培地等の血清添加培地で培養することができるが、必要に応じてエネルギー源、例えばグルコースおよび合成成長因子、例えば組換えインスリンを補充された、Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163で開示されるような無血清培地、またはProCHO-CDMまたはUltraCHOTM (Cambrex NJ, USA)等の市販の培地でそのような宿主細胞を培養することが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、無血清条件での生育にそれらの細胞を適合させることを必要とするかもしれない。適合アプローチの1つは、そのような宿主細胞を血清添加培地で培養し、培地の80%を無血清培地と交換することを繰り返し、宿主細胞が無血清条件への適合を習得するようにすることである(例えばScharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishersを参照のこと)。
使用目的に好適な精製の程度を提供する種々の技術を使用して、培地中に分泌された本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体を培地から回収および精製することができる。例えば、ヒト患者の治療に関する本発明の治療用抗原結合(bidning)タンパク質、例えば抗体の使用は、典型的に、治療用抗原結合タンパク質、例えば抗体を含む培地と比較して、還元SDS-PAGEによって測定された場合に少なくとも95%の純度、より典型的には98%または99%の純度を要求する。まず第一に、典型的に、遠心分離およびその後の例えば精密ろ過、限外ろ過および/またはデプスフィルトレーション(depth filtration)を使用する上清の清澄ステップを使用して培地由来の細胞片を除去する。あるいは、事前の遠心分離を行わずに、精密ろ過、限外ろ過またはデプスフィルトレーションによって抗原結合タンパク質、例えば抗体を回収することができる。種々の他の技術、例えば透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフィー技術、例えばヒドロキシアパタイト(HA)、アフィニティークロマトグラフィー(場合によりポリヒスチジン等の親和性タギング系を含む)および/または疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC, US 5, 429,746を参照のこと)が利用可能である。一実施形態では、種々の清澄ステップ後の本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体を、プロテインAまたはGアフィニティークロマトグラフィーおよびその後の追加のクロマトグラフィーステップ、例えばイオン交換および/またはHAクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫安沈殿を使用して捕捉する。典型的に、種々のウイルス除去ステップ(例えばナノフィルトレーション(例えばDV-20フィルターを使用する))も用いられる。これらの種々のステップ後に、少なくとも10mg/ml以上、例えば100mg/ml以上の本発明の抗体を含む精製された(典型的にモノクローナル)調製物が得られ、したがって、それは本発明の実施形態を形成する。超遠心によって100mg/ml以上の濃縮物を作製することができる。好適には、そのような調製物は凝集型の本発明の抗体を実質的に含まない。
細菌系は抗体断片の発現に特に適している。そのような断片は細胞内またはペリプラズマ(periplasma)内に位置する。当業者に公知の方法にしたがって、不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出して再フォールディングさせ、活性タンパク質を形成させることができる。Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20およびCupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277を参照のこと。
3. 医薬組成物
上記のような本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体の精製された調製物(特にモノクローナル調製物)を、上で概説される疾患および障害等のヒト疾患および障害の治療に使用するための医薬組成物に組み入れることができる。典型的にそのような組成物は、許容される薬務によって公知でかつ要求される製薬的に許容される(すなわち不活性)担体をさらに含む。例えばRemingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co.を参照のこと。そのような担体の例には、好適なバッファー、例えば酢酸ナトリウム3水和物で製薬的に許容されるpH、例えば5〜8の範囲内のpHに緩衝された、滅菌された担体、例えば生理食塩水、リンゲル液またはブドウ糖液が含まれる。注射(例えば静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、門脈内による注射、または眼への局所適用もしくは眼周囲適用または眼への硝子体内注射による眼への局所送達による注射)または持続注入用の医薬組成物は、好適には、目に見える粒状物質を含まず、1mg〜10gの治療用抗原結合タンパク質、例えば抗体、典型的には5mg〜1g、より具体的には5mg〜25mgまたは50mgの抗原結合タンパク質、例えば抗体含んでよい。そのような医薬組成物の調製のための方法は当業者に周知である。一実施形態では、医薬組成物は、場合により使用説明書とともに、単位投与剤形中の本発明の1mg〜10gの治療用抗原結合タンパク質、例えば抗体を含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知または自明の方法にしたがって、投与前の再組成のために凍結乾燥(フリーズドライ)することができる。本発明の実施形態がIgG1アイソタイプを含む本発明の抗体を含む場合、銅を含めた金属イオンのキレート剤、例えばクエン酸塩(例えばクエン酸ナトリウム)またはEDTAまたはヒスチジンを医薬組成物に加えて、このアイソタイプの抗体の金属媒介性分解の程度を減少させることができる。EP0612251を参照のこと。医薬組成物は、可溶化剤、例えばアルギニン塩基、界面活性剤/抗凝集剤、例えばポリソルベート80、および、バイアルヘッドスペース酸素を置換するための窒素等の不活性ガスを含んでもよい。
本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体を投与するための有効量および治療方式は、一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態および治療対象の疾患または障害等の要因に依存する。そのような要因は主治医の認識の範囲内である。適切な用量の選択に関する指針は例えばSmith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出すことができるが、一般に1mg〜10gである。一実施形態では、ヒト患者を治療するための投薬方式は1mg〜1gの本発明の治療用抗体を週1回または2週毎に1回皮下投与するか、または1または2か月毎に静脈内注入によって投与することである。そのような用量は0.014〜140mg/kg、例えば0.014〜14mg/kgに相当する。本発明の組成物は予防的に使用することもできる。
組成物を、局所適用、硝子体内注射または眼周囲投与によって、すなわち球後、球周囲、テノン下(subtenon)または結膜下注射によって強膜下に、より局所的に眼に送達してもよい。治療用抗体の受動的、例えば静脈内投与による全身投与はドルーゼ減少を達成するために十分である。他の局所投与経路は、治療用抗体がより低用量でより容易に眼の後区に到達することを可能にする。局所適用は、ウサギモデルにおいて眼の後部への抗体断片の浸透を可能にすることが報告されている(Williams KA, Bereton HM, Farrall A, Standfield SD, Taylor SD, Kirk LA, Coster DJ (2005) Eye 19; 910-913)。抗体断片または完全モノクローナル抗体の硝子体内注射が報告されており、製品ラニビズマブおよびベバシズマブの硝子体内注射はAMD患者に対して良好な耐容性を示す。治療用抗体を硝子体内インプラントによって投与してもよい。球後および球周囲注射は特殊な23〜26ゲージ針を用いて達成することができ、硝子体内注射より低侵襲性である。テノン下注射は組成物を強膜に接触させて長期間配置し、眼の後部への浸透を支援することができる。結膜(conjuctiva)の直下へのタンパク質の注射はウサギモデルにおいて報告されており、これにより、分子が強膜をより直接的に横切って拡散し、眼の後区に到達することが可能になる。より長い時間枠にわたって眼の中または周囲への物質の放出を可能にし、ゆえに投薬が低頻度であってよい、持続放出薬物送達系を使用してもよい。そのような系には、治療用組成物で充填またはコーティングできるミセル、ゲル、ヒドロゲル、ナノ粒子、マイクロカプセルまたはインプラントが含まれる。これらは、注射または他の以前に記載されている低侵襲性経路のいずれかによって、すなわち眼周囲または強膜下経路を通して眼の硝子体内に送達することができる。そのような持続放出系および局所送達経路の例には、網膜後部およびRPE層を標的にするナノ粒子ベースの製剤の強膜下投与または硝子体内投与のための熱感受性徐放性ヒドロゲルが含まれる(Janoira KG, Gunda S, Boddu SHS, Mitra AK, (2007) Expert Opin Drug Deliv 4:371-388; Birch DG, Liang FQ, (2007) Int J Nanomed 2:65-77)。送達系および局所投与経路の多数の他の組み合わせが可能であり、治療用抗体の組成物に関して考慮することができる。抗体は物理的デバイス、例えばイオン導入によって送達してもよい(Association for Research in Vision and Ophthalmology, 2008, Annual meeting, April 27th - May 1st, Posters #98/A125 & #1813/D693 from EyeGate Pharma: Blalock et al., & Ruiz-Perez et al)。
4. 臨床使用
β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物の増加によって特徴付けられる疾患には、アルツハイマー病、軽度認知障害、ダウン症候群、オランダ型のβ-アミロイド症を伴う遺伝性脳出血、脳β-アミロイド血管障害および種々のタイプの退行性痴呆、例えばパーキンソン病、進行性核上麻痺、皮質基底変性およびびまん性ルイス体型のアルツハイマー病と関連しているもの、加齢性黄斑変性(AMD)、「緑内障型」疾患およびAβ依存的白内障形成が含まれることが理解される。
本発明の一実施形態では、β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物の増加によって特徴付けられる疾患はアルツハイマー病である。
本発明の別の実施形態では、β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物の増加によって特徴付けられる疾患は、加齢性黄斑変性(AMD)、「緑内障型」疾患またはAβ依存的白内障形成である。
本発明を主にヒト疾患または障害の治療に関して記載してきたが、非ヒト哺乳類の類似の疾患または障害の治療に本発明を適用してもよい。
実施例
方法
ABi8200 Applied Biosystems 8200 FMAT用蛍光マクロ共焦点細胞検出系
BiacoreTM/Biacore SPRを使用して分子的相互作用のリアルタイムキネティクスの測定を可能にするデバイス
CM5 カルボキシメチル化デキストランマトリックスでコーティングされた汎用表面を有するBiacoreTMセンサーチップ
cSLO 共焦点走査型レーザー検眼鏡
ELISA 酵素結合免疫吸着測定法
FMAT 蛍光定量微量アッセイテクノロジー(Applied Biosystems)
FPLC 高速タンパク質液体クロマトグラフィー
IHC 免疫組織化学
Integra CL1000 IBS Integra Biosciencesによって販売されているミニバイオリアクター
MSD(登録商標) メソスケールディスカバリー
ProSepA HiTrap GE Healthcareによって販売されているFPLC用プロテインAカラム
RU 共鳴単位(Biacore測定でのセンサーチップへの結合を定量するための任意単位)
SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
SPR (表面プラズモン共鳴) - センサーチップ上の質量変化の測定のためにBiacoreTM機器によって用いられる物理現象。
SPSS 統計解析ソフトウェアパッケージ
SRU 無標識の生化学的相互作用をモニターすることを可能にするSRU BINDTM Biosensorテクノロジー。
材料
BSA ウシ血清アルブミン
C57/BL6 「C57 black 6」 - 一般的な近交系の実験室マウス
DAB 3,3'ジアミノベンジジン
DAPI 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール
DMEM ダルベッコ変法イーグル培地
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
FA ギ酸
FCS ウシ胎児血清
FITC フルオレセインイソチオシアネート
Glutamax 培地に添加される安定な形態のグルタミン(ジペプチドL-アナニル-L-グルタミン(L-Ananyl-L-Glutamine)補充剤)
HEK ヒト胎性腎293細胞
HBS-EPバッファー 0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfactant P20を含有する汎用BiacoreTMバッファー
HEPES N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)
Histoclear 組織除去剤
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IMS 工業用メチレーテッド・スピリット
Lipofectamine Invitrogen/Gibcoによって販売されているカチオン性脂質ベースの細胞トランスフェクション剤
NaCl 塩化ナトリウム
Opti-MEM Invitrogen/Gibcoによる変法イーグル培地ベースの培地
PBS リン酸緩衝食塩水
PFA パラホルムアルデヒド
PEG ポリエチレングリコール
PPD 精製されたタンパク質誘導体
PRF F12 Nutrient Mixture F-12を含むフェノールレッド不含培地
RIBI 水-油エマルジョンベースの抗原アジュバント
RT-PCR 逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応
TASTPM APP695 Swedish突然変異マウス(TAS10)とPS-1M146V系統(TPM)の交配によって作製された二重トランスジェニックマウス系統
TBS TRIS緩衝生理食塩水
Transfast Promegaによって販売されているリポソームトランスフェクション剤
Tris HCl tris-(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩
Tween-20 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート。
Versene 金属イオンキレート剤(エチレンジアミン四酢酸)。
略語
AMD 加齢性黄斑変性
APP アミロイド前駆タンパク質
BM ブルック膜
CFH 補体因子H
CFI 補体因子I
CHO チャイニーズハムスター卵巣細胞
CNV 脈絡膜血管新生
CPM カウント毎分
CSF 脳脊髄液
ICV 脳室内
IgG 免疫グロブリンガンマ
i.p. 腹腔内
hAPP ヒトアミロイド前駆タンパク質
HIER 熱誘導抗原賦活
HVT 健康なボランティア
KD 平衡時の解離定数
NDS 正常ロバ血清
MO 月齢
MRT 平均滞留時間
OS 外節
RPE 網膜色素上皮細胞。
ヒトベータアミロイドに特異的なマウスモノクローナル抗体の作製
1セットのマウスをPPDにN-末端でカップリングされたペプチドCGGGNKGAIIGLMVGG (β-アミロイドの残基27〜38を含有する)(配列番号７)で最初に免疫した。血液サンプルを採取し、同ペプチドのオボアルブミンコンジュゲートを用いるELISAでこれを検査して、免疫されたマウスの抗体力価を測定することによってこれらのマウスの免疫応答を評価した。弱い応答しか観察されなかった。別の実験では、腹腔内経路でRIBIアジュバント中で、PPD (精製されたタンパク質誘導体; Cambridge Research Biochemicals)にコンジュゲートされたN-末端でカップリングされたCGGGEDVGSNKGAIIGLMVGGペプチド(β-アミロイドの残基22〜38を含有する)(配列番号７３)10μgで1セットのマウスを免疫した。各追加免疫の7日後に血清サンプルを採取し、ELISAでこれを検査して、免疫されたマウスの抗体力価を測定することによってこれらのマウスの免疫応答を再度評価した。ペプチドコンジュゲート2.5μgでの追加免疫によってマウスが(最後の2つの血清サンプル中の抗体力価の比較分析に基づいて)最適な応答に達したら、最高の抗体力価を有するマウスを犠牲にし、ハイブリドーマ作製のために脾臓を取り出した。脾臓細胞を取得し、PEG (ポリエチレングリコール)方法論を使用してこれらを骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製した。そして、得られた混合細胞集団を96ウェル細胞培養プレートにまいた。
そして培養上清に含まれる各発現抗体をFMAT (蛍光微量アッセイテクノロジー)均一(homogenous)イムノアッセイにおいてスクリーニングした。このスクリーニングカスケードから29の陽性抗体を同定した。それらはポリスチレンビーズに受動的に吸収されたオボアルブミンタンパク質に関して陰性であるが、以下に関して陽性であった。
(i) ポリスチレンビーズに結合している、N-末端でカップリングされたCGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG (22-38) (配列番号７３)オボアルブミンコンジュゲート、
(ii) ストレプトアビジンコーティングポリスチレンビーズに結合している、N-末端でビオチニル化されたβ-アミロイド(1-40)ペプチド、
(iii) ストレプトアビジンコーティングポリスチレンビーズに結合している、C末端でビオチニル化されているβ-アミロイド(1-40)ペプチドおよび
(iv) ストレプトアビジンコーティングポリスチレンビーズに結合している、N-末端でビオチニル化されているVGSNKGAIIGL (配列番号８)のβ-アミロイド(24-34)ペプチド。
以下で概説されるように、選択された抗体上清サンプルをβ-アミロイド(1-40)ペプチドに対する結合速度論に関して分析した。
表面プラズモン共鳴アッセイを使用する結合相互作用オフレート(off-rate)(kd)の測定
Biacore A100機器を使用して、選択された29抗体とβ-アミロイド(1-40)との相互作用のオフレート速度論を得た。このために、ストレプトアビジンBiacoreセンサーチップフローセルを低レベルのN末端ビオチニル化β-アミロイド(1-40)で誘導体化した。各抗体サンプルに関して3つの曲線を作製し、反応速度式に近似して解離速度を得た。12のクローンでは、オフレートに基づくランキングは不可能であった。その理由は、選択された実験条件で解離速度の測定が不可能であったからである。しかし、これらの条件下で、すべての12クローンは少なくとも10-5のオフレート(kd)を示した。
ヒトβ-アミロイド結合ELISA
上記で同定されたハイブリドーマ上清に含まれる29の抗体をELISAによってヒトβ-アミロイド(1-40)に対する結合に関して再検査した。妥当な比較を可能にするために、培養上清に含まれる抗体の濃度をIgG定量ELISAを使用して測定した。機能的抗体のアイソタイプを決定するために、1セットのアイソタイプ特異的検出抗体を使用してヒトβ-アミロイド結合ELISAを行った。全29抗体はこのELISA形式でヒトβ-アミロイド(1-40)に結合した。IgG1、IgG2aまたはIgG2bに対して使用されるアイソタイプ特異的二次抗体によって各結合抗体クローンのアイソタイプを特定した。1事例では、機能的アイソタイプの混合物が観察された。
オーバーラップペプチドを使用するELISAによるエピトープマッピング
一次スクリーニングから選択されかつハイブリドーマ上清に含まれる29の抗体によって認識されるエピトープを、β-アミロイド1-42ペプチドの完全配列をカバーする1セットの31の12量体オーバーラップペプチドを使用するELISAによってマップした。すべてのペプチドは3アミノC末端リンカー(グリシン-セリン-グリシン)および末端ビオチニル化リシン残基を含有した。
96ウェルイムノアッセイプレートを蒸留水中の100μl 0.5μg/ウェルのストレプトアビジン(Sigma)で4℃で一晩コーティングした。プレートを3回洗浄(PBS/0.01% Tween 20)し、ウェルをPBS中の250μl/ウェル 3% BSAで室温で1時間ブロックした。プレートを3回洗浄し、100ulのペプチド溶液(PBS中の1% BSA 0.1% Tween 20中の0.5ug/ウェル)を三つずつのウェルに室温で3時間加えた。さらにDMSOのみのコントロールウェルを調製した。プレートを3回洗浄し、100μlの29ハイブリドーマ上清(1% BSA/ 0.1% Tween 20中で1/20希釈)をすべてのウェルに加え、4℃で一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄し、抗マウスIgG抗体-ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(Amersham, PBS中の1% BSA, 0.1% Tween 20中で1:2000希釈)を100μl/ウェルで加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、3回洗浄し、100ul/ウェルのテトラメチルベンジジン(Sigma)基質を室温で約5分間使用し、青色の発色をモニターして検出抗体の結合を示した。反応を停止させ、各ウェルの光学密度を450nmで読み取った。
すべての抗体はモチーフKGAIIGLM (β-アミロイドの残基28〜35に相当)(配列番号９)を含有する非常に類似の領域に結合した。
表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される結合速度論
29のプールから選択された8つのモノクローナル抗体のβ-アミロイド結合親和性および速度論を、Biacore 3000テクノロジーを使用して、より詳細に評価した。精製されたマウス抗体調製物をポリクローナル抗マウスIgG抗体チップ表面に捕捉した。新たに調製されたヒトβ-アミロイド1-40をHBS-EPバッファー中で希釈し、捕捉された抗体表面に対して4〜500nMの範囲の濃度で5分間通過させた。注射後の解離をさらに20分間観察した。100mM H3PO4のパルスによって再生を達成した。抗体捕捉およびβ-アミロイド結合のその後のサイクルは再生によって影響されないことが示された。すべての実施(run)はブランク表面およびブランクバッファー注射に対して二重参照した。得られたデータを表2に示す。
Figure 2011506387
結果は、8モノクローナル抗体すべての親和性が同等であるが、16D4は他のクローンと比較して少なくとも12〜2.5倍低い親和性を示すことを示した。この1実験での残りの7抗体間のKD値の差異は4.4倍までであった。これらのクローンのうちの2つ、5D1および6F6を次のスケールアップのために選択し、3重に再検査した。このデータを表3に示す。
Figure 2011506387
また、同一のBiacore法を使用して、ヒトおよびマウスβ-アミロイド(1-40)およびβ-アミロイド(1-42)に対する6F6の結合を調べた。6F6はこれらのペプチドすべてに類似の値で結合した。
細胞によって発現されたアミロイド前駆タンパク質(APP)に対する結合
β-アミロイドは、アミロイド前駆タンパク質(APP)と称されるI型膜貫通前駆タンパク質のタンパク質分解性の切断によって形成されるペプチドから構成される。APPは大きな細胞外ドメインを有するので、このタンパク質への結合は抗体依存性細胞性細胞傷害反応(ADCC)を潜在的に惹起する。
FMAT TM ABI8200ベースのアッセイ
蛍光定量微量アッセイテクノロジー(FMAT; Cellular Detection System 8200)を使用し、上記で選択された8抗体を用いて、HEK 293T細胞上で発現されたアミロイド前駆タンパク質に対する細胞ベースの結合アッセイを実施した。偽トランスフェクトされたかまたは完全長ヒトAPPをコードするプラスミドでトランスフェクトされたHEK293T細胞をトランスフェクションの48時間後に回収した。トランスフェクトされた細胞を、APPの細胞外ドメインに対する精製されたポジティブコントロール抗体LN27 (Zymed)マウスIgGまたはハイブリドーマ上清の種々の希釈物、およびβ-アミロイドペプチドの遊離N末端を認識するだけのネガティブコントロール抗体(自家試薬)とともにインキュベートした。抗体結合を、FMATブルーでタグ付けされた抗マウス抗体を使用して示し、Cellular Detection System 8200を使用して検出した。偽トランスフェクトされた細胞から得られたバックグラウンドシグナルをAPPトランスフェクトされた細胞から差し引いた。7つのクローンは、ポジティブコントロールモノクローナル抗体LN27と比較してHEK293T細胞上で発現されたAPPに対する結合を示さなかった。偽トランスフェクトされたHEK293T細胞の場合の結果を研究すると、1クローン(5C9)がHEK293T細胞に非特異的に結合する証拠を示し、この特定のクローンのAPP結合能の解釈が困難になった。
トランスジェニックマウスの脳切片でのアミロイド前駆タンパク質(APP)に対する結合
2月齢TASTPM (Howlett et al 2008)または12月齢TAS10マウスの脳切片をIHCによって調べた。切片を85%ギ酸で処理し、完全長APP結合に関して染色した。選択された月齢で、それぞれのマウスはアミロイドプラーク沈着物をまったく示さないが、一部の染色は、この技術を使用してアクセス可能な細胞内アミロイドのせいかもしれない。6F6はこれらの切片において染色を示さなかったが、完全長APP (Zymed)に関するコントロール抗体は染色を示した。
Fab断片としてのヒトβ-アミロイド結合ELISA
ビーズ上に固定されたパパイン(Pierce #20341)を使用する標準プロテアーゼ切断によって6F6のFab断片を作製した。6F6 lgGの精製Fab断片を用いて、ELISAプレート上に固定されたヒトAβペプチド(1-40)に対する結合に関するELISAを行った。1回のELISA実験から得られた結果は、6F6のFab断片が依然としてAβペプチド(1-40)に結合可能であることを示した。
ヒトボランティア由来の血漿サンプル中の未変性ヒトアミロイドに対する6F6の結合
健康なボランティア(HVT)由来の全血を静脈穿刺によってK2 EDTAチューブに回収し、チューブをすぐに氷上に置いた。血液サンプルを30分以内に2000 x gで4℃で15分間回転させることによって処理し、血漿を得た。次いでプロテアーゼインヒビター(Roche Complete Protease Inhibitor cocktail, Cat No: 11 973 580 001, Roche Applied Science)を製造元の指示書にしたがって血漿に加えた。次いで分析前に血漿のアリコートを-70℃未満で凍結した。
アッセイでは、96ウェルECLイムノアッセイ形式(メソスケールディスカバリー, MSD)において捕捉抗体として6F6を使用した。簡潔に言えば、6F6を96ウェルMSDプレート上にスポットコーティングし; 次いでサンプル(アッセイキャリブレータ、ネガティブコントロール、QCおよび試験サンプル)を加えた。インキュベーション後、未結合物質を洗浄して除き、次いで検出抗体(ビオチニル化4G8 (β-アミロイドエピトープ17-24に特異的))をインキュベートにアプライした。その後、洗浄後にストレプトアビジン-スルホ-TAGを加えた。このインキュベーションの終了時に、洗浄ステップを適用した。MSD ReadバッファーTをプレートに加えることで、MSD Sector Imager 6000で電気化学発光(electrochemiluminescent)シグナルを読み取ることが可能になった。既知の濃度のAβ1-42を用いて確立されたアッセイ標準曲線を使用してアナライト濃度をMSDシグナルから逆算した。このアッセイの定量下限は78.1 pg/mLであった。
表4に、上記6F6-4G8抗体アッセイによって測定された10個のHVT血漿サンプルのAβ濃度をまとめる。すべてのサンプルを2重に検査した。
Figure 2011506387
ウエスタンブロットによる未変性および変性条件下のAβ1-42に対する結合
精製された6F6モノクローナル抗体を種々の形態のAβ1-42に対する結合に関して調べ、未変性または変性SDS-PAGE条件下で分析した。Aβ1-42を新たに調製して使用するか、または4℃でPRF F12を用いて一晩、37℃でPBS中で一晩、または37℃で10mM HCl中で一晩前処理した。調製物をSDS-PAGEによって分離し、6F6抗体または6E10 (ヒトAβ1-16に特異的な抗体; 市販の試薬, Eurogentec)および5G5 (Aβ1-42に特異的な抗体; 自家試薬)を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。結果は、未変性ゲルで、6E10は高次形態のアミロイドを認識するが、6F6および5G5はこれらのオリゴマー形態および線維状形態(fibrillar forms)に対して比較的弱いシグナルしか示さないことを示した。変性条件下で、6F6および5G5は単量体形態のベータアミロイドを主に認識したが、N末端特異的6E10は、この実験で使用された変性条件によって分解されなかったベータアミロイドの高次凝集物に依然として結合可能であった 図１)。結論として、これは、これらの条件下でかつ上記アミロイド調製物を使用すると、6F6はAβ1-42の低分子量形態および単量体に優先的に結合することを示す。
精製されたモノクローナル抗体6F6のELISAによるエピトープマッピング
精製された6F6モノクローナル抗体を使用して、上で概説されたエピトープマッピングをELISAによって反復した。希釈されたハイブリドーマ培養上清の代わりに100μlの希釈された精製抗体溶液(1% BSA中0.1ug/ml)を加えたことを除き、使用されたプロトコルは同じであった。
精製された6F6モノクローナル抗体はモチーフKGAIIGL (β-アミロイドの残基28〜34に相当)に結合したが、そのペプチド(β-アミロイドの残基28〜35に相当; (配列番号９))に残基35Mが含まれる場合に結合がずっと増強された。隣接する残基のわずかな寄与はオーバーラップエピトープマッピング技術を使用して除外できない。
モノクローナル抗体6F6の表面プラズモン共鳴によるエピトープマッピング
ストレプトアビジンコーティングセンサーチップによって捕捉されたβ-アミロイド配列の24-35 (配列番号１０: VGSNKGAIIGLMGSG)、28-39 (配列番号１１: KGAIIGLMVGGVGSG)および31-42 (配列番号１２: IIGLMVGGVVIAGSG)に相当するC末端ビオチニル化ペプチドに対して、精製された6F6モノクローナル抗体を8〜64nMで3分間注入した。Biacore 3000機器を使用してこの実験を実施した。結果は、6F6がβ-アミロイドのペプチド24-35および28-39に結合可能であるが、ペプチド31-42に結合しないことを示し、上記オーバーラップペプチドの結果が確認された。また、残基31-35が6F6の結合に十分ではなく、35位より上流の残基がこの抗体の結合に関与しないようであることが示された。
アミロイドの中枢投与後のアミロイド血中レベルに対する、抗β-アミロイドモノクローナル抗体6F6および5D1の静脈内投与の効果
この研究の目的は、試験抗体をあらかじめ静脈内注射されたマウスにおいて、125I (1μCi)β-アミロイド1-40の脳室内(ICV)注射後の血液中の放射活性のレベルを調べることであった。
125I (1μCi)β-アミロイド1-40を、ICVにカニューレを挿入された雄性C57BL6/Jマウス(n=8〜10/処置)にICV注入によって投与した。125Iβ-アミロイド1-40のICV注入の1時間前に、リン酸緩衝食塩水(PBS)または600μgの抗β-アミロイドモノクローナル抗体6F6または5D1をマウスに静脈内注射した。ICV注入後に動物をホームケージに戻し、ICV注入後4時間の時点で犠牲にし、血液を採取し、カウント毎分(CPM)のガンマ照射を検出した。
外科的準備
マウスをイソフルオラン(isofluorane)(3〜5%)の吸入によって麻酔し、定位固定フレームに配置した。全ての外科的処置の前に、0.05ml (ストックからの1:10希釈物)の皮下vetergesic(登録商標)(ブプレノルフィン)を鎮痛のためにマウスに投与した。頭皮の正中に沿って切開を施し、頭蓋の背側面を洗浄し、乾燥した。頭蓋を通過するボアホールを介してブレグマに対する以下の定位座標で側脳室内にカニューレを配置した(前後(anterioposterior)(AP): -0.5, 左右(lateral)(L): +0.7, 背側/腹側(DV): -2.5)。頭蓋を通過するさらに2つのボアホールを穿孔し、その中に皮質骨スクリューを配置した。カニューレをシアノアクリレートゲルによって適所に固定し、シアノアクリレートゲルヘッドキャップの周囲で切開を縫合した。術後に、マウスに0.3ml生理食塩水を皮下投与し、暖かい環境に置いて麻酔から回復させた。正向反射(righting relex)が回復したら、マウスを単独で飼育し、5日間の標準術後ケアに付した。5日間または手術前の体重が回復するまで次の手順を実行しなった。
カニューレ配置
回復後、アンギオテンシンII飲水応答によってカニューレの配置を確かめた。各マウスに100ngのアンギオテンシンIIのICV投与を施した。投与後、水摂取を15分間観察した。
結果
ビヒクルを投与された動物と比較して両モノクローナル抗体6F6および5D1を投与された動物の血液中で放射活性の有意な増加が観察されたが、これは恐らく、循環中の放射性標識β-アミロイドに結合し、ゆえに標識β-アミロイド1-40ペプチドの血中半減期を延長する能力のせいである。モノクローナル抗体間の差異は有意ではなかった。6F6および5D1処置の結果、ビヒクル注射コントロールと比較してCPMの統計学的に有意な増加が生じた- (CPM: ビヒクル1280 +/- 312; 5D1 8152 +/- 2001; 6F6 8875 +/- 2123) 単変量ANOVA, F (3,32) = 15.14, p<0.001 (対数変換されたデータ), post-hoc LSD検定 ***p<0.001 全群対ビヒクル。
モルモットでの6F6-アミロイド複合体形成の薬物動態の調査
この研究の目的は、ヒトと同一のβ-アミロイドアミノ酸配列を有するモルモットでのin vivoでの抗体-β-アミロイド複合体の形成を測定することであった。19日間にわたって種々の時点で遊離抗体濃度および抗体-β-アミロイド複合体を測定することによってこれを達成した。
方法
雄性Dunkin-Hartleyモルモットをイソフルオラン麻酔下で二重頸静脈カニューレ(cannulae)で外科的に準備した。カニューレを挿入されたモルモットに抗体6F6 (n = 6)の静脈内注入を1時間施した。PBS溶液中の精製された抗体調製物をそれぞれ0.700および0.625 mL/kg/時間で投与して、標的用量3 mg/kgを達成した。血液サンプル(60μl)は、各モルモットから投与前(0分)に採取し、さらに注入の開始後の以下の時点(20日間にわたる): 15、30、45、60 (iv注入停止)、90、120、180、360分、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、312、360、408および456時間後にEDTAチューブを使用して収集した。
ラージサンプル(0.5 ml)を、注入の開始後の0、10、96、216、312および456時間の時点で採取した。20日目の最後の血液サンプル採取後、動物を麻酔し、瀉血した。ELISAによる分析まで血漿サンプルを-80℃で保存した。β-アミロイド1-40コーティングマイクロタイタープレートを使用して抗原結合ELISAによって遊離抗体レベルを評価した。0、10時間、96時間、196時間、312時間および456時間から得られた血漿サンプルをこれらのウェルに加え、結合した6F6モノクローナル抗体を抗マウスIgG-HRPコンジュゲートを使用して検出した。β-アミロイド42 C末端特異的ポリクローナル抗体でコーティングされたプレート上での捕捉によってβ-アミロイド-抗体複合体を検出した。抗マウスIgGビオチンコンジュゲートおよびストレプトアビジンユーロピウムクリプタート(europium kryptate)によって、捕捉された複合体を、6F6モノクローナル抗体を介して検出した。
結果
遊離抗体レベルはIV (静脈内)送達後に予測通り急速に増加したが、最初の24時間以内に急速に減少した。レベルは約160時間で定常状態レベルに達した。結果は、6F6抗体の血液クリアランス速度1.75 ml/時間/kgおよび平均滞留時間(MRT) 49.4時間を示す。
複合体レベルも抗体の投与後に急速に増加し、平均複合体レベルは残りの研究期間にわたって該レベルで安定なままであった。しかし、個々の動物はかなりの差異を示した。ある動物では複合体レベルが減少し、ある動物では複合体レベルが増加したが、ほとんどの場合、約216時間の時点から先で複合体レベルは安定であるようであった。実験は、ヒト同等物アミロイドとの複合体がin vivoで形成可能であり、一回量投与後の血漿中での複合体のレベルは長期間不変であるようであることを示した。
トランスジェニックTASTPMマウスでの4週間の6F6の投薬研究
ヒトアミロイド前駆タンパク質(hAPP)を過剰発現するトランスジェニック(tg)マウスはアミロイド症のモデルを提供し、アミロイド生産、隔離および沈着に対する薬物の影響を研究するために好適である。この研究では、発明者らは、ヒトアミロイド前駆タンパク質および突然変異型のプレセニリン1を過剰発現するTASTPMトランスジェニックマウス(APP695 Swedish突然変異マウス(TAS10)をPS-1M146V系統(TPM)と交配させることによって作製された二重トランスジェニックマウス系統(Howlett et al 2008))を使用した。約10週齡の雄性および雌性マウスで研究を行った。
動物は以下の3処置群であった。
処置群:
(A) 研究の開始時点のアミロイドレベルを決定するための、化合物を投与されずに1日目に終了されたトランスジェニック(Tg)動物(n=16; 雄9, 雌7)
(B) 週2回で4週間、腹腔内注射によってビヒクル(PBS)を投与されたTg動物(n=19; 雄9, 雌10)
(C) 週2回で4週間、腹腔内注射によってマウスあたり6F6 300μgを投与されたTg動物(n=19; 雄9, 雌10)
1週間空けて投薬計画を開始する3つの処置コホートに動物を分けた。
2回目、4回目、6回目および8回目の投与前に処置群あたり雄3匹および雌3匹の動物から尾静脈出血によって血液サンプルを採取した。すべての群から1日目(A群)または最初の投与の4週間後(BおよびC群)に最終EDTA血漿サンプルを調製した。左および右脳半球を採取し、瞬間凍結し、生化学的アミロイドレベルに関する後の分析まで-80℃で保存した。また、尾の先端を採取し、遺伝子型の確認に使用した。
脳ホモジネート中の生化学的アミロイド量の測定
抽出された脳サンプル中のAβ1-40およびAβ1-42のレベルをORIGENテクノロジー(Igen Internatioanl Inc)を使用して測定した。簡潔に言えば、脳半球の重さを量り、Complete TMプロテアーゼインヒビター(Roche Diagnostic)を150mg/ml w/vで含有する5MグアニジンHCl (Calbiochem)中で小型乳棒を使用して抽出した。抽出物をIgenバッファー中で希釈し、20000gでの遠心分離によって浄化された1:10および1:40希釈物をアッセイで使用した。
ORIGENアッセイには、サンプル由来のAβを捕捉するための、ビオチニル化6E10抗体(ヒトAβ1-16に特異的; Signet Labs)が固定されているストレプトアビジンコーティングDynabeads (Dynal)、およびori-タグで標識されたG210 (Aβ1-40に特異的な抗体; 自家試薬)または5G5 (Aβ1-42に特異的な抗体; 自家試薬)での結合Aβの検出を使用した。
各群由来の死後のAβ1-40およびAβ1-42負荷の分析は、この研究においておよびここで用いられた分析方法によって6F6処置関連の脳アミロイド負荷の減少を示さなかった。脳アミロイドの潜在的減少に関する決定的な結論には達しなかった。その理由は、研究の経過に伴うビヒクル処置動物の脳でのAβ増加のパターンが小さく、すべての動物にわたって均一でなかったからである。
6F6抗体の血漿レベルの測定
ELISAによって長期的および最終EDTA血漿サンプルを抗体レベルに関して評価した。簡潔に言えば、サンプルを1:50、1:500および1:5000希釈し、PBSで希釈された0.5μg/mlのAβ1-40ペプチドが固定されているELISAプレートに加えた。サンプルを4℃で一晩インキュベートし、洗浄し、抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して結合6F6抗体を検出した。0〜30μg/mlの範囲の8つの既知の濃度の6F6を使用して作製された標準曲線を使用してサンプル中の濃度を決定した。
結果は、すべてのマウスに6F6抗体がうまく投与され、最終血漿濃度が約250μg/mlの平均値を有することを示した。長期血漿サンプルは2回目および4回目の投与の間で反復投与に起因して血漿レベルの増加を示したが、サンプルされたすべての動物において研究の終了時まで少なくとも150μg/mlのレベルを維持した。
免疫沈降およびウエスタンブロットによる血漿中のアミロイド-抗体複合体の測定
このin vivo研究で抗体-Aβ複合体が形成されたかどうかを試験するために、免疫沈降およびその後のウエスタンブロット分析を使用して複合体の形成に関して血漿サンプルを調べた。簡潔に言えば、15μlの血漿サンプルを10μlのプロテインAセファロースビーズスラリーとインキュベートし、4℃で3時間振とうした。プロテアーゼインヒビターを含有する氷冷PBS 1ml中でビーズを5回洗浄した。毎回サンプルを4℃で2000rpmで2分間遠心分離した。洗浄後、0.1M DTTを含有する電気泳動サンプルバッファー20μlにビーズを再懸濁した。サンプルを5分間煮沸し、上記のように遠心分離した。上清を再煮沸後、サンプルを10% Bis/trisミニゲルにロードし、電気泳動によって分離した。ゲルをニトロセルロースメンブレンにブロットし、ブロックし、6E10抗体(ヒトAβ1-16に特異的; Signet Labs)でプローブした。結合6E10の検出をIR dye800にコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG (H+L)抗体(Rockland)で行った。Odysee赤外イメージング系を使用してブロットを可視化した。
結果は、免疫沈降(immunoprecipiation)法を使用して同時精製されたブロット上で低分子量Aβを検出できることを示した。これは、6F6とAβの複合体がin vivoで形成され、血漿サンプル中に存在することを結論づける。試験された雌性動物ではバンド強度は弱かった。結局、これにより、6F6がヒトAβにin vivoで結合可能であり、ウエスタンブロッティングによって検出可能な安定な複合体を形成することが確認された。
トランスジェニックhAPPマウスでの16週間の6F6での投薬研究
マウスThy-1プロモーターのコントロール下でhAPP(751)を過剰発現するトランスジェニックマウスを使用して、London (717)およびSwedish (670/671)突然変異を有するヒトAPPを高レベルで発現させ、アミロイドベータ1-40およびアミロイドベータ1-42 (Aβ1-40およびAβ1-42)の年齢依存的増加を生じさせた。これらのマウスは、約4か月で開始される、早期年齢でのアミロイド沈着からなるプラークを発生する。脳病理学の重症度は年齢の増加および行動障害(behavioral deficits)と相関する。
この研究は、研究者に対してブラインドで実施し、投与される化合物の正体を明かさなかった。非トランスジェニック同腹子の群に加えて4月齢の雌性トランスジェニックマウスを3群に割り当て(n= 15/群)、4か月の期間にわたって腹腔内経路で毎週処置した。同腹子群およびコントロールIgGを投与されたTg群の1つはコントロールとして機能した。処置の終了時点で、行動試験を行い(Morris Water Maze, New Object Recognition Task)、動物を犠牲にした。脳、CSFおよび血漿を回収した。各脳の一方の半球を組織学的評価のために処理し、2つ目をTBS、Triton X-100、SDSおよびギ酸(FA)脳ホモジネートフラクションならびにCSF中のAβ1-38、Aβ1-40およびAβ1-42の測定のためにただちに凍結した。抗ベータアミロイド抗体6E10での免疫染色を使用して固定サンプル中の脳プラーク量を測定し、コンピュータ画像解析ソフトウェア(Image Pro Plus, version 4.5.1.29)でプラーク表面積およびプラーク数を測定およびカウントした。VIP検出系(Vector(登録商標))によりビオチニル化二次抗体によってマーキングされるシナプトフィジン特異的抗体染色(Neomarkers(登録商標))抗体を使用してシナプス密度を調べた。
処置群: 3群のTg動物(15/群)および1群の非トランスジェニックC57BL6動物(n=15):
(A) 17mg/kg bwの化合物6F6を毎週投与されたトランスジェニック(Tg)動物(n=15)
(B) 17mg/kg bwの化合物mIgG2aを投与されたTg動物(n=15)
(D) 33mg/kg bwの化合物6F6を投与されたTg動物(n=15)
(E) 17mg/kg bwのmIgG2aを投与された非トランスジェニック同腹子(n=15)
経時的に抽出された脳ホモジネートおよびCSF中の生化学的アミロイド量の測定
処置群A、BおよびDの動物からCSFを回収し、ただちに、ELISA技術での次の分析の直前まで、凍結した。脳ホモジネートについては、A、BおよびD群の動物由来の凍結された半球をプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する5 ml Tris緩衝生理食塩水(TBS)中でホモジナイズした。脳ホモジネートの約半分をアリコート中でただちに凍結した。他方の半分を74.500 gで1時間遠心分離し、得られた上清(= TBSフラクション)をアリコートにし、測定まで-20℃で維持した。ペレットをTriton X-100 (2.5 ml)に懸濁し、遠心分離し、上清をアリコートにし、-20℃で維持した。これらのステップをSDS (2.5 ml)を加えて反復した。SDSフラクションのペレットを70%ギ酸(0.5ml)に懸濁した後、遠心分離した。得られた上清を1M TRIS (9.5 ml)で中和し、アリコートにし、-20℃で維持した。CSFならびに4つの脳フラクションのサンプルを、市販のキット(Mesoscale Discovery Abeta 3-plex kit #K15148E, Sector Imager MS2400を使用)を製造元の指示書にしたがって使用したAβ38、Aβ40およびAβ42の測定に使用した。脳の値は、脳の湿重量g (g wet brain)あたりのAβ ngとして算出し、CSFの値は、mlあたりのAβ pgとして算出した。
TBSフラクションでは、Aβレベルはすべての3アミロイド種に関してB群の動物で最も低かった。Aβ42については、6F6処置群AおよびDのこの増加はコントロール群Bより有意であった(p<0.05 vs. A群およびp<0.001 vs. D群)が、Aβ38およびAβ40については有意ではなかった。Triton X-100フラクションでも、平均Aβ42レベルは6F6処置群A (p<0.05)およびD (p<0.01)でコントロール群Bよりも有意に増加した。B群およびD群のAβ40レベルに有意な差異はなかったが、A群では、コントロール群Bと比較してなお有意に増加した(p<0.05)。有意性は欠いているものの、コントロール群Bより高い6F6処置群AのAβ38の増加が観察されたが、6F6処置群Dではコントロール群Bよりわずかに減少した。SDSおよびFAフラクションで測定された結合および水不溶性Aβは、B群(Aβ38およびAβ42)またはD群(Aβ38およびAβ40)と比較して6F6処置群Aの動物の脳で有意に高かった。コントロール群Bおよび6F6処置群Dに有意な差異はなかった。
CSFサンプルでは、Aβ38、Aβ40レベルの有意な群差は観察されなかった。Aβ38、Aβ40およびAβ42レベルは6F6処置群Aと比較してコントロール群Bの動物でわずかに低下した。6F6処置群Dの動物のCSF Aβ42レベルはコントロール群Bと比較して有意に増加した(p<0.05)。これは、恐らく、CSF内への隔離によるかまたは間接的に血流を通る可溶性Aβ42の動員を示す。
シナプス密度の測定
動物個体ごとに3つのスライスを、抗シナプトフィジン抗体(1:200; Neo Markers; Cat# RM9111-SO)およびビオチニル化二次抗体(1:200; Vector Laboratories; Cat# PK-6101)、その後のVIP発色(ペルオキシダーゼの基質キット; Cat# SK4600)で染色する。個別の平均シナプス密度を測定するために、領域(海馬CA1、CA3および歯状回中葉(medial blade)(DGmb)由来の顆粒層)およびスライスあたり3つの画像をマクロベースの測定手順で評価する。マクロ実行の際に、画像を等しく対比させ、一定閾値より上のシナプスをカウントする。単一および連続シナプスをサイズ制限の使用下で別々にカウントする。連続シナプスの総面積を単一シナプスの平均サイズによって割る。以下の式を用いて最終シナプスカウントを算出する。
Figure 2011506387
さらに、画像面積を血管の面積の減少に関してバックグランド補正し、シナプスの合計を、血管の面積分だけ減少した総画像面積と比較して考察する。
処置群A、BおよびDから採取された海馬脳切片のCA1、CA3およびGDmb領域のシナプスカウントを測定すると、シナプス密度は処置群間で不変のままであった。
トータルおよび未結合(遊離)ベータアミロイドの長期血漿レベルの測定
in vivo血液サンプルは、治療の開始前(0日目)ならびに3、6、9および12週に再び、顔面静脈/動脈からの下顎サンプリングによって採取した。血液サンプルをEDTAおよびコーティングされていないバイアルに回収して血漿を得た。すべての血漿サンプルを分析まで凍結して保存した。
未結合(遊離)アミロイドのレベルおよびトータルアミロイド(未結合Aβおよび抗体と複合体化されたもの)のレベルをGyrolabTMワークステーションを使用して測定した。ビオチニル化6F6マウスmAbを遊離β-アミロイドアッセイの捕捉試薬として使用し、ビオチニル化N末端特異的抗β-アミロイド抗体(自家試薬)をトータルβ-アミロイドアッセイの捕捉試薬として使用した。ストレプトアビジンコーティングマトリックスを含有するGyros Bioaffy CD捕捉カラム上に両捕捉試薬を捕捉した。捕捉抗体を700nMの濃度で加えた。両アッセイで、12.5nMの濃度のAlexa 647標識4G8 (β-アミロイドエピトープ17-24に特異的)を検出に使用した。サンプル中のβ-アミロイドの量を定量するために、Aβ1-42標準曲線を作製して(Innogenetics Aβ1-42)、31.25 pg/ml〜20000 pg/mlのダイナミックレンジを得た。β-アミロイド枯渇ヒト血漿中でAβ1-42標準曲線および血漿サンプルの希釈を行った。装置に固有のソフトウェアを使用してデータを解析し、Excelでプロットした。
トータルβ-アミロイドレベルは17 mg/kgおよび33 mg/kgの両6F6処置群で3週(最初の時点)までに2000倍以上増加した。33 mg/kg処置群では、わずかに高いレベルのトータルβ-アミロイドレベルが研究期間中に観察されたが、用量レベルの増加と相関しなかった。これは効果が飽和に達していたことを恐らく示す。両6F6処置群の遊離β-アミロイドレベルは、処置後の最初の時点(3週)までに、非トランスジェニックマウスによって示されるバックグラウンドレベルであることが観察された。その理由は、恐らく、このアッセイで検出された、すべてではないがほとんどのβ-アミロイドが抗体-β-アミロイド複合体に関与したからである。治療介入なしでは、トランスジェニックマウスのベータアミロイドに関するベースラインレベルは非トランスジェニックコントロールマウスより約6倍高かった。
6E10染色を使用するプラーク量の測定
18匹のTgマウス(A群; B群およびD群の6匹ずつのTg)の脳の半分から、アミロイド沈着の定量化のために脳あたりの十分な数のスライスを調製した。6E10免疫反応性を海馬および皮質中で定量的に評価した。層(Paxinos and Franklinの形態学アトラス"The Mouse Brain," 2nd Editionの図104〜105、107〜108、111〜112、115〜116および118〜119に対応する全部で5層)あたり15の切片を厚さ各5μm(Leica SM 2000R)で矢状切断した。調査されたすべてのトランスジェニック動物の組織を正確に同じ方法で取り扱って、この手順の変動に起因するバイアスを回避した。
ヒトアミロイドペプチドの1-17位を標的にするモノクローナル6E10抗体(Signet(登録商標))を使用してアミロイド沈着およびプラーク量を測定した。海馬および皮質の測定領域面積はすべての調査された脳で一定であった。これは、免疫組織化学的染色ステップでの組織に対する負の影響(例えば縮み、異なる切断状況等)を排除し、処置によって誘発された萎縮がないことを示す。人為的結果、フォールディングまたは構成要素の喪失に対処可能であるよう、プラーク量データはスライス中の個別の領域サイズに関連付けた。高用量の6F6での処置(D群)は、低用量の6F6処置(A群; ANOVA: 皮質および海馬: p<0.01)およびコントロール群Bと比較して海馬および皮質中のプラーク面積のパーセンテージを有意に減少させた(図２)。mm2あたりのプラーク数でも同じ傾向が得られ、コントロール群B (t-検定: 皮質: p= 0.093)および低用量の6F6処置群A (t-検定: 海馬: p=0.051)と比較して6F6処置群Dでやはり少なかった(図３)。平均プラークサイズはすべての処置群間で不変のままであった。
「非滲出型(dry)」AMDのモデルである補体因子H欠損マウスの眼でのアミロイド症の実証
動物
10週齢、3月、6月、9月および1年の齢のcfh-/-マウス(n=6)(C57BL/6遺伝的背景に対して10世代以上戻し交配された)および年齢適合正常C57BL/6マウス(n=6)を温度制御環境中で12時間の昼(160ルクス)-夜サイクルで飼育し、通常の実験用の食餌で維持した(実験用の食物を自由に与えた)。マウスを麻酔し(0.75 mlケタミン, 0.5 ml Domitor, 0.75 ml滅菌水を0.2 ml/100 gで必要に応じてi.p.補充する)、cSLOイメージングの10〜15分前に、その瞳孔を局所1%トロピカミドおよび2.5%塩酸フェニレフリンで散大させた。各イメージシーケンスの前に、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(0.3%)の液滴を眼に入れて乾燥を防いだ。すべての実験手順は、United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act 1986を遵守し、その条件下で実行された。
網膜イメージング
以下で詳細に記載されるように、3月、6月および12月cfh-/- (n=12)および年齢適合コントロール(n=6)マウスでイメージングを実施した。下記のように共焦点走査型レーザー検眼鏡で高分解能およびハイコントラスト網膜画像を得た。簡潔に言えば、488-および820-nmレーザーラインを使用することによってリフレクタンスイメージングを実施した。488-nm励起および498 nmのバリアのエッジ(50%透過の値)を有する内蔵の標準発光カットオフフィルターを使用してマウス網膜の自己蛍光およびフルオレセイン血管造影像を記録した。
マウスを麻酔し(0.75 mlケタミン, 0.5 ml Domitor, 0.75 ml滅菌水を0.2 ml/100 gで必要に応じてi.p.補充する)、イメージングの10〜15分前に、その瞳孔を局所1%トロピカミドおよび2.5%塩酸フェニレフリンで散大させた。各イメージシーケンスの前に、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(0.3%)の液滴を眼に入れて乾燥を防いだ。報告されている方法(Guo L, Salt TE, Maass A, Luong V, Moss SE, Fitzke FW, Cordeiro MF (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci 47:626-633)の変法を使用して、共焦点走査型レーザー検眼鏡(Heidelberg Retina Angiograph, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)で高分解能およびハイコントラストの網膜画像をin vivoで得た。簡潔に言えば、ピンホール直径を100μmに減少させて距離分解能を向上させ、かつレーザーパワーを増加させて信号雑音比を向上させておいた。マウス瞳孔でのパワーが488 nmで1400 Wであることが測定された。特別に設計された平凹コンタクトレンズをマウスにはめ込み、非常に長い作動距離を有する50x顕微レンズを使用して屈折力(optical power)を提供し、それにより、光学的解像力を向上させ、かつ直径3μmほどの小さいマイクロキャピラリー構造の検出を可能にした。
断層画像スタックを記録し、該スタックでは、硝子体〜強膜かつ中枢〜末梢に軸平面を15-μm間隔で連続的に移動させ、一次血管叢(primary plexus)から外側血管叢まで網膜血管系を視覚化した。すべてのイメージシーケンスは8.9 Hz、100視野でキャプチャーされ、8-ビット、768 768-ピクセルの画像ファイルとしてデジタル化され、横方向画像解像度1.2μm/ピクセルを得た。マウス眼での距離分解能は5〜8μmであると測定された。
SPSS (Chicago, IL)を使用して画像データにStudent unpaired t検定を適用することによって、cfh-/-と年齢適合コントロール動物の間の、RPEのレベルでの網膜下自己蛍光沈着物の数の差異を分析した。
組織学および免疫組織化学
簡潔に言えば、動物をケタミンおよびドルミトール(dormitor)で深麻酔した後、10週齢cfh-/-マウス(n=6)、3月(n=3)、6月(n=3) 9月(n=3)および1年の齢のcfh-/-マウス(n=6)を0.1 M PBS、次いで4%パラホルムアルデヒド(0.1 M PBS中, pH 7.2)で潅流した。眼を取り出し、4%パラホルムアルデヒド中に入れた後、30%ショ糖溶液(0.1 M PBSバッファー中)中で凍結保護し、4℃で24時間置いた。角膜切開によってレンズを取り出し、眼をOCT化合物中で急速凍結し、免疫組織化学的分析のために厚さ10μmの切片にした。下記詳細を参照のこと。選択された動物の神経網膜および脈絡膜を分離し、独立して平らにマウントした。
cfh-/-マウス(n=20)および年齢適合コントロール(n=20)マウスから得られた眼の切片を一次抗体とインキュベートし、(表5)次いで適切な蛍光コンジュゲート二次抗体および核を染色するためのDAPIとインキュベートした。詳細については下記参照のこと。
免疫組織化学を室温で実施し、4%パラホルムアルデヒドで固定された眼から得られた厚さ10μmのクリオスタット切片に対して行った。網膜切片を、0.3% Triton X-100を含む0.1Mリン酸バッファー生理食塩水(PBS) pH 7.4中の5%正常ロバ血清中で1時間ブロックし、一次抗体と一晩インキュベートし、0.3% Triton X-100を含む0.1M PBS中の1%正常ロバ血清で希釈した。各一次抗体の希釈は下記の通りであった。一次抗体への曝露後、洗浄し、状況に応じて、蛍光コンジュゲートされた適切な二次抗体(Santa Cruz, Biotechnology, Inc., ロバ抗マウスsc-2099)を、0.3% Tritonおよび2%正常血清を含むPBS中で組成し(1:100希釈, 一次抗体を同じ希釈剤)、切片を2時間曝露した(FITC Santa Cruz, Biotechnology, Inc., ロバ抗マウスsc-2099)。ネガティブコントロールは無関係のアイソタイプ適合抗体または一次抗体の除外の両者から構成された。次いで核を0.5 ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(5 mlの0.1M PBSに対する1μlのDAPI原液; Sigma-Aldrich)で1分間染色した。次いでスライド板を数回0.1 M PBSで洗浄し、次いでTrisバッファー生理食塩水(pH 7.4)で4回洗浄し、最後にガラスのカバーガラスをVECTASHIELD (Vector Laboratories)中でマウントした。
切片を観察し、レーザー走査型共焦点顕微鏡(Leica SP2; Leitz)で8ビット/チャンネルおよび1024 x 1024 pxで、またはエピ蛍光明視野顕微鏡(Epi-fluorescence bright-field microscope)(Olympus BX50F4, Olympus, Japan)(Nikon DXM1200 (Nikon,Tokyo, Japan)デジタルカメラを使用して3840x3072 px解像度で24ビットカラー画像としてデータをキャプチャーする)で画像をキャプチャーした。
市販の一次抗体
C3 (FITCコンジュゲートヤギ抗マウス1:100希釈; ICN Biomedicals)を使用して指定の希釈度で網膜切片を染色した。
この作業で使用した抗アミロイドベータ抗体:
(1) Covance SIG-39153ウサギポリクローナル抗体(Ab)。げっ歯類アミロイドベータに特異的。1/250希釈でIHCパラフィン包埋切片中での使用に推奨される,
(2) Calbiochem NE1002 (4G8)マウスモノクローナルAb。(IgG2b)。ヒトおよびマウスの両アミロイドベータを認識。1/100〜1/1000希釈でIHCパラフィン包埋切片中での使用に推奨される(ギ酸での前処理が必要とされる),
(3) Abcam ab2539ウサギポリクローナルAb。ヒトおよびマウスの両アミロイドベータを認識。1/100希釈でIHCパラフィン包埋切片中での使用に推奨される(IHC染色手順前に熱媒介性抗原賦活を必要とする),
市販の二次抗体
Figure 2011506387
cfh -/- マウスでのドルーゼノイド(Drusenoid)様沈着物の検出。
老齢cfh-/-マウスの網膜中で自己蛍光沈着物を検出することができる。蛍光性脂質、ドルーゼノイド様沈着物は、cfh-/-マウスで約14週齢の時点で最初に検出することができ、その存在は年齢とともに増加し、網膜下腔(RPEの尖側)に位置する。これらの沈着物は野生型マウスにも存在するが、その程度は有意に低い。例えば、6月齢cfh-/-マウスの網膜のcSLO画像では、グレーバックグラウンド上にいくつかの自己蛍光性白斑が特定され、これらはIHC用のin vitro網膜拡散培養物中で10xおよび40x倍率で緑色(FITC)チャンネル中の容易に特定可能な自己蛍光沈着物として観察することができる。自己蛍光沈着物間には蛍光発光スペクトルの大きい変動が存在する(データは示していない)。
cfh -/-マウスの網膜の切片をIHC自己蛍光によって調査すると、RPE細胞の尖側の網膜下腔中の補体C3沈着の部位に結合しているドルーゼノイド様沈着物を観察することができる。これは12月齢cfh-/-マウスで観察することができる(データは示していない)。
市販の抗アミロイドベータAbでのCFH -/-マウス眼の分析。
Aβ染色に関する陽性が確認された固定ヒトアルツハイマー脳の市販の切片(Abcam ab4582)を使用して、表6に示される3つの市販の抗アミロイドベータAbの交差反応性を調べた。
このために使用した手順は以下の通りであった。
脳パラフィン切片に関して:
1. キシレン- 10分
2. 100%エタノール- 8分
3. 95%エタノール- 5分
4. 蒸留水- 5分
5. 抗原賦活;
- クエン酸バッファーを伴うAb2539 HIER
- NE1002(4G8) - 70%ギ酸
- SIG-39153
パラフィンおよび凍結切片の両者に関して;
6. PBSで洗浄, 各5分間を3回
7. 5%正常ロバ血清で1時間ブロック
8. PBSで短時間洗浄
9. 一次抗体をアプライ;
- Ab 2539 - 1:100
- NE1002 (4G8) - 1:200
- SIG-39153 - 1:250
一晩インキュベート
10. PBSで洗浄, 各5分で3回
11. 二次抗体をアプライ
ab2539の場合- Ab sc-2090 1/100
NE1002の場合- Ab sc-2099 1/100
SIG-39153の場合- Ab sc-2090 1/100
1時間インキュベート
12. PBSで洗浄, 各5分間の3回
13. 1分間のDAPI
12. PBSで洗浄, 3回
13. TBSで洗浄, 各5分で4回
14. マウント, カバーガラスおよび密封。
予測通り、ヒトベータアミロイドと交差反応可能な一次抗体(NE1002 [4G8], およびab2539)のみが、ヒトアルツハイマー脳組織中でヒトアミロイドベータプラークの陽性検出を与えた(データは示していない)。
市販のAbを使用する老齢(>1歳)および10週齡マウスCFH-/-の眼でのアミロイドベータの検出
Figure 2011506387
以下の手順にしたがった。
1. スライド板を数時間空気乾燥
2. 3回洗浄
3. 5% NDSで1時間ブロック
4. 表6の一次抗体を以下のように調製;
a. SIG39153 - 1:250
b. NE1002 (4G8) - 1:200
c. Ab2539 1:500
5. 短時間洗浄し、一次抗体と一晩インキュベート
6. 3回洗浄
7. 二次抗体を以下のように調製;
a. 抗ウサギFITC
b. 抗マウスFITC
1時間インキュベート
8. 3回洗浄
9. DAPIを1分間アプライ
10. PBSで3回洗浄
11. TBSで4回洗浄
12. マウント, カバーガラスおよび密封。
最初に、12〜13月齢の年齢適合cfh-/-マウスおよび野生型同腹子コントロール(C57Bl/6)の固定された網膜の眼組織を上記3つの市販の抗アミロイドベータ一次抗体(Ab)を使用して検査した。各一次Abを、該当する二次蛍光標識二次Abを使用して検出した。Ab SIG39153の場合、製造元が推奨するプロトコルにしたがったにもかかわらず、いずれの組織でもシグナルが(上記脳サンプルと同様に)検出できなかった(データは示していない)。しかし、アミロイドベータは、老齢cfh-/-マウスの網膜中で、他の市販の抗アミロイドベータ一次抗体の両者を使用して特異的に検出することができた(が、野生型同腹子では検出できなかった)。このデータの例を図４に示す。図４では、パネル（Ａ）は老齢野生型マウスの網膜組織を示し、パネル（Ｂ）は老齢cfh-/-マウスの組織を示し、ともに一次Abとしてab2539でプローブされ; パネル（Ｃ）は老齢野生型マウスの網膜組織を示し、パネル（Ｄ）は老齢cfh-/-の組織を示し、ともに一次AbとしてNE1002 (4G8)でプローブされたものである。データは、アミロイド-ベータが特に老齢cfh-/-マウスでブルック膜の周囲に沈着することを示す。RPE /ブルック膜界面での沈着したアミロイドベータに対する抗体の交差反応性の陽性シグナルは、図４（Ｂ）および（Ｄ）で白色矢印によって強調される強い白色縞として観察することができる。いくつかのアミロイド沈着はcfh-/-マウスの眼の神経線維層および神経節細胞の領域中で観察することもできる。例えば図４（Ｂ）の上部で白色矢印で強調される白色シグナルである。
次いで、10週齢の、年齢適合cfh-/-マウスおよび野生型同腹子コントロール(C57Bl/6)の固定された網膜の眼組織をNE1002 (4G8)およびab2539の両抗アミロイドベータ一次抗体を使用して検査した。やはり、アミロイドベータはcfh-/-マウスの網膜中で特異的に検出することができたが、野生型同腹子では検出できなかった(データは示していない)。データは、アミロイドベータ沈着が10週齢cfh-/-マウス(n=3)の網膜の10%に存在することを示した(データは示していない)。沈着の大部分は網膜色素上皮層(RPE)の基底側であり、基底層沈着物と結合しているようである(データは示していない)。留意すべきは、10週齢の時点でのアミロイドベータ沈着が、「ドルーゼノイド」自己蛍光沈着物および補体C3沈着物がcfh -/-マウスで最初に出現する時点と類似であることである。
cfh -/- マウス眼の網膜でのアミロイドベータとの6F6の交差反応性
この研究で使用した一次抗体
(i) 6F6マウスモノクローナルAb, IgG2a
(ii) マウスIgG2aアイソタイプコントロールモノクローナルAb(シトシンデアミナーゼ抗原に特異的な自家試薬)
(iii) マウスIgG2a, カッパ[MOPC-173]アイソタイプコントロールモノクローナルAb, (ab18413, Abcam), 未知の特異性のBalb/c骨髄腫由来のクローン
以下の手順にしたがった。
1. スライド板を数時間空気乾燥
2. 1X PBSで洗浄, 各5分で3回
3. PBS中の0.3% Triton X-100中の5%正常ロバ血清でブロック, 室温で1時間インキュベート
4. 一次抗体を調製, PBS中の0.3% Triton X-100中の1%正常ロバ血清で希釈
a. マウスモノクローナルアミロイドベータ6F6 i) - 1:1000, 1:2000および1:4000
b. マウスIgG2aコントロールii) 1:1000 ,1:2000および1:4000
短時間洗浄
5. 一次抗体をアプライし、室温で一晩インキュベート
翌日;
1. 1X PBSで洗浄, 各5分で3回
2. PBS中の0.3% Triton X-100中の1%正常ロバ血清中で希釈することによって二次抗体を調製
a. ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488 (1:2000)
二次抗体をアプライし、室温で1時間インキュベート
3. 1X PBSで洗浄, 各5分で3回
4. PBS中で1:5000のDAPIをアプライし、暗所で1分間インキュベート
5. 1 X PBSで洗浄, 各5分間の3回
6. 1XTBSで洗浄, 各5分で4回
7. Vectashieldを用いてマウント, カバーガラスおよび密封。
最初に、12〜13月齢の年齢適合cfh-/-マウスおよび野生型同腹子コントロール(C57Bl/6)の固定された網膜の眼組織を、上で概説されるように検査した。市販の抗アミロイドベータAbによって検出される領域と類似の網膜の領域に対する6F6の交差反応性が存在したが、コントロール抗体でも類似の交差反応性が存在した。ただし、この交差反応性のいくらかは二次Ab単独のバックグラウンド交差反応性に起因するかもしれない。いくらかのバックグラウンド染色は野生型サンプルでも観察された。
上記バックグラウンド染色を解決するために、実験を反復したが、二次抗体をAlexa Fluor 488標識抗マウスIgG AbからFITC標識分子に切り換えた。また、一次コントロール抗体を市販のアイソタイプコントロール(iii)に切り換えた。
この実験のために使用した手順は以下の通りであった。
スライドを数時間空気乾燥
1X PBSで洗浄, 5分で1回
PBS中の0.3% Triton X-100中の5%正常ロバ血清でブロック, 室温で1時間インキュベート
一次抗体を調製, PBS中の0.3% Triton X-100中の1%正常ロバ血清で希釈
(a) マウスIgG2a, カッパab18413 1:100
短時間洗浄
一次抗体をアプライし、室温で一晩インキュベート
翌日;
1X PBSで洗浄, 各5分で3回
PBS中の0.3% Triton X-100中の1%正常ロバ血清中で希釈することによって二次抗体を調製
(b) ロバ抗マウスFITC (1:300)
二次抗体をアプライし、室温で1時間インキュベート
1 X PBSで洗浄, 各5分で3回
PBS中の1:5000のDAPIをアプライし、暗所で1分間インキュベート
1 X PBSで洗浄, 各5分間の3回
1XTBSで洗浄, 各5分で4回
Vectashieldを用いてマウント, カバーガラスおよび密封。
上記染色手順を用いて得られたデータの例を図５に示す。パネル（Ａ）は、老齢cfh-/-マウスの網膜の切片を染色するために一次抗体として6F6を1/4000 (1 in 4000)希釈で使用して得られたデータを示し、パネル（Ｂ）は、老齢cfh-/-マウスの網膜の切片を染色するために一次抗体としてアイソタイプコントロール(iii)を(6F6と同様のw/v希釈で)使用して得られたデータを示し(cfh-/-市販のネガティブコントロールと表示される)、パネル（Ｃ）は、年齢適合野生型コントロールマウスの網膜の切片を染色するために一次抗体として6F6を1/4000希釈で使用して得られたデータを示し、パネル（Ｄ）は、老齢cfh-/-マウスの網膜の切片を染色するために一次抗体としてアイソタイプコントロール(ii)(cfh-/-ネガティブコントロールと表示される)を1/4000希釈で使用して得られたデータを示す。
データは、6F6が、cfh-/-マウスの網膜で沈着したアミロイドベータを特異的に検出可能であり(図５Ａ)、それは年齢適合野生型マウスには存在しない(図５Ｃ)ことを確認している。6F6の特異性は、一次抗体として市販のアイソタイプコントロールを6F6と同様のw/v希釈で使用した染色の完全な不存在によって確認された(図５Ｂ)。別の自家アイソタイプコントロール抗体(ii))を1/4000希釈で使用して得られたデータ(図５Ｄ)はcfh-/-マウスでの特異的網膜染色を示唆した。しかし、これは、このアイソタイプ適合抗体の特異性によって説明される。その理由は、シトシンデアミナーゼが老齢cfh-/-マウスの網膜に存在している可能性が高い細胞崩壊のマーカーであるからである。振り返って考えると、これはこの実験でのアイソタイプ特異的Abコントロールに適切な選択ではなかった。
cfh-/-マウス眼の網膜での6F6および4G8に対するアミロイドの交差反応性の時間経過
年齢適合C57Bl/6(野生型)およびcfh-/-マウスを10週および12か月の時点の間の中間時点: 3月齢(n=3) 6月齢(n=3)および9月齢(n=3)で免疫組織化学によって同様に分析した。6F6またはCalbiochem NE1002 (4G8)を一次検出抗体として使用して分析を実施した。3月齢では、野生型とcfh-/-マウスの間でトータルレベルで差異がほとんど観察されなかった。しかし、6月齢までに: cfh -/-マウスのブルック膜と網膜色素上皮(RPE)細胞の境界周囲でアミロイド沈着が明らかに検出されたが、年齢適合野生型コントロールマウスでは観察されなかった(データは示していない)。6か月の時点で、4G8を使用する染色はRPEとBMの間の境界全体にわたるようであったが、6F6を一次抗体として使用する同様の染色は、より分断されて(punctuate)いた(データは示していない)。6月齢の時点では、年齢適合野生型コントロールと比較されたcfh-/-マウスの網膜でのアミロイド沈着のレベルの、IHCによる明らかな区別が示された。
要約すれば、cfh-/-マウスは眼、特に網膜のアミロイド症の急速なモデルであり、これは該モデルの「非滲出型」AMD表現型に密接に関連している。該マウスは、網膜のアミロイドベータに対する6F6等の治療用抗アミロイドベータAbの効果の分析のための良好なモデルである。
補体因子Iに対するアミロイドベータの結合を妨害する6F6の能力の実証
アミロイドベータと補体因子I (CFI)(補体因子H (CFH)の「パートナー」および補助因子である)の直接の相互作用を示す最近公開されたデータ(Wang, J. et al., 2008)は、cfh-/-マウスの網膜での急速なアミロイドベータ沈着を説明するために役立つ。CFHの不存在下では、アミロイドベータはマウス網膜中で任意の「パートナーを組んでいない」CFIと自由に結合できる(Wang, J. et al., 2008, 未公開データ)。治療用抗アミロイドベータ抗体、6F6、またはヒト化等価物が、アミロイドベータに結合することによってアミロイドベータとCFIの間の相互作用を妨害しうることを示すために; Wang, J. et al., 2008によって記載される実験と同様の一連の実験を実施することができる。6F6と市販のアミロイドベータタンパク質調製物(例えばPeptide Institute製)のプレインキュベーションが市販のCFHタンパク質(Quidel Corporation)の存在および不存在下で市販のCFIタンパク質(Quidel Corporation)に結合するその能力に与える影響は、報告されているように(Wang, J. et al., 2008, p716-717)決定することができ、標準的共免疫沈降研究および/またはBiaCore分析によって分析することができる。同様に、CFHの存在および不存在下で、あらかじめ形成されたアミロイドベータ: CFI複合体を分離させる6F6抗体の能力を共免疫沈降研究および/またはBiaCore分析によって確かめることができる。
同様に、6F6と市販のアミロイドベータタンパク質調製物(例えばPeptide Institute製)のプレインキュベーションが市販のCFHタンパク質(Quidel Corporation)の存在下で市販のCFIタンパク質(Quidel Corporation)の機能に影響するその能力に与える影響は、報告されている補体C3b (Quidel Corporation)切断アッセイ(Wang, J. et al., 2008, p717)を使用して測定することができ、標準SDS PAGEによって分析することができる。同様に、CFHの存在下で、あらかじめ形成されたアミロイドベータ: CFI複合体を分離させ、それによりCFI/CFH複合体にC3b切断機能を回復させる6F6抗体の能力は、報告されているように(Wang, J. et al., 2008, p717)確かめることができ、標準SDS PAGEによって分析することができる。
最近公開されたin vitro研究から得られた結果は、アミロイドベータが、網膜下組織での低グレードの慢性炎症を生じさせる補体因子Iの機能をブロックすることによってドルーゼ内の補体系を活性化し; ゆえにAMDの発症に関連する4因子: 炎症、補体活性化、アミロイドベータ沈着およびドルーゼを関連付けるという仮説を支持することが示唆された(Wang, J. et al., 2008)。補体因子Iに対する結合に関して補体因子Hと潜在的に拮抗することによる代替補体経路の活性化でのアミロイドベータの影響に関するそのような直接証拠は以前に提供されていない(Wang, J. et al., 2008)。6F6等の抗体の治療的投与による活性化補体C3成分のクリアランスに対するアミロイドベータの負の影響の妨害はAMDの停止または回復に関する新規作用機構を構成する。
Thioflavin T染色および6F6交差反応性を使用する老齢ヒト眼でのアミロイドベータ沈着の検出
ヒトドナー眼組織のサンプルをMoorfields Eye Bank, Moorfields Eye Hospital, London, UKから入手した。得られた第1のサンプルは65歳のCaucasian男性のものであった(Moorfields Eye Bank, Moorfields Eye Hospital, London, UK)。眼を固定し、以前に記載されるように処理し、切片を、以前に公開されているプロトコルを使用するthioflavin T (Sigma T3516)での染色に付した(Anderson et al., Exp Eye Res (2004), 78; 243-256; Levine, H, Methods in Enzymology (1999), 309;274-284。眼組織を用いて作製されたthioflavin T染色データは、Thioflavin T結合アミロイドベータ由来の蛍光シグナルを示し、眼組織のヒト外側網膜中のRPE ブルック膜界面周囲の基底層沈着物およびドルーゼの周囲のかすかな白色染色として観察された。
ヒトドナー眼組織の別のサンプルをMoorfields Eye Bank, Moorfields Eye Hospital, London, UKから入手した。該サンプルには、41歳および90歳男性のサンプルが含まれた。これらの眼をやはり固定し、以前に記載されるように処理したが、今回は、切片を一次抗体である6F6での染色に付し、以前に記載されるようにFITCコンジュゲート抗マウスIgG二次抗体を使用することによって視覚化した。90歳の眼サンプルは処理中にほとんどの網膜を失ったが、残りの組織の外節中で6F6に対するアミロイド交差反応性が検出された。この染色は41歳男性の眼の外節または網膜には存在しなかった。眼組織のヒトドナーは正式にAMDと診断されていなかったが、重度の基底層沈着物と、さらにそのアミロイドベータとの結合の存在は、65歳男性のthioflavin T染色眼組織での早期非滲出型AMDの病因を強く示唆する。90歳の眼のサンプル中では組織処理によってほとんどの網膜が失われたが、残りの組織中で6F6に対するアミロイド交差反応性が検出された一方、41歳男性(AMDの症状を有するには若過ぎると考察される)の眼の外節でも網膜でも検出されなかったという事実は、老齢ヒト眼で見出されるアミロイドへの結合における6F6様抗体の使用を十分に予見させる。
ハイブリドーマ可変領域のクローニング
可変領域配列
トータルRNAをすべてのハイブリドーマセルラインから抽出し、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって重鎖および軽鎖可変ドメインcDNA配列を作製した。RT-PCRのフォワードプライマーは、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーは抗体定常領域に特異的であった。したがって、例えば6F6では、重鎖に関してはマウスアイソタイプIgG2aであり、軽鎖に関してはマウスカッパである。Jones and Bendigによって記載されるストラテジー(Bio/Technology 9:88, 1991)にしたがってプライマーを設計した。正確なV領域配列の後の検証を可能にするためにRT-PCRを両V領域配列に関して重複して実行した。RT-PCRによって作製されたV領域産物をクローニングし(Invitrogen TA Cloning Kit)、配列データを得た。
6F6 VHアミノ酸配列(配列番号１９)
EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSSNTAYLQLSSLTSEDAAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
6F6 VH DNA配列(配列番号２０)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGGAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTGGCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTATATATACCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTTTGACAGTAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACGCTGCCGTGTACTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCAC
TCTCACAGTCTCCTCA
6F6 VLアミノ酸配列(配列番号２１)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQPPQLLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
6F6 VL DNA配列(配列番号２２)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCTCAACTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
2C1 VHアミノ酸配列(配列番号３１)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETIYAPKFQDKATLTVDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
2C1 VH DNA配列(配列番号３２)
GAGGTTCAGCTACAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTGGCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTATATATGCCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTTTGACAGTAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
2C1 VLアミノ酸配列(配列番号３３)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
2C1 VL DNA配列(配列番号３４)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
2E11 VHアミノ酸配列(配列番号３５)
EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCTASGFNIKVYYIHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETKYVPKFQGKATLTVDTSSNTAYLHLSSLTSEDTGVYYCVTSGYWGQGTTLTVSS
2E11 VH DNA配列(配列番号３６)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGGTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGTCTACTATATCCACTGGTTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTAGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTAAGTATGTCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTTTAACAGTAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGGCGTCTATTACTGTGTTACCTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
2E11 VLアミノ酸配列(配列番号３７)
DIVMTQAAFSNPVALGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
2E11 VL DNA配列(配列番号３８)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCGCTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
4D4 VHアミノ酸配列(配列番号３９)
EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETLYTPKFQGKATLTVDTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTSLTVSS
4D4 VH DNA配列(配列番号４０)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGGAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTTCACTGGCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AGAATGGTGAAACTCTATACACCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTTTGACAGTAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCTCTCTCACAGTCTCCTCA
4D4 VLアミノ酸配列(配列番号４１)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
4D4 VL DNA配列(配列番号４２)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
5C9 VHアミノ酸配列(配列番号４３)
EVQLQQSGAEFVRPGASVKLSCTASGFNIKTYYIHWLKQRTDQGLEWIGRIDPEDGETKFGPKFRGKATLTADTSSNTASLQLSSLTSEDTGVYYCVTSGYWGQGTTLSVSS
5C9 VH DNA配列(配列番号４４)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGTTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTATCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAACCTACTATATACACTGGCTGAAACAGAGGACTGACCAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCCG
AGGATGGTGAAACTAAATTTGGCCCGAAATTCCGGGGCAAGGCCACTTTAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTCCCTACAACTCAGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGGCGTCTATTACTGTGTTACCTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCAC
TCTCTCAGTCTCCTCA
5C9 VLアミノ酸配列(配列番号４５)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
5C9 VL DNA配列(配列番号４６)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCTTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
5D1 VHアミノ酸配列(配列番号４７)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETKYAPKFQDKATLTVDTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
5D1 VH DNA配列(配列番号４８)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTGGCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTTTGACAGTAGACACATCCTCCAATACAGCCTACCTTCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
5D1 VLアミノ酸配列(配列番号４９)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
5D1 VL DNA配列(配列番号５０)
GACATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTATTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
14B3 VHアミノ酸配列(配列番号５１)
EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTGSGFNIKVYYVHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETLYTPKFQGKATFTVDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
14B3 VH DNA配列(配列番号５２)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGGAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTAAGGTCTACTATGTTCACTGGCTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AGAATGGTGAAACTCTATATACCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTTTTACAGTAGACACATCATCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCAC
TCTCACAGTCTCCTCA
14B3 VLアミノ酸配列(配列番号５３)
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
14B3 VL DNA配列(配列番号５４)
GATATTGTGATGACGCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
16D4 VHアミノ酸配列(配列番号５５)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWLKQLTEQGLEWIGRIDPENGETQYAPKFQGKASLTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCVSSGYWGQGTTLTVSS
16D4 VH DNA配列(配列番号５６)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGTTGAAGCAGTTGACTGAGCAGGGCCTGGAATGGATTGGAAGGATTGATCCTG
AAAATGGTGAAACTCAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCTCTTTAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTTCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
16D4 VLアミノ酸配列(配列番号５７)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGGGTKLEIK
16D4 VL DNA配列(配列番号５８)
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
アミノ酸配列中の相補性決定領域(CDR)に下線を引いている。
6F6キメラのクローニングおよび発現
機能的マウスV領域の正確なクローニングを確認するために使用される組換え抗体材料を発現するために、重鎖に関してヒトIgG1または軽鎖に関してヒトCカッパ領域上に移植された親マウスV領域からなるキメラ6F6抗体(6F6c)を作製した。6F6マウス重鎖および軽鎖V領域およびマウスシグナル配列をコードするDNA (Kabat et al "Sequences of Immunological Interest", NIH, 1991, Fifth edition, p.30 95VNP'CL)を、ヒト定常領域(それぞれ無能IgG1 FcまたはヒトCカッパ)をすでに含有する哺乳類発現ベクターRLD-bshe (重鎖用)およびRLN-bshe (軽鎖用)にインフレームでクローニングした。好適なクローニング部位の導入によって、VHアミノ酸配列のFR4 (フレームワーク領域4 (CDR3の下流で第1の定常ドメインの上流のV領域配列))のアミノ酸配列を配列番号１９に示されるTTLTVSSからTLVTVSSに変更された。
重鎖発現用のRLD-bshe発現ベクターの要素は以下の通り:
Figure 2011506387
(上記ベクターの要素の位置および全体のサイズは単に例示のためのものであり、抗体鎖挿入物のサイズに依存する)。
軽鎖発現用のRLN-bshe発現ベクターの要素は以下の通り:
Figure 2011506387
(上記ベクターの要素の位置および全体のサイズは単に例示のためのものであり、抗体鎖挿入物のサイズに依存する)。
正確にクローニングされたVHおよびVL配列を有するクローンを同定し、CHO細胞での発現のためのプラスミドを調製した。発現された6F6c抗体をFPLC系でのプロテインAクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、ELISAおよび、BiacoreTMテクノロジーを使用するSPRによってAβへの結合に関して試験した。結果は、正確な6F6マウスV領域がクローニングおよび発現され、親マウス抗体6F6と類似の特性を有する機能的抗体が得られたことを示した。
重鎖ヒト化ストラテジー
6F6マウス可変重鎖配列に関して、マウス6F6可変重鎖配列(配列番号１９)と58%の同一性(CDRを含む)を有するヒト生殖細胞系アクセプターフレームワーク(IGHV1-24, 配列番号１３)を、JH4ミニ遺伝子(Kabat: YFDYWGQGTLVTVSS (配列番号１５))とともに選択した。JH4ミニ遺伝子残基の最初の4残基は、ドナー抗体由来の導入(incoming)CDRによって置換されるCDR3領域に入る。
配列比較および抗体機能への起こりうる影響に基づいて34個のヒト化可変重鎖変異体のパネルを作製した。6F6マウス重鎖CDRs (Kabat定義を使用)(配列番号１、２および３)を、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに移植した。1、5、13、24、27、28、29、30、37、40、41、48、66、67、69、71、75、76、93および94位(Kabatナンバリング)から選択される2〜15個の位置での置換を含む多数のヒト化可変重鎖変異体を設計した(表7)。CDRH3のKabat定義のすぐ隣の93および94位は、研究されたすべての変異体に含められた。
Figure 2011506387
軽鎖ヒト化ストラテジー
6F6マウス可変軽鎖配列に関して、マウス6F6可変軽鎖配列(配列番号２１)と79%の同一性(CDRを含む)を有するヒト生殖細胞系アクセプターフレームワーク(IGKV2-28)をJ領域カッパ1 (Kabat: WTFGQGTKVEIK)とともに配列類似性に基づいて選択した。JK-1ミニ遺伝子残基の最初の2残基はCDR3領域に入り、マウス6F6軽鎖CDR3の最後の2残基と同一である。
6F6マウス軽鎖CDRs (Kabat定義を使用)(配列番号４、５および６)を、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに移植して、可変ストレートグラフト軽鎖(variable straight graft light chain) L0を得た。配列比較および抗体機能への起こりうる影響に基づいて13個のヒト化可変軽鎖変異体のパネルをさらに作製した。8、11、43、63、64、100および104位(Kabatナンバリング)から選択される1〜4個の位置での置換を含むヒト化可変軽鎖変異体を設計した(表8)。
Figure 2011506387
ヒト化重鎖および軽鎖DNAの構築
既存の変異体を鋳型として使用する、オーバーラップオリゴの構築およびPCR増幅によって、または部位特異的突然変異誘発によって、ヒト化V領域を新規(de novo)合成した。哺乳類発現ベクターRLD-bsheおよびRLN-bsheへのクローニングのための制限部位およびマウスシグナル配列(Kabat et al "Sequences of Immunological Interest", NIH, 1991, Fifth edition, p.30 95VNP'CL)を含ませた。ヒト化V領域をシグナル配列および制限部位とともにコードするPCR産物を哺乳類発現ベクターにインフレームでクローニングし; 重鎖変異体をRLD-bsheにクローニングして、完全長ヒトIgG1 Fc突然変異型重鎖をコードするDNAを作製し; ヒトカッパ定常領域をコードするDNAを含有するRLN-bsheに軽鎖変異体をインフレームでクローニングして、完全長ヒトカッパ軽鎖をコードするDNAを作製した。
ヒト化重鎖および軽鎖抗体の組み合わせの発現の代表例
まずヒト化軽鎖および重鎖DNA構築物の組み合わせを評価するために6ウェルプレートで小規模にCHOK1細胞を一過性トランスフェクトした。5%超低IgG胎児ウシ血清および2mMグルタミンを含むDMEM F12中で継代されたCHOK1細胞を6ウェルプレートで集密状態まで培養した。Optimem Glutamax培地(Invitrogen)中でトータル7.5μg DNA: 30μgトランスフェクション脂質(好適な脂質に関しては、WO2006/053783を参照のこと)を用いて集密細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を37℃で5% CO2でインキュベートした。72時間の時点で、上清を回収し、抗体濃度に関してアッセイし、ELISAによってヒトAβへの結合に関して試験した。
また、重鎖および軽鎖をコードするRLDおよびRLNプラスミドをエレクトロポレーションによってCHO細胞に同時トランスフェクトすることによってヒト化抗体を大規模に発現させた。ヌクレオシド不含培地を使用して、適切な抗体を発現する細胞の安定なポリクローナル集団を選択した。ProSepA HiTrapカラムでのFPLCによって上清から抗体を回収および精製した。
β-アミロイド結合ELISAでのヒト化V H 変異体の評価
小規模6ウェル培養物で発現された34のヒト化VH変異体をヒトAβペプチド(1-40)に対する結合に関して評価した。すべての34の重鎖をL2軽鎖と組み合わせて試験した(下記表8を参照のこと)。L2とのいくつかの組み合わせは抗体材料を発現したが、β-アミロイド1-40に結合せず、したがってこれらの組み合わせに関するEC50値は得られなかった。EC50値が得られた場合、それらは実験間で変動したが、約30倍増加したEC50値〜各実験中に参照として含まれる6F6マウスV領域を使用するキメラ構築物のEC50値と比較された場合に同一の値の範囲であった。CDRH3のKabat定義のすぐ隣の残基93および94はすべてのヒト化変異体で維持されていた。構造的観点から、CDRH1の部分としてみなすことができる27〜30位 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196(4):901-917)は、単独の93および94位での置換よりも、復帰突然変異した場合には良好な結合をもたらした。残基24および37の両方の復帰突然変異は強固な結合をもたらすために必要とされ、これらの残基のいずれか1つがないと、このELISA形式でかつL2軽鎖と組み合わされた場合にヒト化変異体はAβ ペプチド(1-40)に効率的に結合しなかった。表9は、L2軽鎖との組み合わせに基づくアミロイド結合特性の観点で最良のヒト化VH変異体を示す。
Figure 2011506387
β-アミロイド結合ELISAでのヒト化V L 変異体の評価
小規模6ウェル培養物で発現されたヒト化L0およびVL変異体をヒトAβペプチド(1-40)に対する結合に関して評価した。すべての変異体をH11と組み合わせて試験した。表10には作製されたすべての機能的VL変異体をまとめる。
Figure 2011506387
軽鎖L2およびL9、L10、L12およびL13とのVH変異体H11重鎖の最良の組み合わせをより綿密に調べた。これらの実験では、懸濁CHO細胞中で作製された精製された抗体材料を使用した。2つの異なるコーティング濃度のAβペプチド(1-40)を用いる2回の独立した実験の結果を下記表11に示す。
Figure 2011506387
溶液中のヒトβ-アミロイド1-40への結合に関する競合ELISA
6F6cおよびヒト化抗体H11L2、H11L9、H11L10、H11L12およびH11L13について、溶液中でAβ1-40ペプチドに結合し競合ELISAにおいてヒトAβ1-40ペプチドとマウス6F6モノクローナル抗体の相互作用を阻害するその能力について、評価した。一定濃度のビオチニル化β-アミロイド1-40を、連続希釈された量のヒト化6F6抗体変異体とともにプレインキュベートした。固定されたマウス6F6モノクローナル抗体を含有するウェルに、複合体化した遊離のアミロイドを含む混合物を加え、室温で15分間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、固定された親6F6モノクローナル抗体との結合に依然として利用可能な遊離β-アミロイドの量を、ストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを使用して検出した。
表12は、精製された抗体材料を使用する2回の独立した実験に関するこの競合のIC50値を示す。すべてのヒト化変異体は、6F6親モノクローナル抗体への結合に対して、非常に類似のIC50値で効果的に競合することができた。
Figure 2011506387
表面プラズモン共鳴アッセイによって測定したヒト化変異体の結合速度論
選択された重鎖および軽鎖の組み合わせの親和性を、Biacore T100機器を使用して測定した。プロテインA表面Biacoreチップを介して固定されたヒト化抗体およびβ-アミロイド1-40ペプチドの注入を使用して3回の独立した実験を実施した。6F6のキメラ分子は参照分子として機能した。このために、製造元の推奨にしたがって一級アミンカップリングによってプロテインAをCM5チップ上に固定した。抗β-アミロイド抗体をこの表面上に捕捉し、安定化の期間後、ヒトβ-アミロイド1-40を二倍希釈物した濃度256〜2nMで通過させた。捕捉された抗体表面に対するバッファー注入を使用して、Biacore最良実務にしたがってデータセットを二重参照した。選択された弱酸性再生条件は捕捉された抗体を除去したが、プロテインA表面が次の捕捉イベントを実施する能力に大きく影響しなかった。この作業はHBS-EP中で25℃で行った。結果を全3回の実験の平均として表13にまとめる。
Figure 2011506387
ヒト化抗体H11L9のエピトープ微細マッピング
SRU BINDプレートリーダー(SRU Biosytems)を使用してヒト化モノクローナル抗体H11L9の最小結合エピトープを細かくマップした。エピトープの微細マッピングのため18アミノ酸配列に基づいて3つのペプチドセットを作製した: (a) 残基27〜37の10個がアラニン残基で連続して置換されるアラニンスキャニングペプチドセット; (b) 残基23から始まる18量体ペプチドのN末端から連続して1残基が除去されるN末端切断型ペプチドセット、および(c) 残基40から始まる18量体ペプチドのC末端から連続して1残基が除去されるC末端切断型ペプチドセット。
すべてのペプチドは以下の形式: ビオチン-SGSGリンカー-ペプチド-アミドで作製され、ペプチド全体が22量体であることを確保するために必要な場合はリンカーを長くした。
ストレプトアビジンコーティングバイオセンサープレート(SRU Biosytems)をPBSで洗浄し、逆さで回転させてバッファーを除去し、PBS、0.1% tween20および0.4%アセトニトリルで洗浄し、上下逆さでスピン回転させて残りのバッファーを除去した。100ulのPBS、0.1% tween20および0.4%アセトニトリル中でウェルを再懸濁し、SRUプレートリーダーで読み取ってベースラインを確立した。50ulのバッファーを除去し、50ulの希釈されたペプチドを加え、結合を可能にした。プレートをPBSで2回洗浄し、100ulのPBSに再懸濁し、ベースラインを再測定した。ベースラインが安定したら、50ulのバッファーを除去し、H11L9およびコントロール抗体を加えて終濃度30ug/mlにした。抗体の結合をモニターした。プレートをPBSで2回洗浄し、100ulのPBSに再懸濁し、プレートを再測定し、洗浄ステップによって除去される弱い結合剤を探すために抗体の添加に戻って参照した。洗浄されたプレートの結合レベルを取得し、種々のペプチドセットに対する抗体結合に関して分析した。
この領域のN末端欠失は、残基D23〜N27が連続して欠失された場合に結合に対する影響を示さなかった。K28の欠失は50%を超える結合の低下を引き起こしたが、残基G29〜A30の欠失はそれ以上結合を低下させなかった。残基I31およびその先の欠失は結合を完全に消失させた。これは、N末端境界を、完全な結合にK28を必要とすると定めるものである。この領域のC末端欠失は、残基V40〜L34が1個ずつ欠失された場合に結合に対する影響を示さなかった。しかし、位置G33およびその先の欠失によって結合は完全に消失した。これは、C末端境界を、少なくとも残基G33を結合に必要とすると定める。したがって、N-およびC-末端欠失データをまとめると、H11L9はベータ-アミロイドペプチド内の最小エピトープKGAIIG、残基28〜33に細かくマップされた。これにより、残基M35の除去が6F6との結合シグナルの低下を生じさせたようにみえることを除き、モノクローナル抗体6F6を用いた以前のオーバーラップペプチドエピトープマッピングが確認される。
残基N27〜G37のアラニン置換スキャニングは、アミノ酸I32および特にG33をアラニンで置換すると結合に最大の影響を与えることを示した。このデータによって、この抗体の結合にG33が重要であるようだという上記C末端欠失データがさらに確認された。結果を表14に模式的形式でまとめる。
Figure 2011506387
ヒト化抗体H11L9の脱免疫化
潜在的Th細胞エピトープのin silico評価を実施し、機能性を保存しつつこれらのエピトープを破壊するために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列(それぞれ配列番号２４および配列番号２６)中の選択残基を代替残基で置換した。VHの23、30、31、38、42、61および95位およびVLの残基11、30、52および53を、各位置ごとに表15および16で示される代替アミノ酸で置換した。
Figure 2011506387
Figure 2011506387
H11およびL9重鎖および軽鎖変異体を鋳型として使用する、上記のようなオーバーラップオリゴの新規構築およびPCR増幅によってまたは部位特異的突然変異誘発によってV領域を合成した。哺乳類発現ベクターRLD-bsheおよびRLN-bsheへのクローニングのための制限部位およびマウスシグナル配列(Kabat et al "Sequences of Immunological Interest", NIH, 1991, Fifth edition, p.30 95VNP'CL)を含ませた。改変V領域をコードする産物を哺乳類発現ベクターにクローニングし; pEFプロモーターを含むRLD-bsheに重鎖変異体をクローニングして、完全長ヒトIgG1 Fc突然変異型重鎖をコードするDNAを作製し; ヒトカッパ定常領域をコードするDNAを含有する、pEFプロモーターを含むRLN-bsheに軽鎖変異体をインフレームでクローニングして、完全長ヒトカッパ軽鎖をコードするDNAを作製した。
最初に、新規Vh変異体H36-H44をL9軽鎖と組み合わせて発現させて評価し、新規VL変異体L15-L18をH11重鎖と組み合わせて発現させて評価した。発現された抗体を、発現培養上清およびELISAおよびBiacore分析を使用して合成ベータアミロイド1-40への結合に関してアッセイした。この評価にしたがって、結合効力を最も保持する単一の変化を組み合わせて、重鎖および軽鎖構築物H45-H51およびL19-L22を作製した。これらの新規鎖変異体を、上で概説されるようにパートナー鎖H11およびL9と組み合わせて再び発現させた。この第2のセットの変異体から、最良の重鎖(H48-H51)または軽鎖(L19-L21)を互いに組み合わせて、第3のセットを作製し、第3のセットを再び発現させ、ベータアミロイド1-40に対する結合速度論に関してBiacoreによって調べた。表17はそれらの組み合わせおよび結合速度論を示す。
Figure 2011506387
結合速度論を測定するために使用されるBiacore法
抗ヒトIgG (Biacore BR-1008-39)を一級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップにカップリングさせた。抗ベータアミロイド抗体をこの表面上に捕捉した。ベータアミロイド(1-40)を256、64、16、4および1nMで通過させ、0nM (すなわち捕捉された抗体表面に対してバッファーのみを通過させる)を二重参照のために使用した。各アミロイド注入の間に、3M MgCl2を使用して表面を再生させた。これは、捕捉された抗体を除去したが、抗ヒト表面がその後の分析のために抗体を捕捉する能力に大きく影響しなかった。T100に固有の1:1モデルを使用してデータを解析した。操作はHBS-EPをランニングバッファーとして使用して25℃および37℃で行った。
また、このパネル由来のいくつかの構築物を生理的温度での結合速度論に関して評価した。表18はこれらの構築物のサブセットについての37℃での結合速度論を示す。
Figure 2011506387
アクセプターフレームワークおよびヒト化変異体のV領域のアミノ酸配列
IGVH1-24重鎖アクセプターフレームワークV領域, アミノ酸配列(配列番号１３)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
IGVH1-24重鎖アクセプターフレームワークV領域DNA (配列番号１４)
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACACCCTCACTGAATTATCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGTTTTGATCCTGAAGATGGTGAAACAATCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACA
IGKV2-28軽鎖アクセプターフレームワークV領域アミノ酸配列(配列番号１６)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP
IGKV2-28軽鎖アクセプターフレームワークV領域DNA (配列番号１７)
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCT
ATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCT
ヒト化重鎖V領域変異体H11 DNA配列(配列番号２３)
CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGGAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCCGGATTCAACATTAAGGTCTACTATGTGCACTGGCTGCGACAGCTTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAGGATTGATCCTGAAAATGGTGAAACTATATATACCCCGAAATTCCAGGACAAGGCCACCTTGACCGTAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGTTAGTTCGGGCTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
ヒト化重鎖V領域変異体H11アミノ酸配列(配列番号２４)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKVYYVHWLRQLPGKGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVSS
ヒト化軽鎖V領域変異体L9 DNA配列(配列番号２５)
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCAATCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGCAAGAGTCTCCTACATAGGAATGGCATCACCTATTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCT
ATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTAGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCGCTCAAAATCTAGAACTTTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA
GGTGGAAATCAAA
ヒト化軽鎖V領域変異体L9アミノ酸配列(配列番号２６)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
成熟H11重鎖アミノ酸配列(配列番号２７)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKVYYVHWLRQLPGKGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
成熟L9軽鎖アミノ酸配列(配列番号２８)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
最適化H11重鎖DNA (配列番号２９)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCAAAGTGTACTACGTGCACTGGCTGAGGCAGCTGCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACCCCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACAAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGGCCGGAGCCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG
最適化L9軽鎖DNA (配列番号３０)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCCCGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCATCACCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCAGATGTCCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
H48重鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号５９)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIHVYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVSS
H48重鎖V領域変異体DNA配列(配列番号６０)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCCACGTGTACTACGTGCACTGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACCCCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
H49重鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号６１)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKTYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVSS
H49重鎖V領域変異体DNA配列(配列番号６２)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCAAAACCTACTACGTGCACTGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACCCCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
H50重鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号６３)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCTGSGFNIHVYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVSS
H50重鎖V領域変異体DNA配列(配列番号６４)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCACCGGCAGCGGCTTCAACATCCACGTGTACTACGTGCACTGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACCCCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
H51重鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号６５)
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIHTYYVHWLRQLPEKGLEWIGRIDPENGETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVSS
H51重鎖V領域変異体DNA配列(配列番号６６)
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAAGAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGGCAGCGGCTTCAACATCCACACCTACTACGTGCACTGGCTGAGGCAGCTGCCCGAGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGCAGGATCGACCCCGAGAACGGCGAGACCATCTACACCCCCAAGTTCCAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGTGAGCAGCGGGTATTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
L19軽鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号６７)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMDHLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
L19軽鎖V領域変異体DNA配列(配列番号６８)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCCCGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCAAGACCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCAGATGGACCACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAA
L20軽鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号６９)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMDHLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
L20軽鎖V領域変異体DNA配列(配列番号７０)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCCCGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCATCACCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCAGATGGACCACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAA
L21軽鎖V領域変異体アミノ酸配列(配列番号７１)
DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMDNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIK
L21軽鎖V領域変異体DNA配列(配列番号７２)
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCACTGAGCAATCCCGTGACTCCCGGCGAGCCCGCCTCAATCAGCTGCAGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGGAACGGCAAGACCTACCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCAGATGGACAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCTCTAGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAA

Claims (50)

  1. β-アミロイドの残基28〜35を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する治療用抗原結合タンパク質。
  2. β-アミロイドの残基28〜34または28〜33を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する、請求項１に記載の治療用抗原結合タンパク質。
  3. β-アミロイドの残基28〜35の領域内のβ-アミロイドペプチドのエピトープを認識する治療用抗原結合タンパク質。
  4. 抗原結合タンパク質が抗体もしくはその抗原結合断片および/またはそれらの誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療用抗原結合タンパク質。
  5. β-アミロイドペプチドに結合し、かつ以下のCDR、またはそのCDR変異体:
    CDRH1: VYYVH (配列番号１)
    CDRH2: RIDPENGETIYTPKFQD (配列番号２)
    CDRH3: SGY (配列番号３)
    CDRL1: RSSKSLLHRNGITYLY(配列番号４)
    CDRL2: QMSNLAS (配列番号５)
    CDRL3: AQNLELWT (配列番号６)
    を含む抗体もしくはその抗原結合断片および/またはそれらの誘導体である治療用抗体。
  6. ヒトアクセプター重鎖フレームワークがフレームワーク4に加えてIGHV1-24 (配列番号１３)に由来する、請求項５に記載の治療用抗体。
  7. フレームワーク4配列がヒトJH4ミニ遺伝子(Kabat):
    YFDYWGQGTLVTVSS (配列番号１５)
    によってコードされるものであり、かつ重鎖CDR3配列全体がドナー免疫グロブリンによって提供される、請求項６に記載の治療用抗体。
  8. ヒトアクセプター軽鎖フレームワークがフレームワーク4に加えてIGKV2-28 (配列番号１６)に由来する、請求項５に記載の治療用抗体。
  9. フレームワーク4配列がヒトJK-1ミニ遺伝子(Kabat):
    WTFGQGTKVEIK (配列番号１８)
    によってコードされるものである、請求項８に記載の治療用抗体。
  10. ヒトアクセプター重鎖フレームワークがIGHV1-24およびJH4ミニ遺伝子由来であり、ヒトアクセプター軽鎖フレームワークがIGKV2-28およびJK-1ミニ遺伝子由来であり、それらは配列番号１９の配列を有するドナーVHドメインおよび配列番号２１の配列を有するVLドメイン中に見出される対応する残基に基づく1つ以上のアミノ酸残基の置換を場合により含有し、該置換はβ-アミロイドペプチドに対するドナー抗体の結合親和性のすべてまたは実質的にすべてを維持する、請求項５に記載の治療用抗体。
  11. ヒトアクセプター重鎖フレームワークが以下の残基(またはその保存的置換):
    Figure 2011506387
    から選択される1つ以上のアミノ酸残基置換を有する、請求項１０に記載の治療用抗体。
  12. ヒトアクセプター重鎖フレームワークが以下の残基(またはその保存的置換基):
    Figure 2011506387
    を含む、請求項１１に記載の治療用抗体。
  13. ヒトアクセプター軽鎖フレームワークが以下の残基(またはその保存的置換):
    Figure 2011506387
    から選択される1つ以上のアミノ酸残基置換を有する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の治療用抗体。
  14. ヒトアクセプター軽鎖フレームワークが以下の残基(またはその保存的置換基):
    Figure 2011506387
    を含む、請求項１３に記載の治療用抗体。
  15. 配列番号２４に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号２６に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  16. 配列番号５９に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  17. 配列番号６１に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  18. 配列番号６３に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  19. 配列番号６５に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６７に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  20. 配列番号５９に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  21. 配列番号６１に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  22. 配列番号６３に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  23. 配列番号６５に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号６９に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  24. 配列番号５９に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  25. 配列番号６１に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  26. 配列番号６３に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  27. 配列番号６５に記載の配列を有するVHドメインおよび配列番号７１に記載の配列を有するVLドメインを含む治療用抗体。
  28. 配列番号２７に記載の配列を有する重鎖および配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖を含む治療用抗体。
  29. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療用抗原結合タンパク質または請求項５〜２８のいずれか一項に記載の治療用抗体を含む医薬組成物。
  30. β-アミロイドペプチド関連疾患に罹患しているヒト患者の治療方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療用抗原結合タンパク質または請求項５〜２８のいずれか一項に記載の治療用抗体の治療有効量を該患者に投与するステップを含む、方法。
  31. 疾患がアルツハイマー病、加齢性黄斑変性(AMD)、緑内障またはβ-アミロイド依存的白内障形成である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記の抗原結合タンパク質または抗体を、補体経路インヒビターまたは補体経路アクチベータのインヒビターと組み合わせて投与する、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 請求項１〜４のいずれか一項で規定される抗原結合タンパク質または請求項５〜２８のいずれか一項で規定される抗体と、補体経路インヒビターまたは補体経路アクチベータのインヒビターとを含む医薬組成物。
  34. 補体経路インヒビターが補体因子H (CFH)または可溶性補体受容体1 (sCR1)である、請求項３０に記載の方法、または請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 補体経路アクチベータのインヒビターが補体因子D (CFD)インヒビターである、請求項３０に記載の方法、または請求項３３に記載の医薬組成物。
  36. β-アミロイドペプチド関連疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療用抗原結合タンパク質または請求項６〜２８のいずれか一項に記載の治療用抗体の使用。
  37. 疾患がアルツハイマー病、加齢性黄斑変性(AMD)、緑内障またはβ-アミロイド依存的白内障形成である、請求項３６に記載の使用。
  38. 以下のエピトープ:
    (a) β-アミロイドの残基２８〜３５を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープ;
    (b) β-アミロイドの残基２８〜３４を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープ;
    (c) β-アミロイドの残基２８〜３３を含有するβ-アミロイドペプチドのエピトープ; または
    (d) β-アミロイドの残基２８〜３５の領域内のエピトープ
    に対する第1の特異性と補体経路のアクチベータに対する第2の特異性とを有する、
    二重特異性抗体またはその二重特異性断片。
  39. β-アミロイドペプチド関連疾患の治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項で規定される抗原結合タンパク質、請求項６〜２８のいずれか一項で規定される抗体または請求項３８で規定される二重特異性抗体もしくはその二重特異性断片。
  40. β-アミロイドペプチド関連疾患がアルツハイマー病または、β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着物の増加によって特徴付けられる眼または視神経に影響する疾患もしくは障害である、請求項３９に記載の抗原結合タンパク質、抗体または二重特異性抗体もしくはその二重特異性断片。
  41. 配列番号１９の配列を有するVHドメインおよび配列番号２１の配列を有するVL ドメインを含む抗体またはその断片。
  42. ELISAアッセイにおいてβ-アミロイドに対する結合に関して、配列番号２７に記載の配列を有する重鎖および配列番号２８に記載の配列を有する軽鎖を含む抗体(抗体B)と競合する抗原結合タンパク質(抗原結合タンパク質A)。
  43. 抗原結合タンパク質Aおよび抗体Bが等モル量で存在する、請求項４２に記載の抗原結合タンパク質A。
  44. 抗原結合タンパク質Aの存在が、ELISAアッセイでの抗体Bのβ-アミロイドへの結合を10%、20%、30%、40%または50%を超えて減少させる、請求項４２または請求項４３に記載の抗原結合タンパク質A。
  45. ELISAアッセイにおいてβ-アミロイドがイムノアッセイプレートに結合している、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質A。
  46. 抗原結合タンパク質Aが抗体Bのプレート結合β-アミロイドへの結合を減少させるが、非β-アミロイド特異的コントロールは減少させない、請求項４５に記載の抗原結合タンパク質A。
  47. それぞれ配列番号２７、および配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のポリペプチドを含む重鎖および軽鎖を含む抗体であって、β-アミロイドに結合する抗体。
  48. 表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、β-アミロイドの残基24〜35 (配列番号１０)または28〜39 (配列番号１１)を含む、ストレプトアビジンセンサーチップに結合しているC末端ビオチニル化β-アミロイドペプチドに結合する、抗原結合タンパク質。
  49. β-アミロイドに特異的に結合し、β-アミロイドの28〜35領域中の少なくとも1個の残基を結合に必要とする抗原結合タンパク質。
  50. 該β-アミロイドの28〜35領域中の少なくとも1個の残基に対する少なくとも1つのフランキング残基または構造上隣接する残基を結合にさらに必要とする、請求項４９に記載の抗原結合タンパク質。
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