JP2015533786A

JP2015533786A - 遺伝子疾患の治療のための方法および組成物

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Publication number: JP2015533786A
Application number: JP2015530017A
Authority: JP
Inventors: グレゴリージェイ．コスト，; フィリップディー．グレゴリー，; ドミトリーガスチン，; マイケルシー．ホームズ，; ジェフリーシー．ミラー，; デイビッドパッション，; エドワードジェイ．リーバー，; アンドレアスライク，; フィオードルウルノフ，; レイザン，
Original assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2012-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2015-11-26
Also published as: MX2015002409A; BR112015003815A2; JP2022001072A; CA3171494A1; KR20220164090A; AU2013308770A1; US20140093913A1; US20230416775A1; MX367081B; KR20210020174A; WO2014036219A2; JP6629917B2; KR102218562B1; SG11201500852WA; CL2015000450A1; UA118957C2; US9963715B2; PH12015500433B1; US9650648B2; EP2890780A4

Abstract

遺伝病のための方法および組成物が提供される。本明細書に開示されるものは、発現を改変するため、または鎌状赤血球症またはサラセミアのような遺伝子疾患（例えば、不足しているタンパク質を産生すること、疾患および／またはこれらのタンパク質を制御するタンパク質における欠損または異常）に含まれる１つ以上の遺伝子コードタンパク質を修正するための方法および組成物である。そのようなタンパク質の改変は、これらの遺伝子疾患の治療をもたらすことができる。【選択図】図１２

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１２年８月２９日に出願された米国仮出願第６１／６９４，６９３号の利益を主張し、その開示は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は造血幹細胞のゲノム操作の分野のものであり、特に、異常ヘモグロビン症の治療ためのものである。

遺伝子療法は、ヒト医学の新時代のための非常に大きな可能性を有している。これらの手法は、これまでに標準の医療行為によって対処することができなかった状態の治療を可能にする。特に有望な１つの分野は、細胞を遺伝的に操作して、その細胞に以前にその細胞で産生されなかった産物を発現させる能力である。この技術の使用例としては、新規治療タンパク質をコードする遺伝子の挿入、その細胞または個体に欠けているタンパク質をコードするコード配列の挿入、突然変異した遺伝子配列を含有する細胞への野生型遺伝子の挿入、およびマイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのような構造核酸をコードする配列の挿入が挙げられる。

導入遺伝子は、導入遺伝子が細胞自体のゲノムに組み込まれてそこに維持されるような、様々な方法によって細胞に送達することができる。近年、選択されたゲノム遺伝子座への標的挿入のための部位特異的ヌクレアーゼを用いた切断を使用する導入遺伝子組み込みのための方策が開発されている（例えば、本出願人が所有する特許第７，８８８，１２１号を参照のこと）。標的遺伝子のための特異的ヌクレアーゼを利用して、導入遺伝子構造体が、相同組み換え修復（ＨＤＲ）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって起動される過程中での端部捕捉によってのいずれかで挿入されることができる。標的遺伝子座は、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子、またはＲｏｓａ遺伝子等の「セーフハーバー」遺伝子座を含む。米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１１０３０１０７３号、同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号、および米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照のこと。ヌクレアーゼが媒介する組み込みは、導入遺伝子の無作為の組み込みに依存する伝統的な組み込みアプローチに比べて、それが、遺伝子サイレンシングまたは隣接するガン遺伝子の活性化の危険性を最小限にするための正確な導入遺伝子の位置付けを可能にするため、改善された導入遺伝子発現、向上された安全性および発現持続性の可能性を提供する。

赤血球（ＲＢＣ）、または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、血液の主要な細胞成分である。実際に、ＲＢＣは、ヒトにおける細胞の４分の１を占める。成熟ＲＢＣは、ヒトにおいて核および多くの他の細胞小器官を欠いており、ヘモグロビン、すなわち酸素を組織に運搬ならびに二酸化炭素を組織から運び出して除去のために肺に戻るように機能するＲＢＣに見られる金属タンパク質で一杯である。当該タンパク質は、ＲＢＣの乾燥重量のうちの約９７％を占めており、約７０倍血液の酸素運搬能を増大させる。ヘモグロビンは、２つのα様グロビン鎖および２つのβ様グロビン鎖および４つのヘム基を含むヘテロ四量体である。成人では、α２β２四量体は、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）または成人ヘモグロビンと称される。典型的に、アルファおよびベータグロビン鎖は、約１：１の比率で合成され、この比率は、ヘモグロビンおよびＲＢＣ安定化に関して重要であると思われる。実際に、いくつかの場合には、グロビン遺伝子の１つの型が不適切に発現される場合（以下を参照）、（例えば特異的ｓｉＲＮＡを用いて）グロビンの他方の型の発現を減少させ、この１：１の比率を回復することにより、変異細胞表現型のいくつかの様相を軽減させる（Ｖｏｏｎｅｔａｌ（２００８）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ９３（８）：１２８８を参照のこと）。発育中の胎児においては、異なる形態のヘモグロビンである、ヘモグロビンＡよりも酸素に対するより高い結合親和力を有する胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）が、産生され、よって、酸素が母体の血流を介して胎児の系へ送達されることができる。胎児ヘモグロビンも、２つのαグロビン鎖も含有するが、成人βグロビン鎖の代わりに２つの胎児γグロビン鎖を有する（すなわち、胎児ヘモグロビンがα２γ２である）。約３０週の妊娠期間で、βグロビンの産生が増加する間に、胎児におけるγグロビンの合成は、低下し始める。一部のＨｂＦが成人期（総ヘモグロビンの約１〜３％）まで持続するが、生後約１０か月までに、新生児のヘモグロビンは、ほぼ全てα２β２となる。γの産生からβへの産生の切り替えの調節は、かなり複雑であり、主に、βグロビン発現の同時上方調節と共にγグロビンの発現下方調節を含む。

ヘモグロビン鎖をコードする配列中の遺伝的欠陥は、鎌状赤血球貧血およびサラセミアを含む、異常ヘモグロビン症として知られる数多くの疾患の原因となり得る。異常ヘモグロビン症の患者の大多数は、γグロビンをコードする遺伝子が存在して残るが、発現は、上述のように分娩時に生じる正常な遺伝子抑制のため比較的低い。

米国では５０００人に１人の割合で鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有すると推定されており、大多数はサハラ以南のアフリカ系の人々である。マラリア予防のための鎌状細胞ヘテロ接合性の利点があるため、この形質は何度も選択され、よって、サハラ以南のアフリカでは、人口の３分の１が鎌状赤血球形質を有すると思われる。鎌状赤血球症は、６番アミノ酸でバリンがグルタミン酸に（ＤＮＡレベルでＧＡＧがＧＴＧに）置換されるβグロビン遺伝子中の突然変異によって生じ、得られたヘモグロビンは、「ヘモグロビンＳ」または「ＨｂＳ」と称される。低級酸素条件下で、ＨｂＳのデオキシ型への立体構造変化は、Ｅらせん体とＦらせん体との間のタンパク質上に疎水性パッチを曝露する。ヘモグロビンのベータ鎖の位置６でのバリンの疎水性残基は、疎水性パッチと会合することができ、ＨｂＳ分子を凝集させて繊維状の沈殿物を形成させる。これらの凝集体が、次いで、ＲＢＣの異常または「鎌状」を生じ、細胞の柔軟性の喪失をもたらす。鎌状のＲＢＣは、毛細血管床中に入り込むことがもはやできず、鎌状細胞症患者において血管閉塞性の危機をもたらし得る。また、鎌状ＲＢＣは、正常なＲＢＣよりも更に脆弱であり、溶血に向かう傾向があり、最終的に患者の貧血を引き起こす。

鎌状細胞症患者の治療および対策は、急性発症中の抗生物質治療、疼痛対策、および輸血を含む生涯にわたっての命題である。１つのアプローチは、ヒドロキシ尿素の使用であり、部分的にγグロビンの産生を増大させることによってその効果を発揮する。しかしながら、慢性ヒドロキシ尿素療法の長期にわたる副作用は、いまだ不明であり、治療は、不要な副作用をもたらし、患者によって変化しやすい効力を有することがある。鎌状細胞治療の効力の増大にもかかわらず、患者の平均余命は、まだ５０代半ばほどであり、疾患に伴う病的状態は、患者の生活の質に深刻な影響をもたらす。

サラセミアもまた、ヘモグロビンに関連する疾患であり、典型的にグロビン鎖の発現減少を含む。これは、遺伝子の調整領域における突然変異を通じてまたは減少した発現をもたらすグロビンコード配列における突然変異から生じ得る。アルファサラセミアは、西アフリカおよび南アフリカ系の人々と関連し、マラリアの抵抗力を与え得る。ベータサラセミアは、典型的に、ギリシャおよびトルコの沿岸地域およびイタリアからの地中海系の人々と関連する。サラセミアの治療は、通常、輸血および鉄キレート療法を含む。骨髄移植もまた、適切なドナーが識別できた場合重度のサラセミアを患う人々の治療のために使用されるが、この過程は、重大な危険性を有し得る。

提案されたＳＣＤおよびベータサラセミアの両方の治療のための１つのアプローチは、ＨｂＦに機能的に異常な成人ヘモグロビンを置換させる目的を持つγグロビンの発現を増加させることである。上述のように、ヒドロキシ尿素を有するＳＣＤ患者の治療は、γグロビン発現を増加させることへのその影響のため部分的に成功していると考えられている。ＨｂＦ再活性化活性に作用することが発見された化合物の第１のグループは、細胞障害性薬物であった。薬理学的操作によってガンマ−グロビンのデノボ合成を行わせる能力は、最初に実験動物に５−アザシチジンを用いることによって示された（ＤｅＳｉｍｏｎｅ（１９８２）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７９（１４）：４４２８−３１）。後続の研究は、β−サラセミアおよび鎌状赤血球症の患者のＨｂＦを増加させる５−アザシチジンの能力を確認した（Ｌｅｙ，ｅｔａｌ．，（１９８２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０７：１４６９−１４７５、およびＬｅｙ，ｅｔａｌ．，（１９８３）Ｂｌｏｏｄ６２：３７０−３８０）。さらに、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸および誘導体）は、実験系においてＨｂＦを増加させることが示された（Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓら、（１９８８）Ｂｌｏｏｄ７２（６）：１９６１−１９６７）。また、ＨｂＦの上昇した量が成人期に持続する「遺伝性高胎児ヘモグロビン症」（ＨＰＦＨ）として既知の疾患を伴う人口のセグメントが存在する（ＨＰＦＨヘテロ接合体の１０〜４０％（Ｔｈｅｉｎｅｔａｌ（２００９）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ１８（Ｒ２）：Ｒ２１６−Ｒ２２３を参照のこと）。これは、稀な疾患ではあるが、いかなるベータグロビン異常も伴わない場合、個々のヘモグロビンが１００％ＨｂＦであったとしてもいかなる重大な臨床症状も伴わない。ベータサラセミアを有する個人が同時発生的にＨＰＦＨもまた有するとき、ＨｂＦの発現は、疾患の重症度を軽減することができる。更に、鎌状赤血球症の自然経過の重症度は、患者によって著しく異なり、この変化は、部分的に、より軽度の疾患を有するいくつかの個々がＨｂＦのより高いレベルを発現するという事実を遡ることができる。

ＨｂＦの発現を増加させる１つのアプローチは、産物がγグロビン発現の調節において役割を果たす遺伝子を識別することを含む。１つのそのような遺伝子は、リンパ球の発生におけるその役割のため最初に特定されたＢＣＬ１１Ａである。ＢＣＬ１１Ａは、γグロビン発現の段階特異的調節に含まれると考えられるジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは、成人赤血球前駆細胞において発現され、その発現の下方調節は、γグロビン発現の増加をもたらす。また、ＢＣＬ１１ＡｍＲＮＡのスプライシングが発生的に調節されると考えられる。胚細胞では、ＢＣＬ１１Ａ−ＳおよびＢＣＬ１１Ａ−ＸＳとして知られるより短いＢＣＬ１１ＡｍＲＮＡバリアントが主に発現されるが、成人細胞では、より長いＢＣＬ１１Ａ−ＬおよびＢＣＬ１１Ａ−ＸＬｍＲＮＡバリアントが主に発現されると考えられる。Ｓａｎｋａｒａｎｅｔａｌ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２ｐ．１８３９を参照のこと。ＢＣＬ１１Ａタンパク質は、βグロビン遺伝子座と相互作用して、その立体構造を改変するように思われ、したがって、異なる発生的段階でその発現が変化すると考えられる。また、別の調節タンパク質ＫＬＦ１は、γグロビン発現の調節に関与すると考えられる。ＫＬＦ１レベルがＢＣＬ１１Ａレベルに正比例し、両方がγグロビンレベルに反比例することが見出された。例えば、ＨｂＦの発現が持続しているマルタ人族において、一族はＫＬＦ１遺伝子のヘテロ接合性の突然変異を保有する（Ｂｏｒｇｅｔａｌ（２０１０）ＮａｔＧｅｎｅｔ，４２（９）：８０１−８０５）。ＫＬＦ１遺伝子産物は、ｉｎｖｉｖｏでＢＣＬ１１Ａ遺伝子に直接結合し、したがって、その上方調節を行い得ると考えられる（Ｂｏｒｇｅｔａｌ．同上、Ｂｉｅｋｅｒ（２０１０）ＮａｔＧｅｎｅｔ４２（９）：７３３−７３４、Ｚｈｏｕｅｔａｌ．（２０１０）ＮａｔＧｅｎｅｔ４２（９）：７４２−７４４を参照のこと）。したがって、ＫＬＦ１がＢＣＬ１１Ａ発現を刺激するならば、その誘導されたＢＣＬ１１Ａの作用は、γグロビンおよびＨｂＦ産生の抑制をもたらすであろう。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的にする阻害性ＲＮＡの使用が、提案されているが（例えば、米国特許公開第２０１１０１８２８６７号を参照のこと）、この技術にはいくつかの潜在的な欠点があり、すなわち、完全なノックダウンが達成され得ず、そのようなＲＮＡの送達に問題があり得、このＲＮＡは継続的に存在しなければならず、一生涯、複数の治療を必要とする。

アルファサラセミアはまた、特にアジアで、ヒトにおいて高い有病率があり、いくつかの型のアルファグロビン異常は、ヒトにおける最も一般的な遺伝性疾患であると考えられている。世界の熱帯および亜熱帯地域では、アルファグロビン障害は、人口の８０〜９０％で見つかっている（ＨａｒｔｅｖｅｌｄａｎｄＨｉｇｇｓ（２０１０）ＯｒｐｈａｎｅｔＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｒｅＤｉｓｅａｓｅｓ５：１３を参照のこと）。

ヒトは、１６番染色体上にタンデム（α１およびα２）のアルファグロビン遺伝子の２つのコピーを担持し、よって、通常の二倍体細胞には、合わせて４つのコピーが存在する。α２遺伝子は、通常、α１遺伝子よりも２〜３倍以上のαグロビンｍＲＮＡの生成要因である。これら２つの遺伝子のタンデム構成は、アルファサレセミア患者のアルファグロビン遺伝子における大きな欠失の高い有病率と関連し得、そこでは一般に、非機能性であるアルファグロビン遺伝子の数が、任意のアルファサレセミアの重症度に直接関係する（Ｃｈｕｉｅｔａｌ（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（３）：７９１を参照のこと）。１つのコピーの欠失は、かなり一般的であると思われ（アフリカ系アメリカ人の３０％およびサウジアラビア、インド、およびタイに居住する人々の６０〜８０％）、一般的に遺伝子検査が行われない限り、個々においては明らかではない。同じ染色体上か（シス）または各染色体から１つずつか（トランス）の２つのコピーの欠失は、患者に軽度の貧血を生じさせ得る。３つのαグロビン遺伝子が欠失されると、個人は、機能しているαグロビン遺伝子を１つしか有しないことになり、よって、軽度の貧血が起こるが、更に重要なことには、必須のαグロビンとβグロビンとの比率が、乱される。４つのベータグロビン鎖を含むβ４四量体が、多くの場合、ＨｂＨとして既知の疾患である１つの機能的アルファグロビン遺伝子のみを有する患者に見出される。β４四量体は、酸素に結合することができるが、末梢にそれを放出せず、ＨＢＨ疾患として知られているものを生じる。ＨＢＨ疾患を有する個人は、短縮された半減期の、容易に溶血を起こすＲＢＣを有し、さらなる貧血をもたらす。全ての４つのαグロビン遺伝子の損失は、通常、子宮内で致命的なものである。
したがって、例えば鎌状赤血球症およびサラセミアのような異常ヘモグロビン症を治療するように異常遺伝子を修正するまたは他の発現を改変する、ゲノム編集のために使用できるさらなる方法および組成物の必要性が依然として存在する。

米国特許第７，８８８，１２１号明細書米国特許出願公開第２００８／０２９９５８０号明細書米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書米国特許出願公開第２０１１／０１８２８６７号明細書

Ｖｏｏｎｅｔａｌ（２００８）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ９３（８）：１２８８Ｌｅｙ，ｅｔａｌ．，（１９８２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０７：１４６９−１４７５Ｌｅｙ，ｅｔａｌ．，（１９８３）Ｂｌｏｏｄ６２：３７０−３８０Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓら、（１９８８）Ｂｌｏｏｄ７２（６）：１９６１−１９６７Ｔｈｅｉｎｅｔａｌ（２００９）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ１８（Ｒ２）：Ｒ２１６−Ｒ２２３Ｓａｎｋａｒａｎｅｔａｌ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２ｐ．１８３９Ｂｏｒｇｅｔａｌ（２０１０）ＮａｔＧｅｎｅｔ，４２（９）：８０１−８０５Ｂｏｒｇｅｔａｌ．同上、Ｂｉｅｋｅｒ（２０１０）ＮａｔＧｅｎｅｔ４２（９）：７３３−７３４Ｚｈｏｕｅｔａｌ．（２０１０）ＮａｔＧｅｎｅｔ４２（９）：７４２−７４４ＨａｒｔｅｖｅｌｄａｎｄＨｉｇｇｓ（２０１０）ＯｒｐｈａｎｅｔＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｒｅＤｉｓｅａｓｅｓ５：１３Ｃｈｕｉｅｔａｌ（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（３）：７９１

本明細書に開示されるものは、発現を改変するため、または鎌状赤血球症またはサラセミアのような遺伝子疾患（例えば、不足しているタンパク質を産生すること、疾患および／またはこれらのタンパク質を制御するタンパク質における欠損または異常）に含まれる１つ以上の遺伝子コードタンパク質を修正するための方法および組成物である。そのようなタンパク質の改変は、これらの遺伝子疾患の治療をもたらすことができる。特に、ゲノム編集を使用して、異常遺伝子の修正する、野生型遺伝子を挿入する、または内因性遺伝子の発現を変更する。非限定的な例として、野生型遺伝子コードβグロビンが細胞に挿入され得、不足しているタンパク質を産生し得るおよび／または異常のあるβグロビンによって引き起こされた異常ヘモグロビン症を治療し得る。いくつかの例では、野生型遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座に、または赤血球細胞のβグロビン遺伝子座のような関心組織で高く発現されることで知られる遺伝子座に挿入され得る。ゲノム編集を同様に使用して不足するたんぱく質を産生し得、（およびそれによって）野生型アルファグロビン遺伝子をセーフハーバーに挿入することによってアルファサレセミアを治療し得る。別のアプローチは、異常のある内因性αまたはβグロビン遺伝子が標的とされ置換された変異配列である遺伝子修正の使用を含む。あるいは、γグロビンの抑制に関与する制御遺伝子が、改変されるかまたはノックアウトされ得（例えば、抑圧的なタンパク質の量を不活性化させることおよび／または減少させることによってγグロビンの発現を増加させること）、および／またはγグロビン遺伝子の上流またはベータ−グロビン遺伝子座の他の領域における制御結合部位が改変され得、よって、制御因子は、γグロビン遺伝子座に適切に相互作用できず、ＨｂＦが産生され、それによって異常βグロビン遺伝子によって生じた影響（すなわち、ＳＣＤまたはβ−サラセミア）を抑止する。１つのアプローチは、幹細胞の修飾（例えば、造血幹細胞またはＲＢＣ前駆体）を使用することを更に含み、その幹細胞を、次いで使用して異常ヘモグロビン症の治療のために患者に移植できる。

一態様では、ゲノム内の関心領域の標的部位（例えば、βグロビン、αグロビンまたはセーフハーバー遺伝子、または調節遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ、γグロビン、またはＫＬＦ１等のそのＤＮＡ標的）に結合するジンク−フィンガータンパク質（ＺＦＰ）が、本明細書で記載され、ＺＦＰは、１つ以上の遺伝子操作されたジンク−フィンガー結合ドメインを含む。一実施形態では、ＺＦＰは、対象とする標的ゲノム領域を切断するジンク−フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは、１つ以上の遺伝子操作されたジンク−フィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子の標的部位を認識する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、５つまたは６つのジンクフィンガードメインを含み、グロビン遺伝子の標的部位を認識する（例えば、表１Ａに示される認識へリックス領域を有する５つまたは６つのフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質）。別の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、α、β、またはγグロビン遺伝子、またはそれらの調節要素の標的部位を認識する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、５つまたは６つのジンクフィンガードメインを含み、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、α、β、またはγグロビン遺伝子、またはそれらの調節要素の標的部位を認識する（例えば、表１Ａに示される認識へリックス領域を有する５つまたは６つのフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質）。

別の態様では、ゲノム内の関心領域の標的部位（例えば、αまたはβグロビンまたはセーフハーバー遺伝子、または調節遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ、γグロビン、またはＫＬＦ１等のそのＤＮＡ標的）に結合する（転写活性化因子様の）ＴＡＬＥタンパク質が、本明細書に記載され、ＴＡＬＥは、１つ以上の遺伝子操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含む。一実施形態では、ＴＡＬＥは、ＴＡＬＥは、対象とする標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、ＴＡＬＥＮは、１つ以上の遺伝子操作されたＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子の標的部位を認識する。他の実施形態では、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、α、β、またはγグロビン遺伝子、またはそれらの調節要素の標的部位（例えば、表３に例示されるＴＡＬＥＮタンパク質）を認識する。

別の態様では、ゲノム内の関心領域の標的部位（例えば、高度に発現された遺伝子、遺伝子に関連付けられた疾患、またはセーフハーバー遺伝子）に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、本明細書に記載され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび遺伝子操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単一のガイドＲＮＡ）を含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、高度に発現された遺伝子、疾患に関連付けられる遺伝子、またはセーフハーバー遺伝子の標的部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、グロビン、アルブミン、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、またはＨＰＲＴ遺伝子の標的を認識する。

本明細書に記載されるようにＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子内のまたは遺伝子に隣接するコード領域もしくは非コード領域内の関心領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等、あるいはコード領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内の関心領域に結合するおよび／または関心領域を切断することができる。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、グロビン遺伝子に結合するおよび／またはグロビン遺伝子を切断する。他の実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えばＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子、またはＲｏｓａ遺伝子等のセーフハーバー遺伝子に結合するおよび／またはセーフハーバー遺伝子を切断する。米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１１０３０１０７３号、同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号、および米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照のこと。また、選考にあたり補助として、ＨＰＲＴ遺伝子座が使用されてもよい（米国特許公開第２０１３０１２２５９１号を参照のこと）。別の態様では、本明細書に記載されるジンク−フィンガーおよび／またはＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のうちの１つ以上を含む組成物が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、α、β、またはγグロビン遺伝子に結合するおよび／またはそれらを切断するかまたはそれらの調節要素で切断する。別の態様では、本明細書に記載されるジンク−フィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣａｓヌクレアーゼのうちの１つ以上を含む組成物が、本明細書に記載される。

別の態様では、本明細書に記載される１つ以上のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に記載される。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであってもよい。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾され得る（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎｅｔａｌ、（２０１１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９（２）：１５４−１５７を参照のこと）。

別の態様では、本明細書に記載される１つ以上のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを、プロモーターに作動可能に連結されて含むＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系発現ベクターが、本明細書に記載される。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。

一態様では、標的ＤＮＡを切断するように使用されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書に記載される。

他の態様では、遺伝子組み換えされたＲＢＣ前駆体（「ＨＳＣ」として知られる造血幹細胞）が、骨髄移植において与えられ、ＲＢＣは、ｉｎｖｉｖｏで分化して成熟する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ誘導の動員に続いて単離され、他の実施形態では、細胞は、ヒトの骨髄または臍帯から単離される。いくつかの態様では、ＨＳＣは、グロビン発現制御因子（例えば、ＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１）をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼでの処理によって編集される。他の態様では、ＨＳＣは、遺伝子操作されたヌクレアーゼおよびドナー核酸で修飾され、それによって、野生型遺伝子（例えば、グロビン遺伝子）が、挿入されて発現されるおよび／または内因性異常遺伝子が修正される。いくつかの場合では、挿入のための野生型遺伝子配列は、野生型βグロビンまたは野生型αグロビンをコードする。他の場合では、内因性異常遺伝子は、βグロビンまたはαグロビン遺伝子である。いくつかの実施形態では、修飾されたＨＳＣは、軽度の骨髄破壊的移植前治療後に患者に投与される。他の態様では、ＨＳＣは、完全な骨髄破壊の後に投与され、それによって移植に続いて、１００％の造血細胞が、修飾されたＨＳＣに由来する。

別の態様では、ＲＢＣ前駆細胞の内因性遺伝子（例えば、その不活性化がＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１等の増加したガンマグロビン発現をもたらす遺伝子）を切断するための方法が、本明細書に記載され、当該方法は、ＺＦＮ（複数可）、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が発現されて１つ以上の遺伝子が切断されるような条件下で、１つ以上の内因性遺伝子の標的部位に結合する１つ以上のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、細胞内に導入することを含む。別の態様では、細胞のＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１遺伝子を切断するための方法が、本明細書に記載され、当該方法は、ＺＦＮ（複数可）、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が発現されて１つ以上のＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１遺伝子が切断されるような条件下で、１つ以上のＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１遺伝子の標的部位に結合する１つ以上のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、細胞内に導入することを含む。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、５つまたは６つのジンクフィンガードメインを含み、グロビン遺伝子の標的部位を認識する（例えば、表１Ａに示される認識へリックス領域を有する５つ〜６つのフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質）。他の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、βグロビン、α−グロビン、ガンマグロビン、ＫＬＦ、またはＢＣＬ１１Ａ配列（表３に例示される）の標的部位を認識する。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系は、単一のガイドＲＮＡが対象とする標的遺伝子の所望の標的部位を認識するように操作された、βグロビン、αグロビン、ガンマグロビン、ＫＬＦ、またはＢＣＬ１１Ａ配列の標的部位を認識する。切断された遺伝子（複数可）は、非活性化され得（ノックアウト）、例えば、その産物（複数可）が遺伝子の発現を阻害し得る１つ以上の遺伝子（例えば、グロビン遺伝子）のノックアウト、またはそのようなタンパク質のためのＤＮＡ上の調節標的部位の妨害等である。いくつかの実施形態では、非活性化された遺伝子（複数可）またはそれらの標的配列は、胎児ヘモグロビンの発現を阻害するときに含まれるものである。分化されたとき細胞（例えば、幹細胞）は、胎児ヘモグロビンを含有し、それを必要とする患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、グロビン遺伝子は、ノックアウトされる。例えば、アルファグロビン遺伝子は、ベータグロビンが不十分に発現されたときノックアウトされてアルファグロビンとベータグロビンとの比率を修復し得、またはベータグロビン遺伝子をコードするＨｂＳは、野生型ベータグロビンの挿入に合わせてノックアウトされ得る。分化されたとき細胞（例えば、幹細胞）は、ＨｂＡヘモグロビンを含有し、それを必要とする患者に投与することができる。

別の態様では、細胞（例えば、幹細胞）の内因性遺伝子（例えば、ベータグロビン、アルファグロビン、および／またはセーフハーバー遺伝子）中に配列を挿入するための方法が、本明細書に記載され、当該方法は、１つ以上のヌクレアーゼを用いて内因性遺伝子を切断することおよび切断部位に配列を挿入することを含む。ある特定の実施形態では、任意の標的遺伝子におけるゲノム配列が、本明細書に記載されるような例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ対、またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系（または前記ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系をコードするベクター）、および、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系により標的とされた切断に続いて遺伝子に挿入される「ドナー」配列（別名「導入遺伝子」）を用いて置換される。ドナー配列は、ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮベクターに存在してもよいか、別個のベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶ、もしくはＬＶベクター）に存在してもよいか、または代替として、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入されてもよい。標的遺伝子座（例えば、グロビン遺伝子、他のセーフハーバー遺伝子、等）へのそのようなドナーヌクレオチド配列の挿入は、標的遺伝子座の（例えば、グロビンの）遺伝子制御要素の制御の下で、導入遺伝子の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、非コードＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする。ＲＢＣの成熟化の前の導入遺伝子の発現は、対象とする非コードＲＮＡを含有するＲＢＣをもたらす。

他の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、グロビン（例えば、野生型ベータおよび／または野生型ガンマ）タンパク質等の機能的タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、対象とする導入遺伝子の内因性遺伝子（例えば、グロビン遺伝子）への挿入は、未変化の外因性タンパク質配列の発現をもたらし、内因性遺伝子によってコードされた任意の配列を欠く。他の実施形態では、発現された外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子によっておよびグロビン遺伝子によって（例えば、内因性標的遺伝子座からか、または代替として、導入遺伝子上のグロビン−コード配列から）コードされたアミノ酸を含む。いくつかの場合では、グロビン遺伝子は、ベータグロビンであるが、他の場合では、グロビン遺伝子は、アルファグロビンである。他の場合では、グロビン遺伝子は、ガンマグロビン遺伝子である。存在するとき、内因性グロビン配列は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部および／または外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部上に存在し得る。グロビン配列は、完全長の野生型または変異グロビン配列を含み得、または代替として、部分的なグロビンコード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、グロビン導入遺伝子融合が、細胞内の内因性遺伝子座に位置するが、他の実施形態では、グロビン導入遺伝子コード配列が、ゲノム内のセーフハーバー中に挿入される。いくつかの態様では、セーフハーバーは、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（別名ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子、またはＲｏｓａ遺伝子から選択される。米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１１０３０１０７３号、同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号、および米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照のこと。また、選考にあたり補助として、ＨＰＲＴ遺伝子座が使用されてもよい（米国特許公開第２０１３０１２２５９１号を参照のこと）。

なおも別の態様では、細胞株および／または遺伝子導入動物モデル（系）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子導入細胞および／または動物は、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの場合では、遺伝子導入動物は、外因性導入遺伝子に対応する内因性遺伝子座のノックアウトを含み（例えば、マウスグロビン遺伝子が、ノックアウトされ、ヒトグロビン遺伝子が、マウス中に挿入される）、それによって、ヒトタンパク質が孤立した状態で研究され得るｉｎｖｉｖｏ系の開発を可能にする。そのような遺伝子導入モデルをスクリーニング目的のために使用して、小分子、または大きい生体分子、または対象とするヒトタンパク質と相互作用し得るかまたは対象とするヒトタンパク質を修飾し得る他の実体を特定し得る。いくつかの態様では、導入遺伝子は、幹細胞中（例えば、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞等）または本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって獲得された動物胚の選択された遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー）中に組み込まれ、次いで、胚は、移植されて生きた動物が誕生する。他の態様では、幹細胞は、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、またはγグロビン遺伝子、またはそれらの組み合わせのような内因性遺伝子座においてゲノム改変を含有し、それによってγグロビン発現が上昇する。いくつかの実施形態では、γグロビン発現の上昇は、非編集の幹細胞と比較して、細胞のγグロビンとβグロビンとの比率を改変する。次いで、動物は、性的成熟まで飼育され、子孫のうちの少なくともいくつかが編集された内因性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む、子孫を産生することを可能にする。

なおもさらなる一態様では、例えば、胚の染色体へ等の染色体の内因性遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子）への核酸配列の特異的部位の組み込みのための方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）胚に、（ｉ）ＤＮＡベクターが、組み込まれる核酸配列に隣接している上流配列および下流配列を含む、すくなくとも１つのＤＮＡベクターと、（ｉｉ）ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子と、を注入することを含む。Ｃａｓ９タンパク質を用いる場合では、遺伝子操作されたｓｇＲＮＡもまた導入される。ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系は、標的遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子座）の標的部位を認識し、次いで、（ｂ）胚が、培養されてジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の発現を可能にし、二本鎖切断が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって標的に導入され、次いでＤＮＡベクターとの相同組み換えを介して修復され、核酸配列を染色体に組み込む。

本明細書に記載される方法のいずれにおいても、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（複数可）、ＴＡＬＥＮ（複数可）、および／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはプラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含む。

本発明のＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系を含むキットもまた、提供される。キットは、ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸（例えば、好適な発現ベクターに含有される遺伝子をコードするＲＮＡ分子またはＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ９遺伝子）、および必要な場合操作されたｓｇＲＮＡ、またはヌクレアーゼタンパク質の一定分量、ドナー分子、好適な宿主細胞株、本発明の方法を実行するための指示等を含んでもよい。

これらおよび他の態様は、本開示を全体として考慮することにより、当業者に容易に明らかになる。

（図上に示される）鎌状赤血球症突然変異を囲む領域におけるβの様なグロビン遺伝子配列のアラインメントを描写する。（一番上の行から一番下の行に）鎌状細胞突然変異（ＨＢＢ鎌状、配列番号１）を有するヘモグロビンベータ配列、ヘモグロビンベータ（ＨＢＢ、配列番号２）、ヘモグロビンデルタ（ＨＢＤ、配列番号３）、ベータヘモグロビン疑似遺伝子（ＨＢＢＰ１、配列番号４）、ヘモグロビンイプシロン（ＨＢＥ１、配列番号５）、ヘモグロビンガンマ１（ＨＢＧ１、配列番号６）、およびヘモグロビンガンマ２（ＨＢＧ２、配列番号７）が示される。ＣｅｌＩ活性分析の結果が、示された５つのＺＦＮ対についてアラインメントの下に示される。パネルＡおよびＢは、ＣＤ３４＋細胞のβグロビンドナーによって指定された配列の挿入を描写するゲルである。図２Ａ（ＲＦＬＰ）は、挿入がドナーＤＮＡ上に存在する新規の制限部位の存在によって検証されるβグロビンドナーによって指定された配列の挿入を描写する。図２Ｂは、ミスマッチを作製する新規の配列を示すＣｅｌ−１ミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）の結果を描写する。突然変異を担持する対立遺伝子のパーセント（％ＮＨＥＪ）が、ゲルの右側にテキストで示される（ゲルのレーン番号に対応する第１のカラム）。数値は、ＺＦＮ組み合わせを指し、ｕｎｔは非遺伝子導入対照を指す。ＫＬＦ１およびＢＣＬ１１Ａがβおよびガンマグロビン遺伝子発現の調節において果たす役割を描写する図解である。ＫＬＦ１の発現は、ＢＣＬ１１ａおよびβグロビン遺伝子両方の発現を刺激する。ＢＣＬ１１Ａタンパク質は、ガンマ−グロビン発現を抑制する。パネルＡ〜Ｅは、示されたＢＣＬ１１Ａ（図４Ａ）、ＫＬＦ１（図４Ｃおよび４Ｄ）、またはＨＰＲＴ（図４Ｂ）に特異的なＺＦＮによるＨＳＣの処理後の、形質導入された細胞を短い低体温ショック（３０°）または標準条件（３７°）下のいずれかで処理した、上述のＣｅｌ１アッセイの結果を示すゲルを描写する。ＤＮＡが、遺伝子導入の３日後に回収された。図４Ｅは、ＨＳＣの遺伝子導入の３日後または赤血球分化の１７日後に回収された試料で実行されたＣｅｌ１分析の同じ型を描写する。突然変異を担持する対立遺伝子のパーセント（％ＮＨＥＪ）は、レーンの下に示され、使用されたＺＦＮ対の識別が、各図に示される。パネルＡ〜Ｅは、示されたＢＣＬ１１Ａ（図４Ａ）、ＫＬＦ１（図４Ｃおよび４Ｄ）、またはＨＰＲＴ（図４Ｂ）に特異的なＺＦＮによるＨＳＣの処理後の、形質導入された細胞を短い低体温ショック（３０°）または標準条件（３７°）下のいずれかで処理した、上述のＣｅｌ１アッセイの結果を示すゲルを描写する。ＤＮＡが、遺伝子導入の３日後に回収された。図４Ｅは、ＨＳＣの遺伝子導入の３日後または赤血球分化の１７日後に回収された試料で実行されたＣｅｌ１分析の同じ型を描写する。突然変異を担持する対立遺伝子のパーセント（％ＮＨＥＪ）は、レーンの下に示され、使用されたＺＦＮ対の識別が、各図に示される。パネルＡ、およびＢは、ベータ−グロビン（図５Ａ）と比較されたガンマグロビンかまたは１８ｓＲＮＡ標準（図５Ｂ）で修正されたガンマグロビンｍＲＮＡの、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）手順によって分析されたような分化に続いて７日または１７日のいずれかでの、発現を描写する。ガンマ＋ベータ−グロビンｍＲＮＡと比較されたガンマグロビンｍＲＮＡのパーセントが、図５Ａの各バーの上に示される。図５Ｂでは、１８ｓＲＮＡによって規準化されたガンマグロビンの相対レベルが、バーの上に描写され、１８Ｓに関するガンマグロビンｍＲＮＡのレベルが、ＢＣＬ１１Ａ特異的ＺＦＮによって処置された細胞においてより高いことを示す。細胞の遺伝子型によって様々であるＨＳＣに由来するメチルセルロースコロニーのガンマグロビンｍＲＮＡの量を描写する。両方のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が野生型（「ＢＢ」）である細胞は、単一のＢＣＬ１１Ａノックアウト対立遺伝子（「Ｂｂ」）を有したまたは両方の対立遺伝子ノックアウト（「ノックアウト」）を有した細胞と比較して、最小量のガンマグロビンｍＲＮＡを産生する。バーの上の数値は、総ベータ−グロビンのうちの産生されたガンマグロビンのパーセントを示す。Ｋ５６２細胞のガンマグロビン特異的ＺＦＮによる処理に続くガンマグロビン遺伝子の領域上流の一連のＤＮＡ配列（配列番号１４０〜１４８）を示す。配列は、ＨＰＦＨと関連するヒト遺伝子型のうちの１つと同一である１３ｂｐ欠失（「Δ１３ｂｐ」）を含む多数の挿入および欠失を有する。一番上の「参照」配列は、ガンマグロビンに対する野生型５の調整領域の配列である。ＺＦＮ対の結合部位は、赤で強調され、自然に生じる１３ｂｐ欠失には下線が引かれている。パネルＡ〜Ｃは、ガンマ−グロビンプロモーターを標的とするＺＦＮにより処理され、その後にメチルセルロースコロニー上に蒔かれた、ＨＳＣに由来する赤血球コロニーのＴａｑｍａｎ分析を描写する。コロニー番号および遺伝子型が、各バーの下部に示される。図８Ａは、相対的なガンマ／ベータ−グロビンｍＲＮＡ比を示し、図８Ｂは、１８ｓＲＮＡレベルによって修正されたガンマ−グロビンｍＲＮＡレベルを示し、図８Ｃは、１８ｓによって修正されたベータ−グロビンレベル対応する分析を示す。野生型および突然変異コロニーのための比率の平均の比較は、ガンマ−グロビンプロモーターにおけるＺＦＮ誘導の突然変異を有するコロニーのガンマ−グロビンレベルが上昇していることを示す。ガンマグロビン遺伝子（配列番号１４９〜１５２）のプロモーター領域を示す。２つのガンマグロビン対立遺伝子は、整列している（ＨＢＧ１およびＨＢＧ２）。２つの対立遺伝子の配列における相違は、灰色のボックスで示される。また、ＨＰＦＨと関連する突然変異は、黒色の線画で示される。開始ＡＴＧならびにエクソン１境界が示される。各突然変異と関連する胎児グロビンレベルにおける増加が、その上の数値によって示される。パネルＡおよびＢは、ＮＨＥＪの量（すなわち、ヌクレアーゼで標的とされた切断のＮＨＥＪ系修復事象からの結果である標的とされた遺伝子座妨害）、および示されたジンクフィンガーヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチドドナーを用いてＣＤ３４＋細胞のベータグロビン遺伝子の、検出された遺伝子修正の量を描写する。ＮＨＥＪの量およびドナー上のホモロジーアームが変動されるＣＤ３４＋細胞のドナーヌクレオチドの標的とされた組み込みの量を描写する。ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドドナーによって処理された幹細胞の赤血球誘導体における遺伝子編集の持続性を描写する。遺伝子修飾は、コロニー形成単位である赤血球（「ＣＦＵ−Ｅ」）、バースト形成単位である赤血球（「ＢＦＵ−Ｅ」）、コロニー形成単位である顆粒球／マクロファージ（「ＣＦＵ−ＧＭ」）、およびコロニー形成単位である顆粒球／赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）／単球／マクロファージ（「ＣＦＵ−ＧＥＭＭ」）の、分化から起こる細胞集団の４つの型で分析された。ベータグロビン遺伝子の遺伝子修飾の継時的安定性を描写する。

異常ヘモグロビン症のような遺伝子疾患を研究して治療するための方法および組成物が、本明細書に開示される。本発明は、１つ以上のグロビン遺伝子の発現における好ましい変化が存在し、それが次いで鎌状赤血球症またはサラセミアのような異常ヘモグロビン症の治療を、それらを必要とする対象にもたらすような標的細胞のゲノム編集を説明する。グロビン遺伝子の発現における好ましい変化は、異常βグロビンを有する対象におけるγグロビン遺伝子の供給、および／または異常αまたはβグロビン遺伝子配列の修正を含むが、これらに限定されない。さらに、所望のタンパク質産物を発現するように改変された移植片における改変された造血幹細胞の送達は、鎌状赤血球貧血またはサラセミアのような異常ヘモグロビン症を治療する際に同様に有益であり得る。改変されたグロビン発現を有する細胞株および動物もまた説明される。

したがって、本発明の方法および組成物を使用して、細胞（例えば、赤血球前駆細胞）における１つ以上のグロビン遺伝子（例えば、γ、αおよび／またはβ）の細胞の発現を改変することができる。これらの方法および組成物を使用して、γグロビン抑制（例えば、ＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１）に含まれる遺伝子を妨害することができ、それによって、編集に続いて、細胞はより高いレベルでγグロビンを発現し、ＨｂＦを産生することができる。代替的に、編集を使用して遺伝子上の結合部位を妨害し得（例えば、ベータ−グロビン遺伝子座のＢＣＬ１１Ａ結合を妨害する、ガンマ−グロビンプロモーターのガンマ−グロビン転写の抑制因子の結合を破壊する）、遺伝子の抑制を無能にし得る。代替としてまたはこれらの改変に加えて、方法および組成物を使用して、異常内因性αおよび／またはβグロビン遺伝子を修正するまたは細胞のゲノム内の所望の場所に（例えば、ＨＳＣに）野生型遺伝子を挿入することができる。必要とする対象由来の前駆細胞が、ｅｘｖｉｖｏで修飾され、次いで骨髄グラフトのいずれかで対象に返還できる。

概要
本明細書に開示される方法の実践ならびに組成物の調製および使用は、別途指示のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、ならびに当該分野の技術の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７および定期更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“ＣｈｒｏｍａｔｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有するが、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的、非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性の増加は、Ｋ_ｄの低下と相関している。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、自身に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するため）、かつ／または、それは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。

「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。その反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列に少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識へリックス領域の遺伝子操作（１つ以上のアミノ酸をの改変）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。したがって、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然には存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が、主として合理的基準によってもたらされる、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を格納するデータベース内で情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照のこと。国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号、および米国特許公開第２０１１０３０１０７３号もまた参照のこと。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が、主としてファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験プロセスからもたらされる、天然には見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、および米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。

「組み換え」は、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。この開示の目的のために、「相同組み換え」（ＨＲ）は、例えば、相同性指向性の修復機構を介して細胞内の二本鎖切断の修復中に起こる、そのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いずれの特定の理論に拘束されることも望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスが関与し得る。そのような特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。

本開示の方法において、本明細書に記載されるような１つ以上の標的ヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断を作製し、該切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよいか、または代替として、ドナーポリヌクレオチドは、相同組み換えを介した切断の修復のための鋳型として使用され、その結果、ドナー内のヌクレオチド配列の全てまたは一部の細胞クロマチンへの導入をもたらす。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列は、改変することができ、ある特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の、別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味における配列の置換）を表すと理解されてもよく、あるポリヌクレオチドの、別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換は必ずしも必要ではない。

本明細書に記載される方法のいずれにおいても、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対が使用され得る。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を同様に用いてさらなる二本鎖切断を誘導し得る。

細胞クロマチン内の関心領域内の配列の標的組み換えおよび／または置換および／または改変のための方法の特定の実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列を用いた相同組み換えによって改変される。切断領域に対する配列相同性が存在する場合、そのような相同組み換えは、細胞クロマチン内の二本鎖切断の存在によって刺激される。

本明細書に記載される方法のいずれにおいても、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、関心領域のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含有することができ、それによって、関心領域内に非同一配列を挿入するための相同組み換えを促進する。したがって、特定の実施形態において、関心領域内の配列と相同なドナー配列の一部は、置換されるゲノム配列に約８０〜９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば、１００を超える連続的な塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％よりも高い。ある特定の場合、新しい配列が関心領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、関心領域には存在しない配列を含有することがでる。これらの場合、非相同配列は、一般に、５０〜１，０００塩基対（もしくはその間の任意の整数値）の配列、または関心領域内の配列と相同もしく同一である１，０００を超える任意の数の塩基対によって隣接される。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組み換え機構によってゲノム内に挿入される。

対象とする遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的組み込みによる細胞の１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために、本明細書に記載の方法のいずれかを使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。

さらに、本明細書に記載の標的組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、および１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター）を含むことができる。また、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含む、様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。特定の実施形態において、融合ポリペプチドが、標的とする二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と組み合わさって、開裂活性（好ましくは、二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために交換可能に使用される。

「遺伝子操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された切断ハーフドメイン）とともに偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号、および同第２０１１／０２０１０５５号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さであり得、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（または、その間もしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（または、その間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。

「遺伝子に関連付けられた疾患」は、一遺伝子性疾患において、ある様態で欠陥があるものである。一遺伝子性疾患の非限定的な実施例として、重症複合型の免疫不全、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積症（例えば、Ｇａｕｃｈｅｒの、Ｈｕｒｌｅｒの、Ｈｕｎｔｅｒの、Ｆａｂｒｙの、Ｎｅｉｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ、Ｔａｙ−Ｓａｃｈの等）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが挙げられる。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。

「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞に存在する」かは、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間だけ存在する分子は、成体筋細胞に対する外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。

外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体）、または上記分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質は、限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼを含む。

外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞内に存在しない染色体を含むことができる。細胞内に外因性分子を導入するための方法は、当業者に既知であり、限定されないが、脂質介在性導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性導入、およびウイルスベクター介在性導入を含む。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。

「融合」分子は、好ましくは共有結合的に、２つ以上のサブユニット分子が連結した分子である。サブユニット分子は、同一の化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例として、限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例として、限定されないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられる。

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、融合タンパク質を生成するために、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳される。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与する可能性がある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示内の他の場所に提示する。

本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかに関わらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等の過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節は、限定されないが、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含み得る。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるようなＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較した場合の遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。

「関心領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列等である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組み換えの目的のためであってもよい。関心領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノム内に存在し得る。関心領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にある場合がある。関心領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であってもよい。

「真核」細胞は、限定されないが、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む。

「赤血球」（ＲＢＣ）、または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、造血幹細胞に由来する高分化した細胞である。これらは、ヌクレアーゼおよびほとんどの細胞小器官を欠いている。ＲＢＣは、肺から末梢組織に酸素を運搬するヘモグロビンを含有する。実際に、個々のＲＢＣの３３％は、ヘモグロビンである。それらはまた、代謝中に細胞によって組織から産生されたＣＯ_２を運搬し、呼息中に放出のため肺に戻る。ＲＢＣは、腎臓によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の放出によって媒介される血液低酸素に応答して骨髄で産生される。ＥＰＯは、多数の前赤芽球を増加させて、完全なＲＢＣの成熟化に必要な時間を短縮する。約１２０日後に、ＲＢＣが核または任意の他の再生機能を含有しないため、細胞は、肝臓、脾臓、およびリンパ節のマクロファージの食細胞活性（約９０％）によってまたは血漿の溶血（約１０％）によってのいずれかで血行路から除去される。マクロファージ貪食に続いて、ＲＢＣの化学成分は、リソソーム酵素の作用によるマクロファージの空胞内で分解される。

「分泌組織」は、個々の細胞から、典型的には上皮に由来する何らかの種類の管腔に生成物を分泌する動物の組織である。消化管に限局される分泌組織の例として、腸管、膵臓、および胆嚢を裏打ちする細胞が挙げられる。他の分泌組織には、肝臓、目および粘膜に関連する組織、例えば、唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体、および他の内分泌系のメンバーが含まれる。さらに、分泌組織は、分泌することができる組織型の個々の細胞を含む。

「作動可能な連結」および「作動可能に連結した」（または「作動的に連結した」）という用語は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように構成要素が配置された、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列を指して交換可能に使用される。例として、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーター等の転写調節配列がコード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とともにシスに作動可能に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらは隣接していないが、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、「作動可能に連結した」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同じ機能を、他の構成要素との連結において実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは作動可能に連結している。ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドである場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは作動可能に連結している。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を有することができ、かつ／または、１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を判定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を判定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって判定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上述のＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．を参照のこと。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって判定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ第ＷＯ９８／４４３５０号を参照のこと。

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、対象とする遺伝子の発現を司ることができ、かつ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ベヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、日常的なアッセイにおいて必ずしも測定されないが、好ましくは容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子は、抗生物質耐性を媒介する、配列をコードするタンパク質（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）、配列をコードする有色または蛍光または発光のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化された緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を含むが、これらに限定されない。エピトープ標識は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。「発現タグ」は、対象とする遺伝子の発現を監視するように所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。

「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物等の哺乳類を指す。したがって、本明細書で使用される、「対象」および「患者」という用語は、本発明の改変されたＲＢＣ（または幹細胞）を投与できる任意の哺乳類患者または対象を意味する。本発明の対象は、例えば、神経毒素を含む１つ以上の化学毒素に曝露されているものを含む。

ヌクレアーゼ
組成物、具体的には、異常ヘモグロビン症での使用のための遺伝子を標的とするのに有用なヌクレアーゼが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは天然には存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて遺伝子操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように改変されてもよい。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ；異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）、または特異的ガイドＲＮＡ（例えば、ＣＲＰＩＳＲ／Ｃａｓ）によってガイドされた遺伝子ヌクレアーゼを含む。

Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０個の塩基対切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー、すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎｅｔａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒｅｔａｌ．（１９９４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓｃａｔａｌｏｇｕｅも参照のこと。

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、遺伝子操作された（天然には存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎｅｔａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒｅｔａｌ．（１９９４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓｃａｔａｌｏｇｕｅも参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、天然には存在しない標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒｅｔａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔｅｔａｌ．（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈｅｔａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓｅｔａｌ．（２００７）ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号も参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体で改変されてもよく（すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように）、または異種の切断ドメインに融合されてもよい。

他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するかまたは遺伝子操作された（天然には存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが分かっている。キサントモナスの病原性は、植物細胞内に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存された３型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙｅｔａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も特徴付けされたＴＡＬＥの１つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリアに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓｅｔａｌ（１９８９）ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の手掛かりである約３４個のアミノ酸を含有する。また、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説についてはＳｃｈｏｒｎａｃｋＳ，ｅｔａｌ（２００６）ＪＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。さらに、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、青枯病菌の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが分かっている（Ｈｅｕｅｒｅｔａｌ（２００７）ＡｐｐｌａｎｄＥｎｖｉｒＭｉｃｒｏ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％以下の配列同一性を有する。

したがって、いくつかの実施形態において、標的遺伝子座（例えば、ＣＣＲ５またはセーフハーバー）内の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナス（Ｂｏｃｈｅｔａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕａｎｄＢｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１を参照）ならびにラルストニア（Ｈｅｕｅｒｅｔａｌ（２００７）ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照）、米国特許第８，４２０，７８２号、および同第８，４４０，４３１号、および米国特許公開第２０１１０３０１０７３号、に由来するものと同様のＴＡＬエフェクターに由来する遺伝子操作されたドメインである。

ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質（例えば、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質）を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように遺伝子操作されているという点で天然には存在しない。例えば、Ｂｅｅｒｌｉｅｔａｌ．（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏｅｔａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎｅｔａｌ．（２００１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏｅｔａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有することができる。遺伝子操作の方法は、限定されないが、合理的設計および種々の種類の選択を含む。合理的設計は、例えば、３つ組（または４つ組）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各３つ組または４つ組のヌクレオチド配列は、特定の３つ組または４つ組の配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、本出願人が所有する特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、本出願人が所有する国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡドメイン（例えば、マルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥドメイン）は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。６アミノ酸長以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーのいずれの組み合わせを含んでもよい。また、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、本出願人が所有する国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

標的部位の選択、ＤＮＡ結合ドメイン、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築は、当業者に既知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号、ならびに米国特許公開第２０１１０３０１０７３号に詳述されている。

また、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。６アミノ酸長以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

Ｂ．切断ドメイン
任意の好適な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合させてＺＦＮを作成しており、これは、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその目的とする核酸標的を認識し、かつヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位付近でのＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的実体である。例えば、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９６）ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３（３）：１１５６−１１６０を参照のこと。より最近では、様々な生物におけるゲノム修飾のためにＺＦＮが使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照のこと。同様に、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼと融合してＴＡＬＥＮを作製している。例えば、米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。

上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼの切断ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとして、限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２−２００３Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＢｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として使用することができる。

同様に、上述のように、開裂活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のために２つの融合タンパク質が必要である。代替として、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用されてもよい。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来してもよいか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来してもよい。さらに、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする空間的定位にそれぞれ切断ハーフドメインを配置するように、２つの融合タンパク質のための標的部位は互いに対して好ましく配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在してもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対以上）。一般に、切断部位は、標的部位の間に位置する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上ではその認識部位から９ヌクレオチドで、また他方の鎖上ではその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照のこと。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、遺伝子操作されていてもよいかまたはいなくてもよい１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含む。

結合ドメインから切断ドメインが分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅｅｔａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５．したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインであるとみなされる。よって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩの融合物を使用した細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。代替として、ＤＮＡ結合ドメインと、２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、開裂活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のいずれの部分であってもよい。

例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：４１８−４２０を参照のこと。

特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２００８０１３１９６２号（これらの全ての開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防止する１つ以上の遺伝子操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な遺伝子操作された切断ハーフドメインとして、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインが４８６および４９９位のアミノ酸残基に突然変異を含む対が挙げられる。

したがって、一実施形態において、４９０における突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６における突然変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させ、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表記される遺伝子操作された切断ハーフドメインを形成することにより、また、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させ、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と表記される遺伝子操作された切断ハーフドメインを形成することにより、調製した。本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、異常な切断を最小限に抑えたまたは消滅させた偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号（参照により、その開示全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

ある特定の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）に、突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）に置換する突然変異を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）に、突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）に置換する突然変異を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）に、突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）に置換する突然変異を含む。（参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照のこと）。本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号に記載されるような野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって調製することができる。

代替として、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎｖｉｖｏで構築されてもよい（例えば、米国特許公開２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現させてもよいか、または、１つのオープンリーディングフレーム内に連結させることができ、個々の構成要素は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４２１６３号および同第２００９００６８１６４号に記載の酵母菌ベースの染色体系において、使用前に活性化についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当該技術分野で既知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照のこと。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってもよい。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
真核生物のＲＮＡｉ経路に匹敵するものと仮説が立てられていた、古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡが媒介するゲノム防御経路の存在に関する有力な証拠が最近浮上した（概説には、ＧｏｄｄｅａｎｄＢｉｃｋｅｒｔｏｎ，２００６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．６２：７１８−７２９、Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌｅｔａｌ．，２００６．Ａｒｃｈａｅａ２：５９−７２、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ１：７．、Ｓｏｒｅｋｅｔａｌ．，２００８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１８１−１８６）を参照のこと。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核のＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として既知の、この経路は、２つの進化的におよび多くの場合物理的に連結された、系のＲＮＡ成分をコードする遺伝子座すなわち、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座と、タンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座と、から起こることが提案されている（Ｊａｎｓｅｎｅｔａｌ．，２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，２００２．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０：４８２−４９６、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ１：７、Ｈａｆｔｅｔａｌ．，２００５．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組み合わせならびにＣＲＩＳＰＲが媒介する核酸切断の特異性をプログラムすることが可能である非コードＲＮＡ要素の組み合わせを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物のＲＮＡｉ機構のタンパク質成分と有意な配列類似性を共有しないが、類似の予想された機能を有する（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ等）（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ１：７）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲ反復スペーサーアレイと関連する。４０個より多い異なるＣａｓタンパク質ファミリーが、説明されている。これらのタンパク質ファミリーのうちのＣａｓ１が、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の中で広範に分布すると思われる。ｃａｓ遺伝子と反復構造との特定の組み合わせを使用して８ＣＲＩＳＰＲサブタイプ（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）を定義し、そのうちのいくつかは、反復される未知のタンパク質（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＲＡＭＰ）をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連する。２つ以上のＣＲＩＳＰＲサブタイプが、単一のゲノムにおいて生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散発性分布は、系が、微生物の進化中に遺伝子水平伝播に供されることを提案する。

（Ｃａｓ９によって例示される）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も良く特徴付けられた系のうちの１つであり、４つの連続的なステップで標的とされるＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイ、およびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡの反復領域とハイブリッド形成され、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡ内へのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のためのさらなる必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を介して標的ＤＮＡにＣａｓ９を向ける。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介し、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作製する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップを含み、（ｉ）「順応」と呼ばれる過程において異質ＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＲアレイに挿入して今後の攻撃を阻止する、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後に（ｉｉｉ）ＲＮＡが媒介する異質核酸との干渉が続く。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のうちのいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主要産物は、侵入物を標的とする配列を含有する短いＲＮＡであると思われ、それらは、名付けられたガイドＲＮＡかまたは経路でのそれらの仮定された役割に基づいて原核をサイレンシングするＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）である。（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ１：７、Ｈａｌｅｅｔａｌ．（２００８）ＲＮＡ１４：２５７２−２５７９）．ＲＮＡ分析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が反復配列内で切断されて個々の侵入物を標的とする配列および隣接する反復断片を含有する〜６０−〜７０−ｎｔＲＮＡ中間体を放出することを示す（Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：７５３６−７５４１；Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：４６９−４８１、Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌｅｔａｌ．（２００６）Ａｒｃｈａｅａ２：５９−７２、Ｂｒｏｕｎｓｅｔａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１：９６０−９６４、Ｈａｌｅｅｔａｌ．（２００８）ＲＮＡ１４：２５７２−２５７９）。古細菌パイロコッカスフリオサスでは、これらの中間体ＲＮＡは、大量の安定した〜３５−〜４５−ｎｔ成熟ｐｓｉＲＮＡに更に処理される（Ｈａｌｅｅｔａｌ．（２００８）ＲＮＡ１４：２５７２−２５７９）。

Ｃａｓタンパク質
「Ｃａｓ１」ポリペプチドとは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質１を指す。Ｃａｓ１（タンパク質分類系のオルソロガス族のクラスターのＣＯＧ１５１８）は、ＣＲＩＳＰＲ関連系（ＣＡＳＳ）の最良のマーカーである。系統発生比較に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ関連免疫系の７つの別個のバージョンが、識別されている（ＣＡＳＳ１−７）。

本明細書に記載される方法で使用されるＣａｓ１ポリペプチドは、任意の原核生物に存在するいずれのＣａｓ１ポリペプチドであってもよい。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、古細菌微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ユリ古細菌門微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、クレン古細菌門微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、細菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、グラム陰性またはグラム陽性細菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、緑膿菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、超好熱性真正細菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ１−７のうちの１つのメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ３のメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ７のメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ３またはＣＡＳＳ７のメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ジェンバンクで提供されるヌクレオチド配列、例えば、遺伝子ＩＤ（ＧｅｎｅＩＤ）番号：２７８１５２０、１００６８７４、９００１８１１、９４７２２８、３１６９２８０、２６５００１４、１１７５３０２、３９９３１２０、４３８０４８５、９０６６２５、３１６５１２６、９０５８０８、１４５４４６０、１４４５８８６、１４８５０９９、４２７４０１０、８８８５０６、３１６９５２６、９９７７４５、８９７８３６、または１１９３０１８によってコードされ、および／またはアミノ酸配列は、これらのポリヌクレオチドおよびによってコードされたアミノ酸に相同性（例えば、８０％を超える、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む９０〜９９％）を呈し、そのポリペプチドは、Ｃａｓ１ポリペプチドとして機能する。

Ｃａｓ６は、別のＣａｓポリペプチドであり、エンドリボヌクレアーゼ活性は、Ｃａｓ６エンドリボヌクレアーゼ活性として本明細書に参照される。好適なＣａｓ６ポリペプチドの非限定的な例が、ジェンバンク受入番号ＡＡＬ８１２５５に描写される。Ｃａｓ６ポリペプチドは、限定されないがパイロコッカスフリオサスのようなＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座を有する微生物から濃縮される、単離される、または精製され得るか、または組み換え技術を用いて産生され得るか、または通常方法を用いて化学的にまたは酵素的に合成され得る。いくつかの態様では、Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有しない微生物から濃縮される、単離される、または精製され得る。Ｃａｓ６ポリペプチドは、触媒に関与し得る少なくとも１つの残基、またはそれらの保存的置換を含有する。Ｃａｓ６ポリペプチドは、触媒に影響し得る他の残基、または保存的置換を含有し得る。触媒に関与すると予測される残基（複数可）は、タンパク質の３Ｄ構造のＣａｓ６署名モチーフを含有するＧリッチループ付近に位置し得る。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＴＩＧＲ０１８７７およびＰＦ０１８８１の受入番号でＴＩＧＲＦＡＭデータベースに存在するドメインを含み得る。ＴＩＧＲＦＡＭデータベースは、機能が保存されるポリペプチドのファミリーを含む（Ｈａｆｔｅｔａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：３７１−３７３、ＢａｔｅｍａｎａｎｄＨａｆｔ（２００２）ＢｒｉｅｆｉｎｇｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３：２３６−２４５、およびＨａｆｔｅｔａｌ．（２００５）ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌ．１（６）：ｅ６０）。

本明細書に提供されるＣａｓ６ポリペプチドの他の実施例は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびｃａｓ遺伝子座を有する原核微生物に存在するものを含む。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む全ての微生物で容易に識別することができる。Ｃａｓ６ポリペプチドをコードするコード領域は、典型的に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に近接して場所を特定されたｃａｓ遺伝子座にある。Ｈａｆｔｅｔａｌ．（２００５）ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌ．１（６）：ｅ６０）は、Ｃａｓタンパク質ファミリーについて概説し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の特異的サブタイプの識別のための規則を作製した。Ｈａｆｔらは、少なくとも４つの別個のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプ（Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）と会合して見出されるようなものとして、および典型的にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に最も遠位に場所を特定されたｃａｓコード領域として、Ｃａｓ６ポリペプチドをコードするコード領域を説明する。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＪＪＣＶＩ包括的微生物リソース（ＣＶＩＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＲｅｓｏｕｒｃｅ）で利用可能なリソースを用いて識別され得る。したがって、本明細書に記載される方法において有用であるＣａｓ６ポリペプチドは、通常の方法を用いる当業者によって識別されることができる。

Ｃａｓ６ポリペプチドをコードすると予測されるコード領域を含有する既知の全体のゲノム配列を有する原核微生物の例としては、サーモトガ・マリティマＭＳＢ８、カンピロバクター・フィタス亜種フィタス８２−４０、フソバクテリウム・ヌクレアタムＡＴＣＣ２５５８６、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、サーモアナエロバクターテングコンゲンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）ＭＢ４（Ｔ）、ムーレラ・サーモアセチカＡＴＣＣ３９０７３、デスルフィトバクテリウムハフニエンセ（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｆｎｉｅｎｓｅ）Ｙ５１、破傷風菌Ｅ８８、ウェルシュ菌ＳＭ１０１、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８、ボツリヌス菌ＨａｌｌＡＳａｎｇｅｒ、ボツリヌス菌ＦＬａｎｇｅｌａｎｄ、ボツリヌス菌Ｂ１Ｏｋｒａ菌種、ボツリヌス菌Ａ３ＬｏｃｈＭａｒｅｅ菌種、ボツリヌス菌ＡＨａｌｌ、ボツリヌス菌ＡＡＴＣＣ１９３９７、カルボキシドサーマスヒドロゲノフォーマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）Ｚ−２９０１、表皮ブドウ球菌ＲＰ６２Ａ、サーマス・サーモフィラスＨＢ８、サーマス・サーモフィラスＨＢ２７、Ｎｏｓｔｏｃ菌種ＰＣＣ７１２０、アナベナ・バリアビリスＡＴＣＣ２９４１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｃｕｓ菌種ＯＳＢ型プライム、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｃｕｓ菌種ＯＳＡ型、ジンジバリス菌Ｗ８３、バクテロイデス・フラジリスＹＣＨ４６、バクテロイデス・フラジリスＮＣＴＣ９３４３、超好熱性真正細菌ＶＦ５、ラブロバクターキシラノフィルス（Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ９９４１、結核菌Ｈ３７Ｒｖ（ｌａｂ菌種）、結核菌ＣＤＣ１５５１、マイコバクテリウム・ボビス亜種ボビスＡＦ２１２２／９７、フランキアアルニ（Ｆｒａｎｋｉａａｌｎｉ）ＡＣＮ１４ａ、サーモプラズマボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｖｏｌｃａｎｉｕｍ）ＧＳＳ１、ピクロフィルストリドゥス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓｔｏｒｒｉｄｕｓ）ＤＳＭ９７９０、熱球菌コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１、パイロコッカスホリコシイシンカジ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉｓｈｉｎｋａｊ）ＯＴ３、パイロコッカスフリオサスＤＳＭ３６３８、パイロコッカス・アビシＧＥ５、メタノサルシナバルケリフサロ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒｉｆｕｓａｒｏ）、メタノサルシナ・アセチボランスＣ２Ａ、メタノココイデスブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓｂｕｒｔｏｎｉｉ）ＤＳＭ６２４２、メタノコッカスジャンナスチイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＳＭ２６６１、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ｄｅｌｔａＨ、ハロアーキュラ・マリスモルツイＡＴＣＣ４３０４９、アーケオグロブス・フルギダスＤＳＭ４３０４、ピロバキュラムアエロフィルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）１Ｍ２、スルホロブストコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｔｏｋｏｄａｉｉ）７菌種、スルホロブス・ソルファタリカスＰ２、スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９、アエロパイラム・ペルニクスＫ１が挙げられる。Ｃａｓ６ポリペプチドの他の例は、当業者には既知であり、例えば、ポリペプチドのＣＯＧ１５８３族のメンバー（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネットサイトを通じてタンパク質のオルソロガス族のクラスター（ＣＯＧ）ウェブページで利用可能、Ｔａｔｕｓｏｖｅｔａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８：６３１−６３７およびＴａｔｕｓｏｖｅｔａｌ．（２００３）ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ４（１）：４１も参照）、受入番号ＩＰＲＯ１０１５６を有するＩｎｔｅｒＰｒｏファミリーのメンバー、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．（２００２）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０：４８２−４９６およびＨａｆｔｅｔａｌ．（２００５）ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１（６）：ｅ６０，４７４−４８３）を参照のこと。

全てがＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を組み込むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の３つの型が存在する。Ｉ型およびＩＩＩ型の両方は、ｃｒＲＮＡに完全にプロセスされると、ｃｒＲＮＡに相補的である拡散を切断することが可能な複数のＣａｓタンパク質複合体を構築する、プレｃｒＲＮＡをプロセスするＣａｓエンドヌクレアーゼを有する。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡの反復配列に相補的であるトランス活性化するＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が、Ｃａｓ９タンパク質の存在において二本鎖特異的ＲＮａｓｅＩＩＩによるプロセシングをトリガーする異なる機構を用いて産生される。Ｃａｓ９は、次いで、成熟ｃｒＲＮＡに相補的である標的ＤＮＡを切断できるが、Ｃａｓ９による切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成、およびＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）配列と称されるｃｒＲＮＡの短いモチーフの存在の両方に依存する（Ｑｉｅｔａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５２：１１７３を参照のこと）。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡは、それがｃｒＲＮＡと共にその３’末端で塩基対形成する際にまた存在しなければならず、そしてこの会合がＣａｓ９活性をトリガーする。

Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有し、一方のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼに類似しており、他方は、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインに似ている。一方で、ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的であるＤＮＡ鎖を切断することを担うようであり、一方Ｒｕｖドメインが非相補的鎖を切断する。

ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要条件は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一のガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６およびＣｏｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照のこと）。Ｓ．ピロジーン（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）では、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に形を成すと、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合、またはｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９をガイドする。Ｃａｓ９タンパク質とＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡとを含む本系は、ＲＮＡがガイドしたゲノム編集に使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、同上を参照）、およびＺＦＮおよびＴＡＬＥＮに類似の編集効率を伴うｉｎｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集（Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１（３）：２２７を参照）に有用である。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に生じるＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。未変性配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、未変性配列ポリペプチドと共通した質的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それらが対応する未変性配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有するという条件で、限定されないが、未変性配列の断片と未変性配列ポリペプチドの誘導体およびその断片とを含む。本明細書において企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチド、共有結合修飾の両方のアミノ酸配列バリアントおよびそれらの融合物を包含する。

「Ｃａｓポリペプチド」は、完全長のＣａｓポリペプチド、Ｃａｓポリペプチドの酵素的に活性な断片、およびＣａｓポリペプチドまたはそれらの断片の酵素的に活性な誘導体を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはそれらの断片の好適な誘導体は、変異体，融合、Ｃａｓタンパク質またはそれらの断片の共有結合修飾を含むが、これらに限定されない。

Ｃａｓタンパク質およびＣａｓポリペプチドは、細胞からまたは化学的に合成されるか、またはこれら２つの手順の組み合わせによって獲得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であり得るか、または、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であり、遺伝子操作されてより高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するかまたは外因性的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生し、その核酸は、内因性Ｃａｓと同じかまたは異なるＣａｓをコードする。いくつかの場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、遺伝子操作されてＣａｓタンパク質を産生する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して遺伝子発現を阻害することもできる。Ｌｅｉｅｔａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５２（５）：１１７３−１１８３）は、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている触媒的に死んでいるＣａｓ９が、ガイドＲＮＡと同時発現したとき、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合、または転写因子結合に特異的に干渉することができるＤＮＡ認識複合体を生成することを示している。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と呼ばれるこの系は、標的とされた遺伝子の発現を効率的に抑圧することができる。

加えて、切断ドメインに突然変異を含みそれらがＤＳＢを導入することができなくし、代わりに標的ＤＮＡにニックを導入するＣａｓタンパク質が開発されている（「Ｃａｓ９ｎｉｃｋｉｎｇｅｎｚｙｍｅ」、Ｃｏｎｇｅｔａｌ．、同上を参照のこと）。

本発明のＣａｓタンパク質を突然変異させて機能性を改変し得る。ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＡ成分
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード成分、すなわちｔｒａｃｒＲＮＡおよび同一の直列反復配列（ＤＲ）によって間を置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するプレｃｒＲＮＡアレイ、を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム操作を達成するためには、両方のこれらＲＮＡの機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇｅｔａｌ，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ１２３１１４３を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を介してまたは別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、そこでは（標的特異性を与える）操作された成熟ｃｒＲＮＡが、（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合されてキメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも名付けられる）が作製される。（Ｊｉｎｅｋ、同上、およびＣｏｎｇ、同上を参照のこと）。
キメラまたはｓｇＲＮＡを操作して任意の所望の標的に相補的な配列を含むことができる。ＲＮＡは、標的への相補性およびＧ［ｎ１９］形態の２２の塩基を含み、後にＮＧＧ形態のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が続く。したがって、１つの方法では、ｓｇＲＮＡは、（ｉ）（ヒト、マウス、または特定の植物種の）関連ゲノムの参照配列を有するＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を整列させること、（ｉｉ）ＺＦＮ半部位間のスペーサー領を特定すること、（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの場所を特定すること（２つ以上のそのようなモチーフがスペーサーと重複するとき、スペーサーに対して中央に位置しているモチーフが選択される）、（ｉｖ）そのモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することによる、対象とする遺伝子の既知のＺＦＮ標的の利用によって設計されることができる。この方法は、有利に、判明したヌクレアーゼ標的に依存する。代替として、ｓｇＲＮＡは、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に従う好適な標的配列を識別することだけによって任意の関心領域を標的とするように設計することができる。

標的部位
上に詳細に記載したように、ＤＮＡ結合ドメインは、遺伝子座、例えば、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子等における任意の選択された配列に結合するように遺伝子操作することができる。遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有することができる。遺伝子操作の方法は、限定されないが、合理的設計および種々の種類の選択を含む。合理的設計は、例えば、３つ組（または４つ組）のヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各３つ組または４つ組のヌクレオチド配列は、特定の３つ組または４つ組の配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、本出願人が所有する米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計が行われてもよい。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用される例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。

標的部位の選択、ヌクレアーゼ、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築は、当業者に既知であり、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）に詳述されている。

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照のこと。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーのいずれの組み合わせを含んでもよい。米国特許公開第２０１１０２８７５１２号も参照のこと。

ドナー
上述のように、例えば、変異体遺伝子の訂正ための、または野生型遺伝子の増大した発現のための外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも称される）の挿入である。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことは容易に認識されるであろう。ドナー配列は、対象とする位置で効率的なＨＤＲを可能にするように、２つの相同性領域によって隣接される非相同配列を含有することができる。さらに、ドナー配列は、細胞染色体内の関心領域と非相同な配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞染色体に対するいくつかの不連続な相同性領域を含有することができる。例えば、通常は関心領域内に存在しない配列の標的挿入の場合、当該配列は、ドナー核酸分子中に存在することができ、関心領域内の配列に対する相同性領域によって隣接されてもよい。

選択された場所へ挿入するための任意のポリヌクレオチドの標的とされた挿入の方法が、本明細書に記載される。挿入のためのポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチド、または分子または「導入遺伝子」とも称することができる。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状または環状形態で細胞に導入され得る。米国特許公開第２０１０００４７８０５号、同第２０１１０２８１３６１号、同第２０１１０２０７２２１号、および米国特許出願第１３／８８９，１６２号を参照のこと。ドナー配列（複数可）は、環状または線状形態で細胞内に導入され得る、ＤＮＡＭＣ内に含有されることができる。線状形態で導入される場合、当業者に既知の方法によってドナー配列の末端を（例えば、エキソヌクレアーゼの分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の３’末端に加えられる、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓｅｔａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：８８６−８８９を参照のこと。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の付加、および修飾されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含む。

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子等のさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマー等の薬剤と複合化された核酸として導入されてもよいか、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達されてもよい。

ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーは、例えば、２〜２００ｋｂ、２〜１０ｋｂ（またはそれらの間の任意の値）等の、１ｋｂの長さより大きい配列（例えば、コード配列、導入遺伝子とも称される）配列を含む。二本鎖ドナーは、例えば、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位も含む。ある特定の実施形態では、ドナーは、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓと共に使用するために少なくとも１つの標的部位、または例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの対のために２つの標的部位を含む。典型的に、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の切断のために、例えば導入遺伝子配列に対して５’および／または３’、導入遺伝子配列の外側である。ヌクレアーゼ切断部位（複数可）は、どのようなヌクレアーゼ（複数可）であってもよい。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、切断されたドナーが相同性非依存的方法を介して組み込まれる内因性標的を切断するように使用された同一のヌクレアーゼ（複数可）のためである。

ドナーは、一般的に、挿入され、それによって、その発現は、組み込み部位で内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を操縦するプロモーター（例えば、グロビン、ＡＡＶＳ１等）によって操縦される。しかしながら、ドナーが、プロモーターおよび／あるいはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導的もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことは明白であろう。

内因性遺伝子の全て、いくつかが発現されるように、またはいずれも発現されないように、ドナー分子は、いずれの内因性遺伝子に挿入されてもよい。例えば、本明細書に記載されるような導入遺伝子は、例えば導入遺伝子との融合物として、内因性グロビン配列のうちのいくつかが発現されるように、またはいずれも発現されないように、グロビン遺伝子座内に挿入されてもよい。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、グロビンをコードする配列の有無にかかわらず）は、例えば、セーフハーバー遺伝子座等の任意の内因性遺伝子座に組み込まれる。例えば、米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、および同第２０１０００２１８２６４号を参照のこと。

さらなるもの（例えば、グロビン配列、内因性または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子と共に発現されると、さらなる（例えば、グロビン）配列は、完全長配列（野生型または変異体）または部分配列であってもよい。好ましくは、さらなる配列は、機能的である。例えばグロビンをコードする配列等の、これらの完全長配列またはさらなる部分配列の機能の非限定的な例として、導入遺伝子（例えば、治療的遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清半減期を増大させることおよび／または担体として作用することが挙げられる。

さらに、発現のために必要ではないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含んでもよい。

本明細書に記載されるドナー配列上に担持された導入遺伝子は、ＰＣＲのような当該分野では既知の標準技術を用いて、プラスミド、細胞または他の供給源から単離することができる。使用のためのドナーは、環形の超らせんを形成した、環形のほどけた、線形等を含むトポロジーの異なる型を含むことができる。代替として、それらは、標準オリゴヌクレオチド合成技術を用いて化学的に合成されてもよい。さらに、ドナーは、メチル化されてもよいか、またはメチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌人工染色体またはイースト人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であってもよい。

本明細書に記載される二本鎖ドナーポリヌクレオチドは、１つ以上の非天然の塩基および／またはバックボーンを含み得る。具体的には、メチル化されたシトシンを伴うドナー分子の挿入を、本明細書に記載される方法を用いて実行して、関心領域の転写静止の状態を達成し得る。

外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、対象とする任意の配列（外因性配列）を含み得る。例示的な外因性配列は、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、および発現構築物の様々な型を含むが、これらに限定されない。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性を媒介する、配列をコードするタンパク質（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）、配列をコードする有色または蛍光または発光のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化された緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を含むが、これらに限定されない。エピトープ標識は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。

好ましい実施形態では、外因性配列（導入遺伝子）は、これらに限定されないが、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または細胞核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、成長因子、および上のいずれかのうちの機能的断片を含む、細胞の発現が所望の、ポリヌクレオチドをコードする任意のポリペプチドを含む。コード配列は、例えばｃＤＮＡであってもよい。

ある特定の実施形態では、外因性配列は、標的とされた組み込みを経た細胞の選択を可能にする（上述の）マーカー遺伝子、およびさらなる機能性をコードする連結された配列を含むことができる。マーカー遺伝子の非限定的な例として、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）等が挙げられる。

挿入されることができるさらなる遺伝子配列は、例えば、突然変異された配列を置換する野生型遺伝子を含み得る。例えば、野生型ベータグロビン遺伝子配列は、遺伝子の内因性コピーが突然変異される幹細胞のゲノム内に挿入され得る。野生型コピーは、内因性遺伝子座で挿入されてもよいか、または代替えとして、セーフハーバー遺伝子座に対しての標的とされてもよい。

そのような発現カセットの構築は、本明細書の教示に従い、分子生物学の分野でよく知られる手法を活用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと）。遺伝子導入動物を生成する発現カセットの使用の前に、選択された制御要素と関連されるストレス誘導因子への発現カセットの応答性は、発現カセットを好適な株細胞（例えば、初代細胞、形質転換された細胞、または不死化細胞株）に導入することによって試験することができる。

さらに、発現に必要とされないが、外因性配列はまた、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列等の転写または翻訳調節配列を含んでもよい。さらに、対象とする遺伝子の制御要素をレポーター遺伝子に作動可能に連結して、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作製することができる。

非コード核酸配列の標的とされた挿入がまた、達成されてもよい。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列がまた、標的とされた挿入のために使用されてもよい。

さらなる実施形態では、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼ設計のための特異的標的部位である非コード配列を含み得る。その後に、さらなるヌクレアーゼが、細胞で発現されて、それによって、本来のドナー分子が、対象とする別のドナー分子の挿入によって切断され修飾され得る。この方法で、ドナー分子の反復組み込みが生成され、対象とする特定の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座での形質スタッキングを可能にし得る。

送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、および本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで送達され得る。

本明細書に記載されるようなヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号（これらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

また、本明細書に記載されるようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質（複数可）のうちの１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達されてもよい。限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含む、任意のベクター系が使用されてもよい。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）も参照のこと。さらに、これらのベクターのいずれも、治療に必要な配列のうちの１つ以上を含み得ることは明白であろう。したがって、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクター上または異なるベクター上に担持されてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／もしくはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームのゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５−４６０（１９９２）；ＶａｎＢｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，ＲｅｓｔｏｒａｔｉｖｅＮｅｕｒｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａｅｔａｌ．，ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＤｏｅｒｆｌｅｒａｎｄＢoｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）；およびＹｕｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：１３−２６（１９９４）を参照のこと。

核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、デンドリマー、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用することができる。

さらなる例示的な核酸送達系は、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ），ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ，（例えばＵＳ６００８３３６を参照）によって提供されるものを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適な陽イオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号を含む。

免疫脂質複合体等の標的リポソームを含む脂質、すなわち核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。

さらなる送達の方法は、送達されるべき核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージする使用法を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達される：抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、標的細胞表面にＥＤＶを運び、次いで、エンドサイトーシスによりＥＤＶが細胞内に取り込まれる。一旦、細胞内に取り込まれると、その内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄｅｔａｌ（２００９）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７（７）：６４３を参照のこと）。

遺伝子操作されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、核にウイルス負荷量を輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、対象に直接投与することができるか（ｉｎｖｉｖｏ）、またはｉｎｖｉｔｒｏで細胞を処理するために使用することができ、修飾細胞が対象に投与される（ｅｘｖｉｖｏ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスに基づく系は、限定されないが、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターを含む。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子送達方法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。

レトロウイルスの指向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するかまたは感染させることができる、典型的には高いウイルス力価を生じるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外因性配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次いで、それらは、恒久的な導入遺伝子の発現を提供するように治療遺伝子を標的細胞に組み込むために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づく系が使用されてもよい。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に生成することができる。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸およびペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏの遺伝子治療手段のために、標的核酸を用いて細胞に形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組み換え型ＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。

現在のところ、少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床試験における遺伝子導入に利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの補完に関与するアプローチを用いる。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９４：２２１２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクターには５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ｅｌｌｅｍｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく、有望な代替の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達が、このベクター系の重要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３５１：９１１７１７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０、およびこれらの全てのバリアントを含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。

複製欠損型組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成することができ、多くの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように遺伝子操作され、その後、複製欠損型ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅される。Ａｄベクターは、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるもの等の非分裂の分化細胞含む複数の種類の組織をｉｎｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２４：１５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：７１０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成する。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージする生産細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列（必要に応じて）を含有し、他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠落したウイルス機能は、パッケージングする細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組み込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、相当な量ではパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスのほうがより感受性の高い熱処理によって減少させることができる。

多くの遺伝子治療の用途において、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型に対する高度の特異性をもって送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、対象とする細胞型上に存在することが分かっている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、その組み換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつ、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞対にまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいかなる選択された細胞受容体にも特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように遺伝子操作することができる。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用されてもよい。そのようなベクターを遺伝子操作して、特異的標的細胞による取り込みを好む特異的取り込み配列を含有することができる。

遺伝子治療ベクターは、後述するように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の対象への投与によってｉｎｖｉｖｏで送達することができる。代替として、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または普遍的なドナーの造血幹細胞／前駆細胞等にｅｘｖｉｖｏで送達することもでき、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。

ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、ｉｎｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替として、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含む、通常、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために用いられる経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために１つより多くの経路が用いられてもよいが、特定の経路は、別の経路より即時的かつより効果的な反応を提供できる場合が多い。

本明細書に記載されるポリヌクレオチドの導入に好適なベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙｅｔａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉｅｔａｌ．（２０００）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ２５：２１７−２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照のこと。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、また、組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。したがって、後述するように、多種多様な好適な医薬組成物の製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈｅｄ．，１９８９を参照のこと）。

ヌクレアーゼをコードする配列およびドナー構築物は、同じかまたは異なる系を使用して送達できることは明白であろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドによって担持されてもよく、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって担持されてもよい。さらに、同じかまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって異なるベクターが投与されてもよい。ベクターは、同時にまたは任意の連続的順序で送達されてもよい。

したがって、この開示は、例えばヌクレアーゼが媒介するグロビンタンパク質をコードする遺伝子の組み込みを介する異常ヘモグロビン症の治療等の、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に受け入れられる疾患および状態のｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏ治療を含む。組成物は、血清または標的臓器または細胞の治療的ポリペプチドの所望の濃度を獲得するのに効率的な量でヒト患者に投与される。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によって行うことができる。例えば、ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏの両方法が、熟考される。門脈への静脈注射は、投与の好ましい方法である。他のｉｎｖｉｖｏ投与モードは、例えば、肝臓または胆管の葉内への直接注射および肝動脈を通すことを含む肝臓へ遠位の静脈注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介する注射、および／または胆樹を通した逆行性注射を含む。Ｅｘｖｉｖｏ投与モードは、切除された肝細胞または肝臓の他の細胞のｉｎｖｉｔｒｏの形質導入を含み、後にヒト患者の門脈管構造、肝実質、または胆樹に形質導入され切除された肝細胞を注入し戻すことが続くが、例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎｅｔａｌ．，（１９９４）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，６：３３５−３４１を参照のこと。

投与されるヌクレアーゼ（複数可）およびドナーの効率的な量は、患者によっておよび対象とする治療的ポリペプチドに従って様々である。したがって、効率的な量は、組成物を投与している医師によって最良に決定され、適切な投与量は、当該分野の当業者によって容易に決定され得る。組み込みおよび発現のために十分な期間（例えば、典型的に４〜１５日）経過した後、治療的ポリペプチドの血清または他の組織レベルの分析および投与前の初期レベルとの比較が、投与される量が低すぎるか、正しい範囲内か、または高すぎないかを決定する。初期および後続の投与のための好適な計画はまた、様々であるが、必要な場合には後続の投与が続く初期投与によって典型的に表される。後続の投与は、日単位から年単位で数年ごとに及ぶ様々な間隔で投与されてもよい。当該分野の当業者は、適切な免疫抑制技術が、送達ベクターの免疫抑制によって形質導入の阻害および封鎖を回避することが推奨され得ることを理解するが、例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎｅｔａｌ．，（１９９５）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：１３９１−１４０１を参照のこと。

ｅｘｖｉｖｏ投与およびｉｎｖｉｖｏ投与の両方のための製剤は、液体中の懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、薬学的に許容され、かつ有効成分と適合性のある賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせを含む。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等の、少量の補助物質を含有してもよい。

適用
本明細書に開示される方法および組成物は、鎌状赤血球症またはサラセミアのような遺伝子疾患で発現されたタンパク質の発現を修飾する、またはタンパク質をコードする異常遺伝子配列を修正するためである。したがって、方法および組成物は、そのような遺伝子疾患の治療および／または予防を提供する。例えば幹細胞のゲノム編集を使用して、異常遺伝子を修正する、野生型遺伝子を挿入する、または内因性遺伝子の発現を変更する。非限定的な例として、例えば少なくとも１つのグロビン（例えば、αおよび／またはβグロビン）をコードする野生型遺伝子は、細胞で欠いているおよび／または欠けているグロビンタンパク質を提供するために細胞に挿入され得、それによって、異常のあるグロビン発現によって生じる例えば異常ヘモグロビン症等の遺伝子疾患を治療し得る。代替としてまたは加えて、適切なドナーの投与の有無にかかわらないゲノム編集は、例えば、α−またはβ−ヘモグロビンの点突然変異を修正すること等の異常のある内因性遺伝子を修正することができ、遺伝子の発現を回復するおよび／または例えば鎌状赤血球症等の遺伝子疾患を治療する、および／または任意の直接または間接グロビン調節遺伝子（例えばγグロビン調節遺伝子ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ制御因子ＫＬＦ１の不活性化）のノックアウトまたは変化（過剰発現または抑制）することができる。

本発明の方法および組成物は、１つ以上の治療薬をコードする導入遺伝子を供給するように所望される任意の状況においても使用して、それによって治療薬（複数可）が、ＲＢＣおよび／または治療薬を含有するこれらの細胞に由来する成熟ＲＢＣのような造血性幹細胞で産生できる。

以下の実施例は、ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは例示目的のために過ぎず、例えば、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または、天然に存在するかもしくは遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと、異種の切断ドメインおよび／もしくは操作された単一のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系との融合物等の他のヌクレアーゼが使用されてもよいことを理解されたい。

実施例１：ジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計、構築、および一般的な特徴付け
本質的にＵｒｎｏｖｅｔａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５（７０４２）：６４６−６５１，Ｐｅｒｅｚｅｔａｌ（２００８）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２６（７）：８０８−８１６に説明されるように、および米国特許第６，５３４，２６１号に説明されるように、ジンクフィンガータンパク質を設計し、プラスミド、ＡＡＶ、またはアデノウイルスベクターに組み込んだ。ヒトベータグロビン遺伝子座およびヒトＨＰＲＴ遺伝子座に特異的なＺＦＮおよびＴＡＬＥＮに対しては、本出願人が所有する米国特許第７，８８８，１２１号、および米国特許公開第２０１３０１３７１０４号および同第２０１３０１２２５９１号を参照のこと。ヒトＡＡＶＳ１に特異的なヌクレアーゼに対しては、本出願人が所有する米国特許第８，１１０，３７９号を参照のこと。ＣＣＲ５に特異的なヌクレアーゼに対しては、本出願人が所有する米国特許第７，９５１，９２５号を参照のこと。アルブミンに特異的なヌクレアーゼに対しては、米国特許公開第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３９１７７９６８号を参照のこと。

実施例２：グロビン特異的ＺＦＮの活性
ヒトグロビン遺伝子座を標的とするＺＦＮ対またはベータの様なグロビン遺伝子発現の制御因子を使用して、特的標的部位でＤＳＢを誘導するこれらのＺＦＮの能力を試験した。示されたＺＦＮの各フィンガーの認識へリックス領域のアミノ酸配列を、標的部位全体と共に表１Ａに以下に示す（ＤＮＡ標的部位を大文字で示し、非接触のヌクレオチドを小文字で示した）。

Ｐｅｒｅｚｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８０８−８１６およびＧｕｓｃｈｉｎｅｔａｌ．（２０１０）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．６４９：２４７−５６）に説明されるようなＣｅｌ−Ｉアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を使用して、Ｋ５６２またはＨＳＣの標的遺伝子のＺＦＮ誘導修飾を検出した。このアッセイでは、標的部位のＰＣＲ増幅に続いて、ＤＳＢ頻度の下限推定値を提供したミスマッチ検出酵素Ｃｅｌ−Ｉ（Ｙａｎｇｅｔａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９：３５３３−３５４１）を用いて挿入および欠失（インデル）の定量が行われた。標準条件（３７℃）かまたは低温ショック（３０℃、本出願人が所有する米国特許公開第２０１１００４１１９５号を参照）を用いるかのいずれかでＺＦＮ発現ベクターの遺伝子導入に続いて３日後に、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡをＫ５６２細胞から単離した。

Ｃｅｌ−Ｉアッセイからの結果は、ＺＦＮが、それらのそれぞれの標的部位で切断を誘導することが可能であることを呈した（本出願人が所有する米国仮特許出願第６１／５５６，６９１号も参照のこと）。結果を図１に示すが、結果は、活性タンパク質がベータグロビン遺伝子の標的遺伝子座の大部分に見出されたことを示す。

実施例３：ベータグロビン遺伝子座の編集
ヒトベータグロビン遺伝子（ＨＢＢ）特異的ＺＦＮ（表１）を使用して、以下の通りに、ドナーＤＮＡをベータグロビン遺伝子座に導入した。ベータグロビン遺伝子においてＺＦＮ切断部位を囲む領域に相同（ホモロジーアーム）であった配列が、ＨＢＢ遺伝子配列をコードする配列に隣接するように、ドナーＤＮＡを設計した。ホモロジーアームは、約５００〜６００塩基対長である。ＨＢＢドナー配列は、いかなる非コード配列をも欠くことにより、ベータグロビン標的部位に挿入されると、ベータグロビンプロモーターおよび任意の他のベータグロビン調節配列によってドナーの発現を調節する。挿入されると、ＨＢＢドナーをインフレームに内因性グロビン配列と融合し、融合タンパク質をもたらす。さらに、ＨＢＢドナーオリゴを、ＺＦＮ治療に続く切断されたＨＢＢ遺伝子中へ捕獲するために設計した。オリゴは、制限部位を含有し、それによってオリゴの挿入に続いて、新規制限部位を、引き続いて切断できたＨＢＢ遺伝子に導入した。

図２Ａに示されるように、ドナーＤＮＡ上に存在する新規制限部位の存在によって検証されると、βグロビンオリゴドナーを真の遺伝子座に挿入した。さらに、図２Ｂに示されるように、Ｃｅｌ−Ｉ分析は、オリゴがレーン８の試料においてのみ存在したが、ＺＦＮ対のうちのいくつかがＤＮＡを切断できたことを示す。

遺伝子導入ＣＤ３４＋細胞を成熟ＲＢＣに分化するために、当該分野で既知の方法を使用する。例えば、製造者の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＣＤ３４^＋ミクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、ＳＣＤＣＤ３４^＋細胞を精製する。成長因子の存在においてＢＩＴ９５０００（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＩｓｃｏｖｅのＭＤＭにおいてＣＤ３４^＋細胞を培養する。２相液体培養モデルを用いて赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）系列に向けて細胞を分化する。最初の６日（第１の相）の間に、ＣＤ３４^＋細胞をＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を使用して伸長する。伸長細胞を次いで、Ｅｐｏ（２Ｕ／ｍｌ）およびＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を使用して関連付けて赤血球系列（第２の相）に向けて分化する。Ｇｉａｒｒａｔａｎａｅｔａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ１１８（１９）：５０７１−９を参照のこと。

実施例４：ベータグロビンの突然変異の遺伝子修正
鎌状ベータグロビン遺伝子のヒト鎌状細胞突然変異を修正するために、ベータ−グロビン遺伝子座においてＺＦＮを使用して二本鎖切断を産生し、鋳型（「ドナーオリゴ」）として外因性修正的オリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ修復が続いた。ヌクレアーゼが修正されたグロビン遺伝子（ドナーオリゴが内因性ＨＢＢ遺伝子の鎌状突然変異の修正を示したもの）を切断する可能性を回避するために、ドナーオリゴを設計してサイレント突然変異をＨＢＢコード配列に翻訳的に共導入し、それによって修正された対立遺伝子がＺＦＮ標的配列のうちの１つを欠いた。このようにして、所望の遺伝子修正された対立遺伝子の頻度における増大を観察されることとなった。至適オリゴヌクレオチドドナーを設計するために、ＺＦＮ標的配列のいくつかの突然変異ならびにホモロジーアームの長さを精査した。

以下に、鎌状突然変異を囲む配列を示し、様々な突然変異を数値で示す。したがって、突然変異１＝ＧからＡへの変化、突然変異２＝ＧからＡ、突然変異３＝ＴＣＴからＡＧＣ、突然変異４＝ＣからＴ、および突然変異５＝ＴからＧである。突然変異の様々な組み合わせを含んだオリゴヌクレオチドを生成した。野生型配列（「ｗｔ」）を上位（配列番号２３１）に示し、突然変異を伴う配列（「ｍｕｔ」）を、下位（配列番号２３２）に示す。

ヌクレアーゼ（「標的」）のための標的部位を太線で示し、鎌状突然変異の部位をボックスに入れる。突然変異に従ってオリゴヌクレオチドをラベル付けし、したがって、例えば、オリゴヌクレオチドＳＭＳ１は、存在するサイレント突然変異部位１のみを有するが、一方ＳＭＳ１２４は存在するサイレント突然変異部位１、２、および４を有する。

種々のオリゴを、「センス」もしくは順方向鎖（「Ｆ」と示される）または「アンチセンス」もしくは逆方向鎖（「Ｒ」と示される）のいずれかとして単一鎖分子としてＣＤ３４＋細胞に送達した。オリゴを、ヌクレアーゼの有無のいずれかでＢＴＸＥＣＭ８３０ＳｑｕａｒｅＷａｖｅデバイスを使用した遺伝子導入を介して送達した。別様に示されない限り、３μｇのヌクレアーゼを送達した。遺伝子編集を、ＨＢＢ遺伝子のＰＣＲアンプリコンの高処理ＤＮＡ配列によって測定した。非相同末端結合による遺伝子修飾パーセント（ＺＦＮ誘導切断に続くＤＮＡの二本鎖切断の治癒によって生じる「ＮＨＥＪ」）またはＺＦＮ切断（「遺伝子修正」）に続くオリゴの標的とされた組み込みを示す（図９を参照）。結果は、突然変異のいくつかの組み合わせが細胞の遺伝子修正を強化できたことを示し、それによって、細胞のうちの最大２０％が鎌状遺伝子座で遺伝子修正を表示した。

遺伝子修正の百分率においてホモロジーアーム長の効果を精査するために、ＳＭＳ１２オリゴおよびＳＭＳ１２４オリゴを、鎌状突然変異部位のいずれかの側上で４１および４６ヌクレオチド（８８ｂｐドナーオリゴ）または５０および５０ヌクレオチドの相同性（１０１ｂｐドナーオリゴ）のいずれかで使用した。結果（図１０を参照）は、より長いホモロジーアームの方が、オリゴによって特定された変化を組み込む対立遺伝子の最大４０％を使用して遺伝子修正を行う際にさらに効果的であったことを示した。使用したオリゴを以下に示す。

ＣＤ３４＋細胞分化中に遺伝子修正の分化能力および長寿命を精査するために、ＺＦＮが修飾したＣＤ３４＋細胞のプールを誘導し、製造者の説明書に従って、ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｅｔｈｏｃｕｌｔメチルセルロース媒体を用いて分化した。分化を、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ誘導の分化、すなわちコロニー形成単位である赤血球（「ＣＦＵ−Ｅ」）、バースト形成単位である赤血球（「ＢＦＵ−Ｅ」）、コロニー形成単位である顆粒球／マクロファージ（「ＣＦＵ−ＧＭ」）、およびコロニー形成単位である顆粒球／赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）／単球／マクロファージ（「ＣＦＵ−ＧＥＭＭ」）、から起こるアッセイオフコロニー型によって分析した。結果は、ＺＦＮ処理された細胞が、偽遺伝子導入された細胞として分化する同じ能力を保有することを示した。個々のＢＦＵ−Ｅコロニーをプレートから選び、ＨＢＢで遺伝子型を特定した。結果は、ＺＦＮ誘導修飾がコロニー分化中に維持されたことを示した（図１１を参照）。さらに、修飾されたＢＦＵ−Ｅコロニーの頻度は、開始プールの修飾された対立遺伝子の頻度に類似し、ＢＦＵ−Ｅ形成中に編集された細胞に対してバイアスが存在しないことを呈した。加えて、全体としての細胞集団を、ｉｎｖｉｔｒｏ赤血球分化の液体培養の経過にわたって遺伝子修飾のために評価した。修飾は、少なくとも１８日の赤血球分化プロセスの間ずっと安定していた（図１２を参照）。

ベータ−サラセミアに関連するベータグロビン遺伝子の別の共有の突然変異は、ＩＶＳ１．１として既知である。このＧ−＞Ａ突然変異は、ベータグロビン遺伝子のイントロン１の第１の塩基対内に位置し、遺伝子におけるその存在は、ベータグロビンプレ−ｍＲＮＡの異常のあるスライシングをもたらす。したがって、ＺＦＮの対を操作して領域を認識し切断し、本質的に、モデル目的のためにこの突然変異を繰り返した。これらのＺＦＮを試験することは、ＺＦＮがベータグロビン遺伝子の部位を切断でき、ＣＤ３４＋細胞において５２．６３％のＮＨＥＪをもたらすことを見出した。

実施例５：セーフハーバー遺伝子座へのベータ−グロビンドナーの挿入
セーフハーバー遺伝子座に野生型ベータ−グロビン遺伝子を挿入することにより、導入遺伝子からの発現がＨＳＣのベータグロビン欠損を修正し、そのセーフハーバー遺伝子座に特異的なヌクレアーゼをドナー核酸と共に細胞に導入する。ＨＰＲＴに特異的なヌクレアーゼ（本出願人が所有する米国特許公開第２０１３０１３７１０４号および同第２０１３０１２２５９１号を参照）、ＡＡＶＳ１（米国特許第８，１１０，３７９号を参照）、ＣＣＲ５（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）またはベータ−グロビン（表１Ａを参照）を、ＣＤ３４＋幹細胞由来の患者に導入する。導入は、ｍＲＮＡ電気穿孔法のような当該分野では既知の任意の方法を通じて行うことができる。ドナーＤＮＡを、導入遺伝子、野生型ベータ−グロビン、およびＨＤＲ（典型的に、各側上に５００ｂｐ）を可能にするセーフハーバー標的を囲む領域を有する十分な相同性で導入遺伝子に隣接する相同性の領域を含有するように設計する。代替として、ドナー構築物が相同性の領域を欠くかまたは含有するかどうかで、末端捕獲を介してＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ標的とされた遺伝子座に組み込まれるドナー構築物を提供する（米国特許出願第１３／８８９，１６２号を参照）。ＺＦＮの導入の前、導入の間、または導入の後のいずれかで、ドナーをＣＤ３４＋細胞に共導入する。修飾されたＣＤ３４＋細胞を患者に再導入して移植後、十分なレベルでベータヘモグロビンを産生し、治療的に関連する量のヘモグロビンを産生することを可能にする。

実施例６：ＢＣＬ１１ＡおよびＫＬＦ１の不活性化
ＢＣＬ１１ＡおよびＫＬＦ１に特異的なヌクレアーゼを、（例えば、表１Ａに示されるようなＺＦＮ）上述のようにＨＳＣに導入してガンマグロビン発現（図３を参照）の上流調節を生じさせ、細胞のゲノムを、上述のようにＣｅｌ１アッセイによって分析した（Ｐｅｒｅｚｅｔａｌ（２００８）、同上）。

図４に示されるように、示されたＫＬＦ１特異的ＺＦＮを使用するＨＳＣの処理に続いて、ＺＦＮは、成功裡にＫＬＦ１遺伝子座を修飾した（図４Ｃおよび４Ｄ）。同様に、ＢＣＬ１１Ａ特異的ＺＦＮは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座を修飾した（図４Ａ）。ＨＰＲＴ遺伝子座を標的とするＺＦＮの対（本出願人が所有する米国仮特許出願第６１／５５２，３０９号を参照）を制御として使用して成功した切断も呈した（図４Ｂ）。ＣＤ３４＋細胞形質導入後３日目のシグナルと分化培養の１７日目（図４Ｅ）とを比較すると、遺伝子編集の百分率（％ＮＨＥＪ）時間経過しても安定していることを呈した。図４Ｅに示される各ゲルでは、識別のないレーンは、負の対照である。

ＢＣＬ１１Ａエクソン２またはエクソン４のいずれかを標的としている、ＺＦＮのさらなる対を、同様に試験した。これらの研究のため、候補ＺＦＮ対を、前述のようにＡｍａｘａによってＫ５６２細胞に導入した、またはＣＤ３４＋細胞に導入した。ＣＤ３４＋形質導入のため、２ｍｍの間隙キュベットを有するＢＴＸＥＣＭ８３デバイスを使用した。ｍＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅＴ７ＵｌｔｒａＫｉｔ（＃ＡＭ１３４５，Ａｍｂｉｏｎ）を用いて細胞からｍＲＮＡを調製した。ヒトＣＤ３４＋細胞を、非組織処理されたプレートにおいて１ｘＣＣ１１０（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を有するｘ−ｖｉｖｏ１０媒体（Ｌｏｎｚａ）で成長させた。細胞を数えて室温にて１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離法で採取した。細胞を、室温ＰＢＳで１〜２回洗浄した。各遺伝子導入に２００，０００の細胞を使用し、それらを１００μＬのＢＴｅｘｐｒｅｓｓ溶液中に再懸濁した。２〜４μｇのｍＲＮＡを遺伝子導入毎に添加し、混合物をキュベットに移動した。移動の直後に、混合物を５ミリ秒間２５０Ｖで電気穿孔した。予め温めた媒体をキュベットに添加し、媒体をプラスした細胞を４８ウェルの非組織処理されたプレートに移動させ、次いで３７℃でインキュベートした。

特定された日数後に、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑを用いて細胞をゲノム分析に供した。編集された対立遺伝子のパーセントを定量化するために、対象とするゲノム領域を、アダプタ（ａｄａｐｔｅｒ）配列を配列決定する標準Ｉｌｌｕｍｉｎａを添加するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの１３ラウンドの第２のグループを行い、両末端にバーコードおよび架橋アダプタ配列を添加した。アンプリコン配列決定のための製造者のプロトコルに従って、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ上で配列決定を行った。ＭｉＳｅｑは、対での末端リードを生成し、それらは、標準アラインメントソフトウエアを用いて、併合されアダプタで整えられる。リードを、次いで、カスタムスクリプトを用いて、バーコード配列対を介して試料によって非多重にした。アンプリコン配列を、次いで、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，ＳａｕｌＢ．；ａｎｄＷｕｎｓｃｈ，ＣｈｒｉｓｔｉａｎＤ．（１９７０）．ＪｏｕｒＭｏｌＢｉｏ４８（３）：４４３−５３）の実行を介して参照配列に包括的に整列させた。アラインメントの間隙または挿入を、％ＮＨＥＪ事象として計数し、未処置の対照試料配列と比較し、配列特異的背景速度を決定した。

標的とされた組み込みの計算のため、アンプリコン配列を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，ＳａｕｌＢ．；ａｎｄＷｕｎｓｃｈ，ＣｈｒｉｓｔｉａｎＤ．同上）の遺伝子配列操作（ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ）実行を介して参照配列に包括的に整列させた。実験的治療を介して生成された配列変化を、探索し、計数し、制御試料の計数と比較した。既知の単一特徴多型（ｓｉｎｇｌｅｆｅａｔｕｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＦＰ）を、このプロセス中マスクアウトし得、さらなる計数から除外し得る（例えば、ＺＦＮ標的部位に近い１−ｂｐ欠失ＳＦＰ）。ＮＨＥＪ％（インデルとも称される）を、挿入または欠失を含有する配列の百分率を決定することによって計算した。ＧＦＰベクターのみで処理された試料を使用して、ＰＣＲおよび挿入および欠失の配列決定エラーに基づく背景頻度を評価した。１％未満の背景頻度を観察した。

代表的なデータセットを以下の表１Ｂに示し、これらのヌクレアーゼタンパク質がそれらの標的を切断する際に活性であることを呈した。さらに、ヌクレアーゼ治療された細胞のいくつかにおいてガンマグロビンの発現を監視した。この分析を行うために、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ（「Ｔａｑｍａｎ」）を標準手順通りに使用した（以下参照）。代表的なデータセットからの結果を、ＧＦＰ治療された制御細胞と比較してガンマグロビンの発現における増加倍数として表示する。ガンマグロビンのアルファグロビンに対する比率としてガンマ値を計算し、よって以下に示される全ての観察された増加は、ＧＦＰベクター治療された細胞のガンマとアルファとの比率と比較した、ヌクレアーゼ治療された細胞のガンマとアルファとの比率における増加を表す。

ＴＡＬＥＮはまた、ＢＣＬ１１Ａのエクソン２領域およびエクソン４領域の両方で作成された。基準のＴＡＬＥコードおよび「＋１７」ＴＡＬＥＮバックボーンを用いて、ＴＡＬＥＮを前述のように構築した（本出願人が所有する米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照）。表１Ｃは、ＴＡＬＥＮならびにＤＮＡ結合ドメインのＲＶＤ配列のための標的配列を示す。

上に示されるＴＡＬＥＮ対を細胞に導入し、切断活性を示した。対１０１２９１／１０１２９２は、Ｋ５６２細胞でＣｅｌ−１アッセイによって測定されたように０．８％のインデルの値をもたらした。ＴＡＬＥＮ対１０１３０１／１０１３０４は、ＣＤ３４＋細胞で３５．７％のインデル形成の値を所与し、ＴＡＬＥＮ対１０１３０１／１０１３０４を上述のＲＴ−ＰＣＲアッセイによって見出し約２．３１倍のガンマグロビンｍＲＮＡ発現における増加を誘導した。

ＺＦＮ対も作製し、ＢＣＬ１１Ａ−ＸＬスプライスバリアントの「ＸＬ」部分を標的にした。これらのタンパク質をＫ５６２細胞で試験し、代表的なデータセットを以下の表１Ｄに示す。ＢＣＬ１１Ａの「ＸＬ」イソ型は、３つのさらなる天然のジンクフィンガー（フィンガー４−６）を含有し、よって、取られたアプローチは、この領域でＢＣＬ１１遺伝子を妨害することを含み、可能性としてジンクフィンガー４、５、および／または６およびそれらの組み合わせ（ＸＬ領域内の数１〜３）のアンフォールディングを引き起こした。ＺＦＮをまた操作して関連したＢＣＬ１１Ｂ遺伝子配列の切断を開始した。１つのＺＦＮ対である４４８８８／４４８８９が、ＢＣＬ１１Ａの第４のジンクフィンガーを標的とした一方で、２つの対である４４９０４／４４９０５および４４９１０／４４９１１が、第４のフィンガー（ＸＬ領域内の数１）の上流を標的とし、２つの他の対である４４９４６／４４９４７および４４９４５／４４９４４が第５のフィンガー（ＸＬ領域内の数２）を標的とした。これらのタンパク質をＫ５６２細胞で試験し、代表的なデータセットを以下の表１Ｄに示す。ＺＦＮ対のうちの２つは、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインとの間に新規のリンカー配列を含有した。４４９０４／４４９０５対は、両方がＬ７ａリンカー配列を含有し（米国特許出願第２００９０３０５４１９号を参照）、４４９４６／４４９４７対は、両方がＬ８ｐリンカー配列を含み、その両方を以下に示す。米国仮特許出願第６１／８７１，２１９号も参照のこと。
Ｌ７ａ：ＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＫＳＥＡＡＡＲ（配列番号２４４）
Ｌ８ｐ：ＨＴＫＩＨＬＲＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２４５）。

ＢＣＬ１１ＡＸＬ対を次いでＣＤ３４＋細胞で試験し、活性である。ガンマグロビンの発現の測定は、ＢＣＬ１１ＡＸＬの修飾がアルファグロビンに対するガンマグロビン発現の増加をもたらすことを呈する。

ＫＬＦ１特異的ＺＦＮのさらなる対を、ＣＤ３４＋細胞で活性のために試験をし、これらの細胞を、ガンマグロビン発現における任意の変化に関して分析した。代表的なデータセットを以下の表１Ｅに示す。

ＨＳＣのＢＣＬ１１Ａ−またはＫＬＦ１特異的ヌクレアーゼの治療に続くγグロビンおよびβグロビンをコードするｍＲＮＡの比率を、Ｔａｑｍａｎ分析によるＺＦＮ導入に続いて最大１７日間様々な時点で測定し、ベータの様なグロビンｍＲＮＡレベルも、１８ＳｒＲＮＡのレベルに正規化した。ガンマグロビン発現レベルは、ＢＣＬ１１ＡまたはＫＬＦ１特異的ヌクレアーゼで処置された細胞において増加した（図５）。分析を標準Ｔａｑｍａｎ分析によって行い、プロトコルに続いて、製造者（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって供給された遺伝子特異的アッセイを用いた。

ＢＣＬ１１ＡＺＦＮが修飾した細胞も分析し、１つの対立遺伝子がＺＦＮ（「Ｂｂ」）によって修飾された細胞集団間の通りγ／β ｍＲＮＡ比を決定し、両方の対立遺伝子の細胞をＺＦＮ（「ノックアウト」）および野生型（「ＢＢ」）によって修飾した。

図６に示されるように、γ／β ｍＲＮＡ比は、ＢＣＬ１１Ａノックアウトが１つの対立遺伝子のみで起こった細胞（Ｂｂ、左から６〜１０のバー）または両方の対立遺伝子がノックアウトされた細胞（ノックアウト、最も右の５つのバー、左から１１〜１５のバー）間で異なり、細胞の両方のプールは、野生型（ＢＢ、最初の５つのバー）とは異なる。

実施例７：ガンマグロビン遺伝子の調節領域の修飾
ガンマグロビンの発現を増加させる別のアプローチでは、突然変異をガンマグロビン遺伝子の調節領域で起こし、ＨＰＦＨ突然変異を模倣した（図９参照）。ガンマグロビン遺伝子のＡＴＧに対する領域−２０２〜−１０２を以下に示す。この配列上で、灰色のボックスがＨＰＦＨに関連付けられるように示された領域を示し、欠失されると、下線の配列がＨＰＦＨにも関連付けられた（ＴｈｅＳｉｃｋｌｅＣｅｌｌＡｎｅｍｉａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｎＡｕｇｕｓｔａ，ＧＡ，ＵＳＡにより出版されたＴｉｔｕｓＨ．Ｊ．Ｈｕｉｓｍａｎ、ＭａｒｉａｎｎｅＦ．Ｈ．Ｃａｒｖｅｒ、およびＥｒｏｌＢａｙｓａｌによるＡＳｙｌｌａｂｕｓｏｆＴｈａｌａｓｓｅｍｉａＭｕｔａｔｉｏｎｓ（１９９７）。ＴｉｔｕｓＨ．Ｊ．Ｈｕｉｓｍａｎにより著作権（１９９７）を参照のこと）。

実施例１に記載のようにヌクレアーゼを設計し、表１Ａに示し、これらのＨＰＦＨ関連突然変異の領域で結合し、野生型領域の突然変異を誘導した。ＣｅｌＩ分析によってＫ５６２細胞で欠失された編集された対立遺伝子パーセント（％ＮＨＥＪ）を（Ｐｅｒｅｚｅｔａｌ（２００８）、同上を参照）以下の表２に示す。さらに、いくつかの対を上述のようにＣＤ３４＋細胞で試験し、上述のようにＭｉＳｅｑ配列決定によって分析した。いくつかの対には、ガンマグロビン発現の全ての変化のために細胞を分析した。下の表２は、代表的なデータセットを示す。
このアッセイで試験された最初の３つの対は、ガンマプロモーター領域で−１７５あたりの領域を標的としたが、その一方最後の２つは、ガンマグロビンプロモーターの−１１０領域を標的とした。

編集されたＫ５６２細胞のガンマプロモーター領域を、配列決定し、作製された突然変異を分析した。領域をまずＰＣＲ増幅し、次いで、ＰＣＲ産生物を配列決定し、欠失および挿入を含む多くの異なる突然変異を観察した（図８）。この実験では、対立遺伝子の４２％を突然変異し、２０％が、ＨＰＦＨに関連付けられる−１１４〜−１０２の１３ｂｐ欠失を担持した。

ガンマグロビンプロモーターを標的とするＺＦＮの２つの対も、ＨＰＦＨを有する対象において最も一般的な突然変異を再作製するように設計されたオリゴヌクレオチドドナーとの組み合わせで細胞を処理するのに使用した。ＢＴＸデバイスを用いる使用のための上述の同一のプロトコルの後に、ドナーオリゴヌクレオチドの１００μＭ溶液の３μＬの追加を続けた。オリゴヌクレオチドドナーの配列を以下に示す。典型的に、順方向オリゴヌクレオチドドナーをこれらの実験で使用したが、逆方向ドナーも同様に機能した。

ドナーの存在でＺＦＮ対３４５３９／３４５７４のために、ガンマグロビン遺伝子からのｍＲＮＡ産生は、ＧＦＰベクターで治療された細胞と比較すると、６．３８倍増大する一方で、ＺＦＮ対３１１６０／３４３６５のためには、ガンマｍＲＮＡは、ＧＦＰベクターで治療された細胞と比較すると、６．１３倍増加した。

ヌクレアーゼ治療されたＨＳＣを、メチルセルロース上に蒔いた。ＰＣＲ配列決定によって個々のコロニーの遺伝子型を特定した後、ガンマ−グロビン、ベータ−グロビン、および１８ｓｒＲＮＡ対象についてのｍＲＮＡレベルを、野生型および変異型コロニーについて、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（図８）。平均すると、ガンマグロビンプロモーター変異体は、野生型細胞より高いガンマグロビンとベータグロビンメッセージとの比率を有し、１８ｓｒＲＮＡシグナルによる修正は、突然変異されたコロニーのガンマ−グロビン／ベータ−グロビン比における増大が、ベータ−グロビンｍＲＮＡレベルの減少よりもむしろこれらのコロニーのガンマ−グロビンｍＲＮＡレベルにおける増大によって引き起こされることを示す。

実施例８：ガンマグロビンプロモーターを標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼ
ＴＡＬＥヌクレアーゼをまた作製し、ガンマグロビンプロモーター領域の（上述）−２００領域または−１１０領域を標的とした。基準のＴＡＬＥコードおよび「＋１７」ＴＡＬＥＮバックボーンを用いて、ＴＡＬＥＮを前述のように構築した（本出願人が所有する米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照）。

ＴＡＬＥＮを次いで、対で使用し、Ｋ５６２細胞で切断を試験し、前述のようにＣｅｌ１アッセイによって評価し、対の結果を以下の表４に示す。さらに、ＴＡＬＥＮ対１０２５６６／１０２５６８をＣＤ３４＋細胞に対して試験し、ＭｉＳｅｑ分析によって測定すると、５１．３９％のＮＨＥＪを有することを見出した。

ＴＡＬＥＮの２つの対も、ガンマグロビンとアルファグロビンｍＲＮＡとの比率によって測定されるように、ガンマグロビンｍＲＮＡ発現のために試験した。対１０２５６６／１０２５６８は、ＧＦＰベクターで処理されたＣＤ３４＋細胞と比較すると、６．２５倍ガンマグロビン発現を増大させることを見出し、対１０２３１８／１０２３１４は、ＧＦＰベクターで処理されたＣＤ３４＋細胞と比較すると、２．１４倍ガンマグロビンを増大させた。対１０２５６６／１０２５６８も、上述のドナーオリゴで試験され、得られた細胞は、ＧＦＰベクターで処理されたＣＤ３４＋細胞と比較すると、９．１３倍のガンマグロビン発現の増大を有することを見出した。

実施例９：ＣＤ３４＋幹細胞におけるガンマグロビン編集
ガンマグロビンプロモーター領域に特異的なヌクレアーゼを、患者から得られたＣＤ３４＋細胞において使用する。細胞をヌクレアーゼで処理し、次いで、Ｃｅｌ１分析による成功編集について分析をする。細胞をさらに分析し、ガンマグロビンとベータグロビンとの比率を検査し、増大したガンマグロビンの発現を呈する。増大したガンマグロビン発現のために見出された代表的なデータは、上の異なるアプローチのための実験の章に置かれている。

実施例１０：マウスでの編集されたＣＤ３４＋の移植
ヌクレアーゼで治療されたＣＤ３４＋細胞（ヒト幹細胞前駆体ＨＳＰＣ）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒガンマ（ヌル）マウスを移植する能力を保有し、ガンマグロビンの調節に含まれる遺伝子が持続的に妨害される多クローン性多系列子孫を生じる（Ｈｏｌｔｅｔａｌ，（２０１０）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｕｇ；２８（８）：８３９−４７）を参照のこと）。同様に、ベータグロビン遺伝子座で、突然変異が修正される、またはドナーベータグロビン遺伝子がセーフハーバー遺伝子座に挿入されるように編集された、またはヌクレアーゼで処理され、ガンマグロビンの発現を改変する、ＣＤ３４＋またはＨＳＰＣは、移植することができ、所望のゲノム編集を担持する多系列子孫を生じる。編集されたＨＳＰＣの少数が編集された子孫を有する動物を定植することができるという呈示は、異常ヘモグロビン症を治療する臨床アプローチとして、ヌクレアーゼで修飾された自己造血幹細胞の使用を支持する。

本明細書において言及した全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

理解の明瞭さを目的として、図および実施例を用いて、ある程度詳細に開示を提供したが、当業者には、本開示の主旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が実施され得ることは明白であろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。

Claims

認識ヘリックス領域を含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、表１の単一行に示される順序で前記認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガータンパク質。
請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型もしくは操作された切断ドメインまたは野生型もしくは操作された切断ハーフドメインとを含む、融合タンパク質。
請求項１または請求項２に記載の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項２に記載の１つ以上の融合タンパク質または請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）または前駆細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の細胞。
前記前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項５に記載の細胞。
請求項１もしくは請求項２に記載のタンパク質または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
細胞におけるグロビン遺伝子発現を改変する方法であって、
前記細胞に、請求項１もしくは請求項２に記載の１つ以上のタンパク質または請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上のタンパク質が発現され、前記グロビン遺伝子発現が改変されるような条件下で導入することを含む、方法。
前記タンパク質が、グロビン遺伝子の発現を増加させる、請求項８に記載の方法。
前記グロビン遺伝子が、ガンマグロビンまたはベータグロビン遺伝子である、請求項９に記載の方法。
ドナー配列を前記細胞のゲノムに組み込むことを更に含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
前記ドナー配列が、ウイルスベクター、オリゴヌクレオチド、またはプラスミドを用いて前記細胞に導入される、請求項１１に記載の方法。
前記細胞が、赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞である、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
前記ＲＢＣ前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項１３に記載の細胞。
前記ドナー配列が、内因性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
前記ドナー配列が、外因性プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。