JP2878451B2 - 新規超熱安定性α―アミラーゼ - Google Patents
新規超熱安定性α―アミラーゼInfo
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、熱安定性α−アミラーゼの分野に関する。
更に詳しくは、本発明は超熱安定性α−アミラーゼ、該
酵素の製法および工業的デンプン液化プロセスにおける
α−アミラーゼの使用に関する。
更に詳しくは、本発明は超熱安定性α−アミラーゼ、該
酵素の製法および工業的デンプン液化プロセスにおける
α−アミラーゼの使用に関する。
背景技術 例えば、燃料アルコールもしくはハイフルクトースシ
ロップ（HFS）を製造するため、デンプンの糖への酵素
的交換用のα−アミラーゼが広く実際的に用いられてい
る。工業的デンプン液化プロセスの内で、ジェットクッ
キング法はデンプン液化に関し殆ど全世界で好まれてい
る形式であるが、このプロセスの実施に当っては、熱安
定性α−アミラーゼが必要とされる。
ロップ（HFS）を製造するため、デンプンの糖への酵素
的交換用のα−アミラーゼが広く実際的に用いられてい
る。工業的デンプン液化プロセスの内で、ジェットクッ
キング法はデンプン液化に関し殆ど全世界で好まれてい
る形式であるが、このプロセスの実施に当っては、熱安
定性α−アミラーゼが必要とされる。
HFSはハイDXシロップから製造される。ここで語句DX
はシロップの乾燥物質（DS）を基準にして計算したデキ
ストロース（Ｄ−グルコース）の重量％を意味する。デ
ンプンを高DXシロップに変換するために一般に適用され
る全体的酵素液化プロセスは、二工程プロセスである。
第一の工程は、液化、いわゆるデンプンを加水分解して
オリゴサッカリドいわゆるマルトデキストリン混合物に
変換することである。このプロセスは、α−アミラーゼ
によって触媒化され、次いで典型的ジェットクッキング
プロセスにおいて、デンプンスラリーを、通常単一用量
のα−アミラーゼと共に105〜110℃に少なくとも数分間
加熱し、次いで約90℃で少なくとも１時間保持する。全
体的液化の第一工程において、デンプンスラリーのゲル
化および機械化薄化が行われる。更に分解（デキストリ
ン化）がプロセスの第二工程でおこる。ジェットクッキ
ングプロセスに関し、米国特許3,912,590を参照のこ
と。
はシロップの乾燥物質（DS）を基準にして計算したデキ
ストロース（Ｄ−グルコース）の重量％を意味する。デ
ンプンを高DXシロップに変換するために一般に適用され
る全体的酵素液化プロセスは、二工程プロセスである。
第一の工程は、液化、いわゆるデンプンを加水分解して
オリゴサッカリドいわゆるマルトデキストリン混合物に
変換することである。このプロセスは、α−アミラーゼ
によって触媒化され、次いで典型的ジェットクッキング
プロセスにおいて、デンプンスラリーを、通常単一用量
のα−アミラーゼと共に105〜110℃に少なくとも数分間
加熱し、次いで約90℃で少なくとも１時間保持する。全
体的液化の第一工程において、デンプンスラリーのゲル
化および機械化薄化が行われる。更に分解（デキストリ
ン化）がプロセスの第二工程でおこる。ジェットクッキ
ングプロセスに関し、米国特許3,912,590を参照のこ
と。
工業的液化プロセスに対し、今日まで最も好ましい熱
安定性α−アミラーゼは細菌起源のものでありかつバシ
ラス(Bacillus)属由来のものである。従って、ジェット
クッキングプロセスにおいて、使用するために良好に適
合されたα−アミラーゼは、ノボノルデイスクA/S（デ
ンマーク国）から供給される、バシラス リケニホルミ
ス(Bacillus licheniformis)由来のターマミル（登録商
標）である。バシラス ステアロサーモフィラス(Bacil
lus stearothermophilus)由来のα−アミラーゼは、米
国特許2,695,683および4,284,722に記載されている。バ
シラス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearother
mophillus)α−アミラーゼ（ターマミル（登録商標））
は、エンザイムデベロップメント コーポレイション
（NY,USA）から入手可能である。
安定性α−アミラーゼは細菌起源のものでありかつバシ
ラス(Bacillus)属由来のものである。従って、ジェット
クッキングプロセスにおいて、使用するために良好に適
合されたα−アミラーゼは、ノボノルデイスクA/S（デ
ンマーク国）から供給される、バシラス リケニホルミ
ス(Bacillus licheniformis)由来のターマミル（登録商
標）である。バシラス ステアロサーモフィラス(Bacil
lus stearothermophilus)由来のα−アミラーゼは、米
国特許2,695,683および4,284,722に記載されている。バ
シラス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearother
mophillus)α−アミラーゼ（ターマミル（登録商標））
は、エンザイムデベロップメント コーポレイション
（NY,USA）から入手可能である。
今日まで入手可能なα−アミラーゼの性質のため、液
化プロセスは典型的には約6.0〜6.5のpHで行われ、更に
6.5を超えるpHでは、例えばマルツロース（maltulose）
又はマルツロース「前駆体」の如き未所望副生成物が形
成し、面倒である。例えば、バシラス リケニホルミス
（Bacillus licheniformis）は、6.0未満のpHで急速に
失活する。更に、工業的デンプン液化に対して用いられ
る場合、安定化に対し少なくとも50ppmのカルシウムが
必要とされ、更に120℃でこれは完全に失活する。バシ
ラス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermo
philus)α−アミラーゼは、バシラス リケニホルミス
(Bacillus licheniformis)酵素よりも幾つかのより秀れ
た活性を有し、顕著にはより低い至適pHを有する。しか
し、これらの酵素は、５未満のpH値ではデンプン液化に
適していない。
化プロセスは典型的には約6.0〜6.5のpHで行われ、更に
6.5を超えるpHでは、例えばマルツロース（maltulose）
又はマルツロース「前駆体」の如き未所望副生成物が形
成し、面倒である。例えば、バシラス リケニホルミス
（Bacillus licheniformis）は、6.0未満のpHで急速に
失活する。更に、工業的デンプン液化に対して用いられ
る場合、安定化に対し少なくとも50ppmのカルシウムが
必要とされ、更に120℃でこれは完全に失活する。バシ
ラス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermo
philus)α−アミラーゼは、バシラス リケニホルミス
(Bacillus licheniformis)酵素よりも幾つかのより秀れ
た活性を有し、顕著にはより低い至適pHを有する。しか
し、これらの酵素は、５未満のpH値ではデンプン液化に
適していない。
アルトデキストンをデキストリンに変換する、連続糖
化は、グルコマミラーゼ酵素により最も触媒化される。
通常、アスペルギルス(Aspergillus)又はリゾプス（Rhi
zopus）種から由来する商業的グルコアミラーゼ調製品
は、種々の製業者から、例えばAMG（登録商標）200L、
アスペルギルス（Aspergillus niger）由来でありかつ
ノボノルデイスクA/S（デンマーク国）により製造され
た製品として入手可能である。これらのグルコアミラー
ゼ酵素はpH4.0〜4.5に最適に機能する。
化は、グルコマミラーゼ酵素により最も触媒化される。
通常、アスペルギルス(Aspergillus)又はリゾプス（Rhi
zopus）種から由来する商業的グルコアミラーゼ調製品
は、種々の製業者から、例えばAMG（登録商標）200L、
アスペルギルス（Aspergillus niger）由来でありかつ
ノボノルデイスクA/S（デンマーク国）により製造され
た製品として入手可能である。これらのグルコアミラー
ゼ酵素はpH4.0〜4.5に最適に機能する。
今や、超高温性アルカエバクテリア（archaebcteri
a）は、ソルファタラのかつ海低の熱水作用システムか
ら単離された（フイアラ，ジー．アンド ステラ,K.O.;
Arch.Bicrobial.,145（56〜61）（1986）アンドケレ
ー、R.M.アンド デーミング,J.W.,Biotech.Progress,
4,47−62（1988））。
a）は、ソルファタラのかつ海低の熱水作用システムか
ら単離された（フイアラ，ジー．アンド ステラ,K.O.;
Arch.Bicrobial.,145（56〜61）（1986）アンドケレ
ー、R.M.アンド デーミング,J.W.,Biotech.Progress,
4,47−62（1988））。
今日まで知られている最高の高熱性細菌は、ピロコッ
カス(Pyrococcus)、ピロジクチウム(Pyrodictium)およ
びピロバクラム（Pyrobaculm）属に属する。ピロコッカ
ス（Pyrococcus）群は、熱安定性プロテアーゼおよびア
ミラーゼを含むことが推定された（ステーター,K.O.,J.
chem.Technol.Biotechnol.,42（４）;315〜317（198
8））。ピロコッカス ベセイ(Pyrococcus woesei)に対
する増殖条件が調べられた（ジーリング学;Syst.Appl.M
icrobial.,9,62−70（1987））。しかし、ピロコッカス
由来のアミラーゼはこれまで単離されておらずあるいは
又研究されていない。
カス(Pyrococcus)、ピロジクチウム(Pyrodictium)およ
びピロバクラム（Pyrobaculm）属に属する。ピロコッカ
ス（Pyrococcus）群は、熱安定性プロテアーゼおよびア
ミラーゼを含むことが推定された（ステーター,K.O.,J.
chem.Technol.Biotechnol.,42（４）;315〜317（198
8））。ピロコッカス ベセイ(Pyrococcus woesei)に対
する増殖条件が調べられた（ジーリング学;Syst.Appl.M
icrobial.,9,62−70（1987））。しかし、ピロコッカス
由来のアミラーゼはこれまで単離されておらずあるいは
又研究されていない。
中間のpH調節の必要性を排除するため、pH4.0の低いp
Hで液化可能な超安定性デンプン液化酵素を求めて長く
研究されてきた。更に、精製コストを軽減するため、カ
ルシウム塩の添加を避けることが好ましい。従って本発
明の目的は、今日まで知られたα−アミラーゼの欠点
を、新規な高熱安定性α−アミラーゼ（これは低い至適
pHを有しかつ本質的にカルシウムイオンから独立してい
る）を提供することにより除去することにある。
Hで液化可能な超安定性デンプン液化酵素を求めて長く
研究されてきた。更に、精製コストを軽減するため、カ
ルシウム塩の添加を避けることが好ましい。従って本発
明の目的は、今日まで知られたα−アミラーゼの欠点
を、新規な高熱安定性α−アミラーゼ（これは低い至適
pHを有しかつ本質的にカルシウムイオンから独立してい
る）を提供することにより除去することにある。
発明の簡易な説明 本発明によれば、今や以下の事実が見出された。すな
わち、ピロコッカス（Pyrococcus）菌株はα−アミラー
ゼを産生し、これは法外な熱安定性に加えて、好都合に
低いpH値で至適pHを示しかつ本質的にカルシウムイオン
から独立している。
わち、ピロコッカス（Pyrococcus）菌株はα−アミラー
ゼを産生し、これは法外な熱安定性に加えて、好都合に
低いpH値で至適pHを示しかつ本質的にカルシウムイオン
から独立している。
第一の面によれば、本発明は安定化量の基質の存在下
90℃で測定して至適pH4.0〜6.0、安定化量の基質の存在
下pH5.5で測定して至適温度80〜120℃を有し、本質的に
カルシウムイオンから独立しており、かつ安定化量の基
質の存在下で測定して90℃で１時間後100％、100℃で１
時間後少なくとも80％の残留活性を有するα−アミラー
ゼを提供する。この面の他の変形によれば、基質の非存
在下90℃で測定して至適pH5.2〜5.8、基質の非存在下pH
5.5で測定して至適温度90〜105℃を有し、カルシウムイ
オンから独立しており、かつ基質の非存在下で測定して
110℃で１時間後約70％の残留活性を有するα−アミラ
ーゼを提供する。
90℃で測定して至適pH4.0〜6.0、安定化量の基質の存在
下pH5.5で測定して至適温度80〜120℃を有し、本質的に
カルシウムイオンから独立しており、かつ安定化量の基
質の存在下で測定して90℃で１時間後100％、100℃で１
時間後少なくとも80％の残留活性を有するα−アミラー
ゼを提供する。この面の他の変形によれば、基質の非存
在下90℃で測定して至適pH5.2〜5.8、基質の非存在下pH
5.5で測定して至適温度90〜105℃を有し、カルシウムイ
オンから独立しており、かつ基質の非存在下で測定して
110℃で１時間後約70％の残留活性を有するα−アミラ
ーゼを提供する。
本発明に係るα−アミラーゼは、ピロコッカス(Pyroc
occus)菌株を培養することにより得られる。好ましい菌
株は、P.ボエセイ(woesei)およびP.フリオサス（furios
us）、特にP.ボエセイ(woesei),DSM No.3773およびP.フ
リオサス(furiosus),DSM No.3638である。
occus)菌株を培養することにより得られる。好ましい菌
株は、P.ボエセイ(woesei)およびP.フリオサス（furios
us）、特にP.ボエセイ(woesei),DSM No.3773およびP.フ
リオサス(furiosus),DSM No.3638である。
第二の面によれば、本発明はこれらのα−アミラーゼ
の調製方法を提供するものであり、この方法はピロコッ
カス(Pyrococcus)α−アミラーゼ生産菌株を、炭素およ
び窒素源並びに無機塩を含有する栄養培地内で培養し次
いで所望の酵素を回収することを含んでなる。このプロ
セスの好ましい態様において、P.ボエセイ(woesei)又は
P.フリオサス(furiosus)の菌株、特にP.ボエセイ(woese
i),DSM No.3773、又はP.フリオサス(furiosus),DSM No.
3638を培養する。
の調製方法を提供するものであり、この方法はピロコッ
カス(Pyrococcus)α−アミラーゼ生産菌株を、炭素およ
び窒素源並びに無機塩を含有する栄養培地内で培養し次
いで所望の酵素を回収することを含んでなる。このプロ
セスの好ましい態様において、P.ボエセイ(woesei)又は
P.フリオサス(furiosus)の菌株、特にP.ボエセイ(woese
i),DSM No.3773、又はP.フリオサス(furiosus),DSM No.
3638を培養する。
第三の面によれば、本発明はデンプン液化プロセスを
提供するものであり、このプロセスは本発明に係るα−
アミラーゼの存在下、水性デンプンスラリーを酵素的液
化に委ねることを含んでなる。このプロセスの好ましい
態様によれば、デンプン液化は本質的にカルシウム塩を
デンプンスラリーに添加することなく行われる。更に好
ましい態様によれば、該プロセスは100〜140℃の温度で
120分までジェットクッキングにより行われ、引続き所
望により約30〜120分間90〜100℃の保持すべき温度に低
下させ、しかる後このように液化したデンプンは、劣化
に対して安定であり、プロセス中pHは約4.0〜5.5に保持
される。本発明の別の好ましい態様によれば、液化デン
プンをしかる後グルコアミラーゼの存在下、本質的に中
間pHの調整なしで酵素的液化に委ねる。本発明の別の好
ましい態様によれば、液化デンプンを酵母を用いて糖化
と同時にエタノール発酵に委ねるか又はエタノール発酵
後引き続き糖化に委ねる。
提供するものであり、このプロセスは本発明に係るα−
アミラーゼの存在下、水性デンプンスラリーを酵素的液
化に委ねることを含んでなる。このプロセスの好ましい
態様によれば、デンプン液化は本質的にカルシウム塩を
デンプンスラリーに添加することなく行われる。更に好
ましい態様によれば、該プロセスは100〜140℃の温度で
120分までジェットクッキングにより行われ、引続き所
望により約30〜120分間90〜100℃の保持すべき温度に低
下させ、しかる後このように液化したデンプンは、劣化
に対して安定であり、プロセス中pHは約4.0〜5.5に保持
される。本発明の別の好ましい態様によれば、液化デン
プンをしかる後グルコアミラーゼの存在下、本質的に中
間pHの調整なしで酵素的液化に委ねる。本発明の別の好
ましい態様によれば、液化デンプンを酵母を用いて糖化
と同時にエタノール発酵に委ねるか又はエタノール発酵
後引き続き糖化に委ねる。
本発明の詳細な説明 ピロコッカス（Pyrococcus）を用いた増殖実験により
以下の内容が判明した。すなわち、この層の群はこれま
で記載されたデンプン水解酵素の内、最も熱安定性を有
しかつ熱活性デンプン水解酵素を分泌する。これらのデ
ンプン分解酵素は、種々のグルコースポリマー、例えば
アミロペクチン、グリコーゲン、マルトデキストリンお
よびアミロースにおけるα−1,4−グリコシド結合をラ
ンダムに加水分解することができる。多糖類加水分解の
パターンより、これらの酵素はα−アミラーゼとして同
定される。
以下の内容が判明した。すなわち、この層の群はこれま
で記載されたデンプン水解酵素の内、最も熱安定性を有
しかつ熱活性デンプン水解酵素を分泌する。これらのデ
ンプン分解酵素は、種々のグルコースポリマー、例えば
アミロペクチン、グリコーゲン、マルトデキストリンお
よびアミロースにおけるα−1,4−グリコシド結合をラ
ンダムに加水分解することができる。多糖類加水分解の
パターンより、これらの酵素はα−アミラーゼとして同
定される。
現在２種のピロコッカス(Pyrococcus)、すなわちP.ボ
エセイ(woesei)およびP.フリオサス(furiosus)が知られ
ている。これらの菌によって産生されるα−アミラーゼ
は明らかに同様の性質を有するが、しかしそれらは構造
の点でわずかに異なる。P.ボエセイ(woesei)は、DSMか
らNo.3773として入手可能である。P.フリオサス(furios
us)は、DSMからNo.3638として入手可能である。
エセイ(woesei)およびP.フリオサス(furiosus)が知られ
ている。これらの菌によって産生されるα−アミラーゼ
は明らかに同様の性質を有するが、しかしそれらは構造
の点でわずかに異なる。P.ボエセイ(woesei)は、DSMか
らNo.3773として入手可能である。P.フリオサス(furios
us)は、DSMからNo.3638として入手可能である。
本発明の酵素は、それらの基質、すなわち、多糖類例
えばデンプン、グルカゴン、分枝もしくは直鎖グルコー
スポリマー、アミロース、アミロペクチン、マルトデス
トリン又はこれらの混合物の存在により安定化され、更
にそれらは金属イオンの非存在下で安定である。基質の
安定化作用は、約0.5重量％以上の多糖類濃度で生じ
る。低い多糖類濃度は安定化をもたらさない。
えばデンプン、グルカゴン、分枝もしくは直鎖グルコー
スポリマー、アミロース、アミロペクチン、マルトデス
トリン又はこれらの混合物の存在により安定化され、更
にそれらは金属イオンの非存在下で安定である。基質の
安定化作用は、約0.5重量％以上の多糖類濃度で生じ
る。低い多糖類濃度は安定化をもたらさない。
本発明の酵素は、至適温度80〜120℃を示しかつ60℃
〜140℃で活性であり、特に60〜120℃、より好ましくは
80〜110℃、最も好ましくは90〜105℃で活性である。こ
の100度の広範囲の温度は驚くばかりである。酵素は、p
H3.5〜8.0で触媒的に活性である。約60％の活性がpH3.5
および7.0で測定される。酵素活性に対する至適pHは、
安定化量の多糖類を含有する培地中で測定してpH4.0〜
6.0の範囲内にあり、より好ましくはpH4.0〜5.5内にあ
り、更に安定化量の多糖類の非存在下で測定してpH5.2
〜5.8内にある。
〜140℃で活性であり、特に60〜120℃、より好ましくは
80〜110℃、最も好ましくは90〜105℃で活性である。こ
の100度の広範囲の温度は驚くばかりである。酵素は、p
H3.5〜8.0で触媒的に活性である。約60％の活性がpH3.5
および7.0で測定される。酵素活性に対する至適pHは、
安定化量の多糖類を含有する培地中で測定してpH4.0〜
6.0の範囲内にあり、より好ましくはpH4.0〜5.5内にあ
り、更に安定化量の多糖類の非存在下で測定してpH5.2
〜5.8内にある。
本発明酵素の法外な性質は、３バールの圧力でかつ12
0℃で６時間オートクレーブ処理後でさえ酵素活性の検
出により実証される。殆ど２％のα−アミラーゼ活性が
120℃でさえ検出された。60分後、90℃で100％、100℃
で少なくとも80％、110℃で70％、更に120℃で少なくと
も60％の残留活性が測定される。α−アミラーゼの完全
な失活のためには、３バールの圧力で120℃で少なくと
も12時間のオートクレーブ処理が必要であった。酵素
は、例えば２％SDSの如き洗剤の存在下で煮沸させた後
も触媒的に活性であることも注目すべきである。
0℃で６時間オートクレーブ処理後でさえ酵素活性の検
出により実証される。殆ど２％のα−アミラーゼ活性が
120℃でさえ検出された。60分後、90℃で100％、100℃
で少なくとも80％、110℃で70％、更に120℃で少なくと
も60％の残留活性が測定される。α−アミラーゼの完全
な失活のためには、３バールの圧力で120℃で少なくと
も12時間のオートクレーブ処理が必要であった。酵素
は、例えば２％SDSの如き洗剤の存在下で煮沸させた後
も触媒的に活性であることも注目すべきである。
更に、試験内研究において、金属イオン又は他の細胞
内因子は糖製酵素の触媒活性にとって必要でないことが
判明した。１〜5mMの重金属例えばCr2+，Cu2+又はZn2+
の添加は、酵素抑制をもたらす。5mMのEDTAの添加によ
り抑制は増長される。本発明に係るα−アミラーゼの独
得の性質は現存の商業的プロセスおよび新規適用におい
てそれらの有用性を与える。金属イオンの非存在下、５
未満のpH値でかつ100℃を超える温度で天然デンプンを
多糖類混合物に変換できる能力および独得の熱安定性の
ため、これらの酵素は工業的デンプン液化のため、例え
ば燃料アルコール又はハイフルクトースシロップ（HF
S）の製造のために理想的に適している。デンプン液化
プロセスにおけるこれらの酵素の使用は、法外なプロセ
ス−技術の利点によって達成される。液化と糖化の２つ
の工程間でpHレベルを再調整する必要はない。未所望の
副生成物の形成も避けられる。酵素を安定化させるた
め、カルシウムを添加することは必要でなく、従ってイ
オン交換精製のための操作コストは著るしく減少でき
る。より高温のため、反応はより速やかに進行する。
内因子は糖製酵素の触媒活性にとって必要でないことが
判明した。１〜5mMの重金属例えばCr2+，Cu2+又はZn2+
の添加は、酵素抑制をもたらす。5mMのEDTAの添加によ
り抑制は増長される。本発明に係るα−アミラーゼの独
得の性質は現存の商業的プロセスおよび新規適用におい
てそれらの有用性を与える。金属イオンの非存在下、５
未満のpH値でかつ100℃を超える温度で天然デンプンを
多糖類混合物に変換できる能力および独得の熱安定性の
ため、これらの酵素は工業的デンプン液化のため、例え
ば燃料アルコール又はハイフルクトースシロップ（HF
S）の製造のために理想的に適している。デンプン液化
プロセスにおけるこれらの酵素の使用は、法外なプロセ
ス−技術の利点によって達成される。液化と糖化の２つ
の工程間でpHレベルを再調整する必要はない。未所望の
副生成物の形成も避けられる。酵素を安定化させるた
め、カルシウムを添加することは必要でなく、従ってイ
オン交換精製のための操作コストは著るしく減少でき
る。より高温のため、反応はより速やかに進行する。
α−アミラーゼの調製 本発明に係るα−アミラーゼは、ピロコッカス(Pyroc
occus)の菌株を適当な増殖培地中で培養し次いで産生し
た酵素を回収することにより得ることができる。
occus)の菌株を適当な増殖培地中で培養し次いで産生し
た酵素を回収することにより得ることができる。
ピロコッカス(Pyrococcus)は、80〜106℃（上限の温
度は約110℃である）で、かつpH4.5〜7.5で最大増殖を
示す。生物の酵素合成は、増殖中いつでも行なわれそし
て初期の対数期においてすでに開始し更に定常期中でそ
の最大に達する。検出された多数のタンパク質バンドか
ら、ポリアクリルアミド グレデイエント ゲル電気透
析を用い、１個の主なバンドのみがアミロース分解活性
を有する。この酵素の分子量は、約70KDaである。
度は約110℃である）で、かつpH4.5〜7.5で最大増殖を
示す。生物の酵素合成は、増殖中いつでも行なわれそし
て初期の対数期においてすでに開始し更に定常期中でそ
の最大に達する。検出された多数のタンパク質バンドか
ら、ポリアクリルアミド グレデイエント ゲル電気透
析を用い、１個の主なバンドのみがアミロース分解活性
を有する。この酵素の分子量は、約70KDaである。
先に述べた様に、P.ボエセイ(woesei)に対する増殖条
件を調べられかつ培養方法は記載されている（ジラー
等、同上）。より良き工業的適用により発酵方法を得る
ため、本発明に係るα−アミラーゼの調製方法が開発さ
れ、これは栄養培地に連続的に通気することにより行わ
れる。栄養培地に連続的に通気すると酵素産生を刺激す
ることが見出された。細胞外酵素レベルが約２倍に増加
していると思われる。炭素源として多糖類、例えばデン
プン、アミロース、アミロペクチン、グリカゴン、分枝
もしくは直鎖オリゴサッカリドおよびマルトデキストリ
ン又はそれらの混合物、電子受容体としてのイオウ元素
および３％NaClを用い、H2／CO2−雰囲気を用い連続的
に通気することにより、α−アミラーゼが媒地に分泌さ
れる。非連続的通気のもとでは、わずか120U/l α−ア
ミラーゼが同条件下で検出された。
件を調べられかつ培養方法は記載されている（ジラー
等、同上）。より良き工業的適用により発酵方法を得る
ため、本発明に係るα−アミラーゼの調製方法が開発さ
れ、これは栄養培地に連続的に通気することにより行わ
れる。栄養培地に連続的に通気すると酵素産生を刺激す
ることが見出された。細胞外酵素レベルが約２倍に増加
していると思われる。炭素源として多糖類、例えばデン
プン、アミロース、アミロペクチン、グリカゴン、分枝
もしくは直鎖オリゴサッカリドおよびマルトデキストリ
ン又はそれらの混合物、電子受容体としてのイオウ元素
および３％NaClを用い、H2／CO2−雰囲気を用い連続的
に通気することにより、α−アミラーゼが媒地に分泌さ
れる。非連続的通気のもとでは、わずか120U/l α−ア
ミラーゼが同条件下で検出された。
加えて、ピロコッカス(Pyrococcus)の増殖のためのよ
り明定した栄養培地が開発された。記載した他の培地と
同様に、この培地は濁っておらず、かつこの培地はイオ
ウ元素を含んでいない。この培地中での良好な増殖およ
び酵素産生は、N2／CO2の連続的通気により達成でき
る。この栄養培地を用い、酵素産生は、細胞外酵素約20
0U/lから約1,000U/lまで５倍に更に上昇する。この培地
の組成は、例２から明らかである。興味あることに、出
願人は又次の内容を見出した。すなわち、窒素のみを用
いて培地を通気すると、増殖と酸素産生は低下した。こ
の培地は濁っていないので、増殖は光学密度を測定する
ことにより容易に監視できる。微生物は又、相当量の酵
素を分泌する。上記培地（イオウと共におよびイオウな
しで）が、少量並びに多量のアミラーゼ産生に対して用
いられる。
り明定した栄養培地が開発された。記載した他の培地と
同様に、この培地は濁っておらず、かつこの培地はイオ
ウ元素を含んでいない。この培地中での良好な増殖およ
び酵素産生は、N2／CO2の連続的通気により達成でき
る。この栄養培地を用い、酵素産生は、細胞外酵素約20
0U/lから約1,000U/lまで５倍に更に上昇する。この培地
の組成は、例２から明らかである。興味あることに、出
願人は又次の内容を見出した。すなわち、窒素のみを用
いて培地を通気すると、増殖と酸素産生は低下した。こ
の培地は濁っていないので、増殖は光学密度を測定する
ことにより容易に監視できる。微生物は又、相当量の酵
素を分泌する。上記培地（イオウと共におよびイオウな
しで）が、少量並びに多量のアミラーゼ産生に対して用
いられる。
本発明に係るα−アミラーゼは、又組換え体、DNA−
技術により調製できる。
技術により調製できる。
α−アミラーゼの単離 本発明に係るα−アミラーゼの単離は、常法により達
成できる。酵素は細胞のない上澄みから容易に回収でき
る。それらは天然のおよび可溶性デンプンに吸着し、該
デンプンは、大規模でこれらの酵素の精製を可能にす
る。しかし、α−アミラーゼを0.5％マルトデキストリ
ンで安定化させることが要求される。これらは、酵素活
性を減少しない、エタノールの如き有機溶媒の添加又は
冷却により上澄みから沈殿し得る。
成できる。酵素は細胞のない上澄みから容易に回収でき
る。それらは天然のおよび可溶性デンプンに吸着し、該
デンプンは、大規模でこれらの酵素の精製を可能にす
る。しかし、α−アミラーゼを0.5％マルトデキストリ
ンで安定化させることが要求される。これらは、酵素活
性を減少しない、エタノールの如き有機溶媒の添加又は
冷却により上澄みから沈殿し得る。
デンプン液化プロセス 本発明の液化プロセスは、例えば燃料アルコール又は
ハイフルクトースシロップ（HFS）の生産のため、デン
プンの糖への酵素的変換用に用いることができる。適当
な液化条件は、100〜140℃で120分まで、より好ましく
は100〜120℃で１〜60分、最も好ましくは105〜110℃で
１〜30分であり、所望により約30〜120分間90〜100℃の
範囲内に保持すべき温度を減下させる。水性デンプンス
ラリーにカルシウムイオンを添加しないことが好まし
い。pHは、3.5〜6.0、より好ましくは4.0〜5.5、最も好
ましくは4.2〜4.8内に保持すべきである。連続的プロセ
スが好ましく、加熱はジェットクッキングによるのが最
も好ましい。本発明のα−アミラーゼは、１グラムデン
プンDS（乾燥物質）当たり５〜500NU（NUの定義に関し
下記参照）、好ましくは10〜50NUの用量レベルでデンプ
ンを液化する。デンプン濃度は、通常15〜45％DS（W/W
％乾燥物質）、最も好ましくは25〜35％DSの範囲内にあ
る。
ハイフルクトースシロップ（HFS）の生産のため、デン
プンの糖への酵素的変換用に用いることができる。適当
な液化条件は、100〜140℃で120分まで、より好ましく
は100〜120℃で１〜60分、最も好ましくは105〜110℃で
１〜30分であり、所望により約30〜120分間90〜100℃の
範囲内に保持すべき温度を減下させる。水性デンプンス
ラリーにカルシウムイオンを添加しないことが好まし
い。pHは、3.5〜6.0、より好ましくは4.0〜5.5、最も好
ましくは4.2〜4.8内に保持すべきである。連続的プロセ
スが好ましく、加熱はジェットクッキングによるのが最
も好ましい。本発明のα−アミラーゼは、１グラムデン
プンDS（乾燥物質）当たり５〜500NU（NUの定義に関し
下記参照）、好ましくは10〜50NUの用量レベルでデンプ
ンを液化する。デンプン濃度は、通常15〜45％DS（W/W
％乾燥物質）、最も好ましくは25〜35％DSの範囲内にあ
る。
液化されたデンプンは、その後グルコアミラーゼの存
在下、実質的に中間pHの調節なしで酵素的液化に委ねる
ことができる。この場合、デンプンは、本発明のα−ア
ミラーゼを用い、pH3.5〜6.0で、より好ましくはpH4.0
〜4.5で、最も好ましくはpH4.2〜4.8で液化される。液
化されたデンプンは、例えばプルラナーゼ（詳細にはヨ
ーロッパ特許63,909参照）の如き枝切り酵素および／又
は例えばA.ニガー(niger)由来の酸安定性α−アミラー
ゼ（詳細にはヨーロッパ特許140,410参照）と組合わせ
たグルコアミラーゼの存在下、連続的酵素液化に委ねる
こともできる。
在下、実質的に中間pHの調節なしで酵素的液化に委ねる
ことができる。この場合、デンプンは、本発明のα−ア
ミラーゼを用い、pH3.5〜6.0で、より好ましくはpH4.0
〜4.5で、最も好ましくはpH4.2〜4.8で液化される。液
化されたデンプンは、例えばプルラナーゼ（詳細にはヨ
ーロッパ特許63,909参照）の如き枝切り酵素および／又
は例えばA.ニガー(niger)由来の酸安定性α−アミラー
ゼ（詳細にはヨーロッパ特許140,410参照）と組合わせ
たグルコアミラーゼの存在下、連続的酵素液化に委ねる
こともできる。
本発明の液化プロセスは又、エタノール製造に対して
も使用できる。この場合、デンプンはpH3.5〜6.0で、よ
り好ましくはpH4.0〜5.5で液化され、次いでグルコアミ
ラーゼで糖化および酵母による同時のもしくはその後の
発酵が行われる。しかる後、アルコールは公知方法で回
収できる。好ましくは、全体のプロセスは中間pH調節な
しで約4.5付近のpHで行なわれ、更に糖化と発酵が30〜3
5℃で96時間までに同時に行われる。液化は低DSレベル
（15〜20％）で又は高DSレベル（20〜40％）のいずれか
で行なわれる。高DSプロセスでは、DSレベルは約10％容
量のアルコールを得るためには発酵前の約20％に減少さ
れねばならず、これは大抵の酵母が耐えることのできる
ほぼ最大である。アルコール製造用の原料物質は、精製
デンプン、例えば湿潤ミル化コーンスターチ；原料の未
処理物質、例えばとうもろこし、小麦、ライス、モロコ
シ、カサバおよびトマト（これらのデンプン含量範囲は
15％〜80％）；および他のデンプン含有物質、例えば産
業界からの廃棄物および副産物を含有することができ
る。
も使用できる。この場合、デンプンはpH3.5〜6.0で、よ
り好ましくはpH4.0〜5.5で液化され、次いでグルコアミ
ラーゼで糖化および酵母による同時のもしくはその後の
発酵が行われる。しかる後、アルコールは公知方法で回
収できる。好ましくは、全体のプロセスは中間pH調節な
しで約4.5付近のpHで行なわれ、更に糖化と発酵が30〜3
5℃で96時間までに同時に行われる。液化は低DSレベル
（15〜20％）で又は高DSレベル（20〜40％）のいずれか
で行なわれる。高DSプロセスでは、DSレベルは約10％容
量のアルコールを得るためには発酵前の約20％に減少さ
れねばならず、これは大抵の酵母が耐えることのできる
ほぼ最大である。アルコール製造用の原料物質は、精製
デンプン、例えば湿潤ミル化コーンスターチ；原料の未
処理物質、例えばとうもろこし、小麦、ライス、モロコ
シ、カサバおよびトマト（これらのデンプン含量範囲は
15％〜80％）；および他のデンプン含有物質、例えば産
業界からの廃棄物および副産物を含有することができ
る。
図面の簡単な説明 第１図:98℃で、デンプン上の連続的通気バッチ培養で
P.ボエセイ(woesei)の培養（・アシロース活性；△残留
活性；■pH;◇578nmでの光学密度）。
P.ボエセイ(woesei)の培養（・アシロース活性；△残留
活性；■pH;◇578nmでの光学密度）。
第２図：P.ボエセイ(woesei)由来のα−アミラーゼに温
度およびpHの影響。
度およびpHの影響。
第３図：P.ボエセイ(woesei)由来のα−アミラーゼの熱
安定性（□70〜90℃；◆100℃；■110℃；○120℃；▲1
30℃）。
安定性（□70〜90℃；◆100℃；■110℃；○120℃；▲1
30℃）。
第４図：（Ａ）98℃ブンプン上で増殖中P.フリオサス(f
uriosus)によるα−アミラーゼの分泌。（Ｂ）連続的通
気下での増殖。
uriosus)によるα−アミラーゼの分泌。（Ｂ）連続的通
気下での増殖。
第５図：P.フリオサス(furiosus)由来のα−アミラーゼ
の活性に関する温度およびpHの影響。
の活性に関する温度およびpHの影響。
第６図：P.フリオサス(furiosus)由来のα−アミラーゼ
の熱安定。
の熱安定。
第７図：P.ボエセイ(woesei)由来の非安定化α−アミラ
ーゼの活性（基質の非存在下で測定）に関する温度とpH
の影響。
ーゼの活性（基質の非存在下で測定）に関する温度とpH
の影響。
次の実施例は、更に本発明を説明するものである。
例１ P.ボエセイ（woesei）から得られたα−アミラーゼ P.ボエセイ（woesei）の培養（第１図を参照） ピロコッカス ボエセイ（Pyrococcus woesei）を、9
8℃でジーリッヒ等（同上）によって記載される如く培
地中で培養する。201の培養物にH2／CO2（80対20）を用
いて連続的に通気し、次いで種々の時間間隔後50mlの試
料を取り出した。アミラーゼ活性を、ベルクマイエルア
ンドグラセー（Methods of enzymatic analysis、第３
版、第２巻、151〜152;Verlag Chemieワインヘルム（19
83））に従い細胞を含有しない上澄み中で測定した。１
％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（5
0mM pH5.5）250μｌに、500μｌまでの酵素溶液を添加
し、インキュベーションを95℃で30分間および60分間行
った。α−アミラーゼのIU活性は、標準としてマルトー
スを用い毎分１μmolの還元糖を遊離する酵素の量とし
て定義する。残留デンプン濃度は、第１表に記載する如
くHPLCを用いて算定した。
8℃でジーリッヒ等（同上）によって記載される如く培
地中で培養する。201の培養物にH2／CO2（80対20）を用
いて連続的に通気し、次いで種々の時間間隔後50mlの試
料を取り出した。アミラーゼ活性を、ベルクマイエルア
ンドグラセー（Methods of enzymatic analysis、第３
版、第２巻、151〜152;Verlag Chemieワインヘルム（19
83））に従い細胞を含有しない上澄み中で測定した。１
％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（5
0mM pH5.5）250μｌに、500μｌまでの酵素溶液を添加
し、インキュベーションを95℃で30分間および60分間行
った。α−アミラーゼのIU活性は、標準としてマルトー
スを用い毎分１μmolの還元糖を遊離する酵素の量とし
て定義する。残留デンプン濃度は、第１表に記載する如
くHPLCを用いて算定した。
方法：酢酸ナトリウム（50mM,pH5.5）1ml当たり、0.5U
の酵素を添加した。最終デンプン濃度は１％（W/V）で
あった。インキュベーションを90℃で行い、試料を種々
の時間間隔後取り出した。次いで各試料をイオン交換樹
脂（Serdolyt MB、セルバ、ハイデルベルク、FRG）を用
いて精製し、次いでAminex HPX−42 Aカラム（Bio−Ra
d、リッチモント、カリフォルニア、USA）を用い、HPLC
により糖を分析した。溶出した糖を示差屈折計（Kaue
r、バド ホムブルク、FRG）により監視した。DP、重合
度;DP1、グルコース。
の酵素を添加した。最終デンプン濃度は１％（W/V）で
あった。インキュベーションを90℃で行い、試料を種々
の時間間隔後取り出した。次いで各試料をイオン交換樹
脂（Serdolyt MB、セルバ、ハイデルベルク、FRG）を用
いて精製し、次いでAminex HPX−42 Aカラム（Bio−Ra
d、リッチモント、カリフォルニア、USA）を用い、HPLC
により糖を分析した。溶出した糖を示差屈折計（Kaue
r、バド ホムブルク、FRG）により監視した。DP、重合
度;DP1、グルコース。
タンパク質分離 細胞外タンパク質（20μg,0.2U）の分離は、1.5mm厚
のポリアクリルアミド グレーディエント ゲル（５〜
30％,W/V）において一定電圧400Vで24時間40℃で行っ
た。アミラーゼ活性を示すタンパク質バンドを検出する
ため、ゲルを、１％デンプンを含有する50mMの緩衝液
（pH5.5）中４℃で浸漬した。ゲルを更に90℃で30分間
インキュベートをし、最後に澄明な帯域が可視的になる
まで0.15％（W/V）のヨウ素および1.5％（W/V）のヨウ
化カリウムを含有する溶液中でインキュベートした。同
じゲル中のタンパク質を、HeukeshouenおよびBernick
（Electrophoresis 6,103,112）に従い、銀色に着色し
た。公知の分子量体を用い標準タンパク質（各々10μ
ｇ）をまた分離した。アミロース分解活性を示すタンパ
ク質の分子量は約70KDaであった。
のポリアクリルアミド グレーディエント ゲル（５〜
30％,W/V）において一定電圧400Vで24時間40℃で行っ
た。アミラーゼ活性を示すタンパク質バンドを検出する
ため、ゲルを、１％デンプンを含有する50mMの緩衝液
（pH5.5）中４℃で浸漬した。ゲルを更に90℃で30分間
インキュベートをし、最後に澄明な帯域が可視的になる
まで0.15％（W/V）のヨウ素および1.5％（W/V）のヨウ
化カリウムを含有する溶液中でインキュベートした。同
じゲル中のタンパク質を、HeukeshouenおよびBernick
（Electrophoresis 6,103,112）に従い、銀色に着色し
た。公知の分子量体を用い標準タンパク質（各々10μ
ｇ）をまた分離した。アミロース分解活性を示すタンパ
ク質の分子量は約70KDaであった。
至適pHおよび至適温度（第２図を参照） 至適温度の測定を酵素を用いて行ったが、この酵素は
スーパーローズ12カラムでゲル濾過して部分的に精製
（次いで0.5％マルトデキストリンで安定化したもので
あった。インキュベーションは湯浴（40℃〜100℃）で
更にグリセリン浴（105°〜130℃）中、pH5.5で行っ
た。100℃超の温度でのインキュベーションは、溶液の
沸とうを防止するため封止ヒュンゲート管内で行われ
た。0.5％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩
衝液（50mM,pH5.5）250μｌに、200μｌの酵素溶液（16
00U/l）を添加し、インキュベーションを10分間行っ
た。形成した還元糖をベルクマイエルおよびグラセー
（同上）により記載された如く測定した。酵素の至適pH
の測定のため、次の緩衝液を用いた:50mMのクエン酸ナ
トリウム（pH3.5〜4.0に対し）、50mMの酢酸ナトリウム
（pH4.5〜6.0に対し）およびリン酸カリウム（pH6.5〜
8.0に対し）。pH測定は90℃で行った。
スーパーローズ12カラムでゲル濾過して部分的に精製
（次いで0.5％マルトデキストリンで安定化したもので
あった。インキュベーションは湯浴（40℃〜100℃）で
更にグリセリン浴（105°〜130℃）中、pH5.5で行っ
た。100℃超の温度でのインキュベーションは、溶液の
沸とうを防止するため封止ヒュンゲート管内で行われ
た。0.5％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩
衝液（50mM,pH5.5）250μｌに、200μｌの酵素溶液（16
00U/l）を添加し、インキュベーションを10分間行っ
た。形成した還元糖をベルクマイエルおよびグラセー
（同上）により記載された如く測定した。酵素の至適pH
の測定のため、次の緩衝液を用いた:50mMのクエン酸ナ
トリウム（pH3.5〜4.0に対し）、50mMの酢酸ナトリウム
（pH4.5〜6.0に対し）およびリン酸カリウム（pH6.5〜
8.0に対し）。pH測定は90℃で行った。
試験した酵素は、40〜130℃の広範囲の温度でかつpH
3.5〜8.0で活性であった。最大活性はpH5,100℃で検知
された。
3.5〜8.0で活性であった。最大活性はpH5,100℃で検知
された。
熱安定性（第３図参照） 酵素含有試料を湯浴（70〜90℃）およびグリセリン浴
（100〜130℃）中でインキュベートした。種々の時間間
隔後、試料を取り出し更にα−アミラーゼ活性をベルク
マイエルおよびグラシー（同上）に従って測定した。１
％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（5
0mM,pH5.5）200μｌに、50μｌまでの酵素溶液を添加し
次いで95℃で30分および60分間インキュベーションを行
った（□70〜90℃；◆100℃；■100℃；○120℃；▲130
℃）。
（100〜130℃）中でインキュベートした。種々の時間間
隔後、試料を取り出し更にα−アミラーゼ活性をベルク
マイエルおよびグラシー（同上）に従って測定した。１
％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（5
0mM,pH5.5）200μｌに、50μｌまでの酵素溶液を添加し
次いで95℃で30分および60分間インキュベーションを行
った（□70〜90℃；◆100℃；■100℃；○120℃；▲130
℃）。
金属カチオンおよびEDTAの影響 P.ボエセイ(woesei)由来のα−アミラーゼの活性に対
する金属カチオンおよびEDTAの影響を酵素を用いて調べ
たが、この酵素はスーパーローズ12カラム（ファルマシ
ア、スウェーデン）でゲル濾過することにより部分的に
精製したものであった。第２表参照。α−アミラーゼを
含む分画を集め、４倍に濃縮した。25μｌの酵素（400U
/l）をＬ％（W/V）デンプンを含有する100μｌの酢酸ナ
トリウム緩衝液（50mM,pH5.5）に添加した。酢酸ナトリ
ウム緩衝液（100mM,pH5.5）中に溶解した金属カチオン
を種々の濃度で添加した。グリセリン浴（100℃）中40
分間インキュベーションした。最後に還元糖をベルクマ
イエルおよびグラシー（同上）により記載した如く検知
した。値は、％で測定した酵素活性を表わす。
する金属カチオンおよびEDTAの影響を酵素を用いて調べ
たが、この酵素はスーパーローズ12カラム（ファルマシ
ア、スウェーデン）でゲル濾過することにより部分的に
精製したものであった。第２表参照。α−アミラーゼを
含む分画を集め、４倍に濃縮した。25μｌの酵素（400U
/l）をＬ％（W/V）デンプンを含有する100μｌの酢酸ナ
トリウム緩衝液（50mM,pH5.5）に添加した。酢酸ナトリ
ウム緩衝液（100mM,pH5.5）中に溶解した金属カチオン
を種々の濃度で添加した。グリセリン浴（100℃）中40
分間インキュベーションした。最後に還元糖をベルクマ
イエルおよびグラシー（同上）により記載した如く検知
した。値は、％で測定した酵素活性を表わす。
例２ P.フリオサス（furiosus）から得られるα−アミラーゼ P.フリオサス（furiosus）の培養（第４図参照） 以下の組成（１当たり）を有する複合培地上でN2／CO
2（80％/20％）雰囲気下バッチ−培養で増殖実験を行っ
た。
2（80％/20％）雰囲気下バッチ−培養で増殖実験を行っ
た。
(NH4)2SO4 1.300g MgSO4・7H2O 0.250g NaCl 30.000g KH2PO4 1.400g CaCl2 0.050g FeSO4・7H2O 0.038g Na2SeO3・5H2O ５μM 微量元素** 10ml トリプトン 1.000g 酵母エキス 1.000g デンプン 1.000g レサズリン 0.001g システィン・HCl 0.500g pH6.2−6.5 温度90−100℃ ガスN2／CO2 80/20（連続通気）** 微量元素溶液（11当たり）： MnCl2・4H2O 0.10g CoCl2・6H2O 0.20g NiCl2・6H2O 0.10g ZnCl2 0.10g CaCl2・2H2O 0.05g CuSO4・2H2O 0.05g Na2MoO4・2H2O 0.05g 連続通気を行うことにより、1,000U/l以上の酵素活性
を検知した。これらの増殖条件は、培養液へ酵素の約80
％分泌をもたらした。
を検知した。これらの増殖条件は、培養液へ酵素の約80
％分泌をもたらした。
蛋白質分離 生理化学的調査を行うため、細胞外アミラーゼをゲル
濾過により部分的に精製した。全ての実験は、金属イオ
ンの非存在下かつ好気性条件下で行った。
濾過により部分的に精製した。全ての実験は、金属イオ
ンの非存在下かつ好気性条件下で行った。
至適pHおよび至適温度（第５図参照） 図面示すように、ピロコッカス フリオサス(Pyrococ
cus furiosus)由来のアミラーゼは、40〜130℃の広範囲
の温度でかつ3.0〜8.0のpH域で活性である。最大活性は
100〜105℃でかつpH4.5で測定される。約60％の酵素活
性が130℃で未だ検出できる。至適pHおよび至適温度を
測定するためのピロコッカス フリオサス（Pyrococcus
furiosus）α−アミラーゼの条件は、ピロコッカス
ボエセイ（Pyrococcus woesei）α−アミラーゼに対す
るものと同様であった。
cus furiosus)由来のアミラーゼは、40〜130℃の広範囲
の温度でかつ3.0〜8.0のpH域で活性である。最大活性は
100〜105℃でかつpH4.5で測定される。約60％の酵素活
性が130℃で未だ検出できる。至適pHおよび至適温度を
測定するためのピロコッカス フリオサス（Pyrococcus
furiosus）α−アミラーゼの条件は、ピロコッカス
ボエセイ（Pyrococcus woesei）α−アミラーゼに対す
るものと同様であった。
熱安定性（第６図参照） 極めて高い至適温度の他に、アミラーゼは顕著な熱安
定性を示す。図面に示されるように、沸とう水浴中で６
時間インキュベートすると、酵素活性はわずか20％に減
少する。130℃ですら酵素活性は30分後に未だ検出でき
る。
定性を示す。図面に示されるように、沸とう水浴中で６
時間インキュベートすると、酵素活性はわずか20％に減
少する。130℃ですら酵素活性は30分後に未だ検出でき
る。
金属イオンおよびEDTAの影響 5mMのモリブデン、カルシウムもしくはマグネシウム
の各イオンの添加はアミラーゼ活性に影響しなかった。
活性のわずかな減少が、コバルト、ニッケルおよび鉄イ
オンの存在下で検出できそして5mMの亜塩もしくは銅イ
オンを添加した時完全な粗害が見出された。EDTAは何ら
影響しなかったので、従って金属イオンの添加は酵素活
性に必要でないと推定できる。
の各イオンの添加はアミラーゼ活性に影響しなかった。
活性のわずかな減少が、コバルト、ニッケルおよび鉄イ
オンの存在下で検出できそして5mMの亜塩もしくは銅イ
オンを添加した時完全な粗害が見出された。EDTAは何ら
影響しなかったので、従って金属イオンの添加は酵素活
性に必要でないと推定できる。
基質特異性 ピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）
由来の部分精製細胞外アミラーゼは、天然のデンプン、
可溶性デンプン、アシロペクチン、マルトデキストリン
およびマシロースの加水分解した。デンプン分解の主生
成物は、オリゴサッカリド、例えばマルトヘキソース、
マルトペントース、マルトテトロース、マルトリオース
およびマルトース（第３表）であった。ピロコッカス
フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のアミラーゼ
は、デンプンおよびアミラーゼ中のα−1,4−グリコシ
ド結合をランダムに分解するので、これはα−アミラー
ゼと命名できる。
由来の部分精製細胞外アミラーゼは、天然のデンプン、
可溶性デンプン、アシロペクチン、マルトデキストリン
およびマシロースの加水分解した。デンプン分解の主生
成物は、オリゴサッカリド、例えばマルトヘキソース、
マルトペントース、マルトテトロース、マルトリオース
およびマルトース（第３表）であった。ピロコッカス
フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のアミラーゼ
は、デンプンおよびアミラーゼ中のα−1,4−グリコシ
ド結合をランダムに分解するので、これはα−アミラー
ゼと命名できる。
方法：酢酸ナトリウム（50mM,pH5.5）1ml当たり、0.5U
の酵素を添加した。最終デンプン濃度は１％（W/V）で
あった。インキュベーションを90℃で行い、試料を種々
の時間間隔後取り出した。次いで各試料をイオン交換樹
脂（Serdolyt MB、セルバ、ハイデルベルク、FRG）を用
いて精製し、次いでAminex HPX−42 Aカラム（Bio−Ra
d、リッチモント、カリフォルニア、USA）を用い、HPLC
により糖を分析した。溶出した糖を示差屈折計（Kaue
r、バド ホムブルク、FRG）により監視した。DP、重合
度;DP1、グルコース。
の酵素を添加した。最終デンプン濃度は１％（W/V）で
あった。インキュベーションを90℃で行い、試料を種々
の時間間隔後取り出した。次いで各試料をイオン交換樹
脂（Serdolyt MB、セルバ、ハイデルベルク、FRG）を用
いて精製し、次いでAminex HPX−42 Aカラム（Bio−Ra
d、リッチモント、カリフォルニア、USA）を用い、HPLC
により糖を分析した。溶出した糖を示差屈折計（Kaue
r、バド ホムブルク、FRG）により監視した。DP、重合
度;DP1、グルコース。
例３ 液化プロセス 30％W/Wコーンスターチスラリーを脱イオン水中で調
製し次いでpHを4.5に調節した。次いで、ステンレスチ
ール管（きつくフィットした蓋を備えている）に移し、
次いで1gデンプン当たり17NUのP.ボエセイ(woesei)α−
アミラーゼを添加した。
製し次いでpHを4.5に調節した。次いで、ステンレスチ
ール管（きつくフィットした蓋を備えている）に移し、
次いで1gデンプン当たり17NUのP.ボエセイ(woesei)α−
アミラーゼを添加した。
管を105℃で60分間加熱し、この間デンプンは完全に
液化した。液化後、DEに測定し、16であった。
液化した。液化後、DEに測定し、16であった。
管の内容物を60℃に冷却し、次いで1gのデンプン当た
り0.24AGのA.ニガー(niger)グルコアミラーゼを更にpH
調節なしで添加した。72時間後、HPLC分析により測定
し、試料は次の炭水化物組成を有していた。
り0.24AGのA.ニガー(niger)グルコアミラーゼを更にpH
調節なしで添加した。72時間後、HPLC分析により測定
し、試料は次の炭水化物組成を有していた。
％DP1 95.5 DP2 3.0 DP3 0.9 DP4 0.5 ここで、DPは重合度を意味する（DP1＝モノサッカリ
ド、DP2＝ジサッカリド等）。
ド、DP2＝ジサッカリド等）。
α−アミラーゼ活性の分析 標準活性NU（これはノボα−アミラーゼ単位の略号で
ある）は、１時間当たり37℃,pH5.6でかつ0.0043モルの
Ca2+で７〜20分にわたって溶解したデンプン5.26mgを加
水分解する酵素の量である。分析的方法を記載するホル
ダーAF9は要求に応じノボノルディスクA/S（デンマーク
国）から入手可能である。
ある）は、１時間当たり37℃,pH5.6でかつ0.0043モルの
Ca2+で７〜20分にわたって溶解したデンプン5.26mgを加
水分解する酵素の量である。分析的方法を記載するホル
ダーAF9は要求に応じノボノルディスクA/S（デンマーク
国）から入手可能である。
ピロコッカスα−アミラーゼの活性は60°で測定され
かつ同条件下で分析されたターマミル標準に関係する。
かつ同条件下で分析されたターマミル標準に関係する。
例４ 未置換α−アミラーゼの特性化 至適pH至適および（第７図参照） 至適温度の測定を、スパラース12カラムでゲル濾過す
ることにより部分的に精製したが、マルトデキストリン
で安定化されていない例１で得られた酵素を用いて行っ
た。インキュベーションを、湯浴（40℃〜100℃）中お
よびグリセリン浴（105℃〜130℃）中、pH5.5で行っ
た。100℃を越える温度でのインキュベーションを密封
ヒュンゲートー管内で行い溶液の沸とうを防止した。0.
5％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液
（50mM,pH5.5）250μｌに、20μｌの酵素溶液（1600U/
l）を添加し次いで10分間インキュベーションを行っ
た。次いで形成した還元糖をベルクマイエルおよびグラ
セー（同上）によって記載された如く測定した。酵素の
至適pHの測定に対し、次の緩衝液を用いた:50mMのクエ
ン酸ナトリウム（pH3.5〜4.0に対し）、50mMの酢酸ナト
リウム（pH4.5〜6.0に対し）およびリン酸カリウム（pH
6.5〜7.5に対し）。測定は90°で行った。
ることにより部分的に精製したが、マルトデキストリン
で安定化されていない例１で得られた酵素を用いて行っ
た。インキュベーションを、湯浴（40℃〜100℃）中お
よびグリセリン浴（105℃〜130℃）中、pH5.5で行っ
た。100℃を越える温度でのインキュベーションを密封
ヒュンゲートー管内で行い溶液の沸とうを防止した。0.
5％（W/V）デンプンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液
（50mM,pH5.5）250μｌに、20μｌの酵素溶液（1600U/
l）を添加し次いで10分間インキュベーションを行っ
た。次いで形成した還元糖をベルクマイエルおよびグラ
セー（同上）によって記載された如く測定した。酵素の
至適pHの測定に対し、次の緩衝液を用いた:50mMのクエ
ン酸ナトリウム（pH3.5〜4.0に対し）、50mMの酢酸ナト
リウム（pH4.5〜6.0に対し）およびリン酸カリウム（pH
6.5〜7.5に対し）。測定は90°で行った。
図面で示したように、本発明のα−アミラーゼは又安
定量の基質の非存在下で測定した場合、90°で測定して
至適pH5.2〜5.8およびpH5.5で測定して至適温度90〜105
℃を有する。最大活性はpH5.5および100℃で検出され
る。
定量の基質の非存在下で測定した場合、90°で測定して
至適pH5.2〜5.8およびpH5.5で測定して至適温度90〜105
℃を有する。最大活性はpH5.5および100℃で検出され
る。
60分後、100℃で100％110℃および120℃で70％および
130℃で10％の残留活性を測定する。
130℃で10％の残留活性を測定する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コッホ，ラインハルト ドイツ連邦共和国，デー―3400 ゲッテ ィンゲン，グリゼバッハシュトラーセ ８，インスティテュート フュール ミ クロビオロジー (72)発明者 スプライナット，アンドレアス ドイツ連邦共和国，デー―3400 ゲッテ ィンゲン，グリゼバッハシュトラーセ ８，インスティテュート フュール ミ クロビオロジー (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】（ａ）基質の非存在下90℃で測定した場合
に、5.2〜5.8の範囲内に至適pHを有し； （ｂ）基質の非存在下pH5.5で測定した場合に、90〜105
℃の範囲内に至適温度を有し； （ｃ）本質的にカルシウムイオンから独立しており； （ｄ）安定化量の基質の存在下で測定した場合に、100
℃１時間後約70％の残留活性を有し；そして （ｅ）ピロコッカス(Pyrococcus)菌株の培養によって得
ることのできる、ことを特徴とするα−アミラーゼ。 - 【請求項２】更に、P.ボエセイ(woesei)又はP.フリオサ
ス(furiosus)の菌株を培養することにより得ることので
きることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のα−ア
ミラーゼ。 - 【請求項３】更に、P.ボエセイ(woesei),DSM No.3773の
菌株、又はP.フリオサス(furiosus),DSM No.3638の菌株
を培養することによって得ることのできることを特徴と
する、請求の範囲第２項に記載のα−アミラーゼ。 - 【請求項４】ピロコッカス(Pyrococcus)のα−アミラー
ゼ生産菌株を、炭素および窒素源および無機塩を含有す
る適当な栄養培地中で培養し、次いで目的の酵素を回収
することを含んでなる、請求の範囲第１〜３項のいずれ
か１項に記載のα−アミラーゼの調製方法。 - 【請求項５】α−アミラーゼ生産菌が、P.ボエセイ(woe
sei)又はP.フリオサス(furiosus)の菌株である、請求の
範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】α−アミラーゼ生産菌が、P.ボエセイ(woe
sei),DSM No.3773、又はP.フリオサス(furiosus),DSM N
o.3638の菌株である、請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記
載のα−アミラーゼの存在下、水性デンプンスラリーを
酵素的液化に委ねることを含んでなるデンプン液化方
法。 - 【請求項８】更に、本質的にカルシウム塩をデンプンス
ラリーに添加することなく行うことを特徴とする、請求
の範囲第７項に記載のデンプン液化方法。 - 【請求項９】前記プロセスを、100〜140℃の範囲内の温
度で120分までジェットクッキングにより行い、次いで
所望により、保持すべき温度を90〜100℃の範囲の温度
に約30〜120分間減少させ、しかる後このように液化し
たデンプンは老化に対し安定であり、pHはプロセス中約
4.0〜5.5に保持されている、請求の範囲第７項又は第８
項に記載のデンプン液化方法。 - 【請求項１０】液化デンプンを、しかる後、実質的に中
間のpH調節することなくグルコアミラーゼの存在下、酵
素的糖化に委ねる請求の範囲第７〜９項のいずれかに記
載のデンプン液化方法。 - 【請求項１１】更に酵母を用いたエタノール発酵を、糖
化と同時に行うか又は該糖化の後に行う請求の範囲第10
項記載のデンプン液化方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3809096.5 | 1989-03-20 | ||
| DE3909096A DE3909096A1 (de) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Alpha-amylase |
| PCT/DK1990/000074 WO1990011352A1 (en) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | NOVEL HYPERTHERMOSTABLE α-AMYLASE |
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|---|---|
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| JP2878451B2 true JP2878451B2 (ja) | 1999-04-05 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0464095B1 (ja) |
| JP (1) | JP2878451B2 (ja) |
| KR (1) | KR100189224B1 (ja) |
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| AU (1) | AU5338690A (ja) |
| CA (1) | CA2050485A1 (ja) |
| DE (2) | DE3909096A1 (ja) |
| DK (1) | DK0464095T3 (ja) |
| FI (1) | FI98378C (ja) |
| WO (1) | WO1990011352A1 (ja) |
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| EP0694063B1 (en) * | 1993-02-19 | 2004-04-28 | Novozymes A/S | An alpha-amylase from pyrococcus |
| EP0648843A1 (en) * | 1993-10-01 | 1995-04-19 | Takara Shuzo Co. Ltd. | DNA encoding a hyperthermostable alpha-amylase |
| EP0746606A1 (en) * | 1994-03-04 | 1996-12-11 | Novo Nordisk A/S | $i(STAPHYLOTHERMUS) AMYLASE |
| AU2669195A (en) * | 1994-06-15 | 1996-01-05 | Novo Nordisk A/S | Pyrodictium xylanase, amylase and pullulanase |
| GB2291058B (en) * | 1994-07-14 | 1998-12-23 | Solvay | Acid-stable and thermo-stable alpha-amylases derived from sufolobus species |
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| US6361989B1 (en) | 1997-10-13 | 2002-03-26 | Novozymes A/S | α-amylase and α-amylase variants |
| KR20010015754A (ko) | 1997-10-13 | 2001-02-26 | 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 | α-아밀라제 변이체 |
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| EP1199367B1 (en) * | 1999-08-02 | 2004-10-06 | Takara Bio Inc. | Polypeptides |
| EP1980614A3 (en) | 1999-11-10 | 2009-04-08 | Novozymes A/S | Fungamyl-like Alpha-Amylase Variants |
| US7005288B1 (en) | 1999-11-10 | 2006-02-28 | Novozymes A/S | Fungamyl-like alpha-amylase variants |
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