JP3244696B2 - ヒト筋肉細胞の単離、増殖および分化 - Google Patents
ヒト筋肉細胞の単離、増殖および分化Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （関連分野） 本発明の分野は神経筋病の治療および多様な病因に由
来する病気の細胞性治療を目的とするトランスホーメー
ションに使用する筋原細胞の発生に関する。
来する病気の細胞性治療を目的とするトランスホーメー
ションに使用する筋原細胞の発生に関する。
（背景） 筋原細胞は筋形成に使われる中胚葉の前駆体細胞であ
る。特定の筋原細胞は分化した筋管を生産する他の筋原
細胞を認識し、自然にこれと融合し得る。多核筋管はも
はや分裂せず、またDNAも合成しないが、筋たんぱく質
を多量に生産する。これらには収縮装置の構成物や神経
筋伝達に必要な特定の細胞表面成分が含まれる。最終的
に分化した筋細胞は特徴的な横紋およびリズミカルな収
縮を示す。この経路の次のステップは成熟である。発生
段階の異なる収縮装置および筋肉には多重遺伝子群の異
なるメンバーによってコードされるミオシンおよびアク
チンなどの別のタイプの筋肉たんぱく質が含まれる。
る。特定の筋原細胞は分化した筋管を生産する他の筋原
細胞を認識し、自然にこれと融合し得る。多核筋管はも
はや分裂せず、またDNAも合成しないが、筋たんぱく質
を多量に生産する。これらには収縮装置の構成物や神経
筋伝達に必要な特定の細胞表面成分が含まれる。最終的
に分化した筋細胞は特徴的な横紋およびリズミカルな収
縮を示す。この経路の次のステップは成熟である。発生
段階の異なる収縮装置および筋肉には多重遺伝子群の異
なるメンバーによってコードされるミオシンおよびアク
チンなどの別のタイプの筋肉たんぱく質が含まれる。
胎児や成人組織からの筋原細胞の生産法が開発されて
きている。これらの方法は実質的に他の細胞を含まない
成人筋肉組織から大量の筋原細胞を生産することができ
ることを示している。筋原細胞には様々な用途がある。
まず筋原細胞は筋肉組織に関する様々な遺伝病の治療に
使用できる。また、筋原細胞は、１つ以上の遺伝子を導
入して目的の産物を提供する細胞治療を目的としたベヒ
クルとしても有用である。
きている。これらの方法は実質的に他の細胞を含まない
成人筋肉組織から大量の筋原細胞を生産することができ
ることを示している。筋原細胞には様々な用途がある。
まず筋原細胞は筋肉組織に関する様々な遺伝病の治療に
使用できる。また、筋原細胞は、１つ以上の遺伝子を導
入して目的の産物を提供する細胞治療を目的としたベヒ
クルとしても有用である。
（関連技術） ブロー（Blau）およびウェブスター（Webster）,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA（1981）78:5623−5627、は個々
のクローンの増殖や分化を目的とした筋原細胞の単離お
よびクローニングについて報告している。ブロー（Bla
u）等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA（1983）80:4856−486
0、はダチェン型筋ジストロフィー患者由来の培養細胞
のクローン分析における筋原細胞（サテライト細胞）、
成熟筋繊維の単核前駆体の増殖能の欠除について報告し
ている。ブロー（Blau）等、Exp.Cell.Res.（1983）14
4:495−503、はダチェン型筋ジストロフィー患者の生検
由来の純粋な筋原細胞クローンの生産および分析につい
て報告している。ブロー（Blau）等、Science（1985）2
30:758−766は筋肉遺伝子が活性化された非筋肉細胞と
筋肉細胞との融合について報告している。ウェブスター
（Webster）等、Exp.Cell.Res.（1988）174:252−265、
は蛍光活性化セルソーターを用いたヒト筋原細胞の精製
について報告している。ハム（Ham）等、In Vitro Cel
l.＆ Dev.Biology（1988）24:833−844、はヒト筋肉サ
テライト細胞のクローン増殖を目的とした無血清培地に
ついて報告している。ウェブスター（Webster）等、Cel
l（1988）52:503−513、はダチェン型筋ジストロフィー
は速い収縮に特殊化した骨格筋繊維群に選択的に影響す
ることを示した（ここで引用している参考文献参照）。
c.Natl.Acad.Sci.,USA（1981）78:5623−5627、は個々
のクローンの増殖や分化を目的とした筋原細胞の単離お
よびクローニングについて報告している。ブロー（Bla
u）等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA（1983）80:4856−486
0、はダチェン型筋ジストロフィー患者由来の培養細胞
のクローン分析における筋原細胞（サテライト細胞）、
成熟筋繊維の単核前駆体の増殖能の欠除について報告し
ている。ブロー（Blau）等、Exp.Cell.Res.（1983）14
4:495−503、はダチェン型筋ジストロフィー患者の生検
由来の純粋な筋原細胞クローンの生産および分析につい
て報告している。ブロー（Blau）等、Science（1985）2
30:758−766は筋肉遺伝子が活性化された非筋肉細胞と
筋肉細胞との融合について報告している。ウェブスター
（Webster）等、Exp.Cell.Res.（1988）174:252−265、
は蛍光活性化セルソーターを用いたヒト筋原細胞の精製
について報告している。ハム（Ham）等、In Vitro Cel
l.＆ Dev.Biology（1988）24:833−844、はヒト筋肉サ
テライト細胞のクローン増殖を目的とした無血清培地に
ついて報告している。ウェブスター（Webster）等、Cel
l（1988）52:503−513、はダチェン型筋ジストロフィー
は速い収縮に特殊化した骨格筋繊維群に選択的に影響す
ることを示した（ここで引用している参考文献参照）。
（本発明の概要） 細胞治療用に筋原細胞を無血清または低血清培地で調
製する。筋原細胞は移動し、予め存在する繊維と融合し
得、またトランスホーメーションの結果導入される遺伝
子のキャリヤーとしても使用される。基底層を通過する
筋原細胞の移動で、種々の病気の治療を目的とした注入
を減らすことができる。
製する。筋原細胞は移動し、予め存在する繊維と融合し
得、またトランスホーメーションの結果導入される遺伝
子のキャリヤーとしても使用される。基底層を通過する
筋原細胞の移動で、種々の病気の治療を目的とした注入
を減らすことができる。
（特定の態様の説明） 病気の治療を目的とした細胞性治療に使用する方法お
よび細胞が提供される。栄養培地中血清の非存在下、ま
たは実質的に非存在下、クローン的に純粋な、もしくは
実質的に濃縮した筋原細胞を大量に調製する方法が示さ
れている。生成した細胞は筋肉組織または可溶性因子が
関連する他の組織に関する様々な病気の治療に用いられ
る。
よび細胞が提供される。栄養培地中血清の非存在下、ま
たは実質的に非存在下、クローン的に純粋な、もしくは
実質的に濃縮した筋原細胞を大量に調製する方法が示さ
れている。生成した細胞は筋肉組織または可溶性因子が
関連する他の組織に関する様々な病気の治療に用いられ
る。
使用する細胞は、胎児、新生児またはより成熟したヒ
ト由来の組織を含む組織サンプルから得られる筋原細胞
である。これらの細胞には新鮮なものか、患者から入手
後直ちに凍結したものか、もしくは約５〜30倍に増殖さ
せ使用するまで凍結して保存したクローン培養物を用い
る。この細胞は至適条件として細胞培養インキュベータ
ーを用い（37℃、５％CO2含有空気、飽和湿度）増殖す
る。もし必要なら別の条件を用いる。使用した培地は有
意な分化なしに増殖させるものである。したがってこの
培地は筋原細胞の成熟レベルを維持するが、必要に応じ
てそれらが分化し成熟する環境に導入することもでき
る。
ト由来の組織を含む組織サンプルから得られる筋原細胞
である。これらの細胞には新鮮なものか、患者から入手
後直ちに凍結したものか、もしくは約５〜30倍に増殖さ
せ使用するまで凍結して保存したクローン培養物を用い
る。この細胞は至適条件として細胞培養インキュベータ
ーを用い（37℃、５％CO2含有空気、飽和湿度）増殖す
る。もし必要なら別の条件を用いる。使用した培地は有
意な分化なしに増殖させるものである。したがってこの
培地は筋原細胞の成熟レベルを維持するが、必要に応じ
てそれらが分化し成熟する環境に導入することもでき
る。
この培地には必須アミノ酸、無機塩、微量元素および
ビタミン類、ならびに他の有機成分が含まれる。以下の
表には当分野ではよく知られているように筋原細胞の増
殖に有害な影響を与えないよう各成分を変化させている
が一般には至適と考えられているものを示している。
ビタミン類、ならびに他の有機成分が含まれる。以下の
表には当分野ではよく知られているように筋原細胞の増
殖に有害な影響を与えないよう各成分を変化させている
が一般には至適と考えられているものを示している。
MCDB120と呼ばれる基礎培地に加えて以下の因子を補
う。最初の因子は、0.3〜0.5μg/ml、好ましくは約0.39
/0.40μg/mlのデキサメタゾンである。0.25〜0.75μg/m
l、好ましくは約0.50mg/mlの血清アルブミン、特にウシ
血清アルブミンも使用される。約５〜15ng、好ましくは
約10ngの上皮成長因子も使用する。約0.25〜0.75mg/m
l、好ましくは0.5mg/mlのフェチュインも使用する。最
後に、約150〜200μg/ml、好ましくは約180μg/mlのイ
ンシュリン、簡便にはウシインシュリンも使用される。
う。最初の因子は、0.3〜0.5μg/ml、好ましくは約0.39
/0.40μg/mlのデキサメタゾンである。0.25〜0.75μg/m
l、好ましくは約0.50mg/mlの血清アルブミン、特にウシ
血清アルブミンも使用される。約５〜15ng、好ましくは
約10ngの上皮成長因子も使用する。約0.25〜0.75mg/m
l、好ましくは0.5mg/mlのフェチュインも使用する。最
後に、約150〜200μg/ml、好ましくは約180μg/mlのイ
ンシュリン、簡便にはウシインシュリンも使用される。
筋原細胞の増殖には上述の培地に接種物を導入し、先
に述べた条件下細胞を増殖させる。接種物添加後、集密
度を高める目的で細胞の分布を均一に保つため培地を緩
やかに攪拌する。
に述べた条件下細胞を増殖させる。接種物添加後、集密
度を高める目的で細胞の分布を均一に保つため培地を緩
やかに攪拌する。
細胞を簡便な方法で収穫する。組織は一定に攪拌しな
がらウィーチントリプシン処理用フラスコ中0.05％トリ
プシン−EDTAを用い２〜３回連続的に総計40〜60分間の
処理を行うことで解離させる。
がらウィーチントリプシン処理用フラスコ中0.05％トリ
プシン−EDTAを用い２〜３回連続的に総計40〜60分間の
処理を行うことで解離させる。
各トリプシン処理後の上清から回収した細胞を収穫
し、氷上で４℃に冷却する。最終10％（v/v）となるよ
うウマ血清を加えてプロテアーゼ活性を停止させる。解
離した細胞を遠心する（２分間、25℃）。この細胞ペレ
ットをならし培地に懸濁し、培地にプレーティングする
か、もしくは1ml当り組織約0.1cm3の密度として液体窒
素中で凍結する。
し、氷上で４℃に冷却する。最終10％（v/v）となるよ
うウマ血清を加えてプロテアーゼ活性を停止させる。解
離した細胞を遠心する（２分間、25℃）。この細胞ペレ
ットをならし培地に懸濁し、培地にプレーティングする
か、もしくは1ml当り組織約0.1cm3の密度として液体窒
素中で凍結する。
培養の場合、その筋原細胞を融合、トランスフェクシ
ョン、インフェクション、エレクトロポレーション、粒
子衝突法などを含む種々の方法でトランスホームする。
外来DNAを導入する方法は本発明にとって重要ではな
い。DNA導入の目的に依存して、組換え、または非相同
的組換えにより特異的に相同的または正統的組込みを行
うことは興味深い。スミシーズ（Smithies）等（1985）
Nature317:230−235;トーマス（Thomas）およびカペッ
チ（Capecchi）（1987）Cell51:503−512およびマンサ
ー（Mansour）等（1988）Nature336:348−352参照。特
異的組込みを行う場合、組込み部位と相同的DNAの各側
の少なくとも50bp、通常100bpのところに目的の遺伝子
を隣接させる。この相同的DNAの大きさは10kbp程、通常
せいぜい約5kbp程度でその隣接領域もほぼ同サイズであ
ることが好ましい。
ョン、インフェクション、エレクトロポレーション、粒
子衝突法などを含む種々の方法でトランスホームする。
外来DNAを導入する方法は本発明にとって重要ではな
い。DNA導入の目的に依存して、組換え、または非相同
的組換えにより特異的に相同的または正統的組込みを行
うことは興味深い。スミシーズ（Smithies）等（1985）
Nature317:230−235;トーマス（Thomas）およびカペッ
チ（Capecchi）（1987）Cell51:503−512およびマンサ
ー（Mansour）等（1988）Nature336:348−352参照。特
異的組込みを行う場合、組込み部位と相同的DNAの各側
の少なくとも50bp、通常100bpのところに目的の遺伝子
を隣接させる。この相同的DNAの大きさは10kbp程、通常
せいぜい約5kbp程度でその隣接領域もほぼ同サイズであ
ることが好ましい。
組込み領域には特定の筋肉欠陥に関連するDNA配列が
含まれる。したがって、その宿主の筋原細胞は宿主から
取り出し、相同組換えによりトランスホームする。つい
で、細胞のクローン化の後欠陥部位における相同組換え
についてスクリーニングする。それとは別に、通常、筋
原細胞または成熟筋肉組織中では抑制されている天然の
誘導可能遺伝子の場合、転写開始調節配列、たとえばエ
ンハンサーを伴う、または伴なわないプロモーターなど
を修正し誘導または構成的転写への基礎を提供する相同
組換えを起こし得る。したがって、この筋原細胞を用
い、通常筋肉組織では発現されない内在的（宿主にとっ
て）または異種の遺伝子を発現し得る。たとえば、サイ
トカイン、成長因子、コロニー刺激因子、インターフェ
ロン、表面膜レセプター、インシュリンなどの発現も可
能となる。転写開始調節領域を修正することにより、筋
原細胞は発現産物の構成的生産を行ない得るし、また、
それとは別個に、あるいはそれと同時に、可溶性産物に
対するレセプターを導入することができ、この事はたと
えば細胞質や核などの細胞性たんぱく質の誘導可能な転
写を提供する。このレセプターを活性化することにより
筋原細胞は関連リガンドの誘導条件下発現産物の生産が
誘導される。
含まれる。したがって、その宿主の筋原細胞は宿主から
取り出し、相同組換えによりトランスホームする。つい
で、細胞のクローン化の後欠陥部位における相同組換え
についてスクリーニングする。それとは別に、通常、筋
原細胞または成熟筋肉組織中では抑制されている天然の
誘導可能遺伝子の場合、転写開始調節配列、たとえばエ
ンハンサーを伴う、または伴なわないプロモーターなど
を修正し誘導または構成的転写への基礎を提供する相同
組換えを起こし得る。したがって、この筋原細胞を用
い、通常筋肉組織では発現されない内在的（宿主にとっ
て）または異種の遺伝子を発現し得る。たとえば、サイ
トカイン、成長因子、コロニー刺激因子、インターフェ
ロン、表面膜レセプター、インシュリンなどの発現も可
能となる。転写開始調節領域を修正することにより、筋
原細胞は発現産物の構成的生産を行ない得るし、また、
それとは別個に、あるいはそれと同時に、可溶性産物に
対するレセプターを導入することができ、この事はたと
えば細胞質や核などの細胞性たんぱく質の誘導可能な転
写を提供する。このレセプターを活性化することにより
筋原細胞は関連リガンドの誘導条件下発現産物の生産が
誘導される。
筋原細胞のトランスホーメーションには種々のベクタ
ーが使用される。トランスフェクションやインフェクシ
ョンに特に興味深いのは細胞内に導入し得る複製能欠失
ウイルスベクター、DNAウイルスまたはレトロウイルス
ベクターである。通常これらのベクターには原核性DNA
は含まれず、かつ種々の機能性配列が含まれている。
ーが使用される。トランスフェクションやインフェクシ
ョンに特に興味深いのは細胞内に導入し得る複製能欠失
ウイルスベクター、DNAウイルスまたはレトロウイルス
ベクターである。通常これらのベクターには原核性DNA
は含まれず、かつ種々の機能性配列が含まれている。
すでに議論されているように、機能性配列には、転写
および翻訳開始および停止調節配列を踏むDNA領域、目
的たんぱく質をコードするオープンリーディングフレー
ムがあり、また、さらに部位特異的組込み用の隣接領域
を含むこともある。すでに示したように、ある状況で
は、５′隣接領域は相同組換えにより転写開始領域の性
質を変えてしまう。たとえば、エンハンサーがある場合
とない場合では転写誘導の可否や転写レベルの増減など
に違いが起こる。同様に、プロモーター領域が修正を受
けて誘導の感受性や転写レベルが変化することもある。
および翻訳開始および停止調節配列を踏むDNA領域、目
的たんぱく質をコードするオープンリーディングフレー
ムがあり、また、さらに部位特異的組込み用の隣接領域
を含むこともある。すでに示したように、ある状況で
は、５′隣接領域は相同組換えにより転写開始領域の性
質を変えてしまう。たとえば、エンハンサーがある場合
とない場合では転写誘導の可否や転写レベルの増減など
に違いが起こる。同様に、プロモーター領域が修正を受
けて誘導の感受性や転写レベルが変化することもある。
使用する構造遺伝子は、細胞質や核などのオルガネラ
など細胞内に維持されるか、細胞内膜や細胞膜に輸送さ
れる細胞内産物を生産するものや、その構造遺伝子に本
来存在する天然のシグナル配列や本来存在しないシグナ
ル配列を与えることにより分泌されるものがある。目的
の可溶性たんぱく質が大きいたんぱく質の断片であるよ
うな場合、そのようなたんぱく質にシグナル配列を与え
る必要がある。その結果分泌やプロセシング部位におけ
るプロセシングの際に所望されるたんぱく質が天然の配
列のものになる。
など細胞内に維持されるか、細胞内膜や細胞膜に輸送さ
れる細胞内産物を生産するものや、その構造遺伝子に本
来存在する天然のシグナル配列や本来存在しないシグナ
ル配列を与えることにより分泌されるものがある。目的
の可溶性たんぱく質が大きいたんぱく質の断片であるよ
うな場合、そのようなたんぱく質にシグナル配列を与え
る必要がある。その結果分泌やプロセシング部位におけ
るプロセシングの際に所望されるたんぱく質が天然の配
列のものになる。
ベヒクル構築物を含む細胞を選択するためのマーカー
が存在する。通常このマーカーは１つ以上の細胞毒性薬
剤耐性を提供するポジティブ選択を可能にする。たとえ
ば細胞をG418で選択するカナマイシン耐性や、メソトレ
キセートに対する耐性を示すジヒドロフォレートリダク
ターゼが用いられる。これらのマーカーは誘導可能また
は非誘導性の遺伝子が用いられるので、選択は誘導条件
または非誘導条件で行なわれる。
が存在する。通常このマーカーは１つ以上の細胞毒性薬
剤耐性を提供するポジティブ選択を可能にする。たとえ
ば細胞をG418で選択するカナマイシン耐性や、メソトレ
キセートに対する耐性を示すジヒドロフォレートリダク
ターゼが用いられる。これらのマーカーは誘導可能また
は非誘導性の遺伝子が用いられるので、選択は誘導条件
または非誘導条件で行なわれる。
また、ベクターには複製オリジンや宿主における複製
に必要なその他の遺伝子が含まれる。オリジンを含む複
製システムおよび特定のウイルスにコードされている複
製関連のたんぱく質が構築物の一部として含まれてい
る。複製をコードする遺伝子が筋原細胞のトランスホー
メーションを起こさないよう複製システムの選択には注
意しなければならない。例示的複製システムにはエプス
タイン・バーウイルスがある。その他に複製欠失ベヒク
ル、特に複製欠失レトロウイルスベクターが用いられ
る。これらのベクターに関してはプライス（Price）
等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA（1987）84:156−160およ
びサレス（Sares）等、EMBO J.（1986）５:3133−3142
による報告がある。最終的ベヒクル構築物には目的の遺
伝子が１つ以上含まれる。cDNA遺伝子または染色体遺伝
子のいずれも使用し得る。５′側非コード領域またはコ
ード領域に少なくとも１つのイントロンを提供すること
は特に興味深い。イントロンの存在はメッセンジャーRN
Aの安定性を増すことが分っている。
に必要なその他の遺伝子が含まれる。オリジンを含む複
製システムおよび特定のウイルスにコードされている複
製関連のたんぱく質が構築物の一部として含まれてい
る。複製をコードする遺伝子が筋原細胞のトランスホー
メーションを起こさないよう複製システムの選択には注
意しなければならない。例示的複製システムにはエプス
タイン・バーウイルスがある。その他に複製欠失ベヒク
ル、特に複製欠失レトロウイルスベクターが用いられ
る。これらのベクターに関してはプライス（Price）
等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA（1987）84:156−160およ
びサレス（Sares）等、EMBO J.（1986）５:3133−3142
による報告がある。最終的ベヒクル構築物には目的の遺
伝子が１つ以上含まれる。cDNA遺伝子または染色体遺伝
子のいずれも使用し得る。５′側非コード領域またはコ
ード領域に少なくとも１つのイントロンを提供すること
は特に興味深い。イントロンの存在はメッセンジャーRN
Aの安定性を増すことが分っている。
また、感染性の複製欠損ウイルスベクターの注射によ
りインビボで細胞をトランスホームできる。ベクターは
エコトロピックパッキング用のレトロウイルスプロデュ
ーサー細胞に導入する。それからこの細胞を収穫し、濾
過後遠心で濃縮する。その後、インビボで１部位にこの
ウイルスストックを注射する。筋原細胞は移動すること
が分っており、隣接領域に拡がることから、筋肉繊維に
必要な注射は比較的少ない。
りインビボで細胞をトランスホームできる。ベクターは
エコトロピックパッキング用のレトロウイルスプロデュ
ーサー細胞に導入する。それからこの細胞を収穫し、濾
過後遠心で濃縮する。その後、インビボで１部位にこの
ウイルスストックを注射する。筋原細胞は移動すること
が分っており、隣接領域に拡がることから、筋肉繊維に
必要な注射は比較的少ない。
ベクターの投与には、水、食塩水、リン酸緩衝液など
生理的に許容可能な培地を用いて注射するのが簡便であ
る。一般的にウイルス濃度は約105ffu以上である。その
他の添加物にはポリブレンがある。通常注射には筋肉組
織cm3当り約105個の細胞が用いられる。その組織の損傷
は目的部分への注射回数を抑えることで最小限にとどめ
る。特に、患者が膨大な治療を必要とする場合、特定領
域への注射回数を減らすことが望ましいのは明白であ
る。
生理的に許容可能な培地を用いて注射するのが簡便であ
る。一般的にウイルス濃度は約105ffu以上である。その
他の添加物にはポリブレンがある。通常注射には筋肉組
織cm3当り約105個の細胞が用いられる。その組織の損傷
は目的部分への注射回数を抑えることで最小限にとどめ
る。特に、患者が膨大な治療を必要とする場合、特定領
域への注射回数を減らすことが望ましいのは明白であ
る。
以下に示す例は説明を目的とするもので本発明を制限
するものではない。
するものではない。
（実験） （ベクター） BAGおよびpMMuLVSVnlsLacZと呼ばれる２つのβ−ガラ
クトシダーゼベクターを使用した、これらのベクターは
各々、MMuLVプロモーター／エンハンサーまたはSV40初
期プロモーターの転写コントロール下のβ−ガラクトシ
ダーゼコード配列を含む。さらにこれらのベクターなne
oγおよびLacZ遺伝子を有し、ある場合にはSV40ラージ
Ｔ核局在化配列に対する７個のアミノ酸コドンを有す
る。
クトシダーゼベクターを使用した、これらのベクターは
各々、MMuLVプロモーター／エンハンサーまたはSV40初
期プロモーターの転写コントロール下のβ−ガラクトシ
ダーゼコード配列を含む。さらにこれらのベクターなne
oγおよびLacZ遺伝子を有し、ある場合にはSV40ラージ
Ｔ核局在化配列に対する７個のアミノ酸コドンを有す
る。
組換え耐性のΨCREまたはΨ２エコトロピックパッキ
ング細胞系列への各々BAGまたはpMMuLVSVnlsLacZのトラ
ンスフェクションによって作製した各々CREBAG2またはP
A12Ψ212−C2レトロウイルスプロデュース細胞由来の上
清を回収し、濾過後遠心により濃縮した（プライス（Pr
ice）等、1987;サネス（Sanes）等、1986）。ウイルス
ストック（50〜200μ）を活性炭および10μＭポリブ
レンと混合した後、麻酔をかけたウィスターラットの後
足の側背面に26ゲージの針で注射した。約２週間後、こ
れらの動物を４％パラホルムアルデヒド、0.5％グルタ
ルアルデヒド、100mM PIPES（pH7.4）を用いた心臓灌流
で固定した。30〜60分後、後足の皮を除去して４℃で一
晩同じ固定剤中に浸し、ついで30％スクロースリン酸緩
衝液（PBS）中、４℃で24時間浸した。これをフリージ
ングイソペンタン中で凍結し、クリオスタットを用いて
連続的に30μｍの厚さでスライスした。これらの断片を
２％パラホルムアルデヒドで固定後、洗浄してから1mg/
mlX−gal、35mMフェリおよびフェロシアン化カリウム、
1mM MgCl2のリン酸緩衝液を用いて30℃で一晩かけて染
色し、グリセリン:PBS（9:1）に置き、ついでツァイス
アクシオフォト明視野顕微鏡でブルーのＸ−gal反応産
物の存在を調べた。青く染った筋肉繊維は後足に散在し
ていた。活性炭粒子は一般にかかとおよび側腓腹筋の間
に存在し、感染部位の同定に使用した。ラベルした筋細
胞クラスターの分布またはサイズの差が各々BAGまたはp
MMuLVSVnlsLacZベクターで観測された。BAGベクターはP
9（Ｐ＝生後）に注射P23に分析し、またpMMuLVSVnlsLac
ZはP16に注射、P29に分析した。さらに、活性炭粒子に
近いラベル化細胞クラスターは数ミリメートル離れたも
のと区別できず、このことは注射が近くの組織を壊さな
かったことを示している。
ング細胞系列への各々BAGまたはpMMuLVSVnlsLacZのトラ
ンスフェクションによって作製した各々CREBAG2またはP
A12Ψ212−C2レトロウイルスプロデュース細胞由来の上
清を回収し、濾過後遠心により濃縮した（プライス（Pr
ice）等、1987;サネス（Sanes）等、1986）。ウイルス
ストック（50〜200μ）を活性炭および10μＭポリブ
レンと混合した後、麻酔をかけたウィスターラットの後
足の側背面に26ゲージの針で注射した。約２週間後、こ
れらの動物を４％パラホルムアルデヒド、0.5％グルタ
ルアルデヒド、100mM PIPES（pH7.4）を用いた心臓灌流
で固定した。30〜60分後、後足の皮を除去して４℃で一
晩同じ固定剤中に浸し、ついで30％スクロースリン酸緩
衝液（PBS）中、４℃で24時間浸した。これをフリージ
ングイソペンタン中で凍結し、クリオスタットを用いて
連続的に30μｍの厚さでスライスした。これらの断片を
２％パラホルムアルデヒドで固定後、洗浄してから1mg/
mlX−gal、35mMフェリおよびフェロシアン化カリウム、
1mM MgCl2のリン酸緩衝液を用いて30℃で一晩かけて染
色し、グリセリン:PBS（9:1）に置き、ついでツァイス
アクシオフォト明視野顕微鏡でブルーのＸ−gal反応産
物の存在を調べた。青く染った筋肉繊維は後足に散在し
ていた。活性炭粒子は一般にかかとおよび側腓腹筋の間
に存在し、感染部位の同定に使用した。ラベルした筋細
胞クラスターの分布またはサイズの差が各々BAGまたはp
MMuLVSVnlsLacZベクターで観測された。BAGベクターはP
9（Ｐ＝生後）に注射P23に分析し、またpMMuLVSVnlsLac
ZはP16に注射、P29に分析した。さらに、活性炭粒子に
近いラベル化細胞クラスターは数ミリメートル離れたも
のと区別できず、このことは注射が近くの組織を壊さな
かったことを示している。
９日目に注射し、23日目に分析したラットの場合、多
くの繊維に及びクラスターの数は25個中16個であった
が、19日目に注射し、35日目に分析したラットの場合、
多くの繊維に及ぶクラスターの数は１個中１個であるこ
とが分った。
くの繊維に及びクラスターの数は25個中16個であった
が、19日目に注射し、35日目に分析したラットの場合、
多くの繊維に及ぶクラスターの数は１個中１個であるこ
とが分った。
側部腓腹筋中の染色筋肉繊維のクラスターは、その筋
原細胞は多核繊維への融合後でさえ感染を受け、β−ガ
ラクトシダーゼを発現し得ることを示している。観測さ
れたクラスターの多くは単一細胞由来のクローンを示し
ており、それらの子孫のいくつかは所定の筋肉繊維の基
底層を通過して移動し、隣りの筋肉繊維と融合する。各
筋原細胞は感染時に単一の繊維と会合するので、そのデ
ータは筋原細胞は１つの繊維から他の繊維へと基底層を
通して移動し得ることを示している。さらに大部分の感
染は多数の筋肉繊維に及ぶクローンを生じるので、それ
らの移動は比較的頻繁に起こると思われる。
原細胞は多核繊維への融合後でさえ感染を受け、β−ガ
ラクトシダーゼを発現し得ることを示している。観測さ
れたクラスターの多くは単一細胞由来のクローンを示し
ており、それらの子孫のいくつかは所定の筋肉繊維の基
底層を通過して移動し、隣りの筋肉繊維と融合する。各
筋原細胞は感染時に単一の繊維と会合するので、そのデ
ータは筋原細胞は１つの繊維から他の繊維へと基底層を
通して移動し得ることを示している。さらに大部分の感
染は多数の筋肉繊維に及ぶクローンを生じるので、それ
らの移動は比較的頻繁に起こると思われる。
感染したラットの足に存在するβ−ガラクトシダーゼ
ポジティブ細胞の各クラスターが単一のレトロウイルス
感染筋原細胞に由来することを示すため、異なるβ−ガ
ラクトシダーゼ染色パターンを示す２つのベクターの混
合物を注射した。クローンの数と大きさを最高にするた
め、２つのベクター混合物は増殖や繊維形成が盛んに起
っているP0のラットの後足に注射した。細胞質性β−ガ
ラクトシダーゼを有する23種を含む87種のβ−ガラクト
シダーゼポジティブクラスターを十分感染させた２つの
足においてわずか２つの場合にかぎり、細胞質染色繊維
に隣接する繊維が核染色を含んでいた。したがって隣接
する筋原細胞が独立に感染する頻度は、後足当り40〜50
クローンのレベルで感染させた動物の場合15％以下であ
る。したがって軽度の感染を受けた後足では、事実上１
つ以上もしくは２つのクローンが２つ以上の別個の感染
に由来することはないと考えられる。大部分は単一の感
染に由来するクローンである。
ポジティブ細胞の各クラスターが単一のレトロウイルス
感染筋原細胞に由来することを示すため、異なるβ−ガ
ラクトシダーゼ染色パターンを示す２つのベクターの混
合物を注射した。クローンの数と大きさを最高にするた
め、２つのベクター混合物は増殖や繊維形成が盛んに起
っているP0のラットの後足に注射した。細胞質性β−ガ
ラクトシダーゼを有する23種を含む87種のβ−ガラクト
シダーゼポジティブクラスターを十分感染させた２つの
足においてわずか２つの場合にかぎり、細胞質染色繊維
に隣接する繊維が核染色を含んでいた。したがって隣接
する筋原細胞が独立に感染する頻度は、後足当り40〜50
クローンのレベルで感染させた動物の場合15％以下であ
る。したがって軽度の感染を受けた後足では、事実上１
つ以上もしくは２つのクローンが２つ以上の別個の感染
に由来することはないと考えられる。大部分は単一の感
染に由来するクローンである。
２つのウイルス技術を用い、全てのラベル化繊維にお
ける細胞質および核染色がランダムな分布をしているか
どうかを測定することにより、各繊維のラベル化が別個
の感染に由来するかどうかを調べた。細胞質および核染
色パターンは、別個の領域に分離しており、その各々が
いくつかの繊維からなるクラスターを含む点で逆の事が
観察された。
ける細胞質および核染色がランダムな分布をしているか
どうかを測定することにより、各繊維のラベル化が別個
の感染に由来するかどうかを調べた。細胞質および核染
色パターンは、別個の領域に分離しており、その各々が
いくつかの繊維からなるクラスターを含む点で逆の事が
観察された。
繊維数は明らかに一定に保たれていることから実験中
に新しく繊維が形成されたとは考え難い。クローン内の
繊維の平均径は筋肉の全平均繊維径と同じであり、この
ことは多重繊維クローンにおいて小さい新しく生成した
繊維が選択的に含有されてはいないことを示している。
新しい繊維生成の最高速度と比べた高頻度の多重繊維ク
ローンの生成は、新しい繊維形成を運命付けられた筋原
細胞は分裂する筋原細胞の集団と比較してベクターの感
染に対して非常に選択性が高くなければならないことを
示している。これらのデータはトランスホームした筋原
細胞が異なる繊維に含まれるメカニズムとして基底層を
通した筋原細胞の移動を強く支持している。
に新しく繊維が形成されたとは考え難い。クローン内の
繊維の平均径は筋肉の全平均繊維径と同じであり、この
ことは多重繊維クローンにおいて小さい新しく生成した
繊維が選択的に含有されてはいないことを示している。
新しい繊維生成の最高速度と比べた高頻度の多重繊維ク
ローンの生成は、新しい繊維形成を運命付けられた筋原
細胞は分裂する筋原細胞の集団と比較してベクターの感
染に対して非常に選択性が高くなければならないことを
示している。これらのデータはトランスホームした筋原
細胞が異なる繊維に含まれるメカニズムとして基底層を
通した筋原細胞の移動を強く支持している。
本発明が筋肉繊維関連病の治療もしくは宿主内におけ
る可溶性または他のたんぱく質の生産を目的とする筋肉
形成細胞の使用を可能にしていることは上述の結果から
明白である。筋原細胞は新しい筋肉組織を形成し、また
繊維形成に参加することができ、そこでこれらの細胞は
有用な性質を提供したり、欠陥を修正したりすることが
できる。さらに、これらの細胞をマーカーで修飾するこ
とにより天然に存在する細胞中の形質転換細胞の選択を
可能にできる。本明細書で引用している全ての出版物お
よび特許出願は各々参考として引用している事を言及し
ているのと同様に参考として引用している。
る可溶性または他のたんぱく質の生産を目的とする筋肉
形成細胞の使用を可能にしていることは上述の結果から
明白である。筋原細胞は新しい筋肉組織を形成し、また
繊維形成に参加することができ、そこでこれらの細胞は
有用な性質を提供したり、欠陥を修正したりすることが
できる。さらに、これらの細胞をマーカーで修飾するこ
とにより天然に存在する細胞中の形質転換細胞の選択を
可能にできる。本明細書で引用している全ての出版物お
よび特許出願は各々参考として引用している事を言及し
ているのと同様に参考として引用している。
これまでにより明確に理解されることを目的として詳
細に説明および例で本発明を示してきたが、特許請求の
精神や範囲を逸脱することなしに修正が可能なことは当
業者にとって明白であろう。
細に説明および例で本発明を示してきたが、特許請求の
精神や範囲を逸脱することなしに修正が可能なことは当
業者にとって明白であろう。
フロントページの続き (72)発明者 ヒューズ シモン エム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94301 パロ アルト アディソン ス トリート 733 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 48/00 ABJ C12N 5/10 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (19)
- 【請求項１】有意な分化なしに筋原細胞の増殖を提供す
る実質的な無血清培地において、初代筋原細胞を増殖さ
せてクローン的に純粋な又は実質的に濃縮した筋原細胞
の集団を得る工程を含む方法によって得ることができる
筋原細胞組成物であって、該初代筋原細胞あるいは該ク
ローン的に純粋な又は実質的に濃縮した筋原細胞の集団
への外来DNAのin vitroトランスホーメーションの結果
として該筋原細胞組成物が外来DNAを含有し、該外来DNA
が蛋白質をコードする遺伝子を含有し、該筋原細胞組成
物の筋原細胞が先在する筋繊維に組み込まれて該外来DN
Aを発現することができる筋原細胞組成物。 - 【請求項２】該外来DNAがトランスフェクションによっ
て初代筋原細胞あるいはクローン的に純粋な又は実質的
に濃縮した筋原細胞の集団へ導入されている請求項１記
載の筋原細胞組成物。 - 【請求項３】該トランスフェクションが複製能欠失レト
ロウイルスを含む請求項２記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項４】該遺伝子が相同組換えによって初代筋原細
胞あるいはクローン的に純粋な又は実質的に濃縮した筋
原細胞の集団のゲノムへ組み込まれている請求項１記載
の筋原細胞組成物。 - 【請求項５】該外来DNAが初代筋原細胞あるいはクロー
ン的に純粋な又は実質的に濃縮した筋原細胞の集団中で
機能する転写開始領域を含有し、該遺伝子が該転写開始
領域の転写制御下にある、請求項１〜４のいずれか１項
記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項６】該転写開始領域が該遺伝子の構成的発現を
提供する請求項５記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項７】該転写開始領域が該遺伝子の誘導性発現を
提供する請求項５記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項８】該外来DNAがさらにシグナル配列を含有す
る請求項１〜７のいずれか１項記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項９】該外来DNAが初代筋原細胞あるいはクロー
ン的に純粋な又は実質的に濃縮した筋原細胞の集団で発
現する遺伝子を含有している請求項１〜８のいずれか１
項記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項１０】該外来DNAが分泌蛋白質をコードする遺
伝子を含有している請求項１〜９のいずれか１項記載の
筋原細胞組成物。 - 【請求項１１】分泌蛋白質がサイトカイン、成長因子、
コロニー刺激因子、インターフェロン、表面膜レセプタ
ー又はインシュリンを含む請求項10記載の筋原細胞組成
物。 - 【請求項１２】初代筋原細胞が成熟筋原細胞である請求
項１〜11のいずれか１項記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項１３】初代筋原細胞がヒト筋原細胞である請求
項12記載の筋原細胞組成物。 - 【請求項１４】請求項１〜13のいずれか１項記載の筋原
細胞組成物を含有する、筋肉組織に関連した病気を治療
するための医薬組成物。 - 【請求項１５】請求項１〜13のいずれか１項記載の筋原
細胞組成物を含有する、可溶性因子が関連する筋肉組織
以外の組織に関する病気を治療するための医薬組成物。 - 【請求項１６】初代筋原細胞で発現することができる遺
伝子を含むDNA構築物を使用することを特徴とする請求
項１〜13のいずれか１項記載の筋原細胞組成物の製造方
法。 - 【請求項１７】請求項14記載の医薬組成物の製造方法で
あって、初代筋原細胞で発現することができるDNA構築
物を含む複製能欠失ウイルスを使用することを特徴とす
方法。 - 【請求項１８】請求項15記載の医薬組成物の製造方法で
あって、初代筋原細胞で発現することができるDNA構築
物を含む複製能欠失ウイルスを使用することを特徴とす
方法。 - 【請求項１９】複製能欠失ウイルスがレトロウイルスで
ある、請求項17又は18記載の方法。
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