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JP2002517227A - 造血幹細胞の試験管内維持 - Google Patents

造血幹細胞の試験管内維持

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JP2002517227A
JP2002517227A JP2000553556A JP2000553556A JP2002517227A JP 2002517227 A JP2002517227 A JP 2002517227A JP 2000553556 A JP2000553556 A JP 2000553556A JP 2000553556 A JP2000553556 A JP 2000553556A JP 2002517227 A JP2002517227 A JP 2002517227A
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mesenchymal stem
cell
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ムバラビール，ガブリエル
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オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 この発明は骨髄細胞などの組織標本から分離されたヒト間葉幹細胞に指向し、また造血幹細胞がその表面型を維持するように分離間葉幹細胞およびもしくは間葉幹細胞誘導脂肪細胞を造血前駆細胞と共存培養する方法に指向する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
この発明は造血幹細胞に関し、とりわけヒト間葉幹細胞の拘束系統への分化を
減少しあるいは除去するヒト造血幹細胞を維持するためのプロセスと組成物に関
する。
【０００２】
【背景技術】
培養での前駆造血幹細胞の維持は、幹細胞がその上に住み着く付着層を提供し
、また、造血幹細胞の各種造血系統への増殖、自己再生および分化を必要とする
異なったシグナルを産出するストローマ細胞の混合集団の存在に依存することは
公知である。間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）から生じるストローマ細胞と脂肪細胞を含
む異なった細胞型は骨髄に存在する。
【０００３】 細胞が増殖し大多数の細胞がそのＣＤ３４＋表現型を保持するように、ＣＤ３
４＋細胞などの前駆造血幹細胞を培養で維持することはある状況の下では望まし
いことである。
【０００４】 もし分化か起こるとすれば、分化は単細胞、破骨細胞もしくは他の細胞型など
の選択された造血細胞系統に沿って存在するように造血幹細胞を維持することは
更に有益なことである。
【０００５】
【発明の概要】
この発明の一つの見地に従って、ヒト造血幹細胞を維持するプロセスと組成物
が提供され、ここでヒト造血幹細胞はヒト間葉幹細胞あるいは脂肪細胞と共存培
養される。脂肪細胞はヒト間葉幹細胞から誘導される。出願人は、このような共
存培養がこのような造血幹細胞などの前駆ＣＤ３４＋表現型を維持するのに有用
であることを発見した。
【０００６】 この発明のも一つの見地に従って、そのようなＣＤ３４＋／Ｔｈｙｌ＋表現型
が維持されるように、ヒト造血幹細胞をヒト間葉幹細胞と共に共存培養で維持す
るためのプロセスと組成物が提供される。
【０００７】 この発明の特殊な実施例では、脂肪細胞はヒト間葉幹細胞から誘導される。
【０００８】 この発明のも一つの見地において、ヒト造血幹細胞は対象となる遺伝子とりわ
け生理的あるいは薬理的活性タンパク質の発現のために遺伝子をその中で運ぶよ
うに遺伝的修飾される。
【０００９】
【発明の開示】
この発明は一般にヒトＣＤ３４＋幹細胞の維持を支持するヒト間葉幹細胞の使用
に関し、またヒトＣＤ３４＋細胞とヒト間葉幹細胞よりなる組成物に関する。
【００１０】 とりわけ、ＣＤ３４＋細胞と共同して支持細胞層として培養に使用されるヒト
間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）が、低水準あるいは高水準のＣＤ１４あるいはＣＤ９
０を発現するＣＤ３４＋細胞を維持するのに有用であることを出願人は発見した
。ＣＤ９０はまたＴｈｙｌとして公知である。かくして、ＣＤ３４＋細胞集団は
、例えば骨髄移植と再生のための造血前駆細胞源として増殖し、維持され、利用
することができる。
【００１１】 一つの実施例で、この発明はヒトＣＤ３４＋幹細胞の維持を支持する間葉幹細
胞誘導脂肪細胞に関し、またヒトＣＤ３４＋細胞、ヒト間葉幹細胞およびもしく
は間葉幹細胞誘導脂肪細胞よりなる組成物に関する。
【００１２】 とりわけ出願人は、ＣＤ３４＋細胞と共同して支持細胞層として培養で使用さ
れるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）あるいは脂肪細胞が低水準あるいは高水準の
ＣＤ１４あるいはＣＤ９０を発現するＣＤ３４＋細胞を維持するのに有用である
ことを出願人は発見した。
【００１３】 発明者はここで、ヒト間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞の存在下で
適切な試験管内条件下で造血細胞の維持と成長に成功したことを示す。
【００１４】 発明の方法に従って、間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞が造血幹細
胞と共存培養される時、間葉細胞は、前駆ＣＤ３４＋細胞の分化とＣＤ３４＋表
現型の損失が減少し、幹細胞のより大きな潜在能が維持されるようなやり方で造
血幹細胞の成長を支持する。
【００１５】 この発明の方法に従って、分離間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞お
よび分離造血前駆細胞、望ましくはＣＤ３４＋細胞は、それぞれ適切な培地で培
養拡張され、すなわち当業者には明らかな条件を用いる方法により培養され、こ
れは細胞成長と同種細胞集団の産生を助ける。
【００１６】 間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞集団および造血前駆細胞は、次い
でヒト間葉幹細胞の成長を促進し造血幹細胞の維持に逆作用しない培地で共存培
養される。この例に適した培地は合衆国特許番号第５，４８６，３５９号に記載
されている。
【００１７】 望ましい実施例において、間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞集団お
よび造血幹細胞はヒト間葉幹細胞培地であるダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ−ＬＧ＃１１８８５，メリーランド，ゲイザーズバーグ，ライフ・テクノロ
ジーズ）で共存培養される。この培地は望ましくはヒト間葉幹細胞を維持するあ
る血清量を含む。この培地を使うと、ヒト間葉幹細胞がＣＤ３４＋細胞集団を支
持することができ、それにより初期段階ヒト造血幹細胞の特性である原始表現型
（ＣＤ３４＋Ｔｈｙｌ＋）を含む幹細胞の損傷を減少させることが発見された。
【００１８】 従って、この発明の目的のため、培養培地は血清、例えばもっとも望ましくは
少なくとも５％の濃度である胎仔ウシ血清を含む。血清濃度は約２５％までの濃
度にすることとができるが、望ましくは２０％を越えない濃度である。
【００１９】 温度、ｐＨ、その他の培養条件はこの発明で利用されるヒト間葉幹細胞あるい
は間葉幹細胞誘導脂肪細胞と造血幹細胞でこれまでに使用されたものであり、当
業者にとっては明らかなものであろう。
【００２０】 ここに記載の方法のための主題のヒト間葉幹細胞を得るために、間葉幹細胞は
骨髄あるいは他の間葉幹細胞源から回収される。骨髄細胞は腸骨稜、大腿骨、脛
骨、脊髄、肋骨あるいは他の骨髄腔から得ることができる。ヒト間葉幹細胞の他
の源は、胚卵黄包、胎盤、臍帯、胎仔および青年期の皮膚および血液を含む。培
養コロニーでの間葉幹細胞の存在はモノクロ−ナル抗体で同定される特異的細胞
表面マーカーにより立証される。合衆国特許番号第４，５８６，３５９号を参照
されたい。これらの分離間葉細胞集団は間葉幹細胞とのみ関連するエピトープ特
性を示し、分化することなく培養で増殖する能力を持ち、また損傷組織の部位で
試験管内あるいは生体内のいずれかに導入された時に特異的な間葉系統に分化す
る能力を持つ。
【００２１】 ヒト間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞集団は造血幹細胞に対し、同
種異系、すなわち供与体不適合であり、あるいは間葉幹細胞は造血細胞に対し自
己由来のものであることとができる。
【００２２】 従って、ヒト組織から間葉幹細胞を回収するのに有用ないずれのプロセスも大
抵の間葉幹細胞よりなる細胞の集団を生むように利用される。一つの見地におい
て、ヒト間葉幹細胞を分離する方法は、間葉幹細胞、望ましくは骨髄を含む組織
標本を提供し、例えば密度勾配遠心分離により標本から間葉幹細胞を分離し、分
化なしで間葉幹細胞成長を刺激する因子を含み、また、培養基質表面に間葉幹細
胞のみの選択的付着を許す培地に分離細胞を加え、標本培地混合物を培養し、か
つ基質表面から非付着性物質を除去して間葉幹細胞の分離集団を生む、これらの
段階を含む。
【００２３】 間葉幹細胞誘導脂肪細胞は、例えば合衆国特許番号第５，８２７，７４０号に
記載された間葉幹細胞の分化を脂肪細胞に導入する方法を使用して得ることがで
きる。
【００２４】 この発明の更なる見地おいて、ヒト組織から造血幹細胞を回収するのに有用で
あるいずれのプロセスも大抵の造血細胞よりなる細胞の集団を生むのに利用され
る。幹細胞は各種の組織、例えば骨髄および末梢血を含む血液から回収すること
ができる。ヒト造血幹細胞は骨髄吸引液あるいは末梢血から回収することができ
、例えば合衆国特許番号第４，７１４，６８０号参照の当業者に公知の方法を用
いて例えばＣＤ３４などの造血幹細胞表面抗原と結合する商業的に利用可能な抗
体を使用して分離することができる。例えば、抗体は磁気ビードに結合されある
いは磁気ビードの上で支持され、また支持された抗体は免疫原処理の利用で回収
される細胞と結合するであろう。
【００２５】 ヒト間葉幹細胞と造血細胞は間葉細胞が基質表面に付着し単層を形成するよう
に適切な培養条件下で共存培養される。間葉幹細胞はｃｍ2当り約３×１０3乃至
５×１０3細胞の範囲での密度で平板培養される。脂肪細胞形成は間葉幹細胞が
密集に到達した後に前に記載の通り誘導される。ＣＤ３４＋細胞は望ましくはｃ
ｍ2当り約５×１０4細胞の細胞密度にある。
【００２６】 ここに記載の方法に従って生産された造血幹細胞はそれを必要とする個体、例
えば化学療法あるいは骨髄移植を受ける個体などの血液産物あるいは成分の輸血
を必要とする個体に対し造血幹細胞の信頼すべき定常源を提供するのに使用でき
る。
【００２７】 この発明のも一つの見地は造血幹細胞が新しい遺伝物質を運び望ましい遺伝産
物を発現できるように外部遺伝子の造血幹細胞への導入に関する。造血幹細胞へ
の形質導入のための遺伝物質は造血幹細胞維持、組織の成長、再造形、修飾ある
いは細胞外遺伝産物の生体内産生で役割を果たす遺伝産物を発現するものを含む
。
【００２８】 発明のこの見地に従って、造血幹細胞は対象となる遺伝物質（形質導入あるい
は形質転換もしくは形質移入された物質）で修飾することができる。これらの修
飾細胞は次いで発現産物が有益な作用を与える標的組織、例えば骨髄に対し投与
できる。修飾ＣＤ３４＋細胞もまた間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞
と共存培養することができる。
【００２９】 かくして、遺伝子は細胞内に導入され、それは次いで自己由来供与体あるいは
同種異系受容体に戻されそこで遺伝子の発現が治療作用を持つことになる。例え
ば造血幹細胞は生体内で変化した活性を持つように遺伝子操作される。
【００３０】 造血幹細胞はヒト間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞の存在下あるい
は不在下で遺伝子修飾される。
【００３１】 造血幹細胞は例えば組換え発現ベクターを使用し、遺伝物質を細胞内にとり込
むことにより遺伝子修飾される。
【００３２】 ここで使用されるように「組換え発現ベクター」という用語は、（１）遺伝子
発現に調節役割を持つ遺伝因子、（２）ｍＲＮＡに転写されタンパク質に翻訳さ
れる構造配列あるいはコード配列および、（３）適切な転写開始配列と終結配列
、のアセンブリーよりなる転写ユニットを引用する。真核発現システムでの使用
を意図した構造ユニットは宿主細胞により翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能に
するリーダー配列を含む。選択肢として、組換えタンパク質がリーダー配列ある
いは輸送配列なしで発現される場合には、それはＮ末端メチオニン残基を含む。
この残基は最終産物を提供するために続いて切断されたり切断されなかったりす
る。
【００３３】 ヒト造血幹細胞はかくして組換え転写ユニットを染色体ＤＮＡに安定して組込
み、あるいはレジデントプラスミドの成分として組換え転写ユニットを運ぶ。細
胞は例えば生態外でポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド（ＤＮＡある
いはＲＮＡ）で操作される。細胞はＲＮＡポリペプチドをコード化するＲＮＡを
含むレトロウイルス粒子の使用により従来の技術で公知の手順で操作することか
できる。
【００３４】 前に言及したレトロウイルスプラスミドベクターが誘導されるレトロウイルス
は必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウ
イルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、
鳥類白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデ
ノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス乳腺癌ウイルス、などを含む。一つの実施
例では、レトロウイルスプラスミドベクターはマウス胚性幹細胞から誘導さされ
るＭＧＩＮである。
【００３５】 ポリペプチドをコード化する核酸配列は適切なプロモーターの制御下にある。
採用されるプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、ＴＲＡＰプロモータ
ー、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター
；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸融合細胞ウイルス（ＲＳ
Ｍ）プロモーター；ラウス肉腫プロモーター；誘導性プロモーター、例えばＭＭ
Ｔプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど；熱ショックプロモーター
；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば単純性ヘルペスチミジンキ
ナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ；ＩＴＲｓ；βアクチンプロモー
ター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを含む。プロモーターは更にポリペ
プチドをコード化する遺伝子を制御する天然プロモーターであることもある。こ
れらのベクターは更に遺伝子操作前駆細胞によりポリペプチドの産生を調節する
ことも可能である。適切なプロモーターの選択は当業者には明らかなものである
。
【００３６】 造血幹細胞を遺伝子操作あるいは修飾してレトロウイルス以外のベクターを使
用することも可能である。対象の遺伝情報はそのような細胞内で新しい遺伝物質
を発現できるいずれかのウイルスにより導入することができる。例えばＳＶ４０
，ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ヒト乳頭種ウイ
ルスはこの目的に使用することができる。クローン真核ＤＮＡを培養哺乳類細胞
に導入するために他の方法も使用できる。例えば幹細胞に移転された遺伝物質は
ウイルス核酸の形態にある。
【００３７】 加えて、発現ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼあるいはネオマイシン耐性
などの形質転換細胞選択のための表現型形質を提供するために１個もしくはそれ
以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【００３８】 造血幹細胞は従来技術で公知のもの以外の手段で形質移入される。このような
手段は必ずしもそれに限定されないが、リン酸カルシウムあるいはＤＥＡＥデキ
ストランを媒介する形質移入；ポリカチオンポリブレンを媒介する形質移入；プ
ロトプラスト融合法；電気窄孔；リポソーム内でＤＮＡあるいはＲＮＡの被包を
通じ、次いでリポソームを細胞膜と融合させるか、もしくは合成カチオン脂質で
被覆したＤＮＡが融合により細胞内に導入できるようにしたリポソーム、などで
ある。
【００３９】 この発明は更に、ヒト造血幹細胞が生物学的に有意な量で造血幹細胞を正常に
生産するかあるいは僅かな量で産生されるのではなくて、調節発現が治療利益に
導くような状況でポリペプチド、ホルモンおよびタンパク質を試験管内あるいは
生体内で産生するやり方でヒト造血幹細胞を遺伝子操作することを可能にする。
例えば造血幹細胞は骨吸収を特異的に阻害する分子を発現する遺伝子で操作する
ことができる。選択肢として、細胞は正常に発現されたタンパク質が可成り低い
水準で発現されるように修飾することができる。これらの産物は次いで取りかこ
む培地に分泌されるかあるいは細胞から精製される。このようなやり方で形成さ
れたヒト造血幹細胞は発現物質の連続した短期あるいは長期の産生システムとし
て役立つことができる。これらの遺伝子は例えばホルモン、成長因子、基質タン
パク質、細胞膜タンパク質、サイトカイン、付着分子、組織修飾に重要な「再建
」タンパク質などを発現することができる。外因性生体内遺伝物質の発現はしば
しば「遺伝子治療」として引用される。そのような処理が適用される疾病状態と
手順は骨および免疫系の遺伝疾患と疾病を含む。形質導入細胞の細胞送達は各種
の方法で実行される。それは骨膜、骨髄および皮下の各部位への注入と直接蓄積
注射を含む。
【００４０】 加えて、前に記載のように、形質導入細胞は望ましいタンパク質の試験管内産
生に使用することができる。形質導入細胞は更に薬剤発見のためのスクリーニン
グ検定にも使用される。
【００４１】 この発明の前の記載と以下の実施例は説明のみによるものである。この発明の
変形と実例は以下の図面と組合せた前記の説明の見地から当業者により容易に予
見されるであろう。従って、このような変形と変更はこの発明の範囲内である。
【００４２】
【発明を実施するための最良の形態】
間葉幹細胞とＣＤ３４＋細胞の分離に使用されるヒト骨髄吸引液はメリーラン
ド，ゲイザーズバーグ，ポイエティック・テクノロジーズから購入された。
【００４３】 （実施例１） ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は分離され既知の方法（例えば合衆国特許番号
第５，４８６，３５９号）に従って培養された。ヘパリン化骨髄サンプルが健康
なヒト供与体から回収された。単核細胞は１：０７３パーコル密度勾配を使用し
て分離され、１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ−ＬＧ（低グルコース）培地に
置かれた。
【００４４】 ＭＳＣｓの脂肪形成文化は例えば合衆国特許番号５，８２７，７４０号に記載
の通り実施された。
【００４５】 健全な患者の骨髄から分離されたＣＤ３４＋細胞（メリーランド，ゲイザーズ
バーグ，ポイエテック・テクノロジーズ，インコーポレイテッド）が磁気ビード
に接合されたＣＤ３４に対する抗体を利用して９５％まで精製され（ＣＤ３４＋
細胞分離カラム：カリフォルニア，オーバーン，ミルテニィ・バイオテック，Ａ
ｂ：ＱＢＥＮＤ．１０）冷凍保存された。
【００４６】 ＣＤ３４＋細胞はＭＳＣｓあるいはＭＳＣ誘導脂肪細胞の層にｃｍ2当り５×
１０4細胞で播種された。共存培養は３週間３７℃で空気９５％炭酸ガス５％で
維持され、３日毎にｈＭＳＣ培地を供給された。大抵のＣＤ３４＋細胞が最初の
２週間非付着のままであったので、培養培地の半分は非付着細胞を攪拌すること
なくゆっくり吸引され、新鮮培地で置換された。
【００４７】 フローサイトメトリー分析 造血細胞は５ｍＭ，ＥＤＴＡを含むＣａ2+−ＭＧ2+を含んでいないハンクス緩
衝食塩液（ＨＢＳＳ）ベースの緩衝液を用いてゆっくり収穫された。全細胞数が
計数された。図１はヒト間葉幹細胞との共存培養での全造血ＣＤ３４＋集団の成
長と維持を示す。２１日での共存培養で全細胞数の増加は３倍であった。時々Ｍ
ＳＣｓは収穫で発見されたが形態学上認められる僅かの量であったため計数され
なかった。未培養冷凍保存ＣＤ３４＋前駆細胞は正の対照として使用された。約
２×１０5細胞が非特異的結合を遮断するためにＢＳＡ，０．５％で保温され、
次いで、２０ｕｇ／ｍｌの特異的抗体あるいは対照抗体と共に保温された。細胞
はＣＤ３４＋；ＣＤ３４＋／９０＋（原始造血細胞）；あるいはＣＤ３４＋／１
４＋（単球／マイクロファージ）表面マーカーを分析された。ＣＤ３４，ＣＤ９
０，ＣＤ１４に対する抗体はカリフォルニア，サンディエゴ，ファーミンゲン，
インコーポレイテッドから購入された。すべての保温は４℃、３０分で行なわれ
た。未結合抗体は遠心分離洗浄で廃棄された。保温の後、０．５％のＢＳＡを含
む３ｍｌのＰＢＳが管に加えられ、それは次いで５分，６００ｘｇで遠心分離さ
れた。サンプルは同じ緩衝液の０．５ｍｌで再懸濁され、フローサイトメトリー
で直ちに分析された。バックグラウンド測定値は各サンプルの読み取りから控除
された。
【００４８】 コロニー検定 ＭＳＣｓあるいはＭＳＣｓ誘導脂肪細胞と共存培養された造血細胞は前に記載
の通り２１日に緩やかに収穫された。培養されなかった冷凍保存ＣＤ３４＋前駆
細胞（すなわち細胞は解凍され検定に委ねられなかった）は正の対照として使用
された。収穫された細胞は計数され、サイトカインとエリスロポエチンを含む完
全メチルセルロース培地のメトカルト（カナダ、バンクーバー、ステムセル・テ
クノロジーズ、インコーポレイテッド）と混合され、メーカーのプロトコルに従
って平板培養された。培養物は２週間、３７℃で９５％空気、５％炭酸ガスの下
で維持された。１００個以上の細胞を含むコロニー数は全培養ウエルを一貫した
やり方で手動でスキャナーで調べて顕微鏡の下で計数された。
【００４９】 結果 表１で示されるコロニー検定の結果はＭＳＣｓとの長期の共存培養（ＬＴＣ）
がＬＴＣ開始培養（ＬＴＣ−ＩＣ）を生成したことを示している。
【００５０】
【表１】
【００５１】 造血細胞コロニーの全数（表２参照）はＭＳＣｓとＭＳＣ誘導脂肪細胞がＬＴ
Ｃ−ＩＣの形成を促進することを示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】 共存培養での細胞のフローサイトメトリー分析の結果は図２で示される。０日
では、ＣＤ３４＋（図２Ａ），ＣＤ３４＋／１４＋（図２Ｂ）、およびＣＤ３４
＋／９０＋（図２Ｂ）表面マーカーの発現は（全細胞数５０×１０3の内）それ
ぞれ約９０％，７％，１３％の細胞集団を含んでいた。共存培養の２１日には、
共存培養での細胞は（全細胞数１５０×１０3の内）それぞれ約３０％，９％お
よび７％の細胞集団で、ＣＤ３４（図２Ａ），ＣＤ３４／１４（図２Ｂ）および
ＣＤ３４／９０（図２Ｃ）の発現を示した。ＣＤ３４＋細胞の全体の絶対数は培
養期間を通じて保持され、ＣＤ３４＋／ＣＤ１４＋細胞表現型の全体の絶対数は
増加し、一方ＣＤ３４＋／９０＋細胞の全体の絶対数は僅かに増加した。
【００５４】 ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓあるいはＣＤ３４＋細胞とＭＳＣ誘導脂肪細胞の１
４日と２１日での収穫造血細胞の全数が測定された。データはＭＳＣｓあるいは
ＭＳＣ誘導脂肪細胞がＣＤ３４＋細胞の増殖を促進することを示した（図３）。
【００５５】 １４日と２１日にＭＳＣｓあるいはＭＳＣ誘導脂肪細胞と共存培養されたＣＤ
３４＋細胞の異なった造血細胞表現型の数が測定された（図４）。ＣＤ３４＋細
胞の絶対数は共存培養の最初の２週間保持され、次いで２１日に２５％減少した
（図４Ａ）。ＣＤ３４＋／ＣＤ１４＋細胞表現型の細胞の絶対数はＣＤ３４＋細
胞とＭＳＣｓの共存培養での２１日に増加し、またＣＤ３４＋細胞とＭＳＣ誘導
脂肪細胞の共存培養では１４日と２１日に増加した（図４Ｂ）。ＣＤ３４＋／Ｃ
Ｄ９０＋細胞表現型との細胞の絶対数はＭＳＣｓとＭＳＣ誘導脂肪細胞の両方と
共存培養されたＣＤ３４＋細胞で１４日と２１日に増加した（図４Ｃ）。
【００５６】 図５はＣＤ３４＋細胞とＭＳＣ誘導脂肪細胞の共存培養から生じた造血細胞に
より生成するコロニーの形態を示す。同様のコロニーはＣＤ３４＋３４細胞とＭ
ＳＣｓの共存培養で見られた。
【００５７】 これらの結果は原始幹細胞がその原始造血幹細胞表現型を失すことなく培養で
維持することができることを示している。かくして、ここに記載された方法は、
例えば移植を促進するために細胞を投与する目的で培養でＣＤ３４＋細胞を拡張
するのに有利である。
【００５８】 この発明の数多くの修飾と変化が前記の教訓の光の下で可能であり、従って冒
頭の請求項の範囲内でこの発明は特に記載されたもの以外にも実施することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト間葉幹細胞との共存培養での全造血ＣＤ３４＋集団の成長と
維持
【図２】 ２１日にフローサイトメトリーにより検定された共存培養での異
なった造血細胞表現型の数で、２ＡはＣＤ３４＋細胞表現型が共存培養期間を通
じて維持されることを示す図、２ＢはＣＤ３４＋／ＣＤ１４＋細胞表現型が増加
したことを示す図、２ＣはＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞表現型が僅かに増加した
ことを示す図
【図３】 ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣｓあるいはＣＤ３４＋細胞とＭＳＣ誘導
脂肪細胞の共存培養での１４日と２１日の全造血細胞数
【図４】 ＭＳＣｓあるいはＭＳＣ誘導脂肪細胞と共存培養されるＣＤ３４
＋細胞での異なった造血細胞表現型の数で、４ＡはＣＤ３４＋細胞表現型が１４
日に維持され２１日に２５％減少したことを示す図、４ＢはＣＤ３４＋／ＣＤ１
４＋細胞表現型が１４日と２１日にＭＳＣ誘導脂肪細胞と共存培養されたＣＤ３
４＋細胞でＭＳＣｓと共存培養されたものから得られたものよりはるかに増加し
たことを示す図、４ＣはＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋表現型が１４日と２１日にＭＳ
ＣｓとＭＳＣ誘導脂肪細胞の両方で共存培養されたＣＤ３４＋細胞で増加したこ
とを示す図
【図５】 ＣＤ３４＋細胞とＭＳＣ誘導脂肪細胞との共存培養から生じる造
血細胞で生成したコロニーの写真
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ムバラビール，ガブリエル アメリカ合衆国，21045 メリーランド， コロンビア，グレイストーン レーン 8488，アパートメント １ジー Ｆターム(参考） 4B065 AA94X CA60

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 造血幹細胞がその幹細胞表現型を維持するようにヒト間葉幹
    細胞を造血幹細胞と共存培養することよりなる試験管内でヒト造血幹細胞を維持
    することを特徴とする一つの方法。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の方法であって、ここで造血幹細胞がＣＤ３４
    ＋細胞であることを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載の方法であって、ここで間葉幹細胞集団が造血
    幹細胞集団に対し同種異系あるいは自己由来であることを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】 造血幹細胞がその幹細胞表現型を維持するように脂肪細胞を
    造血幹細胞と共存培養することよりなる試験管内でヒト造血幹細胞を維持するこ
    とを特徴とする一つの方法。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の方法であって、ここで脂肪細胞がヒト間葉幹
    細胞から誘導されることを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 請求項４記載の方法であって、ここで造血幹細胞がＣＤ３４
    ＋細胞であることを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 請求項４記載の方法であって、ここで脂肪細胞が造血幹細胞
    集団に対し同種異系あるいは自己由来であることを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】 造血幹細胞がヒト造血幹細胞とヒト間葉幹細胞よりなるその
    表現型を保持するようにヒト造血幹細胞を維持することを特徴とする一つの組成
    物。
  9. 【請求項９】 造血幹細胞がヒト造血幹細胞とヒト間葉幹細胞よりなるその
    表現型を保持するようにヒト造血幹細胞を維持することを特徴とする一つの組成
    物。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の組成物であって、ここで脂肪細胞がヒト間
    葉幹細胞から誘導されることを特徴とする組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項９記載の組成物であって、ここで造血幹細胞が遺伝
    的修飾されることを特徴とする組成物。
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