JP4014088B2 - 糖化アミノ酸の消去方法 - Google Patents
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【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケトアミンオキシダーゼを用いた遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、試薬及びキットに関する。より詳細には、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンのごとき糖化タンパク質の定量に有効な、遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、試薬及びキットに関する。本発明によると、ケトアミンオキシダーゼの消去能力を最大限に引き出すことができ、臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンA1c(HbA1c)、グリコアルブミン、フルクトサミン、1.5アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカーの測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるHbA1c、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。HbA1c、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法(HPLC法)や免疫法で測定されてきたが、最近、大量検体を迅速に処理することか可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献1〜4）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献5）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献6）を開発してきた。
【０００３】
これらの方法は、プロテアーゼにてタンパク質をアミノ酸、若しくはペプチドのレベルまで断片化し、生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドをケトアミンオキシダーゼ等のケトアミンオキシダーゼを用いて測定する。よって何らかの原因で試料中に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが混入すると測定値が異常に高値を示すことになる。本発明者らは酵素法の研究の過程で一定の割合で血中にケトアミンオキシダーゼの基質、つまり遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを高濃度に含有するものが存在することを見出し、酵素法の測定上大きな問題であることを確認した。一方これらの問題は特に高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者で頻出し、輸液により高濃度の糖及びアミノ酸が体内に補充された場合に、血中若しくは輸液バック中で遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが生成するのではないかと考えられた。
【０００４】
そこで本発明者らは糖化アミノ酸の消去系を構築することにより、より正確に糖化タンパク質を測定できることを見出し、正確に糖化タンパク質を測定する方法（特許文献7）を開発してきた。しかしながらこれらの方法は比較的低濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを消去することは可能であるが、高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが混入した場合には消去が不十分になる傾向にあった。
糖化アミノ酸の消去法に於いて、高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが混入した場合にも問題なく消去反応を行う方法についてはこれまで知られていなかった。
【０００５】
特許文献1 特開平6−46846号公報
特許文献2 特開平5-192193号公報
特許文献3 WO98/48043号公報
特許文献4 WO97/13872号公報
特許文献5 特開2001-54398号公報
特許文献6 特開2001-20449号公報
特許文献7 PCT/JP02/0072
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、糖化タンパク質をケトアミンオキシダーゼを用いて測定する場合に、血中に存在する遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する必要がある。
本発明の課題は、糖化タンパク質をケトアミンオキシダーゼを用いて測定するにあたり、効率的に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去することにある。さらに具体的には本発明の課題は、臨床生化学検査において糖化タンパク質を測定するにあたり、検体中に存在し、測定値の誤差のもととなる遊離の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを消去する方法、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを除いた検体中に存在する糖化たんぱく質の測定方法及びこれらの方法に用いられる試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明者は、如何にすれば効果的にケトアミンオキシダーゼを用いて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去できるか検討を行った。
その結果、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いることにより、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを効果的に消去出来ることを見出した。これはケトアミンオキシダーゼが糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを酸化する際に過酸化水素を生じ、その過酸化水素の分解を水素供与体が助けるものと考えられる。
【０００８】
さらに、消去反応後の反応溶液にカップラーおよびプロテアーゼを添加して、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定すると糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを正確に測定出来ることを見出した。
そして、消去の対象となる糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドがα及びε糖化物の混合物であることから、ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸若しくはε糖化アミノ酸のどちらかに特異性の高いものを用いればさらに効率的にこの消去反応を行えることを見出し本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次のとおりの遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去した試料中の糖化タンパク質より生成される糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法、これらの方法に使用する試薬及び試薬キットに関する。
すなわち、本発明は、
(1) 水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去することを特徴とする遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法。
(2) 試料に、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ試薬を混合して試料中の遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を行い、次いでカップラー及びプロテアーゼを添加して、糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定することを特徴とする糖化タンパク質の測定方法。
(3) ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸又はε糖化アミノ酸に特異性の高い酵素であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
(4) 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであることを特徴とする（２）又は（３）に記載の方法。
(5) ケトアミンオキシダーゼ及び水素供与体を含有することを特徴とする遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する試薬。
(6) 糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする（５）に記載の試薬。
(7) ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸又はε糖化アミノ酸に特異性の高い酵素であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の試薬。
(8) 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである（６）又は（７）に記載の試薬。
(9) ケトアミンオキシダーゼ及び水素供与体を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬とカップラー及びプロテアーゼを含有する試薬とを組み合わせてなることを特徴とするキット。
(10) 試薬キットが糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする（９）に記載のキット。
(11) 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである（１０）に記載のキット。
に関する。
【００１０】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる水素供与体としては、ケトアミンオキシダーゼを用いた遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する方法において、ケトアミンオキシダーゼの作用を助けるものであればいずれの水素供与体を用いても良いが、例えばトリンダー試薬を用いると良い。
水素供与体の例としては、フェノール及びその誘導体、例えば4-クロロフェノール、2,4-ジクロロフェノール、2,6-ジクロロフェノール、2,4,6-トリクロロフェノール、3,5-ジクロロ-2-ヒドロキシベンゼンスルホン酸、2,4-ジブロモフェノール、2,4,6-トリブロモフェノール、3-ヒドロキシン-2,4,6-トリヨードベンゾイル酸や、アニリン類例えば、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン(ADPS)、N-エチル-N-スルホプロピルアニリン(ALPS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン(DAPS)、N-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン(HDAPS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン(MAPS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン(TOPS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(ADOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン(ALOS)、 N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシ-4-フルオロアニリン(FDAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(TOOS)、N-スルホプロピルアニリン(HALPS)、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N-アセチルエチレンジアミン(EMAE)、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-(2-カルボキシエチル)-N-エチル-m-トルイジン(CEMB)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ)-3-ホスホプロピル-m-トルイジン(EHSPT)、N,N-ビス-(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン(TODB)、N-エチル-N-(2-サクシニルアミノエチル)-m-トルイジン(ESET)等を用いることが出来る。なかでもN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(TOOS)、 N,N-ビス-(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン(TODB)は測定の感度が高く好ましい。
【００１１】
本発明に使用しうるケトアミンオキシダーゼとしては糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに良好に作用し、過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼであればいかなる酵素を用いても良いが、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００１２】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、カンジダ（Candida ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が挙げられる。
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；PCT/JP02/0072）が知られている。
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。
【００１３】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開2001-20449号公報（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、37℃−1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義した。
【００１４】
本発明で消去の対象となる糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドは、血液、血漿、血清等の測定対象の中に含まれている遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを示しているのであり、糖化蛋白質中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドのことではない。本発明者らの検討では特に高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者血液中に高確率に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが確認されている。
【００１５】
本発明に使用し得るカップラーとしては4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)、アミノジフェニルアミン誘導体等が挙げられるがこれ以外のものを用いても良い。
【００１６】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。特に糖化タンパク質を測定する場合には、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良いが、例えばトリプシン(Tripsin)、キモトリプシン(Chymotripsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００１７】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン(Subtilisin)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase) 等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c（シグマ社製）等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(Proteinase A;シグマ社製) 等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeputidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例の１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００１８】
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法はカゼインフォリン法を用いた。活性の定義は、37℃−1分間において1μgのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
【００１９】
本発明の糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法及び試薬に於ける測定対象である糖化タンパク質としては、例えば糖化アルブミンまたは糖化ヘモグロビンが挙げられるが、測定対象となる糖化タンパク質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化タンパク質を測定しても良い。
本発明の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬については、水素供与体及びケトアミンオキシダーゼを同一試薬に含有するように組成を決定すれば良い。
【００２０】
また糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合、例えば第一試薬に水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。またアスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む目的で第１試薬の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方してもよい。
【００２１】
本発明に使用し得る水素供与体の濃度としては0.1〜500ｍMの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200ｍM、最も好ましくは1.0〜100ｍMであるがこれ以外の量を用いても良い。本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼの濃度としては0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００２２】
本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のカップラーの濃度としては0.1〜500ｍMの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200ｍM、最も好ましくは1.0〜100ｍMであるがこれ以外の量を用いても良い。同様に本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のプロテアーゼの濃度としては0.1U〜1MU/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは1U〜500KU/ml、最も好ましくは5U〜100KU/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００２３】
本発明の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて糖化アミノ酸を消去する場合には、一定量の被検液0.1〜1000μl程度に、糖化アミノ酸を消去するに十分な量の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば1.0〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。さらに被検液中の糖化タンパク質を測定するには前記の被検液と水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬に、カップラー及びプロテアーゼを含有する試薬例えば1.0〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、糖化タンパク質より生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを水素供与体とカップラーの結合によリ生じる色素の吸光度変化を測定すればよい。
【００２４】
以上のことから、本発明に於ける水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を含む糖化タンパク質測定キットとしては、水素供与体、ケトアミンオキシダーゼを含有するものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
また本発明を、電極等を用いた、過酸化水素の定量等に応用することも可能である。
さらに本発明に基づく糖化タンパク質を定量する酵素反応試薬には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００２５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
実施例１
＜ケトアミンオキシダーゼを用いた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応に於ける水素供与体添加の効果＞
＜反応液組成Ａ＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＶＩＩ（ＫＡＯＤＶＩＩ；旭化成社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ；シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
＜反応液組成Ｂ＞
反応液組成のＴＯＯＳを４−アミノアンチピリンに入れ替えたもの。
＜試料＞
糖化−Ｚ−リジン水溶液（ＦＺＬ） ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭ
糖化−バリン水溶液（ＦＶ） ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭ（糖化アミノ酸はハシバらの方法により合成、精製した。Ｈａｓｈｉｂａ Ｈ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２４：７０、１９７６）
市販のアミノ酸輸液 アミノフリード （大塚製薬社製）
（調製直後のもの、調製後３７℃−１日放置したもの。糖化アミノ酸約０．５ｍＭ含有。
糖化アミノ酸はケトアミンオキシダーゼＩＩを用いて測定した。）
乖離血清（ＨＰＬＣ法測定値１８．３％ 消去系のない酵素法６５．７％）ΔＡ＝Ａ１−Ａ０
＜反応手順＞
上記消去試薬１８０μｌおよび試料９μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）し、試料の吸光度変化を計算する（ΔＡ＝Ａ１−Ａ０）。一方、蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定し、試料のブランク引き感度を求めた（ΔＡ−ブランクΔＡ）。その結果を表１に示す。
【００２６】
参考例１
Ｒ−１ 消去試薬中のケトアミンオキシダーゼＶＩＩ（ＫＡＯＤＶＩＩ；旭化成社製）をケトアミンオキシダーゼＩＩ（ＫＡＯＤＩＩ；旭化成社製）に置き換えた以外は実施例１と同様に行った。その結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表1から分かるように、ケトアミンオキシダーゼと組み合わせるのは水素供与体のほうが、各サンプルのブランク引き感度が低く良く消去が進行している。水素供与体とケトアミンオキシダーゼを組み合わせた場合には、KAODII及びVIIのどちらを用いても、0.5mMの糖化アミノ酸が消去できていることが分かる。この効果はTOOSの代わりにTODBを用いても同様の結果であり、どのような水素供与体を用いてもよいことは明白であった。
【００２９】
一方、カップラーと組み合わせた場合には消去能は不十分ではあるがKAODVIIの方がKAODIIに比べて感度が小さく消去が進んでいる。KAODVIIはε糖化アミノ酸にしか作用しないKAODであり、KAODIIはα、ε糖化アミノ酸両方に作用するKAODである。生体内や輸液中に存在する糖化アミノ酸はα、ε糖化アミノ酸の約1：1の混合物であるから、片方に特異的に作用するKAODを用いた場合には消去する糖化アミノ酸が少なくてすむことから、消去が楽になると考えられた。α糖化アミノ酸に特異的なKAODを用いても同様に効果的に消去反応が進むとは容易に推定できる。
【００３０】
参考例２
＜糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を組み込んだ糖化アルブミンの測定試薬＞
＜反応液組成Ａ；消去系を組み込んだ試薬＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
４０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ（シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
Ｒ−３ アルブミン測定試薬 アルブミン測定キット（アルブミンＩＩ−ＨＡテストワコー； 和光純薬社製）にて測定した。
【００３１】
＜反応液組成Ｂ；消去系のない試薬＞
R-1 タンパク質分解試薬
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
5mM 4-AA (和光純薬社製)
R-2 発色試薬
150mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH8.0
0.12% TOOS(同人化学研究所社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（旭化成社製）
R-3 アルブミン測定試薬 アルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)にて測定した。
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（GAA-2000；アークレイ社製）使用
【００３２】
＜試料＞ 健常者血清５検体、患者血清（糖尿病患者・血清）５検体、乖離検体３検体
【００３３】
＜反応手順＞
上記R1試薬180μlおよび試料9μlをセルに分注し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光する(A0)。続いてR2試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光する(A1)。試料には蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定し、また試料は、検体とグリコアルブミン濃度既知の管理血清を用いて感度（感度ΔA=（A1-A0）-（A1ブランク-A0ブランク）を求め、グリコアルブミン濃度を算出した。一方アルブミンの測定はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)の用法用量に従って測定した。ＧＡ値はグリコアルブミン濃度をアルブミン濃度で除し、割合換算した。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
表２から分かるように、消去系を組み込んだ糖化アルブミン測定試薬は、健常者、患者血清の測定はもちろん、乖離検体についてもＨＰＬＣ法と同等の測定結果が得られる事が明白であった。
【００３６】
参考例３
＜糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を組み込んだ糖化ヘモグロビンの測定＞
＜反応液組成Ａ；消去系を組み込んだ試薬＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−２ 蛋白質分解試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
８０００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプＸＩＶ；シグマ社製）
Ｒ−３ 糖化アミノ酸定量試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２４Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
【００３７】
＜反応液組成Ｂ；消去系のない試薬＞
反応液組成Ａ R-1 消去試薬からケトアミンオキシダーゼを除いた試薬を、消去系のない試薬；反応液組成Ｂとした。
【００３８】
＜試料＞ ヘモグロビン（シグマ社製）50mg/ml(HbA1c値 4.5％；HbA1c測定装置；アークレイ社製)及びヘモグロビン（シグマ社製）にFZL、250μMを添加した試料
【００３９】
＜反応手順＞
上記R1試薬0.9mlおよび試料90μlを混合し、37℃10分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過した。ろ液800μl にR2試薬0.9mlを混合し、37℃−2時間反応させ、分子量1万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液189μlをセルに分注し555nmを測光し(A0)、続いてR3試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光した(A1)。ブランクの測定は、一方、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定した。試料に検体及び糖化ヘモグロビン濃度既知の試料を用いてブランク引き感度（A1-A0）-ブランクΔAを求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。糖化ヘモグロビン値は糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除して算出した。
その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３から分かるように、消去系を組み込んだ糖化ヘモグロビン測定試薬は、ＦＺＬ添加の有無に係わらず同じ測定結果が得られる事が明白であった。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケトアミンオキシダーゼを用いた遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、試薬及びキットに関する。より詳細には、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンのごとき糖化タンパク質の定量に有効な、遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、試薬及びキットに関する。本発明によると、ケトアミンオキシダーゼの消去能力を最大限に引き出すことができ、臨床検査の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンA1c(HbA1c)、グリコアルブミン、フルクトサミン、1.5アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカーの測定の需要が増加している。なかでもタンパク質中の糖化タンパク質割合で示されるHbA1c、グリコアルブミンは、個人差が少なく、タンパク質濃度の影響を受けないことから、多用されている。HbA1c、グリコアルブミンはこれまで高速液体クロマトグラフ法(HPLC法)や免疫法で測定されてきたが、最近、大量検体を迅速に処理することか可能であり、かつ正確な酵素法が開発されてきた（特許文献1〜4）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を測定する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特許文献5）、糖化タンパク質割合の測定方法（特許文献6）を開発してきた。
【０００３】
これらの方法は、プロテアーゼにてタンパク質をアミノ酸、若しくはペプチドのレベルまで断片化し、生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドをケトアミンオキシダーゼ等のケトアミンオキシダーゼを用いて測定する。よって何らかの原因で試料中に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが混入すると測定値が異常に高値を示すことになる。本発明者らは酵素法の研究の過程で一定の割合で血中にケトアミンオキシダーゼの基質、つまり遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを高濃度に含有するものが存在することを見出し、酵素法の測定上大きな問題であることを確認した。一方これらの問題は特に高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者で頻出し、輸液により高濃度の糖及びアミノ酸が体内に補充された場合に、血中若しくは輸液バック中で遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが生成するのではないかと考えられた。
【０００４】
そこで本発明者らは糖化アミノ酸の消去系を構築することにより、より正確に糖化タンパク質を測定できることを見出し、正確に糖化タンパク質を測定する方法（特許文献7）を開発してきた。しかしながらこれらの方法は比較的低濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを消去することは可能であるが、高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが混入した場合には消去が不十分になる傾向にあった。
糖化アミノ酸の消去法に於いて、高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドが混入した場合にも問題なく消去反応を行う方法についてはこれまで知られていなかった。
【０００５】
特許文献1 特開平6−46846号公報
特許文献2 特開平5-192193号公報
特許文献3 WO98/48043号公報
特許文献4 WO97/13872号公報
特許文献5 特開2001-54398号公報
特許文献6 特開2001-20449号公報
特許文献7 PCT/JP02/0072
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、糖化タンパク質をケトアミンオキシダーゼを用いて測定する場合に、血中に存在する遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する必要がある。
本発明の課題は、糖化タンパク質をケトアミンオキシダーゼを用いて測定するにあたり、効率的に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去することにある。さらに具体的には本発明の課題は、臨床生化学検査において糖化タンパク質を測定するにあたり、検体中に存在し、測定値の誤差のもととなる遊離の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを消去する方法、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを除いた検体中に存在する糖化たんぱく質の測定方法及びこれらの方法に用いられる試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明者は、如何にすれば効果的にケトアミンオキシダーゼを用いて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去できるか検討を行った。
その結果、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いることにより、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを効果的に消去出来ることを見出した。これはケトアミンオキシダーゼが糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを酸化する際に過酸化水素を生じ、その過酸化水素の分解を水素供与体が助けるものと考えられる。
【０００８】
さらに、消去反応後の反応溶液にカップラーおよびプロテアーゼを添加して、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定すると糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを正確に測定出来ることを見出した。
そして、消去の対象となる糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドがα及びε糖化物の混合物であることから、ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸若しくはε糖化アミノ酸のどちらかに特異性の高いものを用いればさらに効率的にこの消去反応を行えることを見出し本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次のとおりの遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去した試料中の糖化タンパク質より生成される糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法、これらの方法に使用する試薬及び試薬キットに関する。
すなわち、本発明は、
(1) 水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去することを特徴とする遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去方法。
(2) 試料に、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ試薬を混合して試料中の遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を行い、次いでカップラー及びプロテアーゼを添加して、糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定することを特徴とする糖化タンパク質の測定方法。
(3) ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸又はε糖化アミノ酸に特異性の高い酵素であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
(4) 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであることを特徴とする（２）又は（３）に記載の方法。
(5) ケトアミンオキシダーゼ及び水素供与体を含有することを特徴とする遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する試薬。
(6) 糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする（５）に記載の試薬。
(7) ケトアミンオキシダーゼが、α糖化アミノ酸又はε糖化アミノ酸に特異性の高い酵素であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の試薬。
(8) 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである（６）又は（７）に記載の試薬。
(9) ケトアミンオキシダーゼ及び水素供与体を含有するケトアミンオキシダーゼ含有試薬とカップラー及びプロテアーゼを含有する試薬とを組み合わせてなることを特徴とするキット。
(10) 試薬キットが糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする（９）に記載のキット。
(11) 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである（１０）に記載のキット。
に関する。
【００１０】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる水素供与体としては、ケトアミンオキシダーゼを用いた遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する方法において、ケトアミンオキシダーゼの作用を助けるものであればいずれの水素供与体を用いても良いが、例えばトリンダー試薬を用いると良い。
水素供与体の例としては、フェノール及びその誘導体、例えば4-クロロフェノール、2,4-ジクロロフェノール、2,6-ジクロロフェノール、2,4,6-トリクロロフェノール、3,5-ジクロロ-2-ヒドロキシベンゼンスルホン酸、2,4-ジブロモフェノール、2,4,6-トリブロモフェノール、3-ヒドロキシン-2,4,6-トリヨードベンゾイル酸や、アニリン類例えば、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン(ADPS)、N-エチル-N-スルホプロピルアニリン(ALPS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン(DAPS)、N-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン(HDAPS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン(MAPS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン(TOPS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(ADOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン(ALOS)、 N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシ-4-フルオロアニリン(FDAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(TOOS)、N-スルホプロピルアニリン(HALPS)、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N-アセチルエチレンジアミン(EMAE)、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-(2-カルボキシエチル)-N-エチル-m-トルイジン(CEMB)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ)-3-ホスホプロピル-m-トルイジン(EHSPT)、N,N-ビス-(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン(TODB)、N-エチル-N-(2-サクシニルアミノエチル)-m-トルイジン(ESET)等を用いることが出来る。なかでもN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン(TOOS)、 N,N-ビス-(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン(TODB)は測定の感度が高く好ましい。
【００１１】
本発明に使用しうるケトアミンオキシダーゼとしては糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに良好に作用し、過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼであればいかなる酵素を用いても良いが、糖化アルブミンを測定対象とする場合には、εアミノ基が糖化されたε糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、αアミノ基が糖化されたα糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましい。
【００１２】
εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、カンジダ（Candida ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素及びコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が挙げられる。
また、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が知られている。一方εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しない酵素としては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；PCT/JP02/0072）が知られている。
さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。
【００１３】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開2001-20449号公報（糖化タンパク質割合測定方法）記載の方法にて測定し、37℃−1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義した。
【００１４】
本発明で消去の対象となる糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドは、血液、血漿、血清等の測定対象の中に含まれている遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを示しているのであり、糖化蛋白質中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドのことではない。本発明者らの検討では特に高カロリーアミノ酸輸液を受けている患者血液中に高確率に遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが確認されている。
【００１５】
本発明に使用し得るカップラーとしては4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)、アミノジフェニルアミン誘導体等が挙げられるがこれ以外のものを用いても良い。
【００１６】
本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。特に糖化タンパク質を測定する場合には、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良いが、例えばトリプシン(Tripsin)、キモトリプシン(Chymotripsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００１７】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン(Subtilisin)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase) 等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c（シグマ社製）等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(Proteinase A;シグマ社製) 等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeputidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例の１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【００１８】
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法はカゼインフォリン法を用いた。活性の定義は、37℃−1分間において1μgのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
【００１９】
本発明の糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法及び試薬に於ける測定対象である糖化タンパク質としては、例えば糖化アルブミンまたは糖化ヘモグロビンが挙げられるが、測定対象となる糖化タンパク質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化タンパク質を測定しても良い。
本発明の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬については、水素供与体及びケトアミンオキシダーゼを同一試薬に含有するように組成を決定すれば良い。
【００２０】
また糖化アミノ酸を消去した後に糖化タンパク質を測定する場合、例えば第一試薬に水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用い、第二試薬にプロテアーゼ及びカップラーを処方すれば良い。またアスコルビン酸、過酸化水素の消去系を組み込む目的で第１試薬の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬に例えばアスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等を処方してもよい。
【００２１】
本発明に使用し得る水素供与体の濃度としては0.1〜500ｍMの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200ｍM、最も好ましくは1.0〜100ｍMであるがこれ以外の量を用いても良い。本発明に使用し得るケトアミンオキシダーゼの濃度としては0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００２２】
本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のカップラーの濃度としては0.1〜500ｍMの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200ｍM、最も好ましくは1.0〜100ｍMであるがこれ以外の量を用いても良い。同様に本発明を用いて糖化タンパク質を測定する場合のプロテアーゼの濃度としては0.1U〜1MU/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは1U〜500KU/ml、最も好ましくは5U〜100KU/mlであるがこれ以外の量を用いても良い。
【００２３】
本発明の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を用いて糖化アミノ酸を消去する場合には、一定量の被検液0.1〜1000μl程度に、糖化アミノ酸を消去するに十分な量の水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、例えば1.0〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、これ以外の量や時間を選択しても良い。さらに被検液中の糖化タンパク質を測定するには前記の被検液と水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬に、カップラー及びプロテアーゼを含有する試薬例えば1.0〜5000μl程度を1〜60分程度作用させれば良く、糖化タンパク質より生じた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを水素供与体とカップラーの結合によリ生じる色素の吸光度変化を測定すればよい。
【００２４】
以上のことから、本発明に於ける水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬、水素供与体を共存させたケトアミンオキシダーゼ含有試薬を含む糖化タンパク質測定キットとしては、水素供与体、ケトアミンオキシダーゼを含有するものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
また本発明を、電極等を用いた、過酸化水素の定量等に応用することも可能である。
さらに本発明に基づく糖化タンパク質を定量する酵素反応試薬には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００２５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
実施例１
＜ケトアミンオキシダーゼを用いた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応に於ける水素供与体添加の効果＞
＜反応液組成Ａ＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
１．３ｍＭ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＶＩＩ（ＫＡＯＤＶＩＩ；旭化成社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
４０００Ｕ／ｍｌ バチルス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ；シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
＜反応液組成Ｂ＞
反応液組成のＴＯＯＳを４−アミノアンチピリンに入れ替えたもの。
＜試料＞
糖化−Ｚ−リジン水溶液（ＦＺＬ） ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭ
糖化−バリン水溶液（ＦＶ） ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭ（糖化アミノ酸はハシバらの方法により合成、精製した。Ｈａｓｈｉｂａ Ｈ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２４：７０、１９７６）
市販のアミノ酸輸液 アミノフリード （大塚製薬社製）
（調製直後のもの、調製後３７℃−１日放置したもの。糖化アミノ酸約０．５ｍＭ含有。
糖化アミノ酸はケトアミンオキシダーゼＩＩを用いて測定した。）
乖離血清（ＨＰＬＣ法測定値１８．３％ 消去系のない酵素法６５．７％）ΔＡ＝Ａ１−Ａ０
＜反応手順＞
上記消去試薬１８０μｌおよび試料９μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）し、試料の吸光度変化を計算する（ΔＡ＝Ａ１−Ａ０）。一方、蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定し、試料のブランク引き感度を求めた（ΔＡ−ブランクΔＡ）。その結果を表１に示す。
【００２６】
参考例１
Ｒ−１ 消去試薬中のケトアミンオキシダーゼＶＩＩ（ＫＡＯＤＶＩＩ；旭化成社製）をケトアミンオキシダーゼＩＩ（ＫＡＯＤＩＩ；旭化成社製）に置き換えた以外は実施例１と同様に行った。その結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
表1から分かるように、ケトアミンオキシダーゼと組み合わせるのは水素供与体のほうが、各サンプルのブランク引き感度が低く良く消去が進行している。水素供与体とケトアミンオキシダーゼを組み合わせた場合には、KAODII及びVIIのどちらを用いても、0.5mMの糖化アミノ酸が消去できていることが分かる。この効果はTOOSの代わりにTODBを用いても同様の結果であり、どのような水素供与体を用いてもよいことは明白であった。
【００２９】
一方、カップラーと組み合わせた場合には消去能は不十分ではあるがKAODVIIの方がKAODIIに比べて感度が小さく消去が進んでいる。KAODVIIはε糖化アミノ酸にしか作用しないKAODであり、KAODIIはα、ε糖化アミノ酸両方に作用するKAODである。生体内や輸液中に存在する糖化アミノ酸はα、ε糖化アミノ酸の約1：1の混合物であるから、片方に特異的に作用するKAODを用いた場合には消去する糖化アミノ酸が少なくてすむことから、消去が楽になると考えられた。α糖化アミノ酸に特異的なKAODを用いても同様に効果的に消去反応が進むとは容易に推定できる。
【００３０】
参考例２
＜糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を組み込んだ糖化アルブミンの測定試薬＞
＜反応液組成Ａ；消去系を組み込んだ試薬＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
１０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−２ 発色試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
４０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ（シグマ社製）
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
Ｒ−３ アルブミン測定試薬 アルブミン測定キット（アルブミンＩＩ−ＨＡテストワコー； 和光純薬社製）にて測定した。
【００３１】
＜反応液組成Ｂ；消去系のない試薬＞
R-1 タンパク質分解試薬
30mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
4000U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
5mM 4-AA (和光純薬社製)
R-2 発色試薬
150mM トリス緩衝液（和光純薬社製）pH8.0
0.12% TOOS(同人化学研究所社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
10U/ml ケトアミンオキシダーゼII（旭化成社製）
R-3 アルブミン測定試薬 アルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)にて測定した。
＜ＨＰＬＣ法＞
グリコアルブミン計（GAA-2000；アークレイ社製）使用
【００３２】
＜試料＞ 健常者血清５検体、患者血清（糖尿病患者・血清）５検体、乖離検体３検体
【００３３】
＜反応手順＞
上記R1試薬180μlおよび試料9μlをセルに分注し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光する(A0)。続いてR2試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光する(A1)。試料には蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定し、また試料は、検体とグリコアルブミン濃度既知の管理血清を用いて感度（感度ΔA=（A1-A0）-（A1ブランク-A0ブランク）を求め、グリコアルブミン濃度を算出した。一方アルブミンの測定はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)の用法用量に従って測定した。ＧＡ値はグリコアルブミン濃度をアルブミン濃度で除し、割合換算した。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
表２から分かるように、消去系を組み込んだ糖化アルブミン測定試薬は、健常者、患者血清の測定はもちろん、乖離検体についてもＨＰＬＣ法と同等の測定結果が得られる事が明白であった。
【００３６】
参考例３
＜糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの消去反応を組み込んだ糖化ヘモグロビンの測定＞
＜反応液組成Ａ；消去系を組み込んだ試薬＞
Ｒ−１ 消去試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２０Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
Ｒ−２ 蛋白質分解試薬
３０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
８０００Ｕ／ｍｌ ストレプトマイセス属由来プロテアーゼ（プロテアーゼタイプＸＩＶ；シグマ社製）
Ｒ−３ 糖化アミノ酸定量試薬
１５０ｍＭ トリス緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．０
５ｍＭ ４−ＡＡ （和光純薬社製）
０．１２％ ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２４Ｕ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼＩＩ（旭化成社製）
２０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ（シグマ社製）
【００３７】
＜反応液組成Ｂ；消去系のない試薬＞
反応液組成Ａ R-1 消去試薬からケトアミンオキシダーゼを除いた試薬を、消去系のない試薬；反応液組成Ｂとした。
【００３８】
＜試料＞ ヘモグロビン（シグマ社製）50mg/ml(HbA1c値 4.5％；HbA1c測定装置；アークレイ社製)及びヘモグロビン（シグマ社製）にFZL、250μMを添加した試料
【００３９】
＜反応手順＞
上記R1試薬0.9mlおよび試料90μlを混合し、37℃10分反応を行う。続いて、分子量１万カットの膜で濾過した。ろ液800μl にR2試薬0.9mlを混合し、37℃−2時間反応させ、分子量1万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液189μlをセルに分注し555nmを測光し(A0)、続いてR3試薬180μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光した(A1)。ブランクの測定は、一方、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔA=A1ブランク-A0ブランク）を測定した。試料に検体及び糖化ヘモグロビン濃度既知の試料を用いてブランク引き感度（A1-A0）-ブランクΔAを求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。糖化ヘモグロビン値は糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除して算出した。
その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
表３から分かるように、消去系を組み込んだ糖化ヘモグロビン測定試薬は、ＦＺＬ添加の有無に係わらず同じ測定結果が得られる事が明白であった。
Claims (4)
- 高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを含む試料における、試料中の糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）α糖化アミノ酸、ε糖化アミノ酸及び糖化タンパク質を含有する試料に、水素供与体を共存させたα糖化アミノ酸若しくはε糖化アミノ酸のどちらかに特異性の高いケトアミンオキシダーゼ試薬を混合して試料中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去する工程
（２）上記（１）の工程に次いで、カップラー及びプロテアーゼを添加して、糖化タンパク質より糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドが生成する工程
（３）上記（２）の工程により生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドに（１）の工程で用いたケトアミンオキシダーゼが作用する工程 - 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 高濃度の遊離の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチド及び糖化タンパク質を含む試料における、試料中の糖化タンパク質より生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを測定するためのキットであって、
以下の第一試薬と第二試薬とを順番に試料に作用させることを特徴とするキット。
（第一試薬）
試料中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを消去するための、以下（i）、（ii）を含有する試薬。
（i）水素供与体
（ii）α糖化アミノ酸若しくはε糖化アミノ酸のどちらかに特異性の高いケトアミンオキシダーゼ
（第二試薬）
以下（iii）、（iv）を含有する試薬。
（iii）カップラー
（iv）プロテアーゼ - 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンである請求項３に記載のキット。
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