TW201312118A

TW201312118A - 糖化血紅素測量用多層試驗片、及使用它之測量方法

Info

Publication number: TW201312118A
Application number: TW101105835A
Authority: TW
Inventors: Jun Okamoto; Akira Tsukamoto; Masahiko Nakamori
Original assignee: Toyo Boseki
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2013-03-16
Also published as: CN202903668U; JP2013074877A; CN102994378A; WO2013038736A1; JP5440633B2

Abstract

本發明提供一種不易受可能存在於待測試樣中但非由糖化血紅素而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響且保存穩定性優異的用於對糖化血紅素含量進行比色定量的多層試驗片以及測定方法。一種用於對糖化血紅素含量進行比色定量的多層試驗片，其至少積層有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序積層，而且，該多層試驗片不具有血液分離層。(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材；(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材。

Description

糖化血紅素測量用多層試驗片、及使用它之測量方法

本發明涉及一種用於在診斷現場正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅素含量進行比色定量的多層試驗片以及測量方法。

測量糖化蛋白質在進行糖尿病的診斷、預防以及治療方面非常重要。糖化蛋白質通過在生物體內葡萄糖與血中蛋白質的胺基(主要是末端胺基酸的α-胺基、賴胺酸殘基的γ-胺基)發生非酶促反應而生成。由於蛋白質糖化的程度直接與血中葡萄糖濃度(以下稱為血糖值)成比例，因此，例如，糖化血紅素的情況下，通過測量糖化蛋白質可以掌握約2～3個月內的血糖控制狀態，糖化白蛋白的情況下，通過測量糖化蛋白質可以掌握約2～3周內的血糖控制狀態。

尤其是作為糖化血紅素的一種的血紅素A1c在糖尿病的診斷時被認為是最重要的。

作為上述糖化蛋白質的測量方法，已知有高效液相色譜(HPLC)法、免疫法以及酶法等。在現有技術中，高效液相色譜(HPLC)法以及免疫法佔據大部分，但是近年來由於酶法可以迅速、大量、正確且廉價地對大量樣本進行測量，因此也開始被頻繁採用。

有關酶法，例如已知有通過以下的步驟對糖化蛋白質進行比色定量的技術(例如，參照專利文獻1～4)。

(1)使待測試樣中的紅細胞溶血以提取出糖化血紅素的步驟。

(2)使上述糖化血紅素與蛋白酶反應從而從糖化血紅素的糖化的β鏈N末端切出糖化胺基酸和/或糖化肽的步驟。

(3)使上述糖化胺基酸和/或糖化肽與糖化胺基酸氧化酶反應從而生成過氧化氫的步驟。

(4)在過氧化酶的存在下使上述過氧化氫與氧化還原系顯色試劑反應而顯色的步驟。

(5)根據上述顯色對待測試樣中的糖化血紅素含量進行比色定量的步驟。

但是，所涉及的現有技術由於受到可能存在於待測試樣中但非來自作為測量對象的糖化蛋白質的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響，存在表觀測量值增加的問題

另一方面，為解決上述問題，發明了測量糖化蛋白質含量的方法(例如專利文獻5～9)，該方法的特徵在於包括前處理步驟，即，在用蛋白酶處理糖化蛋白質之前，通過使糖化胺基酸氧化酶作用於上述可能存在於待測試樣中但非由糖化蛋白質而來的糖化胺基酸和/或糖化肽，從而對上述糖化胺基酸和/或糖化肽進行分解處理。

但是，所涉及的現有技術是稀釋待測試樣、添加液體狀態的試劑、使之在反應容器內發生反應後測量反應液的吸光度的方法，以使用生物化學自動分析裝置的方法為主流。但是所述生物化學自動分析裝置存在是大型裝置且價格昂貴、需要熟練的檢測技師來操作、從採血到出報告結果為止的時間較長這些問題，難以適用於POCT(point of care testing(即，臨床現場即時檢查))。

[現有技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：國際公開第2002-006519號

專利文獻2：日本特開2004-222570號公報

專利文獻3：日本特開2007-181466號公報

專利文獻4：日本特開2010-148515號公報

專利文獻5：日本特開2007-289202號公報

專利文獻6：日本特開2010-104386號公報

專利文獻7：日本特開2010-110333號公報

專利文獻8：日本特開2010-252814號公報

專利文獻9：日本特開2010-263921號公報

非專利文獻

非專利文獻1：Clinical Chemistry 43：12 2390-2396(1997)

本發明是以有關現有技術的技術問題為背景進行的。即，本發明的目的為提供一種用於在診斷現場正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅素含量進行比色定量的多層試驗片以及測量方法。更具體而言，本發明的目的在於提供一種不易受可能存在於待測試樣中但非由糖化蛋白質而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響、且保存穩定性優異的用於對糖化血紅素含量進行比色定量的多層試驗片以及測定方法。

本申請發明人發現，通過將糖化胺基酸氧化酶承載在比蛋白酶更靠近待測試樣點樣面的層上，從而在糖化血紅素被蛋白酶切斷之前，使糖化胺基酸氧化酶作用於可能存在於待測試樣中但非由糖化蛋白質而來的糖化胺基酸和/或糖化肽，從而能夠對上述糖化胺基酸和/或糖化肽進行分解處理。

還發現了當將蛋白酶與糖化胺基酸氧化酶承載在相同層時，在保存中發生由蛋白酶引起的糖化胺基酸氧化酶失活和/或分解，從而導致保存穩定性顯著降低。

另外還發現，當將過氧化酶與氧化還原系顯色試劑承載在相同層時，在保存中發生由過氧化酶引起的氧化還原系顯色試劑的自顯色，從而導致保存穩定性顯著降低。由於與葡萄糖濃度等相比，待測試樣中的糖化血紅素濃度一般為低濃度，因此在測量糖化血紅素時較佳係使用高靈敏度的無色色素，但無色色素特別不穩定，容易發生自顯色。

因而本申請發明人將蛋白酶與糖化胺基酸氧化酶承載在不同層上，並且將糖化胺基酸氧化酶承載在比蛋白酶更靠近待測試樣點樣面的層上。由此發現，不容易受可能存在於待測試樣中但非由糖化血紅素而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響，同時糖化胺基酸氧化酶的保存穩定性也顯著提高，從而完成了本發明。此外，通過將過氧化酶與氧化還原系顯色試劑分別承載在不同層上，使提高氧化還原系顯色試劑的保存穩定性同時獲得成功，從而完成了本發明。

即，本發明具有以下構成要素。

1、一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：該多層試驗片至少積層有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序積層，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材，(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材。

2、一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序積層，在(a)層和(b)層中的不同的層上分別承載過氧化酶和氧化還原系顯色試劑，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材，(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材。

3、根據1或2所述的多層試驗片，其特徵在於：所述多層試驗片在(a)層和(b)中的至少一層上還承載有界面活性劑。

4、一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層、(b)層與(c)層，所述(a)層、(b)層與(c)層從待測試樣點樣面按(a)層和(b)層及(c)層、(a)層和(c)層及(b)層或(c)層和(a)層及(b)層的順序積層，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材，(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材，(c)層：至少承載有除蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。

5、一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層、(b)層與(c)層，所述(a)層、(b)層與(c)層從待測試樣點樣面按(a)層和(b)層及(c)層、(a)層和(c)層及(b)層或(c)層和(a)層及(b)層的順序積層，在(a)層、(b)層與(c)層中的不同的層上分別承載過氧化酶和氧化還原系顯色試劑，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材，(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材，(c)層：至少承載有除蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。

6、根據4或5所述的多層試驗片，其特徵在於：所述多層試驗片在(a)層、(b)層與(c)層中的至少一層上還承載有界面活性劑。

7、根據1至6中任一項所述的多層試驗片，其特徵在於：蛋白酶是選自至少由來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶組成的組中的一種以上。

8、根據1至7中任一項所述的多層試驗片，其特徵在於：氧化還原系顯色試劑是最大吸收波長為600nm～800nm的無色色素。

9、根據1至8中任一項所述的多層試驗片，其特徵在於：界面活性劑是親水親油平衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value：HLB Value)為10～20的非離子性界面活性劑。

10、一種測量方法，其特徵在於：所述測量方法使用1至9中任一項所述的多層試驗片，至少經過以下步驟(i)～(iii)對糖化血紅素含量進行比色定量，步驟(i)：在上述多層試驗片上表面上點樣待測試樣的步驟；步驟(ii)：從與上述多層試驗片的待測試樣點樣面相反的面利用反射光測量反射率和/或吸光度的步驟；以及步驟(iii)：從所得的反射率和/或吸光度計算出選自由血紅素含量、糖化血紅素含量、糖化血紅素含量與血紅素含量的比所組成的組中的一個以上的步驟。

11、根據10的測量方法，其特徵在於：待測試樣為全血樣本。

根據本發明，能夠提供一種不易受可能存在於待測試樣中但非由糖化血紅素而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響且保存穩定性優異的用於對糖化血紅素含量進行比色定量的多層試驗片。

[具體實施方式]

以下，對本發明進行詳細闡述。

(測量物件物)

本發明的測量物件物是糖化血紅素，從糖尿病診斷應用的觀點而言，較佳係血紅素的β鏈N末端被糖化的血紅素A1c(以下有時也稱為HbA1c)。此外，來自作為待測對象物的糖化血紅素的糖化胺基酸和/或糖化肽有時也稱為待測對象糖化物，而並非來自作為待測對象物的糖化血紅素的糖化胺基酸和/或糖化肽有時也稱為非待測物件糖化物。

(待測試樣)

作為本發明的待測試樣，可以列舉出全血、血細胞、血漿、血清、髓液、汗、尿、淚液、唾液、皮膚、粘膜、毛髮等生物體試樣(即從生物體上採取的試樣)或飲料水、調料等食品類。另外，生物體試樣不僅限於來自人體，來自狗、貓、牛等哺乳類動物的生物體試樣也是物件。其中，從糖尿病診斷應用的觀點而言，較佳係全血或血細胞，從POCT的觀點而言，更佳係未進行血細胞/血漿或血清分離前處理的全血。

本發明中待測試樣的量沒有特別限定，例如較佳為1μL～50μL，更佳為1μL～40μL，進一步較佳為1μL～30μL。如果待測試樣量少於1μL，則恐怕無法從多層試驗片的最上層展開到最下層。另一方面，如果待測試樣量多於50μL，則例如待測試樣為血液時，由於患者的負擔變大，因而不佳。

(測量原理)

本發明中糖化血紅素的測量原理是通過所謂的酶比色法進行測量，在該方法中，借助待測試樣中的水分進行酶促反應(所謂的乾式化學處理法)，從而使多層試驗片顯色，然後通過測量反射光來測量其顯色程度。通過使用上述測量原理，裝置的小型、輕量、低價格化成為可能。另外，正確、簡便且迅速的測量成為可能。

以下，對測量紅細胞中的糖化血紅素含量時的反應進行說明，但這並不構成對本發明的任何限制。

(1)使待測試樣中的紅細胞與界面活性劑反應、使之溶血以提取出糖化血紅素的步驟。

(2)使非待測物件糖化物與糖化胺基酸氧化酶反應從而降低非待測物件糖化物的影響的步驟。

(3)使上述糖化血紅素與蛋白酶反應從而從糖化血紅素的糖化的β鏈N末端切出待測對象糖化物的步驟。

(4)使上述待測物件糖化物與糖化胺基酸氧化酶反應從而生成過氧化氫的步驟。

(5)在過氧化酶的存在下使上述過氧化氫與氧化還原系顯色試劑反應而顯色的步驟。

(6)根據上述顯色對待測試樣中的糖化血紅素含量進行比色定量的步驟。

(多層試驗片)

本發明的多層試驗片由多個高分子基材(以下有時也稱為層)構成。上述多層試驗片的層數可以根據實施方式而變化，較佳為2～7層，更佳為2～6層，進一步較佳為2～5層。另外，除了本發明所需要的承載有試劑(界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑等)的高分子基材外，層數中還包括用於展開血液的展開層或透明支撐層等。層數為1層時，蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶不得不承載在同一層上，難以進行用於降低非待測對象糖化物的影響的步驟。另外，層數為一層時，蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶以及過氧化酶和氧化還原系顯色試劑等不得不承載在同一層，恐怕會產生由蛋白酶引起的糖化胺基酸氧化酶的失活、分解或氧化還原系顯色試劑的自顯色。即，多層試驗片的保存穩定性恐怕會顯著降低。另一方面，層數多於7層時，由於從最上層到最下層展開所需的待測試樣量變多，因而不佳。

上述多層試驗片可以採用任意的步驟製作而成。代表性地，可以採用將多個層分別浸漬在一種以上的試劑溶液中後再乾燥的慣用步驟來製作多個層，然後組裝成最終的試驗片。

上述多層試驗片的特徵為不含有血液分離層。另外，血液分離層是指用於通過從全血過濾血細胞而得到血漿或血清的層。本發明的測量對象物不是血漿或血清中所含的糖化白蛋白，而是血細胞中所含的糖化血紅素，因此，將血細胞過濾之後則無法測量。

(層結構)

上述多層試驗片的層結構需要將蛋白酶承載在比糖化胺基酸氧化酶更靠近待測試樣點樣面的層(以下，有時也稱為上層)上。當將糖化胺基酸氧化酶承載在比蛋白酶更遠離待測試樣點樣面的層(以下，有時也稱為下層)上時，不可能進行用於降低非待測物件糖化物的影響的步驟。

另外，上述多層試驗片的層結構需要將蛋白酶與糖化胺基酸氧化酶分別承載在不同的層上，進一步較佳係將過氧化酶和氧化還原系顯色試劑分別承載在不同層上。當將蛋白酶與糖化胺基酸氧化酶承載在相同層時，恐怕會發生由蛋白酶引起的糖化胺基酸氧化酶的失活、分解，當將過氧化酶與氧化還原系顯色試劑承載在相同層時，恐怕會發生氧化還原系顯色試劑的自顯色。即，多層試驗片的保存穩定性恐怕會顯著降低。以下示出層結構的具體例子，但這並不構成對本發明的任何限制。

當設上述多層試驗片的第一層側為待測試樣點樣面、第二層側為反射光測量面時，可以列舉出糖化胺基酸氧化酶承載在比蛋白酶更上層的以下結構。

1、第一層：糖化胺基酸氧化酶；以及第二層：蛋白酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑。

2、第一層：糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶；以及第二層：蛋白酶、氧化還原系顯色試劑。

3、第一層：糖化胺基酸氧化酶、氧化還原系顯色試劑；以及第二層：蛋白酶、過氧化酶。

4、第一層：糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑；以及第二層：蛋白酶。

其中，更佳係將過氧化酶與氧化還原系顯色試劑分別承載在不同層的以下結構。

2、第一層：糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶；第二層：蛋白酶、氧化還原系顯色試劑。

3、第一層：糖化胺基酸氧化酶、氧化還原系顯色試劑；第二層：蛋白酶、過氧化酶。

進一步較佳係將氧化還原系顯色試劑承載在反射光測量面(第二層)上的、可以期待進行高靈敏度的測量的以下結構。

當設上述多層試驗片的第一層側為待測試樣點樣面、第三層側為反射光測量面時，可以列舉出糖化胺基酸氧化酶承載在比蛋白酶更上層的以下結構。

1、第一層：糖化胺基酸氧化酶；第二層：蛋白酶；以及第三層：過氧化酶、氧化還原系顯色試劑。

2、第一層：糖化胺基酸氧化酶；第二層：過氧化酶；以及第三層：蛋白酶、氧化還原系顯色試劑。

3、第一層：糖化胺基酸氧化酶；第二層：氧化還原系顯色試劑；以及第三層：蛋白酶、過氧化酶。

4、第一層：過氧化酶；第二層：糖化胺基酸氧化酶；以及第三層：蛋白酶、氧化還原系顯色試劑。

5、第一層：氧化還原系顯色試劑；第二層：糖化胺基酸氧化酶；以及第三層：蛋白酶、過氧化酶。

6、第一層：糖化胺基酸氧化酶；第二層：蛋白酶、過氧化酶；以及第三層：氧化還原系顯色試劑。

7、第一層：糖化胺基酸氧化酶；第二層：蛋白酶、氧化還原系顯色試劑；以及第三層：過氧化酶。

8、第一層：糖化胺基酸氧化酶；第二層：過氧化酶、氧化還原系顯色試劑；以及第三層：蛋白酶。

9、第一層：過氧化酶；第二層：糖化胺基酸氧化酶、氧化還原系顯色試劑；以及第三層：蛋白酶。

10、第一層：氧化還原系顯色試劑；第二層：糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶；以及第三層：蛋白酶。

11、第一層：糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶；第二層：蛋白酶；以及第三層：氧化還原系顯色試劑。

12、第一層：糖化胺基酸氧化酶、氧化還原系顯色試劑；第二層：蛋白酶；以及第三層：過氧化酶。

13、第一層：糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶；第二層：氧化還原系顯色試劑；以及第三層：蛋白酶。

14、第一層：糖化胺基酸氧化酶、氧化還原系顯色試劑；第二層：過氧化酶；以及第三層：蛋白酶。

15、第一層：過氧化酶、氧化還原系顯色試劑；第二層：糖化胺基酸氧化酶；以及第三層：蛋白酶。

其中，更佳係將過氧化酶與氧化還原系顯色試劑分別承載在不同層上的以下結構。

進一步較佳係將氧化還原系顯色試劑承載在反射光測量面(第三層)上的、可以期待進行高靈敏度的測量的以下結構。

較佳係上述各層(第一層、第二層、第三層)中的至少一層進一步承載有界面活性劑。另外，只要蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶以及過氧化酶和氧化還原系顯色試劑不存在於同一層，則上述試劑(界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑等)可以重複承載於各層(第一層、第二層、第三層)。此外，根據需要各層可以承載有緩衝劑。

(高分子基材)

作為構成本發明的多層試驗片的高分子基材，只要能夠承載所需量的上述試劑(界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑等)，並且待測試樣能夠在水準方向以及豎直方向適當地展開，則可以使用任何形態、組成的材料。以下示出高分子基材的形態、組成的具體例子，但這並不構成對本發明的任何限制。

(形態)

作為上述高分子基材的形態，可以列舉出濾紙、纖維結構體、多孔質膜(膜篩檢程式)、薄膜等可以自支撐的材料或高分子凝膠等不能自支撐的材料。另外，使用高分子凝膠等不能自支撐的材料時，較佳係設置濾紙、纖維結構體、多孔質膜(膜篩檢程式)、薄膜等可以自支撐的材料作為支撐體。

(組成)

作為上述高分子基材的組成，可以列舉出：作為聚酯樹脂的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和聚萘二甲酸丁二醇酯(PBN)等；作為烯烴樹脂的聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚丁烯等；作為乙烯基樹脂的聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氟乙烯和聚醋酸乙烯等；丙烯酸樹脂；丙烯酸酯樹脂；作為氟樹脂的聚四氟乙烯(PTFE)和聚偏二氟乙烯(PVDF)等；聚碳酸酯樹脂；作為聚醚樹脂的聚甲醛(POM)、聚苯醚(PPO)、聚醚酮(PEK)、聚醚醚酮(PEEK)、聚苯硫醚(PPS)、聚碸(PSU)、聚醚碸(PES)和聚醚醯亞胺(PEI)等；作為聚醯胺樹脂的尼龍和芳醯胺等；以及作為纖維素類的醋酸纖維素、硝化纖維素和再生纖維素等。

上述高分子基材的形狀沒有特別限定，例如可以列舉出正方形、長方形、圓形、橢圓形等薄板狀。

從裝置的小型、輕量、低價格化的觀點而言，上述高分子基材的面積越小越好，但是例如較佳為1mm²～1000mm²，更佳為2mm²～500mm²，進一步較佳為5mm²～200mm²。

從待測試樣的展開性以及酶(蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶)反應性的觀點而言，上述高分子基材的(一層的)厚度例如較佳為10μm～2000μm，更佳為20μm～1000μm，進一步較佳為50μm～500μm。

(檢測)

對反應進行檢測時，最簡便的是向已經顯色的多層試驗片照射光(入射光)，然後檢測其反射光，但是也可以使用除此以外的方法。作為光源沒有特別限定，例如可以列舉出UV燈、氙燈、氪燈、水銀燈、氘燈、鎢絲燈、鹵素燈、發光二極體(LED)、鐳射等。其中，從光波長控制的容易性、裝置的小型、輕量、低價格化的觀點而言，較佳係發光二極體(LED)。上述入射光的角度(入射角)沒有特別限定，可以採用任意的角度。另一方面，對反射光的檢測沒有特別限定，較佳係垂直於檢測面。此外，若使用光電二極體或積分球則可以容易地進行檢測。

(蛋白酶)

作為本發明所使用的蛋白酶，只要能夠與糖化血紅素的糖化的β鏈N末端作用而切出待測物件糖化物，則可以使用任何種類的蛋白酶，例如可以列舉出來自動物、植物、微生物的蛋白酶等。以下示出蛋白酶的具體例子，但這並不構成對本發明的任何限制。

(來自動物的蛋白酶)

作為來自動物的蛋白酶，可以列舉出因數Xa(factor Xa)、血纖維蛋白溶酶(plasmin)、凝血酶(thrombin)、胃蛋白酶(pepsin)、亮胺酸胺肽酶(leucinaminopeptidase)、胰液素(pancreatin)、胰肽酶(elastase)、胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶A(chtmotrypsin A)、胺肽酶M(aminopeptidase M)、羧肽酶A(carboxypeptidase A)、羧肽酶B(carboxypeptidase B)、鈣蛋白酶(calpain)、組織蛋白酶B(cathepsin B)、組織蛋白酶C(cathepsin C)、組織蛋白酶D(cathepsin D)、內切蛋白酶Arg-C(endoprotinaseArg-C)等。

(來自植物的蛋白酶)

作為來自植物的蛋白酶，可以列舉出羧肽酶W(carboxypeptidase W)、激肽釋放劑(kallikrein)、無花果蛋白酶(ficin)、木瓜蛋白酶(papain)、糜木瓜酶(chimopapain)、鳳梨蛋白酶(bromelain)等。

(來自微生物的蛋白酶)

作為來自微生物的蛋白酶，可以列舉出：以枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、分散酶(dispase)、蛋白酶N(proteinase N)等為代表的來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶；以IP酶等為代表的來自曲黴菌(Aspergillus)的蛋白酶；以鏈黴蛋白酶(pronase)等為代表的來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶；以蛋白酶K(proteinase K)等為代表的來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶；以肽酶R(peptidase R)等為代表的來自根黴(Rhizopus)的蛋白酶；以羧肽酶P(carboxypeptidase P)、PD酶等為代表的來自青黴菌(Penicillium)的蛋白酶；以內切蛋白酶Glu-C(endoprotinase Glu-C)等為代表的來自葡萄狀球菌(Staphylococcus)的蛋白酶；以梭菌蛋白酶(clostripain)等為代表的來自梭菌(Clostridium)的蛋白酶；以內切蛋白酶Lys-C(endoprotinase Lys-C)等為代表的來自溶桿菌(Lysobacter)的蛋白酶；以金屬蛋白酶(metalloendopeputidase)等為代表的來自豬苓(Grifola)的蛋白酶；以羧肽酶Y(carboxypeptidase Y)、蛋白酶A(proteinase A)等為代表的來自酵母(Yeast)的蛋白酶；以胺基肽酶T(aminopeptidase T)等為代表的來自棲熱菌(Thermus)的蛋白酶；以內切蛋白酶Asp-N(endoprotinase Asp-N)等為代表的來自假單胞桿菌(Pseudomonus)的蛋白酶；以及以質譜級賴胺酸肽鏈內切酶(lysylendopeputidase)、消色肽鍵端解酶(achromopeputidase)等為代表的來自無色菌(Achromobacter)的蛋白酶等。

其中，從穩定性、反應性(血紅素的切斷速度)、獲得的容易性、價格等原因出發，較佳係來自微生物的蛋白酶，更佳為選自由來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶所組成的組中的一種以上。作為市售品，作為來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶的Toyoteam NEP( NEP，東洋紡織公司製)、Type-X(SIGMA公司製)、Type-XXIV(SIGMA公司製)、嗜熱菌蛋白酶(大和化成公司製)、高溫蛋白酶PC10(大和化成公司製)、作為來自曲黴菌(Aspergillus)的蛋白酶的Type-XIII(SIGMA公司製)、Type-XXIII(SIGMA公司製)、作為來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶的Type-XIV以及作為來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶的蛋白酶K(Roche公司製)等適於使用。

其中，從測量血紅素Alc的觀點而言，作為來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶的Toyoteam NEP(東洋紡織公司製)、Type-X(SIGMA公司製)、Type-XXIV(SIGMA公司製)、嗜熱菌蛋白酶(大和化成公司製)、高溫蛋白酶PC10(大和化成公司製)、作為來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶的Type-XIV更適於使用。

只要達到目標活性，則上述蛋白酶可以是精製品，也可以是粗精製品。另外，也可以是通過基因操作而製成的物質，而不管有無化學修飾。並且，上述蛋白酶可以單獨使用，也可以兩種以上組合使用。

上述蛋白酶的濃度沒有特別限定，較佳為0.1U/cm²～10000U/cm²，更佳為1U/cm²～1000U/cm²。蛋白酶濃度低於0.1U/cm²時，由於反應性降低而延長測量時間，因而不佳。另一方面，蛋白酶濃度高於10000U/cm²時，有時會導致背景升高或導致高價格化。

進行上述蛋白酶反應時的pH可以不進行調整，但較佳係通過適當的pH調整劑、例如下列緩衝劑進行調整，以使所使用的蛋白酶達到最合適的pH。

(糖化胺基酸氧化酶)

本發明所使用的糖化胺基酸氧化酶(以下有時也稱為果糖基胺基酸氧化酶FAOD)在公知文獻中被稱為以下各種名稱：果糖基胺氧化酶、果糖基胺基酸氧化酶、果糖基縮胺酸氧化酶、果糖基胺氧化酶、果糖基胺基酸氧化酶、果糖基縮胺酸氧化酶、糖化胺氧化酶、糖化胺基酸氧化酶、糖化縮胺酸氧化酶、糖化胺氧化酶、糖化胺基酸氧化酶、糖化縮胺酸氧化酶、阿馬多裡酶(amadoriase)、酮胺氧化酶、酮胺氧化酶等。

作為本發明所使用的糖化胺基酸氧化酶，只要是與待測物件糖化物或者非待測物件糖化物產生特異性作用而生成過氧化氫的酶，則可以使用任何種類的酶。以下示出糖化胺基酸氧化酶的具體例子，但這並不構成對本發明的任何限制。

作為糖化胺基酸氧化酶，可以列舉出：來自赤黴菌(Gibberella)的酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的酶、來自青黴菌(Penicillium)的酶、來自鐮刀菌(Fusarium)的酶、來自棒狀桿菌(Corynebacterium)的酶、來自子囊殼菌(Coniochaeta)的酶、來自正青黴菌(Eupenicillium)的酶、來自Achaetomiella的酶、來自毛殼菌(Chaetomium)的酶、來自大腸菌的酶、來自德巴厘氏酶(Debaryomyces)的酶、來自彎孢菌(Curvularia)的酶、來自新赤殼菌(Neocosmospora)的酶、來自隱球菌(Cryptococcus)的酶、來自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶、來自念珠菌(Candida)的酶以及來自頂苞黴菌(Acremonium)的酶等。

其中，從穩定性、反應性(糖化胺基酸和/或糖化肽的氧化速度)、獲得的容易性、價格等原因出發，較佳為選自由來自子囊殼菌(Coniochaeta)的酶、來自正青黴菌(Eupenicillium)的酶、來自彎孢菌(C urvularia)的酶、來自新赤殼菌(Neocosmospora)的酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的酶、來自隱球菌(Cryptococcus)的酶和來自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所組成的組中的一種以上，更佳為選自由來自子囊殼菌(Coniochaeta)的酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的酶、來自隱球菌(Cryptococcus)的酶和來自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所組成的組中的一種以上。

其中，從測量血紅素Alc的觀點而言，較佳為選自由來自子囊殼菌(Coniochaeta)的酶和來自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所組成的組中的一種以上。

只要達到目標活性，則上述糖化胺基酸氧化酶可以是精製品，也可以是粗精製品。另外，也可以是由基因操作所製成的物質，而不管有無化學修飾。並且，上述糖化胺基酸氧化酶可以單獨使用，也可以兩種以上組合使用。

上述糖化胺基酸氧化酶的濃度沒有特別限定，較佳為0.01U/cm²～1000U/cm²，更佳為0.1U/cm²～100U/cm²。糖化胺基酸氧化酶濃度低於0.01U/cm²時，由於反應性降低而延長測量時間，因而不佳。另一方面，糖化胺基酸氧化酶濃度高於1000U/cm²時，有時會導致背景升高或導致高價格化。

進行上述糖化胺基酸氧化酶反應時的pH可以不進行調整，但較佳係通過適當的pH調整劑、例如下列緩衝劑進行調整，以使所使用的糖化胺基酸氧化酶達到最合適的pH。

(過氧化酶)

作為本發明所使用的過氧化酶，只要是能夠催化過氧化氫和氧化還原系顯色試劑反應的酶，則可以使用任何種類的酶，可以列舉出例如來自植物、來自細菌、來自擔子菌的過氧化酶。其中，從純度、獲得的容易性、價格等原因出發，較佳為來自西洋芥末、稻子、大豆的過氧化酶，更佳為來自西洋芥末的過氧化酶。作為市售產品，PEO-131(東洋紡織公司製)、PEO-301(東洋紡織公司製)、PEO-302(東洋紡織公司製)等適於使用。

上述過氧化酶的濃度沒有特別限定，較佳為0.01U/cm²～1000U/cm²，更佳為0.1U/cm²～100U/cm²。過氧化酶濃度低於0.01U/cm²時，由於反應性降低而延長測量時間，因而不佳。另一方面，過氧化酶濃度高於1000U/cm²時，有時會導致背景升高或導致高價格化。

進行上述過氧化酶反應時的pH可以不進行調整，但較佳係通過適當的pH調整劑、例如下列緩衝劑進行調整，以使所使用的過氧化酶達到最合適的pH。

(氧化還原系顯色試劑)

作為本發明所使用的氧化還原系顯色試劑，只要能夠與過氧化氫反應而呈色，則可以使用任何種類的色素，可以列舉出例如氫供體和偶合劑、隱色體等。另外，使用氫供體和偶合劑的代表例子是在過氧化酶存在下通過過氧化氫使氫供體和偶合劑進行氧化縮合而形成色素的Trinder法。

以下示出氧化還原系顯色試劑的具體例子，但這並不構成對本發明的任何限制。

(氫供體)

作為氫供體，可以列舉出酚、酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。具體而言，可以列舉出：N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺(ALPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙醯乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀醯乙二胺、N-(2-羥基-3-磺丙基)-2,5-二甲基苯胺、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-磺丙基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺等。

(偶合劑)

作為偶合劑，可以列舉出4-胺基安替吡啉(4AA)、胺基安替吡啉衍生物、香蘭素二胺磺酸(vanillin diamine sulfonic acid)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH：methybenzthiazoline hydrazone)、磺化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(SMBTH：sulphonated methybenzthiazoline hydrazone)等。

(隱色體)

作為隱色體，可以列舉出三苯基甲烷衍生物、吩噻嗪衍生物、二苯胺衍生物等。具體而言，可以列舉出：4,4’-亞苄雙(N,N-二甲基苯胺)、4,4’-雙(N-乙基-N-(3-磺丙基胺基)-2,6-二甲基苯胺)甲烷、1-(乙基胺基硫代羰基)-2-(3,5-二甲氧基-4-羥基苯基)-4,5-雙(4-二乙胺基苯基)咪唑、4,4’-雙(二甲胺基)二苯胺、N-(羧甲基胺基羰基)-4,4’-雙(二甲胺基)二苯胺鈉鹽(DA64)、10-(羧甲基胺基羰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪鈉鹽(DA67)等。

其中，從莫耳吸光係數、最大吸收波長等原因出發，較佳為隱色體，更佳為N-(羧甲基胺基羰基)-4,4’-雙(二甲胺基)二苯胺鈉鹽(DA64)、10-(羧甲基胺基羰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪鈉鹽(DA67)。

上述氧化還原系顯色試劑的最大吸收波長較佳為600nm～800nm，更佳為650nm～750nm。從測量血紅素A1c的觀點而言，最大吸收波長在小於600nm的低波長一側時，由於氧化還原系顯色試劑的顯色光譜與血紅素的光譜重合，恐怕會降低靈敏度。另一方面，最大吸收波長在大於800nm的高波長一側時，檢測設備恐怕會大型化。

上述氧化還原系顯色試劑的濃度沒有特別限定，較佳為0.0001mg/cm²～10mg/cm²，更佳為0.001mg/cm²～1mg/cm²。氧化還原系顯色試劑濃度低於0.0001mg/cm²時，恐怕會降低靈敏度。另一方面，氧化還原系顯色試劑濃度高於10mg/cm²時，有時會導致背景升高或導致高價格化。

(界面活性劑)

作為本發明所使用的界面活性劑，只要起溶血劑和/或蛋白酶反應促進劑的作用，則可以使用任何種類的界面活性劑，較佳係起溶血劑和蛋白酶反應促進劑的作用的界面活性劑。作為上述界面活性劑，可以列舉出：聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(註冊商標)系界面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij(註冊商標)系界面活性劑等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween(註冊商標)系界面活性劑等)、聚氧乙烯脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、烷基葡糖苷、脂肪酸蔗糖酯等非離子性界面活性劑。其中，從作為溶血劑的反應性(溶血速度)、作為蛋白酶反應促進劑的作用性、價格等原因出發，較佳係聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(註冊商標)系界面活性劑等)。作為市售商品，TritonX(註冊商標)-100(Nacalai Tesque公司製)、TritonX(註冊商標)-114(Nacalai Tesque公司製)、Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)等適於使用。另外，上述界面活性劑可以單獨使用，也可以兩種以上組合使用。

上述界面活性劑的親水親油平衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value：HLB Value)較佳為10～20，更佳為12～20，進一步較佳為14～20。HLB值小於10時，恐怕得不到足夠的溶血效果以及促進蛋白酶反應的效果。另一方面，HLB值大於20的界面活性劑在HLB的定義上不存在。

上述界面活性劑的濃度沒有特別限定，較佳為0.0001mg/cm²～10mg/cm²，更佳為0.001mg/cm²～1mg/cm²。界面活性劑濃度低於0.0001mg/cm²時，恐怕得不到足夠的溶血效果以及蛋白酶反應促進效果。另一方面，界面活性劑濃度高於10mg/cm²時，並未發現效果提高。

當待測試樣中為全血時，在使本發明中的非待測物件糖化物與糖化胺基酸氧化酶反應從而降低非待測物件糖化物影響的步驟中所產生的過氧化氫，通過全血中的過氧化氫酶(catalase)被分解為氧和水，因而根據需要也可以添加過氧化氫酶。

作為本發明所使用的過氧化氫酶，只要是對將非待測物件糖化物消去時生成的過氧化氫歧化分解成氧和水的反應進行催化的酶，則可以使用任何種類的酶，例如可以列舉出來自動物、來自微生物的過氧化氫酶。其中，從純度、獲得的容易性、價格等理由出發，較佳為來自微生物的過氧化氫酶。作為市售品適於使用來自曲黴菌(Aspergillus)的過氧化氫酶C3515(SIGMA公司製)、來自棒狀桿菌(Corynebacterium)屬的過氧化氫酶02071(SIGMA公司製)、來自微球菌(Micrococcus)屬的過氧化氫酶60638(SIGMA公司製)等。

上述過氧化氫酶的濃度沒有特別限定，較佳為0.1U/cm²～10000U/cm²，更佳為1U/cm²～1000U/cm²。如果過氧化氫酶濃度低於0.1U/cm²，則有時無法除去非待測物件糖化物消去時生成的過氧化氫，而導致在表觀上測量值增加。另一方面，如果過氧化氫酶濃度高於10000U/cm²，則有時會導致背景升高戴導致高價格化。進行上述過氧化氫酶反應時的pH可以不進行調整，但較佳係通過適當的pH調整劑、例如下列緩衝劑進行調整，以使所使用的過氧化氫酶達到最合適的pH。

為了在上述過氧化氫酶反應後排除過氧化氫酶的影響，也可以在比過氧化氫酶靠下的層上承載疊氮化鈉等過氧化氫酶抑制劑。或者，利用過氧化氫酶和過氧化酶對基質的親和性不同，通過適當地設定過氧化氫酶和過氧化酶的濃度比例，也可以採用不在過氧化氫酶的下層上承載過氧化氫酶抑制劑的結構。

(緩衝劑)

作為可用於本發明的緩衝劑，只要在pH的目標範圍內具有充分的緩衝能力，則可以使用任何種類的緩衝劑，例如可以列舉出：Tris、磷酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、硝酸、硼酸、酒石酸、醋酸、碳酸以及良緩衝劑(MES、ADA、PIPES、ACES、鹽酸膽胺(cholamine)、BES、TES、HEPES、乙醯甘胺酸、麥黃酮、甘胺醯胺、蠶豆嘧啶葡糖苷)等。

其中，從在本發明所使用的蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶以及過氧化酶的最合適pH範圍6.0～8.5(較佳為6.0～7.5)內具有充分的緩衝能力等理由出發，較佳為Tris、磷酸、MES、、PIPES、TES、HEPES，更佳為MES、PIPES。

上述緩衝劑的濃度沒有特別限定，相對於多層試驗片製作時的試劑較佳為50mM～100mM左右。

(其他試劑)

本發明中除了上述試劑(界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑等)外，還可以根據需要添加血紅素的氧化劑(亞鐵氰化物、迭氮化物、亞硝酸鹽、硝酸鹽等)、捕捉妨礙酶反應的離子的螯合試劑(乙二胺、聯二吡啶、乙二胺四醋酸、菲繞啉、卟啉、冠醚等)、用於去除作為妨礙過氧化氫的定量的物質的抗壞血酸的抗壞血酸氧化酶、鹽類(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋁等)、酶穩定化劑(單糖類、低聚糖類、多糖類、糖醇、甘油、葡糖酸鹽、胺基酸類、白蛋白類、球蛋白類、纖維性蛋白質等)、氧化還原系顯色試劑穩定化劑(環糊精(cyclodextrin)類、還原性硫醇類、還原性硫酸鹽類等)。這些可以單獨使用，也可以兩種以上組合使用。

[實施例]

以下通過實施例對本發明進行具體說明，但這並不構成對本發明的任何限制。另外，說明書中的評價方法如下所述。

[各種評價方法]

〈1、蛋白酶的活性測量〉

蛋白酶的活性通過使用了Folin-Ciocalteu試劑的酪蛋白Folin法計算得出。在此，在蛋白酶的最適pH下，在37℃對酪蛋白加水分解1分鐘，將產生相當於1.0μmol的酪胺酸的呈色的酶量定義為IU。

〈2、糖化胺基酸氧化酶的活性測量〉

糖化胺基酸氧化酶的活性通過在過氧化酶的存在下，使由糖化纈胺醯組胺酸(valyl histidine)和糖化胺基酸氧化酶反應而產生的過氧化氫與氧化還原系顯色試劑產生反應，從其吸光度的變化而計算得出。在此，在糖化胺基酸氧化酶的最合適pH(pH=6.5)下，在37℃對糖化纈胺醯組胺酸加水分解1分鐘，將產生相當於1.0μmol的過氧化氫的酶量定義為IU。

〈3、過氧化酶的活性測量〉

過氧化酶的活性通過在過氧化酶存在下，使過氧化氫和焦棓酚(Pyrogallol)反應，從來自生成的紅紫棓精(Purpurogallin)的吸光度的變化而計算得出。在此，在過氧化酶的最合適pH(pH=6.0)下，在20℃反應20秒，將產生相當於1.0mg的紅紫棓精(Purpurogallin)的呈色的酶量定義為IU。

4、〈過氧化氫酶的活性測量〉

過氧化氫酶的活性是通過在過氧化酶的存在下將過氧化氫分解成水和氧，從來自過氧化氫的240nm處的吸光度的變化而計算得出。在此，在過氧化酶的最合適PH下，在25℃反應1分鐘，將使1.0μmol的過氧化氫分解的酶量定義為IU。

〈5、親水親油平衡值((Hydrophile Lipophile Balance Value：HLB Value))的測量〉

HLB值是通過採用Griffin法，由HLB值=20×(親水部分的式量的總和/分子量)而計算得出。另外，界面活性劑的混合物的HLB值以各成分的HLB值的加權平均表示。

〈6、糖化胺基酸氧化酶的保存穩定性〉

在8mmψ的桐山濾紙NO.5A(東京硝子器械公司製)上，滴10μL下述試劑1，在25℃的遮光乾燥器3909-04(東京硝子器械公司製)中乾燥2小時，製作成空白試驗片。

〈試劑1〉

100mM PIPES(同仁化學研究所公司製) pH6.5

500U/mL糖化胺基酸氧化酶FPO-301(東洋紡織公司製)

接著，作為加速試驗，將空白試驗片在37℃的可程式設計低溫恆溫器IN604(Yamato科學公司製)中培育5小時。然後，將上述空白試驗片和1000μL下述試劑2添加至離心管(microtube)內，通過用渦流攪拌器(vortex mixer)(MS儀器公司製)攪拌1分鐘，從而提取出空白試驗片中的糖化胺基酸氧化酶。接著，將上述提取液在離心超濾管(MICROCON)3(Millipore公司製)中以14000G進行離心濃縮，從而獲得200μL濃縮液。接著，將上述濃縮液50μL與Laemmli樣品緩衝液(Bio-Rad Laboratiories公司製)47.5μL、2-巰基乙醇(Bio-Rad Laboratiories公司製)2.5μL混合，在95℃下沸騰5分鐘，從而製得空白溶液。

〈試劑2〉

100mM PIPES(同仁化學研究所公司製) pH 6.5

100倍稀釋的一般用的蛋白酶抑制劑混合物，100倍濃縮(Nacalai Tesque公司製)

接著，作為加速試驗，將本發明的多層試驗片在37℃的可程式設計低溫恆溫器IN 604(Yamato科學公司製)中培育5小時。然後，將上述多層試驗片和1000μL上述試劑2添加至離心管(microtube)內，通過用漩渦混合器(vortex mixer)(MS儀器公司製)攪拌1分鐘，從而提取出多層試驗片中的界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑。其次，將上述提取液在離心超濾管(MICROCON)3(Millipore公司製)中以14000G離心濃縮，除去分子量3000以下的低分子量成分(界面活性劑、氧化還原系顯色試劑等)，從而製得200μL濃縮液。接著，將上述濃縮液50μL與Laemmli樣品緩衝液(Bio-Rad Laboratiories公司製)47.5μL、2-巰基乙醇(Bio-Rad Laboratiories公司製)2.5μL混合，在95℃下沸騰5分鐘，從而製得樣品溶液。

使用電泳最佳組合套件(best package)(預製膠用(Bio-Rad Laboratiories公司製))，在下列條件1下，對所製得的空白溶液以及樣品溶液實施SDS-PAGE。另外，空白溶液以及樣品溶液流過相同凝膠的不同孔道。

〈條件1〉

預製凝膠：預製膠J 10%T、12well

電泳系統：小型垂直電泳槽(mini protean Tetra cell)

電源：基礎電泳儀電源(power pac Basic)

標準：高精度雙標(precision Plus dual standard)

電泳緩衝液：預混合緩衝液Tris/甘胺酸/SDS

標準量：10μL

電泳上樣量：20μL

電泳條件：100V固定電壓、90分鐘

溫度：25℃

接著，在密閉箱(tight box)NO. 3(AS ONE公司製)中添加電泳後的凝膠和200mL蒸餾水，用搖擺式混合機(rocking mixer)RM-80(AS ONE公司製)振盪5分鐘後除去蒸餾水，進行三次這樣的清潔操作。接著，添加50mL Bio-Safe CBB G-250染色劑(Bio-Rad Laboratiories公司製)的染色液，用上述搖擺式混合機振盪1小時後除去上述染色液。最後，添加200mL蒸餾水，用上述搖擺式混合機振盪1小時後除去蒸餾水，可以得到電泳圖譜。

使用GS-800 Calibrated Densitometer(Bio-Rad Laboratiories公司製)根據通常的方法對所得到的電泳圖譜中50kDa附近的來自糖化胺基酸氧化酶的譜帶粗細(泳動方向的譜帶的尺寸)以及濃度(譜帶的吸光度)進行測量。分別從所得的空白以及樣品的譜帶粗細計算出下式(1)中的譜帶保持率1，從所得的空白以及樣品的譜帶濃度計算出下式(2)中的譜帶保持率2，將譜帶保持率1以及譜帶保持率290%設定為◎(優)，將譜帶保持率1以及譜帶保持率2＜90%設定為×(不良)，對糖化胺基酸氧化酶的保存穩定性(即，耐分解性)進行評價。

[數學式1]

譜帶保持率1(%)=(樣品譜帶粗細/空白譜帶粗細)×100　(1)

[數學式2]

譜帶保持率2(%)=(樣品譜帶濃度/空白譜帶濃度)×100　(2)

〈7、氧化還原系顯色試劑的保存穩定性〉

將本發明的多層試驗片放入鋁製封口袋(Alumi lamizip)AL-9(東京硝子器械公司製)中，封入氮氣後，在可程式設計低溫恆溫器IN 604(Yamato科學公司製)中，在4℃下培育0、24、48、72、96、120、144、168、336、504小時，或在25℃下培育0、24、48、72、96、120、144、168、336、504小時。接著，用夾具(參照圖1)將上述多層試驗片從上下夾住固定，在下列條件2下，對承載有氧化還原系顯色試劑的層的一側的反射率進行測量。

〈條件2〉

裝置名稱：分光光度計UV-2450(島津製作所公司製)

附屬裝置名稱：積分球ISR-2200(島津製作所公司製)

標準白板：硫酸鋇標準白板

測量波長：666nm(DA67的λmax)

入射角：0°

狹縫(slit)寬度：2.0nm

光束尺寸：3mm×5mm

溫度：25℃

由所得的反射率通過下式(3)的Kubelka-Munk轉換計算出K/S值，對於3周(504小時)之後的K/S值，將K/S值(4℃)0.25且K/S值(25℃)0.50設定為◎(優)，將0.25＜K/S值(4℃)0.35且0.50＜K/S值(25℃)0.60設定為○(良)，將0.35＜K/S值(4℃)0.40且0.60＜K/S值(25℃)1.30設定為△(尚可)，將0.40＜K/S值(4℃)且1.30＜K/S值(25℃)設定為×(不良)，對氧化還原系顯色試劑的保存穩定性(即，耐自顯色性)進行評價。如果氧化還原系顯色試劑自顯色則K/S值上升是公知的。此外，式(3)中的%R是反射率的意思。

[數學式3]

K/S值=(1-%R)2/(2×%R)　(3)

〈8、蛋白酶的反應性〉

在本發明的多層試驗片上，將100g/L的人類血紅素H7379(SIGMA公司製)水溶液20μL點樣在第一層，在可程式設計低溫恆溫器IN 604(Yamato科學公司製)中，五37℃下培育0、5、10、15、30、60分鐘。接著，將上述多層試驗片和1000μL上述試劑2添加至離心管(microtube)內，通過用漩渦混合器(vortex mixer)(MS儀器公司製)攪拌1分鐘，從而提取出多層試驗片中的界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑。接著，將上述提取液在離心超濾管(MICROCON)3(Millipore公司製)中以14000G離心濃縮，除去分子量3000以下的低分子量成分(界面活性劑、氧化還原系顯色試劑)，從而製得200μL濃縮液。接著，將上述濃縮液2.5μL與蒸餾水47.5μL、Laemmli樣品緩衝液(Bio-Rad Laboratiories公司製)47.5μL、2-巰基乙醇(Bio-Rad Laboratiories公司製)2.5μL混合，在95℃下沸騰5分鐘，從而製得樣品溶液1～6。

使用電泳最佳組合套件(best package)(預製膠用(Bio-Rad Laboratiories公司製))，在上述條件1下，對所製得的樣品溶液1～6實施SDS-PAGE。另外，樣品溶液1～6流過相同凝膠的不同孔道。

使用GS-800 Calibrated Densitometer(Bio-Rad Laboratiories公司製)根據通常的方法對所得到的電泳圖譜中16kDa附近的來自血紅素亞基的譜帶粗細(泳動方向的譜帶的尺寸)以及濃度(譜帶的吸光度)進行測量。分別從所得的37℃下培育0分鐘至60分鐘之後的譜帶粗細計算出下式(4)中的譜帶消失率1，從所得的37℃下培育0分鐘至60分鐘之後的譜帶濃度計算出下式(5)中的譜帶消失率2，對於譜帶消失率1以及譜帶保持率達到90%以上的時間(以下，也稱為譜帶消失時間)，將0分鐘＜譜帶消失時間5分鐘設定為◎(優)，將5分鐘＜譜帶消失時間15分鐘設定為○(良)，將15分鐘＜譜帶消失時間30分鐘設定為△(尚可)，將30分鐘＜譜帶消失時間設定為×(不良)，對蛋白酶的反應性進行評價。

[數學式4]

譜帶消失率1(%)={1-(譜帶粗細(0分鐘至60分鐘)/譜帶粗細(0分鐘))}×100　(4)

[數學式5]

譜帶消失率2(%)={1-(譜帶濃度(0分鐘至60分鐘)/譜帶濃度(0分鐘))}×100　(5)

〈9、氧化還原系顯色試劑的靈敏度、相關性〉

使合成的果糖基纈胺醯組胺酸(fructosyl-valyl-histidine)(以下，有時也稱為F-VH)溶解在100g/L的人類血紅素H7379(SIGMA公司製)水溶液中，使其形成0μm、50μm、100μm、200μm、500μM，調製成5個水準的測量試樣。接著，用夾具(參照圖1)將本發明的多層試驗片從上下夾住固定，將20μL上述測量樣本點樣在第一層，在室溫下培育1分鐘之後，在下列條件3下，對與測量試樣點樣面相反的面的反射率進行測量。

〈條件3〉

測量試樣：人類血紅素H7379 100g/LF-VH 0μM、50μM、100μM、200μM、500μM過氧化氫酶

裝置名稱：分光光度計UV-2450(島津製作所公司製)

附屬裝置名稱：積分球ISR-2200(島津製作所公司製)

標準白板：硫酸鋇標準白板

測量波長：666nm(DA67)、727nm(DA64)、555nm(TOOS)、630nm(MAOS)

入射角：0°

狹縫(slit)寬度：2.0nm

光束尺寸：3mm×5mm

溫度：25℃

由所得的F-VH在0μM～500μM的反射率通過上式(3)的Kubelka-Munk轉換而得到F-VH在0μM～500μM的K/S值。由所得到的F-VH在0μM的K/S值和F-VH在500μM的K/S值計算出下式(6)的K/S波動率，將K/S波動率2.0設定為◎(優)，將K/S波動率＜2.0設定為×(不良)，對氧化還原系顯色試劑的靈敏度進行評價。此外，式(6)中的K/S值(0μM)、K/S值(500μM)分別是F-VH在0μM的K/S值、F-VH在500μM的K/S值的意思。

[數學式6]

K/S波動率=K/S值(500μM)/K/S值(0μM)　(6)

另外，計算出所得到的K/S值和F-VH濃度的Pearson相關係數r，將r＞0.95設定為◎(優)，將0.95r＜0.90設定為○(良)，將0.90r＜0.85設定為△(尚可)，將r0.85設定為×(不良)，對相關性進行評價。

〈10、血紅素A1c值校準曲線的製作〉

用夾具(參照圖1)將本發明的多層試驗片從上下夾住固定，將HbA1c測量性能評價用試樣QRM HbA1c 2007-1(一般社團法人檢查醫學標準物質機構公司製)20μL點樣在第一層，在37℃的可程式設計低溫恆溫器IN 604(Yamato科學公司製)中培育15分鐘之後，在下列條件4下，對與測量試樣點樣面相反的面的反射率進行測量。

〈條件4〉

測量試樣：HbA1c測量性能評價用試樣QRM LEVEL 1、2、3、4、5

裝置名稱：分光光度計UV-2450(島津製作所公司製)

附屬裝置名稱：積分球ISR-2200(島津製作所公司製)

標準白板：硫酸鋇標準白板

測量波長：480nm、666nm

入射角：0°

狹縫(slit)寬度：2.0nm

光束尺寸：3mm×5mm

溫度：25℃

由所得的在480nm處的反射率以及在666nm處的反射率通過上式(3)的Kubelka-Munk轉換而得到在480nm處的K/S值以及在666nm處的K/S值。接著，由所得到的在480nm處的K/S值以及在666nm處的K/S值計算出下式(7)的K/S比。K/S比與血紅素A1c值成比例(參照非專利文獻1)是公知的。另外，式中的K/S值(480nm)、K/S值(666nm)分別是在480nm處的K/S值、在666nm處的K/S值的意思。

K/S比=K/S值(666nm)/K/S值(480nm)　(7)

計算出所得到的K/S比與HbA1c測量性能評價用試樣QRM中所規定的HbA1c值(LEVEL 1=4.67%、LEVEL 2=5.29%、LEVEL 3=6.96%、LEVEL 4=9.08%、LEVEL 5=10.79%)的Pearson相關係數r，將r＞0.95設定為◎(優)，將0.95r＜0.90設定為○(良)，將0.90r＜0.85設定為△(尚可)，將r0.85設定為×(不良)，對相關性進行評價。

〈11、血紅素A1c值的測量〉

使合成的果糖基纈胺醯組胺酸(fructosyl-valyl-histidine)(以下，有時也稱為F-VH)溶解在健康人血液中，使其形成0μm、10μm、20μm、50μm、100μM，調製成5個水準的測量試樣。

接著，用夾具(參照圖1)將本發明的多層試驗片從上下夾住固定，將20μL上述待測樣本點樣在第一層，在37℃的可程式設計低溫恆溫器IN 604(Yamato科學公司製)中培育15分鐘之後，在下列條件5下，對與測量試樣點樣面相反的面的反射率進行測量。另外，對健康人的血液使用作為市售的自動分析儀的日立自動分析儀7180(日立高科公司製)以及作為市售的血紅素A1c測量試劑的Nordia N HbA1c(積水醫療科技公司製)按照通常的方法進行了測量，計算出血紅素A1c值。

〈條件5〉

測量試樣：健康人的血液F-VH 0μM、10μM、20μM、50μM、100μM

裝置名稱：分光光度計UV-2450(島津製作所公司製)

附屬裝置名稱：積分球ISR-2200(島津製作所公司製)

標準白板：硫酸鋇標準白板

測量波長：480nm、666nm

入射角：0°

狹縫(slit)寬度：2.0nm

光束尺寸：3mm×5mm

溫度：25℃

由所得的在480nm處的反射率以及在666nm處的反射率通過上式(3)的Kubelka-Munk轉換而得到在480nm處的K/S值以及在666nm處的K/S值。接著，由所得到的在480nm處的K/S值以及在666nm處的K/S值計算出上式(7)的K/S比。由所得到的K/S和上一項所得到的校準曲線計算出血紅素A1c值。由所得到的添加有0μM的F-VH的健康人血液的血紅素A1c值和添加有100μM的F-VH的健康人血液的血紅素A1c值，計算出下式(8)的HbA1c值差，將HbA1c值差0.5設定為◎(優)，將0.5＜HbA1c值差1.0設定為○(良)，將1.0＜HbA1c值差1.5設定為△(尚可)，將1.5＜HbA1c值差設定為×(不良)，對可能存在於待測試樣中但非由糖化血紅素而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響進行了評價。另外，式(8)的HbA1c值(0μM)和HbA1c值(100μM)分別表示添加有0μM的F-VH的健康人血液的血紅素A1c值和添加有100μM的F-VH的健康人血液的血紅素A1c值的意思。

[數學式8]

HbA1c值差=HbA1c值(100μM)-HbA1c值(0μM)(8)。

[試驗片的製作]

[實施例1]

在8mmψ的桐山濾紙NO. 5A(東京硝子器械公司製)上滴10μL下述試劑3，接著在其他的8mmψ的桐山濾紙NO. 5A(東京硝子器械公司製)上滴10μL下述試劑4，分別在25℃的遮光乾燥器3909-04(東京硝子器械公司製)中對其乾燥2小時，製作成兩種單層試驗片。通過對所得到的兩種單層試驗片進行積層，而製作成多層試驗片。另外，所承載的界面活性劑濃度為0.1mg/cm²，蛋白酶濃度為10U/cm²，糖化胺基酸氧化酶濃度為10U/cm²，過氧化酶濃度為40U/cm²，氧化還原系顯色試劑濃度為0.1mg/cm²。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表1。另外，表中的NP40、XIV、FPO、PEO、DA67是Nonidet(註冊商標)P-40、蛋白酶Type-XIV、糖化胺基酸氧化酶FPO-301、過氧化酶PEO-302、DA67分別承載於各層的意思。以下相同。

〈試劑3〉

100mM　PIPES(同仁化學研究所公司製)　pH 6.5

5.0mg/mL　Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)

500U/mL　糖化胺基酸氧化酶FPO-301(東洋紡織公司製)

〈試劑4〉

100mM　PIPES(同仁化學研究所公司製)　pH 6.5

5.0mg/mL　Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)

500U/mL　蛋白酶Type-XIV(SIGMA公司製)

2000U/mL　過氧化酶PEO-302(東洋紡織公司製)

5.0mg/mL　DA67(和光純藥工業公司製)

[實施例2～4]

除了界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑被承載的層不同外，其餘與實施例1同樣地操作，製作成多層試驗片。所得到的多層試驗片具體示於表1。

[實施例5]

在8mmψ的桐山濾紙NO. 5A(東京硝子器械公司製)上滴10μL下述試劑5，接著在其他的8mmψ的桐山濾紙NO. 5A(東京硝子器械公司製)上滴10μL下述試劑6，再在其他的8mmψ的桐山濾紙NO. 5A(東京硝子器械公司製)上滴10μL下述試劑7，分別在25℃的遮光乾燥器3909-04(東京硝子器械公司製)中對其乾燥2小時，製作成三種單層試驗片。通過對所得到的三種單層試驗片進行積層，而製作成多層試驗片。另外，所承載的界面活性劑濃度為0.1mg/cm²，蛋白酶濃度為10U/cm²，糖化胺基酸氧化酶濃度為10U/cm²，過氧化酶濃度為40U/cm²，氧化還原系顯色試劑濃度為0.1mg/cm²。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表2。

〈試劑5〉

100mM　PIPES(同仁化學研究所公司製)　pH 6.5

5.0mg/mL　Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)

500U/mL　糖化胺基酸氧化酶FPO-301(東洋紡織公司製)

〈試劑6〉

100mM　PIPES(同仁化學研究所公司製)　pH 6.5

5.0mg/mL　Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)

500U/mL　蛋白酶Type-XIV(SIGMA公司製)

〈試劑7〉

100mM　PIPES(同仁化學研究所公司製)　pH 6.5

5.0mg/mL　Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)

2000U/mL　過氧化酶PEO-302(東洋紡織公司製)

5.0mg/mL　DA67(和光純藥工業公司製)

[實施例6～9]

除了界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑被承載的層不同外，其餘與實施例5同樣地操作，製作成多層試驗片。所得到的多層試驗片示於表2。

[比較例1]

在8mmψ的桐山濾紙NO. 5A(東京硝子器械公司製)上滴10μL下述試劑8，在25℃的遮光乾燥器3909-04(東京硝子器械公司製)中對其乾燥2小時，製作成單層試驗片。另外，所承載的界面活性劑濃度為0.1mg/cm²，蛋白酶濃度為10U/cm²，糖化胺基酸氧化酶濃度為10U/cm²，過氧化酶濃度為40U/cm²，氧化還原系顯色試劑濃度為0.1mg/cm²。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表3。

〈試劑8〉

100mM　PIPES(同仁化學研究所公司製)　pH 6.5

5.0mg/mL　Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)

500U/mL　蛋白酶Type-XIV(SIGMA公司製)

500U/mL　糖化胺基酸氧化酶FPO-301(東洋紡織公司製)

2000U/mL　過氧化酶PEO-302(東洋紡織公司製)

5.0mg/mL　DA67(和光純藥工業公司製)

[比較例2～7]

除了界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑被承載的層不同外，其餘與實施例1同樣地操作，製作成多層試驗片。所得到的多層試驗片的詳細情況示於表4。

[比較例8、9]

除了界面活性劑、蛋白酶、糖化胺基酸氧化酶、過氧化酶、氧化還原系顯色試劑被承載的層不同外，其餘與實施例5同樣地操作，製作成多層試驗片。所得到的多層試驗片的詳細情況示於表5。

〈糖化胺基酸氧化酶、氧化還原系顯色試劑的保存穩定性〉

使用實施例1～9、比較例1～9的多層試驗片，對糖化胺基酸氧化酶的保存穩定性、氧化還原系顯色試劑的保存穩定性進行評價。

所得到的評價結果示於表6、7。

根據糖化胺基酸氧化酶的保存穩定性評價結果，當蛋白酶與糖化胺基酸氧化酶承載在同一層時，發生由蛋白酶引起的糖化胺基酸氧化酶的失活、分解，而導致保存穩定性顯著降低。此外，由於糖化胺基酸氧化酶發生失活、分解，有時會導致無法測量。

另外，根據氧化還原系顯色試劑的保存穩定性評價結果，當過氧化酶與氧化還原系顯色試劑承載在同一層時，氧化還原系顯色試劑發生自顯色，而導致保存穩定性顯著降低。此外，由於氧化還原系顯色試劑自顯色，有時會導致靈敏度降低。根據以上結果，作為保存安定性優異的多層試驗片的層結構，需要將蛋白酶與糖化胺基酸氧化酶分別承載在不同的層，例如可以列舉出實施例1～9的多層試驗片。更佳係將過氧化酶與氧化還原系顯色試劑分別承載在不同的層，例如可以列舉出實施例2、3、6～9的多層試驗片。

[實施例10～13]

除了將蛋白酶由Type-XIV(SIGMA公司製)更改為Toyoteam NEP(東洋紡織公司製)、Type-X(SIGMA公司製)、蛋白酶K(Roche公司製)、Type-XIII(SIGMA公司製)外，其餘與實施例2同樣地操作，製作成多層試驗片。所得到的多層試驗片的詳細情況示於表8。另外，表中的NEP、X、K、XIII是表示Toyoteam NEP、Type-X、蛋白酶K、Type-XIII分別承載在各層的意思。

[比較例10]

除了將蛋白酶由Type-XIV(SIGMA公司製)更改為Type-I(SIGMA公司製)外，其餘與實施例2同樣地操作，製作成多層試驗片。所得到的多層試驗片的詳細情況示於表8。另外，表中的I是表示Type-I承載在各層的意思。

〈蛋白酶的反應性〉

使用實施例2、10～13、比較例10的多層試驗片，對蛋白酶的反應性進行評價。

所得到的評價結果示於表9。

根據蛋白酶反應性的評價結果，作為蛋白酶較佳係選自由來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶所組成的組中的一種以上。

[實施例14]

除了將氧化還原系顯色試劑由λmax=666nm的DA67(和光純藥工業公司製)更改為λmax=727nm的DA64(和光純藥工業公司製)外，其餘與實施例2同樣地操作，製作成多層試驗片。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表10。另外，表中的DA64是表示DA64承載在各層的意思。

[比較例11、12]

除了將氧化還原系顯色試劑由λmax=666nm的DA67(和光純藥工業公司製)更改為λmax=555nm的4AA(Nacalai Tesque公司製)和TOOS(同仁化學研究所公司製)以及λmax=630nm的4AA(Nacalai Tesque公司製)和MAOS(同仁化學研究所公司製)外，其餘與實施例2同樣地操作，製作成多層試驗片。此外，所承載的4AA濃度為0.06 mg/cm²、TOOS濃度為0.09mg/cm²、MAOS濃度為0.09mg/cm²。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表10。另外，表中的4AA、TOOS、MAOS是表示4-胺基安替吡啉、TOOS、MAOS分別承載在各層的意思。

〈氧化還原系顯色試劑的靈敏度、相關性〉

使用實施例2、14、比較例11、12的多層試驗片，對氧化還原系顯色試劑的靈敏度、相關性進行評價。

所得到的評價結果示於表11。

根據氧化還原系顯色試劑的靈敏度、相關性的評價結果，作為氧化還原系顯色試劑較佳係莫耳吸光係數高、且不易受血紅素的色調的影響的、在650nm～800nm處具有最大吸收波長的無色色素。

[實施例15～17]

除了將界面活性劑由HLB值=17.6的Nonidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)更改為HLB值=13.5的Triton(註冊商標)X-100(Nacalai Tesque公司製)、HLB值=16.7的Tween(註冊商標)20(和光純藥工業公司製)、HLB值=16.9的Brij(註冊商標)35(和光純藥工業公司製)外，其餘與實施例10同樣地操作，製作成多層試驗片。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表12。另外，表中的TX100、Tw20、Br35是表示Triton(註冊商標)X-100、Tween(註冊商標)20、Brij(註冊商標)35分別承載在各層的意思。

[比較例13、14]

除了將HLB值=17.6的界面活性劑Nodidet(註冊商標)P-40(Nacalai Tesque公司製)更改為HLB值=6.0的DK Ester(註冊商標)F50(第一工業製藥公司製)、HLB值=8.0的DK Ester(註冊商標)F70(第一工業製藥公司製)外，其餘與實施例10同樣地操作，製作成多層試驗片。

所得到的多層試驗片的詳細情況示於表12。另外，表中的F50、F70是表示DK Ester(註冊商標)F50(第一工業製藥公司製)、DK Ester(註冊商標)F70分別承載在各層的意思。

〈蛋白酶的反應性〉

使用實施例10、15～17、比較例13、14的多層試驗片，對蛋白酶的反應性進行評價。

所得到的評價結果示於表13。

根據蛋白酶反應性的評價結果，作為界面活性劑較佳係促進蛋白酶反應的效果優異、HLB值為10～20的非離子性界面活性劑。

〈血紅素A1c值校準曲線的製作：HbA1c測量性能評價用試樣〉

使用實施例1～4、比較例2的多層試驗片，製作HbA1c值的校準曲線，對相關性進行評價。所得到的評價結果示於表14。

〈血紅素A1c值的測量〉

使用實施例1～4、比較例2的多層試驗片，使用上一項所得到的HbA1c值的校準曲線，計算出HbA1c值。所得到的評價結果示於表15。

根據以上結果，使用本發明的多層試驗片測量的血紅素A1c值與使用生物化學自動分析裝置測量的血紅素A1c值非常一致。並且，由於本發明的多層試驗片不易受可能存在於待測試樣中但非由糖化血紅素而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響，且具有優異的保存穩定性，因此通過使用本發明的多層試驗片，能夠正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅素量進行比色定量。

產業上的可利用性

通過使用本發明的多層試驗片，能夠在診斷現場正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅素量進行比色定量，並且，由於本發明的多層試驗片不易受可能存在於待測試樣中但非由糖化血紅素而來的糖化胺基酸和/或糖化肽的影響，且具有優異的保存穩定性，因此希望對以基於預防醫學的臨床檢查領域、診斷醫療領域、治藥領域以及保健醫學領域為首的生命科學領域的產業界作出較大貢獻。

圖1是本實施例中使用的用於上下夾持試驗片將其固定的板狀夾具。本夾具設置有兩個貫穿孔。

Claims

一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序積層；而且所述多層試驗片不具有血液分離層；其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材；(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材。
一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序積層；在(a)層和(b)層中的不同的層上分別承載過氧化酶和氧化還原系顯色試劑；而且所述多層試驗片不具有血液分離層；其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材；(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材。
如申請專利範圍第1或2所述的多層試驗片，其中所述多層試驗片在(a)層和(b)中的至少一層上還承載有界面活性劑。
一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層、(b)層與(c)層，所述(a)層、(b)層與(c)層從待測試樣點樣面按(a)層和(b)層及(c)層、(a)層和(c)層及(b)層或(c)層和(a)層及(b)層的順序積層；而且所述多層試驗片不具有血液分離層；其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材；(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材；(c)層：至少承載有除蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。
一種多層試驗片，其係用於對糖化血紅素含量進行比色定量，其特徵在於：所述多層試驗片至少積層有下述(a)層、(b)層與(c)層，所述(a)層、(b)層與(c)層從待測試樣點樣面按(a)層和(b)層及(c)層、(a)層和(c)層及(b)層或(c)層和(a)層及(b)層的順序積層；在(a)層、(b)層與(c)層中的不同的層上分別承載過氧化酶和氧化還原系顯色試劑；而且所述多層試驗片不具有血液分離層；其中，(a)層：至少承載有糖化胺基酸氧化酶的高分子基材；(b)層：至少承載有蛋白酶的高分子基材；(c)層：至少承載有除蛋白酶和糖化胺基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。
如申請專利範圍第4或5項之多層試驗片，其中所述多層試驗片在(a)層、(b)層與(c)層中的至少一層上還承載有界面活性劑。
如申請專利範圍第1至6項中任一項之多層試驗片，其中蛋白酶是選自至少由來自杆狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲黴菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈黴菌(Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶組成的組中的一種以上。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之多層試驗片，其中氧化還原系顯色試劑是最大吸收波長為600nm～800nm的無色色素。
如申請專利範圍第1至8項中任一項之多層試驗片，其中界面活性劑是親水親油平衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value：HLB Value)為10～20的非離子性界面活性劑。
一種測量方法，其特徵在於：所述測量方法使用如申請專利範圍第1至9項中任一項之多層試驗片，至少經過以下步驟(i)～(iii)對糖化血紅素含量進行比色定量；步驟(i)：在上述多層試驗片上表面上點樣待測試樣的步驟；步驟(ii)：從與上述多層試驗片的待測試樣點樣面相反的面利用反射光測量反射率和/或吸光度的步驟；以及步驟(iii)：從所得的反射率和/或吸光度計算出選自由血紅素含量、糖化血紅素含量、糖化血紅素含量與血紅素含量的比所組成的組中的一個以上的步驟。
如申請專利範圍第10項之測量方法，其中待測試樣為全血樣本。