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JP4160038B2 - 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）核酸リガンド複合体 - Google Patents

血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）核酸リガンド複合体 Download PDF

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Description

発明の分野
本明細書には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性２’−フルオロ（２’−Ｆ）ピリミジン系ＲＮＡリガンドを記載する。このような核酸リガンドを同定するために本発明で用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これはＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（指数的濃縮による系統的リガンド進化）の頭字語である。本発明はさらに、ＳＥＬＥＸ法によりＶＥＧＦ核酸リガンドを同定し、このＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複合体を調製する方法を包含する。本発明はさらに、１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複合体を包含する。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築体（ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を使用することにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、療法用または診断用薬剤をＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、ＶＥＧＦを発現している生物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤をターゲティングする方法であって、複合体がさらに脂質構築体と結合し、ＶＥＧＦ核酸リガンドがさらにその脂質構築体の外側と結合している方法に関する。
発明の背景
Ａ．ＳＥＬＥＸ
核酸は主に情報の役割をもつというのが長年の定説であった。指数的濃縮による系統的リガンド進化（ＳＥＬＥＸと呼ばれる）として知られる方法によって、核酸はタンパク質と異なる三次元構造多様性をもつことが明らかになった。ＳＥＬＥＸは高い特異性でターゲット分子に結合する核酸分子をインビトロ進化させる方法であり、下記に記載されている：米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９０年６月１１日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“核酸リガンドの同定法”、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）；これらをそれぞれ本明細書に援用する。これらの各特許出願（本明細書においてはこれらをまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ）には、目的とするいずれかのターゲット分子に対する核酸リガンドを調製するための、基本的には新規な方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法によれば、核酸リガンドと呼ばれる一群の生成物が得られる。これらのリガンドはそれぞれユニークな配列をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ。ＳＥＬＥＸにより同定された核酸リガンドはそれぞれ、特定のターゲット化合物または分子に特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が実質的にいかなる化合物（モノマーであってもポリマーであっても）についてもリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）のに十分な多様な二次元および三次元構造の形成能、ならびにそれに十分な化学的多能性をそれらのモノマー内にもつという、新しい洞察に基づく。いかなるサイズまたは組成の分子も、ターゲットとすることができる。
ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条件下で混合物をターゲットと接触させ、ターゲット分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分配し、この核酸−ターゲット複合体を解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて核酸リガンド濃縮混合物となす工程を含み、次いで結合、分配、解離および増幅の各工程を目的に応じたサイクル数で再反復して、ターゲット分子に対し特異性の高い高親和性核酸リガンドを得る。
本発明により認識されるように、ＳＥＬＥＸ法は、核酸が化合物として広範な形状、サイズおよび立体配置のアレイを形成することができ、生物学的系内で核酸が示すよりはるかに広いレパートリーの結合その他の機能を示しうることを証明する。
本発明者らは、いずれか特定のターゲットに対する核酸リガンドを同定しうるものと類似の様式で、ＳＥＬＥＸまたはＳＥＬＥＸ様方法を利用していずれか特定の反応を促進しうる核酸を同定できることを認識した。理論的には、核酸約１０１３〜１０１８の候補混合物内に、多様な物理的および化学的相互作用のそれぞれを促進するのに適した形状をもつ核酸が少なくとも１つ存在すると本発明者らは仮定する。
多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択することが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子（非ペプチド系であってもよい）を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法が記載されている。米国特許出願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，５６７，５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法が記載されている。
ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，６６０，９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２’−ヌクレオチドを製造するための新規方法”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。
ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包含する。これはたとえば米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体中において、親油性化合物、たとえばジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールと結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／７３９，１０９号、１９９６年１０月２５日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体中において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、またはグリセロリン脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／８９７，３５１号、１９９７年７月２１日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸複合体”に記載されている。基本的ＳＥＬＥＸ法の変更につき記載した上記特許出願それぞれを全体として本明細書に援用する。
Ｂ．脂質構築体
脂質二重層小胞は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をもつ個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水性部分はホスフェート、グリセロホスフェート、カルボキシ、サルフェート、アミノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。親油性基の例は、飽和または不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロール類（たとえばコレステロール）および他の薬剤学的に許容しうる佐剤（α−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。
リポソームはこれらの二重層小胞の集合体であり、主に、脂肪酸鎖から構成される２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に暴露されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、球状二重膜を形成する。したがって膜のそれぞれの側は親水性表面となり、一方、膜の内部は親油性媒質を含む。これらの膜を、内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で薄い水の層で分離された一連の同心球状膜として配置させることができる。これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を付与して、小さな小胞、または単膜小胞（ＵＶ）に変換することができる。
療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒である薬物の送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対し感受性の組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。リポソームは長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもでき、これにより投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静脈内送達に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供できる。
多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎となりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれらの投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であるという理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアランス速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。
リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違いが生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付着させるものである。抗体はそれらの対応する抗原に対し高い特異性をもつことが知られており、リポソームの表面に付着されたが、多くの場合、結果は成功とはいえなかった。しかし抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティングさせる幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第５，０１９，３６９号、第５，４４１，７４５号、または第５，４３５，９８９号参照。
研究者らが積極的に追求している領域の開発は、特定の細胞タイプのみでなく、細胞の細胞質中へ、さらには核中へ薬剤を送達することである。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイムおよびタンパク質など、生物学的薬剤の送達に特に重要である。この領域の有望な療法の試みは、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを疾病の処置に用いるものである。しかしアンチセンス法の有効適用に際し生じる重大な問題のひとつは、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオチドがターゲット細胞に達する前に体液中で、細胞内および細胞外酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解されることである。静脈内投与によっても腎臓により血流から速やかにクリアランスされ、有効な細胞内薬物濃度を生じるのには取込みが不十分である。リポソーム封入は分解酵素からオリゴヌクレオチドを保護し、循環半減期を延長し、リポソームが食作用されるため取込み効率を高める。こうしてオリゴヌクレオチドをインビボでそれらの目的ターゲットに到達させ、細胞に送達することができる。
研究者らがアンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に付着させた数例が報告されている。しかしアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内薬剤として有効であるにすぎない。上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体をターゲティングするアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドが、ポリエチレングリコールスペーサーによりフォレートに結合させたリポソーム（フォレート−ＰＥＧ−リポソーム）に封入され、フォレート受容体仲介エンドサイトーシスにより培養ＫＢ細胞中へ送達された（Ｗａｎｇら、（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：３３１８−３３２２）。さらに、アルキレンジオールがオリゴヌクレオチドに結合された（Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，２４５，０２２号）。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させた親油性化合物が文献に示されている（欧州特許第４６２ １４５Ｂ１号）。
リポソームへの生物学的薬剤の装填は、脂質配合物への含有または予め形成したリポソームへの装填により達成できる。オリゴペプチドおよびオリゴ糖リガンドをリポソームの外面に受動的にアンカリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）させることが記載されている（Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：１１１：１１８）。
Ｃ．ＶＥＧＦ
既存の内皮からの新たな血管の増殖（血管形成）は、健康な成人では正および負の調節因子の対抗する作用によって厳密に制御されている。増殖性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬および癌を含めた特定の病的状態では正の調節因子が支配し、血管形成が疾病の進行の一因となる（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：２７−３１に概説）。癌の場合、血管形成が腫瘍の増殖および転移の律速段階となるという考え（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９７１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２−１１８６）が、現在かなりの実験的証拠により支持されている（Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ ７１：１３６８−１３８３；ＦｉｄｌｅｒおよびＥｌｌｉｓ（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：１８５−１８８；Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６に概説）。
腫瘍組織の血管量は、胸部癌（Ｗｅｉｄｎｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７）、前立腺癌（Ｗｅｉｄｎｅｒら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：４０１−４０９）、脳腫瘍（Ｌｉら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：８２−８６）、および黒色腫（Ｆｏｓｓら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２９００−２９０３）における強い負の予後指標である。
現在までに多数の血管形成性増殖因子が報告されており、それらのうち血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が生理学的および病的血管形成の正の調節因子として重要な役割を果たしていると思われる（Ｂｒｏｗｎら（１９９６）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓｅｎ監修）に概説、ビルクハウゼル、バーゼル、印刷中；Ｔｈｏｍａｓ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０３−６０６に概説）。ＶＥＧＦは、内皮細胞を選択的に刺激して増殖、移動させ、マトリックス分解酵素を産生する、分泌型ジスルフィド結合ホモ二量体である（Ｃｏｎｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１３２３−１３２７；ＦｅｒｒａｒａおよびＨｅｎｚｅｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：８５１−８５８；Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚｅｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３１１−７３１５；Ｐｅｐｐｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１：９０２−９０６；Ｕｎｅｍｏｒｉら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５３：５５７−５６２）。これらはすべて新たな血管の形成に必要なプロセスである。ＶＥＧＦは既知の唯一の内皮細胞特異性マイトジェンであるほか、それが高分子に対する一過性の血管透過性増大を誘発する効力をもつ点で、血管形成性増殖因子のうちで独特である（したがってその最初の別名は、血管透過性因子、ＶＰＦである）（Ｄｖｏｒａｋら（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：１６６−１７４；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３−９８５；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：５６２９−５６３２）。血管透過性増大とその結果起きる血管外空間での血漿タンパク質沈着が、内皮細胞の移動のための一時マトリックスを提供することによって新たな血管形成を助成する（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。実際、透過性過剰は腫瘍に伴うものを含めて新生血管の特徴である（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。さらに、組織低酸素により誘発される代償性血管形成がＶＥＧＦにより仲介されることは、現在分かっている（Ｌｅｖｙら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４６−２７５３；Ｓｈｗｅｉｋｉら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４５）。
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子のオータナティブスプライシングの結果、４形態（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）で生じる（Ｈｏｕｃｋら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０６−１８１４；Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１９４７−１１９５４）。小さい方の２形態は拡散可能であるが、大きい方の２形態はそれらがヘパリンに対し高い親和性をもつため主に細胞膜に局在したままである。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンに結合し、最も豊富な形態である。ヘパリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、受容体に対する親和性がより低く（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５５１９−５５２３）かつマイトジェン効力も低い（Ｋｅｙら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８−７７９５）ように思われる。ＶＥＧＦの生物学的作用は、その発現が内皮由来の細胞に著しく限定された２種類のチロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ）により仲介される（ｄｅＶｒｉｅｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９９１；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：８３５−８４６；Ｔｅｒｍａｎら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：５１９−５２４）。高親和性結合にはこれら両方の機能性受容体の発現が必要であるが、内皮細胞における走化性およびマイトジェン性のシグナル発生は、主にＫＤＲ受容体により起きると思われる（Ｐａｒｋら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６−２５６５４；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１３５−１４７；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９８８−２６９９５）。血管の発生にＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体が重要であることは、ＶＥＧＦ遺伝子の１つの対立遺伝子を欠如するマウス（Ｇａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２）またはＦｌｔ−１の両方の対立遺伝子を欠如するもの（Ｆｏｎｇら（１９９５）３７６：６６−７０）またはＦｌｋ−１遺伝子を欠如するもの（Ｓｈａｌａｂｙら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６２−６６）において最近証明された。それぞれの場合、明らかに異常な血管形成がみられ、その結果、胚が死に至る。
ＶＥＧＦは、実質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌される（Ｂｒｏｗｎら（１９９７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓｅｎ監修）、ビルクハウゼル、バーゼル、ｐｐ．２３３−２６９）。ＶＥＧＦおよびその受容体が腫瘍の増殖の一因であることの直接的な証拠が、ＶＥＧＦに対する中和抗体により（Ｋｉｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４）、優性ネガティブＶＥＧＦ受容体ｆｌｋ−１の発現により（Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１６１５−１６２０；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６７：５７６−５７９）、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ活性の低分子量阻害薬により（Ｓｔｒａｗｎら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３５４０−３５４５）、またはＶＥＧＦ ｍＲＮＡに対するアンチセンス配列の発現により（Ｓａｌｅｈら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３９３−４０１）、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻止できるという証明により得られた。重要なのは、腫瘍の転移発生率もＶＥＧＦアンタゴニストによって著しく低下することが認められた点である（Ｃｌａｆｆｅｙら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１７２−１８１）。
ＶＥＧＦ阻害薬は抗癌薬としての使用のほか、過度の血管形成を特徴とする多様な増殖性疾患にも有用であり、これには乾癬、眼障害、膠原病および慢性関節リウマチが含まれる。大部分のタイプの腫瘍はＶＥＧＦを産生することが知られているが、機能性ＶＥＧＦ受容体を発現することは最近まで示されていなかった。カポジ肉腫（ＫＳ）細胞は多量のＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能性ＶＥＧＦ受容体をも発現し、したがってＶＥＧＦをオートクリン増殖に利用することが示された。カポジ肉腫は一般に、慣用される代謝拮抗性薬物を用いて治療される。しかしＫＳ患者に化学療法を採用することの主な欠点は、これに伴って免疫抑制が誘導されることであり、これは免疫系が既に低下している患者には重大な結果をもたらす。代替療法の必要性は、ＫＳ病変が出現し始めているが他の点では患者はかなり健康であると感じている疾病初期に特に大きい。これに関し、ダウノルビシンなどの化学療法薬をリポソームに封入するのは、抗腫瘍効力を維持しつつ化学療法の副作用を最小限にする有望な方法であることが、最近証明された。内皮由来の活性化した細胞、たとえば本明細書に記載する核酸リガンドＶＥＧＦアンタゴニストに選択的にターゲティングする低毒性薬物は、ＫＳの処置にきわめて有益であろう。
ＶＥＧＦ核酸リガンドに関する他の領域の臨床用途の可能性は、過度の血管形成を特徴とする眼障害である。そのような障害の例は、黄斑変性および糖尿病性網膜症である。黄斑変性の場合、黄斑（最高視力に関係する網膜部分）下の進行性脈絡膜血管形成が視覚を妨害する。糖尿病性網膜症の場合、網膜における血管形成が視覚を妨害する。黄斑変性および糖尿病性網膜症における血管増殖を開始する最初の刺激は現在分かっていないが、ＶＥＧＦは重要な血管形成誘発因子であると思われる（Ｌｏｐｅｚ，Ｐ．Ｆ．ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，８５５−８６８；Ｋｌｉｆｆｅｎ，Ｍ．ら（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８１，１５４−１６２；Ｋｖａｎｔａ，Ａ．ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，１９２９−１９３４；Ｐａｑｕｅｓ．ら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２３：１２５−１３０）。したがってＶＥＧＦの阻害薬は黄斑変性において血管形成を減少させるのに有用となりうる。
発明の概要
本明細書には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性２’−フルオロ（２’−Ｆ）−修飾ピリミジンＲＮＡリガンドを記載する。このような核酸リガンドを同定するために本発明で用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これは指数的濃縮による系統的リガンド進化の頭字語である。本明細書に記載するリガンドは、３０または４０の隣接位置でランダム化された当初約１０１４ＲＮＡ分子のプールから選択された。本明細書には図２〜６に示す進化したリガンドが含まれる。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核酸混合物をＶＥＧＦと接触させ、（ｂ）候補となる混合物の員子をＶＥＧＦに対する親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＶＥＧＦへの結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得ることにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＶＥＧＦのリガンドである）を同定し、同定したこれらのＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を含む。
本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む脂質構築体を包含する。本発明はさらに、複合体を含む脂質構築体の製造方法であって、複合体がＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物からなる方法に関する。
他の態様において本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与することに関する。本発明はさらに、この複合体をさらに脂質構築体と結合させることにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。
本発明の目的は、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体、およびそれを製造する方法を提供することである。本発明の他の目的は、複合体を含む脂質構築体を提供することである。本発明の他の目的は、改良された薬物動態学的特性を備えた、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを提供することである。
ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることが好ましい。より好ましくは、ＰＥＧは約１０〜８０Ｋの分子量をもつ。最も好ましくは、ＰＥＧは約２０〜４５Ｋの分子量をもつ。ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、親油性化合物はグリセロリン脂質であることが好ましい。本発明の好ましい態様において、脂質構築体は好ましくは脂質二重層小胞、最も好ましくはリポソームである。好ましい態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。
ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）に共有結合した非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）はターゲティング能に作用することができる。
さらにＶＥＧＦ核酸リガンドは、複合体の一部ではない脂質構築体と共有結合または非共有結合による相互作用により結合することができる。
さらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築体または非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物／ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を含む脂質構築体を目的とする本発明の態様であって、脂質構築体が内部コンパートメントを定める膜を備えたタイプのもの（たとえば脂質二重層小胞）である場合、脂質構築体と会合したＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体は脂質構築体の膜と結合するか、またはコンパートメント内に封入されていてもよい。ＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体の膜と結合した態様の場合、ＶＥＧＦ核酸リガンドは膜の内側に面した部分または外側に面した部分と結合し、これによりＶＥＧＦ核酸リガンドが小胞の内側または外側へ突出していてもよい。特定の態様では、予め形成した脂質構築体の外側にＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を受動的に装填することができる。核酸リガンドが脂質構築体から突出した態様の場合、ＶＥＧＦ核酸リガンドはターゲティング能に作用することができる。
脂質構築体のＶＥＧＦ核酸リガンドがターゲティング能に作用する場合、脂質構築体はさらに療法用または診断用薬剤と結合していてもよい。１態様において、療法用または診断用薬剤は脂質構築体の外側に結合している。他の態様においては、療法用または診断用薬剤は脂質構築体に封入されているか、または脂質構築体の内側に結合している。さらに他の態様において、療法用または診断用薬剤は複合体と結合している。１態様において、療法用薬剤は薬物である。他の態様において、療法用または診断用薬剤は１またはそれ以上の他の核酸リガンドである。
本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、血管形成を阻害する方法を提供することである。本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、腫瘍の増幅を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、カポジ肉腫を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、黄斑変性を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、糖尿病性網膜症を阻害する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、療法用または診断用薬剤をＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、ＶＥＧＦを発現している生物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤をターゲティングする方法であって、複合体がさらに脂質構築体と結合し、ＶＥＧＦ核酸リガンドがさらにその脂質構築体の外側と結合している方法を提供することである。
これらおよび他の本発明の目的、ならびに本発明の性質、範囲および有用性は、以下の記載および請求の範囲の記載から当業者に明らかになるであろう。
発明の詳細な記述
定義：
“共有結合”は、電子の共有により形成される化学結合である。
“非共有結合による相互作用”は、分子が共有結合以外の、イオン相互作用および水素結合を含めた相互作用により互いに保持されるという意味である。
“親油性化合物”は、脂質および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相と結合するか、またはそれらに分配される傾向をもつ化合物であり、実質的に親油性成分からなる構造体がこれに含まれる。親油性化合物には、脂質、ならびに脂質（および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相）と結合する傾向をもつ非脂質含有化合物が含まれる。コレステロール、リン脂質、ならびにグリセロ脂質、たとえばジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロール、ならびにグリセロールアミド脂質は、親油性化合物の他の例である。本発明の好ましい１態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合する親油性化合物は、下記の構造をもつグリセロ脂質である：
Figure 0004160038
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｏ（ＰＯ３）−ＣＨ２−；ならびにＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ２−ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＯ−、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＯＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ（ＣＯ）ＯＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ（ＣＯ）Ｏ−およびＸ−よりなる群から選択され、その際少なくとも１つはＸ−でなければならず、Ｘは独立して（ＰＯ４）、ＯおよびＣＨ２ＯＣ＝Ｏよりなる群から選択され、ここでｎ＝０〜３０、好ましくは１０〜２０である。ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｏ（ＰＯ３）−ＣＨ２−である場合、親油性化合物はリン脂質である。ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ２−ＣＨ２−である場合、親油性化合物はグリセロールアミド脂質である。ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｎＯ−、またはＣＨ３（ＣＨ２）ｎＯＣＨ２−である場合、親油性化合物はジアルキルグリセロ脂質である。ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｎ（ＣＯ）ＯＣＨ２−、またはＣＨ３（ＣＨ２）ｎ（ＣＯ）Ｏ−である場合、親油性化合物はジアシルグリセロ脂質である。好ましい態様においてはＲ３はＸ−である。
本明細書中で用いる“複合体”は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有結合させることにより形成される分子を表す。本発明の特定の態様において、複合体はＡ−Ｂ−Ｙとして示され、ここでＡは本明細書に記載する親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物であり；Ｂは任意であって１またはそれ以上のリンカーＺであり；ＹはＶＥＧＦ核酸リガンドである。
本発明に関し“脂質構築体”は、脂質、リン脂質、またはその誘導体を含有する構造体であり、多様な構造様式を含む。これらの脂質は水性懸濁液中に受容されることが知られている。これらの構造体には脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルション、脂質リボンまたはシートが含まれるが、これらに限定されない。これらは、薬剤学的に許容しうることが知られている種々の薬物および成分と複合体を形成していてもよい。好ましい態様において、脂質構築体はリポソームである。好ましいリポソームは単層であり、２００ｎｍ未満の相対サイズをもつ。脂質構築体の一般的な追加成分には、特にコレステロールおよびα−トコフェロールが含まれる。脂質構築体は単独で、または個々の用途に望まれる特性を備えていると当業者が認めるいかなる組合わせでも使用できる。さらに、脂質構築体およびリポソーム形成の技術的観点は当業者に周知であり、当技術分野で慣用されるいかなる方法も本発明に採用できる。
本明細書中で用いる“核酸リガンド”は、ターゲットに対し望ましい作用をもつ、天然には存在しない核酸である。本発明のターゲットはＶＥＧＦであり、したがってこの語はＶＥＧＦ核酸リガンドである。望ましい作用には、ターゲットを結合すること、触媒作用によりターゲットを変化させること、ターゲットまたはターゲットの機能活性を修飾／変化させるようにターゲットと反応すること、自殺阻害物質と同様にターゲットと共有結合すること、ターゲットと他の分子の反応を促進することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、その作用はＶＥＧＦに対する特異的結合親和性であり、その際、この核酸リガンドはＶＥＧＦが結合する既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。
本発明の好ましい態様において、本発明の複合体および脂質構築体のＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。ＶＥＧＦ核酸リガンドは、候補となる核酸混合物（核酸がＶＥＧＦのリガンドである）から下記の方法で同定される：ａ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させる、その際、ＶＥＧＦに対し候補混合物と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる；ｂ）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そしてｃ）これらの高親和性核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物を得る（米国特許出願第０８／２３３，０１２号、１９９４年４月２５日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチド”；米国特許出願第０８／４４７，１６９号、１９９５年５月１９日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド”参照；これらを本明細書に援用する）。
“候補混合物”は、目的とするリガンドをそれから選択する、種々の配列の核酸の混合物である。候補混合物源は、天然核酸もしくはそのフラグメント、化学的に合成した核酸、酵素により合成した核酸、または以上の方法の組合わせにより製造した核酸から得ることができる。好ましい態様において、増殖プロセスを促進するために、それぞれの核酸はランダム領域を囲む固定配列を含む。
“核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのいかなる化学修飾体をも意味する。修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、たとえばヌクレオシド間ホスホロチオエート結合、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングのような３’および５’修飾も含めることができる。
“非免疫原性高分子量化合物”は、一般に免疫原応答を生じない、約１０００〜１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約１０００〜５００，０００Ｄａ、最も好ましくは約１０００〜２００，０００Ｄａの化合物である。本発明の目的に関し、免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫原性高分子量化合物の例には、ポリアルキレングリコールおよびポリエチレングリコールが含まれる。本発明の好ましい１態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合した非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールであり、構造Ｒ（Ｏ（ＣＨ２）ｘ）ｎＯ−をもち、ここでＲは独立してＨおよびＣＨ３よりなる群から選択され、ｘ＝２〜５であり、ｎはほぼポリアルキレングリコールの分子量／１６＋１４ｘである。本発明の好ましい態様において、分子量は約１０〜８０ｋＤａである。最も好ましい態様において、ポリアルキレングリコールの分子量は約２０〜４５ｋＤａである。最も好ましい態様において、ｘ＝２、ｎ＝９×１０２である。１またはそれ以上のポリアルキレングリコールが同一ＶＥＧＦ核酸リガンドに結合して、分子量の和が好ましくは約１０〜８０ｋＤａ、最も好ましくは約２０〜４５ｋＤａであってもよい。特定の態様においては、非免疫原性高分子量化合物も核酸リガンドであってよい。
“脂質二重層小胞”は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をもつ個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水性部分はホスフェート、グリセロホスフェート、カルボキシ、サルフェート、アミノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。非極性基の例は、飽和または不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロール類（たとえばコレステロール）および薬剤学的に許容しうる他の成分（α−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。
“リポソーム”は脂質二重層小胞の集合体であり、主に、長い脂肪酸鎖から構成される２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に暴露されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、二重膜を形成する。したがって膜のそれぞれの側は親水性表面を提供し、一方、膜の内部は親油性媒質を含む。これらの膜は、形成されたとき一般に内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で層間水相により分離された、閉じた同心膜の系として配列する。これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を付与して、単膜小胞（ＵＶ）に変換することができる。
“カチオンリポソーム”は、生理学的ｐＨにおいて全体として正の電荷をもつ脂質成分を含有するリポソームである。
“ＳＥＬＥＸ”法は、ターゲットと望ましい様式で相互作用する（たとえばタンパク質への結合）核酸リガンドの選択と、選択したこれらの核酸の増幅との組合わせを伴うものである。選択／増幅の工程を反復循環することにより、きわめて多数種類の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も強く相互作用する１種類または少数の核酸を選択することができる。選択した目標に達するまで、この選択／増幅操作の循環を続ける。ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に記載されている。
“ターゲット”は、それに対するリガンドを得たいという関心のあるいかなる化合物または分子であってもよい。ターゲットは、タンパク質（たとえばＶＥＧＦ、トロンビンおよびセレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態の類似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、増殖因子など、制限がない。本発明の主なターゲットはＶＥＧＦである。
“改良された薬物動態特性”とは、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に共有結合するか、または脂質構築体と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドが、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に結合していない、または脂質構築体と結合していない同一ＶＥＧＦ核酸リガンドと対比して、より長い循環半減期をインビボで示すことを意味する。
“リンカー”は、２以上の分子を共有結合または非共有結合による相互作用により連結し、これらの分子１またはそれ以上がもつ機能特性を保存する様式で分子を空間的に分離しうる分子である。リンカーはスペーサーとしても知られる。リンカーの例には、図１Ｍ〜１Ｐに示す構造体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いる“療法”には、治療および／または予防が含まれる。療法という場合、これはヒトおよび他の動物について述べたものである。
本発明は、２’−修飾ヌクレオチドを含む、ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンドを包含する。本発明はさらに、表２〜６（配列番号：１５−１３２）に示す、ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンドを包含する。より詳細には、本発明は表２〜６に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同な核酸配列、および実質的に同じＶＥＧＦ結合能をもつ核酸配列を包含する。実質的に相同とは、７０％以上、きわめて好ましくは８０％以上、さらに最も好ましくは９０％、９５％または９９％以上の一次配列相同性の程度を意味する。本明細書に記載する相同％は、比較する配列中の一致するヌクレオチド残基とアラインする２配列のうち小さい方にみられるヌクレオチドの％として計算される。その際、アラインメントを補助するために１０ヌクレオチドの長さに１ギャップを導入できる。実質的に同じＶＥＧＦ結合能とは、その親和性が、本明細書に記載するリガンドの親和性の１桁または２桁以内であることを意味する。ある配列 ― 本明細書に具体的に記載したものと実質的に相同 ― が同じＶＥＧＦ結合能をもつか否かの判定は、当業者が容易になしうる。
表２〜６（配列番号：１５−１３２）に示す、ＶＥＧＦの核酸リガンドの配列相同性をみると、一次相同性をほとんど、または全くもたない配列が、実質的に同じＶＥＧＦ結合能をもつ場合があることが分かる。これらの理由から、本発明は表２〜６に示す核酸リガンドと実質的に同じ推定構造または構造モチーフおよびＶＥＧＦ結合能をもつ核酸リガンドをも包含する。実質的に同じ構造または構造モチーフは、ツッカーフォールド（Ｚｕｃｋｅｒｆｏｌｄ）プログラム（Ｚｕｃｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２参照）を用いる配列アラインメントにより推定できる。当技術分野で知られているように、二次構造および構造モチーフを推定するために他のコンピュータープログラムを使用できる。溶液中または結合構造体としての実質的に同じ推定構造または構造モチーフの核酸リガンドは、ＮＭＲそのほか、当技術分野で知られている技術を用いて推定することもできる。
本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核酸混合物をＶＥＧＦと接触させ、（ｂ）この候補混合物の員子をＶＥＧＦに対する親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＶＥＧＦへの結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得ることにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＶＥＧＦのリガンドである）を同定し、同定したこれらのＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。
本発明はの他の目的は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体をを提供することである。このような複合体は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合していないＶＥＧＦ核酸リガンドに優る下記の利点１またはそれ以上をもつ：１）改良された薬物動態特性、および２）改良された細胞内送達能、または３）改良されたターゲティング能。さらに脂質構築体と結合した複合体も同じ利点をもつ。
複合体、またはＶＥＧＦ核酸リガンドもしくは複合体を含む脂質構築体は、これらの利点のうち１、２または３つをもつであろう。本発明の脂質構築体は、たとえば下記のものからなる：ａ）リポソーム、ｂ）リポソームの内部に封入された薬物、およびｃ）ＶＥＧＦ核酸リガンドと親油性化合物からなる複合体であって、複合体のＶＥＧＦ核酸リガンド成分が脂質構築体の外側と結合し、そこから突出しているもの。そのような場合、複合体を含む脂質構築体は、１）改良された薬物動態特性をもち、２）封入された薬物の細胞内送達能が増大し、かつ３）外側に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドにより、ＶＥＧＦを発現している予め選択された位置にインビボで特異的にターゲティングする。
他の態様において本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与する方法を提供する。本発明はさらに、この複合体を脂質構築体とさらに結合させることにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良する方法に関する。
他の態様において本発明の複合体は、親油性化合物、たとえばグリセロ脂質、または非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合した、ＶＥＧＦ核酸リガンドからなる。これらの場合、複合体の薬物動態学的特性はＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して向上するであろう。他の態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成し、この複合体を脂質構築体とさらに結合させるか、あるいはＶＥＧＦ核酸リガンドを脂質構築体に封入すると、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性がＶＥＧＦ核酸単独と比較して改良される。
多重のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が多重のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。脂質構築体が多重のＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体のみがある脂質構築体と比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。
本発明の特定の態様において、本発明の複合体は他の核酸リガンド１つ（二量体）またはそれ以上（多量体）に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む。この核酸リガンドはＶＥＧＦに対するものであってもよく、異なるターゲットに対するものであってもよい。多重のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が１またはそれ以上の他のＶＥＧＦ核酸リガンドに結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む本発明の態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。
非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物をＶＥＧＦ核酸リガンドの多様な位置に、たとえば塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５−位、プリンヌクレオチドの８−位、ホスフェートのヒドロキシル基、またはＶＥＧＦ核酸リガンドの５’もしくは３’末端のヒドロキシル基もしくは他の基に、共有結合させることができる。親油性化合物がグリセロ脂質であるか、または非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコールである態様では、それは好ましくはそのホスフェート基の５’もしくは３’ヒドロキシル基に結合する。最も好ましい態様では、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は核酸のホスフェート基の５’ヒドロキシル基に結合する。ＶＥＧＦ核酸リガンドへの非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の結合は、直接に、またはリンカーもしくはスペーサーを用いて行うことができる。脂質構築体が複合体を含む態様またはＶＥＧＦ核酸リンカーがリポソームに封入された態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体と脂質構築体との非共有結合による相互作用が好ましい。
核酸を療法に用いる際に生じる問題のひとつは、オリゴヌクレオチドがそれらのホスホジエステル形である場合、目的とする効果を表す前に、体液中で細胞内および細胞外酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解される可能性があることである。ＶＥＧＦ核酸リガンドのインビボ安定性を高めるために、またはＶＥＧＦ核酸リガンドの送達を向上もしくは仲介するために、ＶＥＧＦ核酸リガンドの特定の化学修飾を行うことができる。本発明において考慮するＶＥＧＦ核酸リガンド修飾には、ＶＥＧＦ核酸リガンド塩基またはＶＥＧＦ核酸リガンド全体に、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用および流動性を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングのような３’および５’修飾も含めることができる。
核酸リガンドをＳＥＬＥＸ法により得る場合、修飾はＳＥＬＥＸ前または後、いずれの修飾であってもよい。ＳＥＬＥＸ前修飾によれば、ＶＥＧＦに対する特異性および改良されたインビボ安定性の両方を備えたＶＥＧＦ核酸リガンドが得られる。２’−ＯＨ核酸リガンドにＳＥＬＥＸ後修飾を行うと、核酸リガンドの結合能に不都合な影響を与えずに、改良されたインビボ安定性が得ることができる。本発明のＶＥＧＦ核酸リガンドの好ましい修飾は、５’および３’ホスホロチオエートキャッピング、ならびに／あるいは３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合である。最も好ましい態様では、好ましいＶＥＧＦ核酸リガンド修飾は３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合である。さらに、一部または全部のヌクレオチドの２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、および２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾が好ましい。
本発明の他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドと非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の共有結合により、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合していないＶＥＧＦ核酸リガンドと比較して改良された薬物動態特性（すなわち、より遅いクリアランス速度）が得られる。
本発明の他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体をさらに脂質構築体と会合させることができる。この会合により、脂質構築体と会合していないＶＥＧＦ核酸リガンドと比較して改良された薬物動態特性が得られる。ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を共有結合または非共有結合による相互作用により脂質構築体と会合させることができる。好ましい態様において、会合は非共有結合相互作用による。好ましい態様において、脂質構築体は脂質二重層小胞である。最も好ましい態様において、脂質構築体はリポソームである。
本発明に用いるリポソームは当技術分野で現在知られている種々の方法または今後開発される方法のいずれによっても調製できる。一般にそれらはリン脂質、たとえばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、他の材料、たとえば中性脂質（たとえばコレステロール）、および界面改質剤、たとえば正に荷電した化合物（たとえばコレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースまたはアミノマンニトール誘導体）または負に荷電した化合物（たとえばリン酸ジアセチル、ホスファチジルグリセロール）を含有してもよい。多重膜リポソームは常法により、すなわち脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させて容器の内側に薄膜を残留させて、適切な容器または器の内壁に選択した脂質を沈着させるか、または噴霧乾燥することにより形成できる。次いで容器に水相を添加し、回転運動または渦撹拌運動を与えると、ＭＬＶが生成する。次いでＭＬＶのホモジナイゼーション、超音波処理または押出し（フィルターを通して）により、ＵＶを形成できる。さらに、界面活性剤分離法によりＵＶを形成できる。
本発明の他の態様において脂質構築体は、脂質構築体の表面と結合したターゲティング用ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）および封入された療法薬または診断薬を含む。好ましくは脂質構築体はリポソームである。予め形成したリポソームをＶＥＧＦ核酸リガンドと会合するように修飾してもよい。たとえばカチオン性リポソームは静電相互作用によりＶＥＧＦ核酸リガンドと結合する。グリセロ脂質などの親油性化合物に共有結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを、予め形成したリポソームに添加してもよく、これによりグリセロ脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質がリポソーム膜と結合する。あるいはリポソーム形成中にＶＥＧＦ核酸リガンドをリポソームと結合させてもよい。
リポソームが広範な療法薬または診断薬の封入または取込みに有利であることは当技術分野で周知である。多様ないかなる化合物もリポソーム内部の水性コンパートメントに収容できる。療法薬の具体例には、抗生物質、抗ウイルス性ヌクレオシド、抗真菌性ヌクレオシド、代謝調節薬、免疫モジュレーター、化学療法薬、毒素解毒薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれる。同様に、脂質二重層小胞に診断用放射性核種（たとえばインジウム１１１、ヨウ素１３１、イットリウム９０、リン３２またはガドリニウム）、ならびに蛍光物質、またはインビトロおよびインビボ用途において検出できる他の物質を装填することができる。療法薬または診断薬を水性内部にリポソーム壁により封入できることを理解すべきである。あるいは保有された薬剤が小胞壁形成材料の一部であってもよく、すなわちその材料に分散または溶解していてもよい。
リポソーム形成中に、水溶性キャリヤー物質を水和溶液に含有させることにより水性内部に封入し、そして親油性分子を脂質配合物に含有させることにより脂質二重層に取り込ませてもよい。特定の分子（たとえばカチオン性またはアニオン性の親油性薬物）の場合、予め形成したリポソーム中への薬物の装填は、たとえば米国特許第４，９４６，６８３号に記載された方法で達成できる。その開示事項を本明細書に援用する。薬物封入後、リポソームをゲルクロマトグラフィーまたは限外ろ過などの方法で処理して、封入されていない薬物を除去することができる。次いでリポソームを一般に無菌的にろ過して、懸濁液中に存在する可能性のある微生物を除去する。微生物は無菌処理によっても除去できる。
大型の親水性分子をリポソームで封入したい場合、逆相蒸発法（ＲＥＶ）または溶剤注入法などの方法で、比較的大きな単層小胞を形成できる。リポソーム形成のための他の標準法は当技術分野で知られている。たとえば商業的なリポソーム製造方法には、米国特許第４，７５３，７８８号に記載されたホモジナイゼーション法、および米国特許第４，９３５，１７１号に記載された薄膜蒸発法が含まれる。それらを本明細書に援用する。
療法薬または診断薬が脂質二重層小胞の表面と結合していてもよいことを理解すべきである。たとえば薬物をリン脂質またはグリセリドに結合させることができる（プロドラッグ）。このプロドラッグのリン脂質またはグリセリドの部分を脂質配合物に含有させることによりリポソームの脂質二重層に取り込ませるか、または予め形成したリポソーム中へ装填することができる（米国特許第５，１９４，６５４号および第５，２２３，２６３号参照。それらを本明細書に援用する）。
個々のリポソーム調製法が、意図する用途、および二重膜形成に用いる脂質の種類に依存することは当業者に自明である。
ＬｅｅおよびＬｏｗ（１９９４，ＪＢＣ，２６９：３１９８−３２０４）、ならびにＤｅＦｒｅｅｓら（１９９６，ＪＡＣＳ，１１８：６１０１−６１０４）は、リガンド−ＰＥＧ−脂質と脂質成分の同時配合物によりＰＥＧ−リガンドが内側と外側の両方に面したリポソームが得られることを最初に示した。受動アンカリングはＺａｌｉｐｓｋｙら（１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８：１１１−１１８）が、オリゴペプチドリガンドおよびオリゴ糖リガンドをもっぱらリポソーム外面にアンカリングする方法として概説した。彼らの報文に提示された中心的概念は、リガンド−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを調製し、次いで既存の脂質二重層中への脂質テイルの自然取込み（“アンカリング”）により、予め形成したリポソーム中へ配合しうるというものである。脂質基は、その疎水性脂質アンカーを水溶液から抜き出し、次いで疎水性脂質二重層中に配置することによって、より低い自由エネルギー状態に達するために、この挿入を行う。このような系の重要な利点は、オリゴ脂質がもっぱら脂質二重層の外側にアンカリングすることである。したがって、オリゴ脂質が内側に面した配向であることによりそれらの生物学的ターゲットとの相互作用に利用されないため浪費されるということはない。
細胞へのＶＥＧＦ核酸リガンド送達効率は、リポソームと細胞膜の融合を促進することが知られている脂質配合物および条件を採用することにより、最適化できる。たとえば、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンなど負に荷電した特定の脂質は、特に他の融合誘導物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）（たとえばＣａ２＋など多価カチオン、遊離脂肪酸、ウイルス性融合タンパク質、短鎖ＰＥＧ、リゾレシチン、洗浄剤および界面活性剤）の存在下で融合を促進する。ホスファチジルエタノールアミンも、膜融合を高め、同時に細胞送達を促進するために、リポソーム配合物に含有させることができる。さらに、たとえばカルボキシラート部分を含む遊離脂肪酸およびその誘導体を用いて、高いｐＨでは負に荷電し、低いｐＨでは中性またはプロトン化しているｐＨ感受性リポソームを調製できる。そのようなｐＨ感受性リポソームは、より高い融合傾向をもつことが知られている。
好ましい態様において、本発明のＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法で得られる。ＳＥＬＥＸは、米国特許出願第０７／５３６，４２８号、表題：指数的濃縮による系統的リガンド進化、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出願、表題：核酸リガンド、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題：核酸リガンドの同定法、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）に記載されている。それぞれ本明細書に援用するこれらの特許出願を、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。
ＳＥＬＥＸ法によれば、それぞれユニークな配列をもち、それぞれ目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ核酸分子である一群の生成物が得られる。ターゲット分子は好ましくはタンパク質であるが、特に炭水化物、ペプチドグリカンおよび多様な小分子も含めることができる。ＳＥＬＥＸ法は、生物学的構造体、たとえば細胞表面またはウイルスを、その生物学的構造体の一体部分である分子との特異的相互作用によりターゲティングするのにも使用できる。
ＳＥＬＥＸ法は、その最も基本的な形態では下記の一連の工程により定義される：
１）候補となる、種々の配列の核酸の混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列の領域（すなわち候補混合物の各員子が同じ位置に同じ配列を含む）およびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は以下のように選択される：（ａ）後記の増幅工程を補助する、（ｂ）ターゲットに結合することが分かっている配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の特定の構造様式の核酸の濃度を高める。ランダム配列は完全にランダムであってもよく（すなわちある塩基をいずれかの位置に見出す確率は１／４である）、または部分的にランダムであってもよい（たとえばある塩基をいずれかの位置に見出す確率は、０〜１００％のいずれの水準でも選択できる）。
２）ターゲットと候補混合物の員子の結合に好ましい条件下で、候補混合物を選択されたターゲットと接触させる。これらの状況は、ターゲットと候補混合物の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲットに対し最も強い親和性をもつ核酸の間に核酸−ターゲット対を形成するものと考えることができる。
３）ターゲットに対し最も高い親和性をもつ核酸を、ターゲットに対しより低い親和性をもつ核酸から分配する。候補混合物中には最高親和性の核酸に相当する配列はきわめて少数存在するにすぎない（おそらくわずか１分子の核酸）ので、一般に分配に際し有意量の核酸（約５〜５０％）が保持されるように分配基準を設定することが望ましい。
４）分配に際し、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつとして選択された核酸を、次いで増幅させて、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつ核酸が濃縮された新たな候補混合物を形成する。
５）上記の分配工程および増幅工程を反復することにより、新た形成された候補混合物が含有するユニーク配列はいっそう少なくなり、ターゲットに対する核酸の平均親和度は一般に高まるであろう。極端にはＳＥＬＥＸ法は、最初の候補混合物からターゲット分子に対し最も高い親和性をもつ核酸に相当する１または少数の核酸を含有する候補混合物を与えるであろう。
多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択することが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸと呼ばれる方法が記載されている。米国特許出願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，５６７，５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法が記載されている。米国特許出願第０７／９６４，６２４号、１９９２年１０月２１日出願、表題“ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１Ｒｅｖに対する核酸リガンド”（現在は米国特許第５，４９６，９３８号）には、ＳＥＬＥＸによって改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。米国特許出願第０８／４００，４４０号、１９９５年３月８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：化学ＳＥＬＥＸ”には、リガンドをそのターゲットに共有結合させる方法が記載されている。
ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，６６０，９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２’−修飾ヌクレオチドを製造するための新規方法：”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。
ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包含する。これはたとえば米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。ＳＥＬＥＸ法はさらに、特定のＶＥＧＦ核酸リガンドをジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールなどの親油性化合物と結合させることを包含する。これはたとえば米国特許出願第０８／７３９，１０９号、１９９６年１０月２５日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、またはグリセロリン脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／８９７，３５１号、１９９７年７月２１日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸複合体”に記載されている。基本的ＳＥＬＥＸ法の変更につき記載した上記特許出願それぞれを全体として本明細書に援用する。
ＳＥＬＥＸにより、高い親和性および卓越した特異性でターゲットと結合しうる核酸リガンドが同定される。これは核酸研究の分野で前例のない見事な成果である。これらの特性はもちろん当業者が療法用または診断用リガンドにおいて追求する望ましい特性である。
薬剤として用いるのに望ましい核酸リガンドを得るために、核酸リガンドは好ましくは（１）ターゲットに対し目的とする効果を達成しうる様式でターゲットに結合し；（２）目的効果を得るために可能な限り小さく；（３）可能な限り安定であり；かつ（４）選択したターゲットに対し特異的リガンドである。大部分の場合、核酸リガンドはターゲットに対し可能な限り最高の親和性をもつことが好ましい。さらに、核酸リガンドは促進性をもつことができる。
同一出願人による米国特許出願第０７／９６４，６２４号、１９９２年１０月２１日出願（‘６２４）（現在は米国特許第５，４９６，９３８号）には、ＳＥＬＥＸによって改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１ Ｒｅｖに対する核酸リガンドと題するこの‘６２４出願を本明細書に援用する。
ＳＥＬＥＸ法は、ランダム２’−アミノピリミジンＲＮＡライブラリーからＶＥＧＦに対する一群の高親和性ＲＮＡリガンドを同定し、ランダムｓｓＤＮＡライブラリーからｓｓＤＮＡリガンドを同定するために用いられた（米国特許出願第０８／２３３，０１２号、１９９４年４月２５日出願、表題：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチド の一部継続出願である、米国特許出願第０８／４４７，１６９号、１９９５年５月１９日出願、表題：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド
参照；これら両者を本明細書に援用する；Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：６８３−６９５も参照）。
ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）がターゲティング能に作用しうる態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドには、ＶＥＧＦ核酸リガンドがそのターゲットに結合しうるために保持しなければならない三次元構造がある。脂質構築体が複合体を含み、この複合体のＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体の表面から突出している態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドは、そのターゲット結合能が損なわれないように脂質構築体の表面に対し適正に配向しなければならない。これは、ＶＥＧＦ核酸リガンドをＶＥＧＦ核酸リガンドの結合用部分から離れた位置で付着させることにより達成できる。この三次元構造および適正な配向は、前掲のリンカーまたはスペーサーを用いることによっても保持できる。
複合体によりターゲティングする送達のために、多様な療法薬または診断薬のいずれも複合体に結合させることができる。さらに、脂質構築体によりターゲティングする送達のために、多様な療法薬または診断薬のいずれも前記の脂質構築体に結合させ、封入し、または取り込ませることができる。
複合体がたとえばリポソームに会合した親油性化合物およびＶＥＧＦ核酸リガンドからなる態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドは、抗腫瘍薬（たとえばダウノルビシン）または造影剤（たとえば放射性標識）の送達のために、ＶＥＧＦを発現している腫瘍細胞（たとえばカポジ肉腫）をターゲティングすることができる。腫瘍の周囲の細胞や組織もＶＥＧＦを発現する可能性があり、これらの細胞をターゲティングした抗腫瘍薬送達も有効であることを留意すべきである。
別態様において、ターゲット細胞へ送達すべき療法薬または診断薬が他の核酸リガンドであってもよい。
本発明によればさらに、送達すべき薬剤（たとえばプロドラッグ、受容体アンタゴニスト、または治療もしくは造影のための放射性物質）をリポソームの外面と結合するように複合体に取り込ませることができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドと同様に、これらの薬剤を共有結合または非共有結合による相互作用により結合させることができる。リポソームによりこれらの薬剤を細胞外からターゲティング送達し、その際リポソームはリンカーとして作用する。
他の態様では、非免疫原性高分子量化合物（たとえばＰＥＧ）をリポソームに結合させて、複合体の薬物動態特性を改良することができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドをリポソーム膜に結合させるか、または非免疫原性高分子量化合物に結合させ、これを膜に結合させてもよい。この方法で複合体を血液タンパク質から遮蔽し、こうしてＶＥＧＦ核酸リガンドがなおそのターゲットと接触して結合するのに十分な程度に露出した状態で、長期間循環させることができる。
本発明の他の態様では、２以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これにより同じＶＥＧＦ分子を互いに接近させることができ、これを利用してＶＥＧＦ分子間に特異的相互作用を生じさせることができる。
本発明の別態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび異なるターゲットに対する核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これによりＶＥＧＦを異なるターゲットに接近させることができ、これを利用してＶＥＧＦと他のターゲット間に特異的相互作用を生じさせることができる。ターゲットを接近させる方法としてリポソームを用いるほか、相互作用の強度を高めるためにリポソームに薬剤を封入できる。
複合体を含む脂質構築体は、ＶＥＧＦに多くの結合相互作用をもたらすことができる。これはもちろん複合体当たりのＶＥＧＦ数、および脂質構築体当たりの複合体数、ならびにそれぞれの膜中でのＶＥＧＦ核酸リガンドおよび受容体の移動度に依存する。有効結合定数は各部位についての結合定数の積と共に増大するので、多数の結合相互作用があることは実質的に有利である。すなわち、多数のＶＥＧＦ核酸リガンドを脂質構築体に結合させることにより、したがって多価を形成することにより、ターゲットに対する多重複合体の有効親和性（すなわちアビディティー）は、各部位についての結合定数の積と共に良好になるであろう。
本発明の特定の態様において、本発明の複合体はグリセロール脂質などの親油性化合物に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドからなる。この場合、複合体の薬物動態特性は、ＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して改良されるであろう。前記に述べたように、グリセロール脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質を、ＶＥＧＦ核酸リガンド上の多数の位置でＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合させることができる。グリセロール脂質を用いる態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドをホスホジエステル結合により脂質に結合させることが好ましい。
本発明の他の態様では、脂質構築体がＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む。この態様において、グリセロ脂質は他の親油性化合物と結合する傾向をもつため、グリセロ脂質がリポソームへのＶＥＧＦ核酸リガンドの取込みを補助することができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドと結合したグリセロ脂質を、配合物に含有させることにより、または予め形成したリポソームに装填することにより、リポソームの脂質二重層に取り込ませることができる。グリセロ脂質は、ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソームの内または外へ突出する様式で、リポソームの膜と結合することができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソームの外へ突出する態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドはターゲティング能に作用することができる。脂質構築体の薬物動態特性をさらに改良するために他の化合物を脂質構築体と結合させうることを理解すべきである。たとえばＰＥＧを脂質構築体の膜の外側に面した部分に結合させてもよい。
他の態様において、本発明の複合体は非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールまたはＰＥＧに共有結合したＶＥＧＦ核酸リガンドからなる。この態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して複合体の薬物動態特性が改良される。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧをＶＥＧＦ核酸リガンド上の種々の位置に共有結合させることができる。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧを用いる態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドを５’ヒドロキシル基によりホスホジエステル結合を介して結合させることが好ましい。
特定の態様では、多数の核酸リガンドを単一の非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールもしくはＰＥＧ、または親油性化合物、たとえばグリセロ脂質に結合させることができる。核酸リガンドはすべてがＶＥＧＦに対するものであってもよく、ＶＥＧＦと他のターゲットに対するものであってもよい。多数のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに他の態様では、多数のポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、グリセロール脂質分子を互いに結合させることができる。これらの態様では、１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドまたはＶＥＧＦおよび他のターゲットに対する核酸リガンドを、ポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、グリセロール脂質それぞれに結合させることができる。これにより、同様にターゲットに対するそれぞれの核酸リガンドのアビディティーが増大する。多数のＶＥＧＦ核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質に結合した態様では、ＶＥＧＦ間に特異的相互作用を生じさせるために、ＶＥＧＦ分子を互いに接近させることができる。ＶＥＧＦおよび異なるターゲットに特異的な多数の核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質に結合した態様では、ＶＥＧＦおよび他のターゲット間に特異的相互作用を生じさせるために、ＶＥＧＦおよび他のターゲットを互いに接近させることができる。さらに、ＶＥＧＦに対する核酸リガンドまたはＶＥＧＦおよび異なるターゲットに対する核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質に結合した態様では、薬物をポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質と結合させることもできる。したがって複合体はその薬物をターゲティング送達し、その際ポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質はリンカーとして作用する。
ＶＥＧＦ核酸リガンドはＶＥＧＦを選択的に結合する。したがってＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、またはＶＥＧＦ核酸リガンドもしくはその複合体を含む脂質構築体は、医薬または診断薬として有用である。したがって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＶＥＧＦ核酸リガンドを含むか、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を投与することにより、血管形成を阻止する方法を包含する。ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体および脂質構築体を用いて、不適性なＶＥＧＦ産生を伴ういずれかの疾病状態、特に血管形成を、治療、阻止、予防または診断できる。血管形成は月経周期および創傷治癒以外には、健康な成人で起きるのは稀である。しかし癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチ（これらに限定されない）を含めた種々の疾病状態では、血管形成は主な特徴である。したがって本発明は、糖尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチを、治療、阻止、予防または診断する方法をも包含する（これらに限定されない）。さらに、ＶＥＧＦは実質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌される。したがって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一部ではないＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することにより、癌を治療、阻止、予防または診断する方法を包含する。癌の１タイプであるカポジ肉腫（ＫＳ）では、細胞が多量のＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能性ＶＥＧＦ受容体をも発現し、したがってＶＥＧＦをオートクリン増殖に利用する。したがって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一部ではないＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することにより、カポジ肉腫を阻止する方法を包含する。
本発明の１態様において、脂質構築体はＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物からなる複合体を含み、さらに脂質構築体に封入された、または脂質構築体の内側と結合した診断薬もしくは療法薬を含む。好ましい態様において脂質構築体は脂質二重層小胞、より好ましくはリポソームである。療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒である薬物の送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対し感受性の組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。リポソームは長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもでき、これにより投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静脈内送達に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供できる。
多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎となりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれらの投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であるという理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアランス速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。
リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違いが生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付着させるものである。本発明の１態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソームの外面に結合し、ターゲティング能に作用する。当業者に自明のとおり、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドなど、追加のターゲティング成分を含有させてもよい。さらに、抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティングさせる幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第５，０１９，３６９号、第５，４３５，９８９号、および第５，４４１，７４５号参照。これらの代替ターゲティング法を採用するのは当業者に自明であろう。
ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物からなる複合体を含む脂質構築体、ならびに複合体の一部ではないＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものの、療法用または診断用組成物を注射により非経口的に投与できる。ただし他の効果的な投与形態、たとえば関節内注射、吸入ミスト、経口用配合物、経皮イオン導入または坐剤も想定される。好ましいキャリヤーのひとつは、生理的食塩水であるが、薬剤学的に許容しうる他のキャリヤーの使用も考慮できる。１態様では、キャリヤーおよびＶＥＧＦ核酸リガンド複合体が生理学的に適合する徐放性配合物を構成することが想定される。このようなキャリヤー中の主な溶剤は、水性でも非水性でもよい。さらにキャリヤーは、配合物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭気を変更または維持するための、薬理学的に許容しうる他の賦形剤を含有してもよい。キャリヤーは、ＶＥＧＦ核酸リガンドの安定性、溶解、放出または吸収の速度を変更または維持するために、さらに他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、１回量形または多数回量形の非経口投与用剤形を製造するのに普通に慣用されている物質である。
療法用および診断用組成物を配合した後、それを無菌バイアルに液剤、懸濁液剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、または脱水もしくは凍結乾燥した散剤として保存できる。このような配合物は、そのまま使用する形または投与直前に再構成する必要のある形で保存できる。ＶＥＧＦ核酸リガンドを含有する配合物を全身送達のために投与する方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内、または膣もしくは直腸坐剤による。
本発明の複合体および脂質構築体の利点には、下記のものが含まれる：ｉ）血漿中での核酸リガンドの薬物動態が改良される；ｉｉ）核酸リガンドを、それらのターゲットとの相互作用のアビディティーを高めるために多価アレイで提示できる；ｉｉｉ）異なる特異性をもつ提示核酸リガンド２以上を、同一リポソーム粒子に組み合わせることができる；ｉｖ）リポソーム固有の腫瘍ターゲティング特性を利用して、腫瘍への提示核酸リガンドの送達を高めることができる；およびｖ）リポソーム内容物を特定のターゲットへ導くために、抗体のものに匹敵する提示核酸リガンドの親和性と特異性を利用できる。大部分のタンパク質と異なり、熱、種々の分子変性剤および有機溶剤による提示核酸リガンドの変性は易可逆性であるので、提示核酸リガンドは本明細書に記載する種類の製剤に好適である。
以下の実施例は本発明を説明し、具体的に示すために記載したものであり、本発明を限定するものとみなすべきではない。以下の実施例に記載した核酸リガンドの構造を図１に示す。実施例１には、核酸リガンドと脂質試薬の結合を記載する。ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ２７８）− 遊離リガンドとして、またはリポソームの二重層に取り込まれたもの（ＮＸ２７８−Ｌ）− のジアルキルグリセロール誘導体がインビトロおよびインビボでＶＥＧＦの活性を阻害する効力を、実施例２に記載する。実施例３には、ＶＥＧＦに対する２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮＡリガンドを調製するための実験法を記載する。実施例４には、ＶＥＧＦに対する２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮＡリガンドを記載する。実施例５には、グリセロ脂質、リン脂質、およびグリセロールアミド脂質、ならびにＰＥＧ修飾したＶＥＧＦ核酸リガンドの合成を記載する。実施例６には、リン脂質（ＰＬ）およびＰＥＧ修飾したＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態特性を記載する。実施例７にはＮＸ３１８３８ＰＬ−リポソーム複合体の調製、実施例８〜１０にはＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のインビボ有効性を記載する。実施例１１には、ウサギにおけるＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの硝子体内薬物動態を記載する。
実施例１． ジアルキルグリセロール（１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロール）修飾ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成
本実施例においては、核酸リガンドと脂質試薬とのコンジュゲートを記載する。（１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロール）修飾ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成を以下に示す。
Figure 0004160038
テトラエチレングリコールモノトシル酸（２ａ）：テトラエチレングリコール（２００ｍＬ，１．１５ｍｏｌ）を５００ｍＬのピリジンに溶解し、０℃に冷却し、２２．０ｇ（０．１１５ｍｏｌ）の塩化ｐ−トルエンスルホン酸にて処理した。溶解が完結した後、反応混合液を冷却装置内に一晩保存し、その後、減圧下で濃縮した。残渣を８００ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解し、３ｘ６００ｍＬのＨ２Ｏにて抽出した。Ｈ２Ｏ画分をＥｔＯＡｃにて戻し抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ画分を飽和Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液にて抽出した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、無色の油になるまで濃縮した。８００ｍＬのシリカゲルを用い、ヘキサン、２５％ ＥｔＯＡｃ−５０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、その後ＥｔＯＡｃ、その後１０％ ＭｅＯＨ−２０％ ＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ溶液にて溶出する、フラッシュカラムにてその油を精製し、純粋な生成物を２３．７ｇ（６０％）、および少量の不純物を含む生成物を１１％得た。２ａ：
Figure 0004160038
Ｃ１５Ｈ２４Ｏ３Ｓに関して算出した低分解能ＭＳ ｍ／ｅ （Ｍ＋１）： ３４９．１。
テトラエチレングリコールモノフタルイミド（３ａ）：攪拌した３１．９６ｇ（０．０９２ｍｏｌ）の２ａの４００ｍＬ無水ＤＭＦ溶液に、１４．２ｇ（１．０５当量）のフタルイミドおよび１４．４ｍＬ（１．０５当量）の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンを加えた。溶液を７０℃にて１８時間熱し、その後減圧下で濃縮した。１６００ｍＬのシリカゲルを用い、２５％ ＥｔＯＡｃ−５０％ ＥｔＯＡｃ−７５％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、その後ＥｔＯＡｃ、その後１０％ ＭｅＯＨ−２０％ ＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗黄色油を精製し、２３．８ｇ（８０％）の３ａを油として得た。静置するとすぐに、３ａは蝋状白色固体になった。
Figure 0004160038
化合物４ａの合成：１５ｇ（０．０４６４ｍｏｌ）の３ａの１５０ｍＬ ＴＨＦおよび１５ｍＬ ＤＭＦ溶液を、Ａｒ下０℃に冷却した。臭化アリル（６．０ｍＬ、１．５当量）を溶液に加え、１．７６ｇ（１．５当量）のＮａＨを固体として加えた。不透明な黄色の懸濁液を０℃にて３０分間、その後室温で１８時間攪拌した。ＭｅＯＨ（５０−１００ｍＬ）を加え濃縮し、その後混合液を減圧下で濃縮した。１５００ｍＬのシリカゲルを用い、２５％ ＥｔＯＡｃ−５０％ ＥｔＯＡｃ−７５％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、その後ＥｔＯＡｃ、その後１０％ ＭｅＯＨのＥｔＯＡｃ溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗物質を精製し、１１．０５ｇ（６５％）の４ａを黄色油として得た。
Figure 0004160038
１−ジメトキシトリチル−３−（フタルイミドテトラエチレングリコール）−ｓｎ−グリセロール（９）：スキーム１に従い、化合物９を以下のように合成した。すなわち、攪拌した４ａ（１０．１３ｇ、０．０２７９ｍｏｌ）の１００ｍＬアセトンおよび１ｍＬ Ｈ２Ｏ溶液に、３．９８ｇ（１．２２当量）のＮ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシドを加えた。この懸濁液に、１．７５ｍＬ（０．００５当量）の四酸化オスミウムを２．５％のｉＰｒＯＨ溶液として加えた。ＯｓＯ４溶液の添加後、反応混合液は透明な黄色になった。４ａの完全な変換（約１６時間）を示すＴＬＣ解析の後、反応混合液を１．５ｇのヒドロ亜硫酸ナトリウムおよび５．０ｇのｆｌｏｒｉｓｉｌにて処理し、３０分間攪拌した。懸濁液をｆｌｏｒｉｓｉｌにて濾過し、濾液を油にまで濃縮した。１．０ｇの４ａから同様にして調製した別の群とこの粗生成物を合わせた。１００ｍＬピリジン部分２つを、合わせたロットから共蒸発させ、残渣を３００ｍＬピリジンに溶解した。溶液を０℃に冷却し、１０．８９ｇ（１．０５当量）の塩化４，４’−ジメトキシトリチルを加えた。乾燥管をフラスコ内に挿入し、反応混合液を室温で１６時間攪拌した。溶液を２０ｍＬのＭｅＯＨにて処理し、減圧下、水浴の温度を４０℃以下に保ちながら、濃縮した。１１００ｍＬのシリカゲル（３％トリエチルアミンのヘキサン溶液を用いてカラムに湿装填した）を用い、１０−１００％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液（すべて３％トリエチルアミンを含む）にて溶出する、フラッシュカラムにて粗油を精製し、２１．３ｇ（２工程後、８９％）の９を黄色油として得た。
Figure 0004160038
Ｃ４０Ｈ４５Ｏ１０Ｎに関して算出した低分解能ＭＳ ｍ／ｅ （Ｍ＋ＮＨ４＋）： ７１７．５。
１−ジメトキシトリチル−３−（アミノテトラエチレングリコール）−ｓｎ−グリセロール（１０）：スキーム１に従い、化合物１０を以下のように合成した。すなわち、化合物９（５．２ｇ、７．２ｍｏｌ）を５０ ｍＬの４０％メチルアミンのＨ２Ｏ溶液に溶解し、１０ｍＬのメタノールを加えて出発物質を可溶化した。反応溶液を５０℃にて５時間熱し、その後、減圧下で濃縮しトルエンと共蒸発させた。２００ｍＬのシリカゲルを用い、１５％メタノールアンモニアのジクロロメタン溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗物質を精製した。３．９４ｇ（９６％）の１０を薄い黄色の油として回収した。
Figure 0004160038
Ｃ３２Ｈ４４Ｏ３Ｎに関して算出した低分解能ＭＳ ｍ／ｅ （Ｍ＋１＋）： ５７０．３５３、５７０．４。
Figure 0004160038
クロロホルム酸１９：攪拌した３ｇ（５．０３ｍｍｏｌ）の１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロール１８の６０ｍＬトルエン溶液に、２００ｍＬの１．９３Ｍホスゲン溶液を加えた。さらにホスゲン溶液（２Ｘ１０ｍＬ；計１５．４当量のホスゲン）を、アルコール出発物質が残らなくなるまで（濃縮した分注物の１Ｈ ＮＭＲ解析による）加えた。過剰のホスゲンおよびＨＣｌをアスピレーターによって除き、反応混合液を減圧下濃縮し、目的とするクロロホルム酸１９を白色粉末として３．３ｇ（９８％）得た。
Figure 0004160038
コンジュゲート２０：攪拌した２．２５ｇ（３．９５ｍｍｏｌ）の１０の６０ｍＬ ピリジン溶液に、２．６ｇのジステアリルグリセロールクロロホルム酸１８を加えた。２時間後の濃縮した分注物の１Ｈ ＮＭＲ解析により、残っているクロロホルム酸がないことが明らかになり、混合液を減圧下濃縮した。０．５ｇ（０．８８ｍｍｏｌ）の１０および０．５８ｇのクロロホルム酸から同様に調製した物質と粗残渣を合わせ、２００ｍＬヘキサン、その後、２５０ｍＬのそれぞれ１０−２０および３０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、５００ｍＬ ４０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、その後、それぞれ５０−６０−７０および８０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、最後に２５０ ｍＬのＥｔＯＡｃにて溶出する、１００ｍＬのシリカゲル上のフラッシュシリカゲルカラム（２％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した）にて、合わせたロットを精製した。生成物を含む画分を濃縮し、３．３ｇ（５７％）のコンジュゲート２０を得た。
ホスホロアミダイト２１：攪拌した３．８ｇ（３．２６ｍｍｏｌ）のコンジュゲートの２５ｍＬ ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、１．１４ｍＬ（６．５２ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンエテン、その後１．０９ｍＬ（４．８８ｍｍｏｌ）の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイロプロピルクロロ−ホスホロアミダイトを加えた。２時間後、混合液をＣＨ２Ｃｌ２にて希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液にて洗い、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。１００ｍＬ ヘキサン、その後、２５０ｍＬのそれぞれ１０および２０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、５００ｍＬ ３０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、その後、２５０ｍＬの５０％ ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液にて溶出する、１２５ｍＬのシリカゲル上のフラッシュシリカゲルカラム（２％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した）にて、粗残渣を精製した。生成物を含む画分を濃縮して４．２ｇ（９５％）のホスホロアミダイト２１を得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）ｄ １５１．５２、１５１．０８
ＶＥＧＦ核酸リガンド−１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロコンジュゲート
ホスホロアミダイト２１（スキーム２）を用い、１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ基をＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ２１３（図１Ａ参照）とコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートをＮＸ２７８（配列番号：２）（図１Ｂ）と名付けた。ＮＸ２７８を逆相ＨＰＬＣにより精製し、その組成を電子スプレー質量分析器にて確認した（観測されたｍ／ｓ ＝ １１７０３±４、算出したｍ／ｚ ＝ １１７２０）。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合をＮＸ２７８内の８つの位置（３’および５’末端）に用いたが、予想質量と観測質量間の１６質量単位の違いは、おそらく平均で１分子あたり予想よりも１つ少ないホスホロチオエート結合をもたらす硫化剤による、不完全な酸化のためである。
実施例２． 核酸リガンド−リポソーム複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける効力。リポソーム二重層内に埋め込まれたジアルキルグリセロール（ＤＡＧ）修飾ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ２７８）
ＮＸ−２７８（１ｍｇ）（図１Ｂ；配列番号：２）を、噴霧乾燥したＤＳＰＣ：コレステロール（５０ｍｇ／ｍｌ； ２：１、Ｍｏｌ：Ｍｏｌ）の混合物と、９％ショ糖を含む２５ｍＭリン酸（ｐＨ７．４）緩衝液中でインキュベートし、プローブ型音波処理器を用いておよそ６０度Ｃで、乳光色の溶液が得られるまで１５−３０分間音波処理することにより、ＮＸ２７８−リポソーム複合体を調製した。リガンドＮＸ２７８の配列を乱雑化した（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）類似体（ｓｃＮＸ２７８）（図１Ｃ；配列番号：３）を含む、対照核酸リガンド−リポソーム複合体を同様にして調製した。典型的な調製物において、平均直径が５０ｎｍで１／２高における分布幅が２０ｎｍであるリポソームが得られた。リポソーム粒子のサイズは、粒子解析装置（Ｌｅｅｄｓ ＆ Ｎｏｒｔｈｒｕｐ Ｍｏｄｅｌ Ｍｉｃｒｏｔｒａｃｋ ＵＰＡ １５０、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）で求めた。比較可能なサイズ分布のリポソームを、同じ脂質組成だが脂質コンジュゲートした核酸リガンドなしで得た。５０ｎｍのリポソームは、二重層の両側に提示された平均４０の核酸リガンドを含むと期待される。計算は以下のように行った。コレステロールに対して１９オングストローム、ジステアリルホスファチジルコリンに対しては６０オングストロームと、リポソーム内の表面積を仮定すると、外径５０ｎｍで膜厚２０オングストロームの球状のリポソームに関してリポソームあたり３．１３ｘ１０４という多数の脂質分子を得た。リポソームの組成物（２：１ｍｏｌ：ｍｏｌ ジテアリルホスファチジルコリン（ＭＷ＝７９０．２）：コレステロール（ＭＷ＝３８６．７））から、脂質の均一な分布を仮定すると、リポソームの分子量２．１ｘ１０７が計算された。
リポソームの内側と外側表面間の核酸リガンドの分配を決定するために、リポソーム製剤内のＮＸ２７８の、Ｔ１リボヌクレアーゼに対する接近しやすさを調べた。配列内の２つのリボグアノシン（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５０ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：６８３−６９５）で、ＮＸ２７８はリボヌクレアーゼＴ１により効率よく切断される。ＮＸ２７８ を予め形成したリポソームで単にインキュベートすると、リボヌクレアーゼＴ１から核酸リガンドを保護しない。しかし、ＮＸ２７８が音波処理によりリポソーム内に取り込まれている場合は（ＮＸ２７８−リポソーム）、約１／３がヌクレアーゼから保護される。ヌクレアーゼの活性に影響することなくリポソームを阻害する０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をＮＸ２７８−リポソームに加えると、それまで保護されていた核酸リガンドが切断にさらされる。これらの結果は、核酸リガンドが二重層の両側に分布しているという概念と一致する。
ＮＸ２１３、ＮＸ２７８、およびＮＸ２７８−リポソームの、ＶＥＧＦに対する結合親和性
ＮＸ２１３、ＮＸ２７８、およびＮＸ２７８−リポソームの、ＶＥＧＦに対する結合親和性を、競合電気泳動移動度シフト法（図２）を用いて調べた。ＶＥＧＦに対するＮＸ２７８の結合親和性はＮＸ２１３のものと同等であった。ＮＸ２７８−リポソームの見かけの結合親和性は、ＮＸ２７８と比較して３倍低かった。観察された親和性減少の一部は、核酸リガンド画分のリポソーム内部への限局のためであるかもしれない。予想したように、配列を乱雑化した類似体はＶＥＧＦに十分低い親和性で結合する（図２）。
ＮＸ２１３、ＮＸ２７８、およびＮＸ２７８−リポソームの血漿薬物動態学的特性
時間の関数としてのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ラットの血漿内のＮＸ２１３、ＮＸ２７８、およびＮＸ２７８−リポソームの濃度を図１５に示し、コンパートメント解析のパラメーターを表１に要約する。ＮＸ２１３の大部分は、ｔ１／２が７分かつ全体的なクリアランス速度が６．８ｍｌ／ｋｇ／ｍｉｎで、α相において急速に除去される。核酸リガンドにリン脂質をコンジュゲートさせると、ＮＸ２１３と比較して増加したβ（ｔ１／２）かつ幾分遅い全体的なクリアランス速度（４．９５ｍｌ／ｋｇ／ｍｉｎ）で血中から極めて二相性なクリアランスという結果になる。ＮＸ２７８のリポソーム内への取り込みは、核酸リガンドの血漿からのクリアランスが実質的にさらに減少することを示す（１．８８ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）。
ＨＵＶＥＣ増殖および血管新生に対するＮＸ２７８の効果
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対する、ＮＸ２７８−リポソーム、ｓｃＮＸ２７８−リポソームおよびＮＸ２１３の効果を調べた。ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）およびヘパリン（４５mｇ／ｍｌ）を含むＩＭＤＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）培地中で培養した。細胞を２４穴ゼラチンコートした２４穴プレートに１穴あたり２０，０００細胞の密度で０日目にまき、０．１ｎＭから１μＭのあいだの濃度の上記リガンドで、１、２、および３日目に処理した（リガンドを加えた培地と置き換える）。ＮＸ２７８−リポソームはＨＵＶＥＣの増殖を〜３００ｎＭのＩＣ５０（核酸リガンド成分の濃度）で阻害し；ｓｃＮＸ２７８−リポソームおよびＮＸ２１３は有意に低い効果（ＩＣ５０＞１：μＭ）であった。
ＶＥＧＦはトリ尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおいて血管新生を誘導し、このアッセイは血管新生を阻害する化合物を研究するのに用い得る。ＶＥＧＦに浸したフィルターディスクをＣＡＭ上に置くことによりアッセイを行い、新血管の発生を定量化し得る。ＮＸ２７８−リポソームはＶＥＧＦが誘導する血管新生を効果的に阻害した（データは示さず）が、一方、ＮＸ２１３、ＮＸ２７８およびｓｃＮＸ２７８−リポソームは効果がなかった。これらの研究はともに、ＮＸ２７８がｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦが誘導する内皮細胞の増殖およびｉｎ ｖｉｖｏにおける新血管形成の特異的阻害剤であることを証明する。
ＶＥＧＦが誘導する毛細血管透過性に対するＮＸ２７８の効果
ＶＥＧＦは、毛細血管の透過性を一過性に増強する既知の唯一の血管新生因子である。ＮＸ２７８−リポソームの、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＶＥＧＦの血管透過性活性を阻害する能力を調べた。血管透過性アッセイ（Ｍｉｌｅｓアッセイ（Ｍｉｌｅｓ，Ａ．Ａ． ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．（１９５２） Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）１１８：２２８）として知られている）を、本来記載されているように（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３）モルモットにおいて行った。１μＭの濃度のＮＸ２７８−リポソーム、ＮＸ２７８、およびＮＸ２１３をＶＥＧＦ（２０ｎＭ）とともに、あらかじめエバンスブルー色素を注入しておいたモルモットの皮内に注入した。ＶＥＧＦに応答して、血管透過性の上昇のためにアルブミンに結合したエバンスブルー色素が管外溢出し、注入部位に青い斑点を生じる結果となる。有機溶媒抽出による色素回収率は一般的に非常に低いため、皮膚を透過する光の吸収を測定する定量方法が開発された。ＮＸ２１３、ＮＸ２７８、ＮＸ２７８−リポソームおよびＶＥＧＦに対する中和モノクローナル抗体は、図３に示すようにＶＥＧＦが誘導する透過性をすべて有意に阻害した。核酸リガンドの中で、ＮＸ２７８−リポソームはもっとも強力なアンタゴニストであるとみられた。これらの化合物の配列を乱雑化した類似体は阻害性ではなかった。この違いは目視観察で劇的かつ顕著であった。
ＮＸ２７８−Ｌはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてカポジ肉腫細胞株を阻害する
ＶＥＧＦの阻害剤は、腫瘍の進行および転移が新血管形成に依存する悪性腫瘍を含め、様々な疾患において有益である可能性がある。ほとんどの種類の腫瘍はＶＥＧＦを産生すると知られているが、機能するＶＥＧＦ受容体を発現していることが示されたものはこれまでに一つもない。最近、カポジ肉腫（ＫＳ）細胞が大量のＶＥＧＦを産生するのみならず、機能するＶＥＧＦ受容体をも発現しており、それゆえＶＥＧＦを自己分泌性（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）増殖に用いていることが示された。したがって、ＫＳ細胞株はＮＸ２７８の、自己分泌性ＶＥＧＦ増殖活性を阻害する能力を調べる唯一の機会を提供する。
ＫＳ細胞の増殖に対するＮＸ２７８−リポソーム、ｓｃＮＸ２７８リポソームおよびＮＸ２１３の効果を調べた。ＫＳ細胞株ＫＳＹ−１を、ゼラチンコートした２４穴プレートに１穴あたり７，５００−１０，０００細胞の密度で、２％ ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０を含む培地中、０日目にまいた。核酸リガンドを１、２、および３日目に新鮮な培地中に０．１ｎＭから１μＭのあいだの濃度で加え、細胞計数を４日目に行った。ＮＸ２７８−リポソームはＫＳ細胞の増殖を１００ｎＭのＩＣ５０で阻害し、１μＭのＮＸ２７８−リポソームではこれらの細胞の増殖は完全に阻害された。ｓｃＮＸ２７８−リポソームおよびＮＸ２１３は＞１μＭのＩＣ５０値を示した（図４）。
ＮＸ２７８−リポソームはｉｎ ｖｉｖｏにおいてＫＳ細胞の増殖を阻害する
ＶＥＧＦはＫＳ細胞の増殖因子であるため、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＫＳ腫瘍に対するＶＥＧＦアンタゴニストの効果は２倍、すなわち腫瘍とともにいる内皮細胞に対するＶＥＧＦの傍分泌性（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）増殖効果の阻害および腫瘍細胞に対する自己分泌性増殖効果の阻害であるとみられる。ＫＳ細胞はしたがって、ＶＥＧＦアンタゴニストに対して特に感受性であり得る。核酸リガンドのｉｎ ｖｉｖｏにおける活性を試すために、腫瘍トロカール（３ｍｍ３）を無胸腺のマウスに１日目に移植し、２日目から開始して５０、１００または１５０μｇ／日／マウスで５日続けて処理した。腫瘍増殖の速度を２週間ごとに測定した。ＮＸ２７８−リポソームは用量依存的に、５０μｇ／日／マウス用量というもっとも低い投与量で極めてわずかな腫瘍増殖阻害を示し（図５Ａ）、１００および１５０μｇ／日／マウス投与量の両方で腫瘍増殖阻害を示した（図５Ｂ、１５０μｇ／日／マウスを示す）。空のリポソーム（図５Ａ、Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８−リポソームも、ＮＸ２１３およびＮＸ２７８と同様に調べたすべての用量で無効果だった。加えて、ＮＸ２７８−リポソームはＶＥＧＦが誘導する血管からの液体漏出を阻害した。
実施例３． ＶＥＧＦに対する２’−フルオロピリミジン修飾ＲＮＡリガンドに関する実験手順
本実施例は、ＶＥＧＦに対する２’−フルオロ修飾核酸リガンドの開発に関する実施例４に続き、援用されている一般的な手順を提供する。
材料
昆虫細胞株Ｓｆ２１から精製した組み換えヒトＶＥＧＦ１６５を、キャリアーのない凍結乾燥粉末としてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓより購入した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水に、１０μＭの濃度になるように再懸濁し、少量に分注して使用するまで−２０℃にて保存した。分注物を融解後４週間まで４℃で保存した。Ｓｆ２１発現させたマウスＶＥＧＦ１６４および大腸菌発現させたヒトＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦヘテロ二量体、およびＰＩＧＦも、キャリアーのない凍結乾燥調製物としてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍより購入した。
オリゴヌクレオチドはＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から購入したか、あるいはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９４オリゴヌクレオチド合成機を用い、最適化されたプロトコールにしたがって合成した。２’−Ｆ−および２’−ＯＭｅ−リボヌクレオチドホスホロアミダイトはＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ， ＣＡ）により調製された。２’−Ｆ−ピリミジンＮＴＰもＪＢＬから購入した。２’−ＯＨ−プリンＮＴＰおよびｄＮＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪより購入した。
Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）から購入し；ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）をＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．から；クレノーＤＮＡポリメラーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡより購入した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをＥｎｚｙｃｏ， Ｉｎｃ．（Ｄｅｎｖｅｒ， ＣＯ）から購入した。ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼはＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）により生産されたものである。
α−［３２Ｐ］−ＡＴＰおよびγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ （Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）より得た。
ＳＥＬＥＸプロトコール
ＳＥＬＥＸ手順はＳＥＬＥＸ特許出願に詳細に記載されている。化学的に合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリー（”３０Ｎ７”および”４０Ｎ７”）を、共通の５’および３’固定配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧ（３０または４０Ｎ）ＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡ−３’； 配列番号：１３３及び１３４）が両側に接している、３０または４０ヌクレオチドの無作為化した領域により調製した。各鋳型の５’末端のイタリック体にしてあるヌクレオチドはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列と一致する。鋳型の調製と増幅、および逆転写において使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーも合成した。すなわち、５’−ＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧ−３’ （“３Ｎ７” ； 配列番号：１３５）および５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧ−３’ （“５Ｎ７” ； 配列番号：１３６）。プライマー３Ｎ７を３０Ｎ７または４０Ｎ７ライブラリーにアニールさせ、クレノーＤＮＡポリメラーゼまたはＡＭＶ ＲＴを用いてプライマーを伸長させることにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型を調製した。ＡＭＶ ＲＴに用いたより高いインキュベーション温度（３７℃よりもむしろ４５℃）は、高次構造をとった鋳型オリゴヌクレオチドにもかかわらず完全な伸長をより促進し得る。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、各１ｍＭ ２’−ＯＨ−ＡＴＰおよびＧＴＰ、各３ｍＭ ２’−Ｆ−ＣＴＰおよびＵＴＰ、および５０ μＣｉ α−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下用いてライブラリーを転写した。ＲＮＡを含むゲルスライスを切り出し、粉砕し、２ｍＭ ＥＤＴＡに長時間浸すことにより、ＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルから精製した。
親和性選別し、その後選別したプールを増幅するというＳＥＬＥＸの過程は、詳細に記載されている（ＳＥＬＥＸ特許出願参照）。簡潔に述べると、選別と増幅の一巡を以下のように行った。すなわち、ＶＥＧＦを５−または１０−倍過剰のＲＮＡと、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＭ）中で（３０Ｎ７および４０Ｎ７ライブラリー）あるいはトリス緩衝生理食塩水、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２（ＴＢＳＭＣ）中で（３０Ｎ７ライブラリーのみ）混合し、続いて混合物を３倍に希釈した。３７℃にて１５分間インキュベーションした後、混合物を０．４５μ Ｔｙｐｅ ＨＡフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、ＶＥＧＦとＲＮＡの複合体を回収した。２：１フェノール、ｐＨ７：７Ｍ尿素中でインキュベートすることにより、選別したフィルターからＲＮＡを溶出した。水層から精製した後、ＲＮＡをプライマー３Ｎ７にアニールさせ、ＡＭＶ ＲＴを用いて逆転写した。３Ｎ７および５Ｎ７プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた１５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、得られたｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物の転写により、ＶＥＧＦに親和性を有する配列に富んだ新しいライブラリーが得られた。４巡目に、ＶＥＧＦ非存在下におけるかなりのバックグラウンドフィルター結合シグナルが、選別した３つのうちのすべてのＲＮＡプールに出現した。フィルターに結合したＲＮＡのプールを除くため、５巡および６巡目は、非結合分子からＶＥＧＦ結合ＲＮＡを分離するための代替計画で行った。すなわち、ＲＮＡプールを増殖因子とインキュベートした後、各混合物を８％ポリアクリルアミド、非変性ゲルにのせ、１０ Ｗで４５−６０分間、４℃にて電気泳動した。ＶＥＧＦ／ＲＮＡ複合体はこの系において非結合のＲＮＡよりも上方に移動し、ゲルにＸ線フィルムを感光させることにより可視化された。これらの巡目では、上に記載したように粉砕および浸漬法により、選別したＲＮＡを精製した。選別および増幅を１２巡した後、選別したプール内の個々の分子を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）のｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを用いてクローン化した。アルカリ溶解法（ＰＥＲＦＥＣＴｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｋｉｔ， ５ Ｐｒｉｍｅ → ３ Ｐｒｉｍｅ， Ｂｏｕｌｄｅｒ， ＣＯ）を用いてプラスミドを精製し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）より入手可能なＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔを用いて、クローン化した領域の配列を得た。蛍光の配列を決定するラダーを国立ユダヤ人センター、Ｂｒａｉｎ Ｋｏｔｚｉｎ研究室、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯにて読んだ。配列をファミリーに分類し、目で整列させた。
結合親和性の測定
転写の際のα−３２Ｐ−ラベルされたＮＴＰの取り込みにより、あるいはγ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成した後に放射標識された核酸リガンドを、低濃度で様々な濃度のＶＥＧＦまたは他の増殖因子と、３７℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーションはＴＢＳ、ＰＢＳ、またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ｐＨ ７．４中で、補足の二価の陽イオンを添加するか、あるいは添加せずにであった。あらかじめ洗っておいた０．４５ μｍ Ｔｙｐｅ ＨＡフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に試料を通し、続いて結合バッファーにより５−１０ ｍｌ洗いを行った。フィルターをシンチラントに浸し、計数して各フィルターに保持されているタンパク結合ＲＮＡの量を見積もった。特異的なタンパク質に結合している核酸リガンドの平衡解離定数（ＫＤ）をＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５； １４４１３−１４４２４に記載のデータ点から算出した。
核酸リガンド断片の親和性選別
１０ ｐｍｏｌの内部放射標識された、高親和性ＶＥＧＦ核酸リガンドの転写産物を、Ｓ７ヌクレアーゼにより部分的に切断し、放射標識された断片の混合物を作った。断片化されたＲＮＡの１／１０を、ニトロセルロースを通す濾過の前に、１０ｐＭ ＶＥＧＦと４５ ｍｌ結合バッファー中でインキュベートした。フィルターから回収された選別した断片を、高分離能変性ポリアクリルアミドゲル上で無選別の断片のプールをのせたレーンの隣で泳動した。最小の選別したバンドをそれぞれゲルから精製し、５’末端をポリヌクレオチドキナーゼでさらに標識して比活性を増加させた。試料の１／２をもとの転写産物のｃＤＮＡとアニールさせ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の末端まで伸長した。精製された断片およびその伸長産物の移動度と標準の配列決定ラダーとの比較を用い、選別された断片のもっともらしいサイズおよびもとの転写産物内における位置を決定した。親和性選別された断片と配列上一致する合成オリゴヌクレオチドを調製し、端を一部切断した核酸リガンドがＶＥＧＦに対する親和性を保持しているかどうか確かめた。
２’−ＯＭｅ−置換
実質的にＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：６８３−６９５に記載されているようにして、２’−ＯＭｅ−置換実験を行った。５または６つの２’−ＯＨ−プリン位が部分的に２’−ＯＭｅ−置換されている、３または４つのライブラリーを、端を一部切断したリガンド３つ（ｔ２２、ｔ２、ｔ４４）のそれぞれについて調製した。各プリン位はライブラリーのうちのただ一つにおいて部分的に２’−ＯＭｅ−修飾されていた。各５’−放射標識されたライブラリーをＶＥＧＦとインキュベートし、タンパク質と結合した置換オリゴヌクレオチドをニトロセルロースフィルター上に回収した。選別したプールおよび開始の無選別のライブラリーをアルカリによって部分的に加水分解し、生成物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。選別したプール内のその位置における加水分解から得られたホスホロイメジ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅ）シグナルを、無選別のライブラリー内の同じ位置に関して得られたシグナルで除すことにより、“バンド強度比”を各プリン位に対して決定した。特定の位置に対する範囲よりも十分に下がったバンド強度比は、親和性選別したプール中の２’−ＯＨの（２’−ＯＭｅに対する）偏りを示す。
結合速度定数
少量（典型的には１ ｐｍｏｌより少ない）の５’−放射標識された核酸リガンドを、二価の陽イオンを補った１ ｍｌの緩衝生理食塩水中で、１ ｎＭ ＶＥＧＦと３７℃にてインキュベートした。時間“ゼロ”の時点で、５０ μｌをニトロセルロースに通して濾過し、タンパク質に結合したＲＮＡの画分を決定し、その後、過剰（別々の実験において１００または５００ ｎＭ）の非標識核酸リガンドを加え、５０ μｌ分注物をその後の時点で濾過した。フィルターをシンチラント中で計数し、各時点でＶＥＧＦに依然として結合している放射標識されたＲＮＡの量を求めた。結合したＲＮＡの画分（ｆ）対時間としてプロットしたデータを、指数減少に関する等式に当てはめた。すなわち、
ｆ（ｔ）＝ｆ０ｅ−ｋｔ＋ｂ，
式中、ｆ０は時間ゼロの時点で結合していたＲＮＡの画分であり、ｋは解離速度定数（ｋｄ）であり、ｂは実験の終わりの時点でのフィルターに対する、放射標識されたＲＮＡの残留結合（事実上、タンパク質の非存在下）である。以下の等式：
ｋａ＝ｋｄ／ＫＤ
にしたがい、測定したｋｄおよびＫＤ値から会合速度定数（ｋａｓ）を算出した。
実施例４． ＶＥＧＦに対する２’−フルオロ−修飾ＲＮＡリガンド
リガンドの選別
３０または４０の無作為なヌクレオチドを含む２’−Ｆ−ピリミジン修飾ＲＮＡのライブラリーから、ＶＥＧＦに対するリガンドを３つの独立したＳＥＬＥＸ実験にて単離した。選別は、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補ったＰＢＳ（３０Ｎおよび４０Ｎライブラリー）あるいは１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むトリス緩衝生理食塩水（３０Ｎライブラリーのみ）中で行った。およそ１０１４の独特な配列を各実験の最初の選別サイクルに含めた。１０サイクル後、ＶＥＧＦと各ＲＮＡプールの間の親和性は、開始プールと比較しておよそ１０００倍に改善された。さらに２サイクル後、結合親和性に関してさらなる改善が観察されたなかったため、１２巡目のプールの個々の要素をクローン化し、各選別から約５０個の配列を決定した。
ＶＥＧＦ１６５に対するオリゴヌクレオチドリガンドを３つの独立なＳＥＬＥＸ実験にて単離した。個々のクローンを単離し、配列を決定し、共通な一次構造モチーフに基づいて配列をファミリーに分類した（表２）。各リガンドの名前は、標的（Ｖ＝ＶＥＧＦ）、選別バッファー（Ｐ＝ＰＢＳ；Ｔ＝ＴＢＳ）、ライブラリー内の無作為化した領域の長さ（３０または４０ヌクレオチド）およびクローン番号（小数点以下）を示す。ある配列が解析したクローン内に現れる頻度は括弧内に示し、ただ一ヌクレオチドだけ異なる配列は共通の前駆体のＰＣＲ突然変異のためであるとし、適切な記号（Ｙ＝ＵまたはＣ）で配列内に示してある不定な塩基と一緒に分類した。すべてのリガンドに共通な固定配列を、一番上のロアーケース内の文字で示す。個々のクローンについて、可変領域の配列をアパーケース内に示す。いくつかのリガンドに関しては、可能性として考えられる二次構造に寄与する、ロアーケース内の固定領域配列を可変領域配列に追加してある。ＶＥＧＦに対する結合の高親和性Ｋｄを各リガンドについて示す。各ファミリーのうちの一つのリガンドを、さらなる解析のために選んだ（灰色の囲み）。
解析した合計１４３クローンのうち、１ヌクレオチド以上異なる７６個の配列を得た。これらの配列のうちの４４個は、保存された一次構造モチーフに基づいた３つの主要なファミリーに分類することができた（表２）。５またはそれ以下の要素の少数ファミリーに分類し得る配列および単離したものの中で唯一であった“孤児（ｏｒｐｈａｎ）”配列を表６に示す。ファミリー１および２により定義される一次構造モチーフを含むリガンドは、３つの親和性選別のすべてにおいて現れた。両ファミリーの保存されている一次構造間の類似性は、それらが同様の二次構造をも共有し得ること、および／またはそれらが同様の接触領域を用いてＶＥＧＦを阻害し得ることを示唆している。ファミリー２のメンバーは、大“ループ”内の保存された配列モチーフを囲む、塩基対になった短い軸を形成する可能性を共通に有している（表２中の下線）。閉鎖したＡ／Ｕ塩基対を除き、予想される軸領域内の配列同一性は保存されていない。一次構造よりはむしろ二次構造を保存している塩基のこのような“共−変異（ｃｏ−ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、予想される軸の存在を支持しており、この構造がこのファミリーのＶＥＧＦリガンドの高親和性立体構造にとって重要であり得るということを示唆している。ファミリー１配列間には、同様に保存された塩基対相互作用は一つも検出されなかった。リガンドの第３のファミリーは、ＴＢＳＭＣ（ファミリー３、表２）中で行った選別においてのみ現れた。非常に保存された一次構造モチーフに加えて、このファミリーのすべてのメンバーにおいて、保存された領域の３’の配列は、５’固定領域内のヌクレオチドに相補的な塩基対を共通に有している（表２中の下線）。リガンドのほとんどに関しては、予想される軸の５’側の塩基はその塩基対形成相手と共に変化するとは言えないため、この観察は共通の二次構造をさほど予言するようなものではないが、それにもかかわらず、このファミリーに由来する最小の高親和性配列に関する当初の推測（以下に記載する）は、このモチーフの強力な保存によって導かれた。ＶＥＧＦに対する個々のＲＮＡリガンドの親和性を、その相互作用のＫＤの単一決定に基づいて見積もった。わずかな例外を除き、リガンドは増殖因子に対して、ＫＤが５と５０ｐＭの間という、非常に高い親和性を示した。
最小のリガンド
各配列ファミリーを定義する共通の一次および二次構造モチーフは、ＶＥＧＦに対する高親和性結合に必要な最小配列要素をほのめかしている。各ファミリー由来の典型的なリガンドの、入れ子した端切断（ｎｅｓｔｅｄ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）（表２中の灰色の囲みで示す）を、化学合成により作り、ＶＥＧＦに対するそれらの相対的な親和性を求めた（表３）。リガンドＶＰ３０．２２、ＶＰ３０．２およびＶＴ３０．４４の端を切断した版を化学合成により調製し、ＶＥＧＦに対するそれらの親和性を、実施例３に記載のように求めた。最初の端切断（ｔ２２、ｔ２、ｔ４４）を、５’および／または３’末端から欠けている塩基を加えてオリゴヌクレオチドを合成することにより、さらに精製した。化学合成を始めるために、リガンドのいくつかの最も３’のヌクレオチドを、２’−ＯＨ−シチジンを２’−Ｆ−シチジンに置換すること（下線）により、あるいは３’−３’−結合デオキシチミジン“キャップ”を加えること（星印）により修飾した。各オリゴヌクレオチドの長さ（引くキャップ）およびＶＥＧＦに対する結合の高親和性ＫＤを示す。
クローンＶＰ３０．２２（ファミリー１）由来の最小配列に関する当初の予測は、精製した、全長のリガンドの親和性選別した断片の末端のマッピングにより行った（実施例３参照）。この２９ヌクレオチド分子（“ｔ２２”）は、全長のリガンドと比較してＶＥＧＦに対する結合親和性の点でおよそ３倍の喪失を示した。この分子の３’末端のさらなる端切断は、親和性の点で険しい喪失をもたらしたが、さらに６個までのヌクレオチドを、ほとんど、あるいは全く無影響で５’末端から除き得た（表３）。ファミリー２由来のクローンＶＰ３０．２およびファミリー３由来のクローンＶＴ３０．４４について、予想される５塩基対軸およびすべての保存された配列モチーフを含む、端切断したリガンド“ｔ２”および“ｔ４４”を合成した。端切断したいずれのリガンドも全長分子のほとんど全ての結合活性を保持していた。一回に一つの予想塩基対（リガンドの各末端から１ヌクレオチド）を欠失させることによるさらなる端切断は、親和性を徐々に喪失させた。したがって、これらの配列に関しては、可能性としてあり得る二次構造に基づいた端切断は、最小の高親和性リガンドを非常によく予測た。さらに、予想される軸がこれらのリガンドの高親和性立体構造に寄与するという仮説を支持する。
２’−ＯＭｅ修飾
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの２’−ＯＨ位の２’ＯＭｅによる置換は、ラット尿中にも他の生物分泌液中にも存在するヌクレアーゼに対する安定性を改善することが観察されている。ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性は、治療または診断剤としてのそれらの成功にとって重大であるとみられる。運悪く、２’−ＯＭｅ−修飾ヌクレオシド三リン酸は、一般的には標準的な反応条件下ではＲＮＡポリメラーゼに基質として受け取られない。しかし、２’−ＯＭｅプリンは化学合成によって特異的なオリゴヌクレオチド内に導入し得る。いくつかの高親和性２’−ＯＨプリンＲＮＡリガンドが、驚くべきことに標的タンパク質に対する親和性をわずかに失うだけで高い割合の２’−ＯＭｅプリン置換を受けるであろうということが観察されている。２’−ＯＭｅ置換がＶＥＧＦに対する高親和性結合に影響しないようなプリン位を同定するために、１回あたり５または６個のプリンを修飾ヌクレオチドで部分置換してリガンドｔ２、ｔ２２およびｔ４４のいくつかの合成を調製した（実施例３に記載）。各部分置換ライブラリーの親和性選別を用い、ＶＥＧＦに対する十分な親和性を保持した分子を単離した。そのような親和性選別したプールにおいて、置換を許容しない位置は２’−ＯＨに偏っており、したがって、無選別のライブラリー内の同じ位置に比較して、アルカリによる加水分解に対してより高い感受性を示す。５’−放射標識された、無選別および親和性選別したプールをアルカリにより部分的に加水分解し、生成物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。リガンドｔ２２においてはＧ１０およびＡ１２が、親和性選別したプール内の２’ＯＨにかなりの偏りを示し、リガンドｔ２においてはＡ６およびＧ２１が、そしてリガンドｔ４４においてはＡ５およびＡ６がそうであった。前述の解析により２’ＯＭｅヌクレオチドによる置換を許容しないと見られる位置を同定されるが、これらのデータからは、他のすべてのプリンの同時修飾がいかに結合親和性に影響するかは予想し得ない。実際、Ｇ１０、Ａ２およびＧ２２（これらは２’−ＯＨに対してぎりぎりの優先を示した）を除きすべて２’−ＯＭｅ−プリンで合成したリガンドｔ２２は、すべて２’−ＯＨ−プリン配列よりよいわけではないとしても、それと同等の親和性でＶＥＧＦに対して結合した（表４）。
端切断したオリゴヌクレオチド（ｔ２２、ｔ２、およびｔ４４）を、１、２または３個以外はすべてのプリン位を２’−ＯＭｅ−プリンで置換して、化学的に合成した。残っている２’−ＯＨ−プリンを、各リガンド名の中に示し、リガンド配列中に太字で示す。各置換リガンドのＶＥＧＦに対するＫＤを示す。Ｇ２２におけるさらなる置換は、ＶＥＧＦに対する結合にわずかしか影響しなかったが、予想されたように、Ｇ１０またはＡ１２に２’−ＯＭｅを導入するのは、結合親和性にとって不利益だった。同様に、リガンドｔ２およびｔ４４は、ＶＥＧＦに対する核酸リガンドの親和性に３から４倍の影響で、２個以外はすべてのプリンにおける２’−ＯＭｅ−置換を許容した（表４）。
置換端切断体の結合の親和性および速度定数
最小の長さの、非常に２’−置換されたＶＥＧＦ核酸リガンドの同定を期待して、結合を劇的には減少させなかったすべての２’−ＯＭｅ置換を、端切断したリガンドｔ２２、ｔ２ａ、およびｔ４４ａ（表３参照）に導入した。２’ＯＨヌクレオチドを太字で示し、２’ＯＭｅヌクレオチドを無修飾の文字で示す。得られた核酸リガンド、ｔ２２−ＯＭｅおよびｔ４４−ＯＭｅは、ＶＥＧＦに対してＫＤがそれぞれ６７ｐＭおよび４９ｐＭで結合したが、一方でリガンドｔ２ＯＭｅはＫＤがおよそ１４０ｐＭで結合した（表５）。これらのＫＤは、ＮＸ−２１３（ＫＤ＝１４０ｐＭ）、以前記載されている（本明細書中で参考文献として援用されている、アメリカ合衆国特許出願Ｎｏ． ０８／４４７．１６９参照）ＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２−ピリミジン−、２’−ＯＭｅ−プリン−置換オリゴヌクレオチド阻害剤に、有利に匹敵する。端切断された２’−ＯＭｅ−置換オリゴヌクレオチドのそれぞれが、ＶＥＧＦに対する結合に関してＮＸ２１３と、そしてお互いに競合することがわかった。
３つの２’−ＯＭｅ−置換リガンドのそれぞれについて、大過剰の非標識リガンドを加えた際に、放射標識したリガンドとＶＥＧＦ間の完成した複合体が失われるのを追跡することにより、解離速度定数（ｋｄ）を決定した。リガンドｔ２２−ＯＭｅは半減期がおよそ６０秒で、最も速い解離速度を示した。リガンドｔ２−ＯＭｅおよびｔ４４−ＯＭｅは、それぞれ半減期が１７０および９０秒のオーダーで、わずかに遅い解離速度を示した。会合速度定数（ｋａ）は、平衡解離定数と解離速度定数から算出され（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）、３ｘ１０７から２ｘ１０８Ｍ−１ｓｅｃ−１の範囲であった（表５）。このような会合速度は、これらのリガンドとＶＥＧＦ間の、近接した移動が限られた結合相互作用を示唆しており、他の標的に対するＳＥＬＥＸ由来核酸リガンドに関して観察された会合速度定数と一致している。
二価の陽イオン依存性
ファミリー１および２のリガンドは、マグネシウム陽イオンの存在下で選別したが、ファミリー３リガンドはマグネシウムとカルシウムの両方を含むバッファー中で選別した。二価の陽イオンは、高親和性ＲＮＡ構造の非特異的または特異的な安定化を介してＲＮＡ／タンパク質相互作用に寄与し得るため、ＶＥＧＦに対する典型的なリガンドの高親和性結合にマグネシウムおよび／またはカルシウムが必要であるかどうか検討した。核酸リガンドｔ２２−ＯＭ２およびｔ２−ＯＭｅ（それぞれファミリー１および２由来）の親和性は、補足の二価の陽イオンあるいはキレート剤ＥＤＴＡの非存在または存在下で変わらなかった（データは示さず）。しかし、ファミリー３リガンドは、リガンドｔ４４−ＯＭｅに代表されるように、ＶＥＧＦに対する高親和性に関してカルシウム存在に対して絶対的な依存性を示した。結合バッファー中の二価の陽イオンをＥＤＴＡによって置き換えると、結合は劇的に減少した（ＫＤ＞１０−７）。二価の陽イオンを除いた結合バッファーに過剰のＭｇＣｌ２を加えても、結合親和性に改善はみられなかったが、ＣａＣｌ２は、ＥＤＴＡよりも２倍モル過剰で、結合活性を完全に元に戻した。同様の結合挙動が無修飾のリガンドｔ４４についても観察された（データは示さず）。
タンパク質特異性
本明細書中で記載のオリゴヌクレオチドは、この増殖因子の２つの拡散性アイソフォームのうちの大きい方である、ＶＥＧＦ１６５に対する親和性に基づいて選別された。小さい方のアイソフォームであるＶＥＧＦ１２１は、ＶＥＧＦ１６５内の１つのエキソンを欠いており、後者と異なりヘパリンに結合しない。３つの端切断された２’−ＯＭｅ−置換オリゴヌクレオチドのいずれも、ＶＥＧＦ１２１に対して測定できるほどの親和性で結合しなかった。さらに、オリゴヌクレオチドとインキュベートする前にタンパク質をＤＴＴにて還元すると、いかなる結合も観察されないため、ＶＥＧＦ１６５の天然の構造は３つの核酸リガンドのすべての結合に必須である。
ＶＥＧＦは種間で非常に保存されたタンパク質であり、ヒトＶＥＧＦ１６５およびマウスＶＥＧＦ１６４アイソフォームは８８％の配列同一性を示す。端切断された、２’−ＯＭｅ置換リガンドはヒトおよびマウスＶＥＧＦに対して同等によく結合した。しかし、保存された血小板由来増殖因子様ドメイン間でＶＥＧＦと５３％の配列同一性を有する胎盤由来タンパク質であるＰＩＧＦのホモ二量体に対するいかなるリガンドについても、結合は観察されなかった。ＶＥＧＦとＰＩＧＦのヘテロ二量体が最近、正常および腫瘍由来細胞株の両方の上清から単離され、そのようなヘテロ二量体は、高親和性ＶＥＧＦ受容体２つのうちの１つに対する結合に関して、および培養内皮細胞における誘導性の応答に関して活性を示す。ＶＥＧＦ／ＰＩＧＦヘテロ二量体の生物学的な関連は未知である。親和性は大幅に減少したが、十分な結合がＶＥＧＦ／ＰＩＧＦヘテロ二量体について観察された。これらのデータは、核酸リガンドが二量体をとる２つのサブユニット間の中間面またはその近傍で結合すること、およびＰＩＧＦは高親和性結合に必要な接触部位のすべてに存在するわけではないということを示唆し得る。あるいは、核酸リガンド結合表面に必然的なひずみをもってＰＩＧＦとのヘテロ二量体に参加することにより、ＶＥＧＦサブユニットの構造が変えられている可能性がある。
実施例５．リン脂質、グリセロールアミド脂質及びＰＥＧ−修飾ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成
各種親油性化合物／核酸リガンド複合体の合成に以下の３つの異なる製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を用いた：
Figure 0004160038
１．ＰＬ製剤の合成のためのＣ−１８ホスホロアミダイト
Ｃ−１８ホスホロアミダイト調製の概略をスキーム３に示す。１−オクタデカノールを標準条件でリン酸化した。反応混合物を処理した後、残渣をシリカゲルカラムでヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（９０：１０：５）を用いて精製して純粋生成物２１．５ｇ（５７％収率）を得た。
スキーム３
Figure 0004160038
ＩＩ．脂質アミド１の合成
このホスホロアミダイトは前記ＰＬとは異なり、アミド結合をもつ。この脂質をコンジュゲートすることから得られるオリゴの構造を以下に示す。いくつかの実験から、有機溶媒中への化合物２２の高い不溶性がＮＭＲとＭＳによる性状決定と、化合物２２のＤＡＧアミド２３へのさらなるホスフィチル化を不可能にしていることを示している。しかしながら、脂質−スペーサーアミダイト調製（スキーム１）の結果から、混合物を還流したらクロロ−（２−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスフィンによる化合物２２のホスフィル化（ｐｈｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）が進行すると期待した。ＤＡＧアミダイトを製造するこのアプローチをスキーム４に示す。
スキーム４
Figure 0004160038
Ｎ，Ｎ’−ビス（ステアロイル）−１，３−ジアミノプロパノール−２（２２）
ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ（５０ｍＬ）中の塩化ステアロイル（６．７８９ｇ，２２．４１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ（１００．０ｍＬ）とＴＥＡ（２．８９６ｇ，２２．４１ｍｍｏｌ）中の１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（１．０ｇ，１１．１０ｍｍｏｌ）の溶液中に室温で攪拌しながら滴下した。添加終了後、一晩混合物を７０℃に加熱すると透明溶液が生成し、この溶液を室温に冷却、濾過し、固体をＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ３ＯＨ、５％ ＮａＨＣＯ３及びエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥すると２２（６．４０ｇ，９３％収率）を白色固体として得た。
Figure 0004160038
Ｎ，Ｎ’−ビス（ステアロイル）−Ｏ−（ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィニル）−１，３−ジアミノ−２−プロパノール−２（２３）
一晩真空乾燥した化合物２２（５．８０ｇ，９．３１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５０．０ｍＬ）に入れて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．２ｍＬ，１８．６２ｍｍｏｌ）を注入した。混合物を氷水浴で冷却しクロロ−（２−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスフィン（８．６ｍＬ，０．４７ｍｍｏｌ）を注入した。３０分攪拌後、混合物を６０℃に９０分加熱した。室温に冷却後、不溶性物質を濾過し溶液を５％ ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をＣＨ３ＣＮから沈殿させると純粋生成物（４．６５ｇ，６１％収率）を白色固体として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）：１５４．０４。
Ｉ．ＤＡＧ−スペーサーアミダイト、脂質アミド２の合成
ジアミド化合物２２（これは脂質アミダイト２３の直接の中間体である）の不溶性を緩和するために脂質アミダイト中にヘキサ（エチレングリコール）を導入した。脂質−スペーサーアミダイト２９の調製の概略をスキーム５に示す。ＴＨＦ中での化合物２５と１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンとｔ−ブトキシドカリウムとのカップリング工程は良好に進行せず、収率は約２０％にとどまった。収率を改良する一つの試みとして２５とジアミド２２を反応させたが、所望の生成物は検出できなかった。
スキーム５
Figure 0004160038
（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコール（２４）
無水ピリジン（４００ｍＬ）中に溶解したヘキサ（エチレングリコール）（１８．９３ｇ，６７．０５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３ｘ５０ｍＬ）と共蒸留し、０℃に冷却した後、ピリジン（５０ｍＬ）中のＤＭＴｒＣｌ（２３．８５ｇ，７０．４０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下に攪拌しながら３０分かけて滴下した。反応混合物を一晩室温に維持した。高真空でピリジンを除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、これを５％ ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル、次いでＣＨ２Ｃｌ２及び０．５％ ＴＥＡを含むメタノール（９５／５）のグラジエントを用いて精製した。適切な分画を集めて蒸発させ、真空乾燥すると２４（２６．１ｇ，６６．６％収率）が明るい黄色オイルとして得られた。
Figure 0004160038
（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコールトシレート（２５）
無水ピリジン（５０ｍＬ）中の２４の氷冷（０℃）溶液に、ピリジン（３０ｍＬ）中のトルエンスルホニルクロリド溶液を加えた。室温で２時間後に、溶液を蒸発させて明るい黄色オイルを得た。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に取り、これを５％ ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルを用いて溶出して精製すると生成物（４．０８ｇ，９３％収率）が明るい黄色オイルとして得られた。
Figure 0004160038
２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコール−１，３−ジアミノプロパン（２６）
無水ＴＨＦ中の１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（７４７ｍｇ，８．２８ｍｍｏｌ）とｔ−ブトキシドカリウム（２．７８ｇ，２４．８４ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で２時間加熱し、次いで室温に冷却した。ＴＨＦ中の化合物２５（４．０８ｇ，５．２５ｍｍｏｌ）を注入し、ＴＬＣで確認して２５が残っていなくなるまで混合物を一晩７０℃で攪拌した。溶液を室温に冷却した後、ＴＨＦを真空除去してＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）と水（２５ｍＬ）を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２層を分離して水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２溶液を集めてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留した。粗製生成物（２．４３ｇ）をさらに精製することなく次の反応に直接用いた。
Figure 0004160038
Ｎ，Ｎ’−ビス（ステアロイル）−２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコール−１，３−ジアミノプロパン（２７）
ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ中の塩化ステアロイル（３．３６３ｇ，１１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣｌＣＨ２ＣＨ２ＣｌとＴＥＡ（１．９ｍＬ，１１．１ｍｍｏｌ）中の２６の溶液に室温で攪拌しながら加えた。混合物を室温で２時間維持し、次いで一晩混合物を７０℃に加熱した。溶液を室温に冷却した後、溶液を５％ ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルとＣＨ２Ｃｌ２（５０／５０）、次いで酢酸エチルとメタノール（５０／５０）のグラジエントを用いて精製した。第２分画を集めて、蒸発させ、真空乾燥すると２７（６４０ｍｇ）が明るい黄色オイルとして得られた。
Figure 0004160038
Ｎ，Ｎ’−ビス（ステアロイル）−２−ヘキサエチレングリコール−１，３−ジアミノプロパン（２８）
化合物２７（６４０ｍｇ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の２．５％ ＤＣＡ及びトリヘキシルシラン（２ｍＬ）の混合物を、オレンジ色が青白くなるまで室温で攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を除去した後、残渣をヘキサンから繰り返し沈殿させると明るい黄色固体（２１０ｍｇ，６３％収率）が得られた。
Figure 0004160038
Ｎ，Ｎ’−ビス（ステアロイル）−２−（ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィニル−ヘキサエチレングリコール）−１，３−ジアミノプロパン（２９）
真空で一晩乾燥した化合物２８（２１０ｍｇ，０．２３７ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１８μＬ，１．２５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を氷水浴で冷却しクロロ−（２−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスフィン（１０６μＬ，０．４７ｍｍｏｌ）を注入した。３０分撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して化合物２９を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）：１５４．０４。
ＶＥＧＦ核酸リガンドへの２０Ｋ又は４０Ｋ ＰＥＧ ＮＨＳエステルのコンジュゲート
一般的方法：ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドをトリエチルアンモニウム塩に変換して凍結乾燥した。粗製オリゴヌクレオチドを１００ｍＭホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９）に６０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解した。２当量のＰＥＧ ＮＨＳエステル（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．）を乾燥ＤＭＦに溶解し（ホウ酸：ＤＭＦの比率＝１：１）、混合物を温めてＰＥＧ ＮＨＳエステルを溶解した。オリゴヌクレオチド溶液をＰＥＧ溶液に素早く加えて、混合物を室温で１０分激しく撹拌した。約９０％のオリゴヌクレオチドがＰＥＧ ＮＨＳエステルとコンジュゲートした。図１Ｈ及び１Ｉを参照のこと。
２量体ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成
図１Ｊ，Ｋ及びＬに示す２量体ＶＥＧＦ核酸リガンドを以下のように作製した。
Figure 0004160038
１，３−ジピバロイル−２−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール３２の合成
ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９８８， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ， １６５１）に従って調製した化合物３１（ピリジン２００ｍｌ中、７０％純度の生成物を６２ｇ，２００ｍｍｏｌ）の撹拌ピリジン溶液に、ジメトキシトリチルクロリド（８４ｇ，２４０ｍｍｏｌ，１．２倍過剰）を加えて、反応物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に取り、水で洗浄、乾燥（ＭｇＳＯ４）して濃縮した。粗製混合物（１３０ｇ）をそのまま次の反応に用いた。
２−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール３３の合成
粗製化合物３２（１３０ｇ）、ＮａＯＭｅ（２８ｇ）及びメタノール（９００ｍｌ）の混合物を５０℃で１６時間加熱した。反応終了後（ＴＬＣ）、混合物を濃縮乾燥して残渣を水とＣＨ２Ｃｌ２（１：１）に溶解した。有機層を分離して水層を飽和ＮＨ４Ｃｌ、水及びブラインで洗浄、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を蒸発させるとガム状化合物が得られ、これをシリカゲルカラムでヘキサン／２％ＴＥＡ含有酢酸エチル（１：１）を用いて精製すると、化合物３３を７５％収率で得た。
Figure 0004160038
ビスアミダイト３４の合成
ＣＨ２Ｃｌ２（１２５ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（５８ｍｌ，３２０ｍｍｏｌ）中にアルコール３３（１６．２ｇ，４１．１８６８ｍｍｏｌ）を溶解した氷冷撹拌溶液に、ホスフィチル化剤試薬（２０．５ｍｌ，９０．６２ｍｍｏｌ）を加え、溶液をゆっくり室温まで温めて同じ温度で２時間撹拌した。反応混合物を砕いた氷の中にゆっくりと注ぎ、 ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、５％ ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで洗浄して乾燥した。溶媒を蒸発後に得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーでヘキサン／２％ＴＥＡ含有酢酸エチル（１：１）を用いて精製すると、化合物３４を７０％収率で得た。
Figure 0004160038
３１Ｐ Ｄ３ＰＯ４を外部標準として１５３．６４ ＆ １５３．３９ （２Ｓ）。
ＶＥＧＦ２量体の調製
ＶＥＧＦ２量体の合成は８８００自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で行った。ＮＸ３１８３８を調製し、ここではｒＡはアデノシンを意味し、ｍＧとｍＡはそれぞれ２’−Ｏ−メチルグアノシンとアデノシンを、そしてｆＣとｆＵは２’−デオキシ−２’フルオロシチジンと２’−フルオロウリジンを意味し、［３’−３’］は３’，３’−ヌクレオチド間結合を意味する。合成は、５’−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチル−Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデノシン、５’−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアノシン、５’−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデノシン３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−ＤＭＴ−Ｎ４−アセチルシチジン及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−ＤＭＴ−ウリジン３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイトを用いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ８８００自動合成機で行った。合成サイクルは以下のようであった。活性化剤の組成は表１２に記載する通りである。合成は６００Å孔径、８０−１２０メッシュのＣＰＧサポートを使用し、及び５’−スクシニルチミジンを用いる６０−７０μｍｏｌ／ｇ装填で行った。カップリングサイクルは表１２に示す。
実施例６．リン脂質（ＰＬ）及びＰＥＧ修飾ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性
表２に示す配列のうち、配列ＶＴ３０．４４を選んでさらに研究し、ＮＸ３１８３８と命名し直した。２０及び４０Ｋ ＰＥＧとコンジュゲートしたＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８の薬物動態学的特性をスプラーグ・ドーレイラットで試験した（分子性状についての記載は図１を参照）（配列番号：８及び９）。同様の研究をＰＬ脂質とコンジュゲートしたＮＸ３１８３８について、リポソーム製剤と遊離医薬として行った（分子性状についての記載は図１Ｈを参照）（配列番号：８及び９）。各研究において、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収と吸光係数０．０３７μｇオリゴ／ｍｌに基づいて溶液濃度１．０ｍｇ／ｍｌでオリゴヌクレオチドをＰＢＳに希釈した。全ての研究で９匹のラットにボーラス尾静脈注射によって１．０ｍｇオリゴヌクレオチド／ｋｇ動物体重を投与し、２分から２４時間の様々な時間で血漿サンプルを採取した。血漿サンプル及び品質対照サンプルをハイブリダイゼーションアッセイにより分析した。ハイブリダイゼーションアッセイでは、酸化鉄（ＦｅＯ）ビーズにコンジュゲートしたＶＥＧＦ核酸リガンドの５’−末端に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチド（ＦｅＯ−スペーサー−３’−ｄ（ＧＣＣ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＣＴ Ｔ−５’）（配列番号：１３７）ここでスペーサー＝（ｄＴ）８）と、５’−末端にビオチン２分子を含む検出オリゴヌクレオチド（ビオチン−ビオチン−５’−ｄ（スペーサー−ＣＧＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＡ−３’） ここでスペーサー＝（ｄＴ）８）（配列番号：１３８）を用いた。ＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８を含む血漿サンプルと一緒に捕捉及び検出プローブをインキュベートした後、ビーズにハイブリダイズしたビオチンオリゴヌクレオチドの量を、発光基質としてＣＳＰＤ−Ｓａｐｐｈｉｒｅを用いるストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼで定量した。
ボーラス注射後の時間を関数とする遊離、ＰＥＧ２０Ｋ及びＰＥＧ４０Ｋ ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８）（配列番号：８及び９）の血漿濃度のデータを図６にまとめた。４０Ｋ ＰＥＧコンジュゲートは３６０分の単指数関数的（ｍｏｎｏｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）ｔ１／２で浄化されたが、２０Ｋ ＰＥＧ型ははるかに迅速に浄化され、核酸リガンドの９５％が４９分のアルファｔ１／２で浄化され、５％が１９２分のベータｔ１／２で浄化された。これはサイズが浄化値（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）とって重要であることを示している。ＰＥＧ−コンジュゲートした核酸リガンドと比較して、遊離（非コンジュゲート）ＮＸ３１８３８は数分のｔ１／２で非常に迅速に血漿から浄化された。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、オリゴヌクレオチドに適切な官能基を導入することにより有意に増加した。
ボーラス注射後の時間を関数とするリポソーム付き又はリポソーム無しで調製されたＰＬ脂質コンジュゲート化ＶＥＧＦ核酸リガンド（配列番号：５）の血漿濃度のデータを図７にまとめた。リポソームは実施例７Ａに記載の方法で核酸の存在下に音波処理して作製し、内側と外側にオリゴヌクレオチドを含む。リポソーム製剤は遊離の薬剤よりもはるかにゆっくりと浄化され、ベータｔ１／２はそれぞれ１１６１分及び１３１分であった。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血漿濃度はリポソーム製剤によって有意に増加した。
実施例７．ＮＸ３１８３８ＰＬ−リポソーム複合体の調製
Ａ．薄層化（ｆｉｌｍｉｎｇ）によるリポソーム調製
コレステロール１モルに対してＤＳＰＣ２モルの割合で脂質を組み合わせた。水に溶解したＮＸ３１８３８ＰＬを脂質に１：５０（ｗ／ｗ）の割合で加えた。クロロホルム：メタノール：水（１：３：１）の溶液で溶媒和とすることによって物質を組み合わせた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去すると脂質と混合されたＮＸ３１８３８ＰＬの不均一フィルムが残った。このフィルムを９％スクロース溶液中に脂質ベースで５０ｍｇ／ｍＬで水和し、２５ｍＭリン酸ナトリウムでｐＨ７．４にバッファー化した。溶液を激しく混合し、６５℃に加熱し、得られる白色ミルク様溶液を７５ｍＬアリコートで音波処理して脂質を単膜（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームに組み立てた。リポソーム形成の進行は、溶液が透明になることを目で観察し、次に粒子分析機（Ｌｅｅｄｓ ＆ Ｎｏｒｔｈｒｕｐ Ｍｉｃｒｏｔｒａｃｋ ＵＰＡ １５０， Ｈｏｒｓｈａｍ， ＰＡ）を用いる動的光散乱による粒子サイズ測定により追跡できる。リポソームのサイズは５０−７０ｎｍ（容積重量分布法による）の範囲にある。
Ｂ．受動アンカーリングによるリポソーム調製
あらかじめ形成された（“空の（ｅｍｐｔｙ）”）リポソーム中にｓｃＮＸ−２８７（分子性状については図１Ｃ参照）が自然に導入されるか試験した。ＤＥＡＥアッセイ（遊離の核酸リガンド／グリセロール脂質複合体の除去のため）を用いる予備試験の結果、以下の２つの重要な知見が示唆された：１）装填が達成された；そしてさらに重要なことは、２）室温、２４時間で核酸リガンド／グリセロール脂質複合体の実質的に完全な装填が観察された。装填に及ぼす温度の影響を決定するために更に詳しい研究を行った。温度は導入率に劇的な影響を及ぼすことが観察された。室温、２４時間で完全な装填が達成されたが、高温（６７℃）ではたった数分で完全な導入が達成された。これは、予め形成したリポソーム中に核酸リガンド／親油性化合物複合体を迅速かつ効率よく導入する方法であることが判明した。
次にゲル濾過クロマトグラフィーによってリポソーム会合型から遊離のｓｃＮＸ−２７８を分離した。”空の”２：１ ＤＳＰＣ：コレステロールリポソーム中へのｓｃＮＸ−２７８の装填を用いて予備試験を行った。２２℃でＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００カラムを用いてクロマトグラムを作った。２２時間にわたって、空のリポソーム集団中へのｓｃＮＸ−２７８の漸次的導入がピーク領域のシフトとして観察された（データ示さず）。この結果はＤＥＡＥアッセイのデータとよく関連する。
追加のｓｃＮＸ−２７８が音波処理したオリゴ−リポソーム中に装填されるか試験するためにさらに研究を行った。オリゴ−脂質を脂質と共溶解し、２つを一緒に共音波処理することによってｓｃＮＸ−２７８の音波処理製剤を調製した。得られるリポソームはｓｃＮＸ−２７８を完全に導入したことを示した。この音波処理製剤を次に、追加の遊離ｓｃＮＸ−２７８で受動アンカーリングを２回実施してそれ以上のｓｃＮＸ−２７８が導入されるかを観察した。１回目の受動アンカーリングでは６５℃、１時間のインキュベーション後に遊離のｓｃＮＸ−２７８の全てがリポソーム中に受動アンカーリングされた。追加のｓｃＮＸ−２７８を受動アンカーリングさせる２回目の試みは不完全装填に終わった。
これらの実験から得られる鍵となる知見は、核酸リガンド／親油性化合物複合体は音波処理したオリゴ−リポソーム中に高濃度で受動アンカーリングされうるが、追加の核酸リガンド／親油性化合物複合体を吸収するリポソームの容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）を越えうるということである。２回の受動装填（約３ｍｇ脂質−オリゴ／５０ｍｇ脂質まで）の後に、いくらかの遊離の脂質−オリゴが残っているのでリポソームは明らかに追加のオリゴ−脂質を吸収する”容量”に達する。これらのデータはＤＥＡＥスピン−カラム分析で確認した（データ示さず）。以下の結論が導かれる：１）音波処理したリポソームは核酸リガンド／親油性化合物複合体を導入する追加の容量をもっている；そして２）１００％核酸リガンド導入が音波処理によって達成できる。
ＮＸ３１８３８ＰＬ（分子性状については図１Ｅを参照）で次の研究を行った。ＮＸ３１８３８はリポソーム中に導入されると、ＶＥＧＦターゲットに対する薬物動態学的（実施例６参照）及び生物分布が改良されるので極めて興味深い。受動アンカーリングによるＮＸ３１８３８のリポソーム中への導入をよりよく理解するためにいくつかの研究を行った。
ＮＸ３１８３８ＰＬの動力学的研究によると、この分子の受動アンカーリングはあまりに速いので文献公知のいかなるクロマトグラフィー法（これらはいずれも最低数分の作動時間を必要とする）によっても測定不能であると考えられることを示唆していた。
ＮＸ３１８３８ＰＬ分子の方向性を決定する（すなわち、核酸リガンド成分がリポソームから外側へ向かって進むのか、あるいはリポソームの水性中心に向かって進むのか）ために、外部から導入したＲＮａｓｅを用いてリポソームから外側へ進んでいる核酸リガンド成分を全て選択的に切断した。受動アンカーリングしたＮＸ３１８３８ＰＬリポソームの場合、全ての核酸リガンドがＲＮａｓｅにさらされた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理の後には追加の消化は全く観察されなかった。これらの結果は、受動装填されたＮＸ３１８３８ＰＬは、核酸リガンド成分がリポソームから外側へ向けて進むように方向付けられていることを示唆する。もしも受動アンカーリングされたＮＸ３１８３８ＰＬリポソームをＲＮａｓｅＩで前消化し、次いでＤＥＡＥカラムにかけると、約９９％の核酸リガンドがカラムに捕捉されるが、一方同じサンプルをＲＮａｓｅＩで前インキュベーションせずにＤＥＡＥにかけると、ほぼ１００％のオリゴがＤＥＡＥに結合することなくカラムを通過することができる。リポソームがＤＥＡＥからオリゴを保護するのである。リポソームは核酸リガンドと高い親和性で会合してＤＥＡＥ基にさらされるのを大きく減少するので、ＤＥＡＥから核酸リガンド成分を保護するように作用する。
最後に、リポソームアンカーリング型から遊離の核酸リガンド／親油性化合物複合体を分離するための新規方法を開発する一部として、ＮＸ３１８３８．０５ＰＬをＲＮａｓｅＩで消化した。切断されたオリゴは脂質尾部を除去した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓ−１０００樹脂）を用いて容易に分離できるが、完全な核酸リガンド／親油性化合物複合体は同じ条件下でリポソームと共溶出される。このデータは、核酸リガンド／親油性化合物複合体が溶液中で遊離状態のときには多分ミセルを形成していることを示唆する。このためカラムの空間容積（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ）中でリポソームと共溶出する結果となる。脂質尾部の除去により、ゲル濾過媒体中への侵入が可能になり、サイズ分画されて適切に貯蔵される。
実施例８．ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性−皮膚血管透過性アッセイ
ＮＸ３１８３８核酸リガンドのいくつかの異なる製剤が皮膚血管の透過性においてＶＥＧＦで誘発された変化を弱くさせる（ａｔｔｅｎｕａｔｅ）能力をもつかを上述した方法（Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６：５６２９−５６３２）を少し修飾して行った（マイルスアッセイ）。簡単に述べると、成人雌モルモット（３匹／実験）をイソフルランで麻酔して、背側と側方後ろ領域の毛をクリッパーで除去した。エバンスブルー染料（２．５ｍｇ／モルモット）を静脈内投与した。注射溶液（ＰＢＳ、ＶＥＧＦ、ＮＸ３１８３８製剤、及び抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体）を３０分前に調製し、表記の最終濃度で指示する場合には共混合した。各溶液を毛を刈った領域に描いた格子状パターン内にランダムに皮内注射した（二重に注射／モルモット；４０μｌ／部位）。モルモットを麻酔から快復させ、皮内注射の完了３０分後にＣＯ２にさらして殺した。皮膚を回収して皮下組織を除いて、透視した。カラーＣＣＤカメラ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄｅｎｓｈｉ ＫＰ−５０Ｕ，Ｊａｐａｎ）とＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ソフトウエア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１， Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）を用いて画像を得た。各皮膚サンプルについて、光学密度と関連領域について、分析する各注射部位の強度を正規化した。
図８Ａ−Ｃは、実施例７Ａで記載したリポソーム製剤中でのＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬについて、ＶＥＧＦ−誘導された血管漏出（ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅａｋａｇｅ）の核酸リガンド弱体化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）の結果を示す。全ての製剤は１００ｎＭという低濃度でＰＢＳ対照レベルまで、又はこの近くのレベルまで血管漏出を有意に減少することができた。３０ｎＭでは、核酸リガンドのブロック効果は失われた。ＮＸ３１８３８−ＰＬリポソーム製剤はこの濃度で評価しなかったが、１００ｎＭにおけるブロック効果を減少したようであった。このモデル系で抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体も評価したところ、１００ｎＭまで同様に有効であり、３０ｎＭでは活性を失った。従って、このモデル系では試験した各種製剤形のＮＸ３１８３８がＶＥＧＦタンパク質の機能的効果の１つをブロックするという点において抗体と等しく有効であることを示唆している。
実施例９．ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性−角膜ポケットモデル
ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８）製剤のＶＥＧＦ−誘導した角膜脈管形成減少能を正常駆血ラット角膜で試験した。簡単に述べると、９５％エタノール中の１２％バイオポリマーにタンパク質又は担体溶液を加えることによって、約３０時間前にバイオポリマー（Ｈｙｄｏｎ）ぺレット±ＶＥＧＦタンパク質（３ｐｍｏｌ）を調製した。塩酸ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して成人スプラーグ・ドーレイラット（２００−２４０ｇ）を麻酔した。次に左目に塩酸テトラカインを局所投与して局部麻酔し、希釈ポビドン−ヨウ素液を適用し、次いで等張食塩溶液でリンスした。中央角膜（ｍｉｄ−ｃｏｒｎｅａ）に垂直部分厚さの切開を行った。中央間質ポケットを縁の１．５ｍｍ内に至るまで側方眼角に向けて後ろ側に切り取った。次いでぺレットを挿入してポケットの後ろ端に押しやった。残っている空気を穏やかにマッサージしてポケットから除去した。クロラムフェニコール眼科用溶液を目に１滴入れた。動物をひっくり返して右目にこの処置を繰り返して同じタイプのぺレットを挿入した。それぞれの目にぺレットの挿入が完了したら、各動物にＰＢＳ（核酸リガンド製剤群と匹敵する容積）又は核酸リガンド（１０ｍｇ／ｋｇ）を指示通り１日２回静脈内投与した。５日目に、各動物を麻酔して、解剖顕微鏡（ＫＡＰＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にセットした３５ｍｍカメラ（Ｍｉｎｏｌｔａ Ｘ９）で写真を撮った。血管成長の最大長さ（０−５）、移植ぺレット近くの血管成長密度（１−４）及び血管形成を起こした目の円周（０−１）を測定することによって血管形成応答について各目を評価した。長さ＊密度＊円周の結果で血管形成インデックスを決定した。
核酸リガンド製剤がＶＥＧＦ−誘導した血管形成をブロックする能力を図９Ａ−Ｃに示す。血管透過性変化のブロックにおいてはその他の製剤と等しく有効であったにもかかわらず、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧは正常駆血角膜における血管形成応答の弱体化では無効であった。しかしながら、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ及びリポソームＮＸ３１８３８−ＰＬはいずれも６５−７０％で血管形成レベルを有意に減少した。この違いは核酸リガンドそれぞれの薬物動態学プロフィールによるものと思われる。
統計学的分析：マイルス（Ｍｉｌｅｓ）アッセイ及び角膜血管形成モデルの群はＤｕｎｎｅｔｔ比較を用いるＲａｎｋ ＡＮＯＶＡによって比較した。
実施例１０．腫瘍モデルにおけるＶＥＧＦ核酸リガンドのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ヒト腫瘍異種移植モデル：ＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧが固形腫瘍増殖に及ぼす能力を、ヌードマウスの皮下腫瘍モデルで試験した。Ａ６７３ヒト横紋筋肉腫腫瘍細胞を組織培養で増殖し、回収して、ヌードマウスの脇腹の腋領域近くに１ｘ１０７個の生細胞を皮下移植した。試験化合物による処置は１２時間後に開始し、実験の間中続けた。化合物は１日２回１０及び４０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。陰性対照は乱雑化アプタマー（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ａｐｔａｍｅｒ）配列であるＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ（分子性状については図１Ｒ参照）を１日２回４０ｍｇ／ｋｇ 投与からなり、陽性対照は抗−ＶＥＧＦ抗体Ｍａｂ．２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｏｔ＃ＬＤ０３）を１００μｇ／マウスを週に２回投与からなっていた。核酸リガンドー処置群及び抗体処置群はいずれも乱雑化配列陰性対照群と比べて腫瘍増殖を有意に遅らせた（図１１）。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、４０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ群では７５％及び８０％であり、モノクローナル抗体処置群では８３％であった（表８）。４０ｍｇ／ｋｇ投与群と１０ｍｇ／ｋｇ投与群では有意な差がなかったので、１４日以後は４０ｍｇ／ｋｇの投与を行わなかった。図１１に見られるように、投与終了の数日後に腫瘍増殖は速くなり、陰性対照群の増殖速度と同様になったが、１０ｍｇ／ｋｇ核酸リガンド群及び抗体処置群は低い速度で増殖し続けた。
同じ腫瘍モデルを使ってさらに研究を行った。ここではＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの新しいバッチ（ＮＸ３１８３８．０４及びＮＸ３１８３８．０７と命名）を比較し、また投与量を１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤから少なくして３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ及び１ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤとした滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）実験を行った。１日１回１０ｍｇ／ｋｇについても同様に実験を行い、またＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８−ＰＬのリポソーム形を１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで行った。図１２及び表９に見られるように、いずれの実験でも同程度の腫瘍増殖阻害が達成された。ＶＥＧＦ核酸リガンドのいずれのバッチも１日２回の投与スケジュールで比較したときは同等であり、旧バッチと新バッチのＴＧＩ値はそれぞれ６１％及び７０％であった。さらに、１日１回投与（ＳＩＤ）は１日２回投与と同様に有効であった。しかしながら、この実験で用いた滴定スキームでは有効投与量に達しなかった。
ＶＥＧＦ核酸リガンドのさらに下方滴定が腫瘍増殖に関して用量応答関係を示すかどうかについて第３の実験を行った。この実験ではＶＥＧＦ核酸リガンドを０．０３ｍｇ／ｋｇという無効用量近くまで下方滴定した。相対的腫瘍増殖阻害を図１３に示し、表１０にまとめた。
３つの期に達していない（ｕｎｓｔａｇｅｄ）腫瘍研究に加えて、期に達した（ｓｔａｇｅｄ）腫瘍研究を行った。ここではＶＥＧＦ核酸リガンドによる処置の開始前に腫瘍を樹立して２００±１００ｍｍ３に達せさせた。ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）とｍＡｂ２６５０３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１週２回１００μｇ）の投与群ではそれぞれ５９％及び６９％の腫瘍増殖阻害を達成した（図１４、表１１）。これらの集積的研究では、ＶＥＧＦ核酸リガンドがＡ６７３腫瘍の樹立を遅らせること、ならびにいったん腫瘍が樹立されたら腫瘍増殖を阻害できることを示している。
カポジ肉腫モデル：ヌードマウスにおけるカポジ肉腫セルラインＫＳＹ−１の皮下増殖に及ぼすＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの効果を試験した。ＫＳＹ−１細胞は培養においてＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるという点でユニークな腫瘍セルラインである。ＫＳＹ−１細胞を培養で増殖し、集めて、これをマウスの後ろ脇腹に皮下注射した（２ｘ１０７個細胞／マウス）。３群のマウス（１群４匹）をＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）（分子性状については図１Ｒ参照）又はＰＢＳのいずれかを実験の間中、１２時間毎に腹腔内注射して処置した。処置は腫瘍細胞移植の１日後に開始した。ＰＢＳ−処置群とＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ−処置群の腫瘍増殖は同等であったが、腫瘍増殖のかなりの阻害がＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ−処置群で観察された（図１６）。ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧはＫＳＹ−１腫瘍の増殖を実験終了時（２２日目）に６５％（ＰＢＳ−処置群と比較して）又は６９％（ＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ−処置群と比較して）阻害した。
実施例１１：ウサギにおけるＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８＋４０Ｋ ＰＥＧの硝子体内薬物動態学
ニュージーランド白ウサギに、４０ｍＰＥＧとコンジュゲートしたＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８を０．５ｍｇ／目で硝子体内投与することによって処置した。４０Ｋ ＰＥＧは実施例５に記載の方法でＶＥＧＦ核酸リガンドにコンジュゲートし、得られる複合体は図１Ｈに示すものである（配列番号：８）。ウサギはそれぞれの目にＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧを硝子体内投与した。動物毎の投与間の時間は１５分を超えなかった。血液及び硝子体サンプルを表７に記載するように採取した。
血漿及び硝子体サンプルの分析は二重ハイブリダイゼーションアッセイを用いて行った。このアッセイでは、９６ウエルプレートに付着した捕捉プローブとビオチン化した検出プローブの２つのハイブリダイゼーションプローブを用いる。捕捉プローブは核酸リガンドの５’末端とハイブリッドを形成する。このアッセイは全長核酸リガンドに対して極めて特異的かつ感受性であり、陽性シグナルを生じる。現在の定量限界は血漿５μｌ中で約２ｆｍｏｌｅである。
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図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ０）（図１Ｊ）、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる主鎖修飾を表す。 図２は、ＶＥＧＦに対する種々の核酸リガンドの結合性を示す。非修飾核酸リガンド（ＮＸ２１３、白丸）、そのジアルキルグリセロール修飾類似体（ＮＸ２７８、白菱形）およびリポソームＮＸ２７８（ＮＸ２７８−Ｌ、白四角）、ならびに配列スクランブル型（ｓｃ）対照（ｓｃＮＸ２１３、黒丸；ｓｃＮＸ２７８、黒菱形；およびｓｃＮＸ２７８−Ｌ、黒四角）の結合親和性を、競合電気泳動移動度シフトアッセイにより測定した。ＮＸ２１３は
Figure 0004160038
 （配列番号：１）
ｓｃＮＸ２１３は
Figure 0004160038
 （配列番号：４）
である。
３２Ｐ５＝末端標識ＮＸ−２１３（１．５ｎＭ）を結合用緩衝液（０．０１％ヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水）中、３７℃で２０分間、ＶＥＧＦ（０．３３ｎＭ）および競合体オリゴヌクレオチド（５ｐＭ−０．３３mＭ）の存在下でインキュベートした。３２Ｐ ＮＸ−２１３／ＶＥＧＦ複合体を、遊離３２Ｐ ＮＸ−２１３から８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離した（１９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド、トリス−ボラート、８９ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡを走行緩衝液とする）。種々の競合体濃度での３２Ｐ ＮＸ−２１３／ＶＥＧＦ複合体に対応するバンドの強度を、リン−イマージャー分析（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）により定量した。競合体の不在下で形成された複合体の量につき正規化したデータを、最小二乗法で競合結合方程式に当てはめた。
図３は、種々の核酸リガンドがＶＥＧＦ誘発性の血管透過性増大に与える影響を示す。予めエバンス・ブルー色素を注射したモルモットに、核酸リガンドを含む、または含まないＶＥＧＦ（２０ｎＭ）を、皮内注射した。注射部位の皮膚が吸収した光の相対量を測定することにより、色素の漏出量を定量した。 図４は、ＮＸ２７８−ＬがＫＳ細胞の増殖を阻害することを示す。種々の濃度のＮＸ２１３、ＮＸ２７８−ＬおよびｓｃＮＸ２７８−Ｌの存在下でのＫＳＹ−１細胞の増殖。ＫＳＹ−１細胞を、０日目に２４ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルの密度で接種した。１および３日目に、同様に処理した新鮮な培地と交換した。培養５または６日目に細胞をトリプシン処理し、粒子クールター計数器で細胞数を測定した。実験を三重に数回行った。示した結果は代表的実験の平均とＳＥである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＮＸ２７８が無胸腺マウスにおいてＫＳ細胞の増殖を阻害することを示す。１日目に無胸腺マウスの前足後方にＫＳ腫瘍を移植した。マウスを２日目から始めて１日１回５日間、腹腔内注射によりＮＸ２７８−Ｌ（５０mｇ／日／マウス、図５Ａ、および１５０mｇ／日／マウス、図５Ｂ）で処理した。対照マウスを、核酸リガンド処理群と同量の脂質を用いて空のリポソームで処理した。２週間にわたって腫瘍サイズを測定した。１４日目に腫瘍を摘出して測定した。 図５Ａおよび５Ｂは、ＮＸ２７８が無胸腺マウスにおいてＫＳ細胞の増殖を阻害することを示す。１日目に無胸腺マウスの前足後方にＫＳ腫瘍を移植した。マウスを２日目から始めて１日１回５日間、腹腔内注射によりＮＸ２７８−Ｌ（５０mｇ／日／マウス、図５Ａ、および１５０mｇ／日／マウス、図５Ｂ）で処理した。対照マウスを、核酸リガンド処理群と同量の脂質を用いて空のリポソームで処理した。２週間にわたって腫瘍サイズを測定した。１４日目に腫瘍を摘出して測定した。 図６には、ＮＸ３１８３８ ２０Ｋ ＰＥＧ（白四角）、４０Ｋ ＰＥＧ（黒四角）、およびＮＸ３１８３８（マイナスＰＥＧ）（白下三角）の血漿濃度に関するデータを、ボーラス注射後の時間の関数としてまとめる。 図７には、ＮＸ３１８３８ ＰＬの血漿濃度に関するデータを、ボーラス注射後の時間の関数としてまとめる。 図８Ａ〜８Ｄは、表示したＶＥＧＦタンパク質（０．８ｐｍｏｌ）±核酸リガンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を示す。注射の３０分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透視により測定した。図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬ、またはＮＸ３１８３８ｄ２−４０Ｋ ＰＥＧとタンパク質を注射の３０分前に混和した効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊はＶＥＧＦ単独と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図８Ａ〜８Ｄは、表示したＶＥＧＦタンパク質（０．８ｐｍｏｌ）±核酸リガンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を示す。注射の３０分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透視により測定した。図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬ、またはＮＸ３１８３８ｄ２−４０Ｋ ＰＥＧとタンパク質を注射の３０分前に混和した効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊はＶＥＧＦ単独と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図８Ａ〜８Ｄは、表示したＶＥＧＦタンパク質（０．８ｐｍｏｌ）±核酸リガンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を示す。注射の３０分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透視により測定した。図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬ、またはＮＸ３１８３８ｄ２−４０Ｋ ＰＥＧとタンパク質を注射の３０分前に混和した効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊はＶＥＧＦ単独と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図８Ａ〜８Ｄは、表示したＶＥＧＦタンパク質（０．８ｐｍｏｌ）±核酸リガンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を示す。注射の３０分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透視により測定した。図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬ、またはＮＸ３１８３８ｄ２−４０Ｋ ＰＥＧとタンパク質を注射の３０分前に混和した効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊はＶＥＧＦ単独と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図９Ａ〜９Ｃは、核酸リガンドによるＶＥＧＦ誘発性角膜血管形成の減少についての評価を示す。０または３ｐｍｏｌのＶＥＧＦタンパク質をバイオポリマー（ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））に取り込ませ、角膜支質に埋め込んだ。図示したように動物を１日２回５日間、ＰＢＳまたは核酸リガンドの静脈内投与により処理した。図Ａ、ＢおよびＣは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、またはＮＸ３１８３８−ＰＬ核酸リガンドによる全身処理が与える効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊は３ｐｍｏｌ ＶＥＧＦ＋ＰＢＳ群と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図９Ａ〜９Ｃは、核酸リガンドによるＶＥＧＦ誘発性角膜血管形成の減少についての評価を示す。０または３ｐｍｏｌのＶＥＧＦタンパク質をバイオポリマー（ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））に取り込ませ、角膜支質に埋め込んだ。図示したように動物を１日２回５日間、ＰＢＳまたは核酸リガンドの静脈内投与により処理した。図Ａ、ＢおよびＣは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、またはＮＸ３１８３８−ＰＬ核酸リガンドによる全身処理が与える効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊は３ｐｍｏｌ ＶＥＧＦ＋ＰＢＳ群と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図９Ａ〜９Ｃは、核酸リガンドによるＶＥＧＦ誘発性角膜血管形成の減少についての評価を示す。０または３ｐｍｏｌのＶＥＧＦタンパク質をバイオポリマー（ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））に取り込ませ、角膜支質に埋め込んだ。図示したように動物を１日２回５日間、ＰＢＳまたは核酸リガンドの静脈内投与により処理した。図Ａ、ＢおよびＣは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、またはＮＸ３１８３８−ＰＬ核酸リガンドによる全身処理が与える効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊は３ｐｍｏｌ ＶＥＧＦ＋ＰＢＳ群と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図１０には、ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧの血漿濃度（白丸、白三角）または硝子体濃度（黒丸、黒三角、黒四角）に関するデータを、投与後の時間の関数としてまとめる。 図１１は、４０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８ＮＡＬ）で１日２回（ＢＩＤ）処理したヌードマウスにおいて、皮下で増殖するヒトＡ６７３腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。陰性対照は４０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与したスクランブルＶＥＧＦ核酸リガンド配列ＮＸ３１９１７ＮＡＬ（分子の記述に関しては図１Ｒ参照）からなっていた。陽性対照は１００μｇ／マウスで週２回投与した抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ｍＡｂ２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。４０ｍｇ／ｋｇ投与群と１０ｍｇ／ｋｇ投与群の間に有意差はないように思われたので、１４日後は４０ｍｇ／ｋｇ群の投与をそれ以上行わなかった。マウス８匹の群に０日目に１×１０７個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。腫瘍の体積（ｍｍ３として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ２／２ 図１２は、ＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８核酸リガンド（ＮＡＬ）の異なる投与計画（投与期間中１日２回（ＢＩＤ）と１日１回（ＱＤ）の比較）、４０Ｋ ＰＥＧの各バッチ（ＮＸ３１８３８．０７バッチと新たなＮＸ３１８３８．０４バッチの比較）、および異なる薬物配合物（リポソームＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ＰＬ ＮＡＬとＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ＰＬ ＮＡＬ ４０Ｋ ＰＥＧの比較）の腫瘍増殖曲線を示す。マウス８匹の群に０日目に１×１０７個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。数群で腫瘍の増殖しない動物があり、したがって最終分析につき、ある群では７匹（ＮＸ３１８３８．０４ １０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、およびＮＸ３１８３８．０４ ３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）または６匹（ＮＸ３１８３８．０４ １０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、およびＮＸ３１８３８．０７ １０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）の動物しかいなかった。腫瘍の体積（ｍｍ３として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ２／２ 図１３は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８ ＮＡＬ）による、皮下増殖中のＡ６７３腫瘍の用量依存性阻害を示す。この力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）は無効果量に達せず、最低（０．０３ｍｇ／ｋｇ）用量でもなお腫瘍阻害がみられた。マウス８匹の群に０日目に１×１０７個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。ＮＸ３１８３８ ＮＡＬ ３ｍｇ／ｋｇ群では腫瘍の増殖しない動物が２匹あり、したがって６匹の動物しかいなかった。腫瘍の体積（ｍｍ３として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ２／２ 図１４は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＡＬ）による、皮下増殖中の樹立した（ｓｔａｇｅｄ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）Ａ６７３腫瘍の阻害を証明する増殖曲線を示す。陽性対照は１００μｇ／マウスで週２回投与した抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ｍＡｂ２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。マウスに１×１０７個のＡ６７３細胞を移植し、腫瘍を２００±１００ｍｍ３の体積にまで増殖させ、この時点で動物を体重により選別し、永久識別のため入れ墨をし、被験化合物の腹腔内注射による処理を開始し、実験期間中続けた。各時点で平均８匹のマウスであった。腫瘍の体積（ｍｍ３として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ２／２ 図１５には、ボーラス注射後のＮＸ２１３、ＮＸ２７８、ＮＸ２７８−リポソームの血漿濃度に関するデータをまとめる。 図１６は、ヌードマウスに皮下移植したＫＳＹ−１腫瘍の増殖曲線を示す。マウスを、実験期間中１日２回のＮＸ３１９１７ ４０Ｋ ＰＥＧまたはＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの腹腔内注射により処理した。ヌードマウスの後方側腹部に２×１０７個のＫＳＹ−１細胞を皮下移植した後、０日目に処理を開始した。各群４匹のマウスを用いた。誤差はＳＥＭである。

Claims (15)

  1. ポリアルキレングリコール、並びにＶＥＧＦに対する精製および単離した天然に存在しないＲＮＡリガンドを含む複合体であって、前記リガンドが２’−フルオロ（２’−Ｆ）−修飾オリゴヌクレオチドからなる、前記複合体。
  2. 前記リガンドと前記ポリアルキレングリコールの間にリンカーをさらに含む、請求項１の複合体。
  3. 前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項１の複合体。
  4. 前記ポリエチレングリコールが、およそ１０−８０Ｋの間の分子量を有する、請求項３の複合体。
  5. 前記ポリエチレングリコールが、およそ２０−４５Ｋの分子量を有する、請求項４の複合体。
  6. 前記複合体が、
    Figure 0004160038
     の構造を有する、請求項５の複合体。
  7. 前記複合体が、
    Figure 0004160038
     の構造を有する、請求項５の複合体。
  8. 前記複合体が、
    Figure 0004160038
     の構造を有する、請求項５の複合体。
  9. 前記複合体が、
    Figure 0004160038
     の構造を有する、請求項５の複合体。
  10. 前記複合体が、
    Figure 0004160038
     の構造を有する、請求項５の複合体。
  11. 薬理学的に許容しうるキャリアー中に、請求項１ないし１０のいずれか１つの複合体を含む療法用または診断用組成物。
  12. ＶＥＧＦ仲介による疾病または医学的状態を処置しまたは診断するための療法用または診断用組成物であって、薬理学的に許容しうるキャリアー中に、請求項１ないし１０のいずれか１つの複合体を含む、前記組成物。
  13. ＶＥＧＦ仲介による血管形成を阻害するための療法用組成物であって、薬理学的に許容しうるキャリアー中に、請求項１ないし１０のいずれか１つの複合体を含む、前記組成物。
  14. 腫瘍の増殖を阻害するための療法用組成物であって、薬理学的に許容しうるキャリアー中に、請求項１ないし１０のいずれか１つの複合体を含む、前記組成物。
  15. 眼適用に適した、請求項１１ないし１４のいずれか１項の組成物。
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