JP4365832B2 - 生化学分析用セル、生化学分析用キット及び生化学分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、生化学物質の検出に用いる生化学分析用セル、生化学分析用キット及び生化学分析装置関するものである。

従来、抗原抗体反応などの生化学物質間の結合の測定は、一般的に、放射性物質や蛍光体などの標識を用いることで行われてきた。この標識には手間がかかり、特にタンパク質への標識は方法が煩雑な場合や標識によりタンパク質の性質が変化する場合があった。

そこで、生化学物質間の結合を、標識を用いることなく簡便に直接的に測定する方法として、光学薄膜の干渉色変化を利用した生化学センサが知られている。この生化学センサは、Sandstromらの論文（非特許文献１）に述べられている。その例を図１のモデルを用いて説明する。基板１−１上に光学薄膜１−２を設ける。空気の屈折率は１．００であり、光学薄膜１−２が屈折率１．５０の材料であり、基板の屈折率は２．２５のものを用いている。光学薄膜の光学的厚さを、可視光の波長λ₀の４分の１またはその奇数倍（３／４λ_０、５／４λ_０など）の光学的長さとしておくと、光学薄膜は反射防止膜として働き、干渉色を生じる。この光学薄膜１−２の上に、第１の生化学物質１−３の単分子層を設ける。生化学物質をタンパク質とすると、屈折率は１．５程度、層の厚さは１０ｎｍ程度である。このとき、図２の反射スペクトルＡのように、波長λ_０で光学薄膜に垂直方向の反射光の強度が０となる。この第１の生化学物質１−３に第２の生化学物質１−４が生化学的に結合すると、図２の実線Ａから破線Ａ’の反射スペクトルの変化が生じ、干渉色が変化する。これにより、第２の生化学物質の結合が検出される。一般的な検出の手順は、まず基板１−１上の光学薄膜１−２を第１の生化学物質の単分子層１−３で覆ったものを準備する。これを第２の生化学物質の溶液の中に入れる。その後、溶液から取りだし、乾燥した後、図２の実線Ａから破線Ａ’への干渉色の変化を調べる。また基板１−１の材料として、光吸収性の材料、例えばシリコンを用いることで、基板の裏面で生じる光反射の測定への影響を抑制できることが述べられている。以上のように、非特許文献１では、センサを空気中に取り出して乾燥した後、干渉色を測定するものであった。

一方、光学薄膜に屈折率約２．２の材料を用いると、水溶液中で明瞭な干渉色が得られ、第１の生化学物質と第２の生化学物質の結合量を水溶液中でリアルタイムに測定できる（非特許文献２）。その例を図３のモデルを用いて説明する。シリコン基板３−１上に光学薄膜３−２を設ける。光学薄膜３−２は屈折率２．２の材料でその厚さを７０ｎｍとする。この光学薄膜３−２の上に、第１の生化学物質の単分子層３−３を設ける。透明な材料からなる光学窓３−４を通して白色光を入射して、センサの反射スペクトルを測定する。また、光ファイバ束を光ガイドとして用いて、白色光の照射と反射光の集光を行うことで、センサの大きさを直径サブミリメートルにすることができる。図４に反射スペクトルを示す。この図４に示した反射スペクトルの計算では、光学窓３−４の表面での光の反射は、測定にほとんど影響しないので無視した。これは例えば、光学窓３−４と光学薄膜３−２間の距離を約０．１５ｍｍとすることで、光学窓３−４と光学薄膜３−２との間の光干渉が測定に影響することを防ぐことができるからである。また、光学窓３−４と光学薄膜３−２との間３−６の屈折率を水の屈折率の１．３３３とし、第１の生化学物質３−３の層と第２の生化学物質の層３−５をそれぞれ、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの膜とした。図４の実線Ｂは第２の生化学物質の層３−５が無い時の、図４の破線Ｂ’は第２の生化学物質の層３−５があるときの反射スペクトルである。第１の生化学物質に第２の生化学物質が結合すると、実線Ｂから破線Ｂ’の変化が生じ、反射率の極小の位置は１３．５ｎｍ長波長側へ移動する。この変化を測定することで、第１の生化学物質への第２の生化学物質の結合が測定できる。ここで、非特許文献１では、生化学物質の層の屈折率を１．５と仮定し、また１０ミクロン×１０ミクロンの範囲の厚さ３ｎｍの生化学物質の層には、０．５ｐｇの有機物質を含むと見積もることができるとある。この非特許文献１の見積もりから、非特許文献２の反射率の極小の位置の１ｎｍの変化は、およそ１ｎｇ／平方ミリメートルの生化学物質の結合量と近似することができる。この方法では、試料溶液中でリアルタイムに結合の測定ができるので、試料溶液からセンサを取り出すことなく反応の飽和が分かり、非特許文献１の方法よりも正確かつ迅速に測定を行うことができる。

T. Sandstrom, et al., Applied Optics, 1985, 24, 472-479. T. Fujimura et al., Jpn. J. Appl. Phys. 2005, 44, 2849-2853.

生化学物質を含む試料は一般に貴重である。測定を行う場合に、センサ表面と光学窓との間の空間、すなわちセルの体積を小さくすることで試料の消費量を小さくすることができる。しかしながら、セルの体積を小さくするために、センサ表面と光学窓との間の距離を小さくしていくと、それらの向かい合う面の間での光干渉の影響を無視できなくなる。また、光学窓への生化学物質の吸着も問題となる。例として、図５に光学窓５−３へ第３の生化学物質の層５−５が付加した場合のモデルを示す。このモデルでは、シリコン基板５−１上に厚さ７０ｎｍ、屈折率２．２の光学薄膜５−２を形成し、この上方に光学窓５−３を設け、光学窓５−３と光学薄膜５−２の表面の間の距離を２４０ｎｍとし、この間の空間５−４には水（屈折率１．３３３）が満たされているとした。第３の生化学物質の層５−５は、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの膜とした。図６に、この場合の反射スペクトルを示す。実線Ｃが第３の生化学物質の層５−５が無い場合の反射スペクトルを、破線Ｃ’が第３の生化学物質の層５−５が有る場合の反射スペクトルである。図４の結果とは逆に、図６では光学窓５−３への生化学物質の吸着により反射スペクトルの極小値を与える波長位置が短波長側へシフトしているのが分かる。ここで、光学窓５−３への生化学物質の吸着は一般的に非特異的である。従って、この光学窓５−３への非特異的な吸着が測定の際にノイズとなる。

本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決して、セルの厚さを薄くした状態で、微量の薬液で生化学物質の結合を高スループットかつ高感度に測定できる簡便な生化学分析用セル、生化学分析用キット及び生化学分析装置を提供することにある。

本発明の生化学分析セルは、互いに向き合う面にプローブが固定された第１の基板及び第２の基板を近接させ、その間に形成される間隙を、試料溶液を収めるセルとする。そして、生化学分析用セルに光を照射し、反射された光のスペクトルの変化、例えば極小位置の波長シフトを検出することにより、プローブとターゲットとなる生化学物質との結合を検出する。生化学分析セルは、フローセルの形態とすることもできる。

ここでの生化学物質とは、他の物質に生化学的に結合する物質のことを指し、蛋白質、核酸、脂質、糖などの生体内で生産される物質だけではなく、薬剤物質、内分泌錯乱化学物質などの生体内の分子と結合する外来物質も含む。

本発明によると、少ない試料の消費量で、プローブへのターゲットとなる生化学物質の結合を高感度に検出することができる。

以下に、本発明の生化学分析用キット及び生化学分析装置の例を説明する。図７のように、ガラス、ポリスチレン、ＰＤＭＳなどの材料からなる第１の基板７−１と第２の基板７−２を準備し、この第１、第２の基板の表面にプローブとなる生化学物質（以下、単にプローブという）７−３を固定し、プローブを固定した面同士を向かい合わせる。この向かい合わせた面と面の間にできる空間が、試料を含む溶液を導入するセルになる。また、ターゲットとなる生化学物質（以下、単にターゲットという）とプローブとの結合を検出するために、光源と検出器を準備する。一方の基板側から光源の光を照射し、第１の基板と第２の基板から反射された光を検出器で検出する。ここでは、第１の基板７−１側から光が照射されるとする。セルに試料溶液を導入し、プローブとターゲットとの結合を反射光の各波長での強度変化から検出する。この時、第２の基板７−２のプローブを固定した面とは反対の面で生じる反射光が検出器に入り測定を阻害することを防ぐために、第２の基板７−２に光吸収性の材料を用いるか、この反射光が直接に検出器に戻らないように第２の基板７−２のプローブを固定した面と反対の面を非平行にするか、この反射光の強度を弱めるために第２の基板７−２のプローブを固定した面と反対の面に無反射コーティングを施すことが望ましい。

図８に、第１の基板７−１と第２の基板７−２の間隔を２４０ｎｍとして、プローブの層７−３とターゲットの層７−４をそれぞれ屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの膜とし、その間の液体７−５の屈折率を１．３３３とした場合の反射スペクトルの計算結果を示す。ここで、第１の基板と第２の基板の表面に対してほぼ垂直に光を入射して反射光を検出することから、入射光の入射角は０度とした。実線Ｄは、両方の基板上にターゲットの層７−４が無い場合、破線Ｄ’は、両方の基板上にターゲットの層７−４が有る場合の反射スペクトルである。第１の基板７−１と第２の基板７−２の向かい合うそれぞれの表面で生じる反射光の光路長の差は約６００ｎｍであるので、波長６００ｎｍ周辺に反射スペクトルの極小が現れる。ターゲットとの結合により反射スペクトルの極小を与える波長位置が短波長側へシフトしているのが分かる。これは、第１の基板７−１と第２の基板７−２の表面では無く、第１の基板７−１と第２の基板７−２上に加わったそれぞれの生化学物質の層の表面で光の反射が生じるために、生化学物質の層が無い時よりも光路長の差が短くなり、各波長での反射光の強度が変化したためである。このときの波長シフトの大きさは５３．３ｎｍで、上記非特許文献２の波長シフトの大きさの約４倍である。このように、セルの厚さを小さくすることでセルを満たすのに必要な試料の量、即ち測定で消費される試料量を少なくした状態で、プローブへのターゲットの結合を高感度に検出できる。

また、屈折率１．５の生化学物質の層があるかないかの判定だけではなく、屈折率の段階的な変化も測定できる。図９に、ターゲットの層７−４の屈折率を１．３３３から１．５まで変化させたときの、反射スペクトルの極小を与える波長の変化を示す。屈折率変化に対して、反射スペクトルの極小を与える波長位置がほぼ線形に変化するのが見て取れる。ここで、この屈折率の段階的な変化は、ターゲットの結合の密度の段階的な変化に対応する。この対応関係は、例えばM. Harris, et al., Thin Solid Films, 1979, 57, 173-178.に記載のLorentz-Lorenz理論などの有効媒質近似で説明できる。以上のことから、生化学物質の結合の密度の段階的な変化を波長シフトの変化として測定することができる。

一方、生化学物質の層の厚さの仮定は生化学物質の大きさに対応する。ここでは生化学物質の層の厚さを１０ｎｍと仮定したが、波長シフトの大きさはこの生化学物質の層の厚さに比例する。例えば、より小さい生化学物質を考えて生化学物質の層の厚さを１ｎｍと仮定すれば、波長シフトの大きさは１０ｎｍと仮定したときの１０分の１になる。

基板間の距離を２４０ｎｍとした場合、波長６００ｎｍ周辺に現れる反射スペクトルの極小は１次の光干渉によるものである。このように、第１、第２の基板間の距離を、測定に用いる光の波長の帯域で、次数の低い光干渉による反射スペクトルの極小が現れる距離とすることが、検出感度向上のためには望ましい。以下にその理由を説明する。

基板間の距離を２４０ｎｍの２倍の４８０ｎｍとした場合には、第１の基板７−１と第２の基板７−２の向かい合うそれぞれの表面で生じる反射光の光路長の差は約１２００ｎｍであるので、２次の光干渉により、波長６００ｎｍ周辺に反射スペクトルの極小が現れる。基板間の距離を２４０ｎｍの３倍の７２０ｎｍとした場合には、３次の光干渉により、波長６００ｎｍ周辺に反射スペクトルの極小が現れる。図１０は、プローブにターゲットが結合したときに得られる波長約６００ｎｍ付近の反射スペクトルの極小の位置の波長シフトの大きさと、第１、第２の基板間の距離の大きさの関係をプロットしたものである。ここで、ターゲットとなる生化学物質の層の屈折率は１．５、厚さは１０ｎｍと仮定した。図１０から分かるように、プローブにターゲットが結合したときに得られる反射スペクトルの極小値の位置の波長シフトの大きさと、第１、第２の基板間の距離の大きさは反比例する。例えば、この基板間の距離が２４０ｎｍのときに、この波長シフトの大きさは５３．３ｎｍだったのに対して、この基板間の距離を倍の４８０ｎｍとした場合には、この波長シフトの大きさは半分の２６．７ｎｍになる。さらに光干渉の次数が上がれば、波長シフトの大きさがその次数分の１になる。以上のことから、次数の低い光干渉を用いる方が高感度化に有利である。

また、図５のように、光学薄膜を一方の基板に設けた場合でも、光学薄膜の表面だけでなく光学窓の表面にもプローブを固定化し、光学薄膜と光学窓の間の距離を上記よりもさらに近づけることで、高感度に測定ができる。図１１のように、シリコン基板１１−１上に厚さ７０ｎｍ、屈折率２．２の光学薄膜１１−２を形成する。この光学薄膜１１−２があることによって、その光学的厚さの４倍にあたる波長６００ｎｍ周辺に反射スペクトルの極小値が現れる。この光学薄膜１１−２の上方に光学窓１１−３を設ける。この光学薄膜１１−２表面から光学窓１１−３の距離を５０ｎｍとする。また、光学薄膜１１−２の表面及び光学窓１１−３の表面にそれぞれプローブを設ける。図１２に、プローブの層１１−４とターゲットの層１１−５をそれぞれ屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの膜とし、その間の液体１１−６の屈折率を１．３３３とした場合の反射スペクトルの計算結果を示す。図１２の実線Ｅはターゲットの層１１−５が無い時の、図１１の破線Ｅ’はターゲットの層１１−５があるときの反射スペクトルである。生化学物質の結合により反射スペクトルの極小値を与える波長位置が長波長側へシフトしているのが分かる。この波長シフトの大きさは２３．１ｎｍで、上記非特許文献２のシフトの大きさの１．７倍である。この信号の増大は、光学薄膜１１−２表面から光学窓１１−３の距離を５０ｎｍとしたことで、光学窓側へのターゲットの層１１−５の付加が、波長シフトに寄与するためである。このように、プローブへのターゲットの結合を高感度に検出できる。ここで、光学薄膜と光学窓との基板間の距離は、プローブまたはターゲットとなるタンパク質の大きさから、１０ｎｍ以上が望ましい。

以上のように、両方の基板表面にプローブを固定化し、基板間の距離を小さくした状態、即ち、セルの体積を小さくした状態で、標識を用いることなくターゲットのプローブへの結合を高感度に検出することができる。

以下に、光干渉効果を利用した本発明の簡便な生化学分析用セル及び生化学分析装置の実施例を示す。

最初に生化学分析用キットの製造方法を述べる。図１３に、生化学分析用キットの製造方法を示す。図１３（ａ）に示したように、第１の基板１３−１と平坦な面を有する第２の基板１３−２を準備する。第１の基板１３−１及び第２の基板１３−２は透明なガラス製とすることができる。第１の基板１３−１には高さ約２４０ｎｍの段差１３−３を設けておき、平坦な面１３−４に対して平坦な面１３−５を２４０ｎｍ高くしておく。第２の基板１３−２には、平坦な面の反対側にそれと非平行な面１３−６を設けておく。第１の基板１３−１の平坦な表面１３−４と第２の基板１３−２の平坦な表面に３−アミノプロピルトリメトキシシランでシランコートを行う。この処理を施した表面は親水性なので、第１の基板と第２の基板の間でできるセルに毛細管現象で水溶液を導入できる。また、この処理によって導入されるアミノ基を利用して生化学物質を固定できる。例えばプローブとしてタンパク質を固定化するには、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドと水溶性カルボジイミドの水溶液を用いて、タンパク質のカルボキシル基と表面に導入したアミノ基をアミド結合させることができる。または、第１の基板１３−１の平坦な表面１３−４と第２の基板１３−２の平坦な表面に３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランでシランコートを行うことでも、同様に親水性の表面を得て、また、この処理によって導入されるエポキシ基を利用して、生化学物質をそのアミノ基や水酸基との脱水縮合により固定化できる。

なお、第１の基板１３−１と第２の基板１３−２の組は、プローブを固定化したものを分析用のキットとしてもよいし、プローブの固定はユーザにまかせて、プローブが固定されていないものの組を分析用のキットとしてもよい。

次に、図１３（ｂ）に示したように、第１の基板１３−１の平坦な表面１３−４と第２の基板１３−２の平坦な表面にプローブ１３−７，１３−８，１３−９，１３−１０を固定する。この時、基板同士を向かい合わせたときに、同種のプローブが固定化されている箇所が向かい合うように、プローブを固定する位置を決める。またこの時、基板１３−２においては、非平行な面１３−６の反対側にプローブが固定化されるようにする。プローブを固定した後、図１３（ｃ）に示したように、プローブを固定化した面を向かい合わせて、第１の基板１３−１の平坦な面１３−５と第２の基板１３−２の平坦な面が接触した状態でクランプなどを用いて基板同士を固定する。これにより、プローブを固定した面と面の間に、段差の高さの間隔ができ、セルを形成できる。

以下に、この生化学分析用キットのプローブへのターゲットの結合を検出する手順の一例を示す。図１４は、本発明による生化学分析装置の検出部の一例を示す模式図である。クランプなどで固定された上記の第１の基板１３−１、及び第２の基板１３−２の間にできたセルに試料溶液を導入するために、機械式ピペット１４−１を用いて試料溶液をセル付近に滴下する。セル付近に滴下された試料溶液は毛細管現象でセル内に導入される。セル内に導入されたターゲットと、第１の基板１３−１と第２の基板１３−２表面に固定化されたプローブとの結合は、以下の光学検出系により測定される。光ファイバ束からなる光ガイド１４−２を用いて、白色光源１４−３からの光を第１の基板１３−１側から照射し、第１の基板１３−１及び第２の基板１３−２の各プローブを固定した表面からの反射光を各分光器１４−４に導く。それぞれの反射スペクトルを計算機１４−５でリアルタイムに取り込み、それぞれの反射スペクトルの極小を与える波長を計算し、それら経時変化の表示と記録をリアルタイムに行う。

図１５は生化学分析装置に設置された生化学センサの部分拡大図であり、光ガイド１４−２と、光ガイド１４−２が固定された台１５−３と、第１の基板１３−１と第２の基板１３−２の断面図である。光ガイド１４−２は、光源の光を導く光ファイバ１５−１が反射光を分光器へ導く光ファイバ１５−２を囲むように束ねられた光ファイバ束で構成される。図１５に示したように、光ガイド１４−２の先端と第１の基板１３−１はほとんど接するように配置する。これにより、第１の基板の裏面からの反射光が反射光を分光器へ導く光ファイバ１５−２に直接入ることを防ぐことができる。また、第２の基板１３−２の上面の非平行な面１３−６は傾いているので、非平行な面１３−６での反射光が光ファイバ１５−１に直接戻ることを防ぐことができる。また、面１３−６に無反射コーティングを施すことで、面１３−６での光の反射自体を防ぎ、同様の効果を得ることもできる。または、基板１３−２を黒色などの光吸収性のガラスとすることで、光ファイバ１５−２から照射された光のうち基板１３−２へ透過した光を基板１３−２の中で吸収させ、透過光が界面で反射して分光器へ導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。また、基板１３−２を黒色のガラスとすることで、室内光が、反射光を分光器に導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。

以上の測定を行うための生化学分析装置の一例を図１６に示す。第１の基板１３−１、第２の基板１３−２、機械式ピペット１４−１、光ガイド１４−２の先端、台１５−３を入れるための暗箱１６−１を設ける。この暗箱１６−１を用いることで、室内光が反射光を分光器に導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。暗箱１６−１には蓋１６−２を設け、蓋１６−２を開けた状態でセットアップを行い、閉じた状態で測定を行う。暗箱の中には、さらに、第１の基板１３−１と第２の基板１３−２を固定するクランプを備える。

図１７は、クランプの一例とその周辺の模式図である。図示したクランプは、台１５−３と板１７−１によって第１の基板１３−１と第２の基板１３−２を挟み、ネジによって板１７−１を押し下げることでそれらを固定する。台１５−３には、第１の基板１３−１と第２の基板１３−２が入る溝１７−２が設けられている。溝１７−２の形状は、第１の基板１３−１がちょうど収まる幅で、第１の基板１３−１と第２の基板１３−２をあわせた状態で、第１の基板１３−１のすべてと第２の基板１３−２の一部が入る深さとする。また、この溝１７−２の位置は、光ガイド１４−２のそれぞれの先端がちょうどそれぞれのプローブ１３−７，１３−８，１３−９，１３−１０を固定した位置の真下になるようにする。光源１４−３、光ガイド１４−２の光源側及び分光器側の端、分光器１４−４と計算機１４−５は暗箱の外に配置して使用する。

実施例１では基板をガラスとしたが、ポリスチレンやＰＤＭＳなどの樹脂でも生化学分析用キットを製造できる。図１８に、基板を樹脂とした場合の生化学分析用キットの製造方法を示す。図１８（ａ）に示したように、第１の基板１８−１と平坦な面を有する第２の基板１８−２を準備する。本例では、基板１８−１と基板１８−２は透明なポリスチレン製とした。図１８（ａ）に示したように、第１の基板１８−１には、高さ２４０ｎｍの段差１８−３と、高さ約２４０ｎｍ、幅８０ｎｍの幅の壁を４００ｎｍの周期で配列した基板間の距離を保つための部材１８−４を設けておく。ここで、段差１８−３によって、基板１８−１の平坦な面１８−５の方が、これ以外の平坦な面１８−６よりも２４０ｎｍ高くしてある。第２の基板１８−２には、実施例１と同様に、平坦な面の反対側にそれと非平行な面１８−７を設けておく。

第１の基板１８−１の段差１８−３及び距離を保つための部材１８−４は以下に述べる方法で作製できる。図１９は、本実施例におけるナノインプリント法を用いた生化学分析用キットの製造工程図である。図１９（ａ）のように、ポリスチレン製の原料（２６ｍｍ×４０ｍｍ、厚み１ｍｍ）１９−１とニッケル製の金型１９−２を準備する。図１９（ｂ）のように、この原料１９−１と１５０℃に加熱したニッケル製の金型１９−２をプレス圧力２５ＭＰａで１０秒間プレスする。その後、金型１９−２を基板１９−１から垂直に剥離することで、図１９（ｃ）のように、高さ２４０ｎｍの段差１８−３と、基板間の距離を保つための部材１８−４を有する基板１８−１を得ることができる。図１９（ｄ）に、基板間の距離を保つための部材１８−４の拡大図を示す。壁の高さＦは約２４０ｎｍ、壁の幅Ｇは８０ｎｍ、その配列の周期Ｈは４００ｎｍである。ここで、図１９（ｃ）の矢印１９−３と図１９（ｄ）の矢印１９−４は同じ方向を示している。

図２０に、金型１９−２の製造方法を示す。図２０（ａ）に示した原盤材料２０−１は結晶方位（１００）、２６ｍｍ×４０ｍｍのシリコンウエハである。図２０（ｂ）のように、原盤材料２０−１上にフォトレジスト２０−２を塗布し、電子ビーム露光機によって段差と壁の位置のレジストを感光させる。その後、図２０（ｃ）のように、現像工程によって露光部分のレジストを除去する。図２０（ｃ）の斜線で示したレジストが残った部分２０−３が斜線部すべてレジストを残すのに対して、もう一方の斜線で示したレジストが残った部分２０−４では、格子状にレジストを残す。図２０（ｄ）は、レジストが残った部分２０−４の格子状のパターンの拡大図である。このレジストの格子２０−６の幅と周期は図１９（ｄ）に示したＧ及びＨの値と同じである。矢印２０−７は図２０（ｃ）の矢印２０−５と同じ方向を示している。次に、図２０（ｅ）に示したように、ドライエッチングによって段差と壁に相当する形状を形成した金型原盤２０−８を形成する。図２０（ｆ）は、ドライエッチングにより形成した壁の配列がある領域２０−９の拡大図である。図２０（ｆ）の壁２０−１１の幅及び周期は、図２０（ｄ）に示したＧ及びＨと同じである。矢印２０−１２は図２０（ｅ）の矢印２０−１０と同じ方向を示している。続いて、図２０（ｇ）に示したように、金型原盤２０−８に無電解めっき法でニッケル薄膜を形成した後に電解めっき法でニッケル膜厚を１ｍｍまで増やして金型２０−１３を形成する。その後、金型２０−１３の表面に所定のフッ素系の離型処理を施すことで、図２０（ｈ）に示した高さ２４０ｎｍの段差の型２０−１４と、基板間の距離を保つための部材の型２０−１５を有する金型２０−１６を得ることができる。

なお、本実施例では原料にポリスチレンを用いてナノインプリント法で段差及び壁の配列を形成したが、液状の材料を金型上に流し込むキャスト法を始めとする他の成型法を用いることもできる。特に透明で弾性があり、基板と密着するＰＤＭＳ(ポリジメチルシロキサン)などを用いる際にはキャスト法を用いることが好適である。また、本実施例では、基板間の距離を保つ部材１８−４を壁の配列としたが、図２１に示したような円柱２１−１の配列などの別の形状の部材としてもよい。

図１８に戻って、第１の基板１８−１及び第２の基板１８−２を準備した後に、第１の基板１８−１の領域１８−４と第２の基板１８−２の平坦な表面に３−アミノプロピルトリメトキシシランでシランコートを行う。この処理を施した表面は親水性なので、第１の基板と第２の基板の隙間にできるセルに毛細管現象で水溶液を導入できる。また、この処理によって導入されるアミノ基を利用して生化学物質（プローブ）を固定化できる。または、実施例１と同様に、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランでシランコートを行うことでも、親水性の表面を得て、また、この処理によって導入されるエポキシ基を利用して、生化学物質を固定化できる。続いて、図１８（ｂ）に示したように、第１の基板１８−１の領域１８−４と第２の基板１８−２の表面にプローブ１８−８，１８−９，１８−１０，１８−１１を固定化する。この時、基板同士を向かい合わせたときに、同種のプローブが固定化されている箇所が向かい合うように、プローブを固定する位置を決める。プローブを固定した後、図１８（ｃ）に示したようにプローブを固定化した面を向かい合わせて、実施例１のようにクランプで基板同士を固定する。これにより、プローブを固定した面と面の間に、基板間の距離を保つための部材によってその高さが保たれたセルを形成できる。なお、ＰＤＭＳのように自己接着性を有する材質を第１の基板１８−１または第２の基板１８−２、もしくは第１の基板１８−１と第２の基板１８−２の両方に用いる場合には、クランプを用いなくても第１の基板１８−１と第２の基板１８−２が接着したままの状態を保つことができる。

なお、第１の基板１８−１と第２の基板１８−２の組は、プローブを固定化したものを分析用のキットとしてもよいし、プローブの固定化はユーザにまかせて、プローブが固定化されていないものの組を分析用のキットとしてもよい。

この生化学分析用セルのプローブへのターゲットの結合の検出は、実施例１と同様の生化学分析装置と測定手順を用いることで可能である。また実施例１と同様に、第２の基板１８−２を黒色とすることで、光ファイバ１５−１から照射された光のうち第２の基板１８−２へ透過した光を第２の基板１８−２の中で吸収させ、透過光が界面で反射して分光器へ導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。また、第２の基板１８−２を黒色などの光吸収性とすることで、暗箱を使用しなくても、室内光が反射光を分光器に導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。

実施例１及び実施例２では、毛細管現象を利用して試料溶液をセルに導入した。基板間にできる空間をフローセルとし、圧力を加えるなどして試料溶液がセル内を定常的に流れる状態を作り、プローブへのターゲットの結合の測定を行うこともできる。本実施例では、基板間にできる空間をフローセルとした場合の例を説明する。

図２２は、試料溶液を保持する間隙をフローセルとした場合の生化学分析用キットの製造方法の例についての説明図である。図２２（ａ）に示したように、第１の基板２２−１と平坦な面を有する第２の基板２２−２を準備する。第１の基板２２−１及び第２の基板２２−２は、ＰＤＭＳ製とする。図２２（ａ）に示したように、第１の基板２２−１には深さ２４０ｎｍ、幅３２０ｎｍの幅の溝を４００ｎｍの周期で配列した基板間の隙間を形成するための溝の配列を有する領域２２−３を設けておく。図２３は、この基板間の距離を保つための溝の配列の拡大図である。溝の深さＪは約２４０ｎｍ、溝の幅Ｋは３２０ｎｍ、その配列の周期Ｌは４００ｎｍである。ここで、図２２の矢印２２−４と図２３の矢印２３−１は同じ方向を示している。一方、第２の基板２２−２には、溝のアレイに引圧を加えるためのチューブを接続するための穴２２−５及び２２−６を設けておく。また第２の基板２２−２には、実施例１、実施例２と同様に反射光の影響を防ぐための、平坦な面の反対側にそれと非平行な面２２−７を設けておく。

なお、第１の基板の領域２２−３に溝の配列を形成することは必ずしも必要ではない。領域２２−３に溝の配列を形成しない場合、領域２２−３は周囲の面から約２４０ｎｍだけ下がった平面となる。

第１の基板２２−１、第２の基板２２−２を準備した後に、図２２（ｂ）のように、ＰＤＭＳに対して自己接着性を持つ樹脂のフィルムを貼り付けることでマスク２２−８を施す。第１の基板２２−１の溝を形成した領域２２−３と第２の基板の平坦な表面のマスクをしなかった部分に３−アミノプロピルトリメトキシシランでシランコートを行う。この処理を施した表面は親水性なので、第１の基板と第２の基板の間でできるセルに毛細管現象で水溶液を導入できる。また、この処理によって導入されるアミノ基を利用して生化学物質（プローブ）を固定化できる。または、実施例１と同様に、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランでシランコートを行うことでも、親水性の表面を得て、また、この処理によって導入されるエポキシ基を利用して、生化学物質を固定化できる。続いて、図２２（ｂ）に示したように、第１の基板２２−１の溝の配列を形成した領域２２−３と第２の基板２２−２の平坦な面の表面にプローブ２２-９，２２-１０，２２-１１，２２-１２を固定化する。この時、基板同士を向かい合わせたときに、同じプローブが固定化されている箇所同士が向かい合うように、プローブを固定化する位置を決める。続いて、第１の基板２２−１及び第２の基板２２−２からマスク２２−８を外して、図２２（ｃ）のように、第１の基板２２−１と第２の基板２２−２を、自己接着性を利用して接着する。

なお、第１の基板２２−１と第２の基板２２−２の組は、プローブを固定化したものを分析用のキットとしてもよいし、プローブの固定化はユーザにまかせて、プローブが固定化されていないものの組を分析用のキットとしてもよい。

図２４は、この生化学分析用キットを用いたプローブへのターゲットの結合を検出する装置及び方法を模式的に示したものである。第２の基板２２−２のチューブを接続するための穴２２−６にチューブ２４−３を接続する。このチューブ２４−３の反対側にシリンジ２４−４を接続する。シリンジポンプ２４−５を利用して、シリンジを引き、フローセルに引圧をかける。第２の基板のもう一方のチューブを接続するための穴２２−５にはチューブ２４−６を接続する。このチューブ２４−６の反対側にバルブ２４−７を接続する。このバルブ２４−７を切り替えることで、緩衝液２４−９を送液している状態から、試料溶液２４−８を送液する状態に切り替えることができる。

また、図２４に示したようにバルブを複数取り付ける。また、バルブに接続された容器の一つに希塩酸を入れておき、これを３分間フローセル中に注入することで、プローブとして基板に固定化された生化学物質から、各試料溶液をフローセル中に流した際に結合した生化学物質（ターゲット）を解離させることができる。これにより、以下のように連続的に異なる試料溶液をフローセルに注入して測定することができる。まず緩衝液を送液している状態から、試料溶液を送液する。再び緩衝液を送液し、最初の緩衝液を送液している状態との反射スペクトルの極小の位置のシフトを調べる。そして、希塩酸を３分間送液し生化学物質を解離させた後、緩衝液を送液し、元の状態に戻る。以上を１サイクルとして、同様に次の試料溶液の注入を行うことができる。

セル内に送液された試料溶液中のターゲットと、第１の基板２２−１と第２の基板２２−２表面に固定化されたプローブの結合は、実施例１と同じ光学検出系により測定できる。光ガイド１４−２を用いて、白色光源１４−３からの光を第一の基板２２−１側から照射し、第１の基板２２−１及び第２の基板２２−２の各プローブを固定した表面からの反射光を各分光器１４−４に導く。各分光器１４−４から得られる反射スペクトルを計算機１４−５でリアルタイムに取り込み、それぞれの反射スペクトルの極小を与える波長の変化を読み取る。

実施例１と同様に、光ガイド１４−２の先端を、第１の基板２２−１にほとんど接するように配置する。これにより、第１の基板の裏面からの反射光が、反射光を分光器へ導く光ファイバ１５−２に直接入ることを防ぐことができる。また、第２の基板２２−２の非平行な面２２−７は傾いているので、非平行な面２２−７での反射光が光ファイバ１５−２に直接戻ることを防ぐことができる。以上の測定は、暗箱２４−１を用いることで、室内光が反射光を分光器に導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。暗箱２４−１には蓋２４−２を設け、暗箱内に光ガイド１４−２、第１の基板２２−１、第２の基板２２−２、チューブ２４−３、チューブ２４−６を入れる。蓋２４−２を開けてセットアップを行い、蓋２４−２を閉じて測定を行う。

ここで、第２の基板２２−２を黒色のＰＤＭＳとすることで、光ファイバ１５−１から照射された光のうち第２の基板２２−２へ透過した光を基板２２−２の中で吸収させ、透過光が界面で反射して分光器へ導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。また、第２の基板２２−２を黒色のＰＤＭＳとすることで、暗箱を使用しなくても、室内光が反射光を分光器に導く光ファイバ１５−２に入ることでの測定への影響を防ぐことができる。本実施例では、図２３に示した溝のアレイを形成してセルを形成したが、第１の基板２２−１の領域２２−３に図２１に示したような円柱のアレイを残して溝を形成し、これを第２の基板２２−２と貼り合わせることで円柱の高さをその厚さとしたセルを形成することもできる。また、本実施例ではプローブ及び光ガイドを送液方向に１列に配列したが、これを複数列として２次元配列としてもよい。

上記のように、片側の基板の上にその光学的厚さが可視光の波長の４分の１またはその奇数倍である光学薄膜を形成することで、実施例１、実施例２、実施例３よりもさらに基板間の隙間の厚さを小さくし、セルの容量を小さくすることができる。以下、光学薄膜を用いることでさらにセルの厚さを小さくした場合の実施例を説明する。

図２５は、第２の基板の上に光学薄膜を形成する場合の第２の基板の作製の手順を示す図である。図２５（ａ）のように、２６ｍｍ×１０ｍｍのシリコン基板の平坦な表面に屈折率を２．２に調節した窒化シリコン薄膜を形成した第２の基板２５−１を準備する。その裏面にも窒化シリコン薄膜を形成しておく。これにより、この基板のアルカリ溶液への薬品耐性が向上する。この第２の基板２５−１には高さ５０ｎｍの段差２５−２を設けておき、平坦な面２５−３に対して平坦な面２５−４を５０ｎｍ高くしておく。図２５（ｂ）に図２５（ａ）のＭ−Ｍ’の断面図を示す。シリコン基板の裏面には窒化シリコンの膜２５−５が形成されている。シリコン基板の表面には、窒化シリコンの膜２５−６が形成されている。窒化シリコンの膜２５−６には高さ５０ｎｍの段差２５−２があり、段差２５−２を境として低い面が平坦な面２５−３、高い面が平坦な面２５−４である。

図２６に、センサキットの使用方法を示す。第１の基板としては、スライドガラス２６−１を用いる。スライドガラス２６−１と第２の基板２５−１の平坦な表面２５−３に３−アミノプロピルトリメトキシシランでシランコートを行う。この処理を施した表面は親水性なので、第１の基板と第２の基板の隙間にできるセルに毛細管現象で水溶液を導入できる。また、この処理によって導入されるアミノ基を利用して生化学物質を固定化できる。または、実施例１と同様に、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランでシランコートを行うことでも、親水性の表面を得て、また、この処理によって導入されるエポキシ基を利用して、生化学物質を固定化できる。

続いて、図２６（ａ）に示したように、スライドガラス２６−１と第２の基板２５−１の平坦な表面２５−３にプローブ２６−２，２６−３，２６−４，２６-５を固定する。この時、基板同士を向かい合わせたときに、同種のプローブが固定化されている箇所同士が向かい合うように、プローブを固定する位置を決める。プローブを固定した後、図２６（ｂ）に示したようにプローブを固定化した面を向かい合わせて、実施例１と同様にクランプで基板同士を固定する。これにより、プローブを固定した面と面の間に、段差２５−２の高さの間隔ができ、セルを形成できる。

このセンサキットのプローブへのターゲットの結合の検出は、実施例１と同様の生化学分析装置と測定手順を用いることで可能である。このとき、第２の基板２５−１は不透明なので、実施例１で第２の基板を黒色などの光吸収性のガラスとした場合と同様の効果が得られ、第２の基板への透過光及び室内光の測定への影響を防ぐことができる。なお、ここでは第２の基板に屈折率が２．２である光学薄膜を形成する例について説明したが、光学薄膜は第１の基板の方に設けてもよい。

従来の生化学センサの構成を示す図。 従来の生化学センサの干渉色変化を示す図。 従来の生化学センサの構成を示す図。 従来の生化学センサの干渉色変化を示す図。 光学窓に生化学物質が吸着したセンサの模式図。 光学窓に生化学物質が吸着したことによる反射スペクトルの変化を示す図。 本発明による生化学センサの一例を示す模式図。 反射スペクトルの計算結果を示す図。 生化学物質の層の屈折率と反射スペクトルの波長シフト量との関係を示す図。 基板間の距離と反射スペクトルの波長シフト量との関係を示す図。 本発明による生化学センサの他の例を示す模式図。 反射スペクトルの計算結果を示す図。 生化学分析用キットの製造方法の例を示す図。 本発明による生化学分析装置の検出部の一例を示す模式図。 生化学分析装置に設置された生化学分析用セルの部分拡大図。 生化学分析装置の部分拡大図。 クランプの一例とその周辺の模式図。 基板を樹脂とした場合の生化学分析用キットの製造方法を示す図。 ナノインプリント法を用いた生化学分析用キットの製造工程図。 金型の製造方法を示す図。 基板間の距離を保つ部材の例を示す図。 フローセルを形成する生化学分析用キットの製造方法を示す図。 基板間の距離を保つための溝の配列の拡大図。 フローセルを用いた生化学分析装置の概略図。 光学薄膜を有する基板の作製手順を示す図。 生化学分析用キットの使用方法を示す図。

符号の説明

１−１：基板、１−２：光学薄膜、１−３：第１の生化学物質、１−４：第２の生化学物質、７−１：第１の基板、７−２：第２の基板、７−３：生化学物質の層、７−４：生化学物質の層、７−５：液体、１１−２：光学薄膜、１１−３：光学窓、１３−１：第１の基板、１３−２：第２の基板、１３−７，１３−８，１３−９，１３−１０：プローブ、１４−２：光ガイド、１４−３：白色光源、１４−４：分光器、１４−５：計算機、１５−１：光ファイバ、１５−２：光ファイバ、１５−３：台、１６−１：暗箱、２２−１：第１の基板、２２−２：第２の基板、２４−４：シリンジ、２４−５：シリンジポンプ、２４−７：バルブ、２４−８：試料溶液

Claims (14)

1. 平坦な第１の面と前記第１の面に対して高低差を有する平坦な第２の面とを有する第１の基板と、平坦な底面を有する第２の基板とを有し、
   前記第１の基板の第２の面に前記第２の基板の底面が接触し、前記第１の基板の第１の面と前記第２の基板の底面との間に形成される間隙を介して対向する前記第１の基板の前記第１の面の箇所と前記第２の基板の底面の箇所とに同種のプローブが対をなして固定化されており、
   前記第１の基板と第２の基板の一方の側から光照射し、反射スペクトルの変化を利用して前記プローブへの生化学物質の結合を検出することを特徴とする生化学分析用セル。
2. 請求項１記載の生化学分析用セルにおいて、前記間隙を介して対向する前記第１の基板の前記第１の面と前記第２の基板の底面に複数種類のプローブがそれぞれ対をなして固定化されていることを特徴とする生化学分析用セル。
3. 請求項１記載の生化学分析用セルにおいて、前記間隙に当該間隔の厚みを規定する部材が設けられていることを特徴とする生化学分析用セル。
4. 請求項１記載の生化学分析用セルにおいて、前記間隙を構成する前記第１の基板の第１の面及び前記第２の基板の底面は親水性であることを特徴とする生化学分析用セル。
5. 請求項１記載の生化学分析用セルにおいて、前記第２の基板は光を吸収することを特徴とする生化学分析用セル。
6. 平坦な第１の面と前記第１の面に対して高低差を有する平坦な第２の面とを有する第１の基板と、
   平坦な底面を有する第２の基板とからなり、
   前記第１の基板の第２の面に前記第２の基板の底面を接触させて組み立てられ、前記第１の基板の第１の面と前記第２の基板の底面との間に形成される間隙に試料溶液を導入して、前記第１の基板と第２の基板の一方の側から光照射し、反射スペクトルの変化を利用して生化学物質を検出するのに使用される生化学分析用キット。
7. 請求項６記載の生化学分析用キットにおいて、前記第１の基板の前記第１の面に、前記間隙の厚みを規定する部材が設けられていることを特徴とする生化学分析用キット。
8. 平坦な第１の面と前記第１の面に対して高低差を有する平坦な第２の面とを有する第１の基板と、平坦な底面を有する第２の基板とを有し、前記第１の基板の第２の面に前記第２の基板の底面が接触し、前記第１の基板の第１の面と前記第２の基板の底面との間に形成される間隙を介して対向する前記第１の基板の前記第１の面の箇所と前記第２の基板の底面の箇所とに同種のプローブが固定化されており、前記プローブへの生化学物質の結合によって反射スペクトルが変化する生化学分析用セルと、
   前記生化学分析用セルを固定する固定部と、
   光源と、
   分光器と、
   前記光源からの光を前記生化学分析用セルの前記第１の基板の前記第１の面の下方に導く光学系と、
   前記生化学分析用セルからの反射光を前記分光器に導く光学系と、
   前記分光器の出力から反射スペクトルの変化を検出する計算部と
   を備えることを特徴とする生化学分析装置。
9. 請求項１記載の生化学分析用セルにおいて、前記第１の基板の前記第１の面又は前記第
   ２の基板の底面に、光学薄膜が形成されていることを特徴とする生化学分析用セル。
10. 請求項９記載の生化学分析用セルにおいて、前記光学薄膜の光学的厚さが可視光の波長の４分の１またはその奇数倍であることを特徴とする生化学分析用セル。
11. 請求項６記載の生化学分析用キットにおいて、前記第１の基板の前記第１の面又は前記第２の基板の底面に、光学薄膜が形成されていることを特徴とする生化学分析用キット。
12. 請求項１１記載の生化学分析用キットにおいて、前記光学薄膜の光学的厚さが可視光の波長の４分の１またはその奇数倍であることを特徴とする生化学分析用キット。
13. 請求項８記載の生化学分析装置において、前記第１の基板の前記第１の面又は前記第２の基板の底面に、光学薄膜が形成されていることを特徴とする生化学分析装置。
14. 請求項１３記載の生化学分析装置において、前記光学薄膜の光学的厚さが可視光の波長の４分の１またはその奇数倍であることを特徴とする生化学分析装置。

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