JP4914715B2 - 倒立顕微鏡システム - Google Patents

Description

本発明は試料に光を照射し、試料内の標識した蛍光物質から発せられる螢光の強度ゆらぎを解析する蛍光相関分光解析（Fluorescence Correlation Spectroscopy: FCS）などを実行するための倒立顕微鏡システムに関し、特に試料に入射光のフォーカスを結ばせるための照準検出装置を備えた倒立顕微鏡システムに関する。

本発明の基本となる技術は共焦点光学顕微鏡をベースとしたレーザを用いた螢光相関分光解析法に関する技術である。蛍光相関分光法では共焦点光学顕微鏡の視野の中で、蛍光物質で標識されたタンパク質やコロイド粒子などを溶液中に浮遊させ、これにレーザ光を照射して蛍光物質を励起し、これらの微細物質のブラウン運動に基づく蛍光強度のゆらぎを解析して自己相関関数を求め、対象とする微粒子の数や並進拡散速度などを測定する。

例えば、特表１１−５０２６０８号公報には共焦点光学顕微鏡をベースに、試料ステージ上で蛍光標識された試料にレーザ光を照射し、試料から発せられる蛍光の強度ゆらぎを解析し、螢光分子の並進拡散係数などの統計的な性質や分子間の相互作用などを求める方法及び装置について開示されている。

また、ＵＳ６，０７１，７４８号公報では、蛍光物質を含む試料内にレーザ光を集光照射して蛍光物質を励起し、試料から発せられる蛍光の強度や寿命などを測定する装置について開示している。

ところで、試料にレーザ光を照射して蛍光物質を励起し、試料から発せられる蛍光の強度のゆらぎを解析する方法では、マイクロプレートと呼ばれる試料収容容器が良く用いられている。マイクロプレートを用いれば、一度に多くの試料をマイクロプレート上の試料を収容する複数のウェル内に別々に収容し、それぞれ別々に測定することができる。また、マイクロリットルレベルの極めて少量の試料を測定することができるので、多量の試料を準備する必要がないという利点がある。

蛍光相関分光測定では、マイクロプレートの底面を透明のガラスなどで構成し、対物レンズをマイクロプレートの下に設置して、光源からの光をマイクロプレートの下方からマイクロプレートの底面を通してウェル内に収容された試料に照射することで分子の挙動測定が行なわれる。底面が透明なマイクロプレートを用いると、試料から発せられる蛍光などの光信号を励起光学系を用いて測定することができるため、測定装置が複雑にならず、装置構成上都合が良い。

一方、マイクロプレートの底面から直接光をウェル内の試料に集光照射する場合、入射光のフォーカス位置を精度良く制御して、試料に確実に光が当たるように調整しなくてはならない。しかし、集光レンズとして高倍率の対物レンズを用いるため焦点深度が極めて浅くなり、フォーカス位置を精度良く調整するためには熟練が必要とされていた。

一方、このような問題を解決するための提案がいくつか行なわれている。

特表２００２−５４１４３０号公報に記載された技術では、測定用光学系をそのまま用いて、マイクロプレートの底面位置の検出を行なっている。即ち、光源からの光を集光してマイクロプレートの底面から照射し、入射光の光軸上の集光位置を少しずつ光軸に沿って移動させ、マイクロプレートの底面から直接反射してくる反射光の強度を測定して、これのピークが検出される光軸上の位置をマイクロプレートの底面位置と判断し、この位置情報を基に、マイクロプレートのウェル内のフォーカス位置を設定している。

特表２００２−５４２４８０号公報に記載された技術では、光源からの反射光をＣＣＤカメラで受光し、受光面でのスポット位置を検出してプレートの底面位置などを判定し、これに合わせて光源のフォーカス位置調整を行なっている。

特公平０２−５９９６３号公報に記載された技術では、試料の合焦位置のずれを差動ダイオードで受光される光源の光スポット位置の受光面上の位置ずれから感知し、これを基に試料ステージを光軸に沿って移動させ、常に光源の光スポットが試料面に一致するように制御している。

しかしながら、特表２００２−５４１４３０号公報に記載された方法では、正確な位置での測定を行なうためには、測定を行なうウェルを替えるごとに、改めてマイクロプレートの光軸上の底面位置検出を行ない、その結果に基づいて集光レンズの光軸方向の移動調整を実施しなければならない。従って、多数のウェルがあるマイクロプレートを測定する際には手間と時間がかかる。特にマイクロプレートに歪みやたわみがある場合には、頻繁に測定容器の底面位置検出と移動調整を行わなければならず、多くの時間と手間を要するという問題があった。

特表２００２−５４２４８０号公報に記載された方法では、光の光軸上の底面位置を検出しているが、常にその測定結果をフィードバックしてフォーカス位置を制御しているわけではない。従って、測定を行なうウェルを替えるごとに、改めてマイクロプレートの光軸上の底面位置検出を行ない、その結果に基づいて集光レンズの光軸方向の移動調整を実施しなければならない。従って、多数のウェルがあるマイクロプレートを測定する際には手間と時間がかかる。

特公平０２−５９９６３号公報に記載された方法は、合焦位置検出用光学系による試料上の光の位置に、観察用光学系のフォーカス位置を合わせるものであるため、合焦位置検出用光学系の光が試料上で観測されることが必要である。従って、液体試料を対象とした場合には、合焦位置検出用光学系の光は液体試料に結像できないため、適用することは困難である。

本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであって、迅速に試料に合焦することができ、液体試料に対しても適用することのできる照準検出装置を備えた倒立顕微鏡システムを提供することを目的とする。

本発明の実施の形態に係る倒立顕微鏡システムは、試料を収容するための容器と、前記試料を収容するための容器と対峙するように下方に配置される対物レンズと、前記対物レンズを観察光路の光軸と平行方向に駆動させる対物レンズ駆動機構と、前記試料を収容するための容器へ下方から試料を励起する励起用照射光を照射するための励起用照射光源と、前記励起用照射光を前記容器に収容された試料に集光させるための第１の光学系と、前記励起用照射光源とは波長が異なる光源で、前記対物レンズの下方から前記試料に対して照準用照射光を出射する照準用光源と、前記照準用照射光を前記容器に集光させるための第２の光学系と、前記第１光学系の光路上に配置され、前記第１の光学系の光軸方向に前記照準用照射光源からの前記照準用照射光の波長成分を反射し、前記励起用照射光源からの前記励起用照射光の波長を透過させるダイクロイックビームスプリッタと、前記試料を収容するための容器の上部底面から反射した前記照準用照射光を前記対物レンズを介して受光する光電変換素子と、前記ダイクロイックビームスプリッタと前記光電変換素子の間に配置され、前記第１の光学系の合焦位置と前記第２の光学系の合焦位置とのズレ量を調整するための前記第２の光学系の光軸に沿って移動可能な光学素子からなるずれ量調整手段と、前記光電変換素子の受光状態に基づいて前記対物レンズ駆動機構を制御することで前記照準用照射光を前記試料を収容するための容器の上部底面に合焦する制御手段とを有し、前記ずれ量調整手段の光学素子を前記第２の光学系の光軸に沿って移動させることによって前記第２の光学系の合焦位置を前記第１の光学系の合焦位置よりも所定量下方にずらし、前記制御手段によって前記試料を収容するための容器の上部底面に前記第２の光学系の合焦位置を合わせることで、前記試料を収容するための容器の上部底面より所定量上方にずれた位置に前記第１の光学系の合焦位置を合わせることを特徴とする倒立顕微鏡システムである。

本発明に係る第１の実施の形態の測定装置の構成を示す図。 ２分割受光素子の構成を示す図。 対物レンズとマイクロプレートとの間隔に対応した光ビームの反射状況を示す図。 対物レンズとマイクロプレートとの間隔に対応した光ビームの反射状況を示す図。 対物レンズとマイクロプレートとの間隔に対応した光ビームの反射状況を示す図。 ２分割受光素子上の集光位置を示す図。 ２分割受光素子上の集光位置を示す図。 ２分割受光素子上の集光位置を示す図。 ２個の光電変換素子の出力を示す図。 照準検出値を示す図。 動作の結果を示す図。 本発明に係る第２の実施の形態の測定装置の構成を示す図。 対物レンズとマイクロプレートとの間隔に対応した光束を示す図。 対物レンズとマイクロプレートとの間隔に対応した光束を示す図。 対物レンズとマイクロプレートとの間隔に対応した光束を示す図。 ピンホールに対する照射状況を示す図。 ピンホールに対する照射状況を示す図。 ピンホールに対する照射状況を示す図。 ２個の光検出器の出力を示す図。 照準検出値を示す図。 照準検出用光ビームの形状を示す図。 照準検出用光ビームの形状を示す図。 照準検出用光ビームの形状を示す図。 照準検出用光ビームの形状を示す図。 照準用光学系と測定用光学系の位置関係を説明する図。 照準光学系とマイクロプレートとの間隔に対応した光ビームの反射状況と２分割受光素子上の照射状況を示す図。 照準光学系とマイクロプレートとの間隔に対応した光ビームの反射状況と２分割受光素子上の照射状況を示す図。 照準光学系とマイクロプレートとの間隔に対応した光ビームの反射状況と２分割受光素子上の照射状況を示す図。

本発明の基本的な考え方について説明する。

従来の技術では、上述のように、まず所定位置を検出する位置検出動作を実行し、続いてその結果に基づいて合焦位置を調整する位置調整動作を実行し、この一連の動作によって合焦を行っていた。従って、この動作の内、位置検出動作を実行することで、結果として位置調整動作が実行されるように装置を構成することができれば、合焦動作の迅速化を図ることが可能となる。

また、液体試料を測定対象とする場合、液体試料からの反射光を直接検出して位置調整動作を行うことはできないが、その液体試料を収納している容器の位置を検出することで、結果として液体試料に対する位置調整動作が実行されるように装置を構成することができれば、液体試料に対しても合焦動作の迅速化を図ることが可能となる。

以下、この考え方に基づいて構成した各実施の形態について説明する。
なお、以下の各実施の形態では、倒立顕微鏡システムを上位概念である測定装置として説明する。

なお、本発明において、集光光学系とはレンズを用いて光束を集光させる機能を具備した光学系のことである。

［第１の実施の形態］
図１は、本発明に係る第１の実施の形態の測定装置の構成を示す図である。この測定装置では、照準検出用光学系と測定用光学系とが別光路として構成されている。

先ず、測定用光学系の構成と動作について説明する。

光源１には、波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いる。このアルゴンレーザは試料を励起するための励起光として作用する。光源１から出射された測定用ビームはビームエクスパンダ２によりビーム直径が拡大された平行光となる。測定用ビームはダイクロイックミラー３により反射され、フィルター１８とダイクロイックビームスプリッタ１７とを透過する。そして、対物レンズ４により集光される。

対物レンズ４の周囲には対物レンズ駆動機構３０が設置されており、対物レンズ駆動機構３０は対物レンズ４を保持すると共に、手動またはコントローラ３５により対物レンズ４を光軸に沿って移動させることができる。これによって、測定用ビームの集光（フォーカス）位置を調整することができる。

集光された測定用ビームは、マイクロプレート５の底面を通過してウェル内試料溶液中にフォーカスを結ぶ。このフォーカス位置はマイクロプレート５のウェルの底面、即ち、マイクロプレート５の上部底面から上方に１０μｍとなっている。マイクロプレート５のウェル内には蛍光物質で標識された試料６が収容されており、測定用ビームにより励起されて蛍光を発する。蛍光物質としては、例えばローダミン・グリーン（ＲｈＧ）が用いられる。

ウェル内に収容された試料より発せられた蛍光は再び対物レンズ４を介して、ダイクロイックビームスプリッタ１７とフィルター１８を透過する。ここで、ダイクロイックビームスプリッタ１７は測定用ビームと蛍光とを透過する特性を有し、フィルター１８は、後述する照準検出用レーザ光を遮断する特性を有している。

そして、蛍光は、ダイクロイックミラー３を透過し、蛍光のみを透過するフィルター７を透過し、集光レンズ８によりピンホール４０の面内に集光される。ピンホール４０によってウェル内で発生したノイズ光が除去された蛍光は、ピンホール４０の後方に配設された光検出器９で受光されて測定信号に変換される。

次に、照準検出用光学系の構成と動作について説明する。

偏光特性を有する照準検出用レーザ１０から出射された照準検出用光ビームはコリメートレンズ１１により平行光となり、光路中に配置された遮蔽版１２によって、その断面の半分の光束が遮光される。このとき、光束の断面はほぼ半円形となっている。残り半分の光束は偏光ビームスプリッタ１３で反射され、レンズ１４によって集光された後、リレーレンズ１５を通過し、１／４波長板１６によって、直線偏光から円偏光に変換される。

この光ビームはダイクロイックビームスプリッタ１７で反射され、対物レンズ４によりマイクロプレート５の上部底面に集光する。この光ビームはマイクロプレート５の上部底面で反射し、対物レンズ４を透過して、ダイクロイックビームスプリッタ１７で反射される。そして、光ビームは１／４波長板１６を通過する際に円偏光から直線偏光に変換され、レンズ１５で集光された後、レンズ１４により再び平行光とされ、偏光ビームスプリッタ１３を透過する。偏光ビームスプリッタ１３を通過した光束はレンズ２０により集光され、そのフォーカス位置に配置された２分割受光素子２１で受光する。そして、２分割受光素子２１の出力に基づいてコントローラ３５が、対物レンズ駆動機構３０を駆動して、対物レンズ４を光軸に沿って移動させる。

図２は、２分割受光素子２１の構成を示す図である。２分割受光素子２１は、同じ材質から成る同じ形状の２つの光電変換素子２１ａ、２１ｂを備えている。次に、レンズ２０により集光された光束が、２分割受光素子２１上のどの位置に照射されるかについて説明する。

図３Ａ，３Ｂ，３Ｃは、対物レンズ４とマイクロプレート５との間隔に対応した光ビームの反射状況を示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の上部底面との間隔が所定の値である場合には、図３Ｂに示すように、反射した光ビームは対物レンズ４の中心軸に対称な位置を通過する。しかし、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも近づいている場合には、図３Ａに示すように、反射した光ビームは対物レンズ４の中心に近づいた位置を通過する。また、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも離れている場合には、図３Ｃに示すように、反射した光ビームは対物レンズ４の中心から遠ざかる位置を通過する。

図４Ａ，４Ｂ，４Ｃは、対物レンズ４とマイクロプレート５との間隔による、２分割受光素子２１上の集光位置を示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値である場合には、図４Ｂに示すように、反射した光ビームは光電変換素子２１ａと２１ｂに均等に照射する。しかし、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも離れる場合には、図４Ｃに示すように、反射した光ビームは光電変換素子２１ａにより多く照射する。また、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも近づく場合には、図４Ａに示すように、光電変換素子２１ｂにより多く照射する。なお、対物レンズ４とマイクロプレート５の上部底面との間隔によって、２分割受光素子２１上の光ビームは大きさが変化する点に留意する必要がある。

図５は、対物レンズ４を光軸方向に移動させた場合の２個の光電変換素子２１ａ、２１ｂの出力Ａ、Ｂを示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値である場合には、出力Ａと出力Ｂとは等しいが、間隔（Ｚ）が広がるにつれて出力Ａが大きくなり、さらに間隔（Ｚ）が広がるにつれて出力Ａのみが出力され、光ビームが光電変換素子２１ａから外れるにつれて出力Ａが減少する。出力Ｂについても同様に説明することができる。

コントローラ３５は、出力Ａ、Ｂの信号から図６に示す照準検出値（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）を演算する。そして、対物レンズ駆動機構３０を作動させて対物レンズ４を光軸方向に移動させ、照準検出値がずれ量Ｄに対応する値になるようにフィードバック制御を行う。この照準検出値は対物レンズ４とマイクロプレート５の上部底面との間隔を示している。この動作によって対物レンズ４とマイクロプレート５の上部底面との間隔が所定の値になるように制御される。

以上の動作の結果を図７に示す。図７に示すように照準検出用レーザの合焦位置（Ｘ）はマイクロプレート５の上部底面上に位置する。このとき、測定用レーザの合焦位置（Ｙ）は、照準検出用レーザの合焦位置（Ｘ）から、ずれ量Ｄだけ光軸に沿って上方に位置している。即ち、照準検出用レーザの合焦位置（Ｘ）と測定用レーザの合焦位置（Ｙ）は光軸に沿って予め量Ｄだけずれるように調整されている。

次に、ずれ量Ｄの調整方法について説明する。このずれ量Ｄは、測定しようとする試料の量、マイクロプレート５の種類などによって適正な値に調整できることが望ましい。

第１の調整方法は、図６に示す照準検出値「（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）」に電気的なオフセットを加え、コントローラ３５が、そのオフセットされた照準検出値を０とするように制御するものである。そして、その電気的なオフセット量は外部の設定器（不図示）から入力する。

第２の調整方法は、図６に示す照準検出値「（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）」に対して、コントローラ３５が、オフセットされた値になるように制御するものである。そして、その制御目標値であるオフセットされた値は外部の設定器（不図示）から入力する。

第３の調整方法は、照準用検出光の波長と測定用光の波長とが異なるように構成する。例えば、照準検出光に赤外レーザ光を用いると、対物レンズ４の色収差により照準検出光と測定光との合焦位置が異なるため、この位置の異なりをずれ量Ｄとすることができる。

第４の調整方法は、光学系を調整する方法である。ずれ量Ｄは、照準検出用光学系において、集光レンズ１４を光軸に沿って移動させることで調整することができる。集光レンズ１４を移動することによって、照準検出用光ビームの光軸に沿っての合焦位置を変化させることができるからである。そこで、集光レンズ１４が光軸に沿って移動できる機構を設け、ずれ量Ｄを調整しても良い。また、ずれ量Ｄの調整は集光レンズ１４を光軸に沿って移動させる代わりに図１に示すリレーレンズ１５を同じく光軸に沿って移動させても良い。

第５の調整方法は、同じく光学系を調整する方法であるが、マイクロプレート５内の集光位置を調整し、その後に受光位置である２分割受光素子２１の位置をそれに合わせて調整する。

先ず集光位置の調整は、対物レンズ４に対してコリメート状態よりも発散あるいは収束した光を入射することで行う。例えば、収束した光を入射するためには、照準検出用レーザ１０とコリメートレンズ１１とを相対的に離れる方向に動かせば良い。これは、リレーレンズ１５と集光レンズ１４を相対的に離れる方向に動かすことと同様の効果を生ずる。

次に、集光位置で調整したずれ量Ｄに対応した位置に受光位置の調整を行う。受光位置の調整は、上述の場合では、レンズ２０と２分割受光素子２１を相対的にずれ量Ｄに対応して近づけることにより行う。

なお、この集光位置の調整と受光位置の調整は、手動で操作しても良く、また自動で調整するように構成しても良い。例えば、ずれ量Ｄを入力すると、上述の要領で集光位置の調整と受光位置の調整を行うようにソフトウエアを作成し、位置駆動装置を動作しても良い。

なお、本実施の形態では、ずれ量Ｄはマイクロプレート５の上部底面から１０μｍ上方の試料溶液内として調整している。測定用レーザには、波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ、あるいは波長６３３ｎｍのヘリウムネオン・レーザを用いる。照準検出用光源には、例えば波長７８０ｎｍの赤外半導体レーザを用いる。しかし、照準検出用光源は、赤外光である必要は無く、例えば長波長の可視光であっても良い。また照準検出用光源は、レーザである必要は無くＬＥＤを用いても良い。ＬＥＤを使用すれば装置を小型、安価に製造することができる。ＬＥＤを使用する場合は、コリメートレンズ１１と偏光ビームスプリッタ１３との間に偏光板を入れることで効率的に光を利用することができる。

また、本実施の形態では、照準検出用レーザ１０から出射された照準検出用光ビームは、光路中に配置された遮蔽版１２によって、その断面の半分の光束が遮光されて、光束の断面はほぼ半円形となっている。しかし、光ビームの中心軸付近の光は強度が強いため遮蔽板１２による回折の影響が生ずる可能性がある。即ち、半円形の断面の内、（１）元の円形の中心付近の光、（２）元の円形の中心線付近の光、は回折の影響を受け易いため、この影響が生じないようにすることが望ましい。

図１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ，１３Ｄは、照準検出用光ビームの形状を示す図である。

上述の問題を解決するために、図１３Ａでは、遮蔽板１２を中心線よりもさらに遮光する位置に移動して配置している。これによって、中心軸付近の強度の強い光による回折の影響を除去することができる。図１３Ｂでは、さらに遮蔽板１２の形状を変えて、中心軸付近の光を遮蔽している。なお、遮蔽板１２の形状は、図１３Ｃのように三角形状でも良く、図１３Ｄのように四角形状であっても良い。

［第２の実施の形態］
図８は、本発明に係る第２の実施の形態の測定装置の構成を示す図である。第２の実施の形態に係る測定装置は、照準検出用光学系の構成が第１の実施の形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一の部分には同一の符号を付して、詳細の説明は省略する。

次に、照準検出光学系の構成と動作について説明する。

照準検出用レーザ１０から出射された照準検出用光ビームは、ビームエクスパンダ２３によって一旦集光された後、再び光束を拡大し、偏光ビームスプリッタ１３で反射され、レンズ２４によって平行光となる。そして、１／４波長板１６によって直線偏光から円偏光へ変換され、ダイクロイックビームスプリッタ１７で反射される。

ダイクロイックビームスプリッタ１７で反射された光は、対物レンズ４を通過して集光され、マイクロプレート５に照射される。マイクロプレート５の上部底面で反射した光は再び対物レンズ４を通過して、平行光束に変換され、ダイクロイックビームスプリッタ１７で反射される。そして、光は１／４波長板１６を通過して円偏光から直線偏光に変換され、レンズ２４に到達する。レンズ２４で集光された反射光は偏光ビームスプリッタ１３を通過し、ビームスプリッタ２５により進行方向を２方向に分離される。

一方の光はフォーカス点Ｑよりも光軸上前方に設置されたピンホール２６を通過し、光検出器２７で受光される。光検出器２７からは、受光された光強度に応じた電気信号Ａが出力される。もう一方の光束はフォーカス点Ｑよりも光軸上後方に配置されたピンホール２８を通過し、別の光検出器２９で受光される。光検出器２９からは、受光された光強度に応じた電気信号Ｂが出力信号として得られる。

次に、レンズ２４により集光された光束が、ピンホール２６、２８に対してどのように照射されるかについて説明する。

図９Ａ，９Ｂ，９Ｃは、対物レンズ４とマイクロプレート５との間隔に対応した光束を示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値（焦点距離）である場合には、図９Ｂに示すように、対物レンズ４を通過後は平行光束となる。しかし、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも近づいている場合には、図９Ａに示すように、対物レンズ４を通過後は発散する光束となる。また、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも離れている場合には、図９Ｃに示すように、対物レンズ４を通過後は収束する光束となる。

図１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃは、対物レンズ４とマイクロプレート５との間隔に対応した、ピンホール２６、２８に対する照射状況を示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値である場合には、図１０Ｂに示すように、レンズ２４に入射した光ビームはフォーカス点Ｑに集光し、光検出器２７、２９に均等に照射する。しかし、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも近づく場合には、図１０Ａに示すように、レンズ２４に入射した光ビームはピンホール２８に集光し、光検出器２９により多く照射する。また、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも遠ざかる場合には、図１０Ｃに示すように、レンズ２４に入射した光ビームはピンホール２６に集光し、光検出器２７により多く照射する。

図１１は、対物レンズ４を光軸方向に移動させた場合の２個の光検出器２７、２９の出力Ａ、Ｂを示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値である場合には、出力Ａと出力Ｂとは等しいが、間隔が広がるにつれて出力Ａが大きくなり、さらに間隔が広がるにつれて出力Ａは飽和状態が継続し、その後、出力Ａが減少する。出力Ｂについても同様に説明することができる。

コントローラ３５は、出力Ａ、Ｂの信号から図１２に示す照準検出値（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）を演算する。そして、対物レンズ駆動機構３０を作動させて対物レンズ４を光軸方向に移動させ、照準検出値がずれ量Ｄに対応する設定値になるようにフィードバック制御を行う。この動作によって対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値になるように制御される。

第２の実施の形態では、第１の実施の形態と同様に、照準検出用レーザの合焦位置（Ｘ）と測定用レーザの合焦位置（Ｙ）が光軸に沿って予め量Ｄだけずれるように調整されている。このずれ量Ｄはレンズ２４を光軸に沿って移動させることで調整することができる。

［第３の実施の形態］
第３の実施の形態に係る測定装置は、照準用光学系の構成が集光光学系でない点が第１の実施形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一の部分には同一の符号を付して、詳細の説明は省略する。

図１４は、照準用光学系と測定用光学系の位置関係を説明する図である。図１４では、対物レンズ４とマイクロプレート５近傍を拡大して示している。

照準光学系は、光源４１、レンズ４２及び２分割受光素子４５で構成されている。なお、光源４１、レンズ４２及び２分割受光素子４５は、対物レンズ４と一体化され、図示しない対物レンズ駆動機構３０によって駆動されて図中の上下（Ｚ）方向に移動可能である。照準検出用の光源４１から出射された照準検出用光ビームは、レンズ４２によって平行光となって、マイクロプレート５の下部底面に照射される。そして、その反射光は、２つの受光面をもつ２分割受光素子４５に入力する。

図１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃは、照準光学系とマイクロプレート５との間隔に対応した光ビームの反射状況と２分割受光素子上の照射状況を示す図である。

対物レンズ４とマイクロプレート５の上部底面との間隔が所定の値である場合には、図１５Ｂに示すように、反射した光ビームは２分割受光素子の受光素子４５ａ、４５ｂに均等に照射する。しかし、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも近づいている場合には、図１５Ａに示すように、反射した光ビームは２分割受光素子の受光素子４５ａをより多く照射する。また、対物レンズ４とマイクロプレート５の底面との間隔が所定の値よりも離れている場合には、図１５Ｃに示すように、反射した光ビームは２分割受光素子の受光素子４５ｂをより多く照射する。

そこで第１の実施の形態の図６で示したように、受光素子４５ａ、４５ｂの出力Ａ、Ｂから照準検出値（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）を演算する。そして、対物レンズ駆動機構３０を作動させて照準光学系及び対物レンズ４を光軸方向に移動させ、照準検出値が規定値（例えば０）になるようにフィードバック制御を行う。この動作によって照準光学系とマイクロプレート５の下部底面との間隔が所定の値になるように制御される。この結果、測定用光学系（不図示）の合焦位置をウェル内の所定位置に制御することができる。なお、照準検出用光ビームは、マイクロプレート５の上部底面に照射されるようにしても良い。

検出用光ビームをマイクロプレート５の下部底面に反射させるときは、上部底面の反射光の影響を受けないようにレイアウトすることが望ましい。これは、上部底面に反射させるときも同様である。

なお、本発明は上述した各実施の形態に限定されることはない。例えば、図１の１／４波長板１６は、レンズ１５の後に設けなくとも、偏光ビームスプリッタ１３とダイクロイックビームスプリッタ１７の間に設ければ所要の効果を得ることができる。また、集光レンズ１４は、図１では投光、受光の共通光路に配置してあるが、投光用としてはコリメートレンズ１１と偏光ビームスプリッタ１３との間、受光用としては偏光ビームスプリッタ１３とレンズ２０との間に別々に設置させても良い。

また２分割受光素子２１、４５はポジションセンサ（ＰＳＤ：Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）に置き換え、光ビームが照射されている位置を直接測定することもできる。また測定用レーザは上述の各実施の形態では１種類であるが、複数の測定用レーザを用いて、複数の投光系、受光系を持つ測定装置を構成しても良い。

また、合焦検出用レーザの合焦位置をマイクロプレートの上部底面ではなくマイクロプレート５の下部底面に設定しても同様の効果が得られる。

更に、測定動作と対物レンズの光軸方向の移動動作である合焦追従動作とを同時に行なうことが好ましくない場合は、測定対象ウェルを変更する際に合焦追従動作を行ない、測定中は合焦追従動作を停止させてもよい。

なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。

本発明は迅速に試料に合焦することができ、液体試料に対しても適用することのできる照準検出装置を備えた倒立顕微鏡システムを製造する産業に広く利用することができる。

Claims (3)

1. 試料を収容するための容器と、
   前記試料を収容するための容器と対峙するように下方に配置される対物レンズと、
   前記対物レンズを観察光路の光軸と平行方向に駆動させる対物レンズ駆動機構と、
   前記試料を収容するための容器へ下方から試料を励起する励起用照射光を照射するための励起用照射光源と、
   前記励起用照射光を前記容器に収容された試料に集光させるための第１の光学系と、
   前記励起用照射光源とは波長が異なる光源で、前記対物レンズの下方から前記試料に対して照準用照射光を出射する照準用光源と、
   前記照準用照射光を前記容器に集光させるための第２の光学系と、
   前記第１光学系の光路上に配置され、前記第１の光学系の光軸方向に前記照準用照射光源からの前記照準用照射光の波長成分を反射し、前記励起用照射光源からの前記励起用照射光の波長を透過させるダイクロイックビームスプリッタと、
   前記試料を収容するための容器の上部底面から反射した前記照準用照射光を前記対物レンズを介して受光する光電変換素子と、
   前記ダイクロイックビームスプリッタと前記光電変換素子の間に配置され、前記第１の光学系の合焦位置と前記第２の光学系の合焦位置とのズレ量を調整するための前記第２の光学系の光軸に沿って移動可能な光学素子からなるずれ量調整手段と、
   前記光電変換素子の受光状態に基づいて前記対物レンズ駆動機構を制御することで前記照準用照射光を前記試料を収容するための容器の上部底面に合焦する制御手段と
   を有し、
   前記ずれ量調整手段の光学素子を前記第２の光学系の光軸に沿って移動させることによって前記第２の光学系の合焦位置を前記第１の光学系の合焦位置よりも所定量下方にずらし、前記制御手段によって前記試料を収容するための容器の上部底面に前記第２の光学系の合焦位置を合わせることで、前記試料を収容するための容器の上部底面より所定量上方にずれた位置に前記第１の光学系の合焦位置を合わせることを特徴とする倒立顕微鏡システム。
2. 前記容器はマイクロプレートであり、収容した溶液との境界面であるマイクロプレートの上部底面に前記第２の光学系の合焦位置を合わせることを特徴とする請求項１に記載の倒立顕微鏡システム。
3. 前記第２の光学系の前記照準用光源はレーザーまたはＬＥＤであることを特徴とする請求項１に記載の倒立顕微鏡システム。

Images