JP7700222B2 - 編集効率が向上したプライム編集ベースの遺伝子編集用組成物およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子編集効率が向上したプライム編集ベースの遺伝子編集用組成物、前記組成物を用いた遺伝子編集方法、遺伝子編集用キット、および遺伝子組換え哺乳動物の製造方法に関する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、所望の標的突然変異を効率的に誘導可能なヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）、塩基エディター（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ）、遺伝子トランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｓ）のような様々な進歩したゲノム編集ツールとして進化してきた。特にＣＲＩＳＰＲシステムに基づいて開発されたシトシン塩基エディター（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ、ＣＢＥ）およびアデニン塩基エディター（ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ、ＡＢＥ）は、マウスを含む様々な有機体において、Ｃ・ＧをＴ・Ａに、Ａ・ＴをＧ・Ｃに効率的に置換することができる。また、最近の研究から、ヒト細胞においてＣからＧに塩基編集が可能なＣ－ｔｏ－Ｇ塩基エディター（Ｃ－ｔｏ－Ｇ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ）としてＣＧＢＥ１が報告されている。しかし、１つ以上の塩基の挿入、置換、または切断のような正確な標的突然変異の生成は、細胞内の相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）の低い効率性による遺伝子編集の制限により依然として難しい実状である。

このような要求に応えて開発された新しい概念のゲノム編集ツールであるプライムエディター（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒ、ＰＥ）は、ＤＮＡの二本鎖のうち一本鎖のみを切断するように改変されたＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ－Ｈ８４０Ａ）および逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＲＴ）で構成された融合タンパク質である。プライムエディターは、所望の編集配列をコード化する新しい形態のガイドＲＮＡであるｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を必要とする。前記ｐｅｇＲＮＡは、標的遺伝子の非標的鎖に相補的な塩基配列（ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＰＢＳ）および編集しようとする塩基配列を含む逆転写酵素の鋳型鎖部位（ＲＴ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を有する。プライムエディターのＣａｓ９ニッカーゼが標的遺伝子の非標的鎖を切断し、逆転写酵素がｐｅｇＲＮＡのＲＴ鋳型鎖に基づいて編集された塩基配列が含まれた新しいＤＮＡ鎖を合成し、その後、細胞内修復過程により従来のＤＮＡ塩基配列が除去され、新たに合成された編集形態のＤＮＡ塩基配列がこれに代わる。このような精巧なゲノム編集システムを介して、二本鎖ＤＮＡの切断や供与ＤＮＡ無しに塩基から塩基への置換、小さい大きさの挿入および欠失を含む標的突然変異の生成が可能である。しかし、プライムエディターもまた塩基エディターよりはその頻度が低いが、オフ－ターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の問題が発生し、特に逆転写酵素により追加の塩基配列の挿入および欠失が発生して正確な編集が難しいという問題がある。さらに、上記問題とともに、現在開発された塩基エディターおよびプライムエディターは、非常に低い効率の限界がある。例えば、プライムエディターの中でも最も効率が良いＰＥ３は、遺伝子編集効率が２０～５０％に過ぎない。

ヒトを含む生命体の細胞内の遺伝物質は常に突然変異にさらされており、突然変異の蓄積は様々な変異表現型を誘導し、その一部は疾患と関連がある。従って、プライム編集を利用した精巧な遺伝子編集技術は、遺伝疾患の治療のためのツールとして利用可能であり、病原性変異因子を確認し、疾病メカニズムの研究などに幅広く利用可能である。従って、公知のプライムエディターよりも精巧であるとともに編集効率が改善されたプライムエディターおよびそれを用いた遺伝子編集技術の開発が必要である。

Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２０ Ａｕｇ ２８；２１（１７）：６２４０．

プライム編集ベースの遺伝子編集の上記問題を克服するために、本発明者らは、ｐｒｏｘｙｍａｌ ｄｅａｄ ｓｇＲＮＡ（ｄｓｇＲＮＡ）および／またはクロマチン－調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＭＰｓ）を用いて改善されたプライムエディターを開発し、その著しく増進されたゲノム編集効率および標的特異性などを具体的な実験により確認することで本発明を完成した。

そこで、本発明は、遺伝子編集効率が改善されたプライム編集ベースの遺伝子編集用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物を用いた遺伝子編集方法を提供することを他の目的とする。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物を含む遺伝子編集用キットを提供することをまた他の目的とする。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物を用いてヒトを除いた遺伝子組換え哺乳動物を製造する方法を提供することをさらに他の目的とする。

ただし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に限定されず、言及していない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解され得る。

上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、およびｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体を含む、融合タンパク質またはそれをコード化する核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化する核酸と、を含み、
この際、前記ガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を含み、前記ｄｓｇＲＮＡは、１０～２０ｂｐ長であることを特徴とする、遺伝子編集用組成物を提供する。

本発明の一実施形態として、前記ｄｓｇＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ結合部位から５～７０ヌクレオチドが離れた位置に結合して前記融合タンパク質のクロマチンアクセシビリティを増加させ得る。

本発明の他の実施形態として、前記遺伝子編集用組成物は、非標的ＤＮＡ鎖に相補的に結合して標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をさらに含み得る。

また、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、ｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体、およびｉｉｉ）クロマチン調節ペプチド（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む、融合タンパク質またはそれをコード化する核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化する核酸と、を含み、
前記ガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であることを特徴とする、遺伝子編集用組成物を提供する。

本発明の一実施形態として、前記クロマチン調節ペプチドは、高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １、ＨＮ１）、ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）、またはこれらの組み合わせであり得る。

本発明の他の実施形態として、前記クロマチン調節ペプチドは、化学的結合により直接的に、リンカーにより間接的に、またはこれらの組み合わせにより前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質または逆転写酵素に連結され得る。

本発明のまた他の実施形態として、前記融合タンパク質は、
Ｎ末端－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９］－［Ｈ１Ｇ］－［逆転写酵素］－Ｃ末端、またはＮ末端－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９］－［逆転写酵素］－［Ｈ１Ｇ］－Ｃ末端の構成からなり得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記融合タンパク質は、Ｎ－末端およびＣ－末端にそれぞれ核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列をさらに含み得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質変異体は、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）であり得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質変異体は、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインのいずれか１つが不活性化され得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、Ｍ－ＭＬＶ）に由来し得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記ｄｓｇＲＮＡは、１０～２０ヌクレオチド長で構成され得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記ｄｓｇＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ結合部位から５～７０ヌクレオチドが離れた位置に結合して前記融合タンパク質のクロマチンアクセシビリティを向上させ得る。

本発明のさらに他の実施形態として、前記遺伝子編集用組成物は、遺伝子編集効率および標的特異性が増進されることを特徴とする。

また、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、ｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体、およびｉｉｉ）クロマチン調節ペプチド（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む、タンパク質またはそれをコード化する核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化する核酸と、を含み、
前記ガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であることを特徴とする、遺伝子編集用組成物を提供する。

本発明の一実施形態として、前記ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、および前記ｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体が融合して細胞内に伝達されるか、またはｉ）およびｉｉ）をそれぞれ別に発現させてプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の形態で細胞内に伝達し得る。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）と接触させるステップを含む、遺伝子編集方法を提供する。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物を含む、遺伝子編集用キットを提供する。

また、本発明は、前記遺伝子編集用組成物をヒトを除いた哺乳動物細胞に導入して遺伝子組換え哺乳動物細胞を得るステップと、
前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞をヒトを除いた哺乳動物代理母の卵管に移植するステップと、を含む、ヒトを除いた遺伝子組換え哺乳動物の製造方法を提供する。

本発明の一実施形態として、前記哺乳動物細胞は、哺乳動物の胚細胞であり得る。

本発明では、ｄｅａｄ ｓｇＲＮＡ（ｄｓｇＲＮＡ）および／またはクロマチン－調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＭＰｓ）を用いて性能が改善されたプライムエディターを開発し、その著しく増進されたゲノム編集効率および標的特異性を確認し、標的遺伝子の突然変異動物モデルを作製して次世代への突然変異の伝達および表現型の変化などを確認した。従って、本発明に係る改善されたプライムエディターを含む遺伝子編集用組成物は、ヒト化動物モデルの作製および研究、遺伝工学技術分野、および遺伝疾患の治療手段などの様々な用途として有用に活用することができる。

哺乳動物のゲノムにおいてプライム編集システムを検証した結果であって、図１ａは、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するレポーターＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子においてｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子に対する標的突然変異設計を示した概略図、および前記細胞においてＰＥ３の編集効率を示した顕微鏡イメージおよびサンガーシーケンシングクロマトグラム結果を示したものであり、図１ｂは、ＰＥ３をトランスフェクションさせるかまたはさせていない細胞を１１日間培養後にＦＡＣＳによりｔｄＴｏｍａｔｏ－陰性およびｔｄＴｏｍａｔｏ－陽性細胞を計数した結果である。 マウス遺伝子Ｉｇｆ２およびＡｄａｍｔｓ２０の標的部位で様々な長さのｐｅｇＲＮＡｓおよびｄｓｇＲＮＡを用いてプライム編集効率を最適化した結果であって、図２ａは、前記２種の遺伝子標的においてそれぞれ標的突然変異設計を示した概略図であり、図２ｂは、マウス由来ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてプライマー結合部位（ＰＢＳ）および逆転写酵素鋳型長の様々な組み合わせによるＰＥ３およびＣＭＲ－ＰＥ３のプライム編集効率を比較して示した結果である。 マウス由来ＮＩＨ／３Ｔ３またはＣ２Ｃ１２細胞において順序通りにＩｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｃａｓｐ１、Ｈｏｘｄ１３、Ａｎｇｐｔ１、およびＫｓｒ２それぞれの遺伝子内の標的に対してｄｓｇＲＮＡ使用可否（ＰＥ３、ＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡ）によるＰＥ３のプライム編集効率を比較分析した結果である。 クロマチン調節ペプチド（ＣＭＰ）結合によるプライム編集効率の増進効果を確認した結果であって、図４ａは、ＣＭＰが結合した２種類の融合タンパク質（ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ２）構造を描いたものであり、図４ｂおよび図４ｃは、それぞれＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１およびＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ２のアミノ酸配列を構成別に区分して示したものであり、図４ｄは、ＮＩＨ／３Ｔ３またはＣ２Ｃ１２細胞においてＩｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｃａｓｐ１、Ｈｏｘｄ１３、Ａｎｇｐｔ１、およびＫｓｒ２それぞれの遺伝子内の標的に対してＣＭＰ（ＨＮ１、Ｈ１Ｇ）結合可否によるプライム編集効率を比較分析した結果であり、図４ｅは、ヒト細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＥＫ３配列を標的としてプライム編集効率を比較分析した結果である。 ＮＩＨ／３Ｔ３およびＣ２Ｃ１２細胞においてＩｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｃａｓｐ１、Ｈｏｘｄ１３、Ａｎｇｐｔ１、およびＫｓｒ２それぞれの遺伝子内の標的に対してＰＥ３、ｄｓｇＲＮＡを用いたＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡ、ＣＭＰが結合したＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１、およびＣＭＰとｄｓｇＲＮＡを共に用いたＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡのプライム編集効率を比較分析した結果である。 ＰＥ３、ＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡ、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１、およびＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡの各プライム編集システムが注入されたマウス胚において標的突然変異の生成頻度を分析した結果であって、図６ａは、Ｉｇｆ２での結果であり、図６ｂは、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｈｏｘｄ１３、Ａｎｇｐｔ１、Ｋｓｒ２、およびＡｒでの結果を示したものである。 ＮＩＨ／３Ｔ３およびＣ２Ｃ１２細胞においてＤＮａｓｅ Ｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ分析後、リアルタイムｑＰＣＲによりそれぞれ完全なゲノムＤＮＡの分画を測定した結果であって、図７ａは、前記各細胞においてＩｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｃａｓｐ１、Ｈｏｘｄ１３、Ａｎｇｐｔ１、およびＫｓｒ２標的遺伝子座で完全なゲノムＤＮＡの分画を測定した結果であり、図７ｂは、前記２つの細胞株にＤＮａｓｅ Ｉを２～１６Ｕに異なるように処理し、完全なゲノムＤＮＡの分画を測定した結果であり、図７ｃは、Ｃ２Ｃ１２細胞にＰＥ３、ＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡ、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１、またはＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡをコード化するプラスミドをトランスフェクションさせた後、Ｉｇｆ２標的遺伝子座で完全なゲノムＤＮＡの分画を測定した結果である。 ｄｓｇＲＮＡを用いたＰＥ３を介してマウスにおいて標的突然変異の生成を誘導した結果であって、図８ａは、Ｉｇｆ２遺伝子のｅｘｏｎ４において標的突然変異設計を示した概略図であり、図８ｂは、Ｉｇｆ２においてｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡ＋７を用いたＰＥ３により誘導された標的突然変異（ＧからＣへの置換およびＴＡの挿入）を有する２つのマウスの遺伝子型およびサンガーシーケンシングクロマトグラム結果を示したものであり、図８ｃは、作製されたＩｇｆ２突然変異マウスのＦ１世代マウス７匹に対してサンガーシーケンシングおよびジェノタイピングにより標的突然変異可否を確認した結果である。 本発明に係るプライムエディターのオフ－ターゲット効果を分析した結果であって、図９ａは、野生型および図８で作製された突然変異Ｉｇｆ２ ＃１およびＩｇｆ２ ＃２マウスに対してＩｇｆ２標的突然変異の生成に用いられたｐｅｇＲＮＡおよびｎｓｇＲＮＡの潜在的オフ－ターゲット部位で挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）頻度を測定して示した結果であり、図９ｂは、野生型（Ｉｇｆ２ ＷＴ）およびＩｇｆ２ ＃１マウスに対して全ゲノムシーケンシングを実施し比較した結果であり、図９ｃは、潜在的オフ－ターゲット（ＯＴ）位置に対する塩基配列を比較しサンガーシーケンシングクロマトグラムを示した結果である。 Ｉｇｆ２突然変異マウスの表現型を確認した結果であって、図１０ａは、Ｉｇｆ２^{ｐ＋／ｍ－}雄（Ｆ１）を野生型雌マウスと交配して得られたＩｇｆ２突然変異マウス（ＭＵＴ（Ｉｇｆ２^{ｐ－／ｍ＋}））の小人症表現型を示すイメージであり、図１０ｂは、前記Ｉｇｆ２突然変異マウスとＩｇｆ２野生型マウスの体重を測定して比較した結果である。 本発明に係る３種類の編集効率が改善されたプライム編集システムの構成および作用メカニズムを従来の公知のＰＥ３と比較して描いたものである。

本発明者らは、ｐｒｏｘｙｍａｌ ｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｇＲＮＡ）および／またはクロマチン－調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＭＰｓ）を用いて従来の問題が改善されたプライムエディターを開発し、その優れた編集効率および標的特異性を確認することで本発明を完成した。

そこで、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、およびｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体を含む、融合タンパク質またはそれをコード化する核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化する核酸と、を含み、
この際、前記ガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を含み、前記ｄｓｇＲＮＡは、１０～２０ｎｔ長であることを特徴とする、遺伝子編集用組成物を提供する。

前記遺伝子編集用組成物は、非標的ＤＮＡ鎖に相補的に結合して標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をさらに含み得、好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、本発明においてｎｉｃｋｉｎｇ ｓｇＲＮＡを意味し得る。

本発明で用いられる用語、「遺伝子編集（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）」は、遺伝子矯正、ゲノム編集などと同一の意味として用いられ得る。遺伝子編集は、標的遺伝子内の標的部位に１つ以上の塩基に対して突然変異を誘発する変異（置換、挿入、または欠失）を意味する。好ましくは、前記遺伝子編集は、標的遺伝子の二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ）を伴わないものであり得、より好ましくは、プライム編集（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）を介して行われるものであり得る。

本発明の一実施形態において、前記１つ以上の塩基に対して突然変異を誘発する変異または遺伝子編集は、標的部位に終止コドンを生成させるか、または野生型と異なるアミノ酸をコードするコドンを生成させることで、標的遺伝子を不活性化（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）させる。または、開始コドンを他のアミノ酸に置換して遺伝子を不活性化させるかまたは遺伝子変異を編集するか、挿入または欠失によるフレームシフト（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ）により遺伝子を不活性化させるかまたは遺伝子変異を編集するか、タンパク質を生成しない非コードＤＮＡ配列に変異を導入するか、または疾病を誘発する野生型と異なる配列のＤＮＡを野生型と同一の配列に変化させるなどの様々な形態であり得るが、これらに限定されるものではない。

本発明において、用語「塩基配列」は、当該塩基を含むヌクレオチドの配列を意味し、ヌクレオチド配列、核酸配列、またはＤＮＡ配列と同一の意味として用いられ得る。

本発明において、前記「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」は、遺伝子編集の対象となる遺伝子を意味し、「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅまたはｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）」は、標的遺伝子内の標的特異的ヌクレアーゼによる遺伝子編集または矯正が起こる部位を意味し、一例において、前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ（ＲＮＡｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＧＥＮ）を含む場合、標的遺伝子内のＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼが認識する配列（ＰＡＭ配列）の５’末端および／または３’末端に隣接して位置し得る。

また、本発明は、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、ｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体、およびｉｉｉ）クロマチン調節ペプチド（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む、融合タンパク質またはそれをコード化する核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化する核酸と、を含み、
前記ガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であることを特徴とする、遺伝子編集用組成物を提供する。

前記遺伝子編集用組成物は、非標的ＤＮＡ鎖に相補的に結合して標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をさらに含み得、好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、本発明においてｎｉｃｋｉｎｇ ｓｇＲＮＡを意味し得る。

本発明において、前記クロマチン調節ペプチドは、ヌクレオソームの再配列および／またはクロマチンの再形成を容易にするためにヌクレオソームおよび／または染色体タンパク質と相互作用する染色体タンパク質またはその断片を意味する。より具体的に、前記クロマチン調節ペプチドは、高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １、ＨＮ１）またはその断片、ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）またはその断片、またはこれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されるものではない。

前記高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン（ＨＭＧＮ）は、クロマチンの構造および機能を調節する染色体タンパク質であり、前記ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）は、「リンカーヒストン」とも知られたヒストンＨ１を構成するドメインである。ヒストンＨ１は、ヌクレオソームアレイの圧縮状態を調節し、形態に影響を与え、前記中央球状ドメインは、ヌクレオソーム上のリンカーＤＮＡのｅｎｔｒｙ／ｅｘｉｔ部位近くに結合することが知られている。

前記クロマチン調節ペプチドは、化学的結合により直接的に、リンカーにより間接的に、またはこれらの組み合わせにより前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質または逆転写酵素に連結され得る。具体的に、少なくとも１つのクロマチン調節ペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端、および／または内部位置に連結され得る。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質または逆転写酵素に連結された２個のクロマチン調節ペプチドを含む。より好ましくは、前記融合タンパク質において、ＨＭＧＮ１（ＨＮ１）は、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体のＮ－末端に連結され得、前記ヒストンＨ１中央球状ドメイン（Ｈ１Ｇ）は、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体のＣ－末端または逆転写酵素のＣ－末端に連結され得る。最も好ましくは、前記融合タンパク質は、ｉ）Ｎ末端－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９］－［Ｈ１Ｇ］－［逆転写酵素］－Ｃ末端、またはｉｉ）Ｎ末端－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９］－［逆転写酵素］－［Ｈ１Ｇ］－Ｃ末端の構成からなり得る。

本発明において、前記融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞－透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはこれらの組み合わせをさらに含み得、好ましくは、Ｎ－末端およびＣ－末端にそれぞれ核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列をさらに含み得るが、これに限定されるものではない。

本発明に係る前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり得る。この際、前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。

本発明において、「Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）タンパク質」は、ＤＮＡウイルスに対する特定のバクテリアの免疫学的防御において重要な役割をするタンパク質であり、遺伝工学の応用に多く用いられるが、前記タンパク質の主な機能がＤＮＡを切断することであるため、細胞のゲノムを改変する際に適用することができる。具体的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、３世代の遺伝子ハサミであり、利用しようとする特定の塩基配列を認識し切断して編集し、ゲノムの目的部位に特定の遺伝子を挿入するかまたは特定の遺伝子の活動を停止させる操作を簡単、迅速、かつ、効率性よく実施するのに有用である。Ｃａｓ９タンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができるが、これに限定されるものではない。また、Ｃａｓ９タンパク質は、その目的に合わせて、当業者が追加のドメインを適宜連結し得る。本発明において、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９だけでなく、遺伝子編集のための核酸分解酵素の機能を有するものであれば、Ｃａｓ９の変異体を全て含み得る。

本発明において、前記Ｃａｓ９変異体は、ＤＮＡ二本鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を失うように変異したものを意味し得る。例えば、前記Ｃａｓ９変異体は、エンドヌクレアーゼ活性を失い、ニッカーゼ活性を有するように変異したＣａｓ９タンパク質、およびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て失うように変異したＣａｓ９タンパク質の中から選択された１種以上であり得、好ましくは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ）であり得る。

前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、ヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣまたはＨＮＨドメイン）において変異が起こって不活性化されたものであり得る。具体的に、１０位のアスパラギン酸（Ｄ１０）、７６２位のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０位のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４位のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３位のアスパラギン（Ｎ８６３）、および９８６位のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群から選択された１つ以上が任意の他のアミノ酸に置換された突然変異を含み得、好ましくは、本発明のＣａｓ９ニッカーゼは、８４０位のヒスチジンがアラニンに置換（Ｈ８４０Ａ）された変異を含み得るが、これに限定されるものではない。

前記Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、その由来が限定されず、非限定的な例示として、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、またはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）に由来し得る。

前記Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、微生物から分離したもの、または組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然発生（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものであり得る。前記Ｃａｓ９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め転写されたｍＲＮＡまたは予め生産されたタンパク質の形態、または標的細胞または生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で用いられ得る。一実施形態において、前記Ｃａｓ９は、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、ｒＤＮＡ）により作られた組換えタンパク質であり得る。組換えＤＮＡは、様々な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法により人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。

本発明において、「逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」は、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する能力を有する酵素をいう。本発明において、逆転写酵素は、野生型逆転写酵素だけでなく、上記のようにＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する機能を有するものであれば、逆転写酵素の変異体を全て含み得、逆転写酵素またはその変異体は、好ましくは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、Ｍ－ＭＬＶ）に由来し得るが、これに限定されるものではない。

本発明で用いられる用語「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」は、標的遺伝子内の標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）にハイブリダイゼーション可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体（または、細胞）内でＣａｓのようなヌクレアーゼタンパク質と結合し、それを標的遺伝子（または、標的部位）にガイドする役割をする。

前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成するヌクレアーゼの種類および／またはその由来微生物に応じて適宜選択され得る。例えば、本発明のガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ、ｄｅａｄ ｓｇＲＮＡ、またはｎｉｃｋｉｎｇ ｓｇＲＮＡであり得る。

前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分であるスペーサ領域（Ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎなどと称する）、およびＣａｓ９タンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含み得る。より具体的には、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのヘアピン構造、およびターミネータ（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列を含み得る。追加的に、前記ｐｅｇＲＮＡは、標的遺伝子の非標的鎖に相補的な塩基配列（ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＰＢＳ）および編集しようとする塩基配列を含む逆転写酵素の鋳型鎖部位（ＲＴ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を有する。

前記ガイドＲＮＡの標的配列とハイブリダイゼーション可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（すなわち、ＰＡＭ配列（５’－ＮＧＧ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはその相補的鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味し、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で使用（または、前記組成物に含まれる）されるか、またはそれをコードするＤＮＡを含むプラスミドの形態で使用（または、前記組成物に含まれる）され得る。

本発明において、前記ｄｓｇＲＮＡは、１０～２０ｎｔ（ヌクレオチド）長で構成され得、好ましくは１１～１９ｎｔ、１２～１８ｎｔ、１３～１７ｎｔ、１３～１６ｎｔ、最も好ましくは１４～１５ｎｔ長であり得るが、これらに限定されるものではない。

また、前記ｄｓｇＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ結合部位、好ましくは、ｐｅｇＲＮＡのスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）部位から５～７０ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは６～６５ｎｔ、最も好ましくは７～６２ｎｔ離れた位置に結合して前記融合タンパク質のクロマチンアクセシビリティを増加させ得る。

本発明で用いられる用語、「クロマチンアクセシビリティ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）」とは、主にヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＴＦ）、クロマチン修飾酵素（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）、およびクロマチンリモデリング複合体（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）で構成されたＤＮＡおよび関連タンパク質により形成された複合体であるクロマチンの物理的圧縮レベルを意味する。真核生物ゲノムは、一般的にヒストン８量体（ｏｃｔａｍｅｒ）を囲んでいる～１４７ｂｐのＤＮＡを含むヌクレオソームに圧縮されるが、ヌクレオソームの占有率は、ゲノムにおいて均一でなく、組織および細胞類型に応じて異なる。ヌクレオソームは、一般的に転写調節因子（例えば、転写因子）と相互作用するシス調節因子（エンハンサーおよびプロモーター）が存在するゲノム位置で枯渇して接近可能なクロマチンを生成することになる。遺伝子編集（遺伝子矯正）に関しては、クローズドゲノム領域よりもオープンゲノム領域を標的とするｇＲＮＡの活性に有意な差があり、Ｃａｓ９の効率が局所的クロマチンアクセシビリティにより影響を受けるため、クロマチンアクセシビリティとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介の遺伝子編集効率性との間に正の相関関係があることが公知となっている。

本発明の他の態様として、本発明は、前記遺伝子編集用組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）と接触させるステップを含む、遺伝子編集方法を提供する。

前記遺伝子編集用組成物は、好ましくは、真核細胞に適用され得、前記真核細胞は、好ましくは、ヒトなどの霊長類、マウスなどの齧歯類を含む哺乳動物に由来し得るが、これらに限定されるものではない。

本発明のまた他の態様として、本発明は、前記遺伝子編集用組成物を含む、遺伝子編集用キットを提供する。

本発明において、前記キットは、前記遺伝子編集用組成物とともに、バッファ（ｂｕｆｆｅｒ）およびデオキシリボヌクレオチド－５－トリホスフェート（ｄＮＴＰ）のような遺伝子編集を実施する際に必要な物質（試薬）を全て含み得る。また、前記キットの特定の反応で用いられる試薬の最適量は、本明細書における開示事項を習得した当業者により容易に決定され得る。

本発明のさらに他の態様として、前記遺伝子編集用組成物をヒトを除いた哺乳動物細胞に注入して遺伝子組換え哺乳動物細胞を得るステップと、前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞をヒトを除いた哺乳動物代理母の卵管に移植するステップと、を含む、ヒトを除いた遺伝子組換え哺乳動物の製造方法を提供する。

本発明の前記遺伝子編集組成物の導入により、哺乳動物細胞において４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％の遺伝子編集効率（例えば、塩基置換、挿入、または欠失）を達成することができる。

本発明において、前記哺乳動物細胞に遺伝子編集用組成物を導入するステップは、ｉ）前記細胞を本発明に係るプライム編集用融合タンパク質、ｐｅｇＲＮＡ、ｎｓｇＲＮＡ、およびｄｓｇＲＮＡをコード化するプラスミドベクターまたはウイルスベクターでトランスフェクションさせるか、
ｉｉ）前記細胞に融合タンパク質をコード化するｍＲＮＡ、ｐｅｇＲＮＡ、ｎｓｇＲＮＡ、およびｄｓｇＲＮＡの混合物またはこれらのそれぞれを直接注入するか、または
ｉｉｉ）前記細胞に融合タンパク質、ｐｅｇＲＮＡ、ｎｓｇＲＮＡ、およびｄｓｇＲＮＡの混合物または複合体形態のリボヌクレオタンパク質を直接注入して行われ得る。

前記直接注入は、前記ｉｉ）またはｉｉｉ）の各ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡまたはリボヌクレオタンパク質が組換えベクターを用いず、細胞膜および／または核膜を通過してゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）に伝達されることを意味し得、例えば、ナノ粒子、電気穿孔法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などにより行われ得る。

前記遺伝子編集組成物が導入される哺乳動物細胞は、ヒトなどの霊長類、マウスなどの齧歯類を含む哺乳動物の胚であり得、好ましくは、ヒトを除いた哺乳動物の胚であり得る。例えば、前記胚は、過剰排卵誘発された雌の哺乳動物と雄の哺乳動物を交配して得られた受精胚を前記雌の哺乳動物の卵管から採取し得る。前記塩基編集用組成物が適用（注入）される胚は、受精された１－細胞期の胚（ｚｙｇｏｔｅ）であり得る。

前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞は、前記遺伝子編集組成物の導入により、標的遺伝子に塩基置換、挿入、または欠失突然変異が発生した細胞であり得る。

前記遺伝子組換え哺乳動物細胞、好ましくは、卵管に遺伝子組換え胚細胞の移植を受ける哺乳動物は、前記胚細胞が由来する哺乳動物と同種の哺乳類（代理母）であり得る。

また、本発明は、前記方法により製造された、遺伝子組換え哺乳動物を提供する。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。ただし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

［実施例］
実施例１．実験方法
１－１．プラスミドＤＮＡの構築
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｅ２６２１Ｌ、ＮＥＢ）を用いて、ＨＮ１（Ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １）およびＨ１Ｇ（Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）オリゴをｐＣＭＶ－ＰＥ２（＃１３２７７５、Ａｄｄｇｅｎｅ）においてｎＣａｓ９の両面に融合させ、製造会社のプロトコルに従って、クロマチン調節ペプチドプライムエディター（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒ）を構築した。

また、Ｉｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｃａｓｐ１、およびＨｏｘｄ１３遺伝子に特定の突然変異を誘発させるためのｐｅｇＲＮＡ発現ベクターを作製するために、ｐＵ６－ｐｅｇＲＮＡ－ＧＧ－受容体ベクター（＃１３２７７７、Ａｄｄｇｅｎｅ）にスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）、プライム結合部位（ｐｒｉｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および逆転写酵素鋳型（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｌｉｇｏｓ）配列をＢｓａＩ酵素切断部位に挿入した。ｎｓｇＲＮＡおよびｄｓｇＲＮＡ発現ベクターは、ｐＲＧ２－ＧＧベクター（＃１０４１７４、Ａｄｄｇｅｎｅ）に挿入した。追加的に、本実施例で用いられた各標的遺伝子に特異的なｐｅｇＲＮＡｓ、ｎｓｇＲＮＡ、およびｄｓｇＲＮＡの配列を下記表１～３に整理して示した。

１－２．リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）および電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
ＡＡＶＳ１遺伝子座でｔｄＴｏｍａｔｏを発現するレポーターシステムが導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）、およびＣ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１７７２）は、１０％ ＦＢＳ（Ｓ ００１－０１、Ｗｅｌｇｅｎｅ）またはＢＣＳ（２６１７０－０４３、Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ＬＭ００１－０５、Ｗｅｌｇｅｎｅ）で５％ ＣＯ_２および３７℃の条件下で培養された。本実施例では、製造会社のプロトコルに従って、０．５μｇのｐｅｇＲＮＡ、２．１５μｇのＰＥ２、０．２２μｇのｎｓｇＲＮＡの３種類のプラスミドと、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（１１６６８０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれた５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（３１９８５０７０、Ｇｉｂｃｏ）を２×１０^４細胞に処理してトランスフェクションさせた後、細胞を１１日間培養した。

電気穿孔は、それぞれ１×１０^５個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＣ２Ｃ１２細胞に対して実施し、前記各細胞株を３μｇのＰＥ２またはＣＭＰ－ＰＥ、０．７μｇのｐｅｇＲＮＡ、０．３μｇのｎｓｇＲＮＡ、および０．２５μｇのｄｓｇＲＮＡのプラスミドと混合し、製造会社のプロトコルに従って、Ｎｅｏｎ^ＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＰＫ１０９６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションさせた。その後、細胞を７２時間培養後に回収し、標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。

１－３．ＤＮＡアンプリコンの製造
トランスフェクション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現レポーターＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｃ２Ｃ１２細胞、およびマウス胚からＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔｓ（６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。その後、Ｐｈｕｓｉｏｎ^ＴＭ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ重合酵素（Ｆ－５３０ＸＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＳｕｎｇｅｎ（ＳＧ－ＰＴ０２、Ｓｕｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて編集された標的配列を増幅させた。

１－４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（ＡＭ１３４５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＥ２およびＣＭＰ－ＰＥの転写体を製造し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ^ＴＭ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔ（ＡＭ１９０８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。製造会社のプロトコルに従って、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ｍ０２５１、ＮＥＢ）を用いてｐｅｇＲＮＡ、ｎｓｇＲＮＡ、およびｄｓｇＲＮＡの転写を誘導し、Ｅｘｐｉｎ^ＴＭ ＣｌｅａｎＵｐ ＳＶ（１１３－１５０、ＧｅｎｅＡｌｌ）を用いて転写されたＲＮＡｓを精製した。その後、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ ＵＶ－Ｖｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて前記精製されたＲＮＡｓを定量化した。

１－５．実験動物
本実施例のｉｎ ｖｉｖｏ実験は、ソウル大学校動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の承認を受けて行った。胚寄贈のためにＣ５７ＢＬ／６ＮおよびＩＣＲマウスを利用し、代理母は、特定の病原体がない実験室で飼育された。

１－６．マイクロインジェクション（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎの雌マウスにＨｙｐｅｒＯｖａ（ＫＹＤ－０１０－ＥＸ－ｘ５、ＣＡＲＤ）およびｈＣＧ（ＣＧ１０－１ｖｌ、Ｓｉｇｍａ）を４８時間間隔で注入して卵巣過剰刺激を誘発し、ｈＣＧホルモンの注入後、雌マウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｎの雄マウスと交配させた。受精された１細胞段階の胚を膨大部（ａｍｐｕｌｌａ）から得て、２つの前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ）が現れるまで、Ｍ２培地（Ｍ７１６７、Ｓｉｇｍａ）で培養した。マイクロインジェクションのためのプライム編集用混合物は、１００μＬのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）下で、１００ｎｇのＰＥ２またはＣＭＰ－ＰＥ ｍＲＮＡ、６５ｎｇ ｐｅｇＲＮＡ、３２．５ｎｇ ｎｓｇＲＮＡ、２２ｎｇ ｄｓｇＲＮＡの濃度で準備した。マイクロインジェクション後には、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への発達のために、胚をＫＳＯＭ培地（ＭＲ－１２１－Ｄ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）下で３７℃の培養器にて４日間培養した。その後、２細胞段階の胚の一部を偽妊娠代理母の卵管に移植した。

１－７．ジェノタイピング（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）および標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
各標的は、特異的プライマーを用いて、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲアンプリコンで構成されたライブラリーに対し、ｉＳｅｑ^ＴＭ １００シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）を用いて塩基配列分析を実施した。その後、ＣＲＩＳＰＲ ＲＥＧＮ Ｔｏｏｌｓプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／）とＥＵＮプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｅｕｎｙｏｏｎ．ｃｏｍ／）により配列分析データを分析した。

１－８．全ゲノムシーケンシング（Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）および変異検出（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ）
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）の耳からゲノムＤＮＡを分離した後、製造会社の指針に従って、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２超音波装置システムを用いてゲノムＤＮＡをせん断し、Ｔｒｕｓｅｑ Ｎａｎｏ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ＤＮＡライブラリーを製造した。ディープカバレッジ（３０ｘ）全ゲノムシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において１０１ ｂａｓｅ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンシングにより行われ、配列読み取りは、ＢＷＡ－ＭＥＭを用いて、マウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０に整列して行われた。単一ヌクレオチド変異と小さい挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）は、ＧＡＴＫ４ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを用いて検出し、マウスｖ１４２（ｄｂＳＮＰ１４２）に対してｄｂＳＮＰに存在する公知の変異は、ＡＮＮＯＶＡＲと注を付けた。ｄｂＳＮＰ１４２に存在しない新しい変異体は、さらに分析してオフ－ターゲット部位で位置を確認した。推定されるオフ－ターゲット部位は、最大７－ｂｐまたは２－ｂｐバルジ＋５ｂｐ不一致を考慮して、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒの候補と比較した。全ての変異は、読み取りプロットを視角化して手動で確認した。

１－９．ＤＮａｓｅ Ｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｓｓａｙおよびｑＰＣＲ
本発明者らは、従来の公知の方法に従ってＤＮａｓｅ Ｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｓｓａｙを実施した。具体的に、細胞を剥がし、冷たい１Ｘ ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、９００ｒｐｍで５分間２回スピンダウンした。次に、冷たいＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および３ｍＭ ＭｇＣｌ_２）＋０．１％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（Ｉ８８９６、Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を溶解させ、４ｄｅｇにおいて１０分間５００ｇでスピンダウンして核をペレット化した。次に、上層液を除去し、ＤＮａｓｅ Ｉ（２－１６Ｕ）を処理するかまたは処理しない条件で、核を３７℃で２０－３０分間培養した。その後、５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮａｓｅ Ｉにより分解されたＤＮＡを精製した。リアルタイムｑＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ）は、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＫＲ０３８９、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、完全なゲノムＤＮＡの分画は、比較Ｃ_Ｔ方法を用いて測定された。前記リアルタイムｑＰＣＲに用いられたプライマー配列を下記表４に羅列した。

１－１０．統計分析
データは、平均と標準偏差で示し、３回または５回の独立した繰り返し実験を行った。Ｐ値は、ｕｎｐａｉｒｅｄおよびｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－検定を用いて計算された。

実施例２．哺乳類ゲノムにおけるプライム編集システムの検証および編集効率の確認
本発明者らは、先ず、哺乳類ゲノムにおけるプライム編集システムの適用可能性を検証しようとし、このために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座でｔｄＴｏｍａｔｏを発現するレポーターシステムを用いた。具体的に、図１ａに絵で示すように、プライマー結合部位（ＰＢＳ）長が８ｎｔであり、逆転写酵素（ＲＴ）鋳型長が１７ｎｔ（ＰＢＳ８－ＲＴ１７）であるプライムエディター３（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒ ３、ＰＥ３）を用いて、前記ｔｄＴｏｍａｔｏ配列内にチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ、Ｔ）塩基を挿入することで停止コドンを生成させた。また、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、編集される鎖における編集を抑制するために非標的鎖上のＰＡＭ配列を除去するように設計された。その後、本発明者らは、前記ＰＥ３によるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の編集効率を確認するために、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりｔｄＴｏｍａｔｏ－陰性細胞をゲートして編集効率を評価した。

その結果、図１ｂに示すように、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する陽性対照群（ｔｄＴｏｍａｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＥＫ２９３Ｔ）と比較する際に、ＰＥ３を用いてｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子編集を誘導した場合（ｔｄＴｏｍａｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＥＫ２９３Ｔ＋ＰＥ３）、３２％の細胞がｔｄＴｏｍａｔｏ陰性であることを確認した。このような結果は、プライムエディターが、本発明のシステムにおいて所望する標的突然変異の生成を可能にすることを示唆する。

次に、プライムエディターを用いてマウスモデルを作製するために、８個の転移突然変異または１個以上のヌクレオチド挿入または欠失を含む標的を設計しようとした。先ず、図２ａに示すように、２種のマウス遺伝子、すなわち、Ｉｇｆ２（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２）およびＡｄａｍｔｓ２０（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ－１ ｍｏｔｉｆｓ ２０）において終止コドンの生成を誘導した。Ｉｇｆ２遺伝子は、父系から遺伝したＩｇｆ２対立遺伝子の突然変異により小人症表現型を誘導することができる。具体的に、本発明者らは、Ｉｇｆ２遺伝子のｅｘｏｎ４にＴＡ塩基を挿入することで終止コドンを生成させ、遺伝子の機能喪失を誘導した。また、編集される鎖の持続的編集を抑制するために、ＰＡＭ配列のヌクレオチドをＮＧＧからＮＣＧに置換させた。一方、Ａｄａｍｔｓ２０は、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）の発達に関与する遺伝子であり、Ａｄａｍｔｓ２０遺伝子座のＥ５８４部位における早期停止コドンの生成は、典型的な白色ベルト表現型と関連があると知られている。本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ２０遺伝子座のｅｘｏｎ１２においてＣＧをＴＴに置換を誘導し、早期終止コドン（Ｅ５８４＊）およびＰＡＭ配列の改変（ＮＧＧからＮＡＧに）を誘導した。また、上記のようなマウス遺伝子標的において前記突然変異を誘導するために、ＰＥ（操作されたＭ－ＭＬＶ ＲＴと融合したｎＣａｓ９）、ｐｅｇＲＮＡ、およびｎｉｃｋｉｎｇ ｓｇＲＮＡ（ｎｓｇＲＮＡ）で構成されたＰＥ３システムを使用した。この際、前記ｎｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ鎖、すなわち、非－編集鎖の切断によりＤＮＡ修復活性を促進することで編集効率性を向上させるための目的で用いられたものである。

次に、本発明者らは、Ｉｇｆ２およびＡｄａｍｔｓ２０標的部位でプライム編集を最適化するために、様々なＰＢＳ長（８－１４ｎｔ）およびＲＴ鋳型長（１０－１８ｎｔ）で構成されたｐｅｇＲＮＡによる編集効率性を評価した。この際、転写終結シグナルの一部となり得る３’－末端にチミンが存在するＰＢＳ長と、ｐｅｇＲＮＡ構造を妨害し得る５’－末端にシトシンが存在するＲＴ長は除いた。その後、電気穿孔法によりＰＥ、ｐｅｇＲＮＡ、およびｎｓｇＲＮＡをコード化する３種類のプラスミドをＮＩＨ／３Ｔ３細胞にトランスフェクションさせ、細胞を７２時間の培養後に回収して標的化ディープシーケンシングを実施した。

実験結果、図２ｂに示すように、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてＩｇｆ２およびＡｄａｍｔｓ２０標的に対するＰＥ３媒介の編集効率が３％未満であることを確認した。このような結果から、プライムエディターをマウスモデルの作製に利用するためには、編集効率の改善が必要であると判断した。

実施例３．ｄｓｇＲＮＡによるプライムエディターの編集効率の増進確認
本発明者らは、プライムエディターの編集効率性を改善させるための試みとして、ｐｒｏｘｙ－ＣＲＩＳＰＲアイディアに基づいて、触媒的に不活性であるエンドヌクレアーゼ（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）の代わりに標的部位のクロマチン構造を解くためのｄｓｇＲＮＡｓを用いた。ｄｓｇＲＮＡは、不活性化された触媒作用を示し、かつ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをガイドし、標的部位に結合する１４～１５ｎｔ長のガイドＲＮＡである。そこで、本発明者らは、プライムエディターが次のような２つの役割をすると仮定した。その１つは、標的部位でｐｅｇＲＮＡとともにプライム編集機能をすることであり、他の１つは、ｄｓｇＲＮＡと標的部位に隣接したクロマチンを調節することである。本発明者らは、ｐｅｇＲＮＡのスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）から７－６２ヌクレオチド位置範囲でＩｇｆ２およびＡｄａｍｔｓ２０標的部位に隣接したｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡｓを設計した。その後、編集効率を確認するために、Ｉｇｆ２およびＡｄａｍｔｓ２０部位で様々なｐｅｇＲＮＡ長にｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡを適用し、興味深くにもｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡを用いたＰＥ３の編集効率は、大半のグループにおいて向上したことが明らかになった。従って、本発明者らは、Ｉｇｆ２およびＡｄａｍｔｓ２０標的に対してそれぞれ最も高い効率を示したＰＢＳ９－ＲＴ１４ ｐｅｇＲＮＡおよびＰＢＳ１１－ＲＴ１３ ｐｅｇＲＮＡを選択して後続実験を行った。

次に、編集効率の高いｄｓｇＲＮＡを選別するために、Ｉｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｃａｓｐ１（４ｂｐ欠失）、Ｈｏｘｄ１３（ＧからＴに置換）、Ａｎｇｐｔ１（ＣＧＧからＴＧＡに置換）、およびＫｓｒ２（ＴＧＡＴの挿入）遺伝子に対する追加のｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡを設計してテストしようとした。このために、ＰＥ、ｐｅｇＲＮＡ、ｎｓｇＲＮＡ、およびそれぞれのｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡをコード化するプラスミドを電気穿孔法によりＮＩＨ／３Ｔ３およびＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクションさせ、その後、標的化ディープシーケンシングを実施した。

その結果、図３に示すように、ｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡが、ＰＥ３に比べて、大半の標的において編集効率性を選択的に改善させたことを確認した。このような結果から、ｄｓｇＲＮＡの適用による遺伝子編集効率は、ｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡの位置に応じて異なり、効果的な標的突然変異を誘導するためには、各標的および細胞類型別に最適のｄｓｇＲＮＡのためのスクリーニングプロセスが必要であることが分かった。

実施例４．ＣＭＰが結合したプライムエディターの編集効率の増進確認
本発明者らは、プライムエディターの編集効率性を改善させるための他の試みとして、クロマチン調節ペプチド（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＭＰ）である高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １、ＨＮ１）およびヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）を用いてプライムエディターを操作した。具体的に、プライムエディターのＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ、ｎＣａｓ９）と逆転写酵素が融合したタンパク質に前記ＨＮ１およびＨ１Ｇを追加して２種類のバージョンに製造した。図４ａに示すように、ｎＣａｓ９のＮ－末端側にＨＮ１およびＣ－末端側にＨ１Ｇを結合させた構成の融合タンパク質をＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１と称し、ｎＣａｓ９のＮ－末端側にＨＮ１、ｎＣａｓ９のＣ－末端側に操作されたＭ－ＭＬＶ ＲＴ、および前記ＲＴのＣ－末端にＨ１Ｇが結合するように操作した融合タンパク質をＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ２と称した。また、前記ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１およびＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ２のアミノ酸配列を図４ｂおよび図４ｃにそれぞれ示した。

本発明者らは、前記ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１（ｐｅｇＲＮＡ／ｎｓｇＲＮＡとＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１）またはＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ２（ｐｅｇＲＮＡ／ｎｓｇＲＮＡとＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ２）を２種類のマウス細胞株にそれぞれ伝達し、ＣＭＰを結合させていないＰＥ３を細胞に導入した場合と編集効率を比較した。その結果、図４ｂに示すように、大半の標的部位において、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１の場合、ＰＥ３に比べて遥かに高い編集効率を示すことを確認した。特に、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１による編集効率は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、Ｉｇｆ２の場合は２．５５倍、Ａｄａｍｔｓ２０の場合は３．９２倍さらに高かった。また、ヒト細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＨＥＫ３配列を標的として向上したプライムエディターとｄｅａｄ ｓｇＲＮＡを適用して編集効率を確認した。その結果を図４ｅに示した。ＰＥ３に比べて向上したプライム編集方法であるＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１またはＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ２において編集効率が向上することを確認することができた。また、ｄｅａｄ ｓｇＲＮＡを向上したプライムエディターに共に適用した際に、ＰＥ３や向上したエディターのみを処理したときよりも向上した効率を示すことを確認することができた（ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ２＋ｄｓｇＲＮＡ（－１１）。このような結果は、クロマチン調節ペプチドＨＮ１およびＨ１Ｇを用いて操作されたプライムエディターが編集効率性を有意に向上させることを示唆する。

実施例５．ｄｓｇＲＮＡおよびＣＭＰが適用されたプライムエディターの編集効率の上昇効果の確認
さらに、前記実施例３および４の結果に基づいて、本発明者らは、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１およびｄｓｇＲＮＡ（ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡ）をマウス細胞に共に伝達し、編集効率に対する相乗効果が現れるか否かを分析した。

その結果、図５に示すように、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１およびｄｓｇＲＮＡをマウス細胞に共に伝達した場合（ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡ）、ＰＥ３対照群に比べてＩｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、およびＨｏｘｄ１３標的部位でそれぞれ編集効率が最大４．２０倍、５．１１倍、および３．５６倍向上したことが明らかになり、このような相乗効果は、細胞株と標的に応じて異なるレベルを示した。また、上記の結果から、ＣＭＰ－ＰＥ３のみを細胞に導入させた場合（ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１）には、実験した全ての標的および２種類の細胞類型においてプライムエディターの効率が有意に向上したのに対し、ｄｓｇＲＮＡのみを細胞に導入した場合（ＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡ）、またはＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１およびｄｓｇＲＮＡを共に導入した場合（ＣＭＰ－ＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡ）には、編集効率が標的部位および細胞類型に応じて異なり得ることが分かった。

さらに、本発明者らは、進歩したプライムエディターシステムをマイクロインジェクションによりマウス胚に注入して標的化突然変異の生成を誘導し、その効率を分析しようとした。具体的に、設計されたマウス標的のうち、所望しない突然変異が相対的に低いＩｇｆ２標的部位を選択した。その結果、図６ａに示すように、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１が注入された胚およびＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡが注入された胚においてＩｇｆ２標的に対して相当高いレベルの編集効率を示した。特にＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡの場合、Ｉｇｆ２遺伝子の標的部位で所望の突然変異が２２個の胚中の２１個（９５％）に観察され、ＣＭＰ－ＰＥ３－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡがＰＥ３およびＰＥ３＋ｄｓｇＲＮＡに比べて非常に高い編集効率を示すことを確認した。

これに加え、マウス胚においてＡｄａｍｔｓ２０、Ｈｏｘｄ１３、Ａｎｇｐｔ１、Ｋｓｒ２、およびＡｒ遺伝子における編集効率性を検証するために、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１およびｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡを用いてテストを行った。標的化ディープシーケンシングを行った結果、図６ｂに示すように、ＰＥ３を注入した場合に比べて、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１およびｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡを注入した胚において、Ｋｓｒ２およびＡｒ標的を除き、Ａｄａｍｔｓ２０、Ｈｏｘｄ１３、およびＡｎｇｐｔ１標的において編集効率が改善されたことを確認した。総合的に、このような結果は、マウス胚において、ｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｓｇＲＮＡおよびクロマチン調節ペプチドを用いて編集効率が増進されたプライム編集が可能であることを示唆する。

実施例６．ｄｓｇＲＮＡおよびＣＭＰによる標的部位クロマチンアクセシビリティの向上確認
本発明者らは、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１とｄｓｇＲＮＡが標的部位のクロマチン構造を解いてクロマチンアクセシビリティを向上させるか否かを確認するために、ＤＮａｓｅＩ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ分析およびｑＰＣＲを行って各標的部位のクロマチン状態を確認した。この際、陰性対照群（クローズドクロマチン）としてＣｈｒ３：７１，０２６，６２８－７１，０２６，６８５（マウスゲノムｂｕｉｌｄ ｍｍ９）に位置した遺伝子を用い、陽性対照群（オープンクロマチン）としてＣｏｌ６ａ１遺伝子を用いた。実験結果、図７ａおよび図７ｂに示すように、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株において、Ｉｇｆ２、Ａｄａｍｔｓ２０、およびＨｏｘｄ１３は、相対的に閉じられた状態のクロマチン（ｃｌｏｓｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）として現れ、Ｃ２Ｃ１２では、Ｉｇｆ２を除いた全ての標的が開かれた状態のクロマチンであると分析された。このような結果は、２つの細胞株において標的配列が同一であるとしてもクロマチン構造の状態が異なることを示唆する。

さらに、クローズドクロマチン構造を有するものと確認された代表的な遺伝子であるＩｇｆ２の標的部位において、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１またはｄｓｇＲＮＡがクロマチン状態を変化させるか否かを分析した。その結果、図７ｃに示すように、ＰＥ３と比較する際に、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１、ｄｓｇＲＮＡ、またはＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１＋ｄｓｇＲＮＡにより閉じられた状態のクロマチン構造が開かれた状態に徐々に変化することを確認した。このような結果は、ＣＭＰ－ＰＥ－Ｖ１またはｄｓｇＲＮＡを用いると、閉じられた状態のクロマチン構造を解き、クロマチンアクセシビリティを改善してプライム編集の効率性の向上が可能であることを立証する直接的な証拠である。

実施例７．標的突然変異が誘発されたマウスモデルの作製およびオフ－ターゲット効果の分析
次に、本発明者らは、所望しない突然変異の発生頻度が相対的に低いＰＢＳ９－ＲＴ１４およびｄｓｇＲＮＡ＋７を用いて、マイクロインジェクションにより、マウス胚において、図８ａに示すようなＩｇｆ２の標的突然変異の生成を誘導し、前記マウス胚を代理母に移植した。その後、前記代理母から生まれた子を観察および分析した結果、図８ｂに示すように、最大４７％の編集頻度（１０匹中の２匹）で、Ｉｇｆ２遺伝子座でＧからＣへの置換およびＴＡの挿入が起こったことを確認した。また、上記のようなＩｇｆ２突然変異が次世代に伝達されるか否かを分析した結果、図８ｃに示すように、Ｉｇｆ２突然変異マウスから生まれた９匹のＦ１同腹子中の７匹が同一の突然変異を有することから、標的突然変異の生殖細胞を介した次世代への伝達が可能であることが分かった。

本発明者らは、プライムエディターのオフ－ターゲット効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）を評価するために、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒを用いて、マウスゲノムにおいてそれぞれ最大３個のヌクレオチド不一致があるＩｇｆ２ターゲットのｐｅｇＲＮＡおよびｎｓｇＲＮＡによる潜在的なオフターゲット部位を確認した。その結果、図９ａに示すように、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較した際に、潜在的なオフ－ターゲット突然変異が検出されなかった。また、作製されたＩｇｆ２突然変異マウスにおいてオフ－ターゲット効果を確認するために、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施した。その結果、図９ｂおよび図９ｃに示すように、ｎｓｇＲＮＡの単一オフ－ターゲット部位が発見されたが、ゲノムＤＮＡを用いたサンガーシーケンシングにより前記部位が偽陽性であることを確認した。

最後に、Ｉｇｆ２突然変異マウスの表現型を確認するために、Ｉｇｆ２^{ｐ＋／ｍ－}雄（Ｆ１）を野生型雌マウスと交配させた。その結果、図１０ａおよび図１０ｂに示すように、父系対立遺伝子から遺伝したＩｇｆ２遺伝子の突然変異を保有したＩｇｆ２^{ｐ－／ｍ＋}マウスは、所望の突然変異遺伝子型と一致する小人症表現型を示した。このような結果は、改善された本発明に係るプライム編集システムがマウスモデルの作製に効果的に適用可能であることを示唆する。

上述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。従って、上述した実施例は、全ての面で例示的なものであって、限定的なものではないことを理解しなければならない。

Claims (11)

1. （ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体、
   ｉｉ）逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、
   および
   ｉｉｉ）クロマチン調節ペプチド（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む、融合タンパク質またはそれをコード化する核酸と、
   （ｂ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化する核酸と、を含み、
   前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質変異体は、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインのいずれか１つが不活性化されるニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）であり、
   前記ガイドＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびｄｓｇＲＮＡ（ｄｅａｄ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を含み、
   前記クロマチン調節ペプチドは、高－移動性グループヌクレオソーム結合ドメイン１（ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ １、ＨＮ１）、および ヒストンＨ１中央球状ドメイン（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｃｅｎｔｒａｌ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、Ｈ１Ｇ）であり、
   前記融合タンパク質は、
   Ｎ末端－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９］－［Ｈ１Ｇ］－［逆転写酵素］－Ｃ末端、または
   Ｎ末端－［ＨＮ１］－［Ｃａｓ９］－［逆転写酵素］－［Ｈ１Ｇ］－Ｃ末端の構成になり、
   前記ｄｓｇＲＮＡは、ｐｅｇＲＮＡ結合部位から５～７０ｎｔ離れた位置に結合して前記融合タンパク質のクロマチンアクセシビリティを向上させることを特徴とする、
   哺乳動物細胞の遺伝子編集用組成物。
2. 前記融合タンパク質は、Ｎ－末端およびＣ－末端にそれぞれ核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用組成物。
3. 前記逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）またはその変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、Ｍ－ＭＬＶ）に由来することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用組成物。
4. 前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用組成物。
5. 前記ｄｓｇＲＮＡは、１０～２０ヌクレオチド（ｎｔ）長で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用組成物。
6. 前記遺伝子編集用組成物は、非標的ＤＮＡ鎖に相補的に結合して標的ＤＮＡ鎖の切断を誘導するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用組成物。
7. 前記組成物は、遺伝子編集効率および標的特異性が増進されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子編集用組成物。
8. 請求項１に記載の遺伝子編集用組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）と接触させるステップを含む、遺伝子編集方法。
9. 請求項１に記載の遺伝子編集用組成物を含む、遺伝子編集用キット。
10. 請求項１に記載の遺伝子編集用組成物をヒトを除いた哺乳動物細胞に導入して遺伝子組換え哺乳動物細胞を得るステップと、
    前記得られた遺伝子組換え哺乳動物細胞をヒトを除いた哺乳動物代理母の卵管に移植するステップと、を含む、ヒトを除いた遺伝子組換え哺乳動物の製造方法。
11. 前記哺乳動物細胞は、哺乳動物の胚細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。