KR102679001B1

KR102679001B1 - 신규의 개량된 염기 편집 또는 교정용 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102679001B1
Application number: KR1020210107163A
Authority: KR
Inventors: 김경미; 윤다은
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2021-08-13
Publication date: 2024-06-28
Anticipated expiration: 2041-08-13
Also published as: EP4230737A4; EP4230737A1; KR20220039564A

Abstract

본 발명은 기존의 개발된 염기 편집기를 기초로 염색질 조절 펩타이드(CMP) 등의 구성 추가와 그 배열을 달리하여 개발된 융합단백질에 관한 것으로서, 본 발명의 상기 융합 단백질은 CMP를 포함하여 염기 편집 효율이 향상되고, deadCas9을 사용하여 원치 않는 무작위 염기 삽입 및 결실 발생이 제거된 신규 염기 편집기로 제공될 수 있는바, 정교한 유전자 치료제, 형질전환 동물모델의 제작 및 연구 등 유전공학 기술분야에서 다양한 용도로 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

신규의 개량된 염기 편집 또는 교정용 융합단백질 및 이의 용도{Compositions and methods for use of engineered base editing fusion protein}

본 발명은 기존의 개발된 염기 편집기를 기초로 염색질 조절 펩타이드(CMP) 등의 구성 추가와 그 배열을 달리하여 개발된 융합단백질에 관한 것으로서, 본 발명의 상기 융합 단백질은 CMP를 포함하여 염기 편집 효율이 향상되고, deadCas9을 사용하여 원치 않는 무작위 염기 삽입 및 결실 발생이 제거된 신규 염기 편집기로 제공될 수 있다.

75,000개 이상의 병원성 돌연변이가 인간의 유전 질환을 유발하며 상기 병원성돌연변이에 의한 유전질환 중 약 50%가 점 돌연변이에 의해 유도된다. CRISPR 시스템의 개발로 기증자 DNA를 이용한 상동직접수선 (homology-directed repair, HDR) 방법이 치료적 접근 방법으로 제안되었으나 그 효율성이 매우 낮아 적용에 한계가 있다. HDR 방법의 한계를 극복하기 위하여 염기 수준에서 조절할 수 있은 염기 편집기(Base editor: BE)가 개발되었으며, 최근에는 새로운 정밀 게놈 편집 도구인 nCas9 및 역전사효소로 구성된 프라임 편집기(Prime editor: PE)가 유전자 교정기로서 개발되었다. 프라임 편집기는 Cas9 시스템의 낮은 HDR 효율성을 극복하고 C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, 및 T→G로 치환이 가능한 장점이 있으나, 아직 다양한 유기체에서 그 작동 가능성이 검증되지 아니하였다. 이에 유전자 교정을 위하여 프라임 편집기와 함께 염기 편집기의 이용이 불가피 하다.

CRISPR 시스템 기반으로 개발된 염기 편집기는 사이토신 염기 편집기(cytosine base editor, CBE)와 아데닌 염기 편집기 (adenine base editor, ABE)가 있으며, CBE 및 ABE는 다양한 유기체에서 효율적으로 C→T, T→C, A→G, 및 G→A의 치환이 가능하다. 또한 최근 연구를 통해 인간 세포에서 C에서 G로 염기 교정이 가능한 C-to-G 염기 편집기 (C-to-G base editors)로써 CGBE1이 보고되었다. 그러나 하나 이상 염기의 삽입, 치환 또는 결실과 같은 정확한 표적 돌연변이의 생성은 세포 내 HDR에 의하여 효율성이 낮은 문제가 있다. 이를 개선하기 위하여 다양한 염기 편집기 변이체가 개발되고 있으며, 그 중에서 AncBE4max 및 ABEmax는 BE3 및 ABE보다 대부분의 표적에 대해 더 높은 염기 치환능을 나타내지만, AncBE4max의 편집 효율은 69~77%에 불과하며 ABEmax의 편집 효율은 27~52%에 불과하여 아직 그 효율 향상의 과제가 남아있다.

한편, 다양한 PAM과 호환성을 향상시키기 위하여 xBE3 및 xABE이 개발되었으나, NGG PAM 시퀀스에도 불구하고 대부분의 표적에서 낮은 편집 효율을 나타내어 현재까지 임상 및 생물학적 연구를 위한 최적의 염기편집기로는 AncBE4max 및 ABEmax이 제안된다. 그러나, 상술한 바와 같이 AncBE4max 및 ABEmax의 편집 효율 상승의 문제와 원치 않는 추가적인 염기 서열의 삽입 및 결실과 오프타겟 문제가 남아 있으며, 본 발명자들은 편집 효율이 향상되고 오프타겟 문제와 원치않은 염기의 삽입 및 결실 문제가 제거된 염기 편집기를 개발하기 위하여 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.

Int J Mol Sci. 2020 Aug 28;21(17):6240.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 종래 개발된 염기 편집기(base editor)에 염색질 조절 펩타이드 (chromatin modulating peptides: CMPs)를 추가로 포함하여 염기 편집 효율이 개선된 신규 염기 편집기를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 CMP 추가와 함께 nickaseCas9 대신 deadCas9을 이용하여 무작위 염기 삽입 및 결실 발생 빈도가 현격하게 감소된 신규 염기 편집기 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 염기 편집기 기반의 유전자 교정용 조성물, 유전자 교정용 바이러스 벡터, 및 이를 이용한 유전자 교정방법과 이를 이용하여 형질전환된 세포주 및 유전자 변형 포유동물을 제조하는 방법 등의 제공을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템에 제공되어 염기 편집 효율을 향상시킬 수 있는 융합단백질을 염기 편집기(base editor)로서 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 융합단백질은 Cas9 단백질과 함께 하나 이상의 염색질 조절 펩타이드(Chromatin-modulating peptides: CMP)를 포함할 수 있으며, 상기 CMP는 염기 편집기의 염색질로의 접근성을 향상시켜 염기 편집 효율을 높일 수 있으며, CMP는 고-이동성 그룹 뉴클레오솜 결합 도메인 1 (high-mobility group nucleosome binding domain 1: HN1), 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (histone H1 central globular domain: H1G), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 융합단백질은 사이토신 디아미네이즈(cytidine deaminase)을 포함하여 사이토신 염기 편집기(CBE)로 제공되거나, tRNA 아데노신 디아미네이즈(tRNA adenosine deaminase: TadA)을 포함하여 아데닌 염기 편집기(ABE)로 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 융합단백질이 사이토신 디아미네이즈를 포함하여 CBE로 제공되는 경우 상기 사이토신 디아미네이즈는 APOBEC(apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like)일 수 있으며, 상기 Cas9 단백질은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인이 불활성화된 dead Cas9 (dCas9)인 것이 바람직하다. dCas9은 종래 CBE가 유도하는 원치 않는 염기의 삽입(insertion) 및/또는 결실(deletion), 즉 무작위 인델(indel)의 발생 빈도를 현저하게 감소시켜 정확한 염기 편집기로 기능할 수 있다. 한편, dCas9 이용에 따른 염기 편집 효율 감소는 본 발명에서 제안되는 CMP의 부가로 회복될 수 있다.

한편, CBE로 제공되는 상기 융합단백질은 dCas9의 사용으로 무작위 인델 발생을 현저하게 감소시킬 수 있으나, 여전히 발생하는 무작위 인델은 디아미네이즈(deaminase)와 결합된 dCas9을 통해 완전히 제거할 수 있다.

이에, 상기 CBE로 제공되는 상기 융합단백질은 UGI(uracil DNA-glycosylase inhibitor) 펩타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 UGI 펩타이드는 dCas9의 C-말단에 직접적으로 연결될 수 있고, dCas9에 연결되는 UGI 펩타이드는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명자들이 설계하여 실험적으로 확인한 융합단백질은 2개 UGI 펩타이드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 융합단백질은 핵 위치화 신호(nuclear localization signals: NLS) 펩타이드를 추가로 포함할 수 있으며, NLS 펩타이드는 융합단백질의 N-말단 및 C-말단에 위치하지만, C-말단의 NLS 펩타이드는 결합되는 CMP의 위치가 가변적일 수 있다.

보다 구체적으로 상기 융합단백질은 N-말단에서 C-말단의 순서로 [NLS 펩타이드]-[APOBEC]-[dCas9 단백질]-[NLS 펩타이드]가 위치하며, UGI 펩타이드는 dCas9 C-말단과 직접적으로 연결될 수 있으며, NH1은 APOBEC의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, HIG는 UGI 펩타이드의 C-말단 또는 융합단백질의 C-말단에 위치할 수 있다(도 1에 AncdBE4max 변이체, peptide 1a-b 및 2a-b 참조).

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 융합단백질이 TadA를 포함하여 ABE로 제공되는 경우, 상기 Cas9 단백질은 RuvC 도메인 및/또는 HNH 도메인이 불활성화된 Cas9 단백질, 즉 dCas9 또는 nickase Cas9 (nCas9)일 수 있다.

현재까지 개발된 가장 최적화된 ABE인 ABEmax는 무작위 인델의 발생 빈도가 높지 아니한바, 본 발명의 ABE 변이체는 nCas9을 그대로 포함하고 CMP를 추가로 포함하여 표적 염기 편집 효율이 증진된 염기 편집기로 제공될 수 있다.

ABE로 제공되는 본 발명의 융합단백질의 구조는 N-말단에서 C-말단의 순서로 [NLS 펩타이드]-[TadA]-[nCas9 또는 dCas9 단백질]-[NLS 펩타이드]이며, HN1은 TadA의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있고, H1G는 융합단백질의 C-말단 또는 Cas9 단백질의 C-말단에 위치할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 CRISPR/Cas9 시스템에 이용될 수 있도록, 상기 융합단백질, 상기 융합단백질을 암호화하는 plasmid DNA 또는 mRNA, 또는 상기 plasmid DNA 또는 mRNA를 포함하는 벡터; 및

비표적 DNA 가닥과 혼성화하여 표적 DNA 가닥의 절단을 유도하는 sgRNA(single guide RNA), 상기 sgRNA를 발현할 수 있는 플라스미드, 또는 상기 플라스미드를 포함하는 벡터;를 포함하는 유전자 교정용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노연관바이러스(AAV), 렌티바이러스(lentivirus), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 교정용 조성물을 in vitro 또는 ex vivo 상에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 영역 (region)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 교정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 융합단백질을 암호화하는 mRNA 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 교정용 조성물 또는 렌티바이러스 벡터를 포유동물 세포에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환 세포주 제조방법과 그 방법으로 제조된 형질전환 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 교정용 조성물 또는 렌티바이러스 벡터를 포유동물 세포에 도입하여 유전자 변형 포유동물 세포를 얻는 단계; 및 상기 얻어진 유전자 변형 포유동물 세포를 포유동물 위탁모 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 유전자 변형 포유동물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 포유동물 세포는 포유동물의 배아 세포일 수 있다.

본 발명은 염색질-조절 펩타이드 (chromatin-modulating peptides, CMPs)를 사용하여 염기 편집 효율을 증진시킬 수 있고, nickase Cas9 대신 dead Cas9을 이용하는 경우 무작위 인델을 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하고, 현저히 증진된 게놈 편집 효율 및 표적 특이성이 담보된 염기 편집기를 제공한다. 또한, 본 발명은 표적 유전자의 돌연변이 동물모델을 제작하여 다음 세대로의 돌연변이 전달 및 표현형 변화 등을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 개선된 프라임 편집기를 포함하는 유전자 교정용 조성물은 인간화 동물모델의 제작 및 연구, 유전공학 기술 분야 및 유전질환의 치료 수단 등의 다양한 용도로 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

도 1a는 CBE 변이체의 구조이고, 도 1b는 ABE 변이체의 구조이다.
도 2는 종래 염기 편집기의 활성을 확인한 것으로서, 인간 유전자를 표적으로 하는 CBE 변이체(a 및 b)와 ABE 변이체(c 및 d)의 염기 편집 효율과 무작위 인델 발생 빈도를 비교확인한 것이다. 각 데이터는 3회 반복실험 하여 평균값을 나타내었다. 또한, e는 CBE 변이체에 의해 발생하는 인델 패턴이고, g는 ABE 변이체에 의해 발생하는 인델 패턴이다. 빨간 화살표와 점선은 spCas9의 절단부위를 나타낸다.
도 3은 활성 windows에서 C 또는 A 타겟의 염기 편집 효율을 확인한 것으로서, a는 HEK293 세포에서 CBE 변이체에 대한 인간 표적 HBB, RNF2, HEK3 및 Site18의 각 editing window에 대한 편집 효율을 나타낸 것이며, b는 HEK293 세포에서 ABE 변이체에 대한 인간 표적 Site18, Site19, HBB-E2 및 HEK2의 각 editing window에 대한 편집 효율을 나타낸 것이다. 각 데이터는 3회 반복실험의 평균 ± S.D로 표시하였으며, Pam 영역은 파란색으로 표시하였고, 타겟 서열은 밑줄로 표시하였으며 치환된 타겟의 영역은 빨간색으로 표시하였다.
도 4a 내지 4d는 CBE 표적 서열의 각 위치에서 염기 치환 효율을 확인한 것이다. CBE 변이체는 PAM 서열 13-18nt 상류에서 C→T로 치환을 유도하고, C에서 T로 변환은 파란색으로 강조 표시하였다. 노란색 박스는 당초 의도한 타겟 서열이고, 분홍색 박스는 비표적 염기의 전환(C→A 또는 C→G)을 나타낸다. 각 데이터는 3회 반복실험의 평균값으로 표시하였다.
도 5a 내지 도 5d는 ABE 표적 서열의 각 위치에서 염기 치환 효율을 확인한 것이다. ABE 변이체는 PAM 서열 13-18nt 상류에서 A→G로 치환을 유도하고, A에서 G로 변환은 붉은색으로 강조 표시하였다. 노란색 박스는 당초 의도한 타겟 서열이고, 각 데이터는 3회 반복실험의 평균값으로 표시하였다.
도 6은 sgRNA 길이에 따른 표적 위치에서 editing window의 특이성과 편집 효율 변화를 확인한 것이다. a 및 b는 sgRNA의 길이에 따른 CBE 변이체의 표적 염기의 전환 효율을 확인한 것이고, c는 RNF2에서 sgRNA 길이에 따른 CBE 변이체의 표적 염기 전환 효율을 나타낸 것이며, d 및 e는 sgRNA의 길이에 따른 ABE 변이체의 표적 염기의 전환 효율을 확인한 것이고, c는 HEK2에서 sgRNA 길이에 따른 ABE 변이체의 표적 염기 전환 효율을 나타낸 것이다. 각 염기 치환 빈도는 표적 심층 시퀀싱으로 분석하였으며, 모든 데이터는 3회 반복실험의 평균 ± SD로 표시하였다.
도 7은 nCas9을 이용한 염기 편집기가 Cas9을 이용한 염기 편집기보다 무작위 인델 발생 빈도를 감소시키고, dCas9을 이용한 염기 편집기는 nCas9을 이용한 염기 편집기 보다 현저하게 인델 발생 빈도를 감소시킴을 확인한 것이다. 각 데이터는 3회 반복실험의 평균 ± SD로 표시하였다.
도 8은 UGI의 추가로 CBE 변이체에서 발생하는 무작위 인델을 제거함을 확인한 것으로서, 도 8a는 타겟 유전자의 표적 위치에서 CBE 변이체의 염기 치환 효율을 나타낸 것이고, 도 8b는 UGI 추가 처리 농도에 따른 CBE 변이체의 타겟 유전자(HEK3 및 Site18)에서 표적 염기의 치환 효율과 무작위 인델 발생 빈도를 나타낸 것이다. 무작위 인델과 염기 전환 빈도는 표적 심층 시퀀싱을 수행하여 확인하였고, 각 데이터는 3회 반복실험의 평균 ± SD로 표시하였다.
도 9는 CMP를 포함하는 염기 편집기에서 원치 않는 무작위 인델이 제거됨을 확인한 것으로, a는 CBE 변이체의 염기 치환 효율을 나타낸 것이고, b는 무작위 인델 발생 빈도를 나타낸 것이다. C는 ABE 변이체의 염기 치환 효율을 나타낸 것이고, d는 무작위 인델 발생 빈도를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스의 근육세포와 생체 내에서 Dmd knock-out 유도 실험 결과로서, 도 10a의 (A)는 Dmd 유전자에서 exon20의 서열과 돌연변이 서열을 나타낸 것이며, (B)는 CMP를 포함하는 CBE 변이체의 염기 치환 효율과 무작위 인델 발생 빈도를 나타낸 것이며, 도 10b는 상기 CBE 변이체, BE3, 및 AncBE4max에 의한 C에서 T로 전환 페턴을 표시한 것이다. 각 데이터는 3회 반복실험의 평균 ± SD로 표시하였다.

염기 편집은 다양한 연구 분야에서 널리 사용되는 CRISPR(Clustered regular interspaced short palindromic repeats) 시스템을 기반으로 하는 게놈 편집 방법이다. 염기 편집을 통해 게놈에 단일 염기의 치환을 유도할 수 있다. BE3은 CBE 중 하나로서 nCas9, rAPOBEC1(cytidine deaminase), 및 UGI(uracil DNA-glycosylase inhibitor)를 포함하는 융합 단백질로 구성된다. 또한, ABE인 ABE7.10은 엔지니어링된 동종이량체 아데닌 디아미나제인 TadA와 nCas9으로 구성되어 gRNA 의존 방식으로 A를 G로 치환한다. 양 염기 편집기 활성화된 editing window를 가지며, 상기 editing window는 PAM(protospacer adjacent motif)의 13-17 nt upstream의 영역을 포함한다.

이론적으로, 병원성 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 중에서 약 14%는 CBE를 통해서 교정할 수 있으며, 약 47%는 ABE를 통해서 교정할 수 있다. 그러나, 현재까지 연구에 따르면 염기편집기는 표유동물 세포(마우스 배아)에서 29% 비율로 무작위 인델을 유발한다. 따라서, DNA 표적 부위에서 염기 편집기에 의한 무작위 인델 발생 제거는 임상에 염기 편집기를 적용하기 위해 필수적으로 해결해야 하는 과제로 남아있다.

상술한 바와 같이, 염기 편집기는 게놈에서 정확하고 효율적인 단일 염기 치환이 가능하지만 표적 부위에서 원치 않는 삽입 및 결실이 발생하며 이러 무작위 인델(indel)은 염기 편집기의 임상 적용에 제한이 된다. 본 발명자들은 표적 부위에서 발생하는 무작위 인델을 제거하기 위하여 다양한 CBE 및 ABE 변이체를 제작하고, 단계적으로 무작위 인델 제거와 염기 편집 효율을 향상을 위한 염기 편집기의 구성 요소와 그 배열을 연구하여 본 발명을 완성하였다.

먼저, nCas9은 Cas9과 비교하여 무작위 인델의 발생 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있으나 여전히 무작위 인델을 발생시키고, nCas9 이용에 따라 발생하는 무작위 인델은 dCas9을 이용함으로서 제거할 수 있음을 확인하였다. 그러나, dCas9을 이용한 염기 편집기는 염기 치환 효율이 매우 낮은 문제가 있다. 이를 해결하기 위하여 염기 편집기의 게놈 DNA에 대한 접근성을 향상시키고자 하였다.

게놈 DNA에 대한 염기 편집기의 접근성 향상을 위하여 염색질 조절 펩타이드(CMP) 도메인을 추가한 염기 편집기 변이체를 제작하고 염기 치환 효율과 무작위 인델 발생 빈도를 측정한 결과, CMP 도메인의 추가는 표적 유전자에 따라 상이하지만 염기 치환 효율을 향상시켰으며 무작위 인델 발생 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

한편, ABE에서 nCas9는 CBE 염기 편집기에서 nCas9과 비교하여 무작위 인델을 거의 발생시키지 아니하였으며, 이에 ABEmax에 CMP를 추가로 포함하는 ABE 변이체를 제작하여 염기 편집 효율과 무작위 인델 발생 빈도를 확인한 결과 현저하게 향상된 염기 편집 효율을 나타내었으며 무작위 인델이 완전히 제거됨을 확인하였다. 상기로 결과로부터 염기 편집기에 CMP의 추가는 표적 DNA로의 접근성 증가로 염기 편집 효율 향상과 동시에 무작위 인델 발생 빈도를 낮추는 것에 효과적임을 알 수 있다.

이에, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템 기반의 염기 편집기로서 Cas9 단백질과 CMP를 포함하는 융합단백질을 향상된 염기 편집기로서 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 CMP를 포함하는 융합단백질과 교정하고자 하는 유전자 특이적인 sgRNA(또는 이를 발현하는 벡터)를 포함하는 유전자 교정용 조성물을 제공한다.

상기 sgRNA는 비표적 DNA 가닥에 상보적으로 결합하여 표적 DNA 가닥의 절단을 유도하는 10~30 nt 길이의 단일 가이드 RNA이며, 바람직하게는 19~30nt 길이를 가질 수 있다.

본 발명에서 “유전자 교정 (gene editing)”은 유전자 편집, 게놈 편집 등과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 유전자 교정은 표적 유전자 내의 표적 부위에 하나 이상의 염기에 대하여 돌연변이를 유발하는 변이 (치환, 삽입 또는 결실)를 의미하는 것이다. 바람직하게 상기 유전자 교정은 표적 유전자의 이중가닥 절단 (double-stranded DNA cleavage)을 수반하지 않는 것일 수 있으며, 구체적으로는 염기 편집(base editing)을 매개로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 염기에 대하여 돌연변이를 유발하는 변이 또는 유전자 교정은 표적 부위에 종결코돈을 생성시키거나, 야생형과 다른 아미노산을 코딩하는 코돈을 생성시킴으로써 표적 유전자를 불활성화 (knock-out) 시킨다. 또는 개시 코돈을 다른 아미노산으로 바꾸어서 유전자를 불활성화 시키거나 또는 유전자 변이를 교정하거나, 삽입 또는 결실에 의한 프레임쉬프트로(frameshift)로 유전자를 불활성화 시키거나 또는 유전자 변이를 교정하거나, 단백질을 생성하지 않는 비코딩 DNA 서열에 변이를 도입하거나, 질병을 유발하는 야생형과 다른 서열의 DNA를 야생형과 동일한 서열로 변화시키는 등의 다양한 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “염기서열”은 해당 염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 서열을 의미하는 것으로, 뉴클레오타이드 서열, 핵산 서열 또는 DNA 서열과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 '표적 유전자 (target gene)'는 유전자 교정의 대상이 되는 유전자를 의미하고, '표적 부위 (target site 또는 target region)'는 표적 유전자 내의 표적 특이적 뉴클레아제에 의한 유전자 편집 또는 교정이 일어나는 부위를 의미하는 것으로, 일 예에서 상기 표적 특이적 뉴클레아제가 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNAguided engineered nuclease, RGEN)를 포함하는 것인 경우, 표적 유전자 내의 RNA-가이드 뉴클레아제가 인식하는 서열 (PAM 서열)의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 염색질 조절 펩타이드(CMP)는 뉴클레오솜 재배열 및/또는 염색질 재형성을 용이하게 하기 위하여 뉴클레오솜 및/또는 염색체 단백질들과 상호작용하는 염색체 단백질 또는 이의 단편들을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 염색질 조절 펩타이드는 고-이동성 그룹 뉴클레오솜 결합 도메인 1 (high-mobility group nucleosome binding domain 1, HN1) 또는 이의 단편, 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (histone H1 central globular domain, H1G) 또는 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 고-이동성 그룹 뉴클레오솜 결합 도메인 (HMGN)은 염색질의 구조 및 기능을 조절하는 염색체 단백질이고, 상기 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (histone H1 central globular domain, H1G)은 '링커 히스톤'이라고도 알려진 히스톤 H1을 구성하는 도메인이다. 히스톤 H1은 뉴클레오좀 어레이의 압축 상태를 조절하고 형태에 영향을 주며, 상기 중심 구형 도메인은 뉴클레오솜 상의 링커 DNA의 entry/exit 부위 근처에 결합한다고 알려져 있다.

상기 염색질 조절 펩타이드는 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합으로 상기 CRISPR/Cas9 단백질 또는 역전사효소에 연결될 수 있다. 구체적으로, 최소한 하나의 염색질 조절 펩타이드는 융합단백질의 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 위치에 연결될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 융합단백질은 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 N-말단 및 C-말단에 각각 핵 위치화 신호 (nuclear localization signal, NLS) 서열을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 'Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질'은 DNA 바이러스에 대한 특정 박테리아의 면역학적 방어에서 중요한 역할을 하는 단백질로 유전공학 응용에 많이 사용되는데, 상기 단백질의 주요 기능이 DNA를 절단하는 것이기 때문에 세포의 게놈을 변형하는 데에 적용할 수 있다. 구체적으로, CRISPR/Cas9은 3세대 유전자가위로써 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다. Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자가 추가적인 도메인을 적절하게 연결할 수 있다. 본 발명에 있어서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9뿐만 아니라, 유전자 편집을 위한 핵산분해효소의 기능을 갖는 것이라면 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다.

상기 Cas9 변이체는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 변이체는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 Cas9 (nCas9) 단백질 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 Cas9 (dCas9) 단백질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 nCas9는 뉴클레아제의 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 RuvC 또는 HNH 도메인)에서 변이가 일어나 불활성화된 것일 수 있다. 구체적으로, 10번째 위치의 아스파르트산 (D10), 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863) 및 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 nCas9는 840번째 위치의 히스티딘이 알라닌으로 치환 (H840A)된 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

마찬가지로 dCas9는 10번째 위치의 아스파르트산 (D10), 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863) 및 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 dCas9는 10번째 위치의 아스파르트산이 알라닌으로 치환(D10A)된 변이와 840번째 위치의 히스티딘이 알라닌으로 치환 (H840A)된 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 Cas9 단백질 또는 이의 변이체는 그 유래가 제한되지 않으며, 비제한적인 예시로써 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아 (Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 유래일 수 있다.

상기 Cas9 단백질 또는 이의 변이체는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것 (non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 Cas9은 in vitro에서 미리 전사된 mRNA 또는 미리 생산된 단백질 형태, 또는 표적 세포 또는 생체 내에서 발현하기 위하여 재조합 벡터에 포함된 형태로 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 Cas9은 재조합 DNA(Recombinant DNA, rDNA)에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DNA는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의해 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다.

본 발명에서, 사용되는 용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 유전자 내 표적 부위 내의 특이적인 염기 서열 (표적서열)에 혼성화 가능한 표적화 서열을 포함하는 RNA를 의미하며, 생체 외 (in vitro) 또는 생체 (또는 세포) 내에서 Cas와 같은 뉴클레아제 단백질과 결합하여 이를 표적 유전자 (또는 표적 부위)로 인도하는 역할을 한다.

상기 가이드 RNA는 표적 유전자 (표적 부위) 내의 표적 서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 가지는 부분인 스페이서 영역 (Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas9 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는 표적 유전자 내의 표적 서열과 상보적인 서열을 포함하는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조, 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다.

상기 가이드 RNA의 표적 서열과 혼성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열(5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이 위치하는 DNA 가닥) 또는 이의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.

상기 가이드 RNA는 RNA 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나, 이를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “염색질 접근성 (Chromatin accessibility)”이란 주로 히스톤 (histone), 전사인자 (transcription factor, TF), 염색질 변형 효소 (chromatin-modifying enzymes) 및 염색질 리모델링 복합체 (chromatin-remodelling complexes)로 구성된 DNA 및 관련 단백질에 의해 형성된 복합체인 염색질의 물리적 압축 수준을 의미한다. 진핵생물 게놈은 일반적으로 히스톤 8량체 (octamer)를 감싸고 있는 ~147bp의 DNA를 포함하는 뉴클레오솜으로 압축되지만, 뉴클레오솜의 점유율은 게놈에서 균일하지 않으며 조직 및 세포 유형에 따라 다르게 나타난다. 뉴클레오솜은 일반적으로 전사 조절제 (ex. 전사인자)와 상호작용하는 시스 조절 요소 (인핸서 및 프로모터)가 존재하는 게놈 위치에서 고갈되어 접근 가능한 염색질을 생성하게 된다. 유전자 교정 (유전자 편집)과 관련해서는 닫힌 게놈 영역 보다 열린 게놈 영역을 표적하는 gRNA의 활성에 유의한 차이가 있어 Cas9의 효율이 국소적 염색질 접근성에 의해 영향을 받으므로 염색질 접근성과 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집 효율성 사이의 양의 상관관계가 있음이 공지되어 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 교정용 조성물을 in vitro 또는 ex vivo 상에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 영역 (region)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 교정 방법을 제공한다.

상기 유전자 교정용 조성물은 바람직하게 진핵세포에 적용될 수 있으며, 상기 진핵세포는 바람직하게 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유동물에서 유래된 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 교정용 조성물을 포함하는, 유전자 교정용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 유전자 교정용 조성물과 함께 버퍼 (buffer) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트 (dNTP)와 같은 유전자 교정을 실시하는데 필요한 물질 (시약)을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시 사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 유전자 교정용 조성물을 인간을 제외한 포유동물 세포에 주입하여 유전자 변형 포유동물 세포를 얻는 단계; 및 상기 얻어진 유전자 변형 포유동물 세포를 인간을 제외한 포유동물 위탁모 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 유전자 변형 포유동물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 포유동물 세포에 유전자 교정용 조성물을 도입하는 단계는, i) 상기 세포를 본 발명에 따른 융합단백질과 sgRNA을 암호화하는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터로 형질감염시키거나,

ii) 상기 세포에 융합단백질을 암호화하는 mRNA, sgRNA의 혼합물 또는 이들 각각을 직접 주입하거나,

iii) 상기 세포에 융합단백질, sgRNA의 혼합물 또는 복합체 형태의 리보핵산단백질을 직접 주입하여 수행될 수 있다.

상기 직접 주입은 상기 ii) 또는 iii)의 각 mRNA 및 가이드 RNA 또는 리보핵산단백질이 재조합 벡터를 사용하지 않고, 세포막 및/또는 핵막을 통과하여 유전체(genome)에 전달되는 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 나노입자, 전기천공법, 리포펙션 (lipofection), 미세주입 (microinjection) 등에 의하여 수행될 수 있다.

상기 유전자 교정 조성물이 도입되는 포유동물 세포는 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유동물의 배아일 수 있으며, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물의 배아일 수 있다. 예컨대, 상기 배아는 과배란 유도된 암컷 포유동물과 수컷 포유동물을 교배하여 얻어진 수정된 배아를 상기 암컷 포유동물의 난관에서 채취한 것일 수 있다. 상기 염기 교정용 조성물이 적용 (주입)되는 배아는 수정된 1-세포기의 배아 (zygote)일 수 있다.

상기 얻어진 유전자 변형 포유동물 세포는 상기 유전자 교정 조성물의 도입에 의하여 표적 유전자에 염기 치환, 삽입 또는 결실 돌연변이가 발생한 세포일 수 있다.

상기 유전자 변형 포유동물 세포, 바람직하게 유전자 변형 배아 세포를 난관에 이식받는 포유동물은 상기 배아 세포가 유래하는 포유동물과 동종의 포유류 (위탁모)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 유전자 변형 포유동물을 제공한다.

본 발명자들이 설계 및 제작하여 염기 편집 효율 및 무작위 인델 발생 감소를 확인한 염기 편집기 변이체의 구조는 도 1에 나타내었으며, 각각의 염기 편집기 변이체는 현재 알려진 가장 최적의 CBE인 AncBE4max와 ABE인 ABEmax를 기반으로 CMP등의 구성을 추가하고 그 배열을 달리하여 제작하였다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실험방법]

1. sgRNA 제조용 플라스미트 벡터 클로닝

타겟 sgRNA에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 Phusion polymerase (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 수행을 통해 합성하였다. 합성된 올리고뉴클레오타이드는 T4 ligase (NEB, USA)를 이용하여 pRG2-GG vector (Addgene #104174)에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 이용하여 수용성 DH5a 세포(Invitrogen, USA)를 형질전환하였으며, 형질전환 세포에서 Midi Prep Kit (MACHEREY-NAGEL, U.K)를 이용하여 플라스미트를 추출하고 Sanger sequencing analysis(Macrogen, Korea)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

상기 타겟 sgRNA에 특이적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드와 PCR 수행에 이용된 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

Oligo Name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
HBB_sgRNA	caccgCTTGCCCCACAGGGCAGTAA	aaacTTACTGCCCTGTGGGGCAAGc
RNF2_sgRNA	caccgGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACc
HEK3_sgRNA	caccgGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCc
Site18_sgRNA	caccgACACACACACTTAGAATCTG	aaacCTGATTCTAAGTGTGTGTGTc
Tyr_sgRNA
RNF2_sgRNA_gX30	caccgCCCCTTGGCAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTGCCAAGGGGc
RNF2_sgRNA_gX27	caccgCTTGGCAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTGCCAAGc
RNF2_sgRNA_gX25	caccgTGGCAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTGCCAc
RNF2_sgRNA_gX24	caccgGGCAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTGCCc
RNF2_sgRNA_GX23	caccgGCAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTGCc
RNF2_sgRNA_GX22	caccgCAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTGc
RNF2_sgRNA_gX21	caccgAGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACTc
RNF2_sgRNA_gX20	caccgGTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGACc
RNF2_sgRNA_GX19	caccgTCATCTTAGTCATTACCTG	aaacCAGGTAATGACTAAGATGAc
HEK3_sgRNA_gX30	caccgCAATCCTTGGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCCAAGGATTGc
HEK3_sgRNA_gX27	caccgTCCTTGGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCCAAGGAc
HEK3_sgRNA_gX25	caccgCTTGGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCCAAGc
HEK3_sgRNA_gX24	caccgTTGGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCCAAc
HEK3_sgRNA_gX23	caccgTGGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCCAc
HEK3_sgRNA_gX22	caccgGGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCCc
HEK3_sgRNA_GX21	caccgGGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCCc
HEK3_sgRNA_GX20	caccgGGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCCc
HEK3_sgRNA_GX19	caccgGCCCAGACTGAGCACGTGA	aaacTCACGTGCTCAGTCTGGGCc
1st PCR primer name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
HBB_deep seq_1st	ACTGTGTTCACTAGCAACCTC	TGATGCAATCATTCGTCTGTTTC
RNF2_deep seq_1st	TGTCAGAACATGCTGGAAGG	AGGACTTGCCCAACTTTCTAC
HEK3_deep seq_1st	TGGGTCACAGTGGCAAAT	GGGTAATCTGGTTGATCTCTGAT
Site18_deep seq_1st	AGAAACACCTTGGAGGAAGTG	CCAGTTAAGGAGAGGAATGGAAA
Tyr_deep seq_1^st	TGTATTGCCTTCTGTGGAGTT	GGTGTTGACCCATTGTTCATTT
2nd PCR primer name	Adaptor sequence + Sequence (5'-3')
HBB_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACTAGCAACCTCAAACAGACA
HBB_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGCCTATCAGAAACCCAAGAG
RNF2_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCAGACAAACGGAACTCAA
RNF2_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAACATACAGAAGTCAGGAA
HEK3_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAAACTTGTCAACCAGTATCC
HEK3_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTATTTCTGCTGCAAGTAAGC
Site18_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGTCCAAGAAGCAACA
Site18_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTCTAGTTCTCAAACTTCAGC
Tyr_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGTTTCCAGATCTCTGATGG
Tyr_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCACTGGCAGGTCCTATTAT

Oligo Name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
Site18_sgRNA	caccgACACACACACTTAGAATCTG	aaacCTGATTCTAAGTGTGTGTGTc
Site19_sgRNA	caccgCACACACACTTAGAATCTGT	aaacACAGATTCTAAGTGTGTGTGc
HBB-E2_sgRNA	caccgTCAGAAAGTGGTGGCTGGTG	aaacCACCAGCCACCACTTTCTGAc
HEK2_sgRNA	caccgGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCc
Site 18_sgRNA_gX30	caccgACACACAGACACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTc
Site 18_sgRNA_gX27	caccgCACAGACACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGTCTGTGc
Site 18_sgRNA_gX25	caccgCAGACACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGTCTGc
Site 18_sgRNA_gX24	caccgAGACACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGTCTc
Site 18_sgRNA_gX23	caccgGACACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGTCc
Site 18_sgRNA_GX22	caccgACACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGTc
Site 18_sgRNA_gX21	caccgCACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTGc
Site 18_sgRNA_gX20	caccgACACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGTc
Site 18_sgRNA_gX19	caccgCACACACACTTAGAATCTG	aaacCAGATTCTAAGTGTGTGTGc
HEK2_sgRNA_gX30	caccgAAGGAAACTGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCAGTTTCCTTc
HEK2_sgRNA_GX27	caccgGAAACTGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCAGTTTCc
HEK2_sgRNA_gX25	caccgAACTGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCAGTTc
HEK2_sgRNA_gX24	caccgACTGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCAGTc
HEK2_sgRNA_gX23	caccgCTGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCAGc
HEK2_sgRNA_gX22	caccgTGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCAc
HEK2_sgRNA_gX21	caccgGGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCCc
HEK2_sgRNA_GX20	caccgGAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTCc
HEK2_sgRNA_gX19	caccgAACACAAAGCATAGACTGC	aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTc
1st PCR primer name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
Site18_deep seq_1st	AGAAACACCTTGGAGGAAGTG	CCAGTTAAGGAGAGGAATGGAAA
Site19_deep seq_1st	AGAAACACCTTGGAGGAAGTG	CCAGTTAAGGAGAGGAATGGAAA
HBB-E2_deep seq_1st	CTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATAC	GGCAGAATCCAGATGCTCAA
HEK2_deep seq_1st	TCTAGAGGTCCTAAACCAGTGT	CCTCAGCATTCAGCCACTAATA
2nd PCR primer name	Adaptor sequence + Sequence (5'-3')
Site18_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGTCCAAGAAGCAACA
Site18_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTCTAGTTCTCAAACTTCAGC
Site19_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGTCCAAGAAGCAACA
Site19_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTCTAGTTCTCAAACTTCAGC
HBB-E2_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCTCTTATCTTCCTCCCACA
HBB-E2_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTTGGACTTAGGGAACAAAGG
HEK2_deep seq_2nd_F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGACGTCTGCCCAATATGTAA
HEK2_deep seq_2nd_R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCTGTCAAACTGTGCGTATG

2. 염기 편집을 위한 벡터 준비

xCas9 (3.7)-BE3 (Addgene #108380), pCMV-BE3 (Addgene #73021), pCMV-AncBE4max (Addgene #112094), xCas9(3.7)-ABE7.10 (Addgene #108382), pCMV-ABE7.10 (Addgene #102919), 및 pCMV-ABEmax (Addgene #112095)는 Addgene에서 제작하였으며, pCMV-NLS-UGI 벡터는 GeneCker, Inc. (Korea)에서 제작하였다.

3. 세포 배양 및 형질감염(transfection)

HEK293T 세포(ATCC CRL-3216)는 37℃및 5% CO₂에서 10% 소태아혈청(FBS; Gibco, USA)이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM; Welgene, Korea)에서 배양하였으며, 상기 배양된 세포는 24-웰 플레이트 (SPL, Korea)에 각 웰당 2×10⁴ 농도로 접종하고 17시간 후에 1ul Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 base editor plasmid(750 후), sgRNA plasmid(250 ng), 또는 UGI plasmid(250 ng 또는 500 ng)로 형질전환하였다. 형질전환 72시간 이후에 세포를 수확하고 용해하여 PCR 주형(template)으로 이용하였다.

4. mRNA 준비

pET-AncBE4max 및 pET-UGI는 GeneCker, Inc (Korea)에서 제작하였다.

각 mRNA 주형은 Phusion polymerase (Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용한 PCR 수행을 통해 제작하였다. PCR에 수행된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었다.

Primer_F	5'-GGT GAT GTC GGC GAT ATA GG-3'
Primer_R	5'-CCC CAA GGG GTT ATG CTA GT-3'

mRNA는 RNA transcription kit (mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit, Ambion)를 이용하여 준비하였으며, MEGAclear kit (Ambion)로 정제하였다.

7. 표적 심층 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)

게놈 DNA에서 Phusion polymerase (Thermo Fisher Scientific, USA)와 PCR thermal cycler를 이용하여 표적 부위를 증폭하였다. Illumina MiSeq system (Illumina, Inc., USA)을 이용하여 PCR 앰플리콘을 paired-end 시퀀싱 하였다. 이용된 프라이머는 상기 표 1에 나타내었다. 표적 심층 시퀀싱 데이터는 CRISPR RGEN Tools (www.rgenome.net) 및 EUN program (daeunyoon.com)을 이용하여 분석하였다.

8. 통계 분석

SPSS software, version 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 데이터를 분석하였다. P 값은 독립표본(unpaired) 및 양측 검정(two-sided) Student's t-tests 또는 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)을 수행하고, (multiple comparison) post-hoc으로는 Tukey를 수행하여 결정하였다. 모든 데이터는 평균과 표준편자(S.D.)로 표시하였다.

[실험결과]

실시예 1. 염기 편집기 변이체가 DNA 표적 위치에서 의도하지 않은 인델(indel) 유도를 확인

CRISPR 시스템 기반의 여러 유형의 염기 편집기 변이체는 보다 정확하고 효율적인 유전자 조작을 위해 개발되었다. 개발된 염기 편집기 변이체 중에서 AncBE4max 및 ABEmax는 핵 위치화 신호(nuclear localization signals: NLS), 코돈, 및 탈아미노효소(deaminase)의 구성과 그 사용을 조절하여 최적화되었다. 이러한 조절은 세포에서 염기 편집기의 효율과 정확성을 현저하게 향상시켜 정확한 SNP 수정이 가능하게 합니다. 또한, xCas9-BE3 (xBE3) 및 xCas9-ABE (xABE)는 xCas9 (3.7)과 융합된 진화된 염기 편집기이며, NG 또는 NGT PAM 서열을 인식하여 광범위한 PAM과 호환성이 향상된 염기 편집기이다.

본 발명자들은 염기 편집기의 다양한 변이체를 제작하고 인간 HEK293T 세포에서 상기 변이체의 염기 치환 및 삽입결실 효율을 확인하고자 하였다. CBE 변이체로 xBE3, BE3, AncBE4max를 제작하고, ABE 변이체로 AncBE4max, xABE, ABE 및 ABEmax를 제작하였으며(도 1), CBE 표적 좌위는 인간 HBB, RNF2, HEK3 및 Site18이고, ABE 표적 좌위는 인간 Site18, Site19, HBB-E2 및 HEK22이다.

그 결과, AncBE4max 및 ABEmax의 염기 치환 효율은 다른 염기 편집기보다 높음을 확인하였다(도 2). 모든 ABE 및 CBE 변이체는 모든 타겟 좌위에서 A에서 G로, 또는 C에서 T로 염기 치환을 유도하였다(도 3). CBE 변이체 중에서 AncBE4max는 표적 위치에서 최대 89%의 치환 효율을 나타내었으나, BE3 보다 낮은 삽입결실 효율을 나타내었다(도 3a). BE3에 대한 HEK3 표적 부위의 삽입결실은 최대 6.5%까지 확인되었다(도 3b). AncBE4max와 달리 ABEmax는 다른 염기 편집기에 비해 더 높은 수준의 치환 및 삽입결실을 보였다(도 3c-d). 기본 편집기 xBE3 및 xABE는 모든 표적 부위에서 가장 낮은 삽입결실 및 치환 효율을 나타내었으며, 이는 xCas9(3.7)의 낮은 활성에 의한 것으로 간주하였다. ABE 변이체는 CBE 변이체보다 상대적인 인델 효율이 낮았으며 표적 서열에 따라 인델이 거의 발생하지 않았다. 상기 결과로부터, 염기 편집기 변이체는 높은 효율로 DNA 표적 부위에서 원치 않는 염기의 삽입 및/또는 결실을 유도할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 2. sgRNA 길이가 염기 치환 효율 및 무작위 인델 발생에 미치는 영향 확인

이어서, 본 발명자들은 sgRNA(single guide RNA)의 길이가 염기 편집기의 인델(indel) 효율에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로 각 타겟 위치로 19~30개 염기를 확장하여 서로 길이가 다른 sgRNA를 제작하고, 인델 효율을 확인하고 동시에 표적 위치에서 CBE 및 ABE 변이체의 염기 편집 효율, 특이성, 및 editing windows를 비교하였다(도 4 및 도 5).

그 결과, HEK3 및 RNF2에서 치환 빈도는 Gx19 sgRNA에서 가장 높았고 원치 않는 삽입결실의 빈도는 gx30 sgRNA에서 가장 낮았다(도 6). 또한, CBE 변이체에서 확장된 sgRNA는 ABE 변이체와 비교하여 표적 서열의 활성 editing window를 확장시켰지만 절단 부위의 위치에는 영향이 없음을 확인하였다.

또한, ABE와 ABEmax는 거의 모든 sgRNA 길이에서 유사한 치환 효율을 보인 반면, xABE의 치환 효율은 sgRNA 길이가 짧을수록 증가함이 확인되었다(도 6).

표적별 ABE 변이체의 indel 효율은 sgRNA 길이에 따라 약간 다르지만 그 차이는 1% 미만이었다. 또한 CBE 변이체와 달리 ABE 변이체는 sgRNA의 길이에 관계없이 안정적으로 좁은 editing window를 일관되게 나타내었다. 그리고, ABE 변이체의 sgRNA는 gx21을 제외한 모든 sgRNA 길이에서 증가된 표적 특이성을 확인할 수 있었다(도 6)

상기 결과를 통해서 ABE 및 CBE 변이체의 sgRNA 길이 조절을 통해 보다 높은 염기 치환 효율과 원치 않는 염기의 삽입 및/또는 결실을 배제할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3. UGI 처리에 따른 CBE에 의한 무작위 인델 발생 빈도 감소 확인

nCas9에 의해 유발된 삽입결실의 빈도는 표적에 따라 최대 6.5%였으며, 삽입결실은 주로 Cas9 의존성 표적 절단 부위인 PAM 서열의 상류 3개 뉴클레오티드 주위에서 유도된다(도 7).

본 발명자들은 디아미네이즈(deaminase)와 결합된 dCas9을 사용하여 염기 편집기 변이체에 의한 의도하지 않은 염기 삽입 및 결실을 충분히 제거할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 염기 편집기에서 nCas9 대신 dCas9을 사용하는 경우 CBE 및 ABE 변이체 모두에서 원치 않는 인델 발생을 완전히 제거할 수 있으나 염기 편집의 효율이 현격하게 낮은 문제가 있다(도 7의 c-f). 특히, 표적에 따라 상이하지만 RNF2을 표적으로 하는 경우 CBE 변이체 중에서 AncdBE4max는 AncBE4max과 비교하여 편집효율이 약 9.5배 감소하였다.

실시예 4. dCas9을 이용한 CBE에서 무작위 인델 발생 빈도 감소 확인

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, dCas9를 이용하는 CBE 기본 편집기에서 nCas9 대신 dCas9를 사용하면 CBE 및 ABE 변종으로 인한 indel이 감소되지만, dCas9은 두 변이체 모두에서 매우 낮은 염기 치환 효율을 나타내었다(도 1). 이러한 낮은 편집 효율을 극복하기 위하여 본 발명자들은 염기 편집기에 염색질 조절 펩티드(chromatin modulating peptide: CMP) 도메인을 추가하여 Cas9가 표적 서열에 접근성을 증가시키고자 하였다. 고-이동성 그룹 뉴클레오솜 결합 도메인 1 (high-mobility group nucleosome binding domain 1: HN1) 및 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (histone H1 central globular domain: H1G)을 다양한 영역에 배치하여 염기 편집기 변이체를 제작하였다(도 8). 인간 표적을 대상으로 각 CBE와 ABE 사이에서 CMP 구성의 순서에 따른 염기 편집 효율과 인델 발생 빈도를 확인하였다(도 9).

dCas9가 포함된 모든 BP 및 AP 변이체는 indel 발생을 제거하였고 그 결과 원치 않는 염기 삽입 및 결실 없이 보다 정확한 염기 편집이 가능함을 확인하였다. 구체적으로 BP1a 및 BP2b는 AncBE4max보다 낮은 염기 치환 효율을 나타내지만 dAncBE4max보다 치환 효율이 우수하고 인델이 발생하지 않았다. 또한, AP1a와 AP1b는 dABEmax보다 약간 높은 편집 효율을 나타내었으나, ABEmax는 indel 발생 빈도가 낮아 AP1a 및 AP1b(nAP1a 및 nAP1b)에 nCas9을 사용하였다. 그 결과, nAP1b는 표적 부위에서 현저하게 향상된 염기 치환 효율을 나타내었다.

HEK3 및 Site18을 표적으로 하는 BE3 변이체는 열린 크로마틴 구조를 표적으로 하여 염색질 접근성 증가에 의한 인델 발생 빈도의 감소 효과가 크지 않았다.

실시예 5. 염기 편집기 변이체를 이용한 Dmd KO 동물모델 제작 및 염기 편집 효율 확인

듀센형 근이여양증(Duchenne muscular dystrophy: DMD)은 3500-5000명의 남성 중 1명꼴로 발견되는 유전 질환으로 근육 약화 및 퇴행을 유발하며 디스트로핀(Dmd)의 파괴로 인해 발생한다.

본 발명자들은 pre-stop codon(CAG > TAG)을 만들기 위하여 Dmd의 exon 20에 특이적인 sgRNA를 설계하고 마우스 근모세포(C2C12)에서 CBE 및 BP 변이체의 C에서 T로 치환능을 비교하였으며, 모든 BP 변이체는 높은 편집능과 원치 않는 인델 발생이 제거 효능을 확인하였다(도 10 및 도 11).

구체적으로, AncBE4max 및 BP2b는 대조군으로서 마우스 비표적(mouse nontarget: MNT) 서열을 갖는 sgRNA 또는 Dmd(plenti-MNT-AncBE4max, plenti-Dmd-AncBE4max, plenti-Dmd-BP2b)와 함께 렌티바이러스에 패킹되었다. 염기 편집기가 패킹된 렌티바이러스를 C57BL/6N 마우스(5 x 10⁵ TU/TA muscle)의 P1~P3에 주사하고 1, 3, 및 6개월 후에 NGS 및 조직학적 분석을 수행하여 유전자 편집을 확인하였다.

그 결과, CBE 변이체를 이용하여 근육 세포주인 C2C12의 Dmd(Duchenne muscular dystrophy) 유전자에 종결 코돈을 생성하였을 때, BP1a~AP2b모두 BE3 및 AncBE4max 보다 높은 효율로 C to T conversion을 일으켰으며, 원치 않는 indel이 발생하지 않음을 확인하였다(도 10).

또한, Dmd 돌연변이(Q863*) C2C12도 ABE 및 AP 변이체로 형질감염을 수행하였다. AP2b 또는 nAP1b은 사전에 중지된 번역을 정상으로 복원할 수 있는 A에서 G로 치환에 최고 효율성을 나타내었다. plenti-MNT-ABEmax, plenti-Dmd rescue-ABEmax, plenti-Dmd rescue-AP2b 또는 nAP1b은 렌티바이러스에 패킹되어 CBE와 동일한 역가(titer)로 Dmd 돌연변이(Q863*) 마우스 출생 시에 주입되었다(P1~P3). 주입 1, 3, 및 6 개월 후 NGS 및 조직학적 분석을 수행하여 유전자 편집을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

Cas9 단백질, 하나 이상의 염색질 조절 펩타이드(Chromatin-modulating peptides: CMP), 및 하나 이상의 핵 위치화 신호(nuclear localization signals: NLS) 펩타이드를 포함하는 유전자 교정용 융합단백질로서,
상기 Cas9 단백질은 dead Cas9 (dCas9)이고,
상기 CMP는 고-이동성 그룹 뉴클레오솜 결합 도메인 1 (high-mobility group nucleosome binding domain 1: HN1) 또는 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (histone H1 central globular domain: H1G)이며,
상기 융합단백질은 N-말단에서 C-말단의 순서로 [NLS 펩타이드]-[HN1]- [Cas9 단백질]-[H1G]-[NLS 펩타이드]가 위치하거나,
N-말단에서 C-말단의 순서로 [NLS 펩타이드]-[HN1]- [Cas9 단백질]-[NLS 펩타이드]-[H1G]가 위치하고,
상기 융합단백질은 하나 이상의 UGI(uracil DNA-glycosylase inhibitor) 펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 UGI 펩타이드는 dCas9 단백질의 C-말단에 직접적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 유전자 교정용 융합단백질.
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제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)를 추가로 포함하고,
상기 시티딘 디아미네이즈는 HN1 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 것인, 유전자 교정용 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 tRNA 아데노신 디아미네이즈(tRNA adenosine deaminase: TadA)을 추가로 포함하고,
상기 TadA는 HN1 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 것인, 유전자 교정용 융합단백질.
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제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 N-말단에서 C-말단의 순서로 [NLS 펩타이드]-[HN1]- [dCas9 단백질]-[UGI 펩타이드]-[UGI 펩타이드]-[NLS 펩타이드]-[H1G]가 위치하거나,
N-말단에서 C-말단의 순서로 [NLS 펩타이드]-[HN1]- [dCas9 단백질]-[UGI 펩타이드]-[UGI 펩타이드]-[H1G]-[NLS 펩타이드]가 위치하는 것을 특징으로 하는, 유전자 교정용 융합단백질.
제1항의 융합단백질, 상기 융합단백질을 암호화하는 plasmid DNA 또는 mRNA, 또는 상기 plasmid DNA 또는 mRNA를 포함하는 벡터; 및
비표적 DNA 가닥과 혼성화하여 표적 DNA 가닥의 절단을 유도하는 sgRNA(single guide RNA), 상기 sgRNA를 발현할 수 있는 플라스미드, 또는 상기 플라스미드를 포함하는 벡터;를 포함하는 유전자 교정용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 조성물은 UGI를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 교정용 조성물.
제11항의 유전자 교정용 조성물을 in vitro 또는 ex vivo 상에서 표적 핵산 서열을 포함하는 표적 영역 (region)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 교정 방법
제1항의 융합단백질을 암호화하는 mRNA 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 렌티바이러스 벡터.
제14항에 있어서,
상기 sgRNA는 10~30 뉴클레오티드 (nt) 길이인 것을 특징으로 하는, 렌티바이러스 벡터.
제14항의 렌티바이러스 벡터를 포유동물 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 형질전환 세포주 제조방법.
제14항의 렌티바이러스 벡터로 감염된 형질전환 세포주.