JPH04500161A - Ｂｔ耐性発現の防止 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、プロテアーゼ感受性であるか、又は、プロテアーゼにより切断可能なアミノ 酸配列をコードするＤＮＡ断片が、上記工ＣＰ遺伝子と同じ上記転写単位に存在 し、そして上記ＩＣＰ遺伝子間の枠内に挿入される請求の範囲第５項又は第６項 記載の細胞。

８６　上記ＩＰＣ遺伝子が、翻訳再開を可能にし、該ＩＰＣ遺伝子と同じ転写単 位内にあって該ＩＰＣ遺伝子間に挿入された遺伝子間ＤＮＡ配列を含むジシスト ロン単位中で一緒にされている請求の範囲第５項又は第６項記載の細胞。

９、上記ＩＣＰ遺伝子がＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種に対する活性を有する殺虫蛋 白質をコードする遺伝子であって、特に以下の遺伝子：　ｂｔ２及び／又はｂｔ ７３及び／又はｂｔ４及び／又はｂｔ１４及び／又はｂｔｉｓ及び／又はｂｔｉ ｓである請求の範囲第１項〜第８項のいずれか−に記載の細胞。

１０．上記ＩＣＰ遺伝子がＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ種に対する活性を有する殺虫性 蛋白質をコードする遺伝子であって、特に以下の遺伝子：　ｂ　ｔ　ｊ３及び／ 又はｂｔ２１及び／′又はｂｔ２、特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか− に記載の細胞。

ｉｉ、上記マーカーＤＮＡが：除草剤耐性遺伝子、特にｓｆｒ又は５ｆｒｖ遺伝 子；除草剤に対する低親和性を示す除草剤のための修飾標的酵素をコードする遺 伝子、特にグリフォセートに対する標的としての修飾５−ＥＰＳＰ又はＧＳ咀害 剤に対する標的としての修飾グルタミンシンセターゼ；あるいは抗生物質耐性遺 伝子、特にＮＰＴＩＩである請求の範囲第２項〜第１０項のいずれか−に記載の 細胞。

１２、上記プロモータが：構成プロモータ、特に３５Ｓプロモータ又は３５Ｓ３ プロモータ、ＰＮＯＳプロモータ、ｐｏｃｓプロモータ；傷誘発性プロモータ、 特にＴＲ１’又はＴＲ２′プロモータ；光合成活性を有する植物組織において選 択的に遺伝子発現を指示するプロモータ、特にＳＳＵプロモータ；もしくは、組 織特異性プロモータ、特に塊茎特異性プロモータ、茎特異性プロモータ又は種子 特異性プロモータである請求の範囲第３項〜第６項のいずれか−に記載の細胞。

１３、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか−の上記ＩＣＰ遺伝子を包含する 、植物細胞、特に猛匹公」ｅｒｉｕｍに感染可能な植物細胞を形質転換するに適 したベクター。

１４、改良された毘（害）虫耐性を有し、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれ か−に記載の上記ＩＣＰ遺伝子が細胞の核ゲノム中に安定に組み込まれた植物を 製造するための方法であって、上記ＩＣＰ遺伝子を上記細胞の核ゲノム中に挿入 することによって上記植物の細胞を形質転換し、上記細胞から上記植物及び再生 物質を再生する非生物学的工程を含むことを特徴とする方法。

１５、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか−に記載の植物細胞から成る植物 細胞培養。

１６、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか−に記載の植物細胞から成る植物 。

１７、上記ＩＣＰ遺伝子が以下の遺伝子対二ｂｔ２とｂｔｉｓ、又はｂｔ７３と ｂｔｉｓ、又はｂｔ２とｂ　ｔ　１．８、又はｂｔ２とｂ　ｔ　１．４、又はｂ ｔ２とｂｔ４、又はｂｔｉｓとｂｔ１８、又はｂｔ１４とｂｔ】５、又はｂｔ４ とｂｔｉｓ、又はｂｔｉｓとｂｔ２１、又はｂｔ２１とｂｔ２２、又はｂｔ１３ とｂｔ２２の一つを含む請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか−に記載の植物 細胞から成るハクサイ、トマト、ジャガイモ、タバコ、綿、又はレタス。

１８、上述の方法によって作られる請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか−に 記載の細胞。

１９、植物を、請求の範囲第１項〜第１２のいずれか−に記載の上記ＩＣＰ遺伝 子で形質転換することによって、昆（害）主橋に対して植物を耐性にするための 方法。

明　細　書 Ｂｔ・の 本発明は、好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目又はＣｏ１ｅｏｐｔｅｒａ目に 属する特定の標的昆主橋に対する異った非競合的結合Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕ ｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　（″ト址旦上工匡坦旦”　又は”Ｂｔ”）殺虫結晶蛋白 質（“ＩＣＰ“）に関して各々コードする少なくとも２つの遺伝子を含有するよ うに、そのゲノムが形質転換されている植物細胞及び植物体に関する。このよう な形質転換植物は、特に、このような植物体において発現される少なくとも２つ のＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰに対する標的昆（害）主橋におけ る耐性発現の防止に関して、単一り肋肛亘且匡坦鳥ＩＣＰ遺伝子によって形質転 換された植物体を上回る利点を有する。

本発明はまた、標的昆主橋の中隔における少なくとも２つのＢ、　ｔｈ肛７匣１ ｓＩＣＰの競合的及び非競合的結合特性を考慮し、た、このようなトタンスジエ ニック植物の作製方法に関する。植物内での異った非競合的結合Ｂ、　ｔｈｕｒ ｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰに関して各々コードする少なくとも２つの遺伝子の 植物体内同時発現は、植物体内で発現される少な（とも２つのＢ。

止■遺工国坦１ｓＩＣＰに対する昆虫の耐性発現を防止又は遅延させるのに特に 有用である。

本発明はさらに、少なくとも２つの非競合的結合Ｌｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ Ｉ　ＣＰをコードする少なくとも２つの非競合的結合Ｂ、　ｔｈｕｒｉ吐江胚」 Ｉ　ＣＰ遺伝子を含有する新規の植物発現ベクターの構築、及び新規の植物発現 ベクターそわ自体に関する。このようなベクターは、植物体内における少なくと も２つのＬｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子の組込み及び協働的発現 を可能にする。

ｌ亙五１１ 化学的殺虫剤の開発及び広範な使用がなされて以来、耐性昆虫系統（株）の出現 は重大な問題であった。殺虫剤耐性の発現は生化学的、生理学的、遺伝学的、生 態学的機序による現象である。近年、塩素化炭化水素、有機燐酸塩、カルバミド 酸塩（カーバメイト）、及びピレトリン類゛似（ピレスロイド）化合物をはじめ とする多くの種類の化学的殺虫剤の全てに対して昆虫耐性が報告されている（　 Ｂｒａｔｔｓｔｅｎ等、１９８６）。

合成殺虫剤に対する昆虫耐性の迅速な発現に対比して、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ ｅｎｓｉｓ噴露剤のような細菌性殺虫剤に対する昆虫耐性の発現は、長年の使用 にもかかわらず、徐々に進展した（Ｂｒａｔｔｓｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８６１　、胞子形成グラム陽性細菌Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓは、殺虫 活性を有する結晶蛋白質（ＴＣＰ）を構成するバラ胞子（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ ）結晶を産生する。３．　ｊｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ噴霧剤に対する田畑にお ける耐性昆虫系統の出現の可能性を低減する重要な因子は：第一に、葉に使用後 のＬｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓの半減期か短いことであり；第一に、市販のＢ 、ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ製剤がしばしば胞子、ＩＣＰそして結局はベータ ー外毒素を含むいくつかの殺虫因子の混合物から成るという事実（Ｓ１１ｉｅｌ ｄｓ。

１９８７）　、そして第三に、植物体−害虫相互作用の一時的性質である。首尾 よくいった多数のフィールド試験からは、その胞子−結晶複合体を含有するＬｔ ｈｕｒ上１１匣カの市販の製剤が、農業及び林業における鱗翅目害虫を有効に制 御することが示された（Ｋｒｉｅｇ　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅｎｂｒｕｃｈ、　１９ ８１）。Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓは、目下、害虫の微生物的制御に対 して、最も広範に用いられている病原体である。

Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対する淘汰が数世代の昆虫に適用された種 々の実験室試験から、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対する耐性は鍼灸に 得られないことが確証されている。しかしながら、実験室条件はかなり低い淘汰 圧条件を示すことは力説されるべきである。

例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ等（１９８６）は、１４世代のＡｅｄｅｓ　阻ｕ旦に関 してＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ毒素による淘汰 を適用して、感受性のわずかな低下を見出しただけであった。淘汰系統において 観察され得る任意の感受率低減傾向の欠如は。

限定された数の世代に関して実施された低い淘汰圧（ＬＣ，。）を反映するもの と思われる。しかしながら、ＧｅｏｒｇｈＬｏｕ等（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ　 Ｒｅ５ｉｓｔａｎｅｅ　ｉｎＭｏｓｑｕｉｔｏｅｓ：　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｏｎ 　ｎｅｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｍａｎ ａｇｅｍｅｎｔ及び＋Ｍｏ５ｑｕｉｏｔｏ　ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｓｅａｒｃｈ、 　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２９８３．　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＣａ ｌｉｆｏｒｎｉａ”）は、Ｃｕ１ｅｘ　ｕｉｎ　ｕｅｆａｓｉａｔｕｓを用いて 、ＬＣ−ｓ淘汰圧で３２世代後に、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓｉｓｒａ ｅｌｅｎｓｉｓに対する耐性を１１倍に増大した、ということは指摘されるべき である。

ＭｅＧａｕｇｈｅｙ（１９８５）は、穀物貯蔵害虫であるＰｌｏｄｉａｉｎｔｅ ｒ　ｕｎｅｔｅｌｌａが、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓの胞子−結晶複合 体に対する耐性を発現する、と報告した；市販のＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓ ｉｓＨＤ　−１製剤（−Ｄｉｐｅｌ−Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｃｓ６００６４、　ＵＳＡ ）を用いて、ひき割りトウモロコシ蛾であるＰｌｏｄｉａ凰居■二ュ旦旦で１５ 世代淘汰後に、Ｌｔｈｕｒｉｎ　ｆｅｎｓｉｓ感受性の１００倍増大が報告され た。各コロニーは、７０〜９０％の幼虫死亡率を生じると予測される一定用量の Ｂ、　ｔｈｕｒＬｎ　１ｅｎｓｉｓで処理した餌で数世代に培養された。これら の高淘汰圧条件下で、Ｂ、　ｔｈｕｒ（ｎ　１ｅｎｓｉｓに対する昆虫耐性は迅 速に増大した。さらに最近に、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対する耐性 の発現は、アーモンド蛾であるＣａｄｒａ　ｃａｕｔｅｌｌａに関しても報告さ れている（　ＭｃＧａｕｇｈｅｙとＢｅｅｍａｎ。

１９８８）。淘汰が中断され、そして劣性形質として遺伝する場合に、耐性は安 定であった（　ＭｃＧａｕｇｈｅｙとＢｅｅａ＋ａｎ、　１９８８）　＊　Ｐｌ ｏｄｉａ　１ｎｔｅｒ　ｕｎｃｔｅｌｌａ及びＣａｄｒａｅａ、ｕｔｅｌｌａの Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ毒素に対する昆虫耐性の機序は、明らかにさ れていない。

穀物貯蔵に関連して報告された両方の場合におけるＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎ ｓｉｓ耐性発現の主因は、穀物貯蔵中に普及する環境条件であった。両方の場合 の条件下では、環境は相対的に安定であり、したがって、°Ｌｔｈｕｒｉｎ　ｔ ｅｎｓｉｓ衰退は遅く、微生物殺虫剤の持続的存在下で連続世代の害虫を繁殖さ せた。ある研究においてＰｌｏｄｉａがＢ、ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対す る耐性を発現する速度は、処理穀物の大箱内で一シーズン貯蔵する間にＰｌｏｄ ｉａがそのように発現し得ることを示唆している。

Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓＬｓに対する昆虫耐性発現は、実験室及び予備的 規模の試験においてほとんど観察されているけれども、極（最近、（キャベツ） 畑でのＰｌｕｔｅｌｌａ二組旦旦ハ集団におけるＢ、　ｔｂｕｒｉｎ　１ｅｎｓ ｉｓ耐性発現についての指標が報告されている（　ＫｉｒｓｃｈとＳｃｈｍｕｔ ｔｅｒｅｒ、　１９８８）。多数の要因によって、相対的に小さな地理的領域に おいて、！３．　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対しで！、■胆銭旦シが継続的 に暴されることになった。

このことと、モしてＰ、　狂且旦旦」の短い世代周期が、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　 １ｅｎｓｉｓに対する感受性の低下と耐性の増大を引き起こす多大な淘汰圧を生 じたと考えられる。

植物体を昆虫耐性にさせるために植物体内にＬｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　 ＣＰ遺伝子を発現するための手法（欧州特許第０１９３２５９号［この記載内容 は参照により本明細書中に含めるものとする］　；　Ｖａｅｃｋ　ｅｔａｌ、、 　１９８７；　Ｂａｒｔ、ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９１！７；　Ｆｉｓｃｈｈ ｏｆｆ　ｅｔａｌ、、　１９８７）は、農業における昆虫制御に全く新しいアプ ローチを提供し、同時にこれは、安全で、環境的に魅力があり、そして経費的に も有効である。本アプローチが成功するための重要な決定因子は、トランスシュ ニック植物体中で発現されるＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩＣＰに対する 耐性を昆虫が発現し、得るか否かである（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ ７；　Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７；Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８７）。葉に使用するのと対照をなして、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　 １ｅｎｓｉｓｉ　ＣＰが急速に衰退し、た後、トランスジェニック植物は連続的 淘汰圧を発揮する。連続淘汰圧が、いくつかの昆主橋におけるＬｔｈｕｒｉｎ　 １ｅｎｓｉｓ及びその成分に対して順応させたということが実験室的淘汰実験か ら明らかである。この点に関しては、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　ｉｅ　ｓｉｓに対す る昆虫耐性の発現を引き起こした実験室の条件が、Ｂ、　ｔｈυｒｉｎｉｅｎｓ ｉｓＩＣＰを産生するトランスジェニック植物に関する状況と同様であって、植 物を摂食する昆虫集団に連続淘汰圧を提供する、ということが指摘されねばなら ない。工学的に作り出された昆虫耐性植物がその環境の恒久的部分となる場合、 昆虫における耐性発現が急速に出現すると、淘汰圧の数学モデルは予測している （Ｇｏｕｌｄ、　１９８８）。したがって、トランスジェニック植物におけるＬ ±７ｉｅｎｓｉｓに対する昆虫耐性の発現の機会は、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅ ｎｓｉｓ噴霧剤のフィールド使用と比較し７て、かなり増大すると考えられるＢ 、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＨＤ　−Ｉ　Ｉ　ＣＰに対しては２０倍もの耐 性を示し、純粋ＩＣＰに対しては６倍の耐性を有することが報告されている（Ｓ ｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）。さらに、耐性の財政的及び人的経費は評価するのが難しいが、しか し殺虫剤の有効性の損失は、新規の殺虫剤の発見及び開発がさらに難しくなる場 合には、使用頻度及び用量の増大、そして結局はさらに高価な代替化合物を測り 知れない程に要する。

したがって、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対する耐性の進展を遅延させ る、あるいは防止さえするための手段を開発することが望ましい。

鱗翅類Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ　（Ｄｕｌｍａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１ ）、双翅類Ｄｔｐｔｅｒａ　（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｍａｒｇａｌｉｔ、 　１９７７）及び鞘翅類Ｃｏ１ｅｏｐｔｅｒａ　（Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９ｇ３）に対して活性なり、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ系統が記載され ている。　Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに対して活性な異系統のものからのＩＣＰ、 並びにＣｏ１ｅｏｐｔｅｒａに対して活性な系統からのＩＣＰの間に実質的異質 性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｐｅｉｔｙ）が認められるということが明らかになってき た（）Ｉｏｆｔｅａｎｄ　Ｗｈｔｔｅｌｅｙ、　１９８９）　、、固定された異 なるＬ止匹−山」亘ＩＣＰ遺伝子についての概要を表２に示す（これは本明細書 の実施例の後に付す）。

はとんどの抗鱗翅類Ｂ、　ｔｈｕｒｔｎ　１ｅｎｓｉｓ　（例えばＢｉ３、Ｂｉ ２、Ｂｉ７３、Ｂｉ１４、Ｂ　ｔ　ｉ　５、Ｂｉ２、Ｂｉ１８）ＩＣＰ遺伝子は 、昆虫の中編のアルカリ性環境に溶解し、プロテアーゼによって分解し６０〜６ ５ｋＤａの活性毒素に活性化される１３０〜１４０　ｋＤａプロトキシンをコー ドする。これらの（ＣＰは、関連を有し、配列の相同性に基づく同族のメンバー として認めることができる。しかしながら、配列の違いが相当あり、鱗翅目間の 殺虫スペクトルはかなり異なる（Ｈｏｆｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８Ｕ。

Ｐ２毒素遺伝子及びｃｒｙＢ２遺伝子は、それらが高分子プロトキシンをコード せず、しかしむしろ７０ｋＤａ辺りの毒素をコードするという点で、上記遺伝子 とは異なっている（それぞれ、Ｄｏｎｏｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌＨ８及びＷ ｉｄｎｅｒ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、　１９８９）。

抗鞘翅類毒素遺伝子族においても異質性が存在するということが、近年、明らか になってきた。抗鞘翅類活性を有する異なるＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ 単離体からの過去に報告されたいくつかの毒素遺伝子配列が確認された（欧州特 許第０１４９１６２号及び第０２０２７３９号）が、しかし、ｂｔ２１及びｂｔ ２２の配列及び構造はかなり相違している（欧州特許出願（“ＥＰＡ”）第８９ ４００４２８．２号）。

！ｉＬ止旺立１！二島Ｉ　ＣＰの殺虫範囲は異なるが一方、それらの毒素作用の 主要経路は共通であると考えられている。作用機序が詳細に研究されてきたＬｔ ｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓは全て、感受性種の中隔上皮と相互作用して、刷子縁 膜の透過性特性及びこの膜に関する浸透圧平衡が撹乱されるという事実により、 上皮細胞の溶解を引き起こす（Ｋｎｏｗｌｅｓ　ａｎｄ　Ｅｌｌａｒ。

１９８６）。Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰの毒素作用の経路にお いては、毒素と、これらの細胞の刷子縁膜上の受容体部位との結合が重要な特徴 である（Ｈｏｆｍａｎｎ　ｅｔａｌ、、　１９１１１８ｂ）、中編の毒素結合部 位は、可飽和的方法で、そして高親和性を伴って毒素が結合するために、ＩＣＰ −受容体とみなし得る（Ｈｏｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８８ａ）。

Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰの作用様式のこの概略は一般に受容 されるけれども、それらの殺虫範囲の差異に関する必然的決定因子は何であるか は依然として考察されていない。Ｈａｉｄｅｒ等（１９８６）は、昆虫の中編に おける特定のプロテアーゼの重要性を強調した。）Ｉｏｆａ＋ａｎｎ等（１９８ ８ｂ）は、受容体結合が毒素活性のための前提条件であることを示し、Ｐｉｅｒ ｉｓｂｒａｓｓｉｅａｅは２つの毒素に対する２つの別個の受容体集団を有する と記載している。その他の著者は、中編の環境の差異（例えば中編のｐＨ）が決 定的であり得ると示唆した。

及匪立ｌ且 本発明によれば、特定の標的昆虫に対する、好ましくは鱗翅類又は鞘翅類に対す る少なくとも２つの非競合的結合性殺虫性Ｂ、　ｔｈｕユ皿ｎ凹１ｓＩＣＰをコ ードする少なくとも２つのＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子が そのゲノム中に安定に組み込まれた植物が提供される。このような植物は、少な （とも２つの非競合的結合性Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰの同時 発現を特徴とする。

さらに、本発明によれば、少な（とも２つのＩＣＰ遺伝子、特に、２つの非競合 的結合性抗鱗翅類又は抗鞘翅類Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰをコ ードする２つの遺伝子又はその一部を、植物発現ベクター中にクローン化する。

このベクターで形質転換される植物細胞は、少な（とも２つのＢ、　ｔｈｕｒｉ ｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子の同時発現を特徴とする。その結果生じる形質 転換植物細胞は、植物細胞が：１．少なくとも２つの非競合的結合性抗鱗翅類又 は抗鞘翅類り帥肛力ｌ至ｎ５ｉｓＩ　ＣＰをコードする少なくとも２つのＢ、　 ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子又はその一部を、それらのゲノム中 への安定な挿入体として含有し；そして２、遺伝子を同時に発現し、それによっ て少なくとも１つの標的昆主橋に対する改良された耐性を植物に授与して、形質 転換された植物を摂食する昆虫の少なくとも１つの標的種のＢ、　ｔｈｕｒｉｎ 　１ｅｎｓｉｓに対する耐性の発現を防止又は遅延する形質転換植物を産生ずる ために使用し得る。

さらに、本発明によれば、植物細胞中で少なくとも２つのＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　 １ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子の組み込み及び同時発現を可能にし、そして各々が 同−転写単位内に含有する１つ又はそれ以上のキメラ遺伝子を包含する植物発現 ベクターが提供され、ＩＣＰ遺伝子の１つによってコードされるｍＲＮＡの合成 を指示するよう植物細胞中で機能するプロモータ；各々が非競合的結合性り肋肛 上工匡匣訪ＩＣＰをコードする１つ又はそれ以上の異なるＩＣＰ遺伝子；好まし くはマーカー遺伝子；３′末端形成のために、そしてポリアデニル酸塩ヌクレオ チドをｍＲＮＡの３′末端への付加のために植物細胞中で機能する３′非翻訳Ｄ ＮＡ配列；そして任意の２つのＩＣＰ遺伝子間のプロテアーゼ感受性蛋白質部分 をコードする任意のＤＮＡ配列が提供される。

及朋」１０−心風朋 定１ 本明細書中で用いる場合、”Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩＣＰ”　（又 は“ＩＣＰ”）は、殺虫活性を有し、そしてｆ３．　ｊｈｕｒｊ、ｎ　１ｅｎｓ ｉｓによって天然に産生され得る無傷蛋白質（全蛋白質）又はその一部と理解さ れるべきである。ＩＣＰはプロトキシンであると同時に。

活性毒素又はプロトキシンの別の殺虫性切形部分であって、これは結晶でなく、 そして天然発生性蛋白質でないことが必要である。この点に関しては、ＩＣＰは 、欧州特許第０２２８８３８号に記載されているように、２つの異なるＩＣＰ遺 伝子の２つの可変性領域の組み合わせによってコードされるキメラ毒素であり得 る。

本明細書中で用いる場合、“プロトキシン”は、ＩＣＰをコードする全長遺伝子 の一次翻訳物質であると理解されるべきである。

本明細書中で用いる場合、“毒素”、“毒素コア°。

又は“活性毒素”は、全て、プロテアーゼ（例えばトリプシン）切断によって得 られ、そして殺虫活性を有するプロトキシンの一部であると理解されるべきであ る。

本明細書中で用いる場合、“遺伝子”は、蛋白質（例えば天然に見出されるよう なもの）をコードする全長ＤＮＡ配列、並びに全長ＤＮＡ配列によってコードさ れる蛋白質の少なくとも活性部分（即ち毒素）をコードする、好ましくは、全長 ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質のまさに活性部分をコードするその切形 断片であると理解されるべきである。遺伝子は、天然に生じ得るし、あるいは合 成され得る。

本明細書中で用いる場合、“切形Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　ｉｅｎｓｉｓ遺伝子”は 、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰの少なくとも毒素部分、優先的に 毒素をさらにコードする全長Ｌｔｈｕｒｔｎ　１ｅｎｓｉｓ遺伝子の断片と理解 されるべきである。

本明細書中で用いる壜台、゛マーカー遺伝子　は、。

選択可能なマーカーをコードする（例えば抗生物質耐性をコードする）、又はス クリーニング可能なマーカーをコードする（例えば、トランスジェニック植物の 定量的分析を可能にする遺伝子物質をコードする）遺伝子と理解されるべきであ る。

２つのＩＣＰは、一方のＩＣＰが他方のＩＣＰの全ＩＣＰ受容体に対してコンピ ートする場合に標的昆主橋に対して゛競合的結合Ｉ　ＣＰ　”であるといい、こ の受容体は標的昆主橋の中腸の刷子縁膜中に存在する。

２つのＩＣＰは、少なくとも１つの標的昆主橋に対して、第一のＩＣＰが、第二 のＩＣＰがコンピートしないものに対する少なくとも１つの受容体を有し、そし て第二のＩＣＰが第一のＩＣＰがコンピートしないものに対する少なくとも１つ の受容体を有する場合に°゛非競合的結合ＩＣＰ”であるといい、受容体は標的 昆主橋の中腸の刷子縁膜に存在する。

“受容体”は、配位子（ここではＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩＣＰ、好 ましくは毒素）が高親和性（一般的には１０−１１〜１０−’Ｍの解離定数（Ｋ ｄ））乃び高可飽和性を伴って結合し得る分子と理解されるべきである。２つの ＩＣＰが競合的結合ＩＣＰか非競合的結合ＩＣＰかの決定は、１．第一のＩＣＰ が、約１０゛目〜１０−’Ｍの範囲の親和性を有する第二のＩＣＰの全結合部位 が約１０−’Ｍ又はそれ以下の（例えば約１０−”Ｍを下回る）濃度の第一のＩ ＣＰで飽和され得る場合は、第二のＩＣＰの受容体の全てに対してコンピートす るか否か；そして２．第二のＩＣＰが、約１０−１〜１０−’Ｍの範囲の親和力 を有する第一〇ＩＣＰの全結合部位が約１０−’Ｍ又はそれ以下の濃度の第二の ＩＣＰで飽和され得る場合に、第一のＩＣＰの受容体の全てに対しでコンピート するか否かを測定することによってなされ得る。

二肚盪詐 この項は、本発明のトランスジェニック植物において発現されるＬ肋ｕｒｊ　１ ｅｎｓｉｓ　Ｉ　ＣＰに対する耐性の、標的昆虫における発現の防止のための少 な（とも２つのＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉ、ｓＩ　ＣＰ遺伝子の評価及び 利用に関する一般操作を広範に記載する。一般操作の連続工程の非網羅的一覧表 を、この方法を基礎とし、そして本発明を説明する特定の実施例の後に付記する 。

本発明によれば、特定のＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰは、表２（ これは、実施例の後に付記する）に記載のようなそれぞれの系統から、慣用的方 法で単離し得る。これらのＩＣＰは、慣用的方法におけるこれらのＩＣＰに特異 的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製するために用い得る（Ｈｏｆ ｔｅ　ｅｔ　ａｉ、。

１９８８）。

ＩＣＰ遺伝子は、慣用的方法で、そわぞれの系統から、各々単離し得る。好まし くは、■ＣＰ遺伝子は：それぞれの系統からの全ＤＮＡを適当な制限酵素で消化 し；そのように産生されたＤＮＡ分画を５〜１０ｋｂのＤＮＡ分画中にサイズ分 別し：このような分画を適当なりローニングベクター（例えば受入れ番号４７１ １番で、１９８８年７月１３日にＤｅｕｔｓｃｈｅＳａａｌｌｎｌｕｎｇ　ｖｏ ｎ　ＭＬｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　ＺｅＨｅｕｌｔｕｒｅｎじＤＳ Ｍ＋）、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　 ｏｆＧｅｒｍａｎｙに寄託されたｐＥｃｏＲ２５１）に結紮し；Ｅ、　ｃｏｌｔ をそのクローニングベクターで形質転換し２て；そしてそのクローンを適当なり ＮＡプローブでスクリーニングすることによって、各々が確認される。ＤＮＡプ ローブは、精製蛋白質の気相スクリーニングによって決定されるＮ末端アミノ酸 配列に基づく場合のように、鞘翅類又は鱗翅類に対する結晶プロトキシンをコー ドする種々のＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ遺伝子中に一般に存在する高度 保存領域から構築され得る（欧州特許出願第８８４０２１１５．５号）。

あるいは、そわぞれの系統の総ＤＮＡから調製される所望の断片は、適当な発現 ベクター（例えば、ｊ２ａｃプロモータの制御下で挿入物を有するｐＵＣベクタ ー（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５））に結紮され 、そしてＥ、　ｃｏｌｔ中で形質転換され得るが、その後、このクローンを、そ の系統によって産生された毒素に対して生じたモノクローナル又はポリクローナ ル抗体を用いる毒素の発現に関する慣用的コロ、−一免疫ブローブ法（Ｆｒｅｎ ｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）によってスクリーニングし得る。

つぎに、単離Ｂ、　ｍ９．”、”、’＝”　Ｉ　（：、　ｒ遺イ云了を、七分公 知の手法を用いて（例えばＭａｘａｎ）ａｎＪ　Ｇｉ、、１ｂｅｒｔ。

１９８０）、慣用的方法で、シーケンシングし得る。

現在、いくつかのＩＣＰ遺伝子が、Ｌ ｔ、ｈｕｒｔｎ　ｔｅｎｓｉｓの異なる亜種からクローン化されている（表２） 。これらのＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子のいくつかからの ヌクレオチド配列が報告されている。い（つかの配列は同じであるか又はほぼ同 じであって、同−遺伝子又は同一遺伝子のわずかな変異体を表わすが、一方、い くつかの配列は実質的異質性を示し、そして種々の１３．　ｊ１１ｕ１＝ｉ１１ １ｅｎｓｉｓｌ　ＣＰ遺伝子の存在を明示する。証拠のいくつかの方向は、これ らの遺伝子が全て、一群の関連する殺虫蛋白質を特定することを示唆している。

それらの結晶の蛋白質組成を測定することにより、ポリクローナル抗血清又は精 製結晶に対するモノクローナル体を用いた免疫検出法により、あるいは遺伝子特 異性プローブを用いることによって、異なるＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ 系統におけ６Ｂ、印五上工匡匣且ＩＣＰを分析すると、Ｌ止■Ｐｌ匡坦鳥の亜種 は、異なる種類に属する３つまでの関連Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　 ＣＰ遺伝子を含有し得ることが示される（Ｋｒｏｎｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９１３３）。

組み換え蛋白質の精製及び同定のために異種の宿主中で単離され、同定された遺 伝子を発現するために、好ましい生物は大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌ ｉである。Ｅ。

ｃｏｌｉにおける異種遺伝子の発現増強に関する多数の発現ベクターが記載され ている（例えば、Ｒｅｍａｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１）、通常、遺伝子は 、ラムダｐＬ又はｐＲブロモーク（例えば、Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ　ａｎｄＺａｂ ｅａｕ、　１９８７）　、　１２　ａ　ｃプロモータ（例えば、Ｆｕｌ、１ｅｒ 、　１９８２）　、あるいはｔａｃプロモータ（例えば、Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ 　ａｉ、、　１９８３）のような強力な調節可能なプロモータの制御下で、但し 、適当な翻訳開始部位で（例えば、５ｔａｎｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ ５及び１９８７）、　クローン化される。Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ ＣＰ遺伝子の遺伝子カセットは、例えば、５ｔａｎｓｓｅｎｓ等（１９８５及び １９８７）により記載された手法に従って、部位指示性変異誘発によって生じ得 る。これによって、カセットは、例えばＩＣＰの毒性コア（即ち毒素）をコード する切形ＩＣＰ遺伝子断片、あるいは毒性コア及び選択可能なマーカーをコード するハイブリッド遺伝子を、ＥＰＡ８８４０２２４１９に記載された手法に従っ て、包含し得る。

組み換えＩＣＰを産生ずるよう誘導されてきたＥ。

ｃｏｌｉ培養の細胞を採集する。組み換えＩＣＰを産生ずるよう細胞を誘導する ために用いた方法は、プロモータの選択によるものである。例えば、βａＣプロ モータ（Ｆｕｌｌｅｒ、　１９８２）は、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト −ピラノシド（“Ｉ　ＰＴＧ”）によって誘導される；ｐＬプロモータは、温度 ショックによって誘導される（Ｂｅｒｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９）　 ｅ組み換えＩＣＰは、通常、不溶性封入体として細胞中に析出する（Ｈｓｕｉｎ ｇ　ａｎｄ　Ｂｅｃｋｅｒ、　１９８８）。細胞を溶解して、その封入体を遊離 させる。多量のＥ、　ｃｏｌｉ蛋白質を、その後の洗浄工程で除去する。半精製 プロトキシンペレットが得られ、これから、プロトキシンをアルカリ性緩衝液（ 例えば、Ｎ　ａｔ　ＣＯｓ　、ｐＨ１０）に溶解し得る。その他の組み換え毒素 にも適用可能なＩＣＰＢｔ２に関する操作は、Ｈｏｆｔｅ等（１９８６）が記載 している。

本発明によれば、種々の昆主橋の円柱状中隔上皮細胞の刷子縁膜上のＩＣＰ受容 体と種々のＩＣＰとの結合が研究されてきた。刷子縁膜は各々のＩＣＰの第一標 的であって、優先的に刷子縁膜から生じる膜小胞が、Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅ ｒ等（１９８７）に従って得られる。

１つ又はそれ以上のＩＣＰ（例えば、ＩＣＰ　Ａ、ＩＣＰ　Ｂ等）のＩＣＰ受容 体との結合は、以下の工程によって同定される（　Ｈｏｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａ’ １．　。

１９８８ｂ　）　： １、ＩＣＰＡを、適当なマーカー（通常ＩＺｓＩ（７）ような放射性同位元素） で標識する。

２、刷子縁膜を、種々の濃度の非標識化ＩＣＰＡ（好ましくは１０−”Ｍ未満〜 １１−’Ｍ）とともに、少量の（好ましくば１０−”Ｍ未満）標識化ＩＣＰＡを 用いてインキュベートする。

３、試験される全濃度に関して、刷子縁膜と結合した標識化ＩＣＰ　Ａの量を測 定する。

４、これらのデータの数学的分析により、結合部位の集団の大きさといったよう なＩＣＰ受容体の種々の特性を算出できる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、　１９４９） 。

５、その他の毒素（例えばＩＣＰ　Ｂ）による競合は、好ましくは同量の標識化 ＩＣＰ　Ａを刷子縁膜とともに、異なる量のＩＣＰＢ（優先的にＩＱ−１１〜１ ０−＠Ｍ　、その後工程３及び４を反復する）を組み合わせて、インキュベート することによって調べる。

この操作によって、例えば、Ｂｔ３毒素、Ｂｔ２毒素及びＢｔ７３毒素が、Ｍａ ｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ及びＨｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに対する 競合的結合性抗鱗翅類ＩＣＰであることが判明した（以下の実施例６参照）。毒 素のその他の種々の組み合わせは、非競合的結合抗鱗翅類又は抗鞘翅類毒素であ ることが判明している（実施例６）。

ＩＣＰ結合の競合性対非競合性という概念は、それ自体、いかなる実際的重要性 も有していないけれども、同一標的昆虫に対して活性な２つのＬ肋匹立１国坦堕 Ｉ　ＣＰの非競合性の観察は、非常に有意の実際的使用に向けられる。これは、 ２つの非競合的結合Ｂ、　ｔｈｕｒＬｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰの組み合わせを 用いると、標的昆虫による、このようなＬｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ に対する耐性の発現を防止し得るためである。

Ｂｔ２毒素、Ｂｔ１８毒素、そしてＢｔ２及びＢｔ１８毒素の混合物を用いたＭ 、　５ｅｘｔａに関する淘汰実験から、Ｂｔ２及びＢｔ１８は２つの非競合的結 合抗鱗翅類毒素であることか示された。２０世代淘ｉ大後、Ｂｔ２又はＢ　ｔ、 　１８のみを用いた淘汰実験において、ＩＣＰ感受性の非常に顕著な低減が観察 された（＞　１００倍）。Ｂｔ２−Ｂｔ１８混合物を用いた淘汰実験における感 受性の低減は、取るに足りぬものにすぎなかった（３倍）。これは、ＩＣＰ遺伝 子で形質転換されたトランスジェニック植物の使用に伴って存在する高淘汰圧を 模した状況における２つの非競合的結合ＩＣＰの同時使用の予期せぬ実際的利益 を立証している。この点に関しては、２つの耐性系統はＢｔ２又はＢｔ１８毒素 に対する受容体部位の特異的損失を示した。各々の場合、淘汰には用いられなか った毒素に対する受容体部位は、影響を受けなかったか、あるいはそれらの濃度 は増大さえした。したが・〕て、Ｂｔ２淘汰系統はそのＢｔ１８受容体を保持し 、そしｆＢｔ１８淘汰系統はＢｔ２受容体数の増加を発現した。事実、Ｂｔ１ｇ 淘汰系統は、そのＢｔ２受容体１度の増大に伴って、Ｂｔ２に対する感受性増大 を示し７た。受容体部位における有意の変化は、併用毒素に対して淘汰された系 統においては認められなかった。これらの所見は、以下の実施例７に詳細に記載 する。

Ｂｔに対する耐性の同様の機序は、コナガ（ｄｉａｎ＋ｏｎｄｂａｃｋ　ｍｏｔ ｈ）の株、Ｐｌｕｔｅｌｌａ　陸比旦旦」に関して観察さｔｚている。この系統 ば、Ｂｔ　ＨＤ−１系の市販の処方物であるＤｉｐｅｌに対して、田畑で耐性を 発現した。Ｄｉｐｅｌの結晶は、競合的結合ＩＣＰであるＢｔ２、Ｂｔ３及びＢ ｔ７３蛋白質と同様の、いくつかのＢｔ　ＩＣＰの混合物から成る。Ｂｔ２及び Ｂｔ５を用いた昆虫バイオアッセイ及び競合結合研究の両方によって示されるよ うに、Ｄｉｐｅｌ耐性コナガ系統は、Ｂｔ２プロトキシン及びＢｔ毒素に耐性で あるが、しかしＢｔ１５プロトキシン及びＢｔ１５毒素に対しては十分な感受性 を保持する。この所見は、それらの共通の標的昆虫に対して同様の有益な効果を 有することが予期される非競合的結合抗鱗翅類又は抗鞘翅類ＩＣＰのぞの他の組 み合わせに当てはまる。

ゆえに、非競合的結合ＩＣＰの組み合わせは、トランスジェニック植物において 直接発現される場合は、該植物において発現されるＩＣＰに対する昆虫耐性の発 現の機会を低減するという実質的利益を与ぶる６２つの毒素の合わさったスペク トルは植物において発現される単−ＩＣＰのスペクトルよりも広い可能性がある ため、付加的利益が認められる（以下の実施例８．９及び１０参照）。

２つの競合的結合ＩＣＰの間で、指定された標的昆虫に対して一方が他方よりも 大きな結合部位集団を萄する場合には、より大きな結合部位集団を有する力を用 いて、最も安定な非競合的結合Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩＣＰと組み 合わせて標的害虫を制御するのが最も有益である。例えば、実施例６から分かる ように、Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに対しては、Ｂｔ２又はＢｔ ３よりむしろＢｔ７３を用いるのが好ましく、そして。

Ｍａｎｄｕｅａ　５ｅｘｔａに対（、、ては、Ｂｔ２又はＢｔ７３よりもＢｔ３ を用いるのが好ましい。つぎに、淘汰遺伝子を最も適した非競合的結合ＩＣＰと 組み合わせ得る。

従来は、植物の形質転換は、植物ゲノム中で同一プラスミド内で、単−ＩＣＰ遺 伝子とともにマーカー遺伝子の挿入を包含していた（例えば、Ｖａｅｃｋ　ｅｔ 　ａｌ、、。

１９８７；　Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）。このようなキメ ラＩＣＰ遺伝子は、通常、全ての又は一部のＩＣＰ遺伝子、好ましくは、ネオマ イシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子のような、淘汰可能 なマーカー遺伝子に融合した、毒性コアをコードする切形ＩＣＰ遺伝子断片を包 含する。キメラＩ　ＣＦ’遺伝子は、−−Ｔ　ｉ−プラスミド媒介形質転換のた めにＴ−ＤＮＡ縁反復（ｂｏｒｄｅｒ　ｒｅｐｅａｔｓ）間に置かれた（欧州特 許第０Ｉ９３２５９号）。

本発明は、トランスジェニック植物における２つ又はそれ以上の場合さえあるＢ 、　ｔｈｉ　Ｉ　ＣＰ遺伝子の併用発現を包含する。標的昆主橋に対する２・つ の非競合的結合ＩＣＰをコードする、好ましくはそれぞれの切形ＩＣＰ遺伝子を コードする、殺虫的に有効なり、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子 を、植物細胞における遺伝子の発現を指示し得るプロモータの下流に挿入された 遺伝子が存在し、その制御下にあるように、植物ゲノム中に、好ましくはその核 ゲノム中に挿入する。これは、好ましくは、同一転写単位で、各々が少な（ども １つのＩＣＰ遺伝子；好ましくはマーカー遺伝子−並びに、キメラ遺伝子におけ る任意の２つのＩＣＰ遺伝子間の枠内に挿入されるプロテアーゼ（例えばトリプ シン）−感受性又は−切断可能蛋白質部分をコードするＤＮＡ配列を任意に含有 する１つ又はそ２１以上のキメラ遺伝子を、植物細胞ゲノムに挿入することによ って達成する。各キメラ遺伝子はさらに、植物細胞におけるそのＩＣＰ遺伝子の 発現を指示し得る少なくとも１つのプロモータを含有する。

本発明のキメラ遺伝子に対する適当なプロモータの選択は重大ではない。このよ うなキメラ遺伝子に対する好ましいプロモータとしては：カリフラワーモザイク ウイルスから得られる強力な構成３５Ｓプロモータ、単離体ＣＭ　１８４１　（ Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１）、ＣａｂｂＢ　−Ｓ　（Ｆｒａｎ ｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）、及びＣａｂｂＢ−Ｊ　Ｉ　（Ｈｕｌｌ　ａ ｎｄ　Ｈｏｗｅｌｌ、　１９８７）　；　Ｔ　ｉ−プラスミドのツバリンシンテ ターゼ遺伝子のプロモータ（”　Ｐ　Ｎ　ＯＳ　”　）　（）ｔｅｒｒｅｒａ− Ｅｓｔｒｅｌｌａ、　１９８３）　；オクトビンシターゼ遺伝子のプロモータ（ “ｐｏｃｓ“［Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２］）　：そして、 Ｔ−ＤＮＡのそれぞれ１′及び２′遺伝子の発現を指示する傷誘導性ＴＲＩブロ モーク及びＴＲ２’プロモータ（Ｖｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）、 あるいは、植物のｌっ又はそれ以上の組織又は器官に特異的なプロモータを用い 、それによって挿入遺伝子を特定の組織又は器官の細胞においてのみ発現させ得 る。このようなプロモータの例とし、では、Ａｄｏ、ＩＴ！ｅｔ−シンテターゼ プロモータのような茎特異性プロモータ（Ｐｅｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）　、塊茎特異性プロモータ（Ｒｏｅｈａ−Ｓｏｓａ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）、及び２Ｓプロモータのような種子特異性プロモータ（Ｋｒｅｂｂｅ ｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）がある。ＩＣＰ遺伝子はさらに、欧州特許第 ０１９３２５９号に開示されているように、植物それ自体の、又は豆のような別 の植物体のりブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニ ット遺伝子のプロモータのような光誘導性プロモータの制御下に遺伝子を置（こ とによって、植物（例えばジャガイモ）の葉に選択的に発現され得る。それに代 わるものとしては、その発現が誘導可能な（例えば温度又は化学的因子によって ）プロモータを用いることである。

植物細胞内で、３′末端形成、あるいは植物細胞内の少な（とも１つのＩＣＰ遺 伝子によってコードされるｍＲＮＡ配列の３′末端のポリアデニル化に対して機 能する３′非非翻訳化ＤＮＡ列は、このような各キメラ遺伝子の一部も形成する 。適当な３′非翻訳ＤＮＡ配列の選択は重要ではない。例としては、オクトビン シンターゼ遺伝子、ツバリンシンターゼ遺伝子、又はＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３° 非翻訳末端がある。

本発明のキメラ遺伝子に関するマーカー遺伝子の選択も重要でなく、ＤＮＡ配列 を発現している植物細胞とＤＮＡ配列を発現しない植物細胞とを容易に識別可能 にする蛋白質又はポリペプチドをコードする任意の慣用的ＤＮＡ配列を用い得る （欧州特許第０３４４０２９号）。マーカー遺伝子は、それ自身のプロモータの 制御下に置かれ、そしてマーカー遺伝子がそれが確認するＩＣＰ遺伝子と同じ遺 伝子座にある場合には、上記で開示されたように、それ自身の３′非翻訳ＤＮＡ 配列を有し得る。マーカー遺伝子は、例えば：　ｓｆｒ又は５ｆｒｖ遺伝子のよ うな除草剤耐性遺伝子（ＥＰＡ８７４００１４１）；グリホセートに対する標的 としての修飾５−ＥＰＳＰ　（米国特許第４．５３５．０６０号；欧州特許第０ ２１８５７１号）のような、又はグルタミンシンテターゼ阻害剤に対する標的と しての修飾グルタミンシンテターゼ（欧州特許第０２４０９７２号）のような、 天然（非修飾）標的酵素より低い除草剤に対する親和性を有する除草剤に対する 修飾標的酵素をコードする遺伝子；もしくは、ｎｅｏ遺伝子のような抗生物質耐 性遺伝子（ＰＣＴ出願ＷＯ３４１０２９１３；欧州特許第０１９３２５９号）で あり得る。

しｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓＴ　ｉベクター媒介植物形質転換法を用いて、本発明 の全キメラ遺伝子を、キメラ遺伝子が適当な無力化Ｔｉ−プラスミドベクターの Ｔ−ＤＮＡ縁反復間に置いた後に、植物細胞ゲノム中に挿入し得る（Ｄｅｂｌａ ｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、、　１９８８）ａこの形質転換は、例えば欧州特許第０ １１６７１８号、ＰＣＴ国際出願ＷＯ３４１０２９１３及びＥＰＡ８７４００５ ４４．０に記載されているような慣用的方法で実施し得る。キメラ遺伝子は、直 接遺伝子転移のために用い得る非特異的プラスミドベクター中にも存在し得る（ 例えば、Ｐａｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ｇ４；　Ｄｅ　Ｌａ　Ｐｅ ｎａ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８６）、以下に要約するように、トランスジェニック植物における２つのＢ 、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子の併用発現を得るために、異な る慣用的手法を後に実施してもよい。

１．２つ　は　れν　のＩＣＰ゛　−びマーカーｌ旦玉ＡλＮＡの　−と　て　 ゲノムに　させて、ゲノムの　−′　に　させるキメラ゛　−１Ａ勝 Ｉａ、゛　は、１　のプロモータの　１　でなる　＼で　され′る ２つ又はそれ以上のＩＣＰ遺伝子及びマーカー遺伝子を別々の転写単位として発 現するために、植物細胞における発現を指示するい（つかのプロモータ断片を、 上述のように用い得る。あるＩＣＰ遺伝子に関するキメラ構築物においては、上 記プロモータの全ての組み合わせが可能である。このような個々のキメラ構築物 の例は、ｂｔ２遺伝子に関しては欧州特許第０１９３２５９号に、ｂｔ１３遺伝 子に関してはＥＰＡ８８４０２１１５．５に、モしてｂｔ１８遺伝子に関しては ＥＰＡ８８４０２２４１．９に記載されている。本発明の各キメラ遺伝子中のＩ ＣＰ遺伝子は、無傷ＩＣＰ遺伝子であるか又は、好ましくは無傷ＩＣＰ遺伝子の 殺虫的に有効な部分、特にＩＣＰの毒性コアをコードする切形遺伝子断片であり 得る。個々のキメラ遺伝子は、標準操作（例えば欧州特許第０１９３２５９号） によって、同一プラスミドベクター中でクローン化する。

Ｉｂ、２つの゛　五　１えば工ＣＰ゛伝　とマーカー゛　、　は２つのＩＣＰ゛ 　−るいはれν　の゛　−、Ｂ−１で　し′る 同一転写単位で２つ又はそれ以上のＩＣＰ遺伝子を発現するために、以下の場合 を識別する：第一の場合では、ある遺伝子のコーディング領域が別の遺伝子のコ ーディング領域と融合するフレーム内にあるハイブリッド遺伝子を単一プロモー タの制御下に置く。融合は、ＩＣＰ遺伝子とマーカー遺伝子との間、又は２つの ＩＣＰ遺伝子間でなされ得る。ＩＣＰ遺伝子−マーカー遺伝子融合の例は、欧州 特許第０１、９３２５９号に記載されている（即ち、Ｂｔ２毒素−ＮＰＴＩＩ融 合蛋白質をコードするハイブリッド切形ｂｔ２−ｎｅｏ遺伝子）。

別の可能性としては、２つのＩＣＰ遺伝子の融合がある。依然として殺虫活性を 有するＩＣＰ（即ちプロトキシンの毒性部分）をコードする各遺伝子間には、プ ロテアーゼ（例えばトリプシン）感受性蛋白質部分をコードする遺伝子断片、例 えば標的昆主橋の中隔酵素によって活性化された場合に除去され、又は切断され るＩＣＰの１つのＮ末端又はＣ木端アミノ酸配列の一部をコードする遺伝子断片 が含まれるべきである。

第二の場合においては、２つのそれぞれのＩＣＰ遺伝子のコーディング領域を、 プロモータの制御下におかれたジシストロン単位内で一緒にし得る。２つのＩＣ Ｐ遺伝子のコーディング領域を、一定の長さの遺伝子間配列を用いて相前後して 置く。単一メツセンジャーＲＮＡ分子が生成され、２つの別個の遺伝子物質へと 翻訳されることになる。修正スキャニングモデル（Ｋｏｚａｋ、　１９８７）に 基づいて、上流ＡＴＧを有する枠内終末コドンが下流ＡＴＧ方向に先行すること を条件として、翻訳の再開という概念が受け入れられた。実験データも、植物翻 訳機構がポリシストロンｍＲＮＡからい（つかのポリペプチドを合成し得ること を立証した（Ａｎｇｅｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）。

■、１つ　はそれν　のＩＣＰ゛　−ですでにりされた盲　のゲノムに　される １つ　はそれＶのＩＣＰ゛　を　するキメラ　築 形質転換の第二ラウンドに、形質転換体を選択するための別の系を用いることが できる場合、いくつかの遺伝子は、その後の形質転換工程（再形質転換）中に、 植物細胞中に導入し得る。この再形質転換により、ゲノムの多数の遺伝子座に導 入されるＩＣＰ遺伝子が合同発現される。好ましくは、２つの連続形質転換工程 には、２つの異なる選択可能なマーカー遺伝子を用いる。第一のマーカーは、− 次形質転換において形質転換細胞の選択のために使用し、一方、第二のマーカー は、形質転換の第二ラウンドにおける形質転換体の選択に用いる。カナマイシン 及びヒグロマイシンを用いるその後の形質転換工程は、例えば、５ａｎｄｉｅｒ 等（１９８８）、及びＤａｌａｕｎｅｙ等（１９８８）が記載している。

■、　１した多　におしる１　の植物　のゲノムに１々に転　され、そしてｍ果 ・に六゛にＬ二二監二１１ゲノムに１み　れ　れる１つ　はそれν　の゛　を　 るキメラ　築 最初の植物は、第−ＩＣＰ遺伝子又は自家増殖によってこれから生じるＦ１植物 （好ましくは、ＩＣＰ遺伝子に関して同型接合体であるＦ１植物）で形質転換さ れた植物であるべきである。第二植物体は、第二ＩＣＰ遺伝子又は自家増殖によ ってこれから生じるＦ１植物（好ましくは、第二ＩＣＰ遺伝子に関して同型接合 体であるＦ１植物）で形質転換される植物であるべきである。それらのゲノム中 に存在する２つのＩＣＰ遺伝子を有するそれらの植物を選択するために（例えば サザーンブロッティング）、そして２つのＩＣＰを発現する２つのＩＣＰ遺伝子 を有するそれらの植物を選択するために（例えば、免疫学的に異なるＩＣＰの分 離ＥＬＩＳＡ検出）、この交叉から得られる植物に、選択方法を適用し得る。こ れは、各々異なるＩＣＰ遺伝子で形質転換された２つの親系統からハイブリッド 変異体を産生じ、同様に、同−近交系からの２つの別々の形質転換体（又はそれ らのＦｌ自家増殖子孫）の交叉によって２つの異なるＩＣＰ遺伝子を含有する近 交系を産生ずるために有用な方策である。

皮工五数の゛　−にそれぞれの土凶二盪五王ヱ」ｇ−１６Ｅ＋−ン　におする　 −のゲノムに１々に　される１つ　はそれν　−曵ユエ」５１伝ｌするキメラ　 築 同時形質転換は、一方は第−ＩＣＰ遺伝子を含有し１、他方は第二ＩＣＰ遺伝子 を含有する２つの異なる発現ベクターによる植物体の同時形質転換を意味する。

各ＩＣＰ遺伝子とともに、異なるマーカー遺伝子を用い得るし、そして２つのマ ーカーで同時に選択を行い得る。あるいは、単一マーカーを用いて、２−っのＩ ＣＰ遺伝子を有するそれらの植物を見出すために（例えば、サザーンブロッティ ングによって）、そして２一つの蛋白質を発現するぞねらの植物を見出すために （例えば、Ｅ　Ｔ＝　Ｉ　Ｓ　Ａ法によって）、十分大きな数の選択植物なスク リーニングし得る。１つより多いＴ−ＤＮＡによる同時形質転換は、各々、異な るＴｉ−プラスミドを有する２つの異なる系統ノ狂Ｌｏｂａｃｔ、ｅｒｉｕｍを 同時に用いることによ・）て（Ｄｅｐｉｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５） 、あるいは別々のプラスミド上に２つのＴ−ＤＮＡを含有する１系統のＡ　ｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いて、成し遂げられる。２つのプラスミドを用いる直接 遺伝子転移も、選択可能な、及び非選択可能な遺伝子で植物細胞を同時形質転換 するために用い得る（Ｓｅｈｏｅｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８６）。

得られたトランスジェニック植物は、さらに、植物増殖計画に用い得る。形質転 換植物を自家増殖させて、挿入遺伝子に関して同型接合である植物を得る。

植物が近文系である場合、この同型接合植物を用いて、直接、又はハイブリッド 変種のための親系統として、種子を産生ずる。遺伝子はさらに、慣用植物の増殖 アプローチを用いて、開放授粉集団中に、又は同一植物のその他の近交系中に交 叉可能である。

もちろん、その他の形質転換方法を用い得るし、これは、それらが２つのそれ以 上の非競合的結合ＩＣＰを発現する植物を生じる限りは、本発明の範囲内である 。この点に関しては、本発明は、非競合的結合ＩＣＰをコードする遺伝子で植物 細胞を形質転換するためには、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ　ｉ−プラスミ ドの使用に限定されない。エレクトロポレーションのような、あるいは植物ウィ ルス又は花粉に基づくベクター系を用いるといったような植物細胞形質転換のた めのその他の公知の方法は、２つの非競合的結合ＩＣＰを発現する植物を得るた めに、単子葉植物及び双子葉植物を形質転換するのに用い得る。さらに、本明細 書に開示された以外の２つの非競合的結合ＩＣＰをコードするＤＮＡ配列が、植 物を形質転換するために用い得る。

さらに、本明細書に記載されたＩＣＰ遺伝子は各々、遺伝コードの縮重を考慮し た場合、等価のＤＮＡ配列によってコードされ得る。さらに、ＩＣＰ遺伝子の突 然変異によって得られるような変化したアミノ酸を２〜３個だけ有する等価ＩＣ Ｐも、それらが必然的に同一特性（例えば殺虫活性及び受容体結合）を有する蛋 白質をコードする場合には、用い得る。

以下の実施例で、本発明をさらに説明する。しかしながら、形質転換植物におい て発現されるＬｔｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓに対する耐性の、標的昆虫における発 現を防止するために、本発明によって、２つ又はそれ以上の非競合的結合Ｂ、　 ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＩ　ＣＰ遺伝子のその他の組み合わせを用いて植物 を形質転換し得ることを、当業者は認識するものと思われる。別記されない限り 、ＤＮＡを作製し、そして取り扱うための操作は、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（”Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９ｇ ２）に記載された標準操作によって実施した。

□１：′の 本実施例の目的である、ＩＣＰをコードする抗鱗翅類及び抗鞘翅類Ｂｔ遺伝子の 収集を、表２（実施例の後に付記した）に記載する。それぞれの遺伝子に関する 参考文献も表２に示す。発表されていないＢｔ遺伝子の起源、単離及び特性を以 下に示す、ＨＤ−１、ＨＤ−６８、ＨＤ−１１０及びＨＤ−７３系といったよう なりｔ株は、ｔｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｕｌｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ａｇｒｉｃ ｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｅｏｒｉａ。

１１１ｉｎｏｉｓ　６１６０４．　Ｕ、Ｓ、Ａ、から公けに販売されている。

ｔ３ 遺伝子：　Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉＨ Ｄ　−１から、そのＩＣＰをクローン化した。この遺伝子の特性表示によって、 １３３　ｋＤａのプロトキシンをコードする３、５２８ｂｐの読み取り枠が明ら かになった。この遺伝子は、５ｃｈｎｅｐｔ等（１９８５）が記載したものと同 じであった。

ｔ７３ 遺伝子：　Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ＨＤ　−７３から、 そのＩＣＰをＡｄａｎｇ等（１９８５）が記載したようにして、クローン化した 。

ｔ４ 遺伝子：　Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ａｉｚａｗａｉＨＤ　−６８株 の全ＤＡＮから、ゲノムライブラリーを調製した。プローブとしてｂｔ２遺伝子 の１．ｌｋｂ内部Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を用いて、ｂｔ４と命名された遺伝子を単 離した。この遺伝子の特性表示によって、１３２　ｋＤａのプロトキシン及び６ ０　ｋＤａのトリプシン活性化トキシン断片をコードする３、４９５ｂｐの読み 取り枠が明らかになった。この（昆虫制御蛋白質）遺伝子は、過去に確認された 遺伝子とは異なるものであって、さらに、ＨＤ−１１０を含めた亜種ａｉｚａｗ ａｉ及びｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓの他のいくつかの株においても見出された。図 １３は、ヌクレオチド２６４からヌクレオチド３７６１までの範囲のｂｔ４遺伝 子の読み取り枠（“ＯＲＦ”）のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す 。

ｂｔ１４及びｂｔ１５ 遺伝子二全Ｌ）ＮＡの部分的５ａｕ３Ａ消化及びベクターｐＥｃｏＲ２５１（寄 託番号４７１１としてＤＳＭに寄託）でクローニングによって、Ｌｔｈｕｒｉｎ 　１ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓ　ＨＤ　−１１０系統の全 ＤＮＡからゲノムライブラリーを調製した。モノクローナル抗体（Ｈｏｆｔｅ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）を用いて、少なくとも３つの構造的に異なるＩＣＰ を、Ｌｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓＨＤ　−１１０の 結晶中で確認した。これらのモノクローナル抗体を用いて、このＢ、　ｔｈｕｒ ｉｎ　１ｅｎｓｉｓ株から３つの異なるＩＣＰ遺伝子をクローン化した。これら の遺伝子の１つが、上記のｂｔ４遺伝子である。

二番目の遺伝子を“ｂｔ１５”と名づけだ。図１４は、）（Ｄ−１１０から単離 された、ヌクレオチド２３４からヌクレオチド３８０３まで拡がるｂｔ１５遺伝 子のＯＲＦのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。開始コドンに先行 する５ｈｉｎｅ及びＤａ１ｇａｒｎｏ配列はアンダーラインを付しである。この 遺伝子は、１３５ｋＤδのプロトキシン及び６３　ｋＤａのトキシン断片をコー ドする３、５７６１）ｐの読み取り枠を有する。同様の遺伝子は、Ｈｏｎｅｅ等 （１９８８）によって記載されており、これは、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　ｉｅｎｓ ｉｓｅｎｔｏｍｏｃＬｄｕｓ６０　、　５から単離されたものであった。ｂｔ１ ５遺伝子は、発表された配列とは、３つの位置で異なる：Ａｊ２ａコドン（Ｇ　 ＣＡ　）は９２５位置のＡｒｇコドン（ＣＧＡ）の代わりに存在し、Ｔｈｒ−Ｈ ｆｓコドンの連続（ＡＣＣＧＡＴ）は１４００位置のＴｈｒ−Ａｓｐコドン（Ａ ＣＣＧＡＴ）の代わりに存在する（位置の数値はＨｏｎｎｅｅ等、１９８８によ る）。別の同様の遺伝子が、欧州特許第０２９５１５６号に記載されており、こ れはＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ａｉｚａｗａｉ７−２９及びｅｎｔｏ ｍｏｃｉｄｕｓ　６−０１から単離されたものである。

ｂｔ１５遺伝子は、この発表されたヌクレオチド配列とは、次の３つの位置で異 なる：　１）７００位置のＡβａコドン（ＧＣＡ）の代わりにＧ４ｕコドン（Ｇ ＡＡ）；２）１４５６位雪の配列ＴＧＣ１ＣＡＧ、ＣＧＣ，ＣＡＣ，ＣＡＴの代 わりに配列ＴＧＧ、ＣＣＡ、ＧＣＧ、ＣＣＡ、モして３）２６５４位置のＡρａ コドン（ＧＣＧ）の代わりにＡｒｇコドン（ＣＧＴ）（位置の数値は欧州特許第 ０２９５１５６号による）。

単離された第三の遺伝子は“ｂｔ１４”と呼ばれた。これは、１３７ｋＤａのプ ロトキシン及び６６ｋＤａの活性化毒素断片をコードする３、６２１ｂｐの読み 取り枠を有する。同様の遺伝子は、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓＨＤ−２ からクローン化されている（　Ｂｒ１ｚｚａｒｄ　ａｎｄＷｈｉｔｅｌｅｙ、　 １９８ｇ）。ｂｔ１４遺伝子は、発表済配列とは、２つのヌクレオチド置換によ って異なる：１２６位置のＣの代わりにＴ、４４８位置のＴの代わりにＣ（位置 の数値はＢｒ１ｚｚａｒｄ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、　１９８ｇによる）、 第一の場合は、ｌｌ２ｅコドン（ＡＴＴ又はＡＴＣ）が保存され、一方、第二の 場合にはＴｙｒコドン（ＴＡＴ）がＨｉｓコドン（ＣＡＣ）に転化される。

ｔ２ 遺伝子：欧州特許第０１９３２５９号に記載されたように、ｂｔ２遺伝子をクロ ーン化した。

ｔｉｓ 遺伝子：ＥＰＡ８８４０２２４１．９に記載されたヨウニ、ｂｔｉｓ遺伝子のク ローンニングを実施した。

ｔ１３ 遺伝子：　ＥＰＡ８８４０２１１５．５に記載されたように、ｂｔ１３遺伝子を クローンニングした。

ｂｔ２１及びｂｔ２２ 遺伝子：鞘翅類活性ＩＣＰをコードするこれらの遺伝子は、ＥＰＡ８９４００４ ２８．２に記載されタヨうにクローニングした。

及五皿主：゛　カセットの　びＥ、　ｃｏｌｉにお番るＢｒ゛　の １）ｂｔ２、ｂｔ１８：ｂｔ２及びｂｔ１８遺伝子カセットの構築は過去に、Ｅ ＰＡ８６３００２９１．１及び８８４０２２４１．９にそれぞれ記載されている 。基本的には、それらは、毒性コアをコードする切形遺伝子及びｎｅｏ遺伝子の Ｎ末端と枠内で融合する切形遺伝子から成るハイブリッド遺伝子を包含する。本 遺伝子カセットを用いて、Ｅ。

ｃｏｌｉ形質転換し、Ｂｒ２及びＢｔ１８ＩＣＰ毒素を発現する。

２）ｂｔ１４　、　ｂｔ１５：ＥＰＡ ８８４０２２４１．９に記載されたようにｂｔ１４及びｂｔ１５に関する遺伝子 カセットを、Ｅ、　ｃｏｌｉ中及び植物中で遺伝子を発現させるために構築した 。

先ず、Ｎｃｏ　Ｉ部位を、部位支配突然変異生成によって本遺伝子のＮ末端に導 入した。

ｂｔ１５遺伝子の場合、ＡＴＧコドン直前のＴＴヌクレオチドのＣＣへの転化は 、ＡＴＧ開始コドンと重複するＮｃｏ　Ｉ部位を生じてこの部位を、ｐＭａ／Ｃ ベクターを用いて、部位支配突然変異生成（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９＋＋７）　、そして以下の配列を有する２８−ｍａｒオリゴヌクレオチ ドのために導入した： ５　’　−ＣＧＧＡＧＧＴＡ、ＴＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＴＣ−３ ′。

これは、ＡＴＧ開始コドンにＮｃｏ　Ｉ部位を有するｂｔ１５遺伝子のＮ末端断 片を保有するプラスミドｐＶＥ２９を産生じた。

Ｂｒ１ｚｚａｒｄとＷｈｉｔｅｌｅｙ　（１９８８）によれば、Ｉ）　ｔ１４遺 伝子の開始コドンはＴ　Ｔ　Ｇコドンである。したがって、Ｎｃｏ　Ｉ部位は、 以下の配列：５　′−ＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＣＣＴＣ ＣＴＴＴＴＡＴＧ−３’ を有する３４−ｍａｒオリゴヌクレオチドを用いて、部位支配突然変異生成のた めこのコドンで、同様の方法で生成された。この場合、開始コドン配列は、Ａ　 Ｔ　Ａ　Ｔ　−ｆ”　Ｇ　ＡからＡ　ＣＣＡ　Ｔ’　Ｇ　Ｇに転化された。

これは、開始コドンにＮｃｏ　１部位を宵するｂｔ１４遺伝子のＮ末端断片を保 有するプラスミドｐ　ＨＷ　４４を生じた。

第２工程では、Ｎ−末端遺伝子断片を適当なＣ末端遺伝子断片で結紮して、ＡＴ Ｇ開始コドンにＮｃｏ　Ｉ部位を有するｂｔ１５遺伝子及びｂｔ１４遺伝子を産 生ずることによって、遺伝子を再構築した。

１：、　ｃｏｌｉにおいてプロトキシンをコードするｂｔ１４及びｂｔ１５遺伝 子を発現するために、以下の構築物を作製した：　ｎａｃプロモータの制御下で ｂｔ１５遺伝子を含有するｐＯＨ５０、及びｔａｃプロモータの制御下で、ｂｔ １４遺伝子を含有するｐＨＷ６７゜それぞれのプラスミドを有するＥ、　ｃｏｌ ｉ　Ｗ　Ｋ　６系の培養をＩ　ＰＴＧで誘導して、過剰産生蛋白質を生じた（Ｆ ｕｌｌ、ｅｒ、　１９８２）。

ｂｔ１５及びｂｔ１４プロトキシンの活性毒素断片は、それぞれ、６３及び６０ 　ｋＤａのトリプシン消化物質を包含する。全ｂｔ１５又はｂｔ１４遺伝子を発 現させる代わりに、毒素コーディング遺伝子断片又はその誘導体を植物体中で発 現させることもできる。この目的のために、切形ｂｔ１４及びｂｔ１５遺伝子断 片を構築した。ＩＣＰ遺伝子物質を産生ずるトランスジェニック植物を選択する ことを可能にするためには、切形遺伝子断片のハリブリッド遺伝子も、欧州特許 第０１９３２５９号に記載されているように、選択可能マーカーをコードするｎ ｅｏ遺伝子を用いて作製した。

１）　ｔ　４、ｂｔ１４及びｂ　ｔ　１．５遺伝子のそれぞれのヌクレオチド配 列をｂｔ２及びｂｔ８遺伝子のそれぞれと比較することにより、Ｂｃｊ２Ｉ部位 は、毒素遺伝子断片をコードするコーディング配列の下流に位置する適当な位置 であると確認された。切形遺伝子断片及び、切形遺伝子断片とｎｅｏ遺伝子との ハリブリッド遺伝子を構築するために、充填Ｂｅ１Ｎ部位をｐＬＭＭ９１の充填 ＥｃｏＲＩ部位（Ｈｏｆｔｅ　ｅｔａｌ、、　１９８Ｇ）及びｐＬＫ９４の充填 ＨｉｎｄＤ］部位（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｚａｂｅａｕ、　１９８７） にそれぞれ結紮した。ｐＬＫＭ９１は、ｎ　ｅ　Ｏ遺伝子の酵素的に活性なＣ末 端遺伝子断片をコードする５′切形ｎｅｏ遺伝子断片を保有し、モしてｐＬＫ９ ４は、３つの読取り枠内に翻訳停止コドンな含有する。これは、その後、Ｅ。

ｃｏｌｉを形質転換してＩ　Ｃ，Ｐ遺伝子を発現させるために用いる以下のプラ スミドを産生する：切形ｂｔ−ｎｅｏハイブリッド遺伝子を保有するｐＨＷ７１ ；切形ｂｔ１４遺伝子を保有するｐＨＷ７２：切形ｂｔ１５−ｎｅｏハイブリッ ド遺伝子を保有するｐＶＥ３４；そして切形ｂｔ１５遺伝子を保有するｐＶＥ３ ５゜ ｂｔ１４及びｂｔ１５遺伝子に関して記載されたと同様の方法で、その後Ｅ、　 ｃｏｌｉ内で発現するｂｔ３及びｂｔ４遺伝子に関して、遺伝子カセットを構築 した。

３：　み　えＩＣＰの 実施例２においてＥ、　ｃｏｌｉ中で発現された工ＣＰをＨｏｆｔｅらの方法（ 級み換えＢｔ２プロトキシンについて記載）によって精製する。

４：　トキシン　の Ｂｔ２、Ｂｔ３、Ｂｉ７３、Ｂｔ４、Ｂｉ１４、Ｂｔ１５％Ｂｔ１８、Ｂｉ１２ 、Ｂｔ２１及びＢｉ１２の可溶化プロトキシン（Ｎａｇ　ＣＯｓ　５０ｍＭ、Ｄ ＴＴ　１０ｍＭ、　ｐＨ＝　１０中）をｐＨ８で０．５％（ＮＨ４）！　ｃｏｓ に対して透析して、トリプシン（トリプシン／プロトキシン＝　１　／　２０　 ｗ　／　ｗ　）で、３７℃で２時間処理する。活性化毒素を、Ｈｏｆｍａｎｒｒ 等（１９８８ｂ）が記載したようにクロマトグラフィ処理によって精製する（Ｆ ＰＬＣ上のＭｏｎｏ−Ｑカラム）。

５：８　スペクトルの１ 実施例３及び４の１ＣＰプロトキシン及び毒素を、それらの殺虫活性に関して評 価する。各々のプロトキシンを還元剤を含有するアルカリ性緩衝液（Ｎ　ａ、　 Ｃｏ、　５０ｄ、　ＤＴＴ　１０ｍＭ、　ｐＨ＝　ｌ　Ｏ）に溶解し、そして各 毒素をＦＰＬＣから直接、可溶性蛋白質として用いる。蛋白質濃度を測定する。

次に、その結果生じたプロトキシン又は毒素溶液の希釈液を、０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃｌ２及びｏ、ｉ％ウシ血清アルブミン（“ＢＳＡ”）を含有するＰＢＳ緩衝液 ｐＨ７，４中に調製する。

Ｂｅ１ｌとＪｏａｃｈｉｍ（１９７６）がＭａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａに関して 記載した昆虫培養用人工培地を適当な容器に注ぎ入れて、固形化させる。次に、 ある量の毒素（プロトキシン）希釈液をこの培地上に入れて、層流下で水分を蒸 発させる。これによって、一定量（０，１〜１０、０００ｎｇ／ｃが）の毒素が その表面を覆った培地が生じる。例えば、Ｂｔ２毒素に関しては、Ｍａｎｄｕｃ ａｓｅｘｔａに関する毒性試験のための一般的希釈液は、１．５．２５．１２５ 及び６２５ｎｇ／ｃがである。Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａの第−齢幼虫をつぎ に被覆培地に入れて、６日後の成長及び死亡率を査定する。死亡率は、用量に伴 って増大する。用量−反応データをプロビット分析で分析しくＦｉｎｎｅｙ、　 １９６２）　、そのデータは、昆虫の５０％を殺す毒素の量であるＬＤ、。値で 最もよ（要約される。Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａに対するＢｔ２毒素に関する Ｌ　Ｄ　ｓ　ｏは、約２０　ｎｇ／　ｃｍ”である。

適当な餌を用いて、あるいは昆虫用の葉にＩＣＰを使用して、他の昆主橋に対し て同様の検定を実施するが、この場合、人工飼料は用いない。

６：　Ａ・ 毒素 全てのプロトキシン及びそれらの毒素断片を、Ｈｏｆｔｅ等（１９８６）、及び 欧州特許第０１９３２５９号においてＢｔ２プロトキシン及び毒素に関して記載 された方法によって、精製した。活性化及び精製された毒素はさらに、Ｂｉ２、 Ｂｉ２、Ｂｉ７３、Ｂｉ４、Ｂｉ１４、Ｂｉ１５、Ｂｉ１８、Ｂｉ１３、Ｂｉ２ １及びＢｔ２２毒素と呼ばれる。

Ｂｔ７３毒素に関する実施例により、しｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ　 ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ　７３は６．６ｋｂ型遺伝子によってコード化される１ 　３３　ｋＤａの蛋白質を産生ずることが明示されている。この系の培養を、Ｍ ａｈｉｌｌｏｎとＤｅｌｃｏｕｒ（１９８４）が記載したように増殖させた。自 己分解培養を回転沈降（ＨＢ４０−ター中で４．５０Ｏｒｐｍで２０分）させ、 ２０ｍＭ）リス、１００ｍＭ　ＮａＣｊ２、及び０．０５％トリトンＸ−１００ 、ｐＨ８を含有する緩衝液で洗浄した。最終ベレットをこの緩衝液中に再懸濁し た（１００−培養に対して４−緩衝液）。つぎに、この溶液を線状ウログラフィ ン勾配液（６０〜７０％）上に層にして、これをＳＷ２８０−ター中で、１８． ＯＯＯｒｐｍで９０分、遠心分離した。結晶を収集し、次に使用するまで、−２ ０℃で保存した。Ｈｉ５ｆｔｅ等（１９８６）に従って、活性化を実施した。精 製した毒素はさらに、Ｂｔ７３毒素と呼ばれる。

ＩＣＰのヨ　、 Ｃｈｌｏａ＋ａｔｉｎ　−Ｔ法（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｅｎｗｏｏｄ 、　１９６２）を用いて、Ｂｉ２、Ｂｉ２及びＢｔ７３毒素のヨウ素化処理を実 施した。１ｍＣ１の”Ｊ−ＮａＩ及びＮ　ａ　Ｃ（２／　Ｐ　ｉに溶解した２０ 〜３７．５ｕｇのＣｈｌｏｍａｔｉｎ　−Ｔを５０Ｍｇの精製毒素に加えた。６ ０秒間静かに撹拌した後、Ｈ，Ｏに溶解したメタニ亜硫酸カリウム５３μｇを加 えることによって反応を停止した。全混合物をＰ　Ｄ　Ｉ　Ｏ５ｅｐｈａｃｅｘ Ｇ　−２５Ｍゲル濾過カラムに入れて、遊離ヨウ素を除去した。精製度を増大す るために、ＢｉｏｇｅｌＰ　−６０カラム上で、引き続き処理した。

あるいは、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を用いて、毒素を標識した。Ｉｏｄｏｇｅｎ　（Ｐ ｉｅｒｃｅ）を０．１ｍｇ／−でクロロホルムに溶解した。この溶液１００４を 使い捨てガラス容器中に分取し、窒素気流下で脱水した。この容器をＴｒｉｓ緩 衝液（２０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ８，６５，０，１５Ｍ　ＮａＣｊ２を含む ）で洗浄した。５０Ｍｇの毒素（Ｔｒｉｓ緩衝液中）を１ｍＣ１の　１！６エー Ｎａｌとともに、試験管中で１０分間インキュベートした。つぎに、ＩＭＮａＩ （試料容量の％）を加えることによって、反応を停止させた。試料を直ちにＰ　 Ｄ　１０５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−２５Ｍカラムに入れ、その後ＢｉｏｇｅｌＰ　 −６０カラムに入れて、遊離ヨウ素及び変性したと考えられる物質を除去した。

上記操作の１つを用いて、他の毒素をヨウ素処理した。

ヨウ、、の　ゞ　の゛ ヨウ化Ｂｔ２、Ｂｉ２及びＢｔ７３毒素試料の比活性を、Ｖｏｌｌｅｒ％Ｂｉｄ ｗｅｌｌ及びＢａｒｌｅｔｔ（１９７６）に従って”サンドイッチ”ＥＬＩＳＡ 法を用いて測定した。−次抗体はＢｔ２毒素に対して生じたポリクローナル抗血 清であり、二次抗体はモノクローナル抗体４Ｄ６であった。

使用した接合体は、抗マウスＩｇＧと結合するアルカリ性ホスファターゼであっ た。非標識化毒素の標準希釈液シリーズ、及びヨウ素化毒素試料の希釈液（Ｎａ Ｃｊ２／ＰＬ−０，１％ＢＳＡ中）の反応強度を測定した。線状回帰計算（直線 回帰分析）により放射性毒素試料の蛋白質含量を出した。最大比活性を有する試 料を結合検定に用いた。比活性は、Ｂｔ７３毒素（Ｉｏｄｏｇｅｎ法によって標 識化）、Ｂｔ２毒素（Ｃｈｌｏｍａｔｉｎ−Ｔ法）及びＢｔ３毒素（Ｉｏｄｏｇ ｅｎ法）に関してそれぞれ５９，４００．３３，０００及び１９，８００Ｃｉ／ ｒｎｏＩｅ　（参照日に）であった。

その他の毒素の比活性も同様の手法を用い℃測定した。これらの毒素の各々に対 する特異 的モノクローナル及びポリクローナル抗体が生じ、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を適用した 。

１　ハ　のて　１ 及び巨旦亘朋紐胚ａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａからの刷子縁膜小胞（”ＢＢＭ Ｖ”）を、Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒ等（１９８７）の方法によって調製した 。これは、これらの分画を分離するために、基底外側より、管腔に、より高い密 度の陰性静電荷を用いる示唆遠心方法である。

地含狭ユ １２ｓＩ標準化毒素の、単独でのあるいは種々の量の非標識化毒素と組み合わせ た２通りの試料を、総容量１００４のＴｒｉｓ緩衝液（ＴｒｉｓｌＯｍＭ、１５ ０ｍＭＮａｃｊ２、ｐ＋４７．４）中に溶解した刷子縁膜小胞と一緒に、適温で インキュベートした。緩衝液は全て、０，１％ＢＳＡを含有した。インキュベー ション温度は２０℃であった。Ｗｈａｔｍａｎ　Ｇ　Ｆ　／　Ｆガラス繊維フィ ルターによる限界濾過を用いて、結合物と遊離毒素を分離した。各フィルターは 、５−の水冷緩衝ン夜（ＮａＣｊ２／Ｐｉ−０，１％ＢＳＡ）で直ちに洗浄した 。フィルターの放射能をガンマ計数器（１；　２７５Ｍｉｎｉ−ｇａｍｍａ、、 　Ｌ　Ｋ　Ｂ　）　＊結合データは、ＬＩＧＡＮＤコンピュータプログラムを用 いて分析した。このプログラムは、親和性（Ｋａ又はその逆数のＫｄ＝１　／　 Ｋ　ａ、解離定数）、及び受容体の総濃度又は結合部位濃度（Ｒｔ）が与えられ た場合の、配位子の総濃度の一関数としての配位子の結合濃度を算出する。

１月ｊ」し【以瀝定 精製Ｂｔ２、Ｒｔ３、Ｒｔ７３及びＢｔ１５毒素の蛋白質濃度を、２８０　ｎｍ でのＯＤから算出した（Ｌｌｖｉｋｏｎ　８１０Ｐ、　Ｋｏｎｔｒｏｎ　Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ分析光度計で測定）。その他の毒素の、そして刷子縁膜小胞（ ＢＢＭＶ）の溶液の蛋白質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って測定 した。

Ｒｔ２．Ｂｔ／３　びＲｔ７３　、のＭａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａびＨｅ１ｉｏ ｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓへの、”Ａ：３つの　４・”Ａ−１ＩＣＰの Ｒｔ２、Ｒｔ３及びＢｔ７３毒素は、Ｍａｎｄｕｃａｓｅｘｔａ及びＨｅ１ｉｏ ｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの両方に対して有毒である：　Ｍａｎｄｕｃａ　 ５ｅｘｔａに関するＬＣ，、値はそれぞれ１７．７０．２０．２０及び９　、　 ’ＯＯｎｇ／　ｃｍ２であり；　Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに関 しては、ＬＣ，、は７．１６．９０．００及び１　、６０　ｎｇ／　ｃｒｎ”で ある。

標識化毒素Ｂｔ３　（０，８ｎＭ）、又はＲｔ２（１，０５ｎＭ）又はＢ　ｔ　 ７３　（１、０５ｎＭ）を０．　１−の容量のＢＢＭＶとインキュベートした。

Ｂ　ＢＭＶ蛋白質濃度は、Ｍ、　５ｅｘｔａ及びＢ　ｔ　２−Ｈ，ｖｉｒｅｓｃ ｅｎｓに関しては１００μｇ／′ｌｄ！、Ｂ　ｔ　３−Ｈ，ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ に関しては１５０μｇ／ｄ、Ｂ　ｔ　７３−Ｈ，ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに関しては ５０μｇ／−であった。標識化毒素を、種々の量の非標識化毒素（競合体）と結 合させた。３０分インキュベーション後、結合及び遊離毒素を濾過により分離し た。

第１〜３図は、Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａに関する競合体の濃度の一関数とし てのそれぞれの標識化Ｂｔ２、Ｒｔ３及びＢｔ７３毒素のパーセンテージ結合を 示す。第４〜６図は、Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに関するこれら のデータを示す。競合体の非存在下で結合する量は、常に、１００％結合と解釈 される。第１〜６図は、１″″■−標識化毒素と、Ｍ、　５ｅｘｔａ　（図１． ２及び３）及びＨ，ｖｉｒｅｓｃｅｓｎｓ（図４．５及び６）の刷子縁膜小胞と の結合を示す。小胞を、漸増濃度のＢｔ２毒素（＊）、Ｂｔ３毒素（・）又はＢ ｔ７３毒素（ム）の存在下で、標識化毒素［第１及び４図：　ｌ″Ｊ−Ｂｔ２毒 素（１，０５ｎＭ）；第２及び５図：１ｘ″Ｉ−Ｂｔ３毒素（０，８ｎＭ）　； 第３及び６図、１１１１−　Ｂ　ｔ７３毒素（１，０５ｎＭ）］を用いてインキ ュベートした。結合は、標識化毒素単独でインキュベートした場合に結合する量 のパーセンテージとして表される。Ｍ、　５ｅｘｔａに関しては、これらの量は 、　１２ＳＩ−Ｒｔ２−１　ｌ！Ｓ１３　ｔ　３−及び”’ＩＢｔ７３−毒素に 対してそれぞれ１，８２０．６０１及び２，３８３ｃｐｍ　、　Ｈ，ｖｉｒｅｓ ｃｅｎｓに関しては１，７７５．４７２及び６，６０８ｃｐｍであった。非特異 的結合は消去されなかった。データは、ＬＩＧＡ’ＮＤコンピュータプログラム で分析した。各ポイントは、２通りの試料の平均である。

第１図は、　”’ＩＢｔ２毒素ノＭ、　５ｅｘｔａＢ　Ｅ　Ｍ　Ｖ　ヘの結合を 示す。

第２図は、　”’ＩＢｔ３毒素（７）　Ｍ、　５ｅｘｔａＢ　Ｂ　Ｍ　Ｖ　ヘの 結合を示す。

第３図は、　”’ＩＢｔ７３毒素のＬ肚ム％Ｂ　ＢＭＶへの結合を示す。

第４図は、　”’Ｉ　Ｂ　ｔ　２毒素のＨ，ｖｉｒｅｓｃｅｎｓＢＢＭＶへの結 合を示す。

第５図は、　”’Ｉ　Ｂ　ｔ　３毒素のＨ，ｖｉｒｅｓｃｅｎｓＢＢＭＶへの結 合を示す。

第６図は、　”’ＩＢｔ７３毒素の１．　ｙｉｒｅｓｃｅｎｓＢＢＭＶへの結合 を示す。

第１〜６図から、Ｂｉ２とＢｉ３、Ｂｉ３とＢｉ７３、そしてＢｉ２とＢｉ７３ は、Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａに関して、そしてＨｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒ ｅｓｃｅｎｓに関して、競合的結合ＩＣＰである、と結論される。事実、Ｂｉ３ は、Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａにおける全集団のＢｔ２受容体部位に競合する （第１図）：１０ｎＭのＢｔ３存在下で結合する％標識化Ｂｔ２は、１１００ｎ のＢｉ２それ自体で結合する％Ｂｔ２に等しい。その逆は成り立たない：１１０ ０ｎのＢｉ２の存在下では、標識化Ｂｔ３の％は、１１００ｎのＢｉ３を用いる 場合と同じレベルに低減はしない（第２図）。

同様に、その他の毒素の組み合わせの競合性も観察されると考えられる：　Ｂｉ ３は、Ｍ、　５ｅｘｔａにおけるＢｉ７３の受容体部位の全集団と競合する（第 ３図）；この逆は成り立たない（第２図）：Ｂｉ２及びＢｉ７３は、Ｍ、　５ｅ ｘｔａにおける各々の全集団の各受容体部位と競合する（第１及び３図）。

Ｈ，ｖｉｒｅｓｃｅｎｓにおいては：　Ｂｉ２は、Ｂｉ３の受容体部位の全集団 と競合する（第５図）；Ｂｉ７３は、Ｂｉ３の受容体部位の全集団に競合する（ 第５図）　；Ｂｉ７３は、Ｂｉ２の受容体部位の全集団に競合する（第４図）が 、しかしその逆は成り立たない（第４．５及び６図）。

毒素−受容体複合体の解離定数（Ｋｄ）及び結合部位の濃度（Ｒｆ）を算出する ために、同一データを数学的分析に用い得る（例えば、５ｃａｔｃｈａｒｄ、　 １９４９による５ｃａｔｃｈａｒｄ分析；　Ｍｕｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｄｂａ ｒｄ、　１９８０によるＬＩＧＡＮＤコンピュータプログラムを用いる分析＞　 ；ＬＩＧＡＮＤコンピュータプログラムを用いたこれらの計算を次に示す： Ｂｉ２−Ｍ、　５ｅｘｔａ：　Ｋｄ＝０．４ｎＭ　Ｒｔ＝３．４ｐｍｏ１／ｍｇ 小胞蛋白質 Ｂｉ３−Ｍ、　５ｅｘｔａ：　ＫｄＪ、５ｎＭ　Ｒｔ＝９Ｊｐｍｏｆ／ｍｇ小胞 蛋白質 Ｂｉ７３−Ｍ、　５ｅｘｔａ：　Ｋｄ−０，６ｎＭ　Ｒｔ＝４．Ｏｐｍｏｉ’／ ｍｇ小胞蛋白質 Ｂｉ２−Ｈ，ｖｉｒｅｓｃａｎｓ：　Ｋｄ＝０．６ｎＭ　Ｒｔ＝９．７ｐｍｏＩ ／ｍｇ小胞蛋白質 Ｂｉ３−Ｈ，ｖｉｒｅｓｃａｎｓ：　Ｋｄ＝１．２ｎＭ　Ｒｔ＝３．７ｐｍｏ１ ／ｍｇ小胞蛋白質 Ｂｉ７３−ｊｉ、　ｖｉｒｅｓｃａｎｓ：　Ｋｄ＝０．８ｎＭ　ＲｔＪ９．５ｐ ｍｏｌ／ｍｇ小胞蛋白質 これらのデータは、毒素の高親和性受容体結合を立証する（１０−１０〜１０− ’Ｍの範囲のＫｄ）。

Ｂｉ２　びＢｉ１４　＋と、Ｐ、　ＢｒａｓｓｉｃａｅＰｌｕｔｅｌｌａ　ｘ　 １ｏｓｔｅｌｌａ　びＰｈｔｈｏｒｉｍａｅ　ｏ　ｅｒｃｕｌｌｅｌｌａ（７） ＢＢＭＶと（７）　Ａ：２つ（７）　Ａ　”−ＬΩ旦９１ Ｂｉ２及びＢｔ１４毒素は、以下の表から分かるように、Ｐ、　ｂｒａｓｓｉｃ ａ　（ｐ、ｂ、）、Ｐ、　ｕ匡旦ｅｌｌａ　（ｐ、ｘ、）及びし吐とμ止蛙ハ（ ｐ、ｏ、）に対して有毒である。

毒素のＬＣ，。

Ｂｉ２　Ｂｉ１４ ｐ、　ｃ、　４．２０　０．８−４．０ｐ、　ｘ、に関する可溶化精製Ｂｔ２及 びＢｔ１４毒素のＬ　Ｃｓ。値は、人工飼料の１　ｃｍ”当たりに点在する蛋白 質（ｎｇ）として表わされる。ｐ、　ｂ、に関するＬＣ２゜値は、−齢ｐｂ幼虫 に餌として与えられた葉が浸漬された溶液１−当たりの毒素（μｇ）として表わ される。Ｐ、０゜に関しては、ＬＣ，。値は、摂食前にポテトチップスを浸漬す る溶液ＩＮ１当たりのμｇ数（μｇ／−）として表わされる。

標識化Ｂｔ２毒素（１，０５ｎＭ）又はＢｔ１４毒素（１，４ｎＭ）を、種々の 量の非標識化Ｂｔ２又はＢｉ１４と組み合わせて、０．１−の容量中に溶解した Ｐ、　ｂｒａｓｓｉｃａｅからのＢＢＭＶ　（Ｌｏｏｍ蛋白質／−）とともにイ ンキュベートした。２２℃で３０分間インキュベート後、結合及び遊離毒素を分 離した。

第７及び８図は、　１２１１−標識化毒素とＬｂｒａｓｓｉｃａｅ刷子縁膜小胞 の結合を示す。小胞を、漸増濃度のＢｔ２毒素（０）又はＢｔ１４毒素（・）の 存在下で、標識化毒素［第７における：　”Ｊ−Ｂｔ２毒素（１，０５ｎＭ）； 第８図の：　”Ｊ−Ｂｔ１４毒素（１，４ｎＭ）］とともにインキュベートした 。結合は、標識化毒素のみとインキュベージジンした時に結合した量のパーセン テージとして表わされる。非特異的結合は消去されなかった。データは、Ｌ　Ｎ 　ＧＡＮＤコンピュータプログラムで分析した。各ポイントは、２通りの試料の 平均である。第７図は、標識化Ｂｔ２毒素とＰ、　ｂｒａｓｓｉｃａｅＢ　Ｂ　 Ｍ　Ｖとの結合を示し、そして第８図は、標識化Ｂｔ１４毒素とＰ、　ｂｒａｓ ｓｉｃａｅＢＢＭＶとの結合を示す。

競合データは、Ｂｔ２及びＲｔｌ４の両方に関する高親和性結合部位の存在を立 証すると同時に、Ｂｔ２結合部位に対するＲｔｌ４の競合、そしてＢｔ１４結合 部位に対するＢｔ２の競合がほとんど金（存在しないことを立証している。こｎ は、Ｂｔ２とＲｔｌ４　’が非競合的結合毒素であることを立証している。ゆえ に、それらは、Ｂｒａｓｓｉｃａｅ種で発現されるＬｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉ ｓＩ　ＣＰに対するＰｉｅｒｉｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ耐性の発現を防止するの に有用である。これらの実験から算出されたＫｄ及びＲｆ値を次に示す：ａｔ　 ２：　Ｋｄ＝２．８ｎＭ、　Ｒｔ＝１２．９ｐｍｏＪ／ａ＋ｇ小胞蛋白質Ｂｔ１ ４：　Ｋｄ：８．４ｎＭ、　Ｒｔ＝２１．４ｐｍｏｒ／ｍｇ小胞蛋白質Ｂｔ２７ ７びＲｔｌ５　、のＭ　、　ｓ　ｅ　ｘ　ｔ　ａ　Ｍ　。

ｂｒａｓｓｉｃａｅ　Ｐ、　ｓ　１ｏｓｔｅｌｌａ　、びＰ。

１ｎｔｅｒ　ｕｎｃｔｅｌｌａとの１１Ａ：２つの−　Ａ田糸士Ａ鱗羽１上旦ヱ 五亘 Ｂｔ２及びＢｔ１５１１素は、Ｍ、　５ｅｘｔａに対してともに有毒である（　 Ｌ　Ｃｓ。値はそれぞれ、２０及び１１ｎｇ／ａｍ勺。それらは、Ｍ、　ｂｒａ ｓｓｉｃａｅ、　Ｐ、　ｘ２旦５ｔｅｌｌａ及びＰ、　１ｎｔｅｒ　ｕｎｃｔｅ ｌｌａに対する活性も示す。

標識化Ｂｔ２　（１，０５ｎＭ）又はＲｔｌ５　（０，７ｎＭ）を、種々の量の 非標識化Ｂｔ２又はＲｔｌ５と組み合わせて０．１−の容量中に溶解したＭ、　 ５ｅｘｔａからのＢＢＭＶ（１００ｕｇ蛋白質／−）とともにインキュベートし た。２２℃で３０分間インキュベート後、結合及び遊離毒素を分離した。

第９〜１０図は、　１２ｓニー標識化毒素のＭ、　ｓｅ五％刷子縁膜小胞との結 臼を示す。小胞を漸増濃度のＢｔ。

２毒素（０）又はＢｔ１５毒素（・）の存在下で、標識化毒素［第９図では：　 ”’ｊ−Ｂ　ｔ　２毒素（１，０５ｎＭ）；第１０図では：　”’Ｉ−Ｂｔ１５ 毒素（０，７ｎＭ）　］を用いてインキュベ・−トした。結合は、標識化毒素の みとインキュベーションした場合の結合量のパーセンテージとして表わす。非特 異的結合は消去されなかった。データは、Ｌ　Ｉ　ＧＡＮＤコンピュータプログ ラムで分析した。各ポイントは、２通りの試料の平均である。第９図は、標識化 Ｂｔ２の結合に関するデータを示し、第１０図は、標識化Ｂｔ１５の結合を示す 。

競合データは、Ｂｔ２及びＲｔｌ５の両方に関する高親和性結合部位の存在を立 証すると同時に、Ｂｔ２結合部位に対するＲｔｌ５の、そしてＢｔ１５結合部位 に対するＢｔ２の競合が全く認められないことを立証している。これは、Ｂｔ２ 及びＲｔｌ５が非競合的結合毒素で′あることを示す。ゆえに、Ｂｔ２とＲｔｌ ５との組み合わせは、Ｍａｎｄｕｃａ種が害虫であるタバコ又はその他の作物に おいて発現されるＬｔｈｕｒｉ　１ｅｎｓｉｓ　Ｉ　ＣＰに対するＭ、　５ｅｘ ｔａの耐性の発現を防止するのに有用である。算出されたＫｄ及びＲｆ値を次に 示す： Ｂｔ　２：　Ｋｄ＝０．４ｎＭ、　Ｒｔ＝３．４ｐｍｏＪ／ｍｇ小胞蛋白質Ｂｔ １５：　ＫｄＣｏ、３ｎＭ、　Ｋｄ２：２．９ｎＭ、　Ｒｔｌ：５．９及びＲｔ ２＝６、７ｐｍｏｒ／ｍｇ小胞蛋白質（２つの別個の高親和性受容体部位が存在 する）。

Ｍ、　ｂｒａｓｓｉｃａｅ、　Ｓ、　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓ及びＰ、　１ｎｔｅ ｒ−匹口困」に関して、同様の試験を実施した。

ＬＤｓｏ、Ｋｄ及びＲｆ値は実質的に異なっていたけれども、Ｂｔ２及びＲｔｌ ５はともに有害であり、そして非競合的結合毒素であるという本質的観察が、こ れら３種の昆虫で確証された。したがって、鋒鋭肚旦胚種が害虫である任意の作 物植物において発現されるＩＣＰに対するＭ、　堕ｙ注匡肚の耐性を防止し、あ るいは鋒姐肛旦二種の耐性を防止するのに、それは有用な組み合わせである。

Ｂｔ２　びＢｔ４　素のＭ、　５ｅｘｔａのＢＢＭＶとの±人、２つの　Ａ、± Ａｉ　羽　ＩＣＰのＢｔ２及びＢｔ４毒素は、Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａに対 して有毒である。ＬＤ、。値は、それぞれ２０及び５．４ｎｇ／ｃｍ”である。

標識化Ｂｔ４の結合に対するＢｔ２の、そして標識化Ｂｔ２の結合に対するＢｔ ４の相互競合は観察されなかったが、これはＢｔ２及びＢｔ４が非競合的結合毒 素であることを立証する。

Ｒｔｌ５　びＲｔｌ８　とＳ、　ＨｔｔｏｒａｌｉｓのＢＢＭＶ（Ｄ　Ａ：２つ 　”　Ａ　ＩＣＰ（７）Ｋｈ刊 Ｒｔｌ５及びＢｔ１８毒素はともに、辷１ｉｔｔｏｒａＨｓに対して有毒である 。ＬＤｓ。値は、それぞれ９３及び８８ｎｇ毒素／ｃｍ”である、標識化Ｂｔ１ ５　（０，７ｎＭ）又はＲｔｌ８（０，９ｎＭ）を、種々の量の非標識化Ｂｔ１ ５又はＢｔ１８毒素と組み合わせたＳ、　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓからの小胞蛋白 質１００周とともにインキュベートした。４５分間インキュベート後、結合及び 遊離毒素を分離した。結合データは、Ｌｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ　Ｂ　Ｂ　Ｍ　Ｖ に対するＲｔｌ５及びＲｔｌ８の高親和性結合を立証している。第１１及び１２ 図から分かるように、全集団のＲｔｌ５の受容体部位はＲｔｌ８で飽和できなか ったし、全集団のＢｔ１８受容体部位もＲｔｌ５で飽和できなかった。

Ｒｔｌ３　びＢｔ２２　のり、　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａのＢＢＭＶとの　Ａ ：２つの　Ａ　′：Ａ　羽−Ｌ旦ヱｎ度困 Ｒｔｌ３及びＢｔ２２毒素はともに、Ｌｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａに対して有毒 である。ＬＤ、。値は、それぞれ０．８及び１．１μｇ毒素／Ｒ１である。標識 化Ｂｔ１３（１ｎＭ）又はＢｔ２２　（０，７ｎＭ）を、種々の量の非標識化Ｂ ｔ１３又はＢｔ２２毒素と組み合わせたＳ、　１ｉｔｔｏｒａｔｚｓからの小胞 量Ｉ：ｌ員ｌＯＯｍ／’ｙｄとともにインキュベートした。４５分間インキュベ ート後、結合及び遊離毒素を分離した。結合データは、Ｌｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ 　Ｂ　Ｂ　Ｍ　Ｖに対するＢｔ１３及びＢｔ２２の高親和性結合を立証している 。全集団のＢｔ１３の受容体部位は、Ｂｔ２２で可飽和でなかった。全集団のＢ ｔ２２の受容体部位もＢｔ１３で可飽和でなかった。

Ｂｔ２　びＢｔｌｇ　、のＭ、　５ｅｘｔａのＢＢＭＶとの”Ａ：２つの　Ａ・ 、±人―　羽　ｒｃｐのＢｔ２及びＢｔ１８毒素はともに、Ｍ、　５ｅｘｔａに 対シて有毒であって、ＬＤ、。値は、それぞれ２０及び７３ｎｇ毒素／ｃｍ”で ある。標識化Ｂ　ｔ　２　（１、０５ｎＭ）又はＢｔ　１８　（０，７ｎＭ）を 、種々の量の非標識化Ｂｔ２又はＢｔ１８毒素と組み合わせて、Ｍ、　５ｅｘｔ ａからの小胞蛋白質１１００Ｌ１／−とともにインキュベートした。４５分間の インキュベート後、結合及び遊離毒素を分離した。結合データ（第１１〜１２図 ）は、相性結合を立証する。全集団のＢｔ２受容体部位はＢｔｌｇで可飽和でな かった。全集団のＢｔ１８受容体部位もＢｔ２で可飽和でなかった。算出された Ｋｄ及びＲｆ値を以下に示す： Ｂｔ　２：　Ｋｄ＝０．０４ｎＭ、　Ｒｔ＝３．４ｐｍｏｉ／ｍｇ小胞蛋白質。

Ｂｔｌｇ：　Ｋｄｌ＝０．０４ｎＭ、　Ｒｔｌ＝２．２ｐｍｏ１／ｍｇ小胞蛋白 質、モしてＫｄ２＝１６８ｎＭ、　Ｂｔ２：１９４ｐｍｏＩ／ｍｇ小胞蛋白質（ Ｂｔｌｇに関しては２つの別個の受容体部位が存在する）。

非競合的結合抗鱗翅類ＩＣＰの組み合わせ及び抗鞘翅類ＩＣＰの組み合わせの一 覧を、それらの共通の標的昆主橋とともに以下に示す、これにより、非競合性が 立証された： Ｂｔ２−Ｂｔ１５　（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ、　Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘ　 １ｏｓｔｅｌｌａ。

Ｂｔ２−Ｂｔｌｇ　（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ、Ｓ　ａｄｏ　ｔｅｒａｌｉ ｔｔｏｒａｌｉｓ） Ｂｔ２−Ｂｔ１４　（Ｐｉｅｒｉｓ　ｂｒａｓｓＬｃａｅ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ狂 包区虱旦、　Ｐ　ｔｈｏｒｔｍａｅｅ　几肛シ山江堕）Ｂｔ２−Ｂｔ４　（Ｍａ ｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ）Ｂｔ１５−Ｂｔｌｇ　（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ 、Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａＢｔ１４−Ｂｔ１５　（Ｐｉｅｒｉｓ　ｂｒａｓｓｉｃ ａｅ）Ｂｔ１５−Ｂｔ４　（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ、　ｑ　ｖ１劃胡）Ｂ ｔｌｇ−Ｂｔ１４　（Ｐｉｅｒｉｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）Ｂｔｌｇ−Ｂｔ４　 （Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ）Ｂｔ１３−Ｂｔ２１　（Ｌｅ　ｔｉｎｏｔａｒ ｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）Ｂｔ１３−Ｂｔ２２　（Ｌｅ　ｔｉｎｏｔａ ｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）Ｂｔ２１−Ｂｔ２２　（Ｌｅ　ｔｉｎｏｔ ａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）もちろん、特定の標的害虫に関する特異 的非競合的結合ＩＣＰの組み合わせのこのリストは網羅的なものではなく、未発 見のＩＣＰに関する組み合わせを含めたその他のこのようなＩＣＰの組み合わせ が、任意の標的昆主橋に対する同様のアプローチを用いて見出されるものと考え られる。同様に、標的害虫の前記リストもまた、網羅的ではなく、ＩＣＰの特定 の組み合わせを用い得る（例えば、植物体で発現されるＩＣＰに対するＰｉｅｒ ｉｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｅの耐性を防止するためのＢｒａｓｓｉｃａにおけるＢ ｔ２及びＢｔ１４ＩＣＰの組み合わせ）その他の標的害虫（並びにこのような害 虫による侵襲を防止するために形質転換される植物）が、同様のアプローチを用 いて見出されるものと思われる。

７　：　Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ　バコイモムシ　の・くメコニ１１状 淘汰実験は、多数の幼虫を、飼料中に溶解した（例えば５０〜９０％の）幼虫を 殺害する濃度に暴露することを包含する。生き残った幼虫を再び少数の幼虫を殺 害する毒素濃度に暴露し、この工程を数世代に亘って続ける。毒素に対する幼虫 の感受性を、各々、４世代淘汰後に調べる。

Ｂｔ２毒素単独、Ｂｔ１８毒素単独、そして属（重量比）Ｂｔ２／Ｂｔ　１８混 合物を用いて、Ｍ、　５ｅｘｔａの２０世代淘汰を実施した。Ｂｔ２、Ｂｔｌｇ 及びＢｔ２／Ｂ　ｔ　ｌ　８の％混合物に関する参照系統のＬＣ，。値は、それ ぞれ次の通りであった＋２０ｎｇ／餌１　ｃｒｎｚ、７２　ｎｇ／　Ｃｍ”及び ６２ｎｇ／ｃｍ”であった昏淘汰は、約７５％の幼虫を殺害する濃度で開始した 。４世代淘汰後、Ｂｔ２及びＢｔ１８淘汰の両方で生存率が増大して、殺害率が 約７０％になったが、このような増加はＢ　ｔ、　２とＢｔｌｇとを組み合わせ た淘汰では観察されなかった。ＬＣ，、値を算出するために、用量を再び増大し た。これを全て４世代繰り返した。このようにして淘汰工程を２０世代まで継続 した。最終結果を以下に示す（２０世代のＬＣ，。）ニーＢｔ２淘汰：　Ｌ　Ｃ ｓ。は６，４００μｇ／ｇであった（感受率は３２０倍低減）。

−Ｂｔ１８淘汰：　ＬＣＩ。は１５，１００ｒａ／ｇであった（感受率は２０７ 倍低減）。

−Ｂｔ２／Ｂｔ１８淘汰：ＬＣ，。は１８１μｇ／ｇ（感受率は３倍低減Ｊ したがって、感受率の低減は、併用淘汰実験においては約１００倍低かった。

３つの淘汰Ｍ、　５ｅｘｔａ系統における受容体結合を、Ｂｔ２及びＢｔｌＢを 用いて調べ、参照Ｍ、　ｓｅム捷糸系統非淘汰系統）の場合と比較した。Ｂｔ２ 及びＢｔ１８毒素に関する参照系統の結合特性を次に示す：ＢＥ　Ｚ二Ｋｄ＝０ ゜４ｎＭ、　Ｒｂ２．４ｐａ＋ｏｆ／Ｉｌ！ｇ小胞蛋白質Ｂｔ１８：　Ｋｄｌ＝ ０．０４ｎＭ、　Ｒｔｌ＝２．２ｐｍｏｆ／ｍｇ小胞蛋白質及びにｄ２＝１６８ ｎＭ、　Ｒｔ２＝１９４ｐｍｏ１／ｍｇ小胞蛋白質（ＢｔｌＢに関しては２つの 別個の受容体部位が存在する）。

第１１図及び第１２図は、＃、倶由の刷子縁膜小胞との　目Ｊｌｌｉ識化毒素の 結合を示す。小胞を、漸増濃度のＢｔ２毒素（○）又はＢｔｌＢ毒素（・）の存 在下で、樟識化毒素［第１１図：　””Ｉ−Ｂｔ２毒素（１，０５ｎＭ）　：第 １２図：　”’Ｉ−Ｂｔ１８毒素（０，７ｎＭ）　］　とともにインキュベート した。結合は、標識化毒素単独を用いてインキュベートした場合の結合量のパー センテージとして表わす、非特異的結合は消去されなかった。データは、ＬＩＧ ＡＮＤコンピュータプログラムで分析した。各ポイントは、２通りの試料の平均 である。

Ｂｔ２淘汰系統は、Ｂｔ２の検出可能な高親和性結合を小さなかったが、一方、 そのＢｔｌＢ結合特性は参照系統と同じ位に残った（ＢｔｌＢ：Ｋｄｌ＝０．０ ３ｎＭ、Ｒｔｌ＝２．８ｐｍｏ１ｓ／ｍｇ小胞蛋白質。

及びＫｄ２＝　１９９ｎＭ、　Ｒｔ２＝１０９ｐｍｏｊｓ　／ｍｇ小胞蛋白質、 Ｂｔ１８に関しては２つの別個の受容体部位が依然として存在する）。

Ｂｔ１８淘汰系統は、ＢｔｌＢに対する高親和性受容体部位を損失した。Ｂｔｌ Ｂに対する低親和性部位が、参照系統よりも低濃度で、依然として存在した（Ｋ ｄ＝　１８９ｎＭ、Ｒｔ＝４３ｐｍｏ１ｓ　／Ｂ小胞蛋白質）、Ｂｔ２結合部位 濃度は、参照系統と比較して。

顕著に増大した（　Ｋ　ｄ　＝　０　、４　ｎＭ、　Ｒｔ　＝　２０　、８ｐｍ ｏＩｓ　７ｍｇ小胞蛋白質）、この系統は、Ｌ　Ｃ＠、＝　４ｎｇ／ｃｍ’のＢ ｔ２感受率を有した。したがって、Ｂｔ２に対するその感受率は、参照系統（Ｌ 　Ｄ　＊。＝２０ｎｇ／ｃｍ’）に比して増大した。

Ｂｔ２／Ｂｔ８淘汰系統は、Ｂｔ１８結合部位濃度の、わずかではあるが、統計 的に有意でない低減を示した（Ｂｔ２：Ｋｄ＝０．４ｎＭ、Ｒｔｌ＝３．４ｐｍ ｏｉ’ｓ　／ｍｇ小胞蛋白蛋白Ｂｔ１８：Ｋｄｌ＝０．０４ｎＭ、　Ｒｔ　１　 ：＝　１　、　Ｏｐｍｏｆｓ　７ｍｇ小胞蛋白質及びＫｄ２＝１６８ｎＭ、Ｒｔ ２＝１９．４ｐ！ｌ１ｏ１ｓ／ｍｇ小胞蛋白＊：ＢｔＬ８に関しては、２つの別 個の受容体部位が存在する）、これらのデータは、耐性が生じた２つの淘汰系に おいて、その機序は受容体レベル１こあることを立証する。受容体部位の変化が Ｂ、　ｔｈｕｒｉｌ江ｎ５ｉｓ■ＣＰに対する耐性について最も考えられる機序 である。

！ＥＪＬＬ！Ｌ：　斉１Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓｌこ・ するコナガの　の ＩＣＰに対する昆虫耐性の発現の機序を、Ｌｘｙ　ｌ　ｏ　ｓ　ｔ　ｅ　１１　 ａ系統（’ＰｘＲ”）で調べた。この昆虫系統は、Ｄｉｐｅｌに対して、田畑で 、高レベルの耐性を発現した。　Ｄｉｐｅｌ製剤の結晶は、Ｂｔ３、Ｂｔ２及び Ｂｔ７３ｒＣＰ（７）ようなｒｃｐｔｖａ合物を含有する；実施例６においては 、これらの毒素が競合的結合毒素であることが示された。

Ｄｉｐｅｌに対する耐性は、感受性系統（”ＰｘＳ”　）、及びＤｉｐｏｌ耐性 系統（”ＰｘＲ”）に関する毒性データによって確証された。高レベルの耐性は 、以下の表に示すように、Ｂｔ２プロトキシン及びＢｔ２毒素に関しても観察さ れる。

系統のＬＣｓ。

ＰｘＳ　ＰｘＲ Ｂｔ　２　６．７　＞１３５０ Ｂｔ１５　１３２．６　１２０．４ ＬＣＩ。データは、人工飼料１　ｃｍ”当たりに点在する蛋白質（ｎｇ）として 表わされる。

しかしながら、昆虫毒性データは、Ｂｔ１５プロトキシン及びＢｔ１５毒素に対 する耐性が認められないことを示している；このＩＣＰは、Ｄｉｐｅｌ結晶中に は存在しない、毒素−膜結合の変化が耐性に関与されるか否かを調べるために　 −＊Ｊ　＠脆化Ｂｔ２毒素及びＢｔ１５毒素を、ＰｘＲ及びＰｘＳ系統の幼虫中 編から得られたＢＢＭＶとともに用いて、受容体結合試験を実施した。その結果 を、以下の表１に要約する。

表１．感受性及び耐性Ｐ、　ｕ畑ゴ至■鱈からの刷子縁膜小胞に対するＢｔ２及 びＢｔ１５毒素の結合特性ＩＣＰ　系統　Ｋｄ　（ｎＭ）　Ｒｔ　（ｐｍｏｆ／ Ｂ蛋白質）表１は、ＰｘＳ系統の中腸腺に対するＢｔ２毒素の高親和性可飽和性 結合が認められたが、しかしＰＸＲ系統は検出可能レベルのＢｔ２毒素結合を示 さなかったことを明示する。Ｂｔ１５毒素を用いた場合は、ＰｘＲ及びＰｘＳ系 統の両方のＢＢＭＶとの有意の結合が認められ、その値は２つの系統間で有意に 相違しない。

これらのデータは、Ｐ、■１ｏｓｔｅｌｌａにおける耐性が毒素−膜結合の変化 によるものであることを示す。Ｂｔ２毒素に対する耐性、及びＰｘＲ系統のＢｔ １５毒素に対する感受性は、表１に示す結合特性がこれを反映している。

ゆえに、異なる非競合的結合ＩＣＰ（即ちＢｉ２とＢｉ１２）が同−昆主橋（例 えばＰ、　ｕ胆牡虱封）に対して活性を有する場合、一方のＩＣＰ　（Ｂｉ２） に対する耐性は、他方のＩＣＰｓ（例えばＢｉ１２）に対する耐性を意味しない 。したがって、異なる結合特性を有するＩＣＰは、ＩＣＰに対する昆虫耐性の発 現を遅延するために併用し得る。

９：　々の　亡　の２つのＩＣＰ゛　−の　のゲノム　へのＩ々の トマトのようなトランスシュニック植物体におけるｂｔ２及びｂｔ１５遺伝子の ような２つのＩＣＰ遺伝子の併用発現を行うためには、２つの操作が考えられる 。これらの操作は、同−ＤＮＡ断片内で連関していない２つのキメラＩＣＰ遺伝 子を当該植物のゲノムに転移することを基礎とする。

第一の操作は、すでに第一のキメラＩＣＰ遺伝子で形質転換された植物が、第二 のＩＣＰ遺伝子を導入するために再形質転換される逐次形質転換工程に基つく。

逐次形質転換には、カナマイシン（“Ｋｍ”）、及びホスフィノトリシンアセチ ルトランスフェラーゼ（“ＰＰＴ”）に対する耐性遺伝子のような２つの異なる 淘汰可能なマーカー遺伝子が用いられる。これによって、ホスフィノトリシンに 対する耐性が授けられる。これらの淘汰可能なマーカーの両方についての使用は 、Ｄｅ　ＢＬｏｃｋ等（１９８７）が記載している。

第二の操作は、単一工程での異なるプラスミドに関する２つのキメラＩＣＰ遺伝 子の同時形質転換を基礎とする。両方の１ＣＰ遺伝子の組込みは、それぞれのＩ ＣＰ遺伝子と連関した、Ｋｍ及びＰＰＴに対する耐性を授与する２つの淘汰可能 なマーカーを用いることによって淘汰され得る。

何れかの操作に関して、植物細胞中に、各々のキメラＩＣＰ遺伝子のＡｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換のために、Ｔｉプラスミドベクターを用いる。

欧州特許第０１９３２５９号に記載されたプラスミドｐＧｓＨ１６３は、Ｔ−Ｄ ＮＡＮ及縁体間にキメラ遺伝子：　ＴＲ２’プロモータ制御下でｂｔ２遺伝子の 毒素部分をコードする遺伝子断片と、ＴＲ１’プロモータ制御下でのｎｅｏ遺伝 子を含有する。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７及びオクトビンシンターゼの３′末端は、そ れぞれ転写体の３′末端形成のための情報を提供する。

ＴＲ２’プロモータの制御下でＢｔ１５ＩＣＰの毒素をコードする遺伝子断片を 含有するキメラｂｔ１５遺伝子は、以下の方法で構築した（第１５図）。ｐＯＨ ５０は、ρａＣプロモータの制御下で全ｂｔ１５遺伝子を含むｐＵＣ１８で構成 される。ＨｉｎｄＩｎ−ＢｇＩｎ断片をｐ　Ｍ　ａ　５−８中でクローン化して 、ｐＪＢ３を産生した。部位指示変異誘発により、ＮｃｏＩ部位を開始コドンに 作って、ｐＶＥ２９を産生じた。ｂｔ１５遺伝子の切形遺伝子断片を含有し、翻 訳停止コドンを有する断片は。

ｐＯＨ５０からＢｃｊ２１−ＣＡａｌを単離し、ｐＬＫ９１においてクローン化 し、ｐＨＷ３８を産生ずることによって得られた。全毒素遺伝子断片をｔａｃプ ロモータの制御下で再構築し、ｐＨＷ３８からのＣρａＩ−ＰｓｔＩ断片、ｐＶ Ｅ２９からのＮｃｏ　Ｉ　−Ｃｊ２ａＩ断片及びｐＯＨ４８からのＮｃｏＩ−Ｐ ｓｔ工断片を結紮することによってｐＶＥ３５を産生した。開始コドンにＮｃｏ 　１部位を有する切形ｂｔ１５遺伝子断片は、１９８ＯＮｃｏＩ−ＢａｍＨｒ断 片としてｐＶＥ３５から得て、ｐＧＳＪ　１４１でクローン化し、Ｃｌ２ａｒ及 びＢａｍＨＩで消化した。ｐＧＳＪ１４１は、ＥＰＡ８８４０２１１Ｌ５．５に 記載されている。充填ＣｎａＩ部位を充填Ｎｃｏ　Ｉ部位に結紮することにより 、キメラＴＲ２’　−切形ｂｔ　ｌ　５−３′　ｇ７構築体（ｐＴＶＥ４７）を 産生した。このプラスミドの淘汰可能マーカーとして、ホスフィノトリシンアセ チルトランスフェラーゼをコードし、ＰＰＴに耐性を授与するｂａｒ遺伝子を用 いた。３５５プロモータの制御下のｂａｒ遺伝子と、その後にオクトビンシンタ ーゼの３′末端を含有するキメラｂａｒ遺伝子をｐＴＶＥ４７に導入した。ｐＤ Ｅｌｌｏから、５ｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として３５Ｓ−ｂａｒ−３’　ｏ ｓ断片を得て、ｐＴＶＥ４７でクローン化し、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消 化した。これによって、ＴＲ２’プロモータ制御下の切形ｂｔ１５遺伝子と、３ ５Ｓプロモータ制御下のｂａｒ遺伝子とをＴ−ＤＮＡＮ及縁体間に含有するプラ スミドｐＴＨＷ８８（第１５図）が産生された。プラスミドｐＧＳＨ１６３は同 時組み込み型Ｔｉ−プラスミドベクターであるが、一方ｐＴＨＷ８８は二元型Ｔ ｉ−プラスミドベクターである（ＥＰＡＯ１９３２５９）。

両プラスミドを、　Ｄ６ｂｌａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）によって、　 Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＣ５８ＣＩＲｉｆ系統（ｐＧＶ２２６０）にお いて可動化した。逐次形質転換操作で、ｉｃｅ　Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａＬ、（１ ！：ｊ　８７）によって、ｐＧｓＨ１６３及びｐＧＶ２２６０（７）同時組込み に起因するｐＧｓ１１６３を保有するＡ、　ｔｕａ＋ｅｆａｃｉｅｎｇＣ５８Ｃ ＩＲｉｆ系統を用いてトマトを形質転換した。個々の形質転換体をカナマイシン 耐性に対して淘汰し、再び生じた植物を、Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７ ）によって、切形ｂｔ２遺伝子の発現に関して特性づけした。ある典型的形質転 換体を、次に、虹ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｃ　５８　ＣＩ　Ｒｉ　ｆ系統（ｐＧ Ｖ２２６０及びｐＴＨＷ８８）で再形質転換して、形質転換体をＰＰＴ耐性に関 して淘汰した。この同時形質転換法を用いて、同時取込みベクターｐＧｓ１１６ ３及び二元的ベクターｐ　Ｔ　ＨＷ８８を保有するそれぞれのＡ　ｒｏｂａｃｔ ｅｒｉａ系統を、トマトの形質転換に用いた。個々の植物体を、Ｋｍ及びＰＰＴ に対する耐性に関して淘汰した。

第１５図には、次のことが模式的に示されている： ａ）ｐＶＥ２９の横築：　ＡＴＧ開始コドンに導入されたＮｃｏ　Ｉ部位を有す るｂ　ｔ　’１５　Ｎ末端遺伝子断片。

ｂ）ｐＶＥ３５の構築：ｔａｃプロモータ制御下のｂｔ　１５ＣＣ末端切形遺伝 子片。

ｃ）ｐＴＨＷ８８の構築：１’−ＤＮＡ縁反復俸内にキメラｂｔ１５遺伝子及び キメラｂａｒ遺伝子を有する二元的Ｔ−ＤＮＡベクター。

何れの場合も、個々の形質転換体における２つのＩＣＰ遺伝子の同時発現を、欧 州特許Ｃ１１９３２５９号に記載されているように昆虫毒性試験によって、そし て生化学的手段によって、評価した。特異的ＲＮＡプローブによって、転写レベ ルの定量的分析を行うことができた；それぞれの遺伝子物質とのモノクローナル 抗体交叉反応により、ＥＬＩ　ＳＡ試験においてそれぞれの遺伝子物質の定量的 分析が可能であった（欧州特許第０１９３２５９号）；そして、特異的ＤＮＡプ ローブは、形質転換体におけるｂｔ２及びｂｔ１５遺伝子のゲノム組込みの特性 表示を可能にした。形質転換トマト植物体は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡで測定した場合、 ｂｔ２遺伝子（８、１ｎｇ／　ｍｇ）とｂｔ１５遺伝子（７，６ｎｇ／　ｍｇ） とを同時に発現することが判明したが、これは、発現されつつあるＢｔ２及びＢ ｔ１５毒素の殺虫効力に対するＭ、　５ｅｘｔａの耐性発現を防止又は遅延する と考えられる。

これらの操作は、一方又は両方の１ＣＰ遺伝子がハイブリッド遺伝子の一部であ る場合にも用い得る。例えば、上記と同じ方法は、ＴＲ２’プロモータ制御下の キメラ切形ｂｔ２−ｎｅｏハイブリッド遺伝子と、適当なＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ系統におけるｐＴＨＷ８８を用いて実施し得る。

ｌＯ：　々のタ　において１々の畜 の　ゲノムに２つの工ＣＰ゛　を１々に　し、その′、′によって　−盲　で　 みＡわせる。

タバコ植物体を、欧州特許第０３５８５５７号及び欧州特許第１９３２５９号に それぞれ記載されているのと同じクローニング法を用いて、ｂｔ１８遺伝子又は ｂｔ１５遺伝子で形質転換した。両方の遺伝子に関して、植物体を、Ｂｔ１８又 はＢｔ１５毒素をそれぞれコードする切形ｂｔ１８又はｂｔ１５遺伝子を含有す る植物発現ベクターで形質転換した。

形質転換植物を摂食中の鉦姐並鉦ｒａ　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓ幼虫の死亡率は、 非形質転換植物を摂食した幼虫の死亡率よりも有意に高い。

ｂｔ１８遺伝子に関して同型接合体であるｂｔ１８形質転換植物を、つぎにｂｔ １５遺伝子に関して同型接合体であるｂｔｉｓ形質転換植物と交配する。自家増 殖後、両遺伝子に関して同型接合である植物が得られる。

その結果生じた、ｂｔ１８及びｂｔ１５の両遺伝子を発現するタバコ植物体は、 植物体が発現したＢｔ１８又はＢｔ１５毒素に対するＳ、　１ｉｔｔｏｒａｌｉ ｓによる耐性の発現を有意に遅延する。

１１＝四−ＤＮＡ　で゛　した２つのキメラエＣＰ゛　の　ゲノムへの 用いた方法は、単一ベクターのＴ−ＤＮＡＮ及縁体間の２つの独立したキメラＩ ＣＰ遺伝子の構成に基づく。結合試験から、Ｂｔ２及びＢｔ１４毒素は、Ｐｉｅ ｒｔｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｅに対する殺虫活性を有する２つの非競合的結合ＩＣ Ｐであることが示された。植物における発現に関しては、ｂｔ２及びｂｔ１４遺 伝子はともに同時発現して、昆虫耐性発現を防止し得る。別個のプロモータの制 御下での各ＩＣＰ遺伝子を用いたプラスミドベクターの設計に関しては、２つの 可能性が考えられる＝１）切形ｂｔ２及びｂｔ１４遺伝子、及び淘汰可能マーカ ーを保有する３つのキメラ構築物；又は２）切形遺伝子断片（ｂｔ２又はｂｔ１ ４）とｎｅｏ遺伝子のハイブリッドを、切型ｂｔ１４又はｂｔ２遺伝子と組み合 わせて用い得る。

本実施例は、Ｔ−ＤＮＡＮ及縁体間の以下のキメラＩＣＰ遺伝子を保有する植物 形質転換に関するベクターｐＴ）（Ｗ９４の構築を述べる：ＴＲ２′プロモータ の制御下の切形ｂｔ２遺伝子断片、及びＴＲＩ′プロモータ制御下のハイブリッ ド切形ｂｔ１４−ｎｅ。

遺伝子。Ｔ−ＤＮＡ這伝子７の３°末端及びオクトビンシンターゼは、それぞれ 、適正な３′末端形成に関する情報を提供する。ｐＴＨＷ９４は、１９８９年８ 月２８日に、寄託番号５５１４でＤＳＭに寄託された。

第１６図には、以下のことが模式的に示されている： ａ）ｐＨＷ４４の構築：　ＡＴＧ開始コドンにＮｃ。

１部位を導入されたｔ）ｔ　ｌ　４ＮＮ末端遺伝子片。

ｂ）ｐＨＷ６７の横築：ｔａｃプロモータ制御下のｂｔ１４遺伝子の再構築。

ｃ）ｐＨＷ７１の構築＋　ｔａｃプロモータ制御下のハイブリッド切形とｂｔ１ ４−ｎｅＯ遺伝子の構築。

ｄ）ｐＴＨＷ９４の構築：　Ｔ−ＤＮＡＮ良縁体間にキメラｂｔ１４遺伝子及び キメラｂｔ２遺伝子を有する二元的Ｔ−ＤＮＡベクター。

ｐＴＨＷ９４ベクターをＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｃ５８ＣＬＲ４ｆ系統（ ｐＭＰ９０）中に可動化し、これを用いて、Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ等（１９８９）が 記載した方法によって形質転換した。形質転換体をＫｍに関して淘汰すると、再 生した植物は、昆虫毒性試験及び生化学的試験において、両方のＩＣＰ遺伝子物 質を発現することが判明する。

１２：ハイブリッド　におＧる２つの 工ＣＰ゛の ２つのＩＣＰ遺伝子の併用及び同時発現を生じさせるために、２つの異なるＩＣ Ｐの毒性部分をコードする切形遺伝子断片を適正な読み取り枠で融合し、キメラ 遺伝子構築体で、ハイブリッド遺伝子として同一プロモータ制御下に置く。ある ＩＣＰからの毒性コアを、Ｎ−及び／又はＣ−末端で、プロテアーゼ活性によっ てそれらのプロトキシンから遊離させ得る。したがって、ハイブリッド遺伝子は 、２つ又はそれ以上のＩＣＰ遺伝子の融合点でプロテアーゼ切断部位をコードす る１つ又はそれ以上の領域を有するよう設計され得る。

ｂｔ２及びｂｔ１４遺伝子の同時的共発現は、切形ｂｔ２遺伝子断片と融合され る切形ｂｔ１４遺伝子断片から成るハイブリッド遺伝子を構築することによって 得られる。第１７図には、Ｂｔ２プロトキシンの毒性コアをコードするＣ−末端 切形ｂｔ２遺伝子断片と、枠内のＢｔ１４プロトキシンの毒性コアをコードする Ｃ−末端ｂｔ１４遺伝子断片とのこのようなハイブリッドｂｔ２−ｂｔ１４遺伝 子を模式的に示している。トリプシン切断部位の下流に位置するす、ｔ２遺伝子 のＢｃβ１部位は、枠内で、切形ｂｔ１４遺伝子断片のＮ末端に導入されるＮｃ ｏ　Ｉ部位と融合される。この末端には、プラスミドｐＬＢＫｍ８６０　（欧州 特許第０１９３２５９号）及びｐ、ＨＷ６７を用いる。ｐＬＢＫｍ８６０は、ラ ムダＰｔプロモータ制御下のハイブリッドｂｔ２−ｎｅｏ遺伝子を含有する。ハ イブリッド遺伝子内のｂｔ２遺伝子部分は、Ｃ末端切形ｂｔ２遺伝子断片であっ て、ｂｔ８６０として示される（第１７図）　（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　１ ９８７も参照）。ｐＨＷ６７の構築は、第１６図に記載されている。ｐＨＷ６７ は、ＡＴＧ開始コドンにＮｃｏ１部位を有するＣ末端切形ｂｔ１４遺伝子断片（ ｂｔ１４ｔａｘ）　、無傷ｂｔ１４遺伝子のＢｃｊ２　Ｉ部位に位置する翻訳停 止コドン、及び全遺伝子断片の下流のＢａｍＨＩ部位を含有する適正な読み取り 枠内で両遺伝子断片を融合するために、それぞれのプラスミドのＢｃｎ　Ｉ及び ＮｃｏＩ端を、第１６図に示されているように、ＫｌｅｎｏｗＤ　Ｎ　Ａポリメ ラーゼ及びＳ１ヌクレアーゼで処理する。その結果生じるプラスミドｐＪＢ１０ ０は、ラムダＰｔプロモータ制御下のハイブリッドｂ　ｔ　８６０−　ｂ　ｔ　 １４　ｔ　ｏ　ｘ遺伝子を含有し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上マの予期される動きを有 する融合蛋白質のＥ、　ｃｏｌｉにおける発現を指示する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ株の粗製抽出物は、Ｐ、　ｂｒａｓｓｉｃａｅに対して、その株 が発現した融合蛋白質の毒性を示す。Ｅ。

ｃｏｌｉ株が産生じた融合蛋白質のＮ末端アミノ酸配列分析により、Ｂｔ１４プ ロトキシンからのＮ末端アミノ酸は活性化される時にプロセッシングされること も確証された。したがって、ｂｔ２−ｂｔ１４ハイブリッド遺伝子物質は、２つ の考えられるプロテアーゼ切断部位を有する。

つぎに、このハイブリッド遺伝子を、植物の形質転換のためにベクター内に挿入 し、適正なプロモータの制御下に置いて、ｂｒａｓｓｉｃａのゲノムに転移させ る（欧州特許第０１９３２５９号）が、この場合、ｔ）ｔ２及びｂｔ１４遺伝子 はともに、昆虫毒性試験で発現される。

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（１９８３）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ０゜２１−２５゜ −（！４！　Ｆｒａｍｏｎｄ　Ａ、、　Ｂａｃｋ　Ｅ、、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　Ｗ 、、　Ｋａｙｅｇ　Ｌ。

ａｎｄ　Ｃｈｉｌｔｏｎ　Ｍ−Ｄ　（１９８６）、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ ｔ。

２０２、　１２５−１３１゜ −Ｄａ　Ｇｒａｖｅ　＠ｔ　ａｌ　（１９８２）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ 、Ｇａｎａｔ。

ｉ　（６）、　４９９−５１１゜ −Ｄ＠Ｌａ　Ｐａｎａ　ａｎｄ　１９ｃｈａｌｌ　（１９ｓ６）　、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３２５゜２７４−２””。

−Ｄａｌａｕｎｓｙ　Ａ、、Ｔａｂａｅｉｚａｄａｈ　Ｚ、ａｎｄ　Ｖａｒｍａ 　Ｄ。

（１９８８）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５゜４３０ ０−４３０４゜ −Ｄｅｐｉｃｋｓｒ　Ａ、、　Ｈａｒｍａｎ　Ｌ、、　Ｊａｃｏｂｓ　Ａ、、５ ｃｈｅｌｌ　Ｊ。

ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ　Ｍ、（１９８５）、　Ｍｏ１．　Ｇａｎ、　 Ｇｅｎａｔ。

２０１　４フアー４８４゜ −Ｄｏｎｏｖａｎ　Ｗ、、Ｄａｎｋｏｓｃｉｋ　Ｇ＋ａｎｄ　Ｇ１１ｂａｒｔ　 Ｗ。

（１９８８）、　Ｊ、　Ｂａａセｅｒｉｏ１．１７０．４７３２−４７３８゜− ＤｕＬｍａｇｅ　Ｈ，Ｔ　ａｎｄ　ｃｏｏｐ＠ｒａｔｏｒｓ　（１９８１）、Ｉ ｎ　＝阻ｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐｅｓｔｓ　ａｎｄ　ｐｌａ ｎセｄｉｓｅａｓｅｓ　１９７０−１９８０　（Ｅｄ、　Ｈ，Ｄ、　Ｂｕｒｇｅ ｓｓ）。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９３−２２２＋−Ｆｉｎｎｅｙ　Ｄ、　（１ ９６２）、　Ｐｒｏｂｉｔ　Ａｎａｌｙｓｉｉｇ（ｔＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐ ｒ＠ｓｓ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、　Ｉ）Ｐ、ｓｏ−ｇｏ。

−Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ　Ｄ、、　Ｂｏｗｄｉｓｈ　Ｋ、、　Ｐｅｒｌａｋ　Ｆ、 、　ＭａｒｒｏｎａＰ、、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　Ｓ、、Ｎｉａｄｅｒｍａｙｅｒ 　Ｊ、、Ｄｅａｎ　Ｄ、。

Ｋｕｚａｎｏ−Ｋｒｅｔｚｍａｒ　Ｋ、、　Ｍａｙｅｒ　Ｅ、、Ｒｏｃｈｅｓｔ ａｒ　Ｄ＋。

Ｒｏｇａｒｓ　Ｓ、　ａｎｄ　Ｆｒａｌｅｙ　Ｒ，（１９８７）。

Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５．　Ｅ１０７−８１２゜−Ｆｒａｎｃｋ、　 Ｇｕｉｌｌ、ｅｙ、　Ｊｏｎａｒｄ、　Ｒｌｃｈａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｈｌｒｔｈ （１９８０）、　Ｃｅ１ｌ　２１．２８５−２９４゜−Ｆｒｅｎｃｈ　Ｂ、、　 Ｍａｕｌ　Ｈ，ａｎｄ　Ｍａｕｌ　Ｇ＋（１９８６）、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈａｒａ、１５６．４１７−４２３゜−−Ｆｕｌｌｅｒ　Ｆ、（１９８ ２）、　Ｇｅｎｅ　１９．４３−５４゜−ｃａｒｄｎｅｒ、　Ｈｏｗａｒｔｈ、 　Ｈａｈｎ、　Ｂｒｏｗｎ−Ｌｕｅｄｉ、　５ｈｅｐａｒｄａｎｄ　Ｍｅｓｓｉ ｎｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．２８７１−２８８７゜−Ｇｏ ｌｄｂｅｒｇ　Ｌ、ａｎｄ　Ｍａｒｇａｌｉｔ　Ｊ、（１９７７）、Ｍｏ５ｑ。

Ｎｅｗｓ　３７，３５５−３５８゜ −Ｇｏｌｄｍａｎ　工、、Ａｒｎｏｌｄ　Ｊ、ａｎｄ　Ｃａｒｌｔｏｎ　Ｂ、（ １９８６）。

Ｊ、工ｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈｏｌ＋　４７，３１７−４２４゜−Ｇｏｕｌｄ　Ｆ 、（１９８８）、　Ｂｉｏｓｃｉａｎｃａ　３８．２６−３３゜−Ｈａｉｄｓｒ 　Ｍ、、Ｋｎｏｗｌｅｓ　Ｂ、ａｎｄ　Ｅｌｌａｒ　Ｄ、（１９＋３６）。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５６，５３１−５４０＋−Ｈａｒｒａｒａ−Ｅ ｓｔｒｅｌｌａ　（１９８］）Ｎａｔｕｒｅ　３０３，２０９−２１３゜−Ｈｏ ｆｍａｎｎ　Ｃ，、ＬＧｔｈｙ　Ｐ、、ＨＱｔｔｅｒ　Ｒ，ａｎｄ　Ｐｌｉｓ） ｃａＶ、（１９８８ａ）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３．８５− ９１゜−Ｈｏｆｍａｎｎ　Ｃ，、Ｖａｎｄａｒｂｒｕｇｇｅｎ　Ｈ，、）（６ｆ ｔｅ　Ｈ，、ＶａｎＲｌｅ　Ｊ、、　Ｊａｎｓｅｎｓ　Ｓ、　ａｎｄ　Ｖａｎ　 Ｍｅｌｌａｅｒｔ　Ｈ。

（１９８８ｂ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５゜７８ ４４−７８４８゜ −８６ｆｔｅ　Ｈ，、Ｖａｎ　Ｒｉｇ　Ｊ、、Ｊａｎｇｅｎｓ　Ｓ、、ＶａｎＨ ｏｕｔｖａｎ　Ａ＋、Ｖｅｒｂｒｕｇｇａｎ　Ｈ，ａｎｄ　Ｖａａｃｋ　Ｍ。

（１９８Ｂ）、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４゜２０１ ０−２０１７゜ −Ｈ６ｆｔｅ　Ｈ，、Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ　Ｈ，、５ｅｕｒｉｎｃｋ　Ｊ、、Ｊａ ｎｓｅｎｓＳ、　、　Ｍａｈｉｌｌｏｎ　Ｊ、　、　Ａｍｐｓ　ｃ、　、　Ｖａ ｎｄｅｒｋｅｒｋｈｏｖｅ　Ｊ、　。

Ｖａｎｄｅｒｂｒｕｇｇｅｎ　Ｈ，、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ　Ｍ、、Ｚａｂｅ ａｕ　Ｍ＋ａｎｄ　Ｖａｅｃｋ　Ｍ、（１９８７）、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、１１゜２７３−２８０゜ −Ｈ６ｆｔａ　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｈｉｔａｌｅｙ　Ｈ，Ｒ，（１９８９）。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５３．２４２−２５５゜− Ｈｓｉｕｎｇ　Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅａｋｅｒ　Ｇ、（１９８Ｂ）、Ｂｉｏセｅｃｈ 、ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎ、　Ｒｅｖ、６．４３−６５゜−Ｈｕｌｌ 　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｌｌ　（１９８７）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８６゜４８２− ４９３゜ −Ｈｕｎセｓｒ　Ｗ、ａｎｄ　Ｇｒｅａｎｗｏｏｄ　Ｆ、（１９６２）、Ｎａｔ ｕｒ＠１．９４，４９５−４９６゜ −Ｋｏｚａｋ　Ｍ、（１９８７）、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、ヱ。

３４３Ｆ！−３４４５゜ −Ｋｒｅｂｂｅｒｓ　Ｅ、、Ｈｅｒｄｉｅｓ　Ｌ、、Ｄａ　Ｃ１ａｒｃｑ　Ａ、 。

５ｅｕｒｉｎｃｋ　Ｊ、、Ｌａｅｍａｎｓ　Ｊ、、Ｖａｎ　Ｄａｍｍａ　Ｊ、。

Ｓｅｇｕｒａ　Ｍ、、Ｇｈｅｙｓｅｎ　Ｇ、、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ　Ｍ、ａ ｎｄＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ　Ｊ、（１９８日）、Ｐｌａｒ＋ｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、８７゜８５９−８６６゜ −Ｋｎｏｗｌａｓ　Ｂ、ａｎｄ　Ｅｌｌａｒ　Ｄ、（１９８６）、Ｊ、Ｃｅ１１ ．Ｓｃｉ東し　８９−１０１゜ −Ｋｒｉｅｇ　Ａ、、Ｈｕｇｅｒ　Ａ、、Ｌａｎｇｅｎｂｒｕｃｈ　Ｇ、ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｔｔｅｒ　Ｗ、（１９８３）、Ｚ、Ａｎｇ＋　Ｅｎｔ、９６゜５００ −５０８゜ −Ｋｒｉｅｇ　Ａ、ａｎｄ　Ｌａｎｇｅｎｂｒｕｃｈ　Ｇ、（１９８１）、工ｎ 　：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐｅｓｔｓ　ａｎｄ　ｐｌａ ｎｔｄｉｓｅａｓｅｓ　１９７０−１９８０　（Ｅｄ、Ｈ，Ｄ、Ｂｕｒｇｇｓ） 。

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Ａｐｐｌ、Ｅｎｔ、１０５，２４９−２５５゜−Ｋｒｏｎｓｔａｄ　、７．、　 ５ｃｈｎｅｐｆ　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｈｉセｅｌｅｙ　Ｈｏ（１９８３）、　Ｊ、　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ−１５４，（１９−４２８゜−Ｍａｈｉｌｌｏｎ　Ｊ、ａｎ ｄ　Ｄｅｌｃｏｕｒ　Ｊ、　（１９８４）、Ｊ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２．　６９−７３゜−Ｍａｘａｍ　Ａ 、ａｎｄ　Ｇ１１ｂａｒｔ　Ｗ、（１９８０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙ ｍｏｌ、６５，４９９−５６０゜−ＭｃＧａｕｇｈｅｙ　Ｗ、（１９８５）、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．１９３−１９５゜−ＭｃＧａｕｇｈｅｙ　Ｗ、ａｎｃ ｉ　Ｂｅｅｒｎａｎ　Ｒ，（１９８Ｂ）、　Ｊ、Ｅｃｏｎ＋Ｅｎセｏｍｏ１．　 ８１．　２８−３３゜−Ｍｕｎｓｏｎ　Ｐ、ａｎｄ　Ｒｏｄｂａｒｄ　Ｄ、（１ ９８０）、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、１０７，２２０−２３９゜−Ｐａｚｋｏｗｓｋｉ　ａｎｄ　 ｃｏｏｐｅｒａｔｏｒｓ　（１９８４）、ＥＭＢＯＪ　３゜２７１フー２７２２ ゜ −−Ｐｅｉｅｍａｎ　Ｊ、、　Ｂｏｅｒｊａｎ　Ｗ、、　Ｅｎｇｌ＠ｒ　Ｇ、、 　５ｅｕｒｉｎｃｋＪ、、　Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ　Ｊ、、　Ａ１１ｉｏｔｅ　Ｔ 、、　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ　Ｍ。

ａｎｄ工ｎｚ６　Ｄ、（１９８９）、　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１１，１３ １−９３゜−Ｒａｍａｕｔ　Ｅ、、　５ｔａｎｓｓｅｎ　Ｐ、　ａｎｄ　Ｆｉｅ ｒｓ　Ｗ、（１９８１）。

Ｇａｎｇ　１５．　８１−９３゜ −Ｒｏｃｈａ−９ｏｓａ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）ＥＭＢＯＪ、旦、２３−２ ９゜−５ａｎｄｌａｒ　Ｓ＋、５ｔａｙｔｏｎ　Ｍ、、Ｔｏｗｎｓａｎｄ　Ｊ、 、ＲａｌｓｔａｎＭ、、Ｂｅｄｂｒｏｏｋ　Ｊ、ａｎｄ　Ｄｕｒ＋＋；ｍｕｉｒ 　Ｐ、（１９８８）。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１１．　３０１−３１０゜−５ｃａｔｃｈａ ｒｄ　Ｇ、（１９４９）、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１゜旦、６６０−６ ７２゜ −５ｃｈｏｃｈｅｒ　Ｒ，，５ｈｉｌｌｉｔｏ　Ｒ，，５ａｕｌ　Ｍ、、Ｐａｚ ｋｏｗｓｋｉＪ、ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　１．　（１９８６）　Ｂｉｏ／ｌ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉ。

１０９３−１０９６゜ −５ｈｉｅｌｄｓ　（１９８？）、　Ｎａｔｕｒｅ　３；狙、１２（３゜−５ｃ ｈｎｓｐｆｆｉ　Ｈ，、Ｗｃｒ＋ｇ　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｈｉｊｅｌｅｙ　Ｈ，ｊ１ ９８５）。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．６２６４−６２７２゜−５ｔａｎｓｓ ｅｎｓ　Ｐ、、　Ｒｅｍａｕｔ　Ｅ、　ａｎｄ　Ｆｉｅｒｓ　Ｗ、（１９８５） 。

Ｇｅｎｅ　：１６，２１１−２２３゜ −５ｔａｎｓｓｅｎｓ　Ｐ、、ＭｃＫｅｏｗｎ　Ｙ、、Ｆｒ１ｅｄｒｉｃｈ　Ｋ 、ａｎｄＦｒｉｔｚ　Ｈ，（１９８７）　：　”Ｏｌｉｇｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ 　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎ ｇ　ｔｈｅ　ｐＭａ／ｃ　ｐｌａｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒｓｌｌ、ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　 Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅＥＭＢＯｃｏｕ ｒｓｅ　ｅｎｔｉｔｌｅｄ　”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓＬｓａｎ ｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’″ｉｎ　Ｊｕｌｙ　１９８７　 ａｔ　ｔｈｅＭａｘ　Ｐｌａｎｃｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　ｆｕｒ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｅ。

Ｍａｒｔｉｎｓｒｉａｄ、ＦＲＧ。

−５ｔｏｎｅ　Ｔ、、５１ｍ５　Ｓ、ａｎｄ　Ｍａｒｒｏｎｅ　Ｐ、（１９８９ ）、Ｊ。

工ｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈｏ１．５３，２２８−２３４゜−Ｖａｅｃｋ　Ｍ、、Ｒ ｅｙｎａａｒｔｓ　Ａ、、Ｈ６ｆｔｅ　Ｈ，、ＪａｎｓｅｎｓＳ、、Ｄａ　Ｂｅ ｕｋｅｌｅｅｒ　Ｍ、、Ｄｅａｎ　Ｃ，Ｚａｂｅａｕ　Ｍ、、ＶａｎＭｏｎｔａ ｇｕ　Ｍ、ａｎｄ　Ｌｅｅｍａｎｓ＋　Ｊ、（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ工巨、 ３：１−３７゜ −ｖｏｌｌｅｒ、Ｂｉｄｗｅｌｌ　ａｎｄ　Ｂａｒｌｅｔｔ　（１９７６）、Ｉ ｎ＝Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｅｄｓ 、Ｒｏｓｅ　ａｎｄＦｒｉｅｄｍａｎ）、ｐｐ、５０６−５１２．　八ｍｅｒｉ ｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ−Ｖｅｌｔｅｎ　Ｊ、、Ｖｅｌセａｎ　Ｌ、、Ｈａｉｎ　Ｒ，ａｎｄ　５ｃ ｈｅｌｌ　Ｊ。

（１９８４）、ＥＭＢＯＪ、３，２７２３−２７３０゜−Ｖｅｌｔｅｎ　Ｊ、ａ ｎｄ　５ｃｈｅｌｌ　Ｊ、（１９８５）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１３． ６９８１−６９９８゜ −Ｗｉｄｎｅｒ　ｗ、ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ　Ｈ，（１９８９）、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１．９６５−９７４゜−Ｗｏｌｆａｒｓｂｅｒｇａ ｒ　Ｍ、、Ｌｕｔｈｙ　Ｐ、、Ｍａｕｒｅｒ　Ａ、。

Ｐａｒｅｎｔｉ　Ｐ、、５ａｃｃｈｉ　Ｖ、、Ｇｉｏｒｄａｎａ　Ｂ＋　ａｎｄ Ｈａｎｏｚｅｔ　Ｇ、　（１９８７）、　Ｃｏｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ。

並、３０１．−３０８゜ −Ｙ３ｎｌＯＦ−−ＰＣｒｌ：Ｏｎ　Ｃ，／　Ｖａｘｃｒａ　Ｊ、ａｒｉｄ　Ｍ ｅＧＱｌｎｑ　Ｊ。

（１９８５）、Ｇｅｎｅ　３３，１０：ｌ−１１９゜１２５Ｉ　−Ｂｔ２毒素の 最大結合率（％）１２５Ｉ−Ｂｔ３毒素の最大結合率（％）１２”　Ｉ　−Ｂｔ ２毒素の最大結合率（％）１２５Ｉ　−Ｂｔ７３毒素の最大結合率（％）Ｉ２５ １−Ｂｔ３毒素の最大結合率（％）１２５■−日ｔ７３毒素の最大結合率（％） １２５Ｉ−Ｂｔ２毒素の最大結合率（％）１９ら−−１〜　−ｊ＝＝ｌ＋　ｌ！ 　Ｉ　１ＬＡや　、。７．１２５１−Ｂｔ１４毒素の最大結合率（％）”’Ｉ− Ｂｔ２毒素の最大結合率（％）１２５Ｉ　−Ｂｔ１５毒素の最大結合率（％）１ ２”Ｉ−Ｂｔ２毒素の最大結合率（％）１２５Ｉ−ＢｔｌＢ毒素の最大結合率（ ％）第１３図 １０　２０　３０　！ｔｏ　５０ ＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴ　ＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧ　ＧＡｍＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣ ＧＴＴＡ　ＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＣＣＡＡ　ＡＡＡＣＴＡＧＴＧＣ ＡＡＣＴＡＡＡＴＡＴ　ＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴ　ＡＣＡＣＴＧＡＴＴＡｌｌｏ　 １２０　．１３０　１１１０　１５０ＡＡＴＡＣＴＴＴＡＴ　ｍＴＧＧＧＡＧＴ 　ＡＡＧＡｍＡＴＧ　ＣＴＧＡＡＡＴＧＴＡ　ＡＴＡＡＡＡＴＴＣＧＴＴＣＣＡ ＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＴ　ＣＡＴＡＡＡＡＴＧＴ　ＴＴＣＡＴＡＴＧＣ Ｔ　ＴＴＡＡＡＴＴＧＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡ　ＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡ　ＣＴ ＴＡＡＡＡＧＧＡ　ＣＴＴＴＡＧＴＡＡＴ　ＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ ＡＴＡＧ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＣ ＣＡＡ　ＴＧＴＭＥＴ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｇ ｉｎ　Ｃｙｓ第１３図（続１） ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＴＡＣＡＡＴ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＭＴ　ＣＣＴ　ＭＧ 　ＧＡＧ　ＡＴＡ　ＡＴＡＶａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　ｌ１ｅＴＴＡ　ＧＧＣＧＡ Ｇ　ＧＭ　ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＡ 　ＧＣＡＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＡｌａＧＡＣＡＴＴ　ＴＣＡ　ＴＴＡ　ＧＧ Ｇ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＭＴ　ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＴＡｓｐ　 Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　 Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＴＴＴ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　Ｔ ｆｆ　ＡＴＡ　ＧＴＡ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＡＡＰｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　ＧｌｕＴＴＡ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＣＣＴ 　ＴＣＧ　ＣＭ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＡＴＴＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　ｌ１ｅＴＴ Ｔ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＣＭ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＡＧＴ 　ＣＭ　ＡＧＡ　ＡＴＡＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｎ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ第１３図（続２） ＧＭ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＡＧＧ　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　Ｔ ＣＡ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＧＡＧＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｎ　Ａ］、ａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧＧＧ　ＣＴ Ａ　ＡＧＣＭＴ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣＴＡＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　Ｇ ＣＧ　ＴＴＴＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ、　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖ ａｌ　Ｔｙｒ　Ｖａ、Ｉ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈｅ６１１　’６２０　６２９． ’　６３８ＡＧＣＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＧ　ＭＡ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡ Ｔ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＡＧＧＳｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ 　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＧＡＡ　 ＧＭ　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＡＴＡ　ＣＭ　ＴＴＴ、ＡＡＴ　ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＴ 　ＡＧＴ　ＧＣＴＧｌｕ　Ｇｌｕ　ＭＥＴ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　 Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＭＥＴ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＡｌａＣＴＣＡＴＡ　ＡＣＧ　ＧＣ Ｔ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＣＭ　ＭＴ　ＴＡＴＬ ｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　ＴｙｒＧＡＡ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＴＣ Ｔ　ＧＴＡ　ＴＡＴ　ＧＴＴ　ＣＭ　ＧＣＣＧＣＡ　ＡＡＣＧｌｕ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ａｓｎ第１３図（続３） ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＴＣＴ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　 ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＴＴＣＧＧＡＬｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅ ｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ８００　８０９ 　８１８　Ｂ２７　’８３６ＧＭ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　 ＡＣＡ　ＧＣＧ　ＡＣＴ　ＡＴＣＭＴ　ＡＡＴ　ＣＧＣＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ 　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＩＬｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ 　ＡｒｇＴＡＴ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＡＧＣＣＴＴ　ＡＴＴ　Ｃ ＡＴ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＡｃＴＭＣＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＣＡＴ　Ｔ ＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　Ａ ＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＧＨＩＳ　ＣＹＳ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓ ｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ９Ｌ７　９２６　９３５ 　９４４　’９５３ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＡＧＣＧＡＴ　 ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＴＡ　ＴＡＴ　ＭＴ　ＣＧＴＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒ ｇ９６２　９７１　９Ｂ０　９８９ ＴＴＣＣＧＧ　ＡＧＡ　ＣＭ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＴＴ Ａ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＧＴＴＰｈｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ 　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　１．１ｅ　Ｖａｌ第１３図（’； ａ　４’　） ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　 ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＣＣＡ　ＡＴＴＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔ ｙｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ｌ１ｅＣＡＡ　ＡＣ Ａ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＡＣＧ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＧＴＣＴＡＴ 　ＣＴＧ　ＧＡＴＧｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ１０７９　１０８８　１０９ ７　Ｌ１０６ＴＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＭＴ　ＣＴＴ 　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　 Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　５ｅｒＴ ＡＴ　ＣＣＡ　ＡＣＣＴＴＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＧＣ Ｔ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＡＧＡＴｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ 　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　ＡｒｇＡＧＴ　ＣＣＴ　 ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＧＡＣＴＴＴ　ＴＴＡ　ＭＴ　ＡＧＣＴＴＴ　ＡＣＣ ＡＴＴＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａ ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ１１９６　Ｌ２０５　１２１４　１２２ ３ＴＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＧＴ　ＴＡＴ　ＧＣＡ 　ＴＡＴ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ第１３図（ 続５） Ｌ２３２　１２４１　１２５０　１２５９ＣＡＣＴＴＧ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＴＣ Ｔ　ＴＴＣＣＧＣＡＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＴＨｉｓ　Ｌｅ ｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈ ｒ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＴＴＧ　ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＴＣＣＣＣＴ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　 ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＭＴ　ＡＣＡＧＡＧ　ＣＧＣＣＣＣＧＴＡ　 ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＡＣＣＧＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＡＧＣＧＴＡ　ＣＣＡＧｌｕ 　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ 　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　 ＧＧＣＣＴＴ　ＧＡＣＭＴｌｌｅ　ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＡｓｎＴＣＡ　ＡＡＴ　Ｃ ＣＴ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＣＧＡＧ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴ ＣＣＭＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇ１ｎＡＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＡＧＴ　ＡＧ Ａ　ＡＧＴ　ＡＴＣＴＡＴ　ＣＧＴ　ＡＭ　ＡＧＣＧＧＴ　ＣＣＡＡｓｎ　Ｔｈ ｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

第１３図（続６） ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＡＧＴ　ＧＭ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　Ｃ Ｍ　ＧＡＴ　ＧＣＣＡＧＣｌｌｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　 Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　５ｅｒＧＴＡ　ＴＣＴ　Ｃ ＣＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＡＧＴ　ＣＡＣＣＧＴ　ＴＴＡ　ＴＧ ＣＣＡＴＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　 Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　ＨｉｓＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　Ｇ Ｍ　ＣＧＧ　ＡＴＴ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＧＣＡＡｌａ 　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＡｌａＧＧＣＡＣＣＧＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＣ Ａ　ＣＡＣＣＧＴ　ＡＧＴ　ＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈ ｅ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ、Ｓｅｒ　Ｐｒ 。

ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＡＧＴ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　 ＡＣＡ　ＣＭ　ＡＴＴ　ＣＣＡＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒ ｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。

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ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　 ＭＡ　ＡＧＡ　ＧＣＧ　ＧＡＧＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅ ｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ第１３図（続１ ２） ＡＭ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＣ、ＡＡＡ　ＣＧＣＧＡＡ　ＡＣＡ　ＴＴ Ａ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＧＡＡＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ 　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＡＣＡ　ＡＣＴ　 ＡＴＣＧＴＴ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＭ　ＴＣＴ　ＧＴ Ａ　ＧＡＴＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ２９５１　２９６０　２９６９　２ ９７ＢＧＣＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＡＡＣ’ｒＣＴ　ＣＭ　ＴＡＴ　ＧＡ Ｔ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＣＭ　ＧＣＧＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ＡｌａＧＡＴ　Ａ ＣＧ　ＡＡＣＡＴＣＧＣＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＡＴ 　ＡＡＡ　ＣＧＣＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　ＭＥＴ　Ｉｌｅ　 Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＧＴＴ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　Ａ ＴＴ　ＣＧＡ　ＧＭ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＣ ＴＶａｌ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　５ｅｒＧＴＧ　ＡＴＴ　ＣＣＧ　ＧＧＴ　ＧＴＣＭ Ｔ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＧＭ　ＧＭ　ＴＴＡＶａｌ　Ｉｌｅ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ第１３図（続１３） ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＣＧＴ　ＡＴＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣＣＴ Ａ　ＴＡＴ、　ＧＡＴ　ＧＣＧＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈ ｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＡｌａＡＧＡ　ＡＡＴ 　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＭＴ　ＧＧＣＧＡＴ　ＴＴＣＡＡＴ　ＭＴ　ＧＧＣ ＴＴＡＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐ ｈｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＴＴＡ　ＴＧＣＴＧＧ　ＡＡＣＧＴＧ　 ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　Ｇ’Ｉ’Ａ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡＬｅｕ 　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ 　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＣＡＡ　ＭＣＡＡＴ　ＣＡＣＣＧＴ　ＴＣＡ　ＧＴＣ ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＣＣＣＡ　ＧＭ　ＴＧＧＧｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ 　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　’ｒｒ ｐＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＭ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＣＧＴ　 ＧＴＣＴＧＴ　ＣＣＡ　ＧＧＴＧｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＣＧＴ　ＧＧＣ ＴＡＴ　ＡＴＣＣＴＴ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＡＣＡ　ＧＣＧ　ＴＡＣＡＡＡ　ＧＡ Ｇ　ＧＧＡＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ 　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｉ、ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ第１３図（続１４） ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＭ　ＧＧＴ　ＴＧＣＧＴＡ　ＡＣＧ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ 　ＡＴＣＧＡＧ　ＭＣＴｙｒＧ！Ｙ　Ｇ１４！ＧＩＹＣｙＳｖ、３１　Ｔｉ１ｒ 工１ｅ）ｉｉＳＧｌｕｌＢ　ＧｌｕＡＳｎＡＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣＧＭ　ＣＴＧ 　ＡＡＡ　ＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴ　ＧＴＡ　ＧＭ　ＧＡＧＡｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ３４１９　３４２Ｂ　３４３７　３４４６ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＴＡ Ｔ　ＣＣＡ　ＡＡＣＡＡＣＡＣＧ　ＧＴＡ　ＡＣＧ　ＴＧＴ　ＡＴＴ　ＭＴ　Ｔ ＡＴＧｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　ＴｙｒＡＣＴ　ＧＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＧＭ　 ＧＭ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＴＡＣＡＣＴ　ＴＣＴＴｈｒ　Ａｌａ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ 　Ｔｈｒ　５ｅｒＣＧＴ　ＡＡＴ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＣＧＡＡ　Ｇ ＣＣＴＡＴ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＭＣＣＣＴＡｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔ ｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

３５３６　３５４５’　３５５４　３５６３ＴＣＣＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　Ｇ ＡＴ　ＴＡＴ　ＧＣＧ　ＴＣＡ　ＧＴＣＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡＳｅｒ 　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ第１３図（続１５） ＴＣＧ　ＴＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＭＴ　Ｃ ＣＴ　ＴＧＴ　ＧＭ　ＴＣＴＳｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｒｇ 　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｑｎ　Ｐｒｏ　ＣＹＳ　ＧＩＵ　５ｅｒＭＣＡＧＡ　ＧＧ Ａ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＴＡＣＡＣＡ　ＣＣＡ　ＣＴＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ 　ＧＧＴＡｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　 Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＧｌｙＴＡＴ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＭＧ　ＧＭ 　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＴＡＣＴＴＣＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＡＴＴｙｒ　Ｖａｌ 　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ 　Ｔｈｒ　ＡｓｐＡＡＧ　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　 ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＭ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＴＴＣＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｉｌ ｅ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈ ｅＡＴＣＧＴＧ　ＧＡＣＡＧＣＧＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＣＴＣＣＴＴ　ＡＴＧ 　ＧＡＧ　ＧＭ　ＴＡＧｌｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＭＥＴ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　。

第１３図（統１６） ＧＡＣＣＡＴＣＣＧＡ　ＧＴＡＴＡＧＣＡＧＴ　ＴＴＡＡＴＡＡＡＴＡ　ＴＴＡ ＡＴＴＡＡＡＡ　ＴＡＧＴＡＧＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣＧＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＡ ＴＡ　ＡＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＣＧＡＡＣ３８ ７１３８８１３８９１３９０１’ ＡＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＧＡＴ　ＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ　ＴＡＴＡ ＴＧＧＴＧＴＧＴ第１４図 ＡＡＴＡＧＡＡＴＣＴ　ＣＡＡＡＴＣＴＣＧＡ　ＴＧＡＣＴＧＣＴＴＡ　ＧＴＣ ＴＴＴＴＴＡＡ　ＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＴＧＡＣＡＧＧＧＧ　ＴＡＧＧＡＡＣ ＡＴＡ　ＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴ　ＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧ　ＧＧＧＣＡＴＡＴＡＴ ｌｌｏ　１２０　１３０　１４０　１５０ＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡ　ＴＡＡＡＡＴ ＴＴＧＴ　ＴＡＣＧｍｍ　ＧＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＴ ＡＴＧＴＡＴ　ＴＡＡＡＴＣＧＴＧＧ　ＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡ　ＣＡＧＴＡＴＣ ＡＡＡ　ＣＴＡＴＣＡ（ｉＡＡＣｍＧＧＴＡＧＴＴ　ＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡ　Ａ ＣＧＧＡＧＯＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ−−−−−ＭＥＴ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｕ ２！１８　２５７　２６６　２７５ ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＴＯＣＡＴＡ　ＣＣＴ　ＴＡＣＡＡ Ｔ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　ＡＧＴＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｕｎ　Ｃｙｓ 　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　５ｅｒ２８４’　２９３ 　３０２　３１１　３２０ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　 ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＣＧＧ　ＡＴＡ　ＴＣＡＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉ ｌｅ　Ｓｅｒ第１４図（続１） ３２９　３３８’　３４７　３５６ ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　 ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＧＴＴＴｈｒ　Ｇｌｖ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉ ｌｅ　ＡＳＤ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａ１ＣＡＧ　ＴＴ Ｔ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＡＡＣＴＴＴ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＧＧＡ 　ＧＧＡ　ＴＴＴＧｌｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＰｈｅＴＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　Ｔ ＴＡ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　Ｇ ＧＣＬｅｕＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ 　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ４４６　４５５　４６４　４フ３ ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＣＭ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＧＴＡ　Ｃ Ｍ　ＡＴＴ　ＧＭ　ＣＡＡＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｕｎ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　 Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎＴＴＡ　ＡＴＴ　Ｍ Ｔ　ＧＭ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＡＧＧ　ＡＡＴ 　ＧＣＴＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＡｌａＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　Ｔ ＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣＭＴ　ＴＴＣＡＡＴＡｌａ　Ｉ ｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｕｙ　Ａｓｎ　Ａ ｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ第１４図（続２） ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＭ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　Ｇ Ｍ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＴ■！ｅＴｙｒｖａＩ　Ｇｌｇ　Ａ１３　ｐｈ２　Ｌ ＹＳ　Ｇｌｌ　’ｌ’ｒｐ　ＧＩＩＪ　ＧＩＢ　ＡＳｐｐｒ（＞ＡＡＴ　ＡＡＴ 　ＣＣＡ　ＧＭ　ＡＣＣＡＧＧ　ＡＣＣＡＧＡ　ＧＴＡ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＣＧ ＣＴＴＴＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＰｈｅＣＧＴ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　Ｇ ＧＧ　ＣＴＡ　ＣＴＴ　ＧＭ　ＡＧＧ　ＧＡＣＡＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＧＡｒｇ　 Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　 Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　５ｅｒＴＴＴ　ＣＧＡ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　Ｇ ＡＡ　ＧＴＡ　ＣＣＣＣＴＴ　ＴＴＡ　ＴＣＣＧＴＴＰｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｖａ１ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣＡＡＴ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＣＴ Ａ　ＧＣＴ　ＡＴＡ　ＴＴＡ　ＡＧＡＴｙｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ 　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＧＡＴ　 ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　 ＴＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＧＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ第１４図（続３） ７９７　８０６　８１５　８２ＩＩ ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＧＴＣＡＡＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＴＡＴ　ＡＡＴ　ＡＧＡ　ＣＴ Ａ　ＡＴＴ　ＡＧＧ　ＣＡＴｌｌｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ 　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　ＨｉｓＡＴＴ　ＧＡＴ　 ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＯＡＴ　ＣＡＣＴＧＴ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＡＣＧ　Ｔ ＡＴ　ＡＡＴｌｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｃｙ ｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＡｓｎＣＧＧ　ＧＧＡ　ｍＡ　ＡＡＴ　 ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＡＴＡ ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔ ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　ＡｓｐＴＧＧ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＣＧ Ａ　ＴＴＡ　ＣＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＣＴＴＡ　ＡＣＡ　ＴＴＧＴｒｐ　Ｉｌｅ　 Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　ＬｅｕＡＣＴ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　Ｃ１ＡＴ　ＡＴＣＧＣＣＧＣＴ　ＴＴ ＣＴＴＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＴＡＴ　ＧＡＣＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ ｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ９８ ６　９９５　１００１Ｊ　１０１３　１０２２ＡＡＴ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＴＡＴ 　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＣＡ Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｇｕｎ　Ｉ、ｅｕ　Ｔｈｒ第１４図（絖４） ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＡＣＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　Ｍ Ｔ　ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＣＣＡＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

ＣＡＧ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＴＴ、Ａ　ＣＣＴ 　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＭＣＧＴＴＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌ ａ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｖａ１１１０３　１１ １２　１１２１　１１３０　１Ｄ９ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＡＧＣＡＧＣＧＣＡ　ＡＴ Ｔ　ＡＧＡ　ＭＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＡＴＭＥＴ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　１（ｉｓ　Ｌｅａ 　Ｐｈｅ　Ａｓｎ１４図　１１５７　１１６６　１１７５ＡＴＡ　ＴＴＧ　ＡＡ Ｔ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＡＣＡ　ＡＴＣＴＴＴ　ＡＣＧ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＴＴＴ 　、ＡＧＴｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ 　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　５ｅｒＧＴＴ　ＧＧＡ　ＣＧＣＭＴ　ＴＴ Ｔ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＧＴＡ　ＡＴＡＶａｌ 　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ 　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ｌ１ｅＴＣＴ　ＡＧＣＣＴＴ　ＡＴＡ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　Ｇ ＧＴ　ＡＡＣＡＴＡ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＡＴＡＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ 　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ 　Ｉｌｅ第１４図（続５） ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＭＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＣＣ Ａ　ＡＧＡ　ＴＣＣＴＴＴＴｖｒ　Ｇｌｖ　Ａｒａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　 Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒａ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＡＣＴ　ＴＴＴ　Ａ ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＴＴＴ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　Ｍ Ｔ　ＣＣＴＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ 　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

ＡＣＴ　ＴＴＡ　ＣＧＡ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＣＭ　ＣＣＴ　ＴＧＧ　Ｃ ＣＡ　ＧＣＧ　ＣＣＡ　ＣＣＡＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉ ｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＡ　 ＧＭ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡＰｈｅ　Ａｓ；ｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＣＣＴ　ＡＣ Ａ　ＡＡＴ　ＡＧＣＴＴＴ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＧＴ 　ＡＣＧ　ＧＴＴＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＶａＬ１４５４　１４６３　１４７ ２　１４８Ｊ、　１４９０ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＡ　ＡＣＴ　ＧＭ　Ｔ’ｉ’Ａ 　ＣＣＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＭＴ　ＡＧＴ　ＧＴＧＡＳｐ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ｔｆｌｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡＳｐ　Ａｓｎ　 Ｓｅｒ　Ｖａｌ第１４図（続６） ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＣＧＣＧＡＡ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　Ｔ ＴＡ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＣＡｐｒｎ　Ｐｒｏ　Ａｒａ　Ｇｌ＋Ｉ　ＧＩＶ　Ｔ ’ｖｒ　Ｓ６ｒ　Ｈｉｑ　Ａｒａ　Ｉ、ｅｕ　Ｃｖｓ　１（ｉｓ　Ａｌａ、）　 ＪＪ ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＣＭ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＣＣＴ　Ｔ ＴＴ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＧＧＴ　ＧＴＡ 　ＧＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＴ　ＧＣＡ 　ＡＣＴ　ＣＴＴＧｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　 １（ｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＡＣＡ　ＭＴ　ＡＣＡ　Ａ ＴＴ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＭＴ　ＣＭ　ＡＴＡ　ＣＣＴ Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　 Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。

ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　ＧＧＧ　 ＧＧＣＡＣＣＴＣＴ　ＧＴＣＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｕｙ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ 　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＶａｉＡＴＴ　ＡＣＡ　 ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣＣ ＴＴ　ＣＧ））！１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｇｕｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ第１４図（続７） １７３３　Ｌ７４２　１ソ５１　１７６０ΔＧＡ　ＡＡＴ　ＡＣＣＴＴＴ　ＧＧ Ｔ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＧＴＣＴＣＡｒ（Ｊ　 Ａｓｎ　’ｒｈｒ　ｐｈｅ　Ｇｕｙ　Ａｓｐ　ｐｈｅ　Ｖａｉ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　ＡｓｎＡＴＴ　ＭＴ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＡＣＣＣＡ Ａ　ＡＧＡ　ＴＡＣＣＧＴ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＴＴＴｌｌｅ　Ａｓｎ５ｅｒ　Ｐ ｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｕｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐ ｂｅＣＧＴ　ＴＡＣＧＣＴ　ＴＣＣＡＧＴ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　 ＧＴＴ　ＡＴＡ　ＧＴＡ　ＴＴＡＡｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａ ｒｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ＬｅｕＡＣＡ　ＧＧ Ａ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＡＡ　 Ｇ’ｌ’Ｔ　ＡＧＴＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ 　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　５ｅｒＧＴＡ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　 ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＡＭ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＧＧＧ　Ｇ ＡＧＶａｌ　Ａｓｎ　）正Ｔ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｕｎ　Ｉ、ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｍ ＥＴ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＡＡＣＴＴＡ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＡＧＡ 　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＴＡＴ　ＡＣＣＧＡＴ　ＴＴＴ　ＡＧＴＡｓｎ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　’ｒｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　ｐｈｅ　Ｓｅｒ第１４図（続８） ＭＴ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＭＴ　ＣＣＡ　ＧＡ Ｔ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＧＧＧＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｂｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ 　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　ＧｕｙＡＴＡ　ＡＧＴ　 ＧＭ　ＣＭ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＡＴ Ｔ　ＡＧＴｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ 　Ａｌａ　Ｇｕｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　５ｅｒＡＧＣＧＧＴ　ＧＭ　Ｃ’Ｉ’Ｔ　 ＴＡＴ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＣＴＡＳ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｉｕｅ　Ｇ ｌｕ、　Ｉｌｅ　ｌｉｅ　ＬｅｕＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＴ　Ｇ Ｍ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡＡｌａ　Ａｓｐ 　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈ、ｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＧＣＡ　ＣＭ　ＡＡＧ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＧＣＣＣ ＴＧ　Ｔ’ｌ’Ｔ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＣＡＡＴＡｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａ ｌａ　ＶａＬ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａ ｓｎＣＭ　ＡＴＣＧＧＧ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＡＣＣＧＡＴ　ＧＴＧ　ＡＣＧ　Ｇ ＡＴ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＡＴＴＧｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ第１４図（続９ ） ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＴＡ　ＴＣＣＭＴ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＴＴ Ａ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＧＭＡｓｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇ！ｕＴＴＴ　ＴＧＴ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＭＧ　ＣＧＡ　ＧＭ　ＴＴＧ　ＴＣＣＧＡＧ　ＡＡＡ　 ＧＴＣＰｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａ１ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＣＧ Ａ　ＣＴＣＡＧＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＧＧ　ＭＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴＬｙｓ　Ｈ ｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａ ｓｎ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＣＭ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＴＴＣＡＧＡ　ＧＧＧ　Ａ ＴＣＡＡＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　、ＧＡＣＧｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓ ｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｓ ｐＣＧＴ　ＧＧＣＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　 ＡＣＣＡＴＣＣＡＡ　ＧＧＡＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　ＧｌｙＧＧＡ　ＧＡＴ　 ＧＡＣＧＴＡ　ＴＴＣＡＭ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＴＡＣＧＴＣＡＣＡ　ＣＴＡ　Ｃ ＣＧＧｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙ ｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

第１４図（続１０） ＧＧＴ　ＡＣＣＧＴＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＡＴ　ＣＣＡ　ＡＣＧ　ＴＡ Ｔ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＣＡＧＧｌｙ　ＴｈｒｖＢｌ　、Ａ、６ｐ　Ｇｌｕｌ：’ Ｙ３　’ｌ’ｙｒｐｒＯ’ｒｈｒＴｙｒＬｅｕ’ｌ’ｙｒＧ１ｔ；。

ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　ＡＭ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　Ｔ ＡＴ　ＡＣＣＣＧＴ　ＴＡＴＬｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ 　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＴｙｒＧＭ　ＴＴＡ　Ａ ＧＡ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＡＴＣＧＡＡ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　ＧＡＣＴＴＡ 　ＧＭＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＡＴＣＴＡＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣＣＧＴ　 ＴＡＣＡＡＴ　ＧＣＡ　ＡＭ　ＣＡＣＧＭ　ＡＴＡ　ＧＴＡｌｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｉ ｌｅ　Ｖａ１ＭＴ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣＡＣＧ　ＧＧＴ　ＴＣＣＴＴＡ　Ｔ ＧＧ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈ ｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　Ｓｅｒ　ＡｌａＣＭ　 ＡＧＴ　ＣＣＡ　ＡＴＣＧＧＡ　ＡＡＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　Ａ ＡＴ　ＣＧＡ　ＴＧＣＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃｙ ｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ第１４図（続１１） ＧＣＧ　ＣＣＡ　ＣＡＣＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　Ｃ ＴＡ　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＴＣＣＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒ ｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　５ｅｒ２７０５　２７ １４　２フ２３　２７３２ＴＧＣＡＧＡ　ＧＡＣＧＧＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＴＧ Ｔ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＴＣＣＣＡＴ　ＣＡＴＣｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　 Ｈｉｓ２７４１　２７５０　２７５９　２７６Ｂ　２７７７ＴＴＣＡＣＣＴＴＧ 　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣＴＴＡ　 ＭＴＰｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｃｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＧＡＧ　ＧＡＣＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　 ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＴＡ　ＴＴＣＭＧ　ＡＴＴ　ＭＧ　ＡＣＧＧｌｕ　Ａｓｐ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　 Ｌｙｓ　ＴｈｒＣＭ　ＧＡＴ　ＧＧＣＣＡＴ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＣＴＡ　ＧＧＧ 　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＣＴＣＧｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　 Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＧ Ｍ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＧＧＧ　ＧＭ　ＧＣＡ　ＣＴＡ 　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＧＴＧＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ第１４図（続１２） ＭＡ　ＡＧＡ　ＧＣＧ　ＧＡＧ　ＭＧ　ＭＧ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＣＡＡＡ　 ＣＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔ ｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＴ Ｇ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　’ｒＡＴ　ＭＡ　ＧＡＧ　ＧＣ Ａ　ＡＡＡＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ 　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＬｙｓＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＧＡＴ　 ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＴＡ　ＭＣＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴＧｌｕ 　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ 　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＡＧＡ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＣＧ　 ＭＣＡＴＣＧＣＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＧＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　 Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　ＭＥＴ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　 ＡｌａＧＣＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＧＣＧＴＴ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＡＴＣＣＧＧ 　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　ＣＴＧＡｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　 Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＣＣＡ　Ｇ ＡＧ　ＴＴＧ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＭＴ　ＧＣＧ 　ＧＣＣＡＴＴＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ第１４図（続１３） ＴＴＣＧＡＡ　ＧＭ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＣＧＴ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＡＣ Ａ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　ＴＣＣｐｈＢ　Ｇ１２　Ｇｌｐ　ｊｅｕＧｌｕＧｌｙ　Ａ ｒｇ　ｌＢ　ｐｈＢ　Ｔｈｒ　Ａ１２　ＴｙｒＳｅｒＴＴＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　 ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＧＴＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＣＧＡＴ　ＴＴ ＣＬｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ 　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＰｈｅＡＡＴ　ＭＴ　ＧＧＣＴＴＡ　ＴＴＡ　ＴＧ ＣＴＧＧ　ＭＣＧＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＧＴＡＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌ ｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｈｉ ｓ　Ｖａ１ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＧＭ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＭＣＡＡＣＣＡＣＣＧＴ　 ＴＣＧ　ＧＴＣＣＴＴ　ＧＴＴＡｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓ ｎ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａ１ＡＴＣＣＣＡ　 ＧＭ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　ＣＭ　ＧＡＧ　ＧＴ Ｔ　ＣＧＴｌｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＡｒｇＧＴＣＴＧＴ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　Ｃ ＧＴ　ＧＧＣＴＡＴ　ＡＴＣＣＴＴ　ＣＧＴ　ＧＴＣＡＣＡ　ＧＣＡＶａｌ　Ｃ ｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ第１４図（統１４） ３３７１　３３８０　３３８９　３３９ＢＴＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　Ｔ ＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＧＣＴＧＣＧＴＡ　ＡＣＧ　ＡＴＣＣＡＴＴｙｒ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇａｙ　ＧｌｕＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　Ｉｌｅ　ＨｉｓＧＡＧ　ＡＴＣＧＭ　ＧＡＣＡＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣＧＡＡ 　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓ ｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＴＧ Ｔ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＭ　ＧＴＡ　ＴＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＭＣＡＣ Ａ　ＧＴＡ　Ａ、ＣＧＣｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙ ｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＴｈｒＴＧＴ　ＡＡＴ　ＭＴ　 ＴＡＴ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣＴ　ＣＭ　ＧＭ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧ ＴＣｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＡＣＧ　ＴＡＣＡＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＴ　Ｍ Ｔ　ＣＭ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＣＧＡＡ　ＧＣＣＴＡＴＴｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｒ＋　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａ ｌａ　Ｔｙｒ３５６０’　３５６９　３５７８　３５８’ｌ　３５９６ＧＧＴ　 ＡＡＴ　ＡＡＣＣＣＴ　ＴＣＣＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＴＡＣＧＣＴ 　ＴＣＡ　ＧＴＣＧｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ第１４図（続１５） ＴＡＴ　ＧＭ　ＧＭ　ＡＭ　ＴＣＧ　ＴＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＧＡ 　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＴＴｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＣＣＴ　ＴＧＴ　Ｇ Ｍ　ＴＣＴ　ＭＣＡＧＡ　ＧＧＣＴＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＴＡＣＡＣＡ　ＣＣ ＡＰｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ 　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｂｒ　Ｐｒ。

ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＡＣＡ’　ＡＡＧ　ＧＡＴ 　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＴＡＣＴＴＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ３７２２　３ ７３１　’３７４０　３７４９ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＡＴ　ＭＧ　ＧＴＡ　 ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＧＡ　ＧＭ　ＡＣＡＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ 　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ 　ＴｈｒＧＭ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＴＴＣＡＴＣＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＧＣＧＴＧ　 ＧＭ　ＴＴＡ　ＣＴＣＣＴＴＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ 　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ第１４図（続１６ ） ＡＭＧＭＴＧＡＴ　ＴＡＣＴＧＡＣＣＴＡ　ＴＡＴＴＡＡＣＡＧＡ　ＴＡＡＡＴ ＭＧＡＡ　ＭＴＴＴＴＴＡＴ八３８９３　へ　３９０３　３９１３　３９２３Ｃ ＧＡＡＴＡＡＡＡＡ　ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡ　ＣＴＣＴＴＡＡＧＡＧ　ＭＴＧＡ ＴＧＴＣＣ第１５図 第１５図（続） ｂ） 第１６図 ａ） 第１６図 ｂ） ρ）−（ＷＳ２ Ｎｃｏｌ　ｂｔ１４ ＠１６図 Ｃ） ＮＣＯｙ　ｂｔ１４ｔｏｘ　ｎｅ。

第１６図（続） 第１６図（続） Ｔ 国際調査報告 １＃＋−駒Ｃ豐−・量中Ｎ１＾−１１Ｍｊ１４鈎−−・ＰＣＴ／ＥＰ９０１００ ９０５国際調査報告 ＥＰ９０口０９０５ Ｓ＾　３７３４７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも二つのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（バチレスツリンギエン シス）ＩＣＰ遺伝子が植物のゲノム中に安定に挿入され；該遺伝子の各々が昆虫 種に対する異なった非競合性結合１ＰＣをコードし；それによって、該昆虫種の 円柱状中腸上皮細胞の刷子縁膜と競合的に結合しない少なくとも二つの異なった ＩＰＣが、該細胞によって産生され得ることを特徴とする植物細胞。 ２．上記細胞と、その蛋白質又はポリペプチドを含有しない細胞とを容易に識別 可能にする蛋白質又はポリペプチドをコードする少なくとも一つのマーカー遺伝 子が、少なくとも一つの上記１ＣＰ遺伝子と同じ遺伝子座にある請求の範囲第１ 項記載の細胞。 ３．上記１ＣＰ遺伝子の各々が、上記細胞における遺伝子発現を指示し得る別々 のプロモータの制御下にあって、同一転写単位内に３′末端形成のためのシグナ ルを具備する請求の範囲第１項又は第２項記載の細胞。 ４．上記マーカーＤＮＡが上記植物細胞における遺伝子発現を指示し得る別個の プロモータの制御下にあって、同一転写単位内に３′末端形成のためのシグナル を具備する請求の範囲第２項又は第３項記載の細胞。 ５．上記１ＣＰ遺伝子が同一転写単位内にあって、かつ、シグナルプロモータの 制御下にある請求の範囲第１項又は第２項記載の細胞。 ５．上記マーカー遺伝子が少なくとも一つの上記ＩＣＰ遺伝子と融合し、上記同 一転写単位内にあり、かつ、上記プロモータの制御下にある請求の範囲第５項記 載の細胞。 ７．プロテアーゼ感受性であるか、又は、プロテアーゼにより切断可能なアミノ 酸配列をコードするＤＮＡ断片が、上記ＩＣＰ遺伝子と同じ上記転写単位に存在 し、そして上記１ＣＰ遺伝子間の枠内に挿入される請求の範囲第５項又は第６項 記載の細胞。 ８．上記ＩＰＣ遺伝子が、翻訳再開を可能にし、該ＩＰＣ遺伝子と同じ転写単位 内にあって該ＩＰＣ遺伝子間に挿入された遺伝子間ＤＮＡ配列を含むジシストロ ン単位中で一緒にされている請求の範囲第５項又は第６項記載の細胞。 ９．上記ＩＣＰ遺伝子がＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種に対する活性を有する殺虫蛋 白質をコードする遺伝子であって、特に以下の遺伝子：ｂｔ２及び／又はｂｔ７ ３及び／又はｂｔ４及び／又はｂｔ１４及び／又はｂｔ１５及び／又はｂｔ１８ である請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一に記載の細胞。 １０．上記ＩＣＰ遺伝子がＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ種に対する活性を有する殺虫性 蛋白質をコードする遺伝子であって、特に以下の遺伝子：ｂｔ１３及び／又はｂ ｔ２１及び／又はｂｔ２２である請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一に記載 の細胞。 １１．上記マーカーＤＮＡが：除草剤耐性遺伝子、特にｓｆｒ又はｓｆｒｖ遺伝 子；除草剤に対する低親和性を示す除草剤のための修飾標的酵素をコードする遺 伝子、特にグリフォセートに対する標的としての修飾５−ＥＰＳＰ又はＧＳ阻害 剤に対する標的としての修飾グルタミンシンセターゼ；あるいは抗生物質耐性遺 伝子、特にＮＰＴＩＩである請求の範囲第２項〜第１０項のいずれか一に記載の 細胞。 １２．上記プロモータが：構成プロモータ、特に３５Ｓプロモータ又は３５Ｓ３ プロモータ；ＰＮＯＳプロモータ；ＰＯＣＳプロモータ；傷誘発性プロモータ、 特にＴＲ１′又はＴＲ２′プロモータ；光合成活性を有する植物組織において選 択的に遺伝子発現を指示するプロモータ、特にＳＳＵプロモータ；もしくは、組 織特異性プロモータ、特に塊茎特異性プロモータ、茎特異性プロモータ又は種子 特異性プロモータである請求の範囲第３項〜第６項のいずれか一に記載の細胞。 １３．請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一の上記ＩＣＰ遺伝子を包含する 、植物細胞、特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染可能な植物細胞を形質転換 するに適したベクター。 １４．改良された昆（害）虫耐性を有し、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれ か一に記載の上記ＩＣＰ遺伝子が細胞の核ゲノム中に安定に組み込まれた植物を 製造するための方法であって、上記ＩＣＰ遺伝子を上記細胞の核ゲノム中に挿入 することによって上記植物の細胞を形質転換し、上記細胞から上記植物及び再生 物質を再生する非生物学的工程を含むことを特徴とする方法。 １５．請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一に記載の植物細胞から成る植物 細胞培養。 １６．請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一に記載の植物細胞から成る植物 。 １７．上記ＩＣＰ遺伝子が以下の遺伝子対：ｂｔ２とｂｔ１８、又はｂｔ７３と ｂｔ１５、又はｂｔ２とｂｔ１８、又はｂｔ２とｂｔ１４、又はｂｔ２とｂｔ４ 、又はｂｔ１５とｂｔ１８、又はｂｔ１４とｂｔ１５、又はｂｔ４とｂｔ１５、 又はｂｔ１３とｂｔ２１、又はｂｔ２１とｂｔ２２、又はｂｔ１３とｂｔ２２の 一つを含心請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一に記載の植物細胞から成る ハクサイ、トマト、ジャガイモ、タバコ、綿、又はレタス。 １８．上述の方法によって作られる請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一に 記載の細胞。 １９．植物を、請求の範囲第１項〜第１２のいずれか一に記載の上記ＩＣＰ遺伝 子で形質転換することによって、昆（害）虫種に対して植物を耐性にするための 方法。