JPWO2006054690A1 - 遺伝子多型検出方法、診断方法、並びにそのための装置及び検査試薬キット - Google Patents

Abstract

【課題】複数のＳＮＰ部位のためのタイピングを試料の調整の段階から自動的に行なえるようにする。【解決手段】試料２とＰＣＲ反応液４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行わせる。ＰＣＲ反応終了後、インベーダ試薬６が添加される。次に、インベーダ試薬６が添加された反応液がタイピング反応部のプローブ固定部８に添加して反応をさせる。プローブ固定部８の各部位には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応して蛍光を発するインベーダプローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのインベーダプローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。【選択図】 図１

Description

本発明は人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出するための方法、装置、試薬及びその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を行なう方法及びその装置に関するものである。
この遺伝子多型検出方法や装置は、遺伝子解析の研究や臨床分野において利用することができる。

遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸試料を採取し、該試料中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。

ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特開２００１−２９９３６６号公報。）。

ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。

しかし、ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムDNAの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。
一方、ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などの試料から直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、遺伝子を含む試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含む試料中の遺伝子包含体もしくは遺伝子を含む試料そのものを遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含む試料中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。
特表２００２−５３３０９６号公報 特開２００１−２９９３６６号公報 特開２００２−３００８９４号公報 特許第３４５２７１７号公報 特許第３４９４５０９号公報 Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8):1373-7

既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取するＤＮＡ量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体試料からＤＮＡを抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。

一方、血液などの生体試料から核酸を抽出しない状態で直接にＰＣＲ法により増幅を行なう方法も既に確立されているが、その直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムは構築されていない。
そこで、本発明は目的とする複数のＳＮＰ部位のためのタイピングを試料の調整の段階から自動的に行なえるようにすることを目的とするものである。

本発明の遺伝子多型検出方法は、核酸抽出操作を施していない生体試料を、複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液に直接作用させ、ゲノムＤＮＡを増幅させる増幅工程と、その増幅工程で増幅させたゲノムＤＮＡに対し、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を作用させて前記複数の多型部位の塩基を判別するタイピング工程とを含んでいる。

ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体試料には複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはＳＮＰである。

ここで、核酸抽出操作とは、核酸包含体（細胞、細菌、真菌、ウィルスなど、核酸を内部に含有する膜構造体）を分解し、分解した核酸包含体から核酸を抽出する一連の操作である。核酸包含体の分解は、例えば酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等を用いて行う。分解した核酸包含体からの核酸の抽出は、例えば、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて行う。
したがって、核酸抽出操作を施していない生体試料とは、これらの一連の操作を施していない試料であり、核酸包含体を含む生体試料そのもの、加熱処理もしくは凍結処理などを行なって核酸包含体が分解した状態の生体試料、生体試料から回収した核酸包含体を含む。生体試料から核酸包含体の回収方法は、例えば遠心・超遠心操作、ポリエチレングリコールなどの共沈剤、吸着担体などを用いた方法が挙げられる。

ここで、生体試料は、動植物組織、体液、排泄物等をいい、体液には血液や唾液が含まれる。
ゲノムＤＮＡには、ヒトをはじめ動植物ＤＮＡ、細菌及びウィルス等のＤＮＡ、さらには、ＲＮＡを鋳型に合成されたｃＤＮＡが含まれる。

前記増幅工程はＰＣＲ法などを使用することができる。その場合、ＰＣＲ法を２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下で行なうのが好ましい。
上述した核酸抽出操作を施していない生体試料からのゲノムＤＮＡの増幅工程は、特許文献４，５に詳細に記載されている。
前記タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。
本発明の診断方法は、特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値をデータベースとして用意しておき、本発明の遺伝子多型検出方法により検出された多型結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出すものである。ここで、診断値としては、病気罹患率や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などを含むことができる。

本発明の遺伝子多型検出装置の一局面は、核酸抽出操作を施していない生体試料を設置する試料設置部と、複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液を保持する増幅試薬保持部と、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を保持するタイピング試薬保持部と、前記生体試料を前記遺伝子増幅反応液に添加された反応液内でゲノムＤＮＡを増幅させるためにその反応液の温度を制御する増幅部と、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブが保持されたプローブ固定部をもち、前記増幅部で増幅させたゲノムＤＮＡと前記タイピング試薬との反応液を各プローブと反応させるためにその反応液の温度を制御するタイピング反応部と、前記試料設置部、前記増幅試薬保持部、前記タイピング試薬保持部、前記増幅部及び前記タイピング反応部の位置に移動することができ、試料、増幅試薬、タイピング試薬、及び試料とそれらの試薬との反応液の所定位置への分注を行なう分注装置と、前記タイピング反応部の各プローブ固定部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、前記増幅部及びタイピング反応部の温度制御、前記分注装置の分注動作、並びに前記蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部とを備えて遺伝子多型を自動的に検出するようにしたものである。

ここで、各プローブ固定部は１種類のプローブのみを保持することができるだけでなく、２種類以上のプローブを保持することもできる。１つのプローブ固定部に２種類以上のプローブを保持した場合には、それぞれのプローブから発せられる蛍光を区別して検出することができるように、互いに離して配置しておく。

前記タイピング反応部の一例は、前記プローブ固定部ごとに上部が開口して反応液が供給される凹部を備えているものである。その場合、反応液の蒸発を防ぐオイルを保持するオイル保持部をさらに備え、前記分注装置は前記凹部への反応液の分注前又は分注後に、前記凹部に前記オイルを分注することができるようになっていることが好ましい。

前記タイピング反応部の他の例は、前記プローブ固定部ごとに反応液が供給される流路を備えているものである。その流路は前記プローブ固定部ごとに反応液の供給用入口と排出用出口を備えているものであってもよく、反応液の供給用共通入口と排出用共通出口に接続されているものであってもよい。その場合、前記プローブ固定部は前記流路内に凹部として形成することができる。

前記タイピング反応部のさらに他の例は、複数の前記プローブ固定部が内部に形成された流路を備えているものである。
前記試料設置部と前記増幅部が温度調節部を共通にしていてもよい。

本発明の検査試薬キットは、複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液が収容された増幅試薬収容部、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬が収容されたタイピング試薬収容部、及び前記複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブが個別に保持された複数のプローブ固定部が一体として形成されたものである。
検査試薬キットは、さらに、試料を希釈する希釈液が収容された希釈液収容部が一体として形成されていてもよい。

本発明の遺伝子多型検出装置の他の局面は、本発明の検査試薬キットを使用するものであり、その検査試薬キットを装着する検査試薬キット装着部と、前記増幅試薬収容部内で前記遺伝子増幅反応液と体液試料との反応液内でゲノムＤＮＡを増幅させるためにその反応液の温度を制御する増幅部と、前記増幅部で増幅させたゲノムＤＮＡと前記タイピング試薬との反応液を前記プローブ固定部のプローブと反応させるためにその反応液の温度を制御するタイピング反応部と、前記増幅試薬収容部から前記タイピング試薬収容部への液の移送、及び前記タイピング試薬収容部から前記各プローブ固定部への液の移送を行なう送液装置と、前記各プローブ固定部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、前記増幅部及びタイピング反応部の温度制御、前記送液装置の送液動作、並びに前記蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部とを備えている。
前記送液装置に一例は、分注ノズルを備えて必要な場所に移動可能に設置された分注装置である。

本発明の遺伝子多型検出装置のさらに他の局面は、本発明の検査試薬キットを使用するものであるが、その検査試薬キットとして各収容部が軟質材料で形成されたものを使用するものであり、前記送液装置が前記各収容部を押圧して変形させることにより送液する押圧装置となっているものである。

本発明の診断装置は、本発明の遺伝子多型検出装置と、特定のＳＮＰ又は複数のＳＮＰの組合せについて病気罹患率や投与薬剤の種類と効果及び副作用などの診断値を記憶したデータベースと、前記遺伝子多型検出装置により検出されたＳＮＰ結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出して表示する表示装置とを備えている。

図１は本発明の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体試料２にＰＣＲ反応液４を添加するか、逆にＰＣＲ反応液４に生体試料２を添加する。試料２は例えば１μＬを採取し、それにＰＣＲ反応液４を１０μＬ程度添加する。ＰＣＲ反応液４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのバッファ液、４種類のデオキシリボヌクレオチド、その他必要な試薬が添加されており、試料２と混合したときにｐＨが８.５−９.５になるように調製されている。

試料２とＰＣＲ反応液４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行わせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。試料はゲノム抽出操作を施していないものであるが、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。

ＰＣＲ反応終了後、インベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通である。
次に、インベーダ試薬６が添加された反応液をタイピング反応部のプローブ固定部８に添加して反応をさせる。プローブ固定部８の各部位には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。
インベーダ法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものが用意されており、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。

本発明で用いる増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものであり、かつ核酸抽出操作を施していない生体試料から直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる。そのため、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液を生体試料に直接作用させ、２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。

ＰＣＲ反応液は、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び熱安定性合成酵素を含む。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。

ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。

プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。

タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。

本発明の遺伝子多型検出方法では、核酸抽出操作を施していない生体試料から目的とする複数の多型部位を同時に増幅させ、それらの多型部位を同時にタイピングするので、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。
本発明の診断方法は得られた多型のタイピングを基にしてデータベースから診断値を読み出すので、医療現場で使用するのが可能になる。

本発明の第１の局面の遺伝子多型検出装置では、核酸抽出操作を施していない生体試料を試料設置部に設置して測定を開始するだけで、目的とする複数の多型のタイピングを自動的に実行することができるようになる。

本発明の第２，３の局面の遺伝子多型検出装置では、遺伝子増幅反応液及びタイピング試薬、又はさらに希釈液まで予め収容され、プローブ固定部が一体として形成された検査試薬キットを使用するので、簡便な測定装置によって目的とする複数の多型のタイピングを自動的に実行することができるようになる。
本発明の診断装置では、多型のタイピングからそれに基づいた診断値の表示までを自動的に実行することができるようになる。

図２（Ａ）は一実施例の自動遺伝子多型検出装置を概略的に示したものである。
１０は試料設置部と試薬保持部を兼ねるサンプルテーブルである。試料設置部には試料容器として採血管１２が配置される。採血管１２としては各種のサイズのもの、例えば直径１３ｍｍのもの、直径１６ｍｍのものなどが搭載され、さらにサンプルカップも搭載できるユニバーサルアダプターがついて、種々の試料容器に対応できるようになっている。採血管１２にはゲノム抽出操作を施していない体液試料として血液が採取されてサンプルテーブル１０に搭載される。

サンプルテーブル１０の試薬保持部には増幅試薬としてのＰＣＲ反応液１４と、タイピング試薬としてのインベーダ反応試薬１５が搭載される。
以下、各反応液の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
ヒト新鮮血液１μｌに対して、ＰＣＲ反応液２４μｌを用いて、ＰＣＲを行なう。
このＰＣＲ反応液には、各５０ｍｍｏｌの４０種類のプライマー（２０対）、EX-Taq ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１０ユニット、TaqStart （CLONTECH Laboratories社製）０．５５μｇ、AmpDirect（島津製作所製）が混入されている。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。
インベーダ試薬は、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。すなわち、キットに含まれるバッファー：フレットプローブ：クリベース：蒸留水が、３：３：３：５０になるように混合して調製されたものである。

２０は反応テーブルであり、反応テーブル２０の内側はＰＣＲエリア２２となって、増幅反応容器２４が配置されている。ＰＣＲエリア２２は反応液の温度をＰＣＲ増幅反応のための設定された温度になるように温度調節部が設けられている。増幅反応容器２４は樹脂製の使い捨て可能なものであり、熱交換性がよくなるように薄肉に形成されている。ＰＣＲエリア２２の温度は、例えば９４℃、６３℃、７２℃の３段階に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。

反応テーブル２０ではＰＣＲエリア２２の外周側にタイピング反応用にインベーダ反応エリア２８がＰＣＲエリア２２と同心円状に配置されている。インベーダ反応エリア２８には、タイピング反応容器３０が配置され、タイピング反応容器３０には検出しようとするＳＮＰの数に応じた数又はそれらの数倍の数の微小なウエル４２が形成されている。ウエル４２の容量は例えば数１０ｎＬ〜数μＬである。インベーダ反応エリア２８はＰＣＲエリア２２とは異なる温度になるように、ＰＣＲエリア２２とは独立の温度調節部を備えている。インベーダ反応エリア２８の温度は、例えば６３℃に設定されている。

タイピング反応容器３０の断面図が図２（Ｂ）に示されており、各ウエル４２には予めＳＮＰに応じたインベーダプローブとレポータープローブ４４が固定されている。ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡを含む反応液とインベーダ反応試薬が各ウエル４２に分注され、インベーダプローブ４４と反応を起こす。分注された反応液中にそのインベーダプローブ４４に対応したＳＮＰが存在すればフレットプローブにより蛍光が発せられる。
レポータープローブとインベーダプローブの具体例としては、例えば、非特許文献１の表１中に記載されているPrimary probe１,２とInvader probeを使用することができる。
インベーダプローブとレポータープローブは、ウエル内で風乾された状態で固定されている。

タイピング反応容器３０からの蛍光をウエル４２の底面側から測定するために、タイピング反応容器３０は低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。

図２（Ａ）に戻って説明すると、タイピング反応容器３０からの蛍光を測定するために蛍光検出装置５０が配置されている。蛍光検出装置５０は励起光源として４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）５２を備え、そのレーザ光を容器３０のウエル４２の底面に集光して照射する一対のレンズ５４，５６を備えている。レンズ５４はレーザダイオード５２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ５６は平行にされたレーザ光をウエル４２の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ５６はまた、ウエル４２から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ５４，５６の間にはダイクロイックミラー５８が設けられており、ダイクロイックミラー５８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー５８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー６０が配置されている。ダイクロイックミラー６０は５２５ｎｍの光を反射し６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー６０による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ６２と光検出器６４が配置され、ダイクロイックミラー６０による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ６６と光検出器６８が配置されている。この２つの検出器６４，６８による２種類の蛍光検出により、各ウエルに固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ，ＲＯＸ，ＶＩＣ，ＴＡＭＲＡなどを使用することができる。

サンプルテーブル１０と反応テーブル２０の間にはノズル３４をもつ分注プローブ３２が配置されている。そのノズル３４はサンプルテーブル１０と反応テーブル２０の間を移動し、サンプルテーブル１０に配置されている採血管１２から試料を吸引して反応テーブル２０のＰＣＲエリアにある増幅反応容器２４へ分注する動作、サンプルテーブル１０に配置されているＰＣＲ反応液１４を増幅反応容器２４へ分注する動作、サンプルテーブル１０に配置されているインベーダ反応試薬１５を増幅反応容器２４へ分注する動作、さらに増幅反応容器２４の反応液をタイピング反応容器３０のウエル４２に分注する動作を行なう。ノズル３４による分注動作を操作するために、ノズル３４には切換えバルブ３６を介してシリンジポンプ３８と洗浄水４０が接続されている。洗浄水４０は液の分注とノズル３４の洗浄に使用される。

増幅反応容器２４やウエル４２で蛍光測定中に反応液が乾燥するのを防ぐために、サンプルテーブル１０には更にミネラルオイルの容器１７も配置されており、ノズル３４はそのミネラルオイルをウエル４２に分注して符号４５で示されるように、反応液の表面を被い、蒸発を抑えることができるようになっている。
図３はこの実施例の各テーブル１０，２０と分注プローブ３２のレイアウトを示した平面図であり、プローブ３２は軸３２ａを中心として水平面内で回転するとともに、垂直方向にも変位して分注動作を行なう。

この実施例の動作を説明する。
分注プローブ３２が採血管１２の試料を、例えば１〜数μＬ、ＰＣＲエリアの増幅反応容器２４に分注し、続いて分注プローブ３２がＰＣＲ反応液１４を、例えば５〜１０μＬ、その試料を分注した増幅反応容器２４に分注する。又はその逆に、ＰＣＲ反応液１４を先に分注し、その後に試料を分注するようにしてもよい。試料とＰＣＲ反応液が分注された増幅反応容器では、例えば１〜１．５時間にわたって所定の温度サイクルが繰り返されてＰＣＲ反応が行なわれる。ＰＣＲエリアの別の増幅反応容器２４にも順次試料と反応液が分注され、ＰＣＲ反応が繰り返されていく。

ＰＣＲ反応の終わった増幅反応容器２４には分注プローブ３２によってインベーダ反応試薬１５が添加されて混合される。その混合液が分注プローブ３２によってインベーダ反応エリア２８のタイピング反応容器３０の複数のウエル４２に分注され、数分〜数時間のインベーダ反応が行なわれる。その反応中又は反応終了後に蛍光検出装置５０によって蛍光が測定される。タイピング反応容器３０に反応液が分注された後、反応液の蒸発を防ぐためにウエル４２の反応液上にミネラルオイルを分注してもよい。

図４は他の実施例の遺伝子多型検出装置におけるテーブルなどのレイアウトを示したものである。ここではＰＣＲエリアの更に内側にプレヒートエリア２２ａが設けられている。プレヒートエリア２２ａは９４℃に維持された温度調節部を備え、そこに配置された増幅反応容器を常に９４℃に保温しておくことができるようにしている。またＰＣＲ反応容器２４とタイピング反応容器３０を交換できるようにするために、ＰＣＲ反応容器設置部７０とタイピング反応容器設置部７１が設けられ、それらのＰＣＲ反応容器２４とタイピング反応容器３０を交換するために容器搬送アーム７２が設けられている。

この実施例の遺伝子多型検出装置では容器搬送アーム７２により増幅反応容器２４とタイピング反応容器３０がそれぞれ所定の位置に搬送される。増幅反応容器２４はＰＣＲエリア２２とプレヒートエリア２２ａの両方に搬送されて保持される。採血管１２のサンプルはまずプレヒートエリア２２ａの増幅反応容器２４に分注され、９４℃にプレヒートされる。プレヒートエリア２２ａの増幅反応容器はＰＣＲ反応の開始にあたり、容器搬送アーム７２によりＰＣＲエリア２２に搬送される。

その後は、図２，３の実施例で説明した動作と同様に、ＰＣＲエリア２２の増幅反応容器２４の試料上にＰＣＲ反応液が分注されてＰＣＲ反応が行なわれる。ＰＣＲ反応終了後、インベーダ反応試薬が分注された後、増幅反応容器２４の反応液がタイピング反応容器３０の複数のウエルに分注され、インベーダ反応が行なわれて蛍光検出装置による蛍光検出がなされる。

この実施例では、反応終了後の増幅反応容器２４とタイピング反応容器３０は容器搬送アーム７２により廃棄部へ搬送されて廃棄され、新しい幅反応容器２４とタイピング反応容器３０が反応テーブルの所定の位置に保持される。

図５は遺伝子多型検出装置のさらに他の実施例を表わしたものである。この実施例ではサンプルテーブルが省略され、サンプル設置部とＰＣＲエリアが同じエリアに設けられて温度調節部も共用され、増幅反応容器２４はサンプル容器を兼ねている。ＰＣＲ反応液容器１４、インベーダ反応試薬容器１５及びミネラルオイル容器１７は、反応テーブル２０の近くで分注プローブ３２により、分注できる位置に配置されている。他の構成は図２の実施例と同じである。

この実施例の動作について説明する。
採血管の試料は、例えば１〜数μＬが採取され、増幅反応容器２４に分注されてＰＣＲエリアに設置される。ＰＣＲ反応の開始にあたり、分注プローブ３２がＰＣＲ反応液１４を例えば５〜１０μＬ、試料がすでに分注されている増幅反応容器２４に分注する。又はその逆に、ＰＣＲ反応液１４を先に分注し、その後に試料を分注するようにしてもよい。試料とＰＣＲ反応液が分注された増幅反応容器では、例えば１〜１．５時間にわたって所定の温度サイクルが繰り返されてＰＣＲ反応が行なわれる。ＰＣＲエリアにある試料がすでに分注されている別の増幅反応容器２４にも順次とＰＣＲ反応液が分注され、ＰＣＲ反応が繰り返されていく。

ＰＣＲ反応の終わった増幅反応容器２４には分注プローブ３２によってインベーダ反応試薬１５が添加されて混合される。その混合液が分注プローブ３２によってインベーダ反応エリア２８のタイピング反応容器３０の複数のウエル４２に分注され、数分〜数時間のインベーダ反応が行なわれる。その反応中又は反応終了後に蛍光検出装置５０によって蛍光が測定される。

図６から９はインベーダ反応エリアに配置されるタイピング反応容器の他の例をそれぞれ示したものである。
図６のタイピング反応容器３０ａは、基体に複数の流路７４が形成されており、流路７４には１種類又は複数種類のインベーダプローブが固定されている。１つの流路７４に複数種類のプローブを固定するときは、互いの蛍光を区別して検出できるように互いに場所を離して固定する。流路７４の底面側から蛍光測定がなされるように、基体は低自蛍光性で、光透過性の樹脂などの素材で形成されている。

流路７４を形成している基体は２枚の基板７６ａ，７６ｂが接合されて構成されている。流路７４が基板の内側になるように、流路７４用の溝が一方の基板７６ａの表面に形成され、他方の基板７６ｂがその流路形成面に接合されている。流路７４の両端には反応液用の入口７８ａと出口７８ｂが設けられ、それぞれが基板７６ｂを貫通して基体表面に開口している。

図７のタイピング反応容器３０ｂは、図６のタイピング反応容器３０ａと同様に基体内部に流路７４を備えているが、このタイピング反応容器３０ｂの流路７４はその途中に面積が大きくなった部分７４ａが形成されている。部分７４ａは他の流路部分よりも深さが深くなっていてもよい。その部分７４ａにインベーダプローブが固定されている。
図６、図７のタイピング反応容器３０ａ，３０ｂでは、それぞれの入口７８ａに反応液を分注すると、反応液はそれぞれの流路７４に進入し、内部に固定されたインベーダプローブと反応してそのインベーダプローブに対応するＳＮＰがあれば蛍光を発する。

図８に示されるタイピング反応容器３０ｃは２枚の基板により基体内部に流路７８が形成されている点では図６，７のタイピング反応容器と共通しているが、インベーダプローブが固定されている全ての流路が共通の反応液入口８０ａと共通の反応液出口８０ｂに接続されている点で異なる。

図８のタイピング反応容器３０ｃでは、共通の入口８０ａに反応液を分注すると、反応液は全ての流路７８に進入し、それぞれの流路７８の内部に固定されたインベーダプローブと反応してそれらのインベーダプローブに対応するＳＮＰがあれば蛍光を発する。

図９に示される反応容器３０ｄは、基体内部に流路８２が幅広のチャンバーとして形成されており、その両端に基体表面に開口した入口８４ａと出口８４ｂが設けられている。チャンバー８２内には複数種類のインベーダプローブ４４が互いに離れた位置に固定されている。

図９のタイピング反応容器３０ｄでは、共通の入口８４ａに反応液を分注すると、反応液は流路のチャンバー８２に進入し、それぞれのインベーダプローブ４４と反応してそれらのインベーダプローブ４４に対応するＳＮＰがあれば蛍光を発する。

図１０から図１９は本発明の他の局面の検出装置で使用するスティック形状の検査試薬キットを示したものである。それぞれの図において、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図である。
それぞれの検査試薬キットには、基板面の一方の方向に膨らんだ希釈液収容部８８、ＰＣＲ反応液収容部９０及びインベーダ反応試薬収容部９２の３つの収容部と、基板面内に配置された複数のインベーダプローブ固定部９４を備えている。

各収容部８８，９０，９２にはそれぞれの希釈液、反応液又は反応試薬が収容され、使用前の状態では液が漏れないように各収容部８８，９０，９２の開口が着脱可能なフィルム又はプレートにより封止されている。試料の血液は、希釈液収容部８８の開口のフィルム又はプレートが剥がされてノズル９５により希釈液収容部８８に分注される。試料分注後、希釈液収容部８８の開口がフィルム又はプレートにより再び閉じられて、検査試薬キットが検出装置に装着される。

インベーダプローブ固定部９４はそれぞれに異なるインベーダプローブが固定され、発生する蛍光を基板の裏面側から検出できるように、少なくともインベーダプローブ固定部９４が設けられている部分の基板の素材は低自蛍光性で光透過性の樹脂などで形成されている。

図１０の検査試薬キットでは、インベーダプローブ固定部９４はたがいに離れて配置され、基板表面に露出している。
この検査試薬キットにおける収容部８８，９０，９２からの液の移送は分注ノズルを使用して行なう。そのため、収容部８８，９０，９２の開口を封止しているフィルム又はプレートは分注ノズルによって容易に貫通できるものが好ましい。

この試薬キットは、使用時には血液などの試料を分注ノズルによって希釈液収容部８８に分注した後に後述する遺伝子多型検出装置（図２０）に装着される。その遺伝子多型検出装置内ではこの試薬キットの希釈液収容部８８内の試料が分注ノズルによってＰＣＲ反応液収容部９０に移送され遺伝子多型検出装置内で所定の温度サイクルによってＰＣＲ反応が行なわれる。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液収容部９０内の反応液が分注ノズルによってインベーダ反応試薬収容部９２中に移送されてインベーダ反応試薬と混合される。その後、インベーダ反応試薬収容部９２の反応液が分注ノズルによって各インベーダプローブ固定部９４上に分注される。各インベーダプローブ固定部９４では、試料にそれぞれに対するＳＮＰが存在すればインベーダ反応による蛍光が発生し、遺伝子多型検出装置内の蛍光検出装置で検出される。

図１１の検査試薬キットは、インベーダプローブ固定部９４ａの構造を除いて図１０のものと同じである。インベーダプローブ固定部９４ａの構造は図６のタイピング反応容器３０ａと同じである。

図１２の検査試薬キットも、インベーダプローブ固定部の構造を除いて図１０のものと同じである。この検査試薬キットでは、インベーダプローブ固定部９４ｂは流路形状になっており、その流路内にインベーダプローブが固定されている。インベーダプローブが固定された複数の流路が共通の入口９６ａと出口９６ｂにつながっている。入口９６ａと出口９６ｂのみが開口し、流路は基板内に形成されている。

この検査試薬キットでは、インベーダプローブ固定部９４ｂへの反応液の分注は、入口９６ａへの１回の分注だけですむ。入口９６ａへ分注された反応液は流路内に進入し、流路内に固定されたインベーダプローブと反応し、試料にそれぞれに対するＳＮＰが存在すればインベーダ反応による蛍光が発生し、遺伝子多型検出装置内の蛍光検出装置で検出される。

図１３の検査試薬キットでは、インベーダプローブは符号９４ｃで示されるチャンバー上の広い流路に複数個が互いに離されて固定されている。チャンバー９４ｃは基板内部に形成されており、入口９６ａと出口９６ｂが開口している。この場合も、インベーダプローブ固定部９４ｃへの反応液の分注は、入口９６ａへの１回の分注だけですむ。入口９６ａへ分注された反応液はチャンバー９４ｃ内に進入し、チャンバー９４ｃ内に固定されたインベーダプローブと反応し、試料にそれぞれに対するＳＮＰが存在すればインベーダ反応による蛍光が発生し、遺伝子多型検出装置内の蛍光検出装置で検出される。

図１４の検査試薬キットでは、インベーダプローブ固定部９８は、ろ紙などの低自蛍光性の素材の複数の位置に異なるインベーダプローブが固定され、基板に取り付けられている。インベーダプローブ固定部９８は基板表面に露出している。
この検査試薬キットでは、反応液はノズルによってインベーダプローブ固定部９８の一端に分注するだけでよく、反応液はインベーダプローブ固定部９８の素材を拡散することによってそれぞれの位置に固定されたプローブと反応する。

図１５の検査試薬キットも図１４の検査試薬キットと同様に、ろ紙などの低自蛍光性の素材の複数の位置に異なるインベーダプローブが固定されたインベーダプローブ固定部９６ｂを備えている。しかし、検査試薬キットでは、インベーダプローブ固定部９６ｂは透明フィルム又は透明プレートで挟まれて保持されており、インベーダプローブ固定部９８に反応液を分注するために、インベーダプローブ固定部９６ｂに通じる入口１００が開口している。その入口１００に分注された反応液は、インベーダプローブ固定部９６ｂに流れ込み拡散することによってインベーダプローブ固定部９６ｂのそれぞれの位置に固定されたプローブと反応する。

図１６から図１９に示される検査試薬キットでは、収容部８８，９０，９２が柔軟な素材で形成されており、基板表面の溝１０８，１１０によって収容部８８，９０，９２間がつながっている。使用前の状態では収容部８８，９０，９２はシール又はプレートにより収容部８８，９０，９２間が互いに孤立するように封止されている。また、基板表面に設けられたインベーダプローブ固定部９４ｂ，９４ｃ，９６ｂ，９８とインベーダ反応試薬収容部９２の間の基板表面にも溝１０４が形成されている。

使用時にシール又はプレートを剥がし、希釈液収容部８８に試料を分注する。その後、その検査試薬キットを遺伝子多型検出装置に装着すると、溝１０８，１１０により収容部８８，９０，９２間で液が流れることができるようになり、溝１０４を通ってインベーダ反応試薬収容部９２からインベーダプローブ固定部９４ｂ，９４ｃ，９６ｂ，９８へ液が流れることができるようになる。

遺伝子多型検出装置内での収容部８８，９０，９２間での送液、及びインベーダ反応試薬収容部９２からインベーダプローブ固定部９４ｂ，９４ｃ，９６ｂ，９８への送液は収容部８８，９０，９２をその順に機械的に押圧して押しつぶすことにより行なう。すなわち、希釈液収容部８８を押しつぶすと希釈液収容部８８の液は溝１０８を通ってＰＣＲ反応液収容部９０へ移動する。次にＰＣＲ反応液収容部９０を押しつぶすとＰＣＲ反応液収容部９０の液は溝１１０を通ってインベーダ反応試薬収容部９２へ移動する。さらにインベーダ反応試薬収容部９２を押しつぶすとインベーダ反応試薬収容部９２の液は溝１０４を通ってインベーダプローブ固定部９４ｂ，９４ｃ，９６ｂ，９８へ移動し、インベーダ反応を起こす。

図１６の検査試薬キットは図１２と同様の流路形状のインベーダプローブ固定部９４ｂを備えている。インベーダプローブ固定部９４ｂの先端、すなわち収容部８８，９０，９２とは反対側の端、には出口１０６が設けられており、使用にあたって封止用のシール又はプレートを剥がすことによりその出口が開口し、インベーダ反応試薬収容部９２から送液されてきてインベーダプローブ固定部９４ｂを通過した余分な液がその出口１０６から排出される。

図１７の検査試薬キットは図１３と同様のチャンバー型のインベーダプローブ固定部９４ｃを備えている。この検査試薬キットもインベーダプローブ固定部９４ｃの先端、すなわち収容部８８，９０，９２とは反対側の端、には出口１０６が設けられており、使用にあたって封止用のシール又はプレートを剥がすことによりその出口が開口し、インベーダ反応試薬収容部９２から送液されてきてインベーダプローブ固定部９４ｃを通過した余分な液がその出口１０６から排出される。

図１８の検査試薬キットは図１４と同様のろ紙などの低自蛍光性の素材の複数の位置に異なるインベーダプローブが固定されたインベーダプローブ固定部９８を備えている。インベーダプローブ固定部９８は基板表面に露出している。

図１９の検査試薬キットは図１５と同様のろ紙などの低自蛍光性の素材の複数の位置に異なるインベーダプローブが固定されたインベーダプローブ固定部９８を備えている。このインベーダプローブ固定部９８は透明フィルム又は透明プレートで挟まれて保持されている。

図１８，１９の検査試薬キットにおけるインベーダプローブ固定部９８は吸湿力の大きいろ紙などの素材を備えているので、インベーダ反応試薬収容部９２から送液されてきた液をその素材で吸収することができる。

図２０は簡易型の自動遺伝子多型検出装置の実施例を概略的に表わしたものであり、この遺伝子多型検出装置は図１０から図１９に示された検査試薬キット１２２を使用してＳＮＰを検出するものである。

この遺伝子多型検出装置１２０は複数の検査試薬キット１２２を装着する装着部を備えており、検査試薬キット１２２は希釈液収容部に試料が分注された状態で装着される。装着部に装着された検査試薬キット１２２に対し、送液を行なうノズル１２４が移動可能に設けられている。

図には現われていないが、検査試薬キット１２２のＰＣＲ反応液収容部９０内でＰＣＲ反応液と生体試料との反応液内でゲノムＤＮＡを増幅させるためにその反応液の温度を制御する増幅部と、その増幅部で増幅させたゲノムＤＮＡとタイピング試薬との反応液をプローブ固定部９４，９４ａ，９４ｂ，９４ｃ，９６ｂ，９８のプローブと反応させるためにその反応液の温度を制御するタイピング反応部とを備えている。

１２６は蛍光検出装置としての測光部であり、検査試薬キット１２２のインベーダプローブ固定部から発生する蛍光を検出するために、複数の検査試薬キット１２２の間を移動しながら蛍光検出できるように移動可能に設けられている。検出された蛍光から判定されたタイピング結果はディスプレー１２８に表示される。

以上の実施例は遺伝子多型検出装置であるが、病気罹患率や投与薬剤の種類と効果及び副作用などの診断装置とすることもできる。その場合、これらの遺伝子多型検出装置に特定のＳＮＰ又は複数のＳＮＰの組合せについて病気罹患率や投与薬剤の種類と効果及び副作用などの診断値を記憶したデータベースを設けるか、外部のそのようなデータベースに接続する。外部のデータベースに接続する場合、専用の回線で接続することもできるし、汎用の通信回線を介して接続することもできる。診断装置とした場合には、本発明の遺伝子多型検出装置により検出されたＳＮＰ結果に基づいてデータベースから診断値を読み出して表示装置に表示する。

本発明は遺伝子解析の研究や臨床分野において、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。

本発明の検出方法を概略的に示すフローチャート図である。 （Ａ）は一実施例の遺伝子多型検出装置を概略的に示す要部斜視図、（Ｂ）はそこで使用されるタイピング反応容器の部分断面図である。 同実施例のテーブルと分注プローブのレイアウトを示す平面図である。 遺伝子多型検出装置の他の実施例におけるテーブルと分注プローブなどのレイアウトを示す平面図である。 遺伝子多型検出装置のさらに他の実施例を概略的に示す要部斜視図である。 インベーダ反応エリアに配置されるタイピング反応容器の他の例を示す図で、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ−Ｘ線位置での断面図である。 インベーダ反応エリアに配置されるタイピング反応容器のさらに他の例を示す平面図である。 インベーダ反応エリアに配置されるタイピング反応容器のさらに他の例を示す図で、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は１つの流路に沿った断面図である。 インベーダ反応エリアに配置されるタイピング反応容器のさらに他の例を示す図で、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＹ−Ｙ線位置での断面図である。 スティック形状の検査試薬キットの一実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットの他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 スティック形状の検査試薬キットのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はその正面図を蛍光検出装置の対物レンズとともに示したものである。 簡易型の自動遺伝子多型検出装置の一実施例を概略的に示す要部斜視図である。

符号の説明

２ 試料
４ ＰＣＲ反応液
６ インベーダ試薬
８ プローブ固定部
１０ サンプルテーブル
１２ 採血管
１４ ＰＣＲ反応液容器
１５ インベーダ反応試薬容器
１７ ミネラルオイル容器
２０ 反応テーブル
２２ ＰＣＲエリア
２２ａ プレヒートエリア
２４ 増幅反応容器
２８ インベーダ反応エリア
３０，３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ タイピング反応容器
３４ ノズル
４０ 洗浄水
４２ ウエル
４４ インベーダプローブ
４５ ミネラルオイル
５０ 蛍光検出装置
７０ ＰＣＲ反応容器設置部
７１ タイピング反応容器設置部
７２ 容器搬送アーム
７４，７８， 流路
８２ チャンバー
８８ 希釈液収容部
９０ ＰＣＲ反応液収容部
９２ インベーダ反応試薬収容部
９４，９４ａ，９４ｂ，９４ｃ，９６ｂ，９８ インベーダプローブ固定部
１２２ 検査試薬キット
１２０ 遺伝子多型検出装置
１２４ ノズル１２４
１２６ 測光部
１２８ ディスプレー

Claims (21)

1. 核酸抽出操作を施していない生体試料を、複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液に直接作用させ、ゲノムＤＮＡを増幅させる増幅工程と、
   前記増幅工程で増幅させたゲノムＤＮＡに対し、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を作用させて前記複数の多型部位の塩基を判別するタイピング工程と、を含む遺伝子多型検出方法。
2. 対象とする多型が一塩基多型である請求項１に記載の遺伝子多型検出方法。
3. 前記増幅工程にＰＣＲ法を使用する請求項１又は２に記載の遺伝子多型検出方法。
4. 前記タイピング工程にインベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を使用する請求項１又は２に記載の遺伝子多型検出方法。
5. 特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値をデータベースとして用意しておき、
   請求項１に記載の方法により検出された多型の結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出す診断方法。
6. 核酸抽出操作を施していない生体試料を設置する試料設置部と、
   複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液を保持する増幅試薬保持部と、
   前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を保持するタイピング試薬保持部と、
   前記生体試料が前記遺伝子増幅反応液に添加された反応液内でゲノムＤＮＡを増幅させるためにその反応液の温度を制御する増幅部と、
   前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブが保持されたプローブ固定部をもち、前記増幅部で増幅させたゲノムＤＮＡと前記タイピング試薬との反応液を各プローブと反応させるための反応液の温度を制御するタイピング反応部と、
   前記試料設置部、前記増幅試薬保持部、前記タイピング試薬保持部、前記増幅部及び前記タイピング反応部の位置に移動することができ、試料、増幅試薬、タイピング試薬、及び試料とそれらの試薬との反応液の所定位置への分注を行なう分注装置と、
   前記タイピング反応部の各プローブ固定部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、
   前記増幅部及びタイピング反応部の温度制御、前記分注装置の分注動作、並びに前記蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、
   を備えた遺伝子多型検出装置。
7. 前記タイピング反応部は前記プローブ固定部ごとに上部が開口して反応液が供給される凹部を備えている請求項６に記載の遺伝子多型検出装置。
8. 反応液の蒸発を防ぐオイルを保持するオイル保持部をさらに備え、
   前記分注装置は前記凹部への反応液の分注前又は分注後に、前記凹部に前記オイルを分注することができる請求項７に記載の遺伝子多型検出装置。
9. 前記タイピング反応部は前記プローブ固定部ごとに反応液が供給される流路を備えている請求項６に記載の遺伝子多型検出装置。
10. 前記流路は前記プローブ固定部ごとに反応液の供給用入口と排出用出口を備えている請求項９に記載の遺伝子多型検出装置。
11. 前記流路は反応液の供給用共通入口と排出用共通出口に接続されている請求項９に記載の遺伝子多型検出装置。
12. 前記プローブ固定部は前記流路内で一部が広くなっている部分である請求項９から１１のいずれかに記載の遺伝子多型検出装置。
13. 前記タイピング反応部は複数の前記プローブ固定部が内部に形成された流路を備えている請求項６に記載の遺伝子多型検出装置。
14. 前記試料設置部と前記増幅部が温度調節部を共通にしている請求項６から１３のいずれかに記載の遺伝子多型検出装置。
15. 複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液が収容された増幅試薬収容部、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬が収容されたタイピング試薬収容部、及び前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブが個別に保持された複数のプローブ固定部が一体として形成された検査試薬キット。
16. さらに、試料を希釈する希釈液が収容された希釈液収容部が一体として形成された請求項１５に記載の検査試薬キット。
17. 前記各収容部は軟質材料で形成されている請求項１５又は１６に記載の検査試薬キット。
18. 請求項１５から１７のいずれかに記載の検査試薬キットを装着する検査試薬キット装着部と、
    前記増幅試薬収容部内で前記遺伝子増幅反応液と生体試料との反応液内でゲノムＤＮＡを増幅させるためにその反応液の温度を制御する増幅部と、
    前記増幅部で増幅させたゲノムＤＮＡと前記タイピング試薬との反応液を前記プローブ固定部のプローブと反応させるためにその反応液の温度を制御するタイピング反応部と、
    前記増幅試薬収容部から前記タイピング試薬収容部への液の移送、及び前記タイピング試薬収容部から前記各プローブ固定部への液の移送を行なう送液装置と、
    前記各プローブ固定部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、
    前記増幅部及びタイピング反応部の温度制御、前記送液装置の送液動作、並びに前記蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、
    を備えた遺伝子多型検出装置。
19. 前記送液装置は分注ノズルを備えて必要な場所に移動可能に設置された分注装置である請求項１８に記載の遺伝子多型検出装置。
20. 前記検査試薬キットとして請求項１７に記載の検査試薬キットを使用するものであり、
    前記送液装置は前記各収容部を押圧して変形させることにより送液する押圧装置である請求項１８に記載の遺伝子多型検出装置。
21. 請求項６から１４、及び１８から２０のいずれに記載の遺伝子多型検出装置と、
    特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベースと、
    前記遺伝子多型検出装置により検出された多型結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出して表示する表示装置と、を備えた診断装置。

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