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KR100225307B1 - 사람 간세포-함유 조성물의 배양방법 및 형질전환 방법 - Google Patents

사람 간세포-함유 조성물의 배양방법 및 형질전환 방법 Download PDF

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KR100225307B1
KR100225307B1 KR1019930701843A KR930701843A KR100225307B1 KR 100225307 B1 KR100225307 B1 KR 100225307B1 KR 1019930701843 A KR1019930701843 A KR 1019930701843A KR 930701843 A KR930701843 A KR 930701843A KR 100225307 B1 KR100225307 B1 KR 100225307B1
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medium
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스테펜지.에머슨
마이클에프.클라크
버언하드오.팔슨
리챠드엠.슈바르츠
Original Assignee
로버트 엘. 로브
더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간
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Abstract

본 발명에서는 생체와 사람 간세포 분할 및 안정한 유전적 형질전환 및/또는 사람 조혈 선구 세포 배양액의 최적화 및/또는 사람 간질 세포의 대사 또는 GM-CSF 분비 또는 IL-6 분비의 증가를 제공하는 방법; 및 배양배지 조성물과 반응기가 개시된다. 상기 방법은 사람 간세포 및/또는 사람 조혈 선구 세포 및/또는 사람 간질 세포를, 연속적으로 또는 추가적으로 약 24시간 내지 48시간 주기동안 배양액 1㎖당 배지 1㎖의 비율로 교체되는 액체 배지에서 배양하는 것과, 배양물을 생리적으로 허용되는 조건하에서 유지하면서 대사산물을 제거하고 고갈된 영양분을 보충하는 것을 토대로 한다. 이때 임의로 성장인자들이 배양 배지에 첨가된다.

Description

[발명의 명칭]
사람 간세포 - 함유 조성물의 배양 방법 및 형질전환 방법
[기술분야]
본 발명은 배양중의 포유동물 세포의 성장 및 형질전환을 위한 방법, 반응기 및 조성물에 관한 것이고, 특히 조혈세포 배양물의 성장 및 형질전환을 위한 방법, 반응기 및 조성물에 관한 것이다.
[배경 기술]
적혈구, 백혈구, 혈소판 및 림프구를 포함하여 정상적인 성인이 지니고 있는 순환 혈액 세포는 모두 골수내에 있는 전구 세포로부터 비롯된다. 이들 세포는 또한 선구 세포(progenitor)로 불리는 많은 미성숙 세포로부터 유도되는데, 이런 선구세포는 메틸셀룰로오스 또는 한천과 같은 반고체 배지에서 1 내지 3주 배양될 때 성숙한 혈액세포의 연속적인 콜로니로의 발생에 의해 검정된다. 선구세포 자체는 간세포(stem cell)라 불리는 한 부류의 선구세포들로부터 유도된다. 간세포는 분열시에 자체 재생 및 선구세포로의 분화의 2가지 기능을 가지고 있다. 그러므로 간세포가 분열하면, 추가의 원시 간세포와 다소 더 분화된 선구세포가 생성된다. 혈액 세포의 생성과 더불어, 간세포는 또한 조골세포 및 파골세포, 및 아마도 다른 조직의 세포들까지도 생성할 수 있다. 본 발명은 첫 번째로, 선구세포 및 보다 성숙한 혈액세포로의 증식 및 분화를 유발하는, 사람 조혈 간세포의 성공적인 시험관 내 배양을 가능하게 하는 방법과 그 조성물에 대해 설명하고 있다.
1970년대 후반에, 조혈 골수를 시험관내에서 성장시키기 위한 액체 배양 시스템이 개발되었다. 이 배양물은 정상 및 백혈병성 조혈의 분석 및 골수의 실험적 조작, 예컨대 레트로바이러스 중재 유전자 전달에 대해 매우 중요한 가치를 가지고 있다. 이들 배양물로 쥐과동물의 조혈을 상헤히 분석 할 수 있었고, 쥐과동물 시스템에 대해 상세하게 이해할 수 있었다. 또한 상기 배양 시스템은 레트로바이러스 유전자가 마우스의 배양된 골수세포안으로 이동되는 것을 가능하게 하였다. 이러한 이동은 다능성 간세포의 존재를 증명하는 쥐과동물의 조혈세포를 밝혀내는 것과 백혈병 발생의 과정에서 여러 가지 유전자에 대한 연구를 가능하게 하였다.
그러나,레트로바이러스 유전자가 마우스의 배양된 골수세포내로 전달되는 것이 가능한 한편으로, 이 과정은 아직까지는 사람의 배양된 골수세포에서는 가능하지 못하였다. 왜냐하면, 오늘날가지 사람 골수의 장기간 배양은 골수의 수명 및 간세포 생존유지능력과 시간이 지남에 따른 선구세포 생성능력에 의해 제한되어 왔기 때문이다.
사람 액체 골수 배양물은 초기에 점점 감소되는 수의 선구세포와 성숙한 혈액세포를 생성하며, 6주 내지 8주 정도에 세포생성이 중지되는 제한된 조혈능력을 가지는 것으로 밝혀졌다. 최초 시스템의 계속된 변형은 단지 적정한 진보만이 있었다. 이러한 문제에 대한 해결은, 예컨대, 골수 이식과 화학요법 치료에 대한 보호에 적합하게 사람 간세포 및 선구세포를 증식시키고, 그러한 세포를 유전자 전달을 위해 선택 및 조작하며, 수혈치료를 위해 성숙한 사람 혈액 세포를 제조하는 것을 가능하게 한다는 점에서 무한한 가치가 있다.
조혈작용 및 시험관내 액체 골수 배양물에 대한 연구는 중추 세포 간질 엘레먼트로서 유착층내의 섬유아세포 및 내피세포를 확인해주었다. 이들 세포는 조혈세포를 발생시키기 위한 부착부위를 제공하고, 선구세포 증식 및 분화를 자극하는 조혈 성장 인자를 분비하도록 유도될 수도 있다. 그러한 조혈 성장 인자로는 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 인터류킨-6(IL-6)이 있다.
그러나, 상기와 같은 시험관내 유착층상에서의 사람 골수세포의 배양물은 기대에 크게 어긋났다. 마우스와 나무두더지(tree shrew)와 같은 다른층과 관련된 배양물과는 달리, 사람 액체 골수 배양물은 6주 내지 8주동안 비유착성 조혈 전구 세포 또는 클론형성 선구세포를 상당한 수로 생성하지 못하였다. 또한 배양물은 3 내지 5달 지속되는 것으로 보고되어 있기는 하지만, 4 내지 6주 이상동안 계속적으로 간세포로부터 안정하게 선구세포를 생성하는 배양물은 보고된 것이 없다.
더욱이, 비유착성 세포 및 선구세포 생성은 전형적으로 이들 배양물의 짧은 수명동안 점점 감소하므로, 간세포 생존 또는 증식이 이러한 배양에 의해 향상 유지되는 지는 분명하지 않다. 나아가, 분리된 상태에서 연구될 때, 비자극된 골수 간질 세포는, 만약 검출 가능한 조혈 성장 인자(HGF)들이 있다면 거의 분비되지 않는다.
이들 배양물에서 안정한 선구세포 및 성숙한 혈액세포가 생성되지 않으면 배양물이 지속적인 간세포 재생 및 증식을 유지할 수 없다는 생각에 도달하게 되었다.그러므로, 배양물은 결정적인 간세포 자극물질(들)이 결핍되어 있고/거나 새로운 간세포 억제제(들)을 함유하고 있는 것으로 추정되었다. 그러나, HGF 및 비유도 간질세포 배양물을 검출할 수 없는 이유에 대한 설명이 제시되어 있기는 하지만, HGF 검출 불가능을 사람 액체 골수 배양의 상대적인 불가능과 조합한 귀무 가설(null hypothesis)은, 시험관내에서 사용된 배양 시스템이 생체내 유착성 골수 간질세포의 조혈 유지기능에 대한 완전한 범위를 제공하지 못한다는 것일 것이다.
골수 이식을 위한 간세포 및 선구세포 증식은 장기간의 사람 골수 배양을 위한 효능적인 작용이다. 사람의 자가조직 및 동종 골수 이식은 현재 백혈병, 림프종 및 그 밖의 생명을 위협하는 질병에 대한 치료요법으로 사용되고 있다. 그러나. 이러한 과정에 대하여, 다량의 골수가 기증자로부터 제거되어, 이식에 요구되는 세포가 충분해야 한다.
간세포 및 선구세포를 증식시키는 배양은 다량의 골수 기증에 대한 필요성을 감소시키며, 소량의 골수를 기증받은 후에 수용체에 주입하기 전에 시험관내에서 간세포 및 선구세포의 수를 증가시키는 것을 가능하게 할 것이다. 또한 소수의 간세포와 선구세포가 혈류내에서 순환하는 것으로 알려져 있다. 만약 이들 간세포와 선구세포가 영동법에 의해 수집되고 증식될 수 있다면, 이식에 요구되는 수의 간세포와 전구세포를 말초혈액으로부터 얻는 것이 가능하여, 골수 기증이 필요하지 않을 것이다.
골수 이식은 환자의 체중 1kg당 약 1×108내지 2×108의 골수 단핵 세포가 주입되어 이식되어야 한다. 이러한 요건은 70kg의 기증자에 있어서70㎖의 정도의 골수인 동일한 세포수의 골수 기증이 요구된다. 70㎖가 골수의 적은 분획이기는 하지만, 이는 위험이 따르는 기증이며, 기증과정에서의 상당량의 혈액 손실이 다르게 된다. 만약 간세포와 선구세포가 10배로 증식될 수 있다면, 기증과정은 아주 간단하게 될 것이며, 가능하게는 말초혈액으로부터 간세포와 선구세포만을 단순히 수집하고 이들 간세포와 선구세포를 증식시키면 될 것이다.
선구세포 증식은 또한 화학치료 요법에 대한 보조 치료요법으로서도 유용할 것이고, 장기간의 사람 골수배양에 있어서의 또 다른 적용예이다. 종양 학자들이 직면하고 있는 딜레마는 , 암을 파괴하기 위해 사용된 대부분의 화학 요법제가 세포분열을 수행하는 모든 세포를 박멸함으로써 작용한다는 것이다. 골수는 신체에서 가장 증식성인 조직중 하나이고, 그로 인해서 종종 화학요법 약물에 의해 초기에 손상되는 기관이다. 그 결과, 혈액세포 생성이 화학요법 치료증에 급속하게 파괴되고, 화학요법은 환자가 화학요법으로 다시 치료받기 이전에 조혈 시스템에 혈액세포 공급을 보층할 수 있도록 종결되어야 한다. 일단 휴지기를 거친 간세포가 백혈구 수를 화학요법을 재개할 수 있는 수준으로 상승시키는데는 한달 이상이 소요되며, 그러는 동안에 백혈구 수에서 감소가 반복된다.불행히도 , 혈액세포는 화학요법 치료 사이에 재생되는 한편, 암은 성장할 수 있는 시간을 갖게 되고 자연적인 선택에 기인되는 화학요법 약물에 대한 내성이 보다 강해질 수 있다.
화학요법 치료의 주기를 짧게 하기 위해서, 다수의 선구세포 및 미성숙 혈액세포가 환자에게 제공될 수 있다. 이러한 제공은 환자에게서 백혈구의 수가 낮은 상태가 되는 시간을 줄일 수 있는 효과가 있어서, 화학치료를 보다 신속하게 재개할 수 있게 한다. 화학치료를 보다 장시간 동안 수행하고, 치료주기를 보다 짧게 하면 할수록, 성공적으로 암을 치사시킬 수 있는 기회는 더 커진다.
선구세포 증식에 요구되는 조혈세포는 기증된 골수 또는 말초혈액으로부터 얻을 수 있다. 골수 채취는 약 4×105의 CFU-GM 선구세포의 채취로 이루어질 것이다. 5ℓ의 말초혈액을 전기영동하면 약 105CFU-GM을 채취할 수 있으며, 이러한 수치는 기증자를 GM-CFS로 전처리함으로써 106CFU-GM으로 증가될 수 있었다. 환자가 신속하게 회복하기 위해서는 통상적인 골수 기증 또는 말초 혈액 기증에 의해서 얻어지는 것보다 100 내지 1,000배인 약 1×108내지 5×108CFU-GM의 수혈을 필요로 할 것이다. 그러므로, CFU-GM의 수를 2 내지 3배로 증가시키기 위한 골수 또는 말초혈액의 증식은 화학요법 투여와 암치료에 상당한 영향을 미칠 것이다.
유전자 치료법은 의학분야에서 급속도로 성장하는 분야로서 헤아릴 수 없는 임상적 가치를 가지고 있다. 유전자 치료법은 질병치료에 아주 효능적으로 유용하며, 광범위한 문헌에 기재되어 있다 [참조 : Boggs, Int, J. Cell Cloning (1990) 8 : 80-96, Kohn et al., Cancer Invest. (1989) 7 (2) 179-192, Lehn, Bone Marrow Transp. (1990) 5 : 287-293, and Verma, Scientific Amer, (1990) pp. 68-84].유전학적으로 형질 전환된 사람 간세포는 유전자 치료법의 제제로서 임상의학에서 광범위하게 효능적으로 적용된다.
유전자 치료법은 의학분야에서 선행된 연구로부터 발달해오고 있는 임상치료에 있어서 최근에 진행되고 있는 방법이다. 세기를 거듭하여 발전해온 의료분야에서의 초기의 방법은 거친 외과수술과정을 포함하며, 의료용약제로서 미정제 혼합물을 투여하는 것을 포함하였다. 과거에는 의학적 치료의 주요방법으로서 생화학적 약리학이 결과적으로 발생하였다. 이러한 이론하에서, 순수한 생화학적 분자들이 환자에게 전달된다. 일반적으로, 그러한 약리학적 제제는 독소로서(예, 항균제 또는 화학적 암 치료제), 내인성 수용체를 자극하는 생리적 의사물질(예, 아편제, 아드레날린성 효능제)로서, 또는 내인성 수용체를 차단하는 생리적 길항제(예, 항고혈압제, 마취제)로서 작용한다.
유전자 치료요법을 정의하자면, 의학적 치료를 목적으로 세포에 유전자를 삽입하는 것을 말한다. 유전자 치료요법의 근거를 이루는 원리는, 일정용량의 약리학적 분자를 전달하는 것이 아니라, 기능성 유전자를 전달하여, 기능석 유전자의 RNA 또는 단백질 생성물이 표적 세포 또는 조직에서 원하는 생화학적 효과를 생성할 수 있게 하는 것이다. 이러한 유전자 치료 요법은 전통적인 생화학적 약리요법에 비하여 여러 가지의 효능적인 장점이 있다. 먼저, 삽입된 유전자들은 RNA와 단백질을 포함하는 극히 복잡한 분자를 생성하는데, 이러한 분자는 그 자체로 투여하거나 전달하기가 극히 어렵거나 불가능할 수 있다. 또한, 요구되는 유전자를 특정의 표적 세포내로 조절하여 삽입하면 소정의 조직에 대한 유전자 생성물의 생성물 제어할 수 있다. 마지막으로, 유전자 치료요법은, 유전자가 표적 세포 및 그것의 자손 세포에서 계속 기능을 나타낼 것이기 때문에, 원리적으로 개체내에서 영구적일 수 있다.
그러므로 성공적인 유전자 치료요법을 위해서 처리되어야 할 몇가지 문제가 있다. 첫번째 문제점은 선택된 세포내로 소망하는 치료 유전자를 삽입할 수 있어야 하는 것이다. 둘째, 유전자가 표적 세포에서 충분히 발현되어 적절한 수준의 유전자 생성물이 생성되어야 한다. 마지막으로, RNA 또는 생성된 단백질이 표적세포에 의해 적절하게 처리되어서, 기능성이 되어야 한다. 즉, 유전자 치료요법이 실제로 임상적 치료를 유도해낼 수 있어야 한다. 시험관내에서 사람의 세포내로 유전자를 삽입하는여려가지 방법이 하기 표 1에 기재되어 있다.
[표1]
동종 재조합과 같은 그 밖의 기술이 많은 연구에 의해서 개발되고 있다. 유전자 치료요법의 연구는 여러해 동안 시험관내에서 여러 유형의 세포에 대해서 진행되어 왔고, 동물 연구에까지 진전되었으며, 최근에는 처음으로 사람에 대한 임상시험(들)에 들어갔다.
조혈 시스템은 유전자 치료요법에 대한 전잘 시스템으로서 이상적인 선택이다. 조혈세포는 간단히 골수 흡인 또는 말초혈액 단핵세포 채취에 의해 쉽게 접근할 수 있다. 일단 유전학적 삽입이 시험관내에서 이루어지면, 처리된 세포는 정맥내로 재주입될 수 있고, 그런 다음 유전학적으로 형질전환된 세포들이 골수로 되돌아가서 그곳에서 발생될 것이다. 성숙한 혈액 세포들이 신체 전체를 순환하기 때문에, 유전학적으로 변형된 세포들이 특이한 유전자 생성물을 어떠한 소망하는 조직에 전달할 수 있다.
가장 중요하게는 조혈 조직은 자체 재생하는 능력이 과범위한(아마도 무한한)간세포를 함유한다. 이러한 사항은 만약 유전물질이 안정하게 이들 간세포내로 형질 도입된다면, 조혈 조직의 재주입시에 이들 변경된 간세포가 증식되어 새로운 유전자를 발현하는 세포로 골수가 채워진다는 것을 의미한다. 이것은 장기간 지속되는, 아마도 평생동안의 소망하는 유전자 생성물의 전달을 유도한다. 마찬가지로, 그 밖의 조직에 위치한 간세포, 또는 배(embryo)의 간세포내로의 성공적으로 안정한 유전자 전달은 장기간 지속되는 유전자 생성물 전달을 유도한다.
성공적인 조혈 간세포 유전자 치료요법은 조혈 시스템에 특이적인 질환 및 그 밖의 기관 시스템 질환에 이르기까지 광범위하게 적용된다. 조혈 시스템내에서, 선천성인 질환 및 후천성인 질환 모두가 간세포 유전자 치료 요법에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, α 및 β 지중해 빈혈(Thalassemias)같은 헤모글로빈 결핍증은, 글로빈 α또는 β 사슬을 코딩 하는 유전자를, 고수준의 조직 특이적 적혈구를 부여하는 조절 서열들과 함께 삽입함으로써 치료될 수 있다[참조 : Grosveld et al., Cell (1987) 51 : 975-986]. 유사하게 겸상 적혈구성 빈혈은 태아 글로빈 유전자를 조혈 간세포내로 유전적으로 삽입함으로써 치료될 수 있다. 왜냐하면, 고수준의 태아 헤모글로빈의 조절된 겸상 헤모글로빈의 공동 존재에도 불구하고 적혈구에서의 겸상 적혈구화를 방지하기에 충분하기 때문이다[참조 : Sunshine et al., J. Molec. Biol. (1979) 133 : 435].
기능성 단백질 결핍에 의해 유발된 호중구 유전 질환, 예컨대, 백혈구 유착 결핍증(LAD) 또는 만성 육아종성 질병(CGD)은 결핍 또는 부재 유전자를 코드화하는 유전자를 , 고수준의 조직 특이적 발현을 제공하는 조절성 DNA 서열과 함께 조혈 간세포내로 유전적으로 삽입시킴으로써 치료될 수 있다[참조 : Wilson et al., Science (1990) 248 : 1413-1416] 폰빌레브란드 병(von Wil ebrands 'Disease)과 같은 혈소판과 관련된 유전 질환은, 예컨대, 폰빌레브란드 인자를 코드화하는 유전자를 , 발현 및 분비를 가능하게 하는 서열과 함께 유전적으로 삽입함으로써 치료될 수 있다.
선천적으로 결핍되어 있는 유전자 생성물의 치환을 위한 조혈 간세포 유전자 치료요법의 구체적인 적합성은, 특히 아데노신 탈아민효소 결핍으로 인한 심각하게 복합된 면역결핍증과 같은 림프구 면역결핍 질병의 치료에서 명백하다. ADA 유전자를 지닌 T 세포를 순환시키는 레트로바이러스 유전자 치료요법은 이들 환자들이 앓고 있는 임상적 면역결핍증을 완하시키는데 성공적인 것으로 발견되었지만, 형질 감염된 T 림프구의 수명이 생체내에서 한정되기 때문에, 효과는 단지 일시적이었다[참조 : Kasid et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1990) 87 : 473-477, or Culver et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1991) 88 : 3155-3159]. 그러나 만약 유전자가 조혈 간세포내로 성공적으로 형질 감염될 수 있다면, 이들 간세포로부터 발생하는 모든 T 세포가 ADA 유전자를 함유하고 발현할 것이다. 그러므로, 형질 감염된 간세포가 환자의 수명동안 존속 및 증식할 것이기 때문에, T 세포 ADA 결핍증은 일회의 유전자 전달 간세포 치료에 의해 영구적으로 치료될 것이다[참조 : Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (U.S.A.) (1990) 87 : 439-443]. 유전성의 조혈 시스템의 효소 이상을 치료하는 것와 더불어, 간세포 유전자 치료요법은, 바이러스 또는 화학요법과 같은 독성의 외인성 제제로부터 간세포 및 그것의 자손세포를 보호하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, HIV TAT 처리인자(transactivating factor)의 TAR 결합 부위를 코드화하는 DNA 서열들의 유전자 전달은 HIV 바이러스에 의한 감염의 확산으로부터 T 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다[참조 : Sullenger et al., Cell (1990) 63 : 601-608]. 이들 서열의 조혈 간세포내로의 안정한 처리는 모두 이들 간세포로부터 발생하는 T 세포의 푸울(pool)을 유발할 것이며, 이것은 HIV의 확산에 상대적으로 또는 절대적으로 내성이다.
마찬가지로, 다중 약물 내성 유전자(MDR) 또는 메토트렉세이트 내성 유전자를 코드화하는 유전자의 사람 골수 간세포내로의 성공적인 형질감염은 암 화학요법의 효과에 상대적으로 내성인 간세포를 생성할 것이다. 이렇게 유전적으로 조작된 세포를 이용하는 자가 골수 이식후에, 환자는 제제에 의한 화학요법에 내성을 나타낼 수 있으며, 이들 환자의 간세포는 이러한 제제에 보호되면서 항암 약물에 의해 통상적으로 유발되는 심한 골수 억제를 이겨낼 수 있을 것이다. 이것은 환자들이 보다 적은 독성을 보이면서 암 화학요법을 위해 보다 유효한 용량을 수용하는 것을 가능하게 할 것이다.
당업자는 조혈 산세포 유전자 치료요법이 또한 백혈병, 림프종 및 재생불능빈혈과 같은 후천적인 조혈성 질병에도 유용할 것임을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 일단 이들 질병의 유전적 원인이 발견되면, 세포내에서의 비정상적인 유전자의 유전적 원인을 해소시키거나 이를 직접적으로 치료(아마도, 유전자를 스플라이싱하고 대체함으로써)하는 유전자 생성물을 생성시키는 유전자를 삽입하면 비정상을 정상으로 교정할 것이다.
그러나, 보다 넓은 수준에서, 조혈 간세포 유전자 치료요법은 또한 조혈 시스템외의 질병의 치료에도 유용할 수 있다. 치료용 가용성 단백질을 내포하고 있는 DNA 서열들의 유전자 전달은 원하는 양의 치료분자를 영구적으로 분비하는 혈액세포를 성숙하게 할 수 있을 것이다. 예를 들어, 이러한 방법은, 예컨대, 아마도 상승된 혈장 글루코오스 수준에 대한 반응으로 형질 감염된 인슐린 유전자의 적절한 발현을 제어하는 조절 DNA 서열과 함께, 인슐린을 위한 DNA 서열의 삽입에 의한 당뇨병의 치료에 유용할 수 있다. 전신성 고혈압도 안지오텐신 전환효소, 혈관 평활근 칼슘채널, 또는 아드레날린성 수용체에 대한 경합 억제제로서 작용하는 분비성 펩티드를 코드화하는 DNA 서열을 지닌 간세포의 유전적 삽입에 의해 치료될 수 있다, 또한 가능하게는 알쯔하이머 병도, 중추 신경계내의 아밀로이드 플라크를 파괴시키는 효소들을 코드화하는 DNA 서열을 간세포내로 유전적 삽입함으로써 치료될 수 있다.
특히 간세포 유전적 삽입을 통한 유전자 치료요법의 많은 응용이 공지되어 있고 광범위하게 검토되었다[참조 : Boggs et al., supra, Kohn et al., supra, Lehn, supra, and/or Verma et al., supra]. 예를 들어, T 림프구에 대하여 설명된 바와 같은, 분화된 사람간 세포내로 치료효과를 나타내는 유전자를 전달하는데 있어서 성공한 실예들이 증가되고 있다[참조 : Kalsd et al., Proc. Nat. Acad Sci (U.S.A), (1990) 87 : 473-477, culver et al proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) (1991) 88 : 3155-3159].
불행하게도, 본 발명 이전에는 사람 간세포내로의 (안정한 )유전자 전달을 수행하는 것이 이루어지지 않았다. 여러 연구진들이 사람 조혈세포내로의 레트로바이러스 중재된 유전자 전달의 가능성을 증명한 바 있지만, 사람 원시 조혈 간세포는 성공적으로 형질 감염되지 않았었다. 이러한 결과는 조혈 간세포내로 어떠한 수준의 레트로바이러스 중재된 유전자 전달이 가능 하였던 마우스에서의 실험과는 매우 대조적이다[참조 : Wilson et al., Pro. Nat. Acad. Sci. (USA) (1990) 87 : 439-443].
성공적인 사람 조혈 간세포 유전자 치료요법을 수행하는데 주된 장애는 , 간세포가 분열되고 증식하는 조건하에서 사람 조혈세포내로 유전자를 삽입시킬수 없다는 것이다. 표적 세포내로의 성공적인 안정한 유전자 삽입은, 표적 세포가 최소한 1회의 세포분열을 진행하는 것이 요구된다. 그러므로, 만약 간세포가 소정의 유전물질의 존재하에 분열하지 않는다면 그 유전물질은 간세포내로 안정하게 삽입되지 않을 것이다. 본 발명 이전에는, 사람 간세포의 생체외 분열 및 증식을 유지시키는 시스템이 존재하지 않았었고, 사람 간세포의성공적인 유전적 형질 전환도 가능하지 않았었다.
본원과 관련된 문헌중에는 미국 특허 제 4,721,096호가 있는데, 이 특허에서는 조혈세포의 성장을 위한 간질세포를 포함하고 있는 3차원 시스템이 기재되어 있다(참조 : 상기 특허에 인용된 참고문헌). 글란빌(Glanville)등의 문헌[Glanville et al, Nature (1981) 292 : 267-269]에는 마우스의 메탈로 티오네인-1 유전자를 설명하고 있다. 웡(Wong)등의 문헌[Wong et al., Sciene (1985) 228 : 810-815]에는 사람 GM-CSF를 기재하고 있다. 레미슈카(Lemischka)등은 문헌[Lemischka et al., Cell (1986) 45 : 917-927]에서 조혈 간세포에 대한 마아커로서 레트로바이러스 중재된 유전자 전달과, 이식후 상기 조혈 간세포의 작용을 추적한 것에 대한 설명하였다. 양(Yang)등은 문헌[Yang et al., Cell (1986) 47 : 3-10]에서 사람 IL-3을 설명하였다. 첸(Chen)등은 문헌[Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7 : 2745-2752]에서 플라스미드 DNA에 의한 포유동물 세포의 형질전환을 설명하였다. 그리브스(Greaves)등은 문헌[Greaves et al., Cell(1989) 56 : 979-986]에서 사람 CD2 유전자를 설명하였다. 시빈(Civin) 등은 문헌[Civin et al., J.Immunoi. (1984) 133 : 1576]에서 CD34 항원을 설명하였다. 마르틴(Martin)등은 문헌[Martin er al., Cell(1990) 63 : 203-211]에서 사람 S-CSF를 설명하였고; 포레스터(Forrester)등은 문헌[Forrester et al., J. Cell Science (1984), 70 : 93-110]에서 평행 흐름 챔버에 대해 논의한 바 있다. 쿨롬벨(Coulombel)등은 문헌[Coulombel et al., J. Clin. Invest., (1986) 75 : 961]에서 정지 배양액에서의 CML 세포의 손실을 설명하고 있다.
그러므로, 사람 간세포의 생체외 복제 및 안정한 유전적 형질전환을 위한 방법 및 조성물과, 사람 조혈 선구 세포 배양액의 최적화 방법 및 조성물이, 특이 간세포 증식, 선구 세포 증식, 및 이들 시스템에 의해 제공되는 유전자 치료요법에 대한 큰 효능의 견지에서, 상당히 요구되고 있다, 불행히도, 지금까지 그러한 결과를 달성하기 위한 연구는 기대에 어긋났었다.
[발명의 개시]
따라서, 본 발명의 목적은, 배양 배지 조건 및 반응기를 포함하여 사람 간세포의 생체외 증식 및 안정한 유전적 형질전환을 위한 신규한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 배양 배치 조건 및 반응기르르 포함하여, (i) 사람 조혈 선구 세포 배양액의 최적화 및(ii) 안정하게 유전적으로 형질전환된 사람 조혈 선구 세포를 얻는 것을 최적화하기 위한 신규한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 배양 배지 조건과 반응기를 포함하여, 생체외 사람 간세포 분열과 안정한 유전적 형질전환 및/또는 사람 조혈 선구 세포 배양액의 최적화를 제공하는 신규한 방법의 발견을 토대로 한다. 이러한 방법은 지속적으로 또는 주기적으로, 약 24시간 내지 약 48시간 주기당 배양액 1㎖에 대하여 배지 1 밀리리터(㎖)의 비율로 대체, 바람직하게는 관류되는 액체 배양 배지에서 사람 간세포 및/또는 사람 조혈 선구 세포를 배양하고, 생리적으로, 허용되는 조건하에서 배양액을 유지하면서 대사산물을 제거하고 고갈된 영양물을 보충하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 배지 대체는 신속하게 교환된 배양배지에 대한 조헐성장 인자의 첨가와 함께 이용된다.
본 발명자들은 신속하게 교환된 배양 배지에 조혈 성장 인자들을 임의로 첨가하면서, 본 발명에 따라 이용되는 증가된 배지 교환 속도가, 놀랍게도,(1) 최소한 5달간의 연장된 기간에 걸쳐서 사람 간세포가 증식되게 배양액을 유지시키고, (2)최소한 5달간의 연장된 배양 기간동안 사람 조혈 선구세포가 분열 및 분화에 의해 생성되게 배양액을 유지시키며, (3) 사람 골수 간첩 세포를 포함한 사람 간질세포의 증가된 대사를 자극하고, 사람 간질세포로부터의 GM-CSF 분비를 자극하는 것을 발견하였다. 본 발명은 무엇보다, 배양중의 사람 간세표 생존 및 증식을 제공한다.
본발명은 또한 사람 간세포내로 유전물질을 성공적으로 삽입시켜, 안정하게 유전적으로 형질 전환된 사람 간세포가 생성되도록 하는 사람 간세포의 연속적인 증식을 유지시키는 생체외 배양 시스템을 제공한다.
본 발명의 이러한 구체예는 재조합 레트로바이러스내로 조작될 수 있는 어떠한 유전물질을 전달하는데 이용되거나, 세포 분열을 필요로 하는 어떠한 다른 유전자 전달 벡터를 전달하는데 이용될 수 있다. 이 방법으로 생성된 유전적으로 변형된 사람 간세포는 상기 설명한 바와 같이, 다양한 임상질병에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 사람 조혈 선구 세포내으로의 유전적 전달의 효율을 증진시키는 방법과 함께, 안정하게 유전적으로 형질 전환된 사람 간세포 및/또는 안정하게 유전적으로 형질 전환된 사람 조혈 선구 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 간세포를 포함하여, 배양중의 조혈세포, 특히 성숙화의 초기 단계에 있는 세포의 효과적인 증식을 가능하게 하는 반응기 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 정상적으로 형질 전환된 간질 세포를 사용하는데, 이것은 성장 인자의 구성성 또는 유도성 생성을 제공하며, 이 세포들은 조혈세포가 용이하게 분리되도록 물리적으로 분리된다. 연속적인 관류를 제공하고, 적절하게 세포를 재순화시킴에 의해, 고밀도 및 고수율의 생존 가능한 조혈세포가 얻어질수 있다. 반응기는 간질세포에 대한 단백질 표면과 간질세포 및 조혈세포의 분리를 유지하기 위해 표면 또는 다른 장벽을 사용한다.
[도면의간단한 설명]
제1도는 관류 챔버의 개략도이다.
제2도는 관류 배지 경로의 흐름도 및 개략도이다.
제3a도는 세포의 분리를 위한 전단응력을 측정하기 위한 흐름챔버의 개략도이다.
제3b도는 제3a도의 흐름챔버의 측면도이다.
제3c도는 조혈세포에 대한 전단응력 프로필의 그래프이다.
제4a도 및 제4b도는 조혈세포를 성장시키고 분리시키기 위한 흐름 챔버의 평면도 및 측면도이다.
제5a도 및 제5b도는 간질세포의 연속 성장을 허용하도록 장벽이 차례로 제거되어 있는 흐름챔버의 도면이다.
[발명을 수행하기 위한 최선의 형태]
본 발명의 장점은 본 발명이 조혈 배양물(들)에서 발견되는 세포들과 같은 액체 사람 간세포 및/또는 선구 세포 배양을 위한 어떠한 표준 시스템에 적용될 때는 언제나 관찰될 수 있다. 배양액에 보충적인 조혈성장인자를 임의로 첨가하면서, 본 발명에 따라 사용된 신속한 배지 교환 속도를 이용함으로써, 본 발명자들은 놀랍게도 액체 사람 조혈 배양을 위한 표준 시스템을 만드는 것이 가능하다는 것을 발견하였는데, 이 시스템은 말, 소, 소의 태아, 또는 사람 혈청을 포함한, 동물의 혈청 또는 혈장의 존재 또는 부재하에 수행된 배양액을 포함하며, 질적으로 우수한 방식으로 수행된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 사람 액체 조혈세포 배양은 혈청 알부민, 콜레스테롤 및 /또는 레시틴, 셀레늄, 및 무기염과 조합될 수 있는 예를 들어, IMDM, MEM, DMEM, RPMI 1640, 알파 배지 또는 맥코이 배지와 같은 표준 공지 배지 성분들을 사용하여 배양액 1㎖당 104내지 109세포의 세포 밀도로 수행될 수 있다. 공지되어 있는 바와 같이, 이들 매양액들에는 히드로코르티손(hydrocortisone)과 같은 코르티코스테로이드가 10-4내지 10-7M의 농도로 보충되거나, 코르티손, 텍사메타솜 (dexamethasome) 또는 솔루매드롤(solumedrol)과 같은 다른코르티코스테로이드가 동일한 정도로 첨가될 수 있다. 이러한 배양은 전형적으로 거의 생리적인 pH, 즉, 6.9 내지 7.4의 pH에서 수행된다. 배지는 전형적으로 4 내지 20부피%의 산소, 바람직하게는 6내지 8부피%의 산소를 함유하는 산소 함유 대기에 노출된다.
이들 표준 배양 기법을 사용하여, 사용된 세포의 양은 어떠한 소정량만큼, 예컨대, 간세포 함량 또는 조혈선구세포 함량에 있어서 103배 이상까지 증가될 수 있다. 이런 부화를 달성하기 위해서, 네가티브 선택법 또는 포지티브 선택법의 어느 하나에 상응하게 상이한 공지 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 네가티브 선택법에 따르면, 성숙한 세포는 면역학적 기술, 예컨대, 마우스 항사람 단클론성 항체의 패널로 비선구세포, 비간세포를 표지한 후에, 토끼 항 마우스 Ig-피복된 플라스틱 접시에 대한 유착성에 의해 마우스 항체 피복된 세포를 제거하는 기법을 사용함으로써 제거된다[참조 : Emerson et al., J. Clin. Invest. (1985) 76 : 1286-1290].
본 발명은 상기 조건들 중 어느 하나의 조건하에서 액체 사람 골수 배양의 기초적인 조건을 변경하는 것으로서, 영양배지를 신속하게 교환하는 것에 관한 것이다. 표준 배양 스케쥴은 배지 및 혈청이 주마다 1회 교환되든지, 절반씩의 배지와 혈청이 1주에 2회 교환되는 것으로서, 주마다 교환되는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 배양액의 영양배지는 지속적으로 또는 주기적으로, ㎖당 2×106내지 1×107세포의 밀도로 배양된 세포에 대하여 약 24내지 48시간의 주기로 1㎖의 배양액당 약 1㎖의 비율로 교환, 바람직하게는 관류된다. ㎖당 1×104내지 2×106세포의 세포 밀도에 대해서도 동일한 배지 교환속도가 이용될 수 있다. ㎖당 107보다 높은 세포 밀도에 대해서는, 단위 시간당 세포에 대해 일정한 배지 및 혈청 흐름을 달성하기 위하여 배지 교환속도는 정비례하게 증가될 수 있다.
본 발명에 따르는 영양 배지의 교환은, 예컨데 소모한 배양배지의 일정액을 제거하고 그것을 새로운 일정액으로 치환함에 의해 배지를 치환시키는 결과를 달성하는 어떠한 방식으로든지 가능할 것이다. 첨가되는 일정액의 흐름은 중력, 펌프, 또는 어떠한 다른 적당한 수단에 의해 수행될 수 있다. 흐름은 배양의 형태 및 팩킹(packing)에 따라 어떠한 방향 또는 다수 방향으로 흐를 수 있다. 바람직하게는, 새로운 배지는 세포 덩어리와 접촉하도록 하는 방식으로 배양액에 첨가된다. 가장 바람직하게는, 생체내 관류를 의사하는 방식으로, 즉, 세포 덩어리의 최소한 일부분을 통하여, 전 세포 덩어리를 통하여 관류되는 방식으로 배양액에 첨가되는 것이다.
본 발명의 다른, 임의의, 그러나 중요한 구체예는 합성 조혈 성장 인자들을 포함한, 조혈 성장인자들을, 신속하게 교환된 배양액에 첨가하는 것이다. 이 구체예의 특히 바람직한 측면으로, 시토킨 IL-3과 GM-CSF는 둘다 함께, 0.1 내지 100ng/㎖/일, 바람직하게는 약 0.5 내지 10ng/㎖/일, 가장 바람직하게는 1 내지 2ng/㎖/일의 비율로 배지에 첨가된다. Epo는 0.001 내지 10U/㎖/일, 바람직하게는 0.05 내지 0.15U/㎖/일의 양으로 영양 배지에 첨가 될 수 있다. 비만 세포 성장 인자(MCF, c-키트, 리간드, Steel factor)는 1내지 100ng/㎖/일, 바람직하게는 10 내지 50ng/㎖/일의 양으로 배지에 첨가될 수 있다. IL-1(α 또는β)은 또한 10 내지 100유니트/㎖/3 내지 5일의 양으로 첨가될 수 있다. 또한, IL-6, G-CSF, 염기성 섬유아세포 성장 인자, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, PDGF, 또는 EGF가 1 내지 100ng/㎖/일의 비율로 첨가될 수 있다.
본 발명자들은 IL-3, GM-CSF와 Epo가 상술된 바와 같이 사용될 때 적혈구의 특이한 선형 발생을 얻을 수 있음을 발견하였다. 또한, IL-6 또는 G-CSF의 존재 또는 부재하에 IL-3 및 GM-CSF가 사용될 때, 배양액은 우선적으로 과립구를 생성시킨다. 본 발명자들은 또한 본 발명의 배양액을 사용하여 T 및 B 림프구가 시간이 경과함에 따라 소실되는 것을 발견하였다.
배지내의 대사산물 수준은 정상적으로는 특정의 범위내에서 유지된다. 글루코오스 농도는 통상 약 5 내지 20mM의 범위내에서 유지된다. 락데이트 농도는 통상 35mM 이하로 유지되고, 글루타민 농도는 대체로 약 1 내지 3mM의 범위로 유지된다, 암모늄 농도는 대체로 약 2.4mM이하로 유지된다. 이러한 농도는 공지 방법을 이용하여 주기적인 방법 또는 온라인 연속 측정 방법에 의해 모니터링될 수 있다[참조 : Caldwell et al., J. Cell. Physiol.(1991) 147 : 344-353].
본 발명에 따라 배양될 수 있는 세포들은 사람 간세포 또는 사람 간세포 함유 세포 덩어리일 수 있으며, 또한 사람 말초 혈 단핵세포, 사람 골세포, 사람 태아의 간(liver) 세포, 배(embryo) 간세포 및/ 또는 사람 코오드(cord) 혈액 세포도 포함될 수 있다. 이들 세포 덩어리 각각은 사람 간세포 및/또는 사람 조헐 선구세포를 함유한다. 사람 골수에서 발견되는 어떠한 사람 간세포를 포함하여, 사람 간세포를 함유하고 있는 다른 세포 덩어리들도 또한 본 발명에 따라 사용될 수있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 세포 배양액은 세포 덩어리의 사람 간세포 함량이 증대되도록 부화될 수 있다. 그러한 부화는 상술된 바와 같이 달성될 수 있고, 본 발명에 따라 이용될 때는, 사람 골수 및 사람 골수 간세포에 존재하는 사람 간세포를 포함한 사람 간세포내로의 유전자 전달을 통한 유전적 치료요법에 유용한 첫번째 수단을 제공한다. 사람 골수에 존재하는 간세포는 사람골수, 말초 혈액, 태아의 간(liver), 또는 사람 코오드 혈액으로부터 얻을 수 있는 세포이다.
일반적으로 이러한 구체예에서, 레트로바이러스로 감염된 팩키징 세포주, 또는 그러한 팩키징 세포주 배양액으로부터 얻어진 상징액, 또는 다른 유전자 정달 벡터는 본 발명에 따라 배양된 사람 간세포에 첨가되어, 안정하게 유전적으로 형질 전환된 사람 간세포를 형성시킨다. 본 발명은 증가된 간세포 및 사람 조혈 선구 세포 복제 수준을 제공하는한편, 대조적으로, 선행기술의 배양액은 감소하는 사람 조혈 선구 세포 복제율을 제공하였다(즉, 감쇠 배양액). 본 발명의 배양 시스템은 무엇보다도 세포의 레트로바이러스 감염에 필요한, 배양중의 세포의 증식을 제공한다. 레트로바이러스 감염이 감쇠 배양액에서 수행되었던 종래의 시스템은 조기의 세포 감염을 제공하지 못하였다. 본 발명은, 특히 부화된 간세포 푸울과 함께 실시될 때, 더욱 특히, 합성 성장인자를 포함한 조헐 성장인자의 사용과 더불어 실시될 때, 시험관내에서 간세포 감염을 얻기에 매우효과적인 수단을 제공한다.
본 발명자들은 재조합 레트로바이러스를 함유하고 있는 상징액을 배양액에 첨가하면 사람(조혈)간세포내로 운반되는 바이러스 및 유전자의 도입이 유발된다는 것을 발견하였다. 이들 간세포로부터 분열 및 분화에 의해 발생되는 선구 세포, 및 이들 선구세포의 추가의 분열 및 분화로부터 생성되는 성숙한 혈액 세포들은 시험관내에서 조혈배양 기간동안 형질 감염된 DNA를 함유한다. 본 발명자들은 레트로바이러스가 배양의 초기 단계에서만 첨가되는 경우에, 배양 시작 단계에 존재하고 증식하며, 안정하게 유전적으로 형질 전환된 간세포로부터만 발성할 수 있는 형질 전환된 선구 세포 및 성숙한 혈액 세포를 얻고 있는데, 그 이유는 레트로바이러스 감염된 세포는 인접 세포를 감염시킬 수 없기 때문이라는 것을 관찰하였다. 따라서 원하는 유전물질을 함유하고 있는 선구 세포 및 보다 성숙한 세포는, 초기의 레트로바이러스 감염기간 중에 유전적으로 형질 전환된 보다 원시적인 간세포로부터의 유전자를 수용하였다.
본 발명의 이런 측면의 바람직한 구체예에서 골수, 말초혈액, 태내의 간(liver)또는 탯줄 혈액으로부터 분리된 사람 조혈 세포는 먼저 보다 성숙한 혈액 세포를 제거함에 의하여 간세포의 존재에 있어서 부화되게 된다. 이것은 간세포가 아닌 성숙한 혈액세포 및 골수 선구세포에 있는 에피토프를 인지하는 쥐과의 단클론성 항체와 함께 조혈세포를 인큐베이션한 후, 토끼-항-마우스-Ig 면역흡착표면에 대한 면역유차성에 의해 표지된 세포를 제거함에 의해 이루어진다. 그 결과의 계통 네가티브(Lin) 세포들은 본 발명에 따라 레트로바이러스 또는 다른 유전자 전달 벡터의존재하에 배양된다. 바람직하게는 배양은 GM-CSF(바람직하게는 1mg/㎖/일) 및 lL-3(바람직하게는 1mg/㎖/일)의 존재하에, IL-1(바람직하게는 50 U/㎖/4일), c-키트 리간드(비만 세포 성장인자, 바람직하게는 10mg/㎖/일)가 있거나 없는 상태에서 수행되는 것이 바람직하다.
레트로바이러스 감염은, 배양의 처음 2 내지 21일동안, 바람직하게는 10 내지 14일동안에 재조합 레트로바이러스 감염된 레트로바이러스 팩키징 세포주에 의해 생성된 상징액(예, 5 내지 20% 부피/부피)을 배양 배지내로 포함시키거나, 감염된 레트로바이러스 팩키징 세포주 자체에 직접 Lin-세포를 배양시킴에 의해서, 또는 상기 두가지 방법 모두에 의해서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 레트로바이러스 상징액이 사용되고, 바이러스의 존재하에 인큐베이션의 기간은 12 내지 16일이다. 또한, 팩키징 세포주는 거의 집밀적(confluency)으로 성장되고, 배지는 교환되면, 세포주는 추가로 12 내지 15시간 동안 인큐베이션되는 것이 바람직하다. 그런 다음 배지는 수거되고 사람 간세포의 형질 감염에 사용된다. 그러나, 이러한 원안이 반드시 요구되는 것은 아니며, 레트로바이러스 팩키징 세포주에 의해 생성된 모든 상징액이 사용될 수 있다. 어떠한(공지된) 레트로바이러스 팩키징 세포주가 본발명에 따라 사용될 수 있으며 어떠한 공지의 원안에 따라 배양될 수 있다[참조 : Wilson at al., Science (1990) 248 : 1413-1416 and/or Sullenger et al., Cell (1990) 63 : 601-608].예시될 수 있는 팩키징 세포주는 NIH 3T3 세포와 신장 암 세포주 5637이다.
유전자 발현을 가능하게 하는 적합한 프로모터 및 인핸서 엘레먼트와 함께 재조합 레트로바이러스내로 삽입되는 어떠한 유전자가 사람 간세포 및 조혈 선구세포내로 혼입될 수 있다. 본 발명은 먼저 배양액중에 있는 간세포가 살아서 증식되게 하여, 배양액 중에서 안정하게 형질 감염된 유전적으로 변형된 사람 조혈 간세포의 생성을 허용하는 조건을 제공한다. 용어 안정하게 형질 전환된(stably transformed) 및 안정하게 형질 감염된(stably transfected) 은 본원에서 본 발명에 의해 가능한 사람 간세포 염색체(들)내로의 이종 DNA의 혼입을 설명하는데 사용되는데, 그 이유는 그러한 이종 DNA에 생체외에서 분열하는 사람 간세포를 노출시키는 것이 허용되기 때문이다.
본 발명에 따르면, 사람 조혈 선구세포가 5달 이상의 배양기간을 통하여 사람 간세포로부터 분열 및 증식에 의하여 생성되는 배양물을 얻을 수 있다. 즉, 배양중에 간세포 생존 및 증식을 유지시키는 배양액을 얻는다.
본 발명자들에 의해 얻어진 데이터는 , 배 관류속도가 생체외 사람골수 배양액의 작용(behavior)을 측정하는데 매우 중요한 변수임을 나타낸다. 이 데이터는, 배지 교환속도가 1주에 1회 교환되는 전통적인 덱스터(Dexter)비율에서 1주당 7용적의 일일 기준 배지 교환속도로 증가하였을 때, 생체외 조혈에 상당한 효과가 있음을 보여주고 있다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험에서 모든 배양액은 첫 번째 3 내지 4주 동안 상당한 세포 손실을 나타냈다 이러한 손실 후에 배지는 안정화되었고, 배지 관류의 효과가 나타나기 시작하였다.
1주당 3.5의 배지 교환속도는 가장 증식성인 배양액과, 또한 선구 세포 생성의 견지에서 가장 긴 수명을 가지는 배양액을 유도하였다. 특히, 4주 내지 10주 동안에 특히 주목되는 점은, 생성된 비유착 세포의 1주 2회측정한 수는 실제로 안정하거나 증가하였다.
전체 배양기간 동안에, 3.5주 후에 생성된 세포의 누적된 수는 전통적인 덱스터 배양 원안하에 생성된 것 보다 거의 3배가 더 컸다. 나아가, 선구세포의 안정한 생성은 18주까지 유지된다.
사람 골수에서 발견되는 간질세포와 같은 사람 간질세포는 본 발명의 배양물 중에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 전형적인 배양물중에서, 간질세포는 세포 배양물중에 약 10-3내지 10-1(간질세포/전체세포)의 양으로 존재한다.
본 발명의 다른 측면으로, 본 발명자들은 본 발명의 배양액이 놀랍게도 사람 골수 간질세포에 의한 증가된 대사과정과 GM-CSF 및 lL-6 분비를 제공한다는 것을 발견하였다. 사람 골수 간질세포 상징액에서 GM-CSF가 검출되지 않은 반면, 본 발명에 따르는 신속한 배지 교환은 사람 골수 간질 세포를 자극하여 300센토그램/㎖/일 내지 200피코그램 /㎖/일의 GM-CSF를 분비한다. 사람 골수 간질세포에 의한 IL-6의 분비는 또한 본 발명에 따르는 신속한 배지 교환에 의해 1 내지 2ng/㎖/일로부터 2 내지 4ng/㎖/일로 증가된다. 이러한 증가는 본 발명의 신속한 배지 교환속도만이 이용될 때와 신속한 교환속도와 함께 조혈 성장인자의 첨가가 이용될 때 모두 관찰된다. 본 발명자들에 의해 얻어진 데이터를 토대로, 시토긴의 사람 간질세포 생성에 대한 본 발명의 신속한 배지 교환속도의 효과는 어떠한 복잡한 조직양 시스템에서의 사람 간질세포에 대해서도 관찰되어야 한다.
예시적으로, 본 발명에 따라 사용된 배지는 세가지 기본 성분을 포함할 수 있다. 첫 번째 성분은 IMDM, MEM, DMEM, RPMl 1640, 알파 배지 또는 맥코이스 배지로 구성된 배지 성분, 또는 동등한 공지 배양 배지성분이다. 두 번째 성분은 최소한 말의 혈청 또는 사람 혈청을 포함하고, 임의로 우태아 혈청, 신생 송아지 혈청, 및/또는 소의 혈청을 추가로 포함할 수 있는 혈청성분이다. 세 번재 성분은 코르티코스테로이드, 예컨대, 히드로코르티손, 코르티손, 덱사메타솜, 솔루메드롤, 또는 이들의 조합물, 바람직하게는 히드로코르티손이다.
사용될 수 있는 다양한 배지를 구성하는 조성 성분들을 하기에 나타낸다.
혈청 성분은 배양액에 적어도 1%(v/v) 내지 50%(v/v)의 양만큼 존재할 수 있다. 혈청 농도는 바람직하게 15 내지 30%(v/v)근처이다. 혈청 농도를 더 높이기 위해서는 교환속도를 비례적으로 증가시킨다. 제 3의 성분은 10-7M 내지 10-4M, 바람직하게는 5×10-6내지 5×-5M의 양으로 존재할 수 있다. 배지성분은 세 성분을 모두 가하여 100% 되도록 하는 균형을 나타낸다. 또한, 혈청 성분은 전형적으로 인슐린, 알부민, 및 레시틴 또는 콜레스테롤을 포함하는 몇가지의 표준 혈청 대체 혼합물의 어느 것으로 대체할 수 있다[참조 : Migliaccio et al, Exp. Hematol. (1990) 18 : 1049-1055, Iscove et al. Exp. Cell Res. (1980) 126 : 121-126, and Dainiak et al, j. Clin. Invest (1985) 76 : 1237-1242].
예시적으로는, 사람 조혈간세포 농도를 다음과 같이 증가시킬 수 있다. 피콜-하이파크 구배 원심분리에 의해 적혈구를 골수 흡수물로부터 분리해 낸다. 그 다음에 단헥 세포를 적혈구 및 적혈구, 과립구, 대식세포 및 성숙한 임파구(B- 및 T- 세포 모두)를 포함하는 성숙한 혈액 성분을 인지하는 항체들의 칵테일과 함께 배양한다. 더 나아가, 수임선구세포(항 CD33를 포함)를 인식하는 항체들이 포함된다. 그 다음에 팬닝, 마그s네틱 비드, 또는 형광 활성 세포 분류기(FACS)상에서의 세포 분류를 포함하는 여러 과정중의 하나에 의해 성숙한 세포를 분리해낸다. 성숙한 엘레먼트들을 분리해 냄으로써, 재조합 바이러스 감염의 기회, 및 그에 따른 조혈 간세포로의 원하는유전자(들)의 전달이 상당히 용이해진다.
또다른 구체예에 있어서, 성장 인자를 제공하기 위해서, 섬유아세포와 조혈세포의 혼합물에 가해진 단백질성분으로 정상적으로 형질 전환된 섬유아세포를 사용하고, 효과적인 성장 환경을 유지시키기 위해서, 임의로 재순환되는 실질적으로 연속적인 관류를 이용하는 배양액에서 조혈세포를 성장시키기 위한 방법이 제공된다.
그러므로, 이러한 구체예의 방법에 대한 설명은 관류조건, 반응기 및 이의 내부구조 및 형질 전환된 섬유아세포로 나누어 설명될 수 있다.
반응기는 필요한 세포 분포, 영양분 및 산소의 유입, 폐기 대사 생성물의 제거, 조혈세포의 임의적인 재순환, 간질세포의 치환, 및 조혈세포의 수거를 가능하게 하는 어떤 편리한 형태를 가질 수 있는 용기를 포함한다. 이러한 반응기는 실질적으로 골 관류를 의사하는 조건을 제공해야 한다. 생체내에서 분당 골수 ㎖당 약 0.08㎖의 혈청이 관류된다. 이는 하루에 106세포당 약 0.3㎖의 혈청에 상응한다. 그러므로, 이 배지는 성장을 저해하지 않는 대사 생성물의 양이 유지되도록 어떠한 24시간 주기로 평균 50%이상, 바람직하게는 100% 교환되어야 할 것이다. 이러한 교환율은 일반적으로 하루에 106세포당 약 0.5내지 1.0㎖의 관류배지가 될 것이며, 이는 생체내 관류속도를 의사하는 비율이다.
생체 반응기에서의 관류속도는 반응기에서의 세포밀도에 따라 다양할 것이다. 2 내지 10×106세포/㎖로 배양된 세포에 있어서, 사용된 배지가 20%의 혈청, 10% 우태아 혈청과 10% 말 혈청, 또는 20% 우태아 혈청을 함유하는 경우에, 관류속도는 24 내지 48시간당 1㎖/㎖의 반응기 부피이다. 세포밀도가 더 높은 세포에 있어서는, 일정한 혈청 유량/세포/시간을 달성하기 위해서 환류속도가 비례적으로 증가할 것이다. 따라서, 세포를 5×108세포/㎖로 배양한다면, 환류속도는 분당 0.1㎖/㎖ 반응기 용적이 될 것이다. 혈청과 배지 유량을 세포밀도에 부합되게 하는 이러한 유량은 배양액 중의 정상적인 사람 골수 간질세포로부터 조혈 성장 인자의 내인성 생성을 자극하는데 필수적이다. 이들 혈청 및 배지 유량에 의해 유도된 조혈 성장 인자는 GM-CSF를 포함하며, 또한 다른 조혈 성장인자 뿐만 아니라 S-CSF, IL-6 및 G-CSF도 포함할 수 있다. 이러한 유량은 간세포와 선구세포의 간질세포부착 부위에서의 이들에 의해 경험된 세로 유동으로부터 전단응력이 1.0 내지 5.0다인/㎝2가 되도록 생반응기 내에서 결정된다.
조혈 및 간질세포의 성장을 위해 여러 배지를 사용할 수 있다. 예시적인 배지에는 5 내지 20%의 우태아 혈청, 5 내지 20%의 소 혈청, 및 0 내지 15%의 말 혈청의 조합물로 보충될 수 있는 MEM, IMDM, 및 RPMI, 및 /또는 간질세포 또는 간세포를 자극하는 PDGF, EGF, FGF, HGF 또는 그 밖의 성장 인자로 보충된 혈청 유리 배지가 있다. 형질 전환된 섬유아세포에 의해 제공된 성장인자를 보충하기 위하여, 특히, 특별한 계통의 전용세포가 필요한 경우에, 추가의 성장인자가 관류배지에 포함될 수 있다. 간질세포 분비나 첨가에 의해서 관류 배지에 포함될 수 있는 성장인자는 GM-CSF, G-CSF,도는 M-CSF, 또는 인터류킨(interleukins) 1-7, 특히 1,3,6 및 7, TGF-α 또는 β, 에리트로포이에틴(erythropoietin)등, 특히 사람인자들이다. 특히 주지되어야 할 사항은 0.5 내지 2, 바람직하게는 1ng/㎖ G-MCSF 및 0.5 내지 2, 바람직하게는 1ng/㎖ 뿐만 아니라, 에리트로포이에틴 0.1-2U/㎖일, 약100-300ng/㎖일의 G-CSF 및 약 1-10ng/㎖/일의 간세포 성장인지(S-CSF, 또한 비만 세포 성장 인자 또는 키트 리간드로 나태냄)의 존재이다. 하나 이상.바람직하게는 둘 이상의 성장인자가 형질 전환된 세포로부터 분비됨으로서 제공되는데, 이는 관류배지에서 바람직한 수준의 성장인자를 유지시키기에 충분한 양만큼 존재하는 것을 이해할 수 있을 것이다.
편리하게는, 반응기에서 생리학적 온도, 즉 37℃가 이용되지만 33℃를 포함한 더 낮은 온도가 이용될 수 있으며, 일반적으로는 25℃이상이다. 공기가 약 5%의 이산화탄소를 함유하는 경우, 습도는 약 100%일 것이다. 관류 배지는 반응기 외부 또는 반응기 내부에서 산화될 수 있으며, 내부 산화를 위해 여러 수단이 사용된다. 내부산화는 중공 섬유, 다공성의 소결된 디스크, 실리콘 배관 또는 적합한 다공성 및 소수성 막으로 수행될 수 있다.영양분 수준 및 대사 생성물 수준은 정상적으로 비교적 좁은 범위로 유지된다. 글루코오스 수준은 일반적으로 약 5내지 20mM, 통상 약 10 내지 20mM의 범위로 유지되며, 락테이트 농도는 통상 약 35mM 미만으로 유지되며 20mM 이상이 허용될 것이다.글루타민 농도는 일반적으로 약 1 내지 3mM, 통상 1.5 내지 2.5mM의 범위로 유지되고, 암모니아 농도는 일반적으로 약 2.5mM 미만, 바람직하게는 약 2.0mM 미만으로 유지될 것이다.
유체는 중력,펌프 또는 그 밖의 수단에 의해서 흐를 수 있으며, 이 경우 흐름은 반응기내의 패킹의 성질에 따라 어느 방향 또는 여러 방향일 수 있다. 바람직하게는, 흐름은 반응기를 가로질러 실질적으로 수평일 수 있는 층류가 이용되거나, 흐름이 반응기의 바닥으로부터 상부로 또는 그 역으로 흐르는 수직 흐름이 이용될 수 있다.
사람 조혈세포의 공급원이 신생세포, 예를 들어, 백혈구성 림프종 또는 암을 가지는 것으로 의심되는 경우에, 신생조혈 세포로부터 정상적인 전구세포를 분리하기 위하여 관류 흐름을 선택할 수 있다. 정상 조혈세포는 수직 유체 흐름으로부터 약 1.5 내지 2.0다인/㎠ 견뎌낼 수 있는 친화력을 가지고 간질 및 매트릭스 단백질에 유착된다는 것이 밝혀졌다. 대조적으로,신생세포 및 이들의 전구체들은 간질에 대해 더 약한 친화력, 약 0.05 내지 1.2다인/㎝2을 가진다. 정상 및 신생 전구 세포가 감내할 수 있는 전단응력의 중간의 전단응력, 일반적으로 1다인/㎠을 초과하는 전단응력을 제공하는 관류속도를 제공함으로써, 정상 전구 세포로부터 신생 전구세포를 분리하여 2일 이상, 바람직하게는 약 5일 이상, 더욱 바람직하게는 7일 이상 동안 관류를 유지시킬 수 있다. 이와 같은 방법으로, 환자로부터의 정상적인 조혈세포를 증식시킬 수 있으며, 그와 동시에, 적절한 유속을 이용하여 신생세포를 분리할 수 있다. 이와 같은 방법으로, 종양질환을 앓고 있는 환자로부터의 자가조직 조혈세포를 제공하고, 화학요법 또는 X-조사로 환자를 치료하는 동안에 정상 조혈세포를 증식시키고, 환자의 정상 조혈세포를 회복 시키ㅕ조혈 및 면역체계를 회복시킬 수 있다.
정상 조혈세포로부터 조혈 종양 세포를 분리하기 위하여 전단응력을 이용하는 예는 만성 골수성 백혈병(CML)의 경우이다. CML 세포에 대한 전단응력 허용치는 0.05 내지 1.2다인/㎝2의 범위에 있다. 이 차이로 인하여 개별적인 골수 샘플에 있어서의 효율적인 CML세포의 분리가 가능하다. 약 1.2 내지 1.5 바람직하게는 1.3다인/㎝2의 전단속도를 이용함으로써, CML 세포를 효과적으로 분리할수 있다.
개개의 골수세포 내에서의 전단응력 허용치는 테이퍼링된 방사흐름 챔버를 사용하여 측정할 수 있다. 이 방사흐름 챔버에서, 세포에 가해지는 전단응력은 1/d의 함수로서 챔버의 출발부로부터의 거리 d와 함께 감소한다. 또한 밴드를 분석하여 세포군 및 바람직한 세포군이 유지되도록 설정된 전단응력을 측정할 수 있다.
백혈병성 간세포를 분리하는데 있어서, 백혈병을 앓고 있는 환자로부터 얻은 골수 샘플로부터의 전구세포와 간세포를 먼저 방사흐름 챔버내에 넣는다. 이 방사흐름 챔버는 폴리카보네이트 또는 유리로 제조된 두 개의 평행한 판으로 이루어져 있어서, 골수 간질세포가 더 낮은 판에 유착되게 한다. 최초 측정은 1)조혈 세포를 주입하기 전에 골수 간질세포로부터 미리 형성된 융합성 단일층을 형성시키고, 이어서 12 내지 24시간 후에 유체흐름을 개시시켜, 2) 미리 형성된 간질 단일층을 사용하지 않으면서 환자의 골수를 직접 흐름챔버내로 접종하고, 3 내지 4일을 기다린 후에, 유체 흐름, 일반적으로 0.05 내지 1.0cc/분의 유체흐름을 형성시킴으로써 수행될 수 있다. 판들은 모서리를 고무줄로 묶어서 밀봉하고, 이어서 조정 가능한 나사로 함께 고정시킨다. 챔버의 좁은 주입 단부에서, 튜브가 일정한 압력의 주사기형 펌프에 의해 전달된 유체를 저장소로서부터 챔버내로 흐르게 한다. 유체와 분리된 세포들은 별도의 튜브를 통해 넓은 수거 단부에서 수거된다(참조 : 제3a도 및 제3b도). 관류기간(통상 3 내지 7일)후에, 비유착성 세포들을 제거하고, 판들을 분리하며, 각각의 3 내지 5영역으로부터의 세포를 흡출 및 고무찰자로 개별적으로 제거하고, 각각의 분획을 표준기술(일반적으로 염색체 밴딩에 의한 핵형 분석)로 백혈병 세포의 존재 여부를 분석하였다. 각 분획의 백혈병 분석을 비교해 보면, 어떤 분획에서는(즉, 어떤 진단 응력에서는), 백혈병 세포가 간질에 유착되지 않고 제거됨이 입증되고 있다. 이들 챔버에서, 세포에 의해 인지되는 전단응력은 도입구로부터의 거리의 함수로서 지수적으로 감소된다(참조 : 제3c도). 전형적으로, 비유착성 세포들은 모두 또는 거의 모두 백혈병 세포인 반면, 챔버의 가장 가까운 1/2 지점에서 유착되는 세포들은 완전히 또는 거의 완전한 정상세포이다.
이러한 측정의 결과에 근거해서 일련의 평행한 직사각형 챔버가 설정되는 데, 여기에서 하부 표면상의 유체유속(참조 : 제4a도 및 제4b도)가 테이퍼링된 챔버에서 나타났던 전단응력을 셍성시켜, 모든 정상 세포는 제거하지 않으면서 간질로부터 백혈병 세포를 제거한다. 만성 골수성 백혈병 환자 골수의 경우에 있어서, 이러한 전단 응력은 전형적으로 0.01 내지 0.05다인/㎝2이다. 이용되는 실제 유속은 챔버의 크기와 외형에 좌우된다. 환자의 골수세포를 106M 히드로코르티손과 함께 또는 이것 없이, 5 내지 20%(전형적으로는 10%)의 우태아 혈청 및 0 내지 15%(전형적으로는 10%)의 말 혈청을 함유하는 이스코브의 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)중의 5×106/㎖ 내지 50×106/㎖의 농도로 이들 직사각형 챔버에서 배양한다. 유체흐름 없이 골수세포를 12 내지 24시간동안 배양하고, 이어서 유체흐름을 개시시켰다. 세포를 3 내지 7일간 배양하고, 이 시점에서 모든 비유착성 세포들을 따라낸다. 유착세포는 흡인 및 기계적인 진탕에 의해 작사각형의 판에서 발견되고 수거될 수 있을 것이다. 그 다음에, 이들 세포는 환자에게 직접 되돌려 주거나, 이후 사용을 위해 표준 기술에 의해서 액체 질소에 보관할 수 있다.
조혈 시스템의 세포가 아닌 세포들도 전단응력에 대한 차별적인 허용치를 사용함으로써 분리될 수 있다. 이렇게 해서, 세포의 복합 혼합물내에 세포의 독특한 서브군이 있는 경우에, 상기 방법은 예컨대, 피부, 간. 근육 신경 도는 상피로부터 유도된 세포 현탄액내에서 원하는 세포형을 분리해내는데 사용될 수 있다. 특히 주목의 대상이 되는 사항은 정상 세포군내에서 종양세포를 분리하는 것이다. 분리되는 세포군은 목적하는 세포가 유착되는 정제된 단백질 또는 세포성분과 같은 적합한 간질 기질과 접촉될 수 있다. 각각의 유착성 서브군에 대한 전단 응력 허용치는 상기한 바와 같이 측정한다. 그 다음에, 간질상에 원하는 세포의 서브군이 유지되도록 유체 흐름을 적절하게 조절한다. 그 다음에, 원하는 세포들을 상기한 바와 같이 수거한다. 간질세포와 조혈세포 사이의 어떠한 물리적인 분리를 유지시키면서, 그리고 간질세포와 조혈세포 사이의 어떠한 접촉 또는 근접병치를 가능하게 하면서, 반응기에서 다양한 팩킹을 사용하여 세포를 유착 성장시킬 수 있다. 이러한 방법으로, 간질세포에 의해 분비된 인자들이 용이하게 조혈세포에 취해져서, 증식될 수 있으며, 적절하게는 분화 및 분열될 수있다.
세포를 지지하는단백질 매트릭스는 단편화된 콜라겐 입자. 예를 들어, 스폰지 또는 다공성 콜라겐 비드, 골수로부터의 세포외 골 매트릭스 단백질로 이루어진 스폰지 또는 비드, 또는 단백질 피복된 막의 형태를 가질수 있으며, 여기서 단백질은 콜라겐, 피브로넥틴, 헤모넥틴, RGDS 펩티드, 혼합되어 골수 기질 단백질 등일 수 있다. 막의 구멍크기는 물리적인 간격을 여전히 보유하면서 상이한 세포형 사이의 상호작용을 가능하게 하는 약 1 내지 5μ의 범위일 것이다.
단백질로 피복될 수 있는 막이 사용될 수 있다. 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카아보네이트, 폴리술포네이트 등과 같은 다양한 막 재료가 사용될 수 있다. 다양한 단백질, 특히, 콜라겐 또는 기타 단백질을 사용할 수 있다. 이러한 막은 형질 전환된 세포들이 이 막을 통해 통과할 수 없지만, 막의 한 면상에서 성장하고 밀집층을 형성하며, 일부의 세포막이 구멍내로 연장될 수 있도록 충분히 작은 구멍을 지녀야 한다. 일반적으로 이러한 구멍들은 1 내지 5μ범위의 크기일 것이다. 이러한 방법으로, 조혈 간세포는 막의 반대쪽 부위상에서 성장하고 형질 전형된 세포와 접촉할 수 있어서, 인자들이 형질 전형된 세포로부터 조혈 전구세포로 직접 전달될 수 있다. 전구세포, 간세포들은 구멍내로 통과하는 삽입된 세포질 돌출부에 결합될 수 있다. 간세포로부터의 조혈 분화는 막의 한쪽상에서 발생되고, 분화된 자손세포들은 구멍들을 통해 빠져나갈 수 없게 되는데, 구멍들은 밀집되거나, 거의 밀집되는 경우에 간세포층에 의해 이미 거의 충전되게 된다. 예를 들어, 간질 세포가 성장할 수 있고, 조혈세포가 서브 밀집성 수준의 간질세포를 지니는 챔버에 따라 이동할 수 있는 다수의 챔버를 제공할 수 있다. 이렇게 하여, 챔버들 사이에 이동성 장벽을 가짐으로써, 간질세포가 융합성이 되는 경우, 일반적으로 약 8 내지 12주 후에, 챔버들 사이의 장벽을 개방하거나 제거하고, 조혈세포가 서브 밀집성 간질세포와 접촉되게 할 수 있는데, 이때, 서브 밀집성 간질세포는 조혈세포를 포함하는 챔버에 인자를 공급한다는 (참조 : 제5a도 및 제5b도). 조혈세포는 적절한 유속 또는 그밖의 용이한 수단에 의해 전달될 수 있다. 챔버에 여러 웰(Well)을 제공할 수 있는데, 이들은 적당한 벽에 의해 분할되고, 한 웰에서 시이딩된 후에, 세포들이 밀집성으로 되는 경우, 세포들을 다음 웰로 이동시키고 다음 웰을 서브 밀집성 방법으로 시이딩한다. 이 시스템의 또 다른 변형 방법은 배양 8내지 12주후에, 조혈세포를 새로운 증식성 간질세포에 노출시키는 방법이다. 이러한 변형은 몇가지 방법중의 한가지 방법으로 수행된다. 증식하는 간질세포에 이렇게 노출시키는 것은 여러 방법중의 한 가지 방법으로 수행된다. 한가지 기술로는 배양물을 EDTA에 3내지 5분동안 노출시켜, 조혈 간세포를 간질세포로부터 제거하는 기술이 있다. 제거된 세포를 이어서 새로운 배양용기로 옮기는데, 이러한 배양용기는 3 내지 7일 전에 시이딩된 골수 간질세포를 함유 할 수 있다. 이러한 과정을 매 8 내지 12주마다 반복한다. 또다른 방법은 배양물의 용적을 증가시키고 추가의 콜라겐 비드를 배양물에 8내지 12주째에 가함으로써 추가의 표면적을 부가하는 것이다. 마지막으로, 작은 유기 분자 또는 단백질, 특히 호르몬, 예컨대 혈소판 유도된 성장인자(100 내지 500ng/㎖), 인터류킨 1 알파, 종양 괴사인자 알파, 또는 기본적인 섬유아세포 성장인자 또는 섬유아세포에 유사분열 유발성인 그 밖의 분자들이 배양액에 매 3 내지 7일 마다에 첨가될 수 있다. 간질 유사분열 자극인자에 이렇게 노출 시키면 골수 간질세포의 계속적인 증식 및 조혈 성장인자의 계속적인 생성이 촉진된다. 이렇게 해서, 간질세포의 계속적인 서브밀집 단계를 제공할 수 있다.
유체의 연속적 흐름을 이용해도 골수군내에서 암 세포로부터 정상 세포들을 분리해 낼 수 있다. 이러한 방법에 있어서는, 우선 방사성 흐름챔버를 이용하여 정상세포와 암 세포의 특이적 간질 유착 성질을 측정한 다음, 암 세포를 제거하기에 충분한 전단응력을 달성할 수 있도록 설정된 흐름속도가 있는 직사각형 흐름챔버를 이용하여, 정상세포와 암성세포를 예비조작적으로 분리시키고 있다.
본 발명의 방법과 장치는 또한 관류배지의 흐름에 의해 손실되는 간세포를 재순환시키는 기회를 제공한다. 표면 막 단백질 마아커 CD34는 실질적으로 성숙한 조혈 세포로부터 미성숙 조혈세포를 분리시킨다. 따라서, CD34+인 세포들을 포획 및 재순환시킴으로써, 배지에서의 간세포의 손실을 피할 수 있다.
미성숙 세포분획을 포획하여 반응기에 환원시키는 데에는 다양한 기술이 사용된다. 예를 들어, CD34에 특이적인 항체로 세포를 표지화시킨 다음, CD34+ 세포들을 수거하고 반응기로 재순환시키기 위한 항체에 대한 항체들을 사용할 수 있다. 포지티브 선별을 위한 다른 방법으로는, 네거티브 선별 방법을 이용함으로써, 예컨대 글리코포린 A, CD33, MO1, OKT3, OKT4, OKT8, OKT11, OKT16, OKM1, OKM5, Leu7, Leu9, Leu M1, LeuM3 등에 대한 항체들과 같은, 성숙세포에 결합된 다양한 마아커들에 대한 항체들을 사용하여 성숙세포들을 제거할 수 있다. 다양한 조혈계통, 림프, 골수 및 적혈구의 성숙세포에 특이적인 마아커로 다양한 항체들이 이용될 수 있고, 이들 항체를 사용하여, 반응기의 유출물로부터 성숙 세포를 제거한 후, 잔류 세포를 수거하고 반응기로 귀환시킬수 있다. 이러한 방법으로 간 세포의 손실에 기인한 배양액에 가해지는 감쇠(decline)를 피할 수 있고, 간세포를 시험관내에서 무한하게 생존 유지시킬 수 있다.
항체 마아커를 사용하는 분리방법은, 예컨대, 패닝(panning)방법, 형광활성화 세포의 분류법, 폴리스티렌 표면, 금속 미소구체 및 자석 등에 항체를 결합시키는 방법등과 같은 표준기술을 단독으로나 조합하여 사용하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 항체들은 유착성과 비유착성 사이의 분리를 가능하게 하는 표면에 결합되거나, 항체에 직접 또는 간접적으로 표지화되어 표지화되지 세포와 표지화되진 않은 세포들을 선별할 수 있게 한다.
본 발명의 방법을 수행함에 의해서, 아주 연장된 시간동안 조혈세포가 시험관내 성장하여, 생체외 사람 조혈작용이 배양액내에서 6개월 이상으로 제공되며, 과립구 조혈작용이 4개월 이상 지속되며, 적혈구 조혈작용이 3개월이상 지속된다. 또한, 조혈 선구세포는 배양액 전체에 걸쳐 연속적으로 생성되어 접종 세포의 10배 이상으로 선구세포가 증식된다.
또한, 본 발명의 방법을 수행함에 의해서, 간세포의 분열속도가 현저하게 증가하여, 레트로바이러스로 형질 감염된 유전물질의 효율적인 삽입을 가능하게 한다. 최초 2주 감염기간 중에 적절한 레트로바이러스 벡터에 의해 삽입된 유전자는 4개월 이상의 배양 기간의 후속배양 동안 모든 선구세포 및 전구세포를 10 내지 30%까지 발현시킬수 있다. 따라서,이러한 본 발명의 방법은 유전물질을 고도로 증식성인 사람 조혈 간세포에 성공적으로 전달할 수 있다.
제1도는 관류챔버에 대한 개략도이다. 커버 플레이트(12)와 바닥 플레이트(14)를 구비한 반응기(10)는 볼트(1b)에 의해 연결되고, 윙너트(18)에 의해 제위치에 고정된다. 3개의 볼트를 사용하여 뒤틀림을 방지한다. 챔버(20)에는 3개의 구역, 즉, 간질세포의 지지 매트릭스를 함유하는 중간 구역(22), 간질세포층, 및 골수세포를 지니고 있다.중간구역(22)는 각각 막 또는 메쉬(28) 및 (30)에 의해 상부구역(24) 및 바닥부 구역(26)과 분리되어 있다. 용이하게는 폴리술포네이트 막 또는 스테인레스강 메쉬가 사용될 수 있는데, 메쉬의 크기는 세포들이 챔버의 중간구역내에 함유되도록 충분히 작다. 분리 중간부(interphase)는 분리막을 기계적으로 지지하도록 구획되는 내부 실린더(27)을 사용함으로써 챔버내에 위치할 수 있다. 상부 구역(24)와 바닥부 구역(26)은 동일해야 할 필요는 없고, 액체 배지와 기체가 통과하여 교환되는 튜브나 막을 구비한다. 기체는 예컨대 실리콘과 같이 소수성 튜브를 통해서 교환되는데, 이러한 튜브의 길이(및 가스/액체 접촉면적)는 중간구역에서 대사하는 세포군의 요구에 부합되도록 충분한 가스 유동이 가능하게 다양할 수 있다. 배지는 상부 구역이나 바닥부 구역으로부터 포트(32)를 통해서 직접 펌핑 또는 회수될 수 있고, 공급튜브(34)를 통해 공급될 수 있다.
요구되는 경우, 상부 구역 및 바닥부 구역이 외부 산소공급기를 사용함으로써 제거될 수 있다. 이러한 경우에, 분리막은 글래스 실린더(36)의 아래에 고정되며, 상기 실린더형 그루브 플레이트(12) 및(14)내에 고정되고, 실린더형 그루브의 내부 영역은 막 전체에 걸친 우수한 흐름 분포를 가능하게 한다. 이러한 기하학적 형태는 한정된 수의 도입구로부터의 유체가 혼합되게 하며, 방사사의 입력이 평형되게 하여, 분리막 전체에 걸쳐 액체 흐름을 균일하게 한다. 이러한 구성은 비교적 적은 수의 세포가 있는 챔버에 적합하다. 이러한 설치는 비교적 적은 수의 세포가 함유되어 산화가 제한되지 않게 하는 챔버에 적합하다. 제2도에는 관류챔버를 측부의 배지 저장소, 산소첨가 장치, 센서챔버, 및 샘플/주입구에 연결시키는 루우프가 개략적으로 도시되어 있다.
외부의 새로운 배지 공급원(50)은 펌프(52)에 의해서 라인(56)을 통해 배지 저장소로 펌핑되고, 사용된 배지는 펌프(52)에 의해 저장소(54)로부터 라인(58)을 통해서 추가 처리를 위한 사용된 배지 용기(60)에 회수된다. 제2의 펌프(62)는 배지를 배지 저장소(52)로부터 라인(64)을 통해 중공 섬유 산소첨가 장치(66)를 거쳐서 펌핑한다. 배지는 라인(68)을 통해 생반응기(70)의 제 1 챔버로 보내지게 된다. 적절하게는, 배지성분(82)을 라인(68)내로 도입시켜서 생반응기(70)의 제1챔버내로 이송시키기 위한 배지성분(82)의 주입수단(82)이 제공되어 있다. 성분은 시험성분, 추가인자 등일 수 있다. 생반응기(70)에서 나오는 배지는 중앙챔버(72)를 통해서 생반응기의 제 2 챔버(74)로 유도된다. 제2 챔버로 부터의 배지는 라인(76)에 의해 인-라인 센서(78)로 유도되어 배지 조성에서의 변화에 대해 검출된다.
예를 들어, 글루타민 : 글루코오스 비율은 사용된 세포주에 따라 약 1 : 5내지 8의 범위에 있으며 : 예를 들어, 형질 감염된 3T3 세포에 대해서는 1 : 8이 바람직하다. 또한 암모늄의 농도는 약 2.0mM 미만이 바람직할 것이고, 락테이트의 농도는 약 40mM 미만이 바람직할 것이다. 생반응기로 부터의 유출물을 모니터링함으로써, 생반응기내로 도입되는 배지를 변화시키고나, 산소 분압을 변화시키거나, 기체 흐름속도를 변화시키거나, 다양한 성분들을 증가시키거나, 관류 속도를 완화시키거나 빠르게 할 수 있다.
배지는 펌프(62)에 의해 센서(78)로부터 라인(80)을 통해 저장소(54)로 보내진다.
앞에서 설명한 흐름경로에 의해서, 측부 저장소내의 배지는 별도의 펌프를 사용함으로써, 서서히 교환된다. 이러한 구성은 배지 교환속도(외부펌프)와, 산소 첨가장치 및 관류챔버를 통한 흐름속도를 별도로 조절할 수 있게 한다. 전자의 조절작용은 배지 조성과 관류에 있어서의 장기간 변화를 조절하는데 이용되고, 후자의 조절작용은 챔버내에서의 용존 산소압과 흐름패턴을 조절하는데 이용될 수 있다. 작은 생적합성의 메쉬막을 사용하면 챔버내에서의 플러그(피스톤)흐름이 가능하여, 성장인자, 및 조혈세포와 간질세포에 매우 정밀한 양만큼 도입시키기를 원하는 그밖의 특정 화합물을 정밀하게 조절 전달할 수 있게 한다.
챔버와 루우프 성분들을 오토클레이브시킨 후, 반응기를 무균환경에서 조립한다. 배지는 며칠 동안 측부 루우프와 챔버를 통해 순환될 수 있는데, 그 동안 오염 신호를 모니터링 한다. 무균 어셈블리가 완성되면, 챔버의 중앙구역이 세포외 매트릭스 단독으로 접종되거나, 간질세포를 함유하고 있는 예비 접종된 세포외 매트릭스 지지체로 접종된다. 그 다음에는, 1)간질 세포의 대사능 및/또는 성장인자 반응성이 모니터링되면서, 간질세포가 며칠 동안 챔버에 유지되고, 결과가 충족되는 경우에 골수가 접종되거나; 2) 간질세포가 즉각적으로 골수에 시이딩된다. 이 둘중 어느 한 경우에 있어서, 세포층은 관류챔버의 중앙구역 바닥부에 유지된다. 세포들은 추가의 세포외 매트릭스로 접종되고, 세포층은 분리막에 유착된다. 이때, 챔버를 뒤집어서 세포층을 중앙구역의 천정에 위치하게 한다. 이러한 상태에서, 성숙중인 세포는 간질층에 대한 유착력을 상실함에 따라 중앙챔버의 바닥부로 모이게 된다. 이와 같은 특징은 성숙세포에 의해 야기되는 간질층 및/또는 덜 성숙된 조혈세포에 대한 손상을 방지하는데 중요하다. 이러한 특징은, 또한, 성숙 세포들의 연속적인 제거를 더욱 용이하게 한다.
이러한 세포들은 주사기로 세포를 흡출시키거나, 배출관을 통해 관류된 배지의 압력에 의해서 세포가 챔버로부터 흘러나오게 함으로써 수거될 수 있다.
간질세포들은 대부분 원하는 조혈 성장인자를 제공하는 하나 이상의 유전자로 형질 전환된 섬유아세포이다. 동일하거나 상이한 세포들은 특징의 숙주세포를 선택함에 따라 유전자들로 형질 전환될 수 있고, 다수의 유전자에 대해서 동일하거나 상이한 세포들을 사용할 수 있다.
광범위한 정상 세포들이나 안정한 세포주들을 사용할 수 있다. 그러나, 어떠한 세포주는 형질전환되는 경우 세포의 과성장을 유도할 수 있기 때문에, 모든 세포 계통이 허용되는 것은 아니다. 바람직하게는, 사용되는 세포는 신생세포가 아닌 것이고, 지지체에 대해 유착성이 있는 것이 요구된다. 포유동물 세포는 사람의 세포이어야 할 필요도 없고 영장류의 세포일 필요도 없다. 또한, 사람의 정상적인 골수 유착성 세포, 사람의 정상적인 비장유착성 세포, 및 사람의 정상적이 흉선 상피를 포함하여, 형질전환되지 않은 다양한 세포들이 유착성 세포층에 포함될 수있다.
섬유아세포를 포함하는 포유동물 세포를 형질전환시키는 방법은 공지되어 있으며, 광범위한 문헌이 있는데, 본원에서는 단지 소수의 참고문헌을 상기 기재하였다. 이러한 구성에는 프로모터 및 적절하게는 인핸서를 포함한 천연의 전사개시 조절영역이 사용되거나, 유도가능하거나 구성가능할 수 있는 상이한 전사 개시영역이 관련될 수 있다.
유도가능하거나 구성 가능하며 천연 인핸서와 결합될 수 있는 다수의 전사 개시영역을 이용할 수 있거나, 특정의 세포형에서만 유도되거나 다수 또는 모든 세포형에서 작용할 수 있는 인핸서가 제공될 수 있다. 전사 개시영역은 천연 유전자인 바이러스로부터 유도될 수도 있고 합성될 수도 있으며, 이것들의 조합에 의해 이루어질 수도 있다.
유용할 뿐만 아니라 용도가 밝혀진 프로모터에는 마우스나 사람의 메탈로티오네인-I(methallothionein-I)프로모터, 메탈로티오네인-II 프로모터, 액틴 프로모터 등과 같은 염색체 프로모터, 또는 SV40 초기 유전자 프로터, CMV 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 레트로바이러스의 LTR과 결합된 프로모터 등과 같은 바이러스 프로모터가 있다. 이들 프로모터가 이용될 수 있으며, 전사 개시영역 뿐만 아니라, 목적하는 유전자의 삽입을 위한 폴리링커를 포함하는 적합한 벡터내에 용이하게 삽입될 수있다. 다른 경우에는, 전사개시 영역과 전사 종료영역 사이에 폴리링커를 제공하여, 번역을 위한 메신저의 작용과 결부되어진 다양한 신호, 즉, 캡 좌(cap site)와 폴리아데닐화 신호를 제공하는 발현벡터가 사용될 수 있다.
조절영역과 구조 유전자를 포함하는 발현 카세트의 구성에는 하나 이상의 제한효소, 어댑터, 폴리링커 시험관내 돌연변이 유발, 프라이머 수복(repair),절제술 등이 이용될 수 있다.
발현 카세트는 일반적으로 마아커와 하나 이상의 복제 시스템을 포함하는 벡터의 일부일 것이다. 마아커는 발현 카세트와 마아커가 도입되는 세포를 검출 및/또는 선별할 수 있게 할 것이다. 다양한 마아커들이 사용될 수가 있고, 특히 독소, 구체적으로 항생물질에 대한 내성을 제공하는 마아커들이 사용될 수 있다. 바람직하게는 G418에 대한 내성을 포유동물의 세포숙주에 부여하는 겐타마이신 내성을 이용한다. 복제 시스템은 원핵성 복제 시스템을 포함할 수 있으며, 이러한 원핵성 복제 시스템은 발현 카세트의 개별적 성분들과 함께 운반되는 여러단계 동안에 클로닝을 허용할 것이다. 대부분의 경우에, 복제 시스템은 발현 카세트가 숙주의 염색체내에 통합되도록 선택되겠지만, 에피솜 구성요소를 숙주세포에 유지시키기 위해서 그 밖의 복제 시스템을 사용할 수 있다.
발현 카세트를 숙주에 도입시키는데에는 일반적으로 사용되는 모든 기술이 사용될 수 있는데, 이러한 기술에는 칼슘 침전된 DNA, 형질 감염, 전기영동, 탄도입자(ballistic particles)등을 이용하는 형질전환이 포함된다. 숙주세포가 일단 형질전환되면, 선택적 작용제를 함유하는 적절한 영양배지에서 증폭되어, 마아커를 함유한 세포들을 선별할 수 있게 된다. 그 다음에는 생존 세포들을 증폭시켜서 사용할 수 있다.
사용된 숙주세포들에는 아프리카 녹색원숭이 세포주 CV1, 마우스 세포 NIH-3T3, 사람의 골수 섬유아세포, 사람의 비장 섬유아세포, 마우스의 정상 골수 섬유아세포 및 마우스의 정상 비장 섬유아세포가 있다.어떤 경우에는 벡터와 세포주의 선택에 따라, 세포들이 종양성(neoplastic)으로 될 수도 있다는 점에 주의해야 한다. 생성되는 형질 전환된 세포들이 유착될 수 있어서, 형질 전환된 세포들이 단백질 스폰지(sponges), 단백질 피복막 등과같은 지지체에 대한 결합을 유지할 수 있다는 것은 중요하다.
적절한 성장인자를 발현시키기 위한 벡터가 구성되면, 벡터는 모든 용이한 방법으로 세포를 형질 전환시키는데 사용될 수 있다. 그 다음에는, 수득한 형질 전환된 세포들을 사용하여 앞에 설명된 지지체에 시이딩한다. 이러한 지지체를 반응기내에 넣을 수도 있고, 시이딩할 때에 반응기에 넣을 수도 있다. 세포들을 중분한 시간동안 성장시켜, 세포가 생존할 수 있게 하고 요구되는 성장인자를 생성시킬 수 있게 한다.
그 다음에는 반응기는 적절하게는 조혈세포가 시이딩될 수 있다. 조혈세포에는 다양한 성숙단계에 있는 실질적으로 순수한 간세포, 한 계통 이상의 계통의 성숙한 조혈세포가 실질적으로 유리된 조혈세포들의 혼합물, 모든 또는 거의 모든 계통의 조혈세포를 포함하는 혼합물이 포함될 수 있다.
반응기를 통하여 실질적으로 연속적으로 관류시키고, 관련된 다양한 영양분과 인자를 모니터링하면서 세포를 성장시킨다. 대부분의 경우에, 1차 인자들은 간질세포에 의해 제공되어, 성장인자의 농도가 일정한 상태가 되게 한다. 조절된 상징액이 조혈세포의 성장에 효과적이기 때문에, 반응기에 적절한 농도 수준으로 성장인자를 유지시킬 수 있는 간질세포 대 조혈세포의 비율을 제공할 수 있다.
형질 전환된 간질은 유전자를 사람의 간세포내로 도입시킬 수 있다.
마우스에 있어서는, 마우스를 5-FU로 예비 처리한 다음에, 수거된 골수세포들을 IL-3과 GM-CSF가 함유된 WEHI 조절된 배치내에서 성장시킴으로써, 간세포내로의 레트로바이러스 중제된 유전자 전달이 가능할 수 있다[문헌 : Lemischka Cell (1986) 45 : 917]. 목적하는 레트로바이러스 벡터를 분비하는 레트로바이러스 함유 세포주와 함께 성장시킨 합성 간질을 이용하여, 유전자를 사람의 간세포에 효과적으로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 사람 T-세포는 T-세포에서 조직 특이적 발현을 가능하게 하는 CDC2 조절 서열[문헌 : Greaves, Cell (1989) 56 : 979-986]의 조절하에서 HIV 안티센스 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터로 간세포를 감염시킴으로서 HIV-감염에 대하여 내성을 가지게 될 수 있다. 레트로바이러스의 복제에 필수적인 레트로바이러스 충전 세포주에 의해 인자가 제공되는데; 이러한 인자는 조혈 표직세포에는 존재하지 않을 수 있다. 일단 바이러스가 조혈 표적세포에 전이되면, 바이러스는 복제되지 않는다.
제3a도와 제3b도에는 유입구(102)와 유출구(104)를 구비하고 있는 방사성 흐름챔버(100)와 25챔버(106)를 도시한 도면이고, 여기서, 화살표(108)는 흐름방향을 나타낸다. 조혈세포(110)는 챔버내의 간질층(112)상에 사이딩되어 성장한다. 유속은 어느 세포가 유착될 수 있는지를 결정할 것이며, 유착되지 않는 세포들(114)은 유출구(104)를 통해 배출된다. 제4a도와 제4b도에는 유입구(122)와 유출구(124)가 구비된 성장챔버가 도시되어 있다. 제4b도에 있어서, 유입구(122)는 성장 및 분리를 위해 챔버(126)내에 세포들(110)과 간질(112)을 함유하고 있는 개별적 챔버(126)를 공급하는 매니폴드(128)를 포함한다.
제5a도와 제5b도에는 성장챔버가 도시되어 있는데, 여기에서 격막(134,136,138)은 배양기간 동안에 체계적으로 제거되는데, 격막(134)은 약 8 내지 10주에 제거되고; 격막(136)은 약 18 내지 20주에 제거되며; 격막(138)은 약 28 내지 32주에 제거된다.
지금까지 본 발명을 설명하였으나, 이하에서는 구체적 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 이해할 수 있도록 설명하고자하며, 이러한 설명은 본 발명을 제한하고자 하는 의도가 아니다.
[세포의 분리 및 염색방법에 대한 설명]
피콜(Ficoll)상에서 골수세포의 분리방법 :
1. 실온으로 유지시킨 IMDM(이스코브의 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco Medium); 깁코(Gibco); Cat. No. 430-2200)중에 골수샘플을 1:4 비율로 희석시킨다.
2. 50㎖원심분리관내의 실온의 15㎖ 피콜-파크(Ficoll-Paque)(Sp. Gr. 1.077g/cc; 파마시아(Pharmacia); Cat. No. 17-0840-02)상에 35㎖의 희석된 골수샘플을 주의하면서 층화시킨다.
3. 700×g(베크만(Beckman)상에서 1800rpm)로 실온(20℃)에서 30분간 원심분리한다.
4. 원심분리 후에, 대부분의 상층을 제거하고(중간상위에 약 5㎖를 남기면서), 중간상 층(골수세포)을 수거한 다음, 다음과 같이 빙냉 I-MDM내에서 3회 세척한다 :
제 1세척 : 140 rpm/15분/4℃ 탁
제2세척 : 1200rpm/10분/4℃
제3척 : 1200rpm/10분/4℃
5. 제3회째의 세척후에, 세포들을 배지 또는 균형 염용액등(무엇을 수행하느냐에 따라)에 현탁시키고, 아세트산중의 1:10 세포 희석액을 제조한 후에 세포를 계수한다(10㎕세포 현탄액 =PBS 중의 2% 아세트산 90㎕ : 이러한 현탁액은 WBC만을 계수할 수 있게 하는데, 그 이유는 RBC가 아세트산에 용해되기 때문이다)
6. 이어서, 세포를 적절한 배지중에 요구되는 최종 농도로 현탁시킨다(배지는 다른 특허출원들을 참조하면 된다).
MY-10 양성 골수세포의 형광염색방법 :
시 약
표준 완충액 :
분말화된 박토(Bacto)건조된 DIFCO 완충액
(Baxter; Cat. No. 2314-15GB) : 200g
10% NaN3(아지드화 나트륨) : 20g
열 불활성화된 우태아 혈청(56℃, 30분) : 200㎖
dd-H2O중의 20ℓ부피로 하고; pH 7.15 내지 7.25; 4℃에 보관 1개월간 상태가 양호함.
2%파라포름알데히드 용액
파라포름알데히드 : 10g
dd-H2O : 500㎖
10N NaOH(후드(hood)아래서) : 8-20방울
분말화된 박토 건조된 Difco 완충액 : 5g
500㎖ 플라스크에 dd-H2O를 붓고, 후드내의 열판위에서 60℃가 될 때까지 교반한다.
10g의 파라포름알데히드를 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 NaOH를 적가한다.
5g의 DIFCO를 첨가한다.
냉각시키고, 2N HCI로 pH를 7.35 내지 7.45로 조절한다.
1. 세포를 계수한 후에, 표준 완충액으로 1회 세척한다(100rpm, 5분, 4℃).
2. 이어서, 세포들을 표준 완충액에 2×105세포/㎖의 농도로 현탁시킨다.
3. 2개의 세포 분취액 50㎖를 15㎖의 원심분리용 튜브에 넣는다.
4. 1개의 튜브에 항- HPCA-1의 1:5 희석액 50㎕를 첨가한다(항-사람선구세포 항원; 벡톤 딕킨스(Becton Dickinson); Cat. No. 7660 : 표준 완충액에 1:5로 희석됨). 다른 튜브에는 MIg의 1:5 희석액 50㎲를 첨가하였다(마우스 IgG1 대조군; 벡톤 딕킨슨; Cat. No. 9040; 표준 완충액에 1:5로 희석됨).
5. 이어서, 튜브2개 모두를 얼음위에서 1/2시간 동안 인큐베이션시킨다.
6. 인큐베이션 후에, 5㎖의 표준 완충액내에서 세포를 2회 세척한다(1000rpm, 5분, 4℃).
7. 제2회의 세척후에, 세포 펠릿을 GAM-FITC 1:40 희석액 50㎕에 재현탁시킨다(친화성 분리된 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG 및 IgM, 흡수된 사람 Ig, 콘주게이트된 형광물질; TAGO; Cat. No. 4353; 표준 완충액에 1:40으로 희석됨).
8. 세포들을 얼음위의 어두운 곳에서 1/2시간동안 인큐베이션시킨다.
9. 인큐베이션 후에, 5㎖의 표준 완충액으로 새포들을 2회 세척(100rpm, 5분, 4℃)하고, 각 펠릿을 100㎕ 표준완충액 + 100㎕ 2%파라포름알데히드 용액에 재현탁시킨다.
10. 이어서, 흐름 세포계수기를 이용하여 세포들을 형광 분석한다. 양성 형광성 백분율은 항 -HPCA-1 샘플의 형광 백분율에서 MIg 시료의 형광 백분율을 감하는 것으로 이루어진다.
성숙 선구세포를 분류하기 위한 골수세포 형광염색 방법 :
목적 :
이러한 염색의 목적은 흐름 세포계수기 또는 자성 비드를 사용하여 성숙 세포군을 제거함으로써 조혈 간세포(가장 초기적인 간세포)를 부화시키는 것이다. 분류결과와 비교하고 부화의 정도를 측정하기 위해서, 어떤 세포들을 전체 골수세포로서 보유시켜(Ficoll 분리후), MY-10 양성세포를 염색하는 것은 좋은 생각이다.
1. 상기 설명된 바와 같이 피콜-파크상에서 세포들을 분리한다
(0.5×106세포을 제거하고, 두 분획으로 나누어서 항-HPCA-1/GAM-FITC 및 MIg/GAM-FITC로 염색한다).
2. 제3회 세척후에, 107세포당 1㎖의 단일클론 항체 칵테일(이러한 칵테일의 제조에 관해서 설명하는 부분을 참조)을 사용하여 세포 펠릿을 칵테일에 재현탁시키고, 얼음위에서 세포들을 1시간 동안 인큐베이션시킨다.
3. 이어서, 과량의 빙냉 I-MDM으로 세포들을 3회 세척한다(1000rpm, 5분, 4℃).
4. 제3회 세척후에, GAM-FITC(I-MDM에 희석됨, 표준 완충액이 아님)의 1:40 희석액에 0.25×106세포당 50㎕의 비율로 현탁시키고, 암실중의 얼음상에서 1/2시간동안 인큐베이션시킨다.
5. 인큐베이션 후에, 빙냉 I-MDM내에서 세포를 3회 세척하고, 최종 세척후에, 세포를 2내지 4㎖의 빙냉 I-MDM에 현탁시키고, 분류가 될 때까지 얼음상에 유지시켰다.
6. 이어서, 형광을 기초로 하는 흐름 세포계수기상에서 세포들을 분류하여, 형광 히스토그램의 상부 85%를 제거한다. 부화를 향상시키기 위해 분류작업을 2회 반복한다.
7. 분류후에, 세포를 계수하고 세척하고 분취액을 MY-10 양성 세포용으로 염색하여(상기된 바와 같이), 전체 골수 세포의 염색된 분취액에 비한 부화 정도를 측정한다.
[자성항체를 이용한 미성숙 세포를 선별 방법]
1. 골수세포를 형광 염색하는 방법에 있어서의 단계 1 내지 3을 수행하여 성숙세포를 분류해낸다.
주 : 모든 완충액에서 아지드화 나트륨을 배제시킨다.
2. 한편, 적절한 양의 자성 염소 항-마우스 Ig(바이오맥(Biomag); Collaborative Research; Cat. No. 74340-50; 1㎎/㎖ : 5×108입자/㎖)를 빙냉 I-MDM 중에서 4℃, 1500rpm으로 5분간 3회 세척한다(보존제로 사용된 아지드화 나트륨을 세척 제거하기 위해서).
3. 제 1 단계에서 제3회 세척후에 얻어진 세포 펠릿을 50 입자 바이오맥/세포의 비율로 바이오맥에 재현탁시킨다(예를 들어, 1×106세포에 대해서 5×107입자, 따라서, 0.1㎖의 바이오맥을 사용한다).
4. 세포들을 T-25 또는 T-75 조직배양 플라스크에 넣고(세포수에 따라), 간헐적으로 진탕시키면서 얼음상에서 1/2시간동안 인큐베이션한다.
5. 인큐베이션 후에, 플라스크를 평평한 자석 위에 놓고(바이오맥이 제공), 고무밴드나 테이프로 고정하고, 4℃로 10 내지 15분동안 인큐베이션한다.,
6. 자석과 플라스크를 똑바로 세우고 상징액을 수거한다.
7. 단계 4 내지 6을 2회 이상 반복한다.
8. 세포를 계수하여, 빙냉 I-MDM내에서 1회 세척하고, 분취액을 제거하여 MY-10 양성으로 염색하고, 차후의 사용을 위해 적당한 배지에 재현탁 시킨다.
Ⅰ. 배지의교체
재료 및 방법 :
세포 : 사람 골수세포를 미리 설명을 듣고 승낙한 개체의 장골릉로부터의 헤파린 처리된 흡출물로부터 사람의 골수세포를 얻는다. 골수를 피콜-파크(Pharmacia, No, 17-0840-02)밀도 구배 원심분리법으로 분리하고, 낮은 밀도의 세포들(1.077g/㎝3)을 수거하여 이스코브의 변형된 둘베코 배지(IMDM)로 3회 세척한다. 제2세척과 제3세척 사이에 세포를 계수한다. 이어서, 24-웰 조직배양 플레이트(코스터(Costar) No. 3524)상에 세포들을 322㎕/웰로 2중 또는 3중으로 1,2 및 5×106세포/㎖로 시이딩한다.
장기간의 배양조건 : 습기가 있는 5% CO2/95% 공기중에서 10% 우태아 혈청(Hyclone Laboratories), 10% 말 혈청(Hyclone Laboratories), 1%페니실린/스트렙토마신(Sigma, 10,000U/㎖ 페니실린 G 및 10㎎/㎖ 스트렙 토마이신, Cat. No. P3539), 및 10-5M 히드로코르티손(17-히드록시 코르티코 스테론, Sigma, Cat. No. H0888)이 보충된 IMDM에서 저밀도의 세포들을 인큐베이션시킨다. 매일 100% 배지교환(7/주), 매일 50% 배지교환(3.5/주), 또는 주 2회 50% 배지교환(1/주)의 3가지 배지교환 계획들중의 어느한가지 방법으로 배양액을 처리한다. 배지교환중에, 각 배양 웰로부터 주당 2회로 50%의 비유착성 세포들을 제거하고, 헤모사이토미터를 이용하여 계수한다.
계수를 하기 위해서 세포들을 제거(2회/주)할 때, 3.5/주 및 1/주 배양액의 공급동안 제거된 모든 배지를 세포 계수를 위해 남겨두고 새로운 배지를 웰에 보충한다. 7/주 배양액은 세포계수를 위하여 제거된 배지의 1/2을 남겨두어야 하고, 제거된 배지의 나머지 1/2 원심분리하여 비유착성 세포를 귀환시킨다. 그 다음에는 , 각 웰에 새로운 배지를 첨가하여, 세포계수를 위해 제거된 배지를 대체한다. 계수를 위한 세포를 제거하지 않는 날은, 배지의 100% 또는 50%를 각각 7/주 및 3.5/주 배양 웰로부터 제거하고, 세포를 원심분리하여 추가의 새로운 배지가 첨가된 원래의 웰에 귀환시킨다.
메틸셀룰로오스 및 다형성 분석 : 세포계수를 위해 제거된 비유착성 세포들을 에리트로포이에틴, GM-CSF 및 IL-3의 존재하에 메틸셀룰로오스에 격주로 플레이팅시키고, 과립구 대식세포-콜로니 형성 단위(Granulocyte Macrophase-Colony Forming Units)(CFU-GM)를 계수할 수 있다. 제거된 세포들의 분취액을 세포 원심분리시키고 라이트-기엠사(Wright -Giemsa)로 염색 시키고, 세포의 감별계수를 수행한다.
통계적 분석방법 : 격주의 세포 생성결과를 두 개의 배양액로부터의 평균 + SEM으로 나타낸다. 대응 t-시험(Paired t-test)을 이용하여, 신속하게 교환한 배양액(7/주 및 3.5/주)로부터의 표정된 누적 세포 생성값을 이것에 대응되는 대조 배양액(1/주)과 비교함으로써, 배양액 군들 사이에 현저한 차이가 있을 가능성을 측정한다. 통계적 차이는 5% 수준이다.
결과 :
비유착성 세포생성의 속도론 :
비유착성 세포의 생성을 접종 세포밀도(1-5×106세포/㎖범위 이상)와 배지 교환율의 함수로서 조사하였다. 배지 교환율은 주당 1회의 배지 용적 교환, 즉 통상적인 덱스터(Dexter)형 배양액 비율로부터 주당 7회의 배지용적 교환까지 다양할 수 있다. 격주로 수거한 세포의 수를 배양액당 접종시킨 세포의 수로 나누어서 표정하였다. 각각의 배지 교환속도에서, 표정된 세포 수거곡선은 접종물 밀도에 의해 크게 변하지 않았다. 7/주, 3.5/주 및 1/주의 3가지 배지 관류 속도에서 유지되는 배양액에 대한 세포 생성은 배양액당 접종되는 세포의 수에 대해 표정될 때 유사하다. 접종물 밀도 사이에서 최종 누적 세포 생성을 비교하면, 3가지의 배지 교환 속도 중 어느 것에서도 상당한 차이가 나타나지 않는다(모든 쌍의 샘플에 대한 대응 t-시험에 의해 p20).
대조적으로, 배지 교환 속도는 상기 배양액에서 세포 생성의 속도 및 수명에 큰 영향을 미친다 1/주(대조군), 3.5/주, 및 7/주에서 교환된 배양액의 세포 생성은 모두 처음 몇주동안은 감소한다. 그러나, 배양액 생산성의 차는 배양액에서 3주 후에 분명해진다. 3 내지 10주 사이에, 세포 생성은 7/주 배양액에서 일정하였고, 1/주 배양액에서 더 낮은 수준으로 일정하였지만, 3.5/주 배양액에서는 지수적으로 증가하였다. 10 내지 12주 후에, 세포 생성은 배양 종결시까지 모든 배양액에서 감소한다.
1/주 교환된 배양액에 대한 결과는 다양한 시스템에서 통상적인 사람 덱스터형 배양액에서 공통적으로 관찰되는 것과 동일한 반면에, 3.5 및 7/주의 빠르게 교환된 배양액은 이전의 최적 배양 방법과 비교할 때 증가된 세포 생성율을 보여준다. 배지의 1/2이 매일 교환되는 배양액(3.5/주)은 대조군(1/주) 또는 매일 전체 교환(7/주)이 이루어진 배양액 보다 상당히 더 긴 기간동안 증가된 세포 생성율을 유지한다. 3 내지 9주 사이에, 3.5/주 교환 배양액으로부터 수거되는 비유착성 세포의 수는 매 2.1주마다 배가되어 지수적으로 증가한다.
3.5주 및 1/주 원안하의 세포 생성율은 배양액의 생성율로서 3.5/주 교환속도하의 세포 생성율을 플롯팅함으로써 1/주의 교환속도와 직접 비교될 수 있다. 이러한 비교는 초기 감소 단계동안에는 2가지의 원안하의 세포 생성율이 유사하다는 것을 나타낸다. 그러나 3.5주와 18주 사이에 3.5/주 교환속도하의 세포 생성율은 일관되게 더 높다.
배양액의 증식 효능은 초기 감소후에 세포를 생성시키는 배양액의 능력에 의해 측정될 수 있다. 3주 후의 표정된 누적 세포 생성율은 7/주, 3.5/주의 배지 교환 속도의 경우에 세포 접종 밀도와 무관하다. 유사한 배지 교환속도에서 배양액으로부터의 세포 생성 데이터는 정상적으로 그리고 통계학적으로 유사하며, 그에 따라서 더 큰 통계학적 샘플을 얻기 위해 밀도 평균화하고 조합(바닥판)한다. 3.5주와 20주 사이의 밀도 평균화된 누적 세포 생성율은 7/주 배양액의 경우 0.22; 3.5/주 배양액의 경우 0.40; 1/주 배양액의 경우 0.15이다. 그러므로, 1/주로부터 7/주까지의 배지 교환 속도의 증가는 전형적인 덱스터형 배양액 배지 교환 스케쥴 보다 약60%이상 세포 생성을 증가시킨다. 3.5/주 교환 속도는 1/주 덱스터형 원안에 비해거의 3배의 누적 세포 생산성 증가를 유도한다. 대응 t-시험을 이용한 상기 데이터의 통계학적 분석은 7/주 대 1/주와 3.5/주 대 1/주 둘 모두의 사이에서 5%의 현저한 수준으로 유의차를 입증하고 있다. 3.5/주의 배지 교환 속도는 1/주의 통상적인 텍스터형 원안 이상으로 세포 생성 속도를 개선시킨다.
과립구-대식세포 선구세포 생성 :
과립구-대식세포 선구세포 검정은 이중의 주어진 배지 관류 스케쥴과 접종밀도로 수행된다(표 2). 배지 관류 속도는 생성되는 과립구-대식세포 선구세포의 수에 대해 현저한 효과를 나타낸다. 3.5/주 배지 교환 배양액은 선구세포 생성에 대해 가장 큰 수명을 보여준다. 상기 배양액은 4주와 18주 사이에서 안정한 속도에서 선구세포들을 생성하였다.
선구세포 생성에 대한 최적 조건은 1주당 3.5회 교환되고 5×106세포/㎖로 접종된 배양액이다. 상기 배양액은 20주까지 상당한 수의 선구세포를 생성시킨다. 대응 t-시험을 이용하는 통계학적 분석은 3.5/주의 최적 배지 교환 속도 배양액이 모든 3개의 접종 밀도에서 상응하는 7/주 및 1/주 배양액에서 보다 8주후에 1%수준의 유의차로 상당히 더 많은 과립구-대식세포 선구세포를 생성시킴을 보여준다. 생성되는 선구세포의 수는 간세포 재생을 간접 측정하는 것이므로 중요하다. 선구세포는 여전히 배양액중에 존재하는 원핵세포, 즉 추측상 간세포로부터 분화에 의해서 수주후에 배양액 중에 존재할 수 있다. 따라서 상기 데이터는 더욱 생리학적으로 빠른 배지/혈청 교환 속도 및 더 높은 세포 밀도가 5개월 동안 간세포 재생을 어느 정도 유지시키는 조건을 제공할 수 있음을 제시한다.
비유착성 세포 다형성 : 3.5/주 배양액에 의해 유지된 연장된 조혈이 다른 배양액과 정상적으로 상이한지를 측정하기 위해서, 10주와 19주 사이에 수거된 비유착성 세포를 염색하고 다형성적으로 분류하였다. 1/주와 7/주의 교환 속도에서, 생성되는 세포는 주로 15주까지 대식세포이며(표 3), 이러한 결과는 다른실험에서의 연구에 의한 결과와 유사하다. 반면, 1주당 3.5 배지 용적 속도로 관류되고 5×106세포/㎖로 시이딩된 배양액은 19주까지 과립구 뿐만 아니라 대식세포를 생성한다. 따라서, 상기 배지 교환 속도 및 접종물 밀도가 시험관내에서 과립구 조혈작용을 더욱 효과적으로 재구성하는 것으로 보인다.
[표 2]
배지 관류속도 및 접종 밀도의 함수로소 장시간 골수 배양액으로부터 제거된 비유착성 건구세포의 평균수
각각의 배지 관류속도와 접종밀도의 두 샘플을 풀링하여 하나의 평균 ±SEM으로서의 표로 나타냈다. 8주후의 누적 CFU-GM 생성은 모든 접종 밀도에서 7주/또는 1/주로 관류된 상응하는 배양액보다 1%의 유의수준으로 통계학적으로 많다.
상기 결과는 장기간 인간 덱스터형 배양액 조건이 부분적으로 최적 상태이고, 시험관내 배양액을 생체내 조혈환경에 더욱 우수하게 유사하게 함에 따라. 생체외 골수의 더욱 효과적인 재구성이 달성될 수 있다는 가정을 지지한다.
물리적 상태 : 배지 교환 속도는 배양액의 물리적 상태에서 상당한 영향을 준다. 배양액에서 10주 까지는 7/주 배양액이 간질에서 많은 수의 지방 세포를 갖는 반면 3.5/주 배양액은 야간의 지방세포를 갖고, 1/주 배양액은 전혀 지방세포를 생성하지 않는다. 26주에서 배양 종결시, 7/주 배양액중의 간질은 약 20 내지 30%의 지방세포를 포함하는 반면, 3.5/주 배양액은 여전히 단지 약간의 지방세포를 갖는다. 유착성 콜로니 분포는 또한 상이한 배지 관류 속도로 수행된 배양액들 간에 다양한다. 3.5/주 배양액중의 유착성 콜로니는 7/주 및 1/주 배양액의 유착 콜로니 보다 더 오랫동안 유지된다.
[표3]
데이터는 각각의 배지 관류속도 및 접종 밀도에서 풀링된 두 샘플에 대한 데이터이며, 대식세포, 과립구(성숙한 과립구 및 밴드 , %G), 및 미성숙 과립구(메타골수구 및 덜 성숙한 세포, %미엘로이드 전구세포)의 %로 나타낸다Ⅱ. 조혈 성장 인자를 함유한 배지의 부충과 조합된 배지 교체 재료 및 방법 :
세포 : 더 유니버시티 오브 미시건 휴먼 인베스티게이션 컴미티(the University of Michigan Human Ivestigation Committee)에 의해 승인된 원안하에, 동의한 사람의 장골릉 골수의 헤파린 처리된 흡출물로부터 사람 골수 세포를 얻는다. 골수를 피콜-파크(Pharmacia) 밀도 구배 원심분리에 의해 분리시키고, 저밀도 세포(1.077g/㎝3미만)를 수거하고, IMDM으로 3회 세척한다. 제2세척과 제3세척 사이에서 세포들을 계수한다. 그 다음에 세포들을 6-웰 조직 배양 플레이트(Costar No. 3406) 또는 콜라겐 피복 6-웰 플레이트(rat tail type 1 collagen, Biocoat. Collaborative Research Inc. Cat. No. 40400)상에 1.5㎖/웰으로 5×106세포/㎖로 이중으로 시이딩한다.
배양 배지 : 사용되는 배지는 10%의 우태아 혈청(하이클론 라보라토리즈 (Hyclone Laboratorise)), 10%말 혈청(하이클론 라보라토리즈, 1% 페니실린/스렙토마이신(시그마(Sigma), 10,000U/㎖ 페니실린 G 및 10㎎/㎖ 스토렙토마이신, Cat. No. P3539) 및 10-5M 히드로코르티손(17-히드록시코르 티코스테론, 시그마, Cat. No. H0888)을 함유하고 있는 IMDM(Gibco Laboratories. Cat. No. 430-2200)이다.
조혈성장인자(HGH) : 빠른 배지 교환을 통한 빈번한 배양액 보충으로 인하여, 클론 검정 4에서 콜로니 형성을 촉진하는 것으로 발견된 농도의 약 1/20농도로 배지에 조혈 성장 인자를 첨가한다. 사용되는 농도는 1ng/㎖의 IL-3, 1ng/㎖의 GM-CSF(암겐 바이올로지칼즈(Amgen Biologicals), Cat. No. 13050), O.1U/㎖의 Epo(캐나다 뱅쿠버의 테리 폭스 라보라토리즈 (Terry Fox Labs))이다.
조혈 선구세포 검정 : 배양액으로부터 분리된 비유착성 조혈 세포를 계수하고, 메틸셀룰로우스중에 1×105세포/㎖ 이하로 플레이팅시킨다. GM-CSF 및 Epo를 각각 20ng/㎕ 및 2U/㎖로 메틸셀룰로오스에 첨가한다. 세포를 24-웰 플레이트에 0.25㎖/웰로 플레이팅하고, 37℃에서 14일동안 인큐베이션한다. 그 다음에, 콜로니를 역상 현미경하에서 계수하고 50개의 세포보다 많은 콜로니를 GM-콜로니 형성 단위(CFU-GM), 적혈구 군형성 단위(BFU-E), 또는 과립구 적혈구 거핵세포 대식세포-콜로니 형성 단위(CFU-GEMM)로서 기록한다.
LTBMC 조건 : 배양액을 습윤된 5% CO2/95% 공기중의 37℃에서 인큐베이션하고, 매일 50% 배지 교환율로 관류(배지 교환)시킨다. 배양 1주동안, 배지 교환동안 매일 분리된 모든 세포를 원심분리시키고 원래의 웰로 귀환시킨다. 배양 1주 후에, 전체 비유착성 세포 중 50%를 배지교환중에 격주로 배양액으로부터 제거하며, 단핵화된 세포를 계수하고, 새로운 배지를 웰로 귀환시킨다. 세포를 계수하지 않는 1주당 나머지 5일 동안은 배지중 50%를 각각의 배양 웰로부터 제거하고, 새로운 배지로 교환하며, 분리된 배지는 원심분리하고, 세포 펠릿으로부터 배지를 따라내며, 세포는 원래의 웰로 귀환시킨다.
통계학적 분석 : 배양액의 군들 사이의 상당한 차이의 가능성은 대응 t-시험을 이용하여 조혈 성장인자로 보충된 빠르게 관류된 배양액으로부터의 표정된 누적 세포 생성값을 부합되는 대조 비처리 대조 배양액에 비교함으로서 측정된다. 통계학적 유의성을 5% 수준에서 취하였다. 조직 배양 플라스틱상에서 배양되는 빠르게 관류된 LTBMC과 5%수준의 유형 I래트 테일 코라겐 사이에서의 통계학적 차이는 없다. 따라서, 플라스틱과 콜라겐 매트릭스에 대한 데이터는 상기 및 다른 모든 특징에 대한 표현을 위해 조합하였으며, 조합된 데이터에 대해 통계학적 분석을 수행하였다.
결과 :
신속하게 교환된 성장 인자 보충 LTBMC에서의 세포 생성의 속도 : 장기간 골수 세포 배양액(LTBMC)의 수명 및 생산성이 HGF의 불충분한 생성에 의해 제한받는다는 첫 번째 전제 시험으로서, IL-3 또는 Epo로 보충된 신속하게 교환된 생체외 골수 세포 배양액을 유지시킨다. 상기 배양액에서, 배지중의 50%를 매일 분리하고, IL-3 또는 Epo로 보충되는 동일한 용적의 새로운 배지로 교체한다. 그 다음에 분리된 세포를 원심분리하고, 배지를 따라내어, 세포를 재현탁시키고, 세포를 원래의 배양액으로 귀환시킨다. IL-3 및 Epo는 각각 신속하게 교환된 LTBMC의 세포 생산성을 향상시킨다. 초기에 Epo만을 함유하는 배양액은 실질적인 말단 적혈구 분화로 인하여 놓은 세포 생성 속도를 나타낸다. 그러나, 4주에 적혈구 생성은 중단되고, 세포 생성 속도는 대조군 배양액의 수준까지 감소된다. IL-3 및 Epo는 각각 18주의 175% 및 173%배양에 걸쳐 대조군 이상으로 비유착성 세포 생성의 평균 증가를 유도한다.
성장인자의 조합이 비유착성 세포 생성 속도를 증가시키는데에 더욱 효과적인 것으로 입증되었다. 가장 높은 세포 생성 속도는 IL-3 +GM-CSF+Epo의 조합의 경우 관찰된다. 상기 배양액은 배양액중의 처음 6주 동안 격주로 접종된 세포수의 약 25%를 생성시키고, 2 내지 8주 동안 대조군에 비해 비유착성 세포를 평균 4.8배 증가시킨다. IL-3 +GM-CSF의 조합은 8주에 걸쳐 대조군에 비해 비유착성 세포를 평균 3.5배 증가시킨다. 별도의 실험에서 IL-3 + GM-CSF + Epo의 조합물에 IL-6 또는 G-CSF를 첨가하지 않는 경우, 비유착성 세포 생성 속도는 개선되었지만, 대신에 세포 생성 속도면에서는 IL-3 + GM-CSF의 조합물을 함유하는 배양액과 구분되지 않았다. 모든 경우에, HGF의 첨가에 의해 유도된 세포 생성에 대한 자극 효과는, 배양액 전체를 통해 대조군 세포 생성율이 높다 하더라도 0 내지 8주에서 최대이다.
HGF의 조합물은 신속하게 교환된 LTBMC에서 생성된 비유착성 세포의 절리를 높게 한다. 배양액의 생산성은 시간의 함수로서 비율를 플롯팅함으로써, 접종된 세포의 수 (Co)에 대해서, 시간(i)의 결과에 따라 생성된 누적 세포수는 시간 Ci에따라 수거된 비유착성 세포의 수이다)를 비교함으로써 나타낼 수 있다. 상기 비율이 일관성을 벗어나는 경우, 배양액은 접종된 것 보다 많은 세포를 생성시키고, 배양액은 세포수의 증가를 유도한다.
IL-3 +GM-CSF +Epo의 조합물은 접종된 세포의 수보다 3배 더 많은 누적 세포 생성을 유도한다. 세포 생성 속도는 배양액에서 처음 6주 동안 가장 높으며, 그 기간 동안에는, 배양액은 거의 매 2주마다 접종되는 것만큼 많은 세포를 생성시킨다. 상기 최대 세포 생성 속도는 50%의 골수 세포가 매일 생성되는 것으로 평가된 생체내 골수 세포 생성 속도의 15% 정도이다. IL-3 + GM-CSF의 조합물은 3 내지 7주 배양동안 IL-3 + GM-CSF +Epo의 조합물에 비해서 세포의 수 및 속도를 2배 이상으로 유도한다. HGF로 보충되지 않은 비처리되고 신속하게 교환(매일 50% 배지교환)된 대조 배양액 및 서서히 교환(격주로 50% 배지교환)된 대조 배양액은 18주 후에 접종된 세포수의 약 1 및 0.37배를 각각 생성시킨다. 더욱 중요하게는, 상기 비보충된 배양액으로부터 제거된 모든 세포의 절반 이상이 첫번째 2개의 샘플링으로부터 유도되어, 상기 세포의 대부분이 원래의 접종물로부터 유도되고, 배양액을 HGF로 보충하는 것은 선구세포 및 간세포의 현저한 사이클링을 유도하는데 요구된다는 것을 나타낸다.
비유착성 세포의 형태학적 분석 : 다중 HGF의 첨가는 또한 배양액에서 생성되는 골수 세포의 다양성을 증가시킨다. 대조 배양액은 배양 3주 후에 주로 대식세포인 비유착성 세포를 생성시킨다. 적혈구 세포의 생성은 5주 후에 약간의 적혈구 세포가 검출되면서 빠르게 감소한다. Epo를 함유하는 배양액(Epo 단독IL-3 + Epo 및 IL-3+GM-CSF + Epo)은 적혈구 세포 생성을 일시적으로 증가시키며, 고비율(55-75%)의 비유착성 세포는 3주 동안은 적혈구이다. IL-3 +Epo±GM-CSF가 존재한다면, 배양액은 배양 16주동안 적혈구 세포를 계속 생성시키는데, 약 5내지 15%의 비유착성 세포는 적혈구로서 분류된다. 따라서, IL-3 +Epo의 존재하에, 적혈구 조혈은 전체적으로 활성이다.
IL-3 ± Epo는 5주만에 주로(60-70%) 후발 과립구(LG)인 비유착성 세포군을 유도한다. SG의 비율은 18주에 약 20%에 도달할 때까지 지속적으로 감소한다. 이에 상응하여 대식세포의 생성이 증가한다. GM-CSF가 IL-3±Epo에 첨가될 경우, 고비율의 LG가 18주에 걸쳐 유지된다. 따라서, IL-3 + GM-CSF의 조합물은 배양 18주 동안 활성 과립구 생성을 유도하고, Epo의 첨가는 또한 적혈구 조혈을 유지시킨다. 배양 5.5주에 대조 배양액 및 IL-3 + GM-CSF +Epo 보충된 배양액의 광현미경 사진은 배양액 밀도 및 생성된 세포의 다양성의 급격한 향상을 입증하고 있다.
비유착성 선구 세포 생성 속도론 : 선구세포 생성은 다중 HGF의 첨가에 의해 증가한다. 비처리 대조군에서 과립구 대식세포 콜로니 형성 단위(CFU-GM)의 생성은 18주 이상동안 연장되고 지속되며, 이는 HGF 없이 신속하게 관류된 LTBMC를 사용하여 얻어진 초기 결과와 일치하다. IL-3 + GM-CSF 및 IL-3 + Epo ±GM-CSF 배양액에서 생성된 CFU-GM은 3내지 5주 동안 대조군 보다 거의 10배 더 높다.
인간 LTBMC에서 적혈구 군형성 단위(BFU-E)생성은 낮으며 빠르게 중단되는 것으로 보고되어 있다[참조 : Coutinho er al, Blood (1990) 75(11) : 2118-2129). 신속하게 교환된 비처리 대조군에서는, 17주 배양에 걸쳐 저수준의 BFU-E가 생성되기는 하지만, BFU-E 생성은 신속하게 감소된다. Epo만을 첨가하면 생성되는 BFU-E의 수에 그다지 영향이 없다. IL-3만을 첨가하면 3 내지 5주내에 BFU-E 생성의 완만한 단생(short-lived)자극을 유도한다. 한편으로는, IL-3에 Epo 또는 GM-CSF를 더하면, 배양 3 내지 5주동안 대조군과 비교하여 비유착성 BFU-E 수준이 10내지 20배 상승한다.
Ⅲ. 인간 간세포의 형질전환
재료 및 방법 :
세포 : 더 유니버시티 오브 미시건 휴먼 인베스티게이션 컴미티에 의해 승인된 원안하에 장골릉 골수의 헤파린 처리된 흡출물로부터 사람 골수 세포를 얻는다. 골수 세포를 피콜-파크(파마시아)밀도 구배 원심분리에 의해 분리하고, 저밀도 세포(1.077g/m3미만)를 수거하여 IMDM으로 3회 세척한다. 제2세척과 제3세척 사이에서 세포를 계수한다. CD18 유전자 전달실험을 위해서 CD18 결핍환자 기증자로부터 동의를 얻은 후에 골수 세포를 얻는다.
골수 세포의 계통 네가티브(Lin-)선택
IMDM으로 제 3 세척후에 단클론성 항체(MAb)의 혼합물과 함께 세포를 인큐베이션시킴으로써 성숙한 단핵 세포를 상기 세포 제제로부터 제거한다. 107세포를 1시간 동안 얼음상의 1㎖의 MAb 칵테일중에서 인큐베이션 시키면서, 매 10 내지 15분 마다 서서히 혼합시킨다. 사용되는 MAb 칵테일을 표 4에 나타내었다.
[표4]
계통+골수 단클론성 세포를 분리하는데 사용되는 단클론성 항체의 제조
세포를 과량의 빙냉 IMDM으로 3회 세척하고 4℃에서 원심분리시킨다. 적절한 양의 자성 염소 항-마우스 Ig(Biomag; Collaborative Research Corp, Cat. No. 74340-50, 1㎎/㎖, 5×108입자/㎖)를 빙냉IMDM으로 3회 세척하고 원심분리시킨다. 세포를 50입자/세포로 바이오메그(Biomeg)에 재현탁시키고, T-25 또는 T-75 조직 배양 플라스크에 넣고 30분 동안 얼음위에서 인큐베이션시키면서 간헐적으로 뒤흔든다. 인큐베이션 후에, 플라스크를 평판 자석 위에 놓고, 자석을 플라스크에 고정시키고, 4℃에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션시킨다. 자석 및 플라스크를 직립으로 세우고 상징액을 수거한다. 어둡게[ 하고(shading), 자석을 가하고, 직립으로 세우고 상징액을 수거하면서 인큐베이션을 2회 이상 반복한다. 세포를 계수하고, 6웰 조직 배양 플레이트(Costar No. 3406)상에 시이딩한다.
배양배지 : 사용되는 배지는 10% 우태아 혈청(Hyclone Laboratories), 10% 말 혈청(Hyclone Laboratories), 1% 페니실린/스토렙토마이신(시그마, 10,000U/㎖ 페니실린 G 및 10mg/㎖ 스테렙토마이신, Cat. No. P3539), 및 10-5M 히드로코르티손 (17-히드록시코르티코스테론, 시그마, Cat. No. H0888)을 함유하는 IMDM(Gibco Laboratories, Cat. No. 430-2200)이다.
조혈 성장 인자 : 조혈 성장 인자는 상기 기재된 최적의 것이다. 사용되는 농도는 1ng/㎖또는 0.4U/㎖의 IL-3(매사추세츠 캠브리지 소재의 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사 제품), 1ng/㎖의 GM-CSF(매사추세츠 캠브리지 소재의 제테틱스 인스티튜트사 제품), 50U/㎖의 IL-1a(젠자임 코포레이션(Genzyme Corp.), 0.1U/㎖의 Epo(캐나다 뱅쿠버 소재의 테리 폭스 랩스(Terry Fox Labs)), 10ng/㎖의 MGF(비만 세포 성장 인자; 워싱톤 시애틀 소재의 이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp.)사의 c-Kit 리간드), 및 2.0ng/㎖의 하이브리킨(Hybrikine)(위싱톤 시애틀 소재의 이뮤넥스 코포레이션사의 [PIXY321])이다.
조혈 선구 세포 검정 : 매주 샘플링하는 동안 배양액으로부터 분리된 비유착성 조혈 세포를 계수하고, 1-105세포/㎖이하의 세포로 메틸셀룰로오스에 플레이팅시킨다. MGF, GM-CSF 및 Epo를 각각 50ng/㎖, 20ng/㎖ 및 2U/㎖로 메틸셀룰로오스에 첨가한다. 세포를 0.25㎖/웰로 24-웰 플레이트에 플레이팅시키고, 37℃에서 14일 동안 인큐베이션시킨다. 콜로니를 역상 현미경에 계수하고, 50개의 세포 보다 큰 콜로니를 GM-콜로니 형성 단위 (CFU-GM), 적혈구 군-형성 단위(BFU-E), 또는 과립구 적혈구 거핵세포 대식세포 콜로니 형성 단위(CFU-GEMM)로서 기록한다.
레트로바이러스 생성 세포주 : 2개의 레트로바이러스 생성 세포주를 뉴욕주 뉴욕시에 소재하는 메모리알 슬론 케터링 캔서 센터(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)에 있는 엘리 길보아(Eli Gilboa) 박사의 실험실로부터 얻는다. 세포주는 포유류 네오마이신 유사체 G418에 대한 내성을 제공하는 네오마이신 포스포트랜스페라아제를 생성시키는 NEO 유전자를 함유하는 암포트로픽(amphotropic)바이러스 입자를 생성시킨다. 또한 두 세포주 모두는 요구되는 레트로바이러스 유전자가 결핍되어 있는 레트로바이러스성 입자를 생성시켜서, 레트로바이러스로 감염된 세포가 스스로 감염성 바이러스를 생성하게 한다.
SAX 함유 팩키징 세포주는 변형된 몰로니 머린 백혈병 바이러스(MoMuLV)를 함유하는 3T 3 기재 세포주이다. SAX 프로바이러스는 Xho1 제한 부위에서 NEO 유전자, 즉 SV40 촉진된 아데노신 탈아민효소 유전자를 함유한다. 또한, SAX 프로바이러스는 4 팩키징 영역을 함유하지만, gag(코어 단백질), pol(역전자 효소), 및 env (엔벨로프 단백질)유전자가 결핍 되어 있다. 상기 제 2 레트로바이러스 입자는 이종 DNA의 이중 복사체를 함유하고, 레트로바이러스 입자는 DC-29(이중 복사체-29번째 클론)으로 표현된다. ED-29 프로바이러스는 NEO 유전자의 2개의 복사체를 함유하고, 3T3 세포주에 다른 레트로바이러스 및 이종 DNA를 함유한다.
CD18 실험을 위해서, 사람의 전장 CD 19 cDNA를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 감염된 암포트로픽 팩키징 세포 Psi-Crip를 사용한다[참조 : Wilson et al, Science (1990) 248 : 1413-1416]. 상기 레트로바이러스에서, 사람 CD18에 대한 전장 cDNA를 BA-CD 18로 불리우는 닭의 β-액틴 유전자의 5'-영역에 걸쳐 있는 이종 서열로부터 재조합 유전자를 발현하는 벡터의 BamH1 부위내로 클로닝시킨다. 사람 사이토메갈로바이러스의 초기(IE) 유전자에 대한 5' 서열을 PUC 19내로 서브클로닝시키고, IE 인핸서 서열을 함유하는 일부를 Xho 1상에서(폴리링커로부터) Nco 1(IE 유전자의 -220)단편으로 분리시킨다. 합성 링커를 사용하여 Nco1 부위를 Xho1 부위로 전환시키고, 변형된 단편을 β-액틴 프로모터에 대해 5'에 위치한 BA-CD18의 고유한 XhoI 부위내로 클로닝 시킨다. 상기 새로운 벡터는 CMV-BA-CD18로 명명한다.
레트로바이러스 입자 생성 : SAX레트로바이러스 입자를 -80℃에서 냉동되고 저장된 바이러스 상징 용액으로서 엘리 길로아 박사의 실험실에 있는 클레이 스미스 박사(Dr. Clay Smith)에게서 제공받았다. DC-29 및 CD18 바이러스 팩키징 세포주를 T-25 플라스크에서 거의 밀집되게 성장시키고, 배지를 모두 교환하고, 12내지 15시간 동안 세포를 인큐베이션시킨후, 바이러스 입자를 함유하는 배지를 수거함으로써 CD-29 및 CD18 레트로바이러스 입자를 생성시킨다. 바이러스 함유 상징액을 원심분리시켜서 바이러스 팩키징 세포를 분리하고, 배지를 분리하여, -80℃에서 분취액으로 냉동 시킨다.
SAX 레트로바이러스, DC29 레트로바이러스 또는 CD18 레트로바이러스를 첨가한 상징액을 함유한 LTBMC : 37℃에서 습윤된 5% CO2/95% 공기중에서 배양액을 인큐베이션한다. 배양중 처음 2주 동안, 배지(1㎖)의 2/3를 매일 각각의 배양 웰로부터 분리하고, 배지를 HGF(0.85㎖) 및 바이러스 세포 생성 생징액(0.15㎖)을 함유하는 동일한 양의 새로운 배지로 대체한다. 레트로바이러스 상징액 함유 배지를 사용하기 바로 전에 녹이고, 아주 급하지 않다면, 이것을 냉장고내의 얼음 위에 저장한다. 배양액으로부터 분리된 배지를 원심분리하고, 배지를 경사 분리시키고, 세포를 원래의 웰로 귀환시킨다.
SAX 레트로바이러스 팩키징 세포주와 공동 배양된 LTBMC : SAX 레트로바이러스 팩키징 세포주를 T-25 플라스크(Costar No. 3056)에서 약 10% 밀집도까지 성장시키고, 2000rad의 방사선을 조사한다. 상기 제조된 조혈 세포를 방사선 조사된 바이러스 생성 세포에 첨가하고, 2.5주 동안 매일 50% 배지를 교환하면서 배양시키면서, 모든 세포를 웰로 귀환시킨다. 배양 2.5주만에, 0.5mM EDTA 용액을 플라스크에 첨가하여, 조혈 세포를 분리시키면서, 간질을 남긴다. 분리된 조혈세포를, 웰당 1000개의 새로운 트립신 처리된 골수 섬유아세포를 함유한 6-웰 플레이트중 3개의 웰에 첨가한다.
감염된 LTBMC의 샘플링 : 배양 2주째에 시작하는 경우, 래트로바이러스 첨가가 종료되거나 공동 배양이 중단된 후에, 배양액은 하루에 50% 배지가 교환되며, 교환된 배지중에 존재하는 비유착성 세포는 분석을 위해서 주당 한번 분리된다. 매일 배지를 교환하는 동안 비유착성 세포를 배양액으로부터 분리시키고, 단핵화된 세포를 계수하고, 새로운 배지를 웰로 귀환시킨다. 세포를 계수하지 않는 1주중의 나모지 6일 동안에는, 배지중 50%를 새로운 배지로 교체된 각각의 배양 웰 샌드로부터 분리시키고 분리된 배지를 원심분리시키고, 배지를 세포 펠릿으로부터 경사분리시키고, 세포를 원래의 웰로 귀환시킨다.
레트로바이러스 감염의 분석 : 초기 골수 접종물을 0, 0.4, 0.8, 1.2,1.6 및 2.0mg/㎖ G418로 플레이팅시켜서, 감염 후 골수 세포를 플레이팅시키기 위한 G418의 농도를 결정하는 치사 곡선을 얻는다. 배양액으로부터 분리된 세포를 0.0, 0.8 및 1.6mg/㎖의 G418농도로 G418과 함께 메틸셀룰로오스에 플레이팅시킨다. 2주후에. 메틸셀룰로오스에서 선구 세포 콜로니의 수를 센다. 각각의 콜로니를 메틸셀룰로오스로부터 취하여, 레트로바이러스 DNA에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 검정한다.
통계적 분석 : 배양액의 군들 사이의 유의차의 가능성은, 대응 t-시험을 이용하여 실험 샘플로부터의 누적 세포 생성값을 대조 배양액과 비교함으로써 측정한다. 통계적 유의성이 5%수준에서 얻어진다.
결과 :
SAX 레트로바이러스를 사용한 레트로바이러스 감염
SAX 레트로바이러스 감염된 LTBMC에서의 세포 생성의 속도론 : 레트로바이러스로 감염된 배양액에서의 세포 생성은 동종의 레트로바이러스 감염에 대한 지표가 되고, 따라서 유용한 측정 인자가된다. 표적 세포 게놈으로의 레트로바이러스의 통합은 세포분열 도중에만 일어나는 것으로 생각된다. 이러한 이유로, 배양액의 증가된 생산성은 간세포의 유사분열 가능성을 증가시키고, 그리하여, 레트로바이러스 감염의 가능성을 증가시킨다. 최고의 세포 생생은 배양 4주에 걸쳐 세포수를 증가시키는 IL-3 + GM-CSF 및 IL-3 +GM-CSF + IL-1α로 보충되고 상징액 바이러스가 부가된 배양액에서 유발된다. SAX 바이러스 팩키징 세포와 함께 배양된 LTBMC는 2주 후의 세포생성은 감소하더라도, 2주에는 상징액 부가 배양액 보다 많은 세포를 생성시킨다.
상징액 SAX 바이러스가 부가된 LTBMC에서의 레트로바이러스 감염 분석 : 처음 4주 내지 6주 배양 동안에 IL-3 +GM-CSF 또는 IL-3 + GM-CSF+IL-1α가 보충된 배양액에서 고농도의 G418에 생존하는 선구세포의 비율은 2% 내지 50%로 다양하다. 배양 10주까지(바이러스 부가가 완료된 후 8주), 조혈 콜로니로 클로닝될 수 있는 선구세포수의 43%가 G418에서 생존 하였다. 이러한 결과는 선구세포가 레트로바이러스에 의해서 초기 14일의 감염 기간 동안 배양액에 존재하는 간세포에 전이된 G418 내성 유전자를 함유하는 것으로 인해서 G418 내성을 갖게 되었음을 나타낸다. HGF가 보충되지 않은 신속하게 관류되는 배양액은 8주 내지 11주 사이에 선구 세포가 고농도의 G 418에서 생존하는 비율이 12%였다. 11주의 배양 말기에, IL-3 +GM-CSF가 보충된 배양액의 간질층은 트립신화되고, 간질에 유착되는 선구세포의 17%가 고농도의 G418중에서 생존하였다. 이러한 결과는 상당한 비율의 유착성 선구세포가 또한 SAX 바이러스에 감염되었음을 나타낸다.
방사선에 조사된 SAX 바이러스 팩키징 세포와 함께 배양된 LTBMC에서의 레트로바이러스 감염의 분석 : 방사선에 조사된 SAX 세포와 함께 배양될 때 G418에서 생존한 선구세포의 비율은 0 내지 36% 사이로 다양하였다. HGF가 보충되지 않은 배양액은 4 내지 7주 사이에만 고농도의 G418에서 생존하는 CFU-GM을 생성하였다. 7주후에, 이 배양액에서는 고농도의 G418에서 생존하였던 CFU-GM이 생성되지 않았으며, 이러한 결과는 간세포의 감염이 거의 또는 전혀 일어나지 않았음을 나타낸다. IL-3 + GM-CSF가 보충되고 방사선이 조사된 SAX세포와 2.5주 동안 함께 배양되는 LTBMC는 4, 5 및 8주에 0.8mg/㎖의 G418에서 생존하는 높은 비율의 CFU-GM을 생성하였다. 그러나, 10주째에서는, 이들 배양액에서 G418에 내성이 있는 CFU-GM이 생성되지 않았다. 이러한 결과는 이들 배양액에서 간세포의 감염이 거의 또는 전혀 일어나지 않았거나, 간세포가 분화 또는 치사될 수 있다는 것을 나타낸다.
DC-29 레트로바이러스를 사용하누 레트로바이러스 감염
DC-29 레트로바이러스로 감염된 LTBMC에서의 세포 생성 속도론 : DC-29 레트로바이러스 상징액으로 감염된 배양액에서 생성되는 세포의 수는 HGF에 관계가 있었다. IL-3 + GM-CSF +Epo가 보충된 배양액은 10주의 배양기간에 걸쳐 주당 1.5내지 4×106개의 세포를 생산하였다. IL-3 + GM-CSF +Epo + MGF가 보충된 배양액이 보다 증식성이지만, 하이브리킨(Hybrikine) + Epo가 보충된 배양액이 최고의 세포 생산성을 나타내었다. 흥미롭게도, IL-3 + GM-CSF + Epo가 보충되었지만 DC-29 레트로바이러스 상징액은 부가되지 않은 대조 배양액은 DC-29 레트로바이러스 상징액이 부가된 유사한 배양액 보다 증식이 잘 일어나지 않았다. IL-3 + GM-CSF + Epo, IL-3 +GM-CSF +Epo +MGF 및 하이브리킨 + Epo 배양액(바이러스 부가)에서의 세포 생성은 대조 배양액(IL-3 + GM-CSF + Epo, 바이러스 부가되지 않음)에서의 생성 보다 각각 5%, 1% 및 1%의 유의수준으로 월등히 높았다. 레트로바이러스 상징액이 부가된 배양액에서의 증가된 생성의 일부는 3T3 기재 팩키징 세포주에 의해 생성되는 것으로 알려져 있는 MGF c-키트 리간드(c-Kit ligand)와 같은 성장인자의 존재에 기인한 것일 수 있다.
상징액 DC-29 바이러스가 부가된 LTBMC에서의 레트로바이러스 감염의 분석 : 레트로바이러스 감염의 효율은 1.6mg/㎖의 G418, 즉, 레트로바이러스 감염전에 모든 골수 세포가 죽는 농도에서 생존하는 CFU-GM에 의해 검정되었다. 8주(감염 후 6주)에서 생존하는 CFU-GM의 평균비율은 모든 감염된 배양액에서 높았다(표 5).
[표5]
* 0.0㎎/㎖ G418에서 CFU-GM은 계수되지 않았기 때문에 N/A.
+ 실험말기에 각 배양액에서 트립신 처리된 간질로부터의 1.6㎎/㎖ G418에서 생존하는 CFU-GM %.
생존 %는(비감염된 배양액중의 1.6mg/ml G418에서 CFU-GM의 수-CFU-GM의 평균)을 (0.0mg/ml G418에서 CFU-GM의 수)로 나누고 100을 곱하여 계산하였다.
IL-3 + GM-CSF + Epo의 조합물에 MGF를 부가하면 배양 8주 내지 10주에서 감염효율이 증가하게 되고 배양액중의 하나는 7.7%의 G418 내성 콜로니를 함유하게 된다. 8주에서의 데이터는 하이브리킨 + Epo가 보충된 배양액이 높은 감염효율을 가짐을 나타낸다. 그러나 10주에서의 데이터에서는 감염이 없음을 나타내고 있다. 10주에서, 몇몇의 배양액으로부터 생성된 CFU-GM의 수가 없거나 거의 없을 것으로 예상되는 CFU-GM이 약 10% 감염을 보이고 있다. 또한 1.5mg/㎖ G418은 약간 최적이하의 수준으로 형질 감염된 G418 내성 유전자의 효능을 거의 능가하기에 충분한, 극히 높은 항생 용량이다. 따라서, 이 배양액에서 조혈 간세포로의 유전자 전달 효율은 몇몇 샘플에서 7.7% 이상이었고, 45% 또는 그 이상이 가능할 것이다.
비유착성 선구세포의 생성 속도론 : 본 실험에서 레트로바이러스 감염의 분석은 간세포의 존재, 감염 및 순환을 추정하기 위해 선구세포를 검정하는 것에 관계가 있으므로, 배양시의 선구세포 생성에 대한 HGF의 효과를 측정하는 것이 중요하다. 또한, 이러한 레트로바이러스 실험에서, MGF 및 하이브리킨은 다른 HGF와의 조합에 사용된다. MGF 및 하이브리킨은 신속하게 관류되며 HGF가 보충된 LTBMC에는 사용되지 않았으며, 그로 인해서, 조혈에 미치는 이것들의 효과를 측정할 필요가 있다. 선구세포의 생성은 HGF의 보충에 큰 연관성이 있었다. 배양액으로부터 생성된 CFU-GM의 수를 표 6에 나타낸다.
[표6]
배양액으로부터 샘플을 격주로 채취하여 CFU-GM에 대하여 검정하였으며, 검정되지 않는 값은 두 공지 데이터 사이의 내삽에 의해 추정하였다. 공지 및 내삽된 값을 합하여 배양액으로부터 생성된 CFU-GM 총수의 근사값을 산출하였다.
레트로바이러스 상징액이 부가된 경우에, 부가되지 않는 경우 보다 선구세포의 생성이 2.2배 증가하였다. 레트로바이러스 상징액 및 IL-3 +GM-CSF + Epo+MGF또는 하이브리킨 + Epo가 보충된 배양액에서 생성된 CFU-GM의 수는 감염되지 않는 대조 배양액에서 보다 각각 4.2배 및 3.8배 증가하였다. 접종된 CFU-GM의 수와 비교할 때, 모든 바이러스 보충된 배양액에서, CFU-GM의 생성은 1%의 유의수준에서 통계적으로 더 많았다.
배양액에서 선구세포의 생성 : CFU-GM 구획에 대한 군 균형은 IL-3 + GM-CSF + Epo가 보충된 배양액에 MGF 또는 하이브리킨을 부가하는 것이 CFU-GM 푸울에 특히 좋은 효과를 가짐을 나타낸다. IL-3+ GM-CSF +Epo의 조합물에 MGF를 부가하면 MGF가 보충되지 않은 비슷한 배양액에 비해 CFU-GM의 생성이 1.9배 증가하며, CFU-GM의 분화가 0.5배 증가함을 표7에서 알 수 있다.
[표7]
배양액으로부터 샘플을 격주로 채취하여 CFU-GM을 검정하였으며 검정되지 않은 값은 두 공지 데이터 사이의 선형내삽에 의해 추정하였다. 공지 및 내삽된 값을 합하여 배양액으로부터 생성된 CFU-GM 총수의 근사값을 산출하였다.
하이브리킨 + Epo의 조합물은 CFU-GM의 생성 및 분화에 탁월한 효과를 나타냈다. 하이브리킨 + Epo는 IL-3- GM-CSF+Epo가 보충된 전술한 최적 배양액에 비해 CFU-GM 생성에 있어 1.8배 및 CFU-GM 분화에 있어 3배의 증가를 유도했다. 또한 하이브리킨 + Epo는 IL-3 + GM-CSF + Epo+MGF의 조합보다 과립구 및 대식세포의 수가 거의 두배가 되도록 생성을 유도했다. 이러한 결과는 하이브리킨이 과립구 대식세포 계통의 효과적인 유도물질이라는 것을 나타낸다.
레트로바이러스를 코드화하는 CD18로 감염된 간세포로부터 생성된 호중구의 분석 : CD18 결핍 골수를 상기한 바와 같이 초기 조혈세포에 대해서 부화시켜, 1.0ng/㎖/일의 GM-CSF 및 1.0ng/㎖/일의 IL-3 및 40U/㎖/일의 IL1α로 보충되고 CD18 레트로바이러스 생성 세포주의 상징액으로 보충된 배지를 매일 50%씩 교환하면서 14일간 배양하였다. 15일째부터는, 레트로바이러스 상징액을 부가하지 않으면서 같은 조건에서 세포들을 배양하였다. 비유착성 세포들을 주단위로 배양액으로부터 제거하였고, 표준방법[문헌 : Updyke er al Meth. Enzymol. (1986) 121 : 717-725]에 의해서 비오틴 처리된 항-CD18 단클로성 항체를 사용한 흐름 세포계수법으로 세포표면 CD18의 존재를 분석하였다. CD18 결핍 골수 세포는 이러한 방법에 의해서 세포 표면 CD18 단백질을 발현시키지 않았지만, 레트로바이러스에 감염된 배양액으로부터 발생되는 호중구 및 단구는 세포 표면 CD18을 발현시켰다. 3개의 배양액에서, 세포 표면 CD18의 발현은 6주에 3,5%/5%/2%였고, 11주에 11%/28%/3%였다. 11주에 배양액에 존재하는 호중구 및 단구가 단지 10 내지 14일 일찍 FCU-GM 선구세포로부터 생성되기 때문에, 이러한 데이터는 사람 조혈 간세포가 처음 배양 2주 동안 재조합 레트로바이러스로 성공적으로 안정하게 형질 감염됨을 나타낸다.
이러한 결과를 해석하는데 있어서, 몇몇 그룹이 사람 조혈 선구세포로의 레트로바이러스 중재된 유전자 전달을 입증하고 있지만, 사람 조혈 간세포로의 유전자 전달은 나타나지 않았다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 통상의 서서히 관류된 사람 LTBMC는 검정에 필요한 선구세포가 없기 때문에 감염 측정이 제한되었다.
본 발명에서 레트로바이러스 감염은 포유동물 항생 G418의 존재하에 메틸셀룰로오스중에서 LTBMC로부터 제거된 세포를 성장시킴으로써 초기에 검정하였다. SAX또는 CD-29 레트로바이러스에 감염되고 NEO 생성물을 발현하는 선구세포는 고농도의 G418에서 생존하여 콜로니를 형성시킬수 있지만, 비감염된 세포는 고농도의 G418에서 죽을 것이다. 또한, 바이러스 부가가 종결된 6주 이상 후에, 고농도의 G418에서 생존하는 선구세포의 생성에는 이들 세포들이 보다 초기의 세포(간세포)로부터 분화되는 것을 필요로 하고, 그로 인해서, 간세포가 감염되었음을 나타낸다. 마찬가지로, 11주의 배양 기간동안 생성된 호중구 및 단구의 표면에 발현된 CD18은 초기 조혈 간세포가 초기 배양 2주 동안 감염되는 것을 필요로 하는데, 그 이유는 감염기간동안 존재하는 모든 성숙세포, 전구체 및 클론생성 선구세포가 배양액에서 4 내지 5주에 걸쳐 죽기 때문이다.
본 발명에서 사용된 레트로바이러스 감염에 대한 분석은 NEO 유전자 생성물의 불충분한 발현으로 인해서 레트로바이러스로 감염된 세포의 비율을 과소평가할 수있다. 전달된 유전자 생성물의 낮은 발현은 사람 및 영장류 모델에서 문제가 되는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명에서 감염된 선구세포의 비율은 아마도 대체적인 추정치일 것이다.
고농도의 G 418에서 생존하는 선구세포의 비율은 SAX 레트로바이러스 상징액으로 감염되고 IL-3 + GM-CSF ±IL-1α로 보충된 배양액에서 10 주에 약 40%였다. 이러한 초기 결과는 높은 비율의 간세포가 처음 배양 2주동안 레트로바이러스 상징액으로 보충된 배양액에서 감염되었음을 나타낸다. DC-29 레트로바이러스에 감염된 선구세포의 비율은 바이러스 부가가 끝난후 첫 4주 동안 IL-3 + GM-CSF + Epo + MGF 및 하이브리킨 + Epo 배양액에서 높게 (O내지 21%)나타났다. 이러한 높은 수준의 선구세포 감염은 레트로바이러스에 의한 선구세포 및 원핵세포의 직접적인 감염 때문일 것이다. 고농도의 G418에서 생존하는 선구세포의 비율은 바이러스 부가가 끝난 후 4주간 감소했으나, 2주후에는 다시 0내지 22%로 회복되었다.
DC-29 실험에서 G418 내성 선구세포의 생성은 DC-29 레트로바이러스로 실질적으로 감염된 정확한 선구세포의 비율을 과소평가할 수있다. 감염된 콜로니를 선택하는데 사용된 고농도의 G418(1.6mg/㎖의 G418)은 SAX 감염 실험에서 사용된 농도 보다 2배 높고, NEO 유전자 생성물, 즉, 네모마이신 포스포트랜스페라제가 생존하는 것을 필요로 한다.
흥미롭게도, SAX 또는 DC-29 레트로바이러스 함유 상징액, HGF IL-3 + GM-CSF ±Epo, IL-1 α, 또는 MGF 또는 하이브리킨 + Epo의 조합물이 첨가된 LTBMC에서, G418에서 생존하는 선구세포의 비율은 바이러스 부가가 끝난후 6 내지 8주간 상승하였다. 배양후기로 갈수록 G418에서 생존하는 선구세포의 비율이 증가하는 이유는 공지되지 않았으나, 한가지 가능성은 처음 배양 2주 동안 감염된 간세포가 배양이 진행됨에 따라 보다 활성을 지니게 되는 것이다. 이러한 결과는 G418에서 생존하는 세포의 비율을 효과적으로 증가시킬 것이다. 또 다른가능성은 NEO 유전자의 발현이 초기의 감염배양 기간 동안 직접 형질 감염된 선구세포와는 상이하며 더 우수한 발현 가능 통합부위를 가지는 간세포로부터의 분화에 기인되어, 나중에 생성된 선구세포에서 증가할 수 있다는 것이다. 그러므로, 여러가지 이유에 기인될 가능성이 있기는 하지만., 배양 후기에 높은 수준으로 생존하는 선구세포의 높은 수준은 간세포가 이들 LTBMC에서 감염되었음을 강하게 시사하고 있다.
요약하면, 이러한 데이터는, 본 발명의 배양조건하에서, 조혈 간세포가 배양액에서 증식하여, 레트로바이러스에 전달된 유전물질이 이러한 간세포에 통합되게 하고 있다는 것을 증명한다. 선구세포는 이러한 간세포로부터 연속적으로 그리고 활성적으로 생성되며, 이러한 많은 선구세포는 형질 감염된 유전자를 함유하고 발현하였다. 이들 데이터는 유전적으로 변형된 사람 조혈 간세포가 이러한 배양액에서 존재하고 증식함을 나타태고 있다.
IV. 실험
1. 형질 전환체의 형성
성장인자인 사람 GM-CSF[문헌 : Wong, Science (1984) 228 : 810-815]를 진핵 발현 벡터안에 삽입시켰다. hGM-CSF cDNA(EcoRl에서 Ahalll까지 약 700bp 단편)을 pSP65의 EcoRl에서 Pstl가지의 단편내로 클로닝시켰다[문헌 : Melton, Mucl. Acids Res. (1984) 2 : 7035-7056]. 생성된 플라스미드는 SP65GM-CSF였다. 쥐의 메탈로티오네인 프로모터[문헌 : Glanville, Nature, (1981) 292 : 267-269]를 EcoRl 및 Bg1 ll로 분해시키고, 프로모터를 함유하는 약 26kb의 단편을 pSP65의 EcoRl에서 BamHl까지의 단편에 삽입시켜 P65MT를 형성시켰다. EcoRl으로 pSP65GM-CSF를 분해시키고, DNA 중합효소 l의 클레노우(Klenow) 단편으로 돌출부를 충전시킨 다음, 생성된 선형 DNA를 Hind lll로 분해시켜 GM-CSF의 코딩영역을 포함하는 700bp의 단편을 분리함으로써, 플라스미드 pMT GM-CSF를 구성시켰다. 이러한 단편을 p65MT의 Sa1l 채워진/Hind lll 부위로 서브 클로닝시켰다. 메탈로티오네인 프로모터와 GM-CSF 코딩 영역을 포함하는 2.7kb의 단편을 분리하고, SV-40프로모터가 분리되는 pSV2neo[문헌 : Southern and Berg, J. mol. Appl. Genet(1982) 1 : 327]내로 위치시켰다. 이러한 결과는 GM-CSF 코딩 서열의 하류 SV-40 폴리 A 신호를 생성시킨다.
항생 젠타마이신(G418)에 내성을 부여하는 네오마이신 내성 유전자를 약 3kb의 Pvull에서 EcoRl까지의 단편을 분리하고 EcoRl 링커를 Pvull 부위로 위치시킴으로써 pSV2neo로부터 취했다. EcoRl 말단을 가지는 새로운 내성 유전자를 GM-CSF 발현 플라스미드의 E채끼 부위로 서브클로닝시켜 플라스미드 MTGM-CSFneo를 생성시켰다.
플라스미드 MTGM-CSFneo를 단독으로, 및 공동 혐질 감염으로서 SV40프로모터 및 폴리 A부위의 조절하에 긴팔원숭이의 IL-3 유전자를 코드화하는 플라스미드[문헌 : Yang, Cell(1986) 47 : 3-10]와 함께, 아프리키 녹색 원숭이 세포주 CV1 및 마우스 세포주 NIH 3T3 세포내로 선형 DNA를 전기 영동시킴으로써 형질감염시켰다. 형질 전환체를 500mg/㎖의 G418을 함유하는 배지에서 선별하여 선택하고, 분리하여, AML-193 세포[문헌 : Adams et al, Leukemia (1989) 3 : 314]를 사용한 상징액의 생검정에 의해 GM-CSF 또는 IL-3 생성물을 스크리닝하였다. 몇몇 양성 세포주는 덱스터형 배양에서의 사람 골수세포를 위한 간질로서 사용되었다.
또한, 정상 마우스 골수세포는 오카야마(Okayama)의 칼슘/인산염 방법[문헌 : Chen, Mol. Cell. Biol. (1987) 7 : 2745-2752]을 이용함으로써 상기 플라스미드로 감염되어, 도입된 유전자를 효율적으로 발현시키는 것으로 밝혀졌다.
형질 감염된 섬유아세포에 의한 GM-CSF 및 IL-3 분비를 관찰하였다. 혈청이 없는 72시간 배양 상징액을 NIH-3T3 세포로부터 얻어, 토끼 항-GM-CSF 또는 항-IL-3 항체를 중화시킴으로써 억제 가능한 표적세포상에서3H흡수를 분석하여 hGF 분비를 검정하였다. 20mg/㎖ GM-CSF 에 의해 유도된 증식은 100단위 GM-CSF로 정하고, 10ng/㎖ IL-3에 의해 유도된 증식은 100 단위 IL-3으로 정하였다. 공동 형질감염된 세포는 약 35단위/㎖의 GM-CSF 및 약 57단위/㎖ IL-3을 생성하였다.
ll. 관류챔버
관류챔버는 변형되지 않으면서 오토클레이브를 가능하게 하는 델린캡(Delrin cap)이 있는 유리 실린더이다. 캡은 유리 실린더에 맞는 실린더형 그로브를 가진다. 그로브의 바닥에는 챔버의 관강을 밀봉하기 위해 O-링을 설치하였다. 캡은 몇 개의 구멍에 있는데, 그 내부로 류어(Leur Lok)기구가 제공되고, 류어 기구내로는 배지 및 가스 수송관이 놓여 있을 뿐만 아니라 챔버의 중앙 부분내로 연장된 튜브가 놓여 있어서, 유착성 및 / 또는 비유착성 세포를 샘플로 채취하게 한다. 캡은 유리 실린더의 외부에 위치하여 120℃씩 떨어진 세개의 긴 볼트로 고정되는데;: 나비 너트와 와셔가 어셈블리를 조이는데 사용된다.
챔버는 측부 저장소로 연결되어 있다. 루프는 측부 저장소에 추가하여 온-라인 센서, 산소 공급기 및 샘플의 챔버와, 펌프, 및 주입구를 포함한다. 축부 저장소중의 배지는 분리펌프에 의해 서서히 교환된다. 이러한 구성으로 산소 공급기 및 관류챔버를 통과하는 배지 교환속도 및 유속을 별도로 조절할 수 있게 된다. 전자는 배지 조성물과 관류의 장기적인 변화를 조절하고, 후자는 챔버의 용존 산소량과 흐름방식을 조절한다. 작은 메쉬의 폴리술포네이트 막은 챔버에서 플러그 흐름을 가능하게 하고, 아주 정밀한 양으로 생반응기에 도입하고자 하는 성장인자 및 그밖의 특정 화합물의 정밀한 조절을 가능하게 한다.
형질 감염된 간질세포는 분쇄된 콜라겐 스폰지층에 시이딩되거나, 콜라겐으로 피복된 5μ의 세공크기의 폴리카보네이트 필터의 한면상에 놓이고 여러 시간동안 필터에 부착될 수 있다. 세포는 세포질이 세공을 통과하면서 한면상에 밀집될 때까지 적절한 영양 배지에서 성장한다. 이어서 골수 세포를 막의 다른면상에 시이딩되고, 간세포는 세공을 통과하는 세포질 돌출부에 부착된다.
챔버와 루우프 구성요소를 오토클레이브한 후에, 반응기를 무균환경에 조립한다. 배지는 오염신호를 모니터링하면서 수일 동안 측면 루우프와 챔버를 통해 순환된다. 생반응기의 중앙 부분은 세포외 매트릭스 단독 또는 간질세포를 함유하는 예비 접종된 세포외 매트릭스 지지체로 접종된다. 간질세포는 대사능 및/또는 성장인자 감응을 모니터링하면서 수일 동안 챔버에서 유지될 수 있으며, 결과가 성공적이면, 골수를 접종하거나, 골수로 즉시 시이딩한다. 어떠한 경우든 세포층을 관류챔버의 중앙부 바닥에 방치한다.
세포를 추가의 세포외 매트릭스에 올려놓고, 세포층을 지지체에 유착시킨다. 막이 사용되는 경우, 챔버를 뒤집고, 세포층을 중앙부분의 천장에 위치시킨다. 이러한 구조에서, 성숙중의 세포는 간질층에 대한 유착력이 느슨해짐에 따라 중앙 챔버의 바닥에 정착하게 된다. 비유착성 세포는 배지관류압에 의해 유출관으로 일정한 세포흐름으로 수거된다.
전형적인 실험에서, 분쇄된 콜라겐 스폰지 지지체상에 1일에 NIH-3T3세포로 챔버를 접종시켰다. 처음 40일간 관류속도 및 다른 조작변수들을 조절하였다. 40일째에 정상상태가 됐으며 이러한 상태는 약 20일간 유지되었다. 64일째 챔버를 33×106사람골수세포로 시이딩하였다. 처음 10일동안 수거되는 세포수는 3일마다 약 7 내지 8×105개의 세포를 생성하는 정상상태가 될 때까지 감소하였다. 흐름 세포계수 분석은 일정한 분획, 즉 약 20%의 수거된 세포가 HLA-DR 양성임을 나타냈다. 90일째 펌프가 작동되지 않았고, pH가 밤새 6.9로 떨어졌다. 관류속도가 회복되었을 때 비유착성 세포의 생성이 회복되었고, 박테리아 오염이 일어났을 때 이전의 정상상태 생성속도에 근접하였다. 이 시점에서 연구를 끝마쳤다.
상기의 결과는 관류챔버가 생체외 조혈작용을 수행할 수 있고, pH가 떨어진 후 생체외 조혈작용은 다시 회복될 수 있다는 것을 입증하고 있고, 글루코오스 농도 데이터는 조혈세포가 주로 글루코오스상에서 호기성으로 성장하는데, 그 이유는 접종후 락테이트 농도가 증가하지 않으면서 글루코오스 농도가 저하되어, 산화가 제한됨을 나타내기 때문이다. 글루코오스/락테이트(혐기성)대사는 주로 NIH-3T3 간질층에 기인되는 듯하다. 유사하게, 글루타민과 암모니아의 농도는 조혈세포수가 감소되면 예비 접종 수준에 이르러서, 골수세포에 의한 글루타민 소모가 간질층에 의한 소모 보다 아주 적다는 것을 나타낸다.
lll.대사 생성물의 모니터링
형질 감염된 NIH-3T3 세포에 대한 글루타민과 암모니아 그리고 글루코오스와 락테이트의 소모 및 생성속도를 측정하였다(배지는 IMDM +20% FCS였다).글루코오스 소비의 증가는 영양물질이 매일 공급된 T-플라스크에서만 관찰된 반면에, 배양액이 보다 덜 자주 공급되는 모든 플라스크는 동일하게 서서히 감소하는 글루코오스 소비 패턴을 나타냈다. 매일 50%씩 교환된 배양액은 18일째 매일 100%교환 스케줄로 전환시켰고, 그 결과 1일부터 매일 100%씩 교환된 배양액에서 관찰된 소모와 동일한 경향으로 즉각적인 글루코오스 소비의 증가가 유발되었다. 글루코오스상에서의 락테이트 수율이 일정(0.9 락테이트/글루코오스 : 매우 혐기성 간질대사를 나타냄)하므로, 락테이트 생성속도도 비슷한 패턴을 따르게 된다.
글루타민과 암모니아의 농도는 글루코오스/락테이트 대사와 유사한 패턴을 보여준다. 37℃에서 글루타민의 화학적 분해에 대하여 수정된 값을 이용함으로써, 글루타민 소비속도 : 글루코오스 소비속도는 상대적인 소비율이 일정(약 1:8의 글루타민 :글루코오스)함이 밝혀졌다. 예상되는 최적비율은 산소 소비속도에 따라 변화하는데, 비율은 산소 소비속도가 증가함에 따라 감소한다.
유사한 결과를 정상적인 골수 간질 섬유아세포로부터 유도된 글루코오스/락데이트 대사 데이터로부터도 얻을 수 있다. 배지 교환을 자주하지 않는 조건하에서, 배양액은 주로 혐기성이고 높은 안정한 상태의 락데이트 수준이 신속하게 달성되고 유지된다. 보다 자주 배지를 교환하면, 세포대사는 보다 빨라지고, 글루코오스 소비와 락테이트 생성이 증가하게 된다. 데이터를 자발적인 화학적 분해에 대해 보정한 후에는 검출할 수 있는 글루타민의 소비가 감지되지 않았다. 3T3 세포 및 정상적인 사람 골수 세포 양쪽 모두에서, 혈청/배지 교환속도가 상기의 임계 교환 스케쥴대로 하였을 때 보다 높은 경우에 세포는 계속 분할되고 증식된다.
혈청의 관류속도 대 영양물질의 관류속도의 상대적인 중요도를 확인 하기 위해 하기의 실험을 수행하였다. : 1) 20%혈청 함유 배지를 함유한 한세트의 T-플라스크를 매일 교환; 2)두 세트의 T-플라스크, 즉, 20%의 혈청과 배지를 함유하는 한 세트는 격일로 교환하고, 10%혈청과 배지를 함유하는 한 세트는 매일 교환; 3)두 세트의 T-플라스크, 즉, 10%의 혈청과 배지를 함유하는 한 세트는 격일로 교환하고, 5%의 혈청과 배지를 함유하는 한세트는 매일 교환; 4)두 세트의 T-플라스크, 즉 5%의 혈청과 배지를 함유하는 한 세트는 격일로 교환하고, 2.5%의 혈청을 함유하고 배지를 함유하는 한 세트는 매일 교환하였다. 각 그룹에서의 혈청 교환속도는 동일하지만, 영양물함유 배지의 교환속도는 다양하다. 각 실험에서의 결과는 중요한 것 이 혈청의 교환속도이라는 것을 나타낸다. 실험1)에서는 글루코오스 소비가 증가했으며 4일째까지 9.5mmol/일의 속도로 실질적으로 평형을 유지하였으나, 다른 모든 경우에는, 글루코오스 소비가 그룹 1의 처음 글루코오스 소비 보다 작은 양에서부터 개시되었고, 두배의 혈청을 격주로 사용하고 교환하거나, 절반의 혈청을 사용하고 배지를 매일 교환하거나에 무관하게 실질적으로 선형으로 감소하였다. 이러한 결과는 간질세포의 대사 성장 작용에 영향을 주는 혈청 또는 하나 이상의 혈청성분의 임계 관류속도에 대한 필요성을 말해준다.
상기의 결과로부터 생반응기에서 효율적인 방법으로 조혈세포를 성장시킬 수 있음이 명백해졌다. 간질세포는 동종 또는 이종의 공급원으로부터 제공될 수 있는데, 이러한 간질세포는 유전자로 형질 감염되어 중요한 성장인자를 제공한다. 이러한 방법에서는, 혈청이 배지에 첨가되어 세포를 성장을 보조할 필요가 없다. 간질세포로부터 조혈세포가 분리되게 하는 방법으로 지지체에 유착되는 간질세포를 제공함으로써, 조혈세포를 계속하여 수득하여 사용할 수 있다. 적절한 인자의 조합을 선택함으로써, 특정 계통의 조혈세포를 성장시킬 수 있다. 또한, 필요하다면, 유전자를 조혈세포로 도입하기 위해서 형질감염 바이러스의 저장소에 간질세포가 제공될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물들과 특허출원들은 각각의 간행물 또는 특허출원이 참조로 인용되는 것으로 명확하게 그리고 개별적으로 지적되고 있는 바와 같이 본 명세서에서 참조로 인용되는 것이다.
본 발명에 대한 다수의 변형과 변경이 상기의 교시에 따라 이루어질수 있다는 것은 명백한 사실이다. 그러므로, 이러한 변형 및 변경은 이하에 첨부된 청구범위의 영역내에 있는 것이며, 본 발명은 본원에 특정적으로 기재된 바와는 다르게 실시될 수도 있다.

Claims (16)

  1. 생체외 사람 간세포 분할이 얻어지기에 충분한 속도로 교체되는 액체 배양 배지 중에서 사람 간세포 조성물을 배양하면서,상기 배양물을 생리학적으로 허용될수 있는 조건하에서 유전시키는 단계를 포함하여 생체외에서 사람 간세포를 분활시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 사람 조혈 시스템 중에서 발견되는 사람 간세포를 배양시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 사람 골수 중에서 발견되는 사람 간세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 배양액중의 세포밀도에 관련하여, 배양액 1㎖당 1×104내지 1×107개 세포의 세포밀도에 대해 매일 50 내지 100%의 교체속도에 상응하는 속도로 교체되는 액체 배양 배지 중에서 사람 간세포 조성물을 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 사람 조혈 시스템 중에서 발견된 사람 간세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 사람골수 중에서 발견된 사람 간세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 사람 간세포 조성물을 매일 50%이상의 교체속도로 교체되는 액체 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 배지로서 IL-3, GM-CSF, 강 인자, Epo, IL-α, IL-1β, G-CSF, 기본 섬유아세포 성장인자, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, PDGF 또는 EFG를 함유하는 배지가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 사람 조혈 간세포 조성물을 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 사람 조혈 간세포 조성물을 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 사람 간세포 조성물을 매 3.5일 마다 50%이상 교체되는 액체 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제4항에 있어서, 사람 조혈 간세포 조성물을 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 사람 조혈 시스템에서 발견되는 사람 간세포를 배양함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 사람골수 중에서 발견된 사람 간세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 사람 조혈 세포의 증식, 분화, 또는 이들 둘 모두를 유도하는 하나 이상의 성장인자를 분비할 수있으며 매트릭스에 유착하는 형질 전환된 간질 세포의 존재하에, 관류되는 액체 배양 배지 중에서 사람 조혈 간세포를 함유한 사람 조혈 세포를 배양하는 단계를 포함하며; 상기 배양물을 생리학적으로 허용될 수 있는 조건하에서 유지시키면서, 상기 세포가 매 24 내지 48시간마다 액체 배양 배지 교체에 의해 관류 됨으로써, 사람 조혈 간세포가 생체외 분활되게 하여, 사람 조혈 간세포를 생체외 분활시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 사람 조혈 세포가 골수세포이고, 상기 액체 배양 배지를 사용한 관류 및 간질세포가 사람 골수세포의 분할을 보조함으로써, 사람 골수 간세포가 상기 용기 중에서 생성되게 하고, 상기 사람 골수 간세포를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (197)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2060942T3 (es) * 1989-02-02 1994-12-01 Joel S Greenberger Terapia genetica utilizando celulas estromicas.
US5605822A (en) * 1989-06-15 1997-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5635386A (en) 1989-06-15 1997-06-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture
US5635387A (en) * 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
JPH05509096A (ja) * 1990-06-08 1993-12-16 ニューヨークユニバーシティ 骨髄間質細胞及び始原細胞の刺激
US5612211A (en) * 1990-06-08 1997-03-18 New York University Stimulation, production and culturing of hematopoietic progenitor cells by fibroblast growth factors
US20030125519A1 (en) 1990-08-27 2003-07-03 Peter Besmer Ligand for the c-kit receptor and methods of use thereof
US5744361A (en) * 1991-04-09 1998-04-28 Indiana University Expansion of human hematopoietic progenitor cells in a liquid medium
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
NL9101680A (nl) * 1991-10-04 1993-05-03 Tno Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
JPH07504570A (ja) * 1992-03-04 1995-05-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン ヒトの幹細胞および／または造血細胞を維持，生育するための方法，組成物および装置
AU658065B2 (en) * 1992-03-23 1995-03-30 Nexell Therapeutics Inc. (In vitro)-derived human neutrophil precursor cells
PT639979E (pt) * 1992-04-23 2002-03-28 Sloan Kettering Inst Cancer Ligando para o receptor c-kit e metodos para a sua utilizacao
US6001803A (en) * 1992-04-23 1999-12-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Composition of c-kit ligand, GM-CSF, and TNF-α and method of use
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5554512A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
NZ314644A (en) 1993-05-24 2000-11-24 Immunex Corp Use of flt3-ligands as a growth stimulator of stem cells in the transplantation of tissue
US6037174A (en) * 1993-08-23 2000-03-14 Nexell Therapeutics, Inc. Preparation of serum-free suspensions of human hematopoietic cells or precursor cells
US5846529A (en) * 1993-08-23 1998-12-08 Nexell Therapeutics, Inc. Infusion of neutrophil precursors for treatment of neutropenia
FR2709309B1 (fr) * 1993-08-25 1995-11-10 Centre Nat Rech Scient Compositions cellulaires, préparation et utilisations thérapeutiques.
US5534423A (en) * 1993-10-08 1996-07-09 Regents Of The University Of Michigan Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors
US5599705A (en) * 1993-11-16 1997-02-04 Cameron; Robert B. In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells
US6190655B1 (en) 1993-12-03 2001-02-20 Immunex Corporation Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
US5882918A (en) * 1995-08-08 1999-03-16 Genespan Corporation Cell culture incubator
WO1995021911A1 (en) * 1994-02-09 1995-08-17 Unisyn Technologies, Inc. High performance cell culture bioreactor and method
US5622857A (en) * 1995-08-08 1997-04-22 Genespan Corporation High performance cell culture bioreactor and method
US7294331B2 (en) * 1994-03-07 2007-11-13 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in hematopoietic cell transplantation
US6242417B1 (en) 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
US5631219A (en) * 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
CA2162465A1 (en) * 1994-03-11 1995-09-14 Craig Sandstrom Flow-through bioreactor with grooves for cell retention
US5512480A (en) * 1994-03-11 1996-04-30 Baxter International Inc. Flow-through bioreactor with grooves for cell retention
US7083979B1 (en) * 1994-03-25 2006-08-01 Indiana University Foundation Methods for enhanced retroviral-mediated gene transfer
DE4422667A1 (de) * 1994-06-30 1996-01-04 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung und Züchtung hämatopoetischer Vorläuferzellen
US5811274A (en) * 1994-12-09 1998-09-22 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and apparatus for cell transfection
EP0796110A2 (en) * 1994-12-09 1997-09-24 Joseph D. Mosca System for the maintenance, growth and differentiation of human and non-human primate pluripotent stem, progenitor and mature bone marrow cells
FR2728584A1 (fr) 1994-12-22 1996-06-28 Centre Nat Rech Scient Procede de transfert de gene dans des cellules activees a partir d'un etat de repos
US6974571B2 (en) * 1995-03-28 2005-12-13 Thomas Jefferson University Isolated stromal cells and methods of using the same
US5719058A (en) * 1995-04-10 1998-02-17 Merck & Co., Inc. Method for producing a highly enriched population of osteoclast cells
US6121042A (en) * 1995-04-27 2000-09-19 Advanced Tissue Sciences, Inc. Apparatus and method for simulating in vivo conditions while seeding and culturing three-dimensional tissue constructs
US5792603A (en) * 1995-04-27 1998-08-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Apparatus and method for sterilizing, seeding, culturing, storing, shipping and testing tissue, synthetic or native, vascular grafts
US5846828A (en) * 1995-06-07 1998-12-08 Advanced Tissue Sciences Apparatus and method for sterilizing, seeding, culturing, storing, shipping, and testing tissue, synthetic, or mechanical heart valves orvalve segments
US5876956A (en) * 1995-05-15 1999-03-02 Johns Hopkins University School Of Medicine Methods for identification or purification of cells containing an enzymatic intracellular marker
US5925567A (en) * 1995-05-19 1999-07-20 T. Breeders, Inc. Selective expansion of target cell populations
US5674750A (en) * 1995-05-19 1997-10-07 T. Breeders Continuous selective clonogenic expansion of relatively undifferentiated cells
AU5931896A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Apparatus and method for sterilizing, seeding, culturing, st oring, shipping, and testing replacement cartilage tissue co nstructs
US5843766A (en) * 1995-06-07 1998-12-01 Advanced Tissue Sciences, Inc. Apparatus for the growth and packaging of three dimensional tissue cultures
US5688687A (en) * 1995-06-07 1997-11-18 Aastrom Biosciences, Inc. Bioreactor for mammalian cell growth and maintenance
US5728581A (en) * 1995-06-07 1998-03-17 Systemix, Inc. Method of expanding hematopoietic stem cells, reagents and bioreactors for use therein
GB9518606D0 (en) 1995-09-12 1995-11-15 Inst Of Psychiatry Neural transplantation
US7361330B2 (en) * 1995-10-04 2008-04-22 Immunex Corporation Methods of using flt3-ligand in the treatment of fibrosarcoma
US7150992B1 (en) 1995-10-04 2006-12-19 Innunex Corporation Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen
US20020034517A1 (en) * 1995-10-04 2002-03-21 Kenneth Brasel Dendritic cell stimulatory factor
US6060052A (en) 1995-10-30 2000-05-09 Systemix, Inc. Methods for use of Mpl ligands with primitive human hematopoietic stem cells
US6991787B1 (en) 1995-12-29 2006-01-31 Alg Company Methods of preparing bone marrow stromal cells for use in gene therapy
WO1997024434A1 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Alg Company Expansion of bone marrow stromal cells
US5763267A (en) * 1996-04-16 1998-06-09 Advanced Tissue Sciences Apparatus for the large scale growth and packaging of cell suspensions and three-dimensional tissue cultures
US6165785A (en) * 1996-05-24 2000-12-26 University Of Cincinnati Bone marrow cultures for developing suppressor and stimulator cells for research and therapeutic applications
DE69733694T2 (de) * 1996-07-10 2006-07-06 Muramatsu, Takashi, Nagoya Verwendung von proteinen aus der mk familie als hämatopoietischer faktor
US6458585B1 (en) 1996-08-14 2002-10-01 Nexell Therapeutics Inc. Cytokine-free culture of dendritic cells
NZ334709A (en) 1996-10-01 2001-06-29 Univ Technology Corp Detection of hTRT activity or expression and use in the treatment of cancer
US6090622A (en) * 1997-03-31 2000-07-18 The Johns Hopkins School Of Medicine Human embryonic pluripotent germ cells
US6331406B1 (en) * 1997-03-31 2001-12-18 The John Hopkins University School Of Medicine Human enbryonic germ cell and methods of use
CA2288690A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-19 Osiris Therapeutics, Inc. Osteoarthritis cartilage regeneration using human mesenchymal stem cells
US20020034819A1 (en) * 1998-02-23 2002-03-21 Alan K. Smith Human lineage committed cell composition with enhanced proliferative potential, biological effector function, or both; methods for obtaining same; and their uses
US6835377B2 (en) 1998-05-13 2004-12-28 Osiris Therapeutics, Inc. Osteoarthritis cartilage regeneration
CA2330190C (en) * 1998-06-08 2009-12-22 Osiris Therapeutics, Inc. Regulation of hematopoietic stem cell differentiation by the use of human mesenchymal stem cells
AUPP421298A0 (en) * 1998-06-19 1998-07-09 Fertilitescentrum Ab Method and medium for in vitro culture of human embryos
EP1270719A3 (en) * 1998-08-24 2003-06-25 Viacell, Inc. Cell population containing non-fetal hemangioblasts and method for producing same
GB9904281D0 (en) * 1999-02-24 1999-04-21 Reneuron Ltd Transplantation
US20040241842A1 (en) * 1999-04-15 2004-12-02 Monash University Stimulation of thymus for vaccination development
US20040265285A1 (en) * 1999-04-15 2004-12-30 Monash University Normalization of defective T cell responsiveness through manipulation of thymic regeneration
US20040258672A1 (en) * 1999-04-15 2004-12-23 Monash University Graft acceptance through manipulation of thymic regeneration
US20070274946A1 (en) * 1999-04-15 2007-11-29 Norwood Immunoloty, Ltd. Tolerance to Graft Prior to Thymic Reactivation
US20050020524A1 (en) * 1999-04-15 2005-01-27 Monash University Hematopoietic stem cell gene therapy
AUPR074500A0 (en) * 2000-10-13 2000-11-09 Monash University Treatment of t cell disorders
US20040259803A1 (en) * 1999-04-15 2004-12-23 Monash University Disease prevention by reactivation of the thymus
CA2385628A1 (en) * 1999-09-27 2001-04-05 Ammon B. Peck Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
WO2001039762A2 (en) * 1999-12-06 2001-06-07 Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner Use of taurolidine or taurultam for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors of the central nervous system
US6682902B2 (en) 1999-12-16 2004-01-27 Schering Aktiengesellschaft DNA encoding a novel RG1 polypeptide
WO2001080865A2 (en) 2000-04-25 2001-11-01 Osiris Therapeutics, Inc. Joint repair using mesenchymal stem cells
US6828145B2 (en) 2000-05-10 2004-12-07 Cedars-Sinai Medical Center Method for the isolation of stem cells by immuno-labeling with HLA/MHC gene product marker
NL1017973C2 (nl) * 2000-05-10 2002-11-08 Tristem Trading Cyprus Ltd Inrichting.
EP1167517A1 (en) * 2000-06-22 2002-01-02 IsoTis N.V. Tissue engineering
AU8033401A (en) * 2000-06-28 2002-01-08 Ascendia Ab Dna/rna-embedding medium and method of use
US20060088512A1 (en) * 2001-10-15 2006-04-27 Monash University Treatment of T cell disorders
ES2522890T3 (es) 2000-12-06 2014-11-19 Anthrogenesis Corporation Método para recolectar células troncales placentarias
US7311905B2 (en) 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
US20030032179A1 (en) 2000-12-06 2003-02-13 Hariri Robert J. Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom
WO2002081620A1 (fr) * 2001-04-03 2002-10-17 Kabushiki Kaisya Advance Systemes de culture cellulaire tridimensionnelle
JP2002315567A (ja) * 2001-04-18 2002-10-29 Yasuhiko Tabata 細胞接着活性物質を含有してなる幹細胞培養用基材
US7129034B2 (en) * 2001-10-25 2006-10-31 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation of whole bone marrow
CA2470853A1 (en) * 2001-12-13 2003-06-19 Japan Science And Technology Agency Human cell culture medium and culture method
JP2005531507A (ja) * 2002-03-02 2005-10-20 ザ ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ストローマ細胞前駆体による抗癌物質の局所的な産生および／または送達方法
EP1490478A4 (en) * 2002-03-18 2006-03-22 Nat Jewish Med & Res Center PROCESS FOR PRODUCING NEUTROPHILES AND USES THEREOF
US7498171B2 (en) * 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
WO2003101485A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Macrogenics, Inc. Cd16a binding proteins and use for the treatment of immune disorders
US7838290B2 (en) * 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
CA2505534A1 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Anthrogenesis Corporation Cytotherapeutics, cytotherapeutic units and methods for treatments using them
EP1601248A4 (en) * 2003-02-13 2010-01-27 Anthrogenesis Corp USE OF CORDIAL BLOOD FOR THE TREATMENT OF SUBJECTS SUFFERING FROM A DISEASE, A SUFFERING OR A DISORDER
US20050003533A1 (en) 2003-05-08 2005-01-06 Pawel Kalinski Mature type-1 polarized dendritic cells with enhanced IL-12 production and methods of serum-free production and use
US20050023085A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Munton Timothy John Lifesaver apparatus
US20080279812A1 (en) * 2003-12-05 2008-11-13 Norwood Immunology, Ltd. Disease Prevention and Vaccination Prior to Thymic Reactivation
US20080226554A1 (en) 2003-12-23 2008-09-18 Mount Sinai Hospital Methods For Detecting Markers Associated With Endometrial Disease or Phase
US20070037276A1 (en) * 2004-02-23 2007-02-15 Eudes Francois Marie De Crecy Continuous culture apparatus with mobile vessel, allowing selection of fitter cell variants and producing a culture in a continuous manner
WO2005118780A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Universite Pierre Et Marie Curie - Paris Vi A method for producing red blood cells
EP1773981A1 (en) * 2004-07-12 2007-04-18 Sorin Group Italia S.R.L. Device and method for growing human cells
US20060035375A1 (en) * 2004-08-16 2006-02-16 Head Jonathan F Method for selectively culturing epithelial or carcinoma cells
US7989001B2 (en) * 2004-09-13 2011-08-02 Untae Kim Method of separating tumor cells with and without lymphotropic metastatic potential in a human carcinoma
EP1645626B1 (en) 2004-09-30 2007-09-12 Reneuron Limited Cell line
WO2006052960A2 (en) * 2004-11-08 2006-05-18 The General Hospital Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING STEM CELL HOMING USING Gαs ACTIVATORS
EP1877547B1 (en) 2005-05-04 2012-08-08 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Selecting, culturing and creating lineage committed hematopoietic stem cells
PL1957633T3 (pl) 2005-10-13 2014-05-30 Anthrogenesis Corp Immunomodulacja z zastosowaniem komórek macierzystych łożyska
IL296832A (en) * 2005-10-18 2022-11-01 Nat Jewish Health Process of preparing red blood cells using conditionally immortalized long-term hematopoietic stem cells and erythropoietin
CA2629775A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-24 Enterprise Partners Venture Capital Stem cell factor therapy for tissue injury
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
DK2471907T3 (en) 2005-12-29 2019-01-21 Celularity Inc Placenta stem cell populations
KR20080081088A (ko) 2005-12-29 2008-09-05 안트로제네시스 코포레이션 태반 줄기세포와 제2 세포원으로부터 얻은 줄기세포의 공동배양
US7682822B2 (en) 2006-03-31 2010-03-23 Aastrom Biosciences, Inc. Ex vivo generated tissue system
WO2007146105A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-21 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of fetal placental cells
US20080050814A1 (en) * 2006-06-05 2008-02-28 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of fetal placental cells
WO2007149493A2 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Immugen Inc Restoration of hearing loss
WO2008020654A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ajinomoto Co., Inc. An l-glutamic acid producing bacterium and a method for producing l-glutamic acid
EP2061871A1 (en) * 2006-09-14 2009-05-27 ProBioGen AG Modular culture system for maintenance, differentiation and proliferation of cells
CA2668330C (en) 2006-11-03 2016-02-02 Aastrom Biosciences, Inc. Mixed cell populations for tissue repair and separation technique for cell processing
WO2008097927A2 (en) * 2007-02-06 2008-08-14 Tai June Yoo Treatment and prevention of neurodegenerative diseases using gene therapy
MX2009008559A (es) 2007-02-12 2009-08-21 Anthrogenesis Corp Hepatocitos y condorcitos de celulas madre de la placenta adherentes, y poblaciones de celulas enriquecidas con celulas madre de la placenta cd34+, cd45-.
EP2120977B1 (en) 2007-02-12 2013-05-15 Anthrogenesis Corporation Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
WO2008121461A2 (en) * 2007-02-26 2008-10-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Vaccine for activating helper function of cd8+ tcells
ES2665024T3 (es) * 2007-03-05 2018-04-24 Terumo Bct, Inc. Métodos para controlar el movimiento celular en biorreactores de fibra hueca
CA2680130C (en) 2007-03-05 2016-01-12 Caridianbct, Inc. Cell expansion system and methods of use
WO2008124229A2 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 Caridianbct, Inc. Improved bioreactor surfaces
WO2008128165A2 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Caridianbct, Inc. Cell expansion system and methods of use
NZ617412A (en) 2007-09-28 2015-06-26 Anthrogenesis Corp Tumor suppression using human placental perfusate and human placenta-derived intermediate natural killer cells
EP2210112B1 (en) * 2007-10-15 2012-02-08 King's College London Diagnostic methods for hiv infection
AU2008332303B2 (en) * 2007-12-06 2014-02-13 Nissan Chemical Industries, Ltd. Method for amplifying hematopoietic stem cells using heterocyclic compound
US10350243B2 (en) * 2008-01-30 2019-07-16 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods for off-the-shelf-tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
WO2009097140A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods for off -the -shelf tumor immunotherapy using allogeneic t-cell precursors
CA2618163A1 (en) 2008-02-07 2009-08-07 K. W. Michael Siu Head and neck cancer biomarkers
KR101803099B1 (ko) 2008-05-16 2017-11-30 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 항체 및 그 제조 방법
NZ601497A (en) 2008-08-20 2014-03-28 Anthrogenesis Corp Improved cell composition and methods of making the same
KR20200143506A (ko) 2008-08-20 2020-12-23 안트로제네시스 코포레이션 단리된 태반 세포를 사용한 뇌졸중 치료
PE20110358A1 (es) 2008-08-22 2011-06-13 Anthrogenesis Corp Metodos y composiciones para el tratamiento de defectos oseos con poblaciones de celulas placentarias
WO2010025421A2 (en) 2008-08-28 2010-03-04 Taiga Biotechnologies, Inc. Modulators of myc, methods of using the same, and methods of identifying agents that modulate myc
CA3203374A1 (en) * 2008-11-06 2010-05-14 Indiana University Research & Technology Corporation Materials and methods to enhance hematopoietic stem cells engraftment procedures
JP5869342B2 (ja) 2008-11-19 2016-02-24 アンスロジェネシス コーポレーション 羊膜由来接着細胞
US20120128640A1 (en) 2009-06-04 2012-05-24 Nissan Chemical Industries Ltd. Heterocyclic compounds and expansion agents for hematopoietic stem cells
JP2011045269A (ja) * 2009-08-26 2011-03-10 Hirosaki Univ 幹細胞および／または前駆細胞の培養方法
DK3284818T3 (da) 2010-01-26 2022-06-20 Celularity Inc Behandling af knoglerelateret kræft ved hjælp af placenta stamceller
TW202011974A (zh) 2010-04-07 2020-04-01 美商安瑟吉納西斯公司 利用胎盤幹細胞之血管新生
NZ602798A (en) 2010-04-08 2014-10-31 Anthrogenesis Corp Treatment of sarcoidosis using placental stem cells
CN102869762B (zh) 2010-05-05 2015-09-02 泰尔茂比司特公司 重新接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方法
MX342995B (es) 2010-07-13 2016-10-21 Anthrogenesis Corp Métodos de generar células asesinas naturales.
WO2012021969A1 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Mount Sinai Hospital Markers of the male urogenital tract
EP2625577B1 (en) 2010-10-08 2019-06-26 Terumo BCT, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
AU2011352036A1 (en) 2010-12-31 2013-07-18 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules
US9040035B2 (en) 2011-06-01 2015-05-26 Anthrogenesis Corporation Treatment of pain using placental stem cells
WO2013055476A1 (en) 2011-09-09 2013-04-18 Anthrogenesis Corporation Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells
DK2760994T4 (da) 2011-09-30 2021-10-11 Bluebird Bio Inc Forbindelser til forøget viral transduktion
CN104204193B (zh) 2012-02-13 2016-10-26 加米达细胞有限公司 间充质干细胞的培养
US8940294B2 (en) 2012-03-02 2015-01-27 Tissuetech, Inc. Methods of isolating and culturing stem cells
AU2013260101B2 (en) 2012-05-09 2016-10-27 Cantex Pharmaceuticals, Inc. Treatment of myelosuppression
WO2014011901A2 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
AU2013292330B2 (en) 2012-07-20 2018-07-12 Htyr Acquisition Llc Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
EP2885393A1 (en) 2012-08-20 2015-06-24 Terumo BCT, Inc. Method of loading and distributing cells in a bioreactor of a cell expansion system
HK1218515A1 (zh) 2013-02-05 2017-02-24 人类起源公司 来自胎盘的自然杀伤细胞
US10272115B2 (en) 2013-03-11 2019-04-30 Taiga Biotechnologies, Inc. Production and use of red blood cells
US9365825B2 (en) 2013-03-11 2016-06-14 Taiga Biotechnologies, Inc. Expansion of adult stem cells in vitro
US9617506B2 (en) 2013-11-16 2017-04-11 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
US10077421B2 (en) 2014-04-24 2018-09-18 Terumo Bct, Inc. Measuring flow rate
EP3198006B1 (en) 2014-09-26 2021-03-24 Terumo BCT, Inc. Scheduled feed
EP3258941A4 (en) 2015-02-17 2018-09-26 Cantex Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers and hematopoietic stem cell disorders privileged by cxcl12-cxcr4 interaction
US20160243168A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 Cantex Pharmaceuticals, Inc. Adoptive cell transfer methods
WO2016182034A1 (ja) * 2015-05-12 2016-11-17 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 単一粒子解析方法およびその解析のためのシステム
GB201508752D0 (en) * 2015-05-21 2015-07-01 Mason Christopher And Veraitch Farlan S Cell culture device, system and methods of use thereof
CA2990231C (en) * 2015-06-23 2024-06-04 Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and apparatus for conditioning cell populations for cell therapies
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
US11286454B2 (en) 2015-08-31 2022-03-29 I Peace, Inc. Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells
WO2017061528A1 (ja) * 2015-10-09 2017-04-13 国立大学法人名古屋大学 血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法
RU2021103425A (ru) 2016-02-12 2021-02-25 Блубёрд Био, Инк. Композиции, повышающие число копий вектора (чкв), и способы их применения
US11326183B2 (en) 2016-02-12 2022-05-10 Bluebird Bio, Inc. VCN enhancer compositions and methods of using the same
JP6965874B2 (ja) * 2016-03-28 2021-11-10 ソニーグループ株式会社 細胞培養方法
CN109153959B (zh) 2016-05-02 2021-06-18 整合培育株式会社 生长诱导系统、生长诱导控制装置、生长诱导控制方法和生长诱导控制程序
JP6111510B1 (ja) 2016-05-02 2017-04-12 インテグリカルチャー株式会社 成長誘導システム、成長誘導制御装置、成長誘導制御方法、および、成長誘導制御プログラム
JP7034949B2 (ja) 2016-05-25 2022-03-14 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 細胞の増殖
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
AU2017367730A1 (en) 2016-12-02 2019-06-06 Taiga Biotechnologies, Inc. Nanoparticle formulations
WO2018184028A2 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US10149898B2 (en) 2017-08-03 2018-12-11 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of melanoma
EP3775118A4 (en) * 2018-03-30 2022-03-09 DSM IP Assets B.V. Method of reducing emulsion by broth washing
AU2020272664A1 (en) 2019-04-08 2021-11-04 Taiga Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for the cry opreservation of immune cells
SG11202112529WA (en) 2019-05-14 2021-12-30 Taiga Biotechnologies Inc Compositions and methods for treating t cell exhaustion

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486188A (en) * 1980-08-14 1984-12-04 Applied Medical Devices, Inc. Bone marrow transplant method and apparatus
US4481946A (en) * 1980-08-14 1984-11-13 Altshuler John H Bone marrow transplant method and apparatus
US4514499A (en) * 1983-02-04 1985-04-30 Corning Glass Works Cell culture using a monolithic support
US4963489A (en) * 1987-04-14 1990-10-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5032508A (en) * 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5032407A (en) * 1987-01-16 1991-07-16 Ohio University Edison Animal Biotechnology Center Gene transfer using transformed, neodetermined, embryonic cells
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
CA2062741A1 (en) * 1989-06-15 1990-12-16 Stephen G. Emerson Methods, compositions and devices for growing cells
US5061620A (en) * 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
NL9101680A (nl) * 1991-10-04 1993-05-03 Tno Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
CA2131368A1 (en) * 1992-03-04 1993-09-16 Chu-Chih Shih Culturing of hematopoietic stem cells and their genetic engineering
WO1993018136A1 (en) * 1992-03-05 1993-09-16 Cytomed, Inc. Process for supporting hematopoietic progenitor cells
AU679120B2 (en) * 1993-09-03 1997-06-19 Systemix, Inc. Genetically modified human hematopoietic stem cells and their progeny

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