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KR100352171B1 - 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법 및 그방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이 - Google Patents

올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법 및 그방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이 Download PDF

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KR100352171B1
KR100352171B1 KR1020000019557A KR20000019557A KR100352171B1 KR 100352171 B1 KR100352171 B1 KR 100352171B1 KR 1020000019557 A KR1020000019557 A KR 1020000019557A KR 20000019557 A KR20000019557 A KR 20000019557A KR 100352171 B1 KR100352171 B1 KR 100352171B1
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(주) 제노텍
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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 말단 일측에 소수성기를 부착시키고 이 소수성기를 지지체에 도포된 소수성 막에 결합시킴으로써 올리고뉴클레오타이드를 고정시키는 올리고뉴클레오타이드의 고정방법 및 이 방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 지지체에 일정 조건하에서 고형화될 수 있는 소수성의 고정층을 도포하는 단계; 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 가지는 올리고뉴클레오타이드 수용액을 상기 고정층 상의 일정 부위에 점적하는 단계; 및 상기 고정층을 고형화시키는 단계로 구성된다. 본 발명의 방법은 공유결합을 이용하는 종래기술에 비하여 지지체 및 올리고뉴클레오타이드를 변형시키기 위한 복잡한 전처리 과정이 필요하지 않으며, 높은 결합 효율로 다양한 종류의 올리고뉴클레오타이드를 동시에 부착시킬 수 있다.

Description

올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법 및 그 방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이{Method for attaching oligonucleotide to solid support and the oligonucleotide array prepared by the method thereof}
본 발명은 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법 및 그 방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이에 관한 것이다. 본 발명은 하이브리디제이션을 기초로 하는 유전진단, 분석 및 DNA 칩 분야에 효과적으로 이용될 수 있다.
지지체에 고정된 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 하이브리디제이션은 각종 유전자를 탐색하는 방법으로 생명공학 관련 전분야에서 폭넓게 사용되는 기술이며, 최근에는 이를 기본원리로 고밀도 집적 올리고뉴클레오타이드 어레이 즉, DNA 칩이 기존의 전통적인 젤(gel-based) 방법을 대치하여 유전적 돌연변이, 유전형질 발현, 염기서열결정 등 빠르고 경제적인 유전연구의 도구로 급부상하여 실용화되고 있다. 그러나 지지체에 올리고뉴클레오타이드를 효율적으로 고정시키는 것에 어려움이 있다.
현재까지 유리, 실리콘, 니트로셀룰로우즈 막 또는 폴리스타이렌과 같은 지지체에 미리 합성된 올리고뉴클레오타이드를 고정하거나 또는 직접 지지체 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 다양한 방법들이 알려져 있다.
올리고뉴클레오타이드를 직접 지지체 상에서 합성하는 방법은 고밀도 DNA 어레이에 적합하다. 그러나 진단 등 많은 분야에서는 미리 합성된 올리고뉴클레오타이드나 PCR 등으로 만들어진 유전자 조각을 이용해야 하며, 이를 위하여 현재까지는 DNA와 지지체 표면을 결합반응기로 각각 활성화시켜 상호간의 공유결합을 이용하는 방법과 수동 부착방법(passive adsorption)이나 아비딘-바이오틴 친화성 결합 또는 폴리아크릴아마이드, 폴리파이롤 또는 니트로셀룰로오즈 용액과 올리고뉴클레오타이드를 섞은 후 공중합시키는 비공유 결합방법 등이 제시되었다. 또 유리판에 폴리아크릴아마이드 젤을 형성시킨 후 젤표면을 활성화시켜 올리고뉴클레오타이드와 공유결합을 유도하는 3차원적 기능화 폴리아크릴아마이드 젤패드법도 제시되었다.
좀더 구체적으로, PCR 등으로 만들어진 DNA 조각을 유리 지지체에 결합하기 위하여 스탠포드대의 패트릭 브라운은 유리판을 폴리-L-라이신으로 코팅하고 3xSSC에 녹인 DNA를 점적한 후 UV 조사로 고정시키는 방법을 사용하였으나, 이 방법은 비특이적 결합율이 높다.
이러한 비특이적 결합을 최소화하기 위한 노력으로 Chrisey 등은 티올을 가하여 변형시킨 올리고뉴클레오타이드와 아미노실란을 가하여 변형시킨 실리카 슬라이드 또는 n-형 Si 웨이퍼 지지체 그리고 다양한 종류의 아민/설프하이드릴 이형 양기능 크로스링커(heterobifunctional crosslinker)를 이용하였으며, 그 결과 고정밀도 162-234fmol/㎟, 하이브리디제이션 효율 9.3-76.1% (15-178pmol/㎟)을 나타낸다고 보고한 바 있으나(Linda A. Chrisey 등 (1996)Nucleic Acids Res. 24, 3031-3039) 이 방법은 다양한 염기로 구성된 올리고뉴클레오타이드의 경우 효율이낮아 올리고뉴클레오타이드 종류에 따라 사용이 제한된다.
또한, Michael 등은 DNA 마이크로어레이를 위해 이황화-변형된 올리고뉴클레오타이드를 멀켑토실란으로 변형된 지지체에 크로스링커 없이 d(T)10스페이서만을 사용하여 직접 고정하는 방법을 보고하였다(Yu-Hui Roger 등 (1999)Anal. Biochem., 266, 23-30). 이 방법은 기존의 고정방법에서 대두되는 올리고뉴클레오타이드상의 다른 반응기로 인한 비특이적 고정을 최소화하여 상대적으로 높은 고정율(3×105oligo/㎛2)과 하이브리디제이션 효율(16%)을 보이고 있으며, 지지체 표면의 소수성 특징은 점적 후 건조상태에 따라 형성되는 '도우넛(doughnut)' 효과와 다양한 종류의 올리고뉴클레오타이드를 동시에 고밀도 점적시 발생할 수 있는 혼합현상을 억제할 수 있다고 보고하였다.
Joos 등은 카르복실화 올리고뉴클레오타이드와 아미노기로 변형시킨 지지체간의 아미노/카르복시 양기능 크로스링커(EDC)를 이용한 고정방법을 보고하였다 (Beda Joos 등(1997)Anal. Biochem., 247, 96-101). 그들에 의하면 고정시 EDC 반응 pH에 따라 고정효율은 다르게 나타나며 최고 고정밀도는 160fmole/㎟이었다. 하이브리디제이션의 최적조건은 고정되는 올리고뉴클레오타이드 상에 스페이서로 약 15개 이상의 염기가 필요한 것으로 보고되었다.
스페이서를 필요로 하는 또다른 예로 Smith 등은 지지체를 아미노프로필트리메톡실실란으로 처리하고 이를 p-페닐렌다이아이소티오시아네이트와 반응시켜 5' 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드와 공유결합을 이루도록 하였다(Zhen guo등(1994)Nucleic Acids Res. 22, 5456-5465). 이들에 의하면 최고고정밀도는 330fmole/㎟이며, 스페이서로 d(T)15를 사용하였다.
이와 같은 공유결합을 이용하는 방법은 모두 별도의 크로스링커를 준비해야 하고 고형매질(본 명세서의 "지지체"와 동일한 개념으로, 본 명세서에서 혼용함) 표면과 올리고뉴클레오타이드에 각각 상호 결합할 수 있는 반응기를 유도하는 전처리를 하여야 하므로 제조과정이 복잡하고 올리고뉴클레오타이드 어레이 제조 비용이 증가한다.
비공유결합 방법인 수동 부착 방법으로는 지지체로 폴리스타이렌을 사용하는 방법이 제시되었다(Nikiforov T.T. 등(1995)Anal. Biochem., 227, 201-209). 이는 염이나 양이온성 계면활성제가 포함된 DNA 용액을 그대로 지지체와 반응, 고정시키는 방법으로 염은 올리고뉴클레오타이드 골격의 포스페이트와 폴리스타이렌 표면의 음전하 간의 반발력을 줄이며, 양이온성 계면활성제의 양전하는 올리고뉴클레오타이드의 음전하간의 반발력을 줄임으로써 폴리스타이렌과 올리고뉴클레오타이드간의 전기적 반발력을 최소화시켜 소수성 상호작용에 의한 결합을 유도할 수 있다고 하였다. 이 방법으로 고정된 올리고뉴클레오타이드의 고정효율은 1.1pmol/well이었으며 하이브리디제이션은 최고 50%까지 나타났다. 이 방법은 비교적 간단하고 경제적이기는 하나 상용할 수 있는 지지체가 제한된다는 단점이 있다.
또 바이오틴-아비딘 친화성 결합을 이용하는 방법(Syvanen, A.C. 등(1998)Nucleic Acids Res. 16, 11327-11338)은 고형매질과 올리고뉴클레오타이드에 아비딘과 바이오틴을 각각 결합시키는 전처리 단계를 거쳐야 하므로 시료 제조 단가가 매우 높아진다.
코폴리머화 방법은 5'-말단에 아크릴아미드기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 아크릴아마이드와 섞고 이 용액을 실란으로 처리된 유리슬라이드 위에 점적한 후 코폴리머화시킴으로써 올리고의 염기부위가 밖으로 노출된 폴리머층이 유리표면에 형성된다(Farah N. Rehman, 등 (1999)Nucleic Acids Res. 27, 649-655). 이 방법은 고정율은 83-84%(약 200fmol/㎟)로 매우 높으나 이에 비해 하이브리디제이션은 상기 고정조건 하에서 약 15%로 상대적으로 낮다.
따라서, 본 발명은 상기 종래기술의 단점을 극복하고 높은 결합효율성과 안정성을 가지며 하이브리디제이션을 위해 올리뉴클레오타이드를 특정 방향으로 결합하도록 지지체에 부착시키는 방법 및 그 방법에 의하여 제조된 올리고뉴클레오타이드 어레이를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명은 많은 수의 다양한 올리고뉴클레오타이드에 대하여 제약없이 사용할 수 있는 올리뉴클레오타이드를 지지체에 부착시키는 방법 및 그 방법에 의하여 제조된 올리고뉴클레오타이드 어레이를 제공하려는 것이다.
나아가, 본 발명은 간단하고 경제적으로 올리뉴클레오타이드를 지지체에 부착시키는 방법 및 그 방법에 의하여 제조된 올리고뉴클레오타이드 어레이를 제공하려는 것이다.
도 1은 지지체에 고정된 DMT-올리고뉴클레오타이드와 일반올리고뉴클레오타이드의 하이브리디제이션 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 지지체에 고정시킨 DMT-올리고뉴클레오타이드를 상보성/비상보성 형광 올리고뉴클레오타이드로 농도별로 하이브리디제이션시킨 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 지지체에 동일한 조건으로 DMT-올리고뉴클레오타이드를 고정시킨 후 하이브리디제이션을 시행하여 재현성을 확인한 사진이다.
도 4는 고정율 및 하이브리디제이션 효율을 확인하기 위한 형광크기의 표준곡선이다.
도 5는 농도별로 지지체에 고정된 DMT-올리고뉴클레오타이드를 상보성 형광 올리고뉴클레오타이드로 농도별로 하이브리디제이션시킨 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법을 도시한 것이다.
본 발명은 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 개선된 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이를 제공한다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 지지체 상에 일정 조건 하에서 고형화될 수 있는 소수성의 고정층을 도포하는 단계; 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드 수용액을 상기 고정층 상의 일정 부위에 점적하는 단계; 및 상기 고정층을 고형화시키는 단계로 구성된다.
또한, 본 발명은 지지체 상에 도포된 고형화된 소수성의 고정층을 일정 조건 하에서 유동화시키는 단계; 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드 수용액을 상기 고정층 상의 일정 부위에 점적하는 단계; 상기 고정층을 고형화시키는 단계로 구성된다.
또한, 본 발명의 구성에는 상기 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드 대신 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 프라이머로부터 증폭된 PCR 증폭산물을 지지체에 고정시키는 방법도 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 고정층은 바람직하게는 중합 또는 중축합에 의하여 형성되는 폴리머인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 PCR 증폭산물 또는그 프라이머에 결합되는 소수성기는 바람직하게는 다이메톡시트리틸기인 것을 특징으로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이, 즉, 지지체 상에 도포된 고정층에 복수개의 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 또는 3'-말단에 결합된 소수성기가 고정된 올리고뉴클레오타이드 어레이로 구성된다.
본 발명에서 지지체는 유리, 실리콘, 니트로셀룰로오스 막 또는 폴리스타이렌과 중합체 등, DNA 칩에 이용되는 지지체는 어떠한 것이라도 이용될 수 있다.
본 발명에서 "올리고뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드 뿐 아니라, 프라이머로 증폭된 PCR 증폭산물도 포함하는 의미로 사용한다.
DNA 합성은 ① 염기 단량체 또는 이량체 이상의 올리고뉴클레오타이드의 5'-OH의 보호기, 예컨대 다이메톡시트리틸기(dimethoxytrityl group; DMT)를 제거시켜 5'-OH를 활성화시키는 탈보호(deprotection) 단계, ② 탈보호된 5'-OH를 새로운 염기 단량체와 포스파이트트리에스테르 결합을 형성시키는 커플링 단계, ③ 포스파이트트리에스테르 결합을 안정적인 포스포러스로 변화시키는 산화 단계 ④ 반응하지 않고 남은 5'-OH를 다이메톡시트리틸기(dimethoxytrityl group; DMT) 등을 이용하여 불활성화(본 명세서에서 "보호(protection)"와 동일한 개념으로 사용됨)시키는 캡핑(capping) 단계;와 같은 4단계의 일련의 과정의 반복을 통해 이루어진다. 따라서 최종적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 5'-OH는 보호기(protection group)로 보호되어 있으며, 일반적으로 올리고뉴클레오타이드의 경우 5' 말단의 보호기를제거하는 "탈보호 단계"를 거쳐서 합성되거나, 최종합성 후 5'-보호기를 제거하고 사용하게 된다.
본 발명에서 고정층으로는 일정 조건 하에서 고형화될 수 있는 다양한 소수성 물질을 포함한다. 바람직하게는 중합 또는 중축합에 의하여 형성되는 폴리머를 사용할 수 있는데, 이들 폴리머의 단위체인 모노머를 적당한 용매에 녹여 유동성 있는 상태로 만든 후 지지체 상에 도포함으로써 고정층을 형성한다. 예를 들어 PVC 수지 또는 자외선이나 빛에 의해 고형화되는 폴리머 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 고정층은 지지체 상에 도포된 후 고형화되기 전에 말단 일측에 소수성기가 결합된 올리고뉴클레오타이드 수용액을 고정층 상에 점적한 후 소수성기가 소수성인 고정층 내에 소수성 상호반응(hydrophobic interaction)하게 한 다음 고정층을 폴리머리제이션 등으로 고형화시킬 수 있다. 고정층을 폴리머리제이션 또는 고형화시키는 방법은 사용되는 고정층 성분의 특성에 따라 선택할 수 있으며, 예컨대 건조시키거나 자외선 조사 등의 방법으로 고형화시킬 수 있다.
또는, 지지체 상에 미리 고정층을 도포하고 고형화시켜 두었다가 올리고뉴클레오타이드를 고정시킬 필요가 있는 경우에는 지지체 상에 도포된 고형화된 소수성의 고정층을 일정 조건 하에서 예컨대 유기용매를 일정량 가하는 등의 방법으로 유동화시킨 후 말단 일측에 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드 수용액을 상기 고정층 상의 일정 부위에 점적하고 상기 고정층을 다시 고형화시킬 수 있다.
본 발명에서 올리고뉴클레오타이드를 용해시키는 용매로는 친수성이며 올리고뉴클레오타이드를 용해시키는 용매는 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어 물이나 적당한 완충용액을 사용할 수 있으며, 특히 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 3'- 또는 5'-말단 소수성기를 안정화시킬 수 있는 용매가 바람직하다.
본 발명에서 올리고뉴클레오타이드는 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 가진다. 본 발명의 일 실시예에서는 올리고뉴클레오타이드 합성 종료후 5'-말단에 부착된 소수성 보호기를 제거할 필요 없이 그대로 올리고뉴클레오타이드 어레이 제조에 사용할 수 있다. 한 예로, 현재 상업적으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드 제조용 DNA 단량체는 5'-말단이 DMT로 보호되어 있는 예가 많은데, 올리고뉴클레오타이드 제조 후 최종단계에서 결합된 뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착된 DMT를 제거할 필요 없이 그대로 올리고뉴클레오타이드 어레이 제조에 이용할 수 있다. 이 경우 DMT제거공정 즉, 탈보호공정 및 다른 링커를 결합시키는 공정이 생략되므로 전체 공정이 종래 방법에 비하여 훨씬 간단해지고 비용 또한 현저히 저감된다. 필요한 경우 올리고뉴클레오타이드 제조 후 남아 있는 5'-말단의 보호기를 제거하고, 소수성의 또다른 보호기를 말단 일측 즉, 3'- 또는 5'-측에 결합시킨 후 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
또한, 올리고뉴클레오타이드 말단 일측에 결합시키는 소수성기는 필요에 따라 3'- 또는 5'-말단에 결합시킬 수 있다. 예컨대 지지체 상에 올리고뉴클레오타이드를 특정 방향으로 결합시켜야 할 필요가 있을 때 3'-말단에만 또는 5'-말단에만 소수성기를 결합시킴으로써 지지체에 부착되는 올리고뉴클레오타이드의 방향성을 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 말단 일측에 소수성기가 결합된 올리고뉴클레오타이드를 이용하므로서 이 소수성기가 결합된 올리고뉴클레오타이드 수용액을 고정층 상에 제공하면 친수성 및 소수성의 동일 성질간의 친화성과 다른 성질간의 반발력으로 인해 올리고뉴클레오타이드에 결합된 소수성기 부위는 상대적으로 소수성인 고정층에, 올리고뉴클레오타이드의 친수성 부위, 즉 DNA는 고정층과 반대방향에 위치하는 상태로 유지된다(도 6 참조). 먼저, 지지체(10) 상에 고정층(20)을 도포한다. 이 고정층이 유동상태에 있을 때 예컨대, 모노머가 폴리머리제이션되지 않았을 때 올리고뉴클레오타이드 수용액(30)을 고정층 상에 점적한다. 이때 올리고뉴클레오타이드의 말단 일측에 결합된 소수성기(31)는 소수성 고정층 상에 소수성 결합을 하게 되고, 친수성의 올리고뉴클레오타이드 측(32)은 지지체와 반대편에 위치하게 된다. 고형화 단계를 거쳐 고정층이 고형화됨으로써 올리고뉴클레오타이드는 지지체에 고정되게 된다.
이 상태에서 고정층을 건조(또는 고형화)시킴으로써 올리고뉴클레오타이드가 하이브리디제이션을 할 수 있는 최적의 상태로 방향성을 갖고 지지체 상의 고정층에 고정되게 된다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 제조된 올리고뉴클레오타이드 어레이는 정확하게 5'-말단 또는 3'-말단의 소수성기 부분이 지지체 쪽에 부착되고 올리고뉴클레오타이드는 지지체 반대쪽으로 위치하게 되므로, 하이브리디제이션시 입체 방해(steric hindrance)에 의한 영향이 없다는 점이 또다른 장점이다.
본 발명에서 지지체는 유리, 실리콘, 니트로셀룰로오스 막 또는 폴리스타이렌과 중합체 등, DNA 칩에 이용되는 지지체는 어떠한 것이라도 이용될 수 있다.
실시예 1: 올리고뉴클레오타이드 제조
DNA 합성기를 이용하여 다음과 같은 서열의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 다음 서열들은 임의의 인공서열이며, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 서열의 특성과는 관계 없이 모든 올리고뉴클레오타이드에 적용할 수 있다.
DMT-올리고뉴클레오타이드 1(30mer) :
5'-DMT-GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC GTA TAA-3'
DMT-올리고뉴클레오타이드 2(30mer) :
5'-DMT-GCT TTG GGG CAT GGT TAT TGA CCC GTA TAA-3'
일반 올리고뉴클레오타이드 1(30mer) :
5'-GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC GTA TAA-3'
일반 올리고뉴클레오타이드 2(30mer) :
5'-GCT TTG GGG CAT GGT TAT TGA CCC GTA TAA-3'
합성된 올리고뉴클레오타이드는 암모니아 용액을 처리하여 합성시 사용된 고형 지지체로부터 분리하였다.
이중 일부는 DMT-올리고뉴클레오타이드로 사용하기 위해 1M 트리스(pH 8) 완충용액을 최종농도 100mM이 되도록 적정량을 첨가한 후 진공윈심분리건조기로 건조시켰으며 이를 0.1xTE, pH 8 완충용액으로 녹여 정량하였다. 1xTE, pH 8 완충용액으로 2, 20, 50, 100, 200pmol/ul의 다양한 농도로 희석 후 냉동보관하면서 사용하였다.
DMT기가 결합되지 않은 올리고뉴클레오타이드(본 명세서에서 "일반 올리고뉴클레오타이드"라 함)는 암모니아 처리후 COP 칼럼을 사용하여 DMT기를 제거한 상태로 정제하고 완전히 말린 후 1xTE, pH8 완충용액으로 적정농도로 녹여 냉동보관하면서 사용하였다. 위의 DMT-올리고뉴클레오타이드 1과 2는 일반 올리고뉴클레오타이드 1, 2와 각각 염기구성은 같으며 5'말단에 소수성 DMT기의 유무에 의해 구별된다.
또, 하이브리디제이션 확인에 사용하고자 위에서 합성된 DMT-올리고뉴클레오타이드 1 및 일반 올리고뉴클레오타이드 1과 상보적인 염기서열을 가지며 3'-말단에 형광물질이 결합된 상보성 형광올리고뉴클레오타이드 및 5'-말단에 형광물질이 결합된 비상보성 형광올리고뉴클레오타이드를 합성후 COP 칼럼으로 정제하여 사용하였다.
상보성 형광올리고뉴클레오타이드(24mer) :
5'-TAC GGG TCA ATG TCC ATG CCC CAA-Fluoroscein-3'
비상보성 형광올리고뉴클레오타이드(21mer) :
5'-Fluoroscein-GTG GTT TCA CCT ACG ACA CTA-3'
실시예 2: 올리고뉴클레오타이드 어레이 제조
일반적으로 사용되는 유리 슬라이드를 2N HCl로 5분간 처리하고 증류수로 3회 세척한 후 아세톤으로 1분간 처리하여 수분을 제거하였으며 고정층으로서 중합체가 견고히 결합될 수 있도록 일반적으로 사용되는 결합실레인(디메틸디클로로실레인)으로 표면을 처리한 후 실온에 보관하면서 사용하였다.
고정층으로서 중합체는 소수성 PVC수지 및 자외선 고형화 수지(자외선 조사에 의해서만 고형화되는 특성을 갖는다- 시중판매됨)를 각각 결합실레인 처리된 슬라이드 표면에 0.2∼0.3mm두께로 고르게 도포하였다.
다양한 농도로 준비된 DMT-올리고뉴클레오타이드 1,2와 일반올리고뉴클레오타이드 1,2를 0.2∼1ul씩 점적한 후 점적된 표면이 아래로 향한 상태를 유지하면서 공기 중에서 건조시키거나(PVC 수지의 경우), 약 2∼5분간 방치한 후 312nm 자외선을 약 30초간 조사하여 중합체를 고형화시킴에 의해(UV 고형화 중합체의 경우) 올리고뉴클레오타이드를 중합체에 고정시켰으며, 1xTE, pH 8 완충용액으로 3회 세척하여 비특이적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하였다.
하이브리디제이션은 5xSSC, 0.5% SDS 하이브리디제이션 용액에 상보성 및 비상보성 형광 올리고뉴클레오타이드를 적정량 희석하여 이를 상기와 같이 올리고뉴클레오타이드가 점적된 위치에 점적하고 30℃에서 3시간 처리하였으며 2xSSC, 0.1%SDS 세척용액으로 10분간 2회 처리하고, 1xTE, pH 8 완충용액으로 5회 세척하였다. Molecular Dynamics사(미국)의 'Storm(상표명)'을 이용하여 형광을 측정 및 분석하였다. 본 실험에서는 픽셀(pixel)당 200um의 스캔 분해능으로 분석하였으며, 0.5ul를 점적할 경우 약 3㎟의 표면적이 되며 이는 75픽셀/스팟(pixel/spot)에 해당한다. 각 픽셀의 형광크기는 16-비트 정확도(precision)로 계수화되며, 이를 ImageQuaNT v4.0 분석 프로그램으로 분석하였다.
실시예 3. 올리고뉴클레오타이드의 고정 확인
실시예 1에서 준비된 네가지의 DMT-올리고뉴클레오타이드 및 일반 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드 고정여부를 확인하였다.
DMT-올리고뉴클레오타이드 1과 2(도 1의 spot 1, 2) 그리고 일반 올리고뉴클레오타이드 1과 2(도 1의 spot 3, 4)를 고정층으로서 중합체가 도포된 지지체 표면에 각각 30pmol/spot(0.3ul)씩 점적한 후 각각의 상보성 형광올리고뉴클레오타이드 25pmol로 하이브리디제이션시켰으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. C는 대조구로써 1xTE 완충용액 0.3ul를 점적한 후 하이브리디제이션을 시행하지 않은 결과이다. 도 1로부터 DMT-올리고뉴클레오타이드는 DMT에 의해서 지지체에 잘 고정되며 하이브리디제이션이 가능함을 알 수 있다.
실시예 4. 상보성 및 비상보성 형광올리고뉴클레오타이드의 하이브리디제이션 비교
지지체에 고정된 올리고뉴클레오타이드의 하이브리디제이션 여부를 비상보성 형광올리고뉴클레오타이드를 이용하여 재확인하였다.
도 2의 래인 A는 DMT-올리고뉴클레오타이드 1을 50pmol/spot(50ul)씩 점적한 후 상보성 형광올리고뉴클레오타이드 1을 10, 50, 100pmol(spot 1, 2, 3)씩 하이브리디제이션하였고, 도 2의 래인 B는 DMT-올리고뉴클레오타이드 1을 50pmol/spot(50ul)씩 점적한 후 비상보성 형광올리고뉴클레오타이드를 10, 50,100pmol(spot 4, 5, 6)씩 하이브리디제이션하였다. C는 대조구로써 하이브리디제이션을 시행하지 않은 상태이다. 결과는 도 2에 나타난 바와 같이 상보성 형광 올리고뉴클레오타이드를 가한 경우 하이브리디제이션이 일어났으며, 상보성 형광 올리고뉴클레오타이드 농도가 높아질수록 하이브리디제이션이 잘 일어났다.
실시예 5. 재현성 확인
DMT-올리고뉴클레오타이드를 0.5ul(50pmol)씩 8개 점적후 상보성 형광올리고 50pmol로 하이브리디제이션시켰다. 7개(도 3의 spot 1~7)의 결과를 비교하여 재현성을 확인하였다. C는 대조구로써 DMT-올리고뉴클레오타이드 점적후 하이브리디제이션을 시행하지 않은 것이다. 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 6. 고정의 안정성 확인
DMT에 의해 고정된 상태의 안정성을 확인하기 위하여 고정된 것이 확인된 슬라이드를 1xTE 완충용액에 담가둔 상태로 실온에서 18시간동안 처리한 후 다시 형광크기를 측정했다.
재현성 확인을 위해 사용된 슬라이드(도 3)를 이용하여 전기방법을 시행하였으며 형광의 크기에 있어서 변화가 없었다. 즉 안정적인 결합임을 알 수 있었다.
실시예 7. 고정 및 하이브리디제이션 효율 비교
DMT-올리고뉴클레오타이드 1을 100pmol(래인 A), 50pmol(래인 B)로 각 4개씩점적한 후 상보성 형광 올리고뉴클레오타이드를 100, 50, 25, 0pmol(1, 2, 3, 4)로 하이브리디제이션시킨 후 결과를 비교하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 각각의 형광값을 도 4의 표준곡선과 비교하여 고정 및 하이브리디제이션 밀도를 산출한 결과는 표 1과 같다.
하이브리디제이션 양
100pmol 50pmol 25pmol
고정에 사용된 DMT-올리고 양 100pmol 420 400 260
50pmol 430 290 200
단위: fmol/㎟
본 방법의 경우 고정된 올리고뉴클레오타이드가 430fmol/㎟까지 하이브리디제이션이 가능함을 알 수 있었다.
본 발명에 의한 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법은 지지체 및 올리고뉴클레오타이드에 별도의 링커를 부착시키는 등의 전처리가 필요하지 않다.
또한, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오타이드 고정방법은 높은 결합효율로 다양한 종류의 올리고뉴클레오타이드를 동시에 부착시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오타이드 고정방법은 하이브리디제이션효율이 종래기술에 비하여 현저히 높아 진단 등의 분야에서 유용하다.
뿐만 아니라, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오타이드 고정방법 및 그 방법에 의하여 제조된 올리고뉴클레오타이드 어레이는 특정 방향 즉, 지지체로부터 5'→3', 또는 지지체로부터 3'→5'방향과 같이 올리고뉴클레오타이드 어레이의 방향성을 특정할 수 있어 종래의 방법에 비하여 유용하며, 하이브리디제이션 효율도 높다.
또한, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오타이드 고정방법 및 그 방법에 의하여 제조된 올리고뉴클레오타이드 어레이는 종래의 지지체와 올리고뉴클레오타이드 간의 비특이적인 결합에 비하여 입체방해가 적다.

Claims (8)

  1. 지지체 상에 일정 조건 하에서 고형화될 수 있는 소수성의 고정층을 도포하는 단계; 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드 수용액을 상기 고정층 상의 일정 부위에 점적하는 단계; 및 상기 고정층을 고형화시키는 단계로 구성되는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  2. 지지체 상에 도포된 고형화된 소수성의 고정층을 일정 조건 하에서 유동화시키는 단계; 3'- 또는 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드 수용액을 상기 고정층 상의 일정 부위에 점적하는 단계; 상기 고정층을 고형화시키는 단계로 구성되는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 소수성기를 결합시킨 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단에 소수성기를 결합시킨 프라이머로부터 증폭된 PCR 증폭산물인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 고정층은 중합 또는 중축합에 의하여 형성되는 폴리머인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 소수성기는 다이메톡시트리틸기인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 고정층은 중합 또는 중축합에 의하여 형성되는 폴리머인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 소수성기는 다이메톡시트리틸기인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 지지체에 고정시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 방법에 의하여 제조되는 올리고뉴클레오타이드 어레이.
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