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KR100593712B1 - 다수의 형광 시그널을 갖는 마이크로입자 - Google Patents

다수의 형광 시그널을 갖는 마이크로입자 Download PDF

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KR100593712B1
KR100593712B1 KR1020007008048A KR20007008048A KR100593712B1 KR 100593712 B1 KR100593712 B1 KR 100593712B1 KR 1020007008048 A KR1020007008048 A KR 1020007008048A KR 20007008048 A KR20007008048 A KR 20007008048A KR 100593712 B1 KR100593712 B1 KR 100593712B1
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KR
South Korea
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fluorescent
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microparticles
analyte
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KR1020007008048A
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챈들러마크비.
챈들러돈
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루미넥스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 다른 형광 염료로 착색된 다수의 좀더 작은 중합체 입자 또는 나노입자를 그의 표면에 갖는 코어 또는 담체 입자를 포함하는 새로운 형광 약품을 제공한다. 광원에 의해 여기될 때 그들은 다수의 형광 방출을 동시에 나타내며, 이는 샘플 내 다수 검체의 복합 분석에 유용하다. 형광 나노입자를 그의 표면에서 수송하는 결합된 복합체 입자, 그러한 중합체 물품을 제조하는 방법, 및 그러한 입자를 사용하는 여러 가지 응용 및 방법을 개시한다.

Description

다수의 형광 시그널을 갖는 마이크로입자 {MICROPARTICLES WITH MULTIPLE FLUORESCENT SIGNALS}
본 출원은 1998년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 제 60/072,160 호의 우선일을 주장하며, 그의 전체적인 내용은 참고로 여기에 함께 개시하였다.
본 발명은 일반적으로 플로우 세포계측법(flow cytometry)에 관한 것이며, 더 상세하게는 1 또는 그 이상의 형광 염료로 착색된 중합체 나노입자의 표면상에서 수송하는 마이크로입자에 관한 것이다.
형광성 중합체 입자들은 때때로 다양한 생의학적 분석에서 마커(marker) 및 지시기로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 이하에서 사용되는 바와 같이, "마이크로입자"(microparticle), "마이크로구체"(microsphere) 또는 "마이크로비드" (microbead)라는 용어는 서로 바꾸어 사용될 수 있으며, 본질적으로 전체 직경이 마이크로미터 범주 안에 속하는 소립자로 간주되는 동일한 의미를 갖는다. 나노구체(nanosphere), 나노입자(nanoparticle) 또는 나노비드(nanobead)라는 용어는 전체 크기가 본질적으로 나노미터 범주 안에 속하는 좀 더 작은 입자에 관한 것이다. 이후 사용된 바와 같이, 입자, 구체 또는 비드의 일반적인 용어는 모두 고체 지지체나 고상(固相)으로 효과적으로 작용하는 마이크로입자 및 나노입자들을 지칭한 다. 형광 입자들은 통상 엘. 비. 뱅(L. B. Bangs)에 의해 처음으로 서술된 기술에 따라 형광 염료를 매설하거나 분산시켜 얻어진다(Uniform Latex Particles; Seragen Diagnostics Inc. 1984, p. 40). 형광 염료로 입자들을 착색시키는 다른 방법들도 선행 기술로서 알려져 있다. 이후 사용된 것처럼, 형광염료, 형광물질, 형광색소 또는 형광단이란 용어는 서로 바꿔 사용될 수 있으며, 동일한 의미를 지닌다. 마이크로입자들은 수작업으로 또는 다른 선행기술에서 알려진 방법으로 분석될 수 있으나, 만서(Mansour) 등의 미국 특허 번호 제 4,665,024호에 개시된 것과 같은, 자동 기술, 예를 들면 플로우 세포계측법을 사용하는 것이 바람직하다.
이들 입자의 다양성은 각각 독특한 스펙트럼 특성을 갖는 다수의 염료를 하나의 입자에 결합함으로서 향상될 수 있다. 당업자는 2 이상의 염료를 다양한 비율로 사용하여 단일 입자상에 독특한 염료를 결합시키는 순열 수를 증가시킬 수 있다는 것을 인식하였을 것이다. 하나의 염료를 하나의 입자로 흡수시키는 간단한 흡수 작용은 대부분의 목적에는 적당한 것으로 증명되었으나, 반면에, 하나 이상의 염료가 하나의 입자에 흡수될 때에는 몇 가지 문제들이 발생한다.
첫 번째로, 묻혀진 염료 분자들이 가깝게 밀접한 것은 상당량의 형광 에너지의 전이를 일으킨다. 이 에너지 전이는 관련된 염료 농도 및 그들 본래의 방출 패턴과 불일치하는 형광 방출을 일으킨다.
사용된 염료 물질들이, 입자내에 염료를 통합시키기 위하여 사용된 용매에 대하여 다른 용해도를 가질 때 또 다른 문제가 제기된다. 모든 염료들이 동시에 흡수되어야만 하기 때문에 가능한 염료 비는 용매 성질에 따라 제한된다.
다수 염료들이 마이크로 입자에 파묻혀 있을 때 발생되는 제 3 문제는 염료 스펙트럼들의 변화이다. 특히, 입자가 가교 폴리스티렌으로 구성되었을 때에는, 형광 방출 피크가 상당히 넓게 나타난다는 것에 주목해야한다.
이들 문제들을 우회하는 한가지 방법은 각 염료 물질을 입자 표면에 화학적으로 결합시키는 것이다. 이러한 접근법의 예로서, 미국 특허 번호 제5,194,300호 정(Cheung); 제4,774,289호 스와르츠(Schwartz)에 개시되어 있으며, 여기에 따르면 하나 또는 그 이상의 형광 염료들이 입자들의 표면에 공유 결합적으로 결합되어 있다. 그러나, 이것은 산화 또는 다른 화학적 공격에 의해 분해를 촉진시킬 수 있는 환경에 염료 분자들을 노출시키게 된다. 게다가, 다수의 표면 결합 부위는 염료에 의해 점유되어 분석을 하기에 필요한 분석적 반응물 분자와의 결합에 이용할 수 없었을 것이다.
그러므로, 상기 문제들은 피하면서 다색 형광 입자들을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명은 다중 염색 입자의 여러 성능을 유지하면서도 이러한 복잡성들을 최소화하거나 제거한다.
따라서 본 발명은 형광적으로 착색된 하나 이상의 나노입자 집단 또는 세트가 그의 표면에 부착된 중합체 마이크로입자를 포함하는 새로운 물품을 제공한다. 주어진 집단의 모든 나노구체들을 동일 농도의 염료로 염색하고, 소정 수의 이들 나노구체들을, 다른 염료들로 착색된 기지량의 다른 나노구체와 함께 마이크로입자에 결합시켜, 결과적으로 다중형광 마이크로구체를 만든다. 다른 집단 또는 세트의 나노구체들의 양과 비를 변화시킴으로써, 독특한 방출 스펙트럼들 또는 형광 시그 널을 갖는 다수의 분명한 담체 입자 집단을 확인하고 구별하는 것이 가능해진다.
마슨 등이 미국 특허 제4,279,617호에서 개시한 바로는, 상대적으로 큰 직경(예를 들면, 0.79㎛)의 라텍스 입자들을 단순 흡착이나 브롬화시아노겐 또는 수산화라텍스와 공유결합시킴으로써 분석적 반응물, 예를 들면 알레르겐으로 코팅시켰다. 이들 입자의 현탁액을 알레르기 반응을 갖는 것으로 생각되는 사람으로부터 얻은 혈청과 혼합한다. 이 혼합물을 배양하고 상대적으로 작은 직경(예를 들면, 0.08㎛)의 라텍스 입자들을 첨가한다. 이들 작은 입자들을 토끼 항-IgE 항체로 코팅하고 만약 큰 입자들이 알레르겐에 결합된 IgE를 갖으면 작은 입자들은 이들 항체에 결합할 것이며 응집반응에 의해 소위 응집 입자, 즉 서너개의 작은 입자들로 둘러쌓인 큰 입자를 형성할 것이다. 그러나 이들 입자들은 비공유결합을 통해 서로 결합되고 응집은 결과적으로 일어나며 관심있는 검체가 존재하다는 결과이다. 대조적으로, 본 발명품은 관심있는 검체의 검출 전에 형성되는 것이 필요하다.
본 발명의 약품이 마슨 등 및 다른 유사한 선행기술에 의해 개시된 기존의 응집 입자과 유사한 것으로 보일수도 있겠지만, 그들은 본 발명과 특허적으로 별개의 것이며, 이는 입자 대 입자의 결합의 연속적인 순서가 라디칼적으로 비유사하기 때문이다. 응집 분석의 목적 및 검출의 방법 또한 철저히 다르다. 그러므로 입자 응집 방법 및 조성과 관련된 선행기술의 개시는 총체적으로 본 발명과 전혀 관련이 없다.
본 명세서에 인용된 참고문헌은 선행기술이 아니다. 모든 참고문헌은 참고로 여기에 기재하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 형광적으로 착색된 하나 이상의 나노입자 집단을 그의 표면상에서 수송하는 마이크로입자를 포함하는 새로운 물품을 제공한다. 주어진 집단의 모든 나노구체들을 동일 농도의 염료로 염색하고, 기지량의 이들 나노구체들을 다른 염료들로 착색된 기지량의 다른 나노입자와 함께, 마이크로입자에 결합시키면, 다중 형광 마이크로 구체가 나타난다. 나노구체의 다른 집단의 양과 비를 변화시킴으로써, 독특한 방출 스펙트럼들을 갖는 다수의 담체 입자들의 별개 집단들을 확인하고 구별할 수 있다. 이 담체 입자들은 추가적 색채나 시그널을 제공하기 위하여 또한 착색될 수 있다.
본 발명에서 담체 또는 코어 입자들로서 사용된 중합체 마이크로입자들은 1 mm보다 작은 직경, 바람직하게는 약 0.1∼1,000㎛의 직경 범위의 크기를 갖는다. 마이크로입자는 어떤 크기도 될 수 있지만, 바람직한 크기는 1∼100㎛이며, 더욱 바람직하게는 2∼50㎛, 보다 더 바람직하게는 3∼25㎛이며, 더욱 더 바람직하게는 약 6∼12㎛이다.
나노입자의 바람직한 크기는 직경이 약 1∼100,000nm의 범위이다. 가장 바람직한 직경은 약 10∼1,000nm, 바람직하게는 100∼800nm, 더욱 바람직하게는 200∼500nm이다.
본 발명의 또 다른 목적은 담체 입자뿐만 아니라 나노구체를 제공하는 것이며, 이들은 중합체 물질, 즉 폴리스티렌으로 만들어지는 것이 바람직하다. 그러나, 중합체 물질들로는 브롬화폴리스티렌, 폴리아크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아 미드, 폴리아크릴아미드, 폴리아크로레인, 폴리부타디엔, 폴리카프로락톤, 폴리카본네이트, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리이소프렌, 폴리우레탄, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐벤질클로라이드, 폴리비닐톨루엔, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리비닐벤젠, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리액티드, 폴리글리콜리드, 폴리(락티드-co-글리콜리드), 폴리언하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리포소파즈, 폴리술폰, 또는 이들의 조성물들을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 탄수화물, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 한천, 겔, 단백질성 중합체, 폴리펩타이드, 진핵 및 원핵 세포, 바이러스, 지질, 금속, 수지, 라텍스, 고무, 실리콘, 예를 들면 폴리디메틸디페닐 실록산, 유리, 세라믹, 숯, 카올리나이트, 벤토나이트 등과 같은 다른 중합체 물질이 동등하게 사용될 수 있다.
이들 중합체들은 또한 자석 또는 초상자성, 상자성, 또는 강자성 금속 산화물로 이루어진 군으로부터 선택된 자성적으로 반응성인 금속 산화물을 통합시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 디비닐벤젠, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸롤프로판 트리메타크릴레이트, 또는 N,N'메틸렌-비스-아크릴아미드와 같은 가교제 또는 선행기술에서 알려진 기능적으로 등가 시약을 약 0%∼50%(중량/중량)을 함유하는 입자들을 제공하는 것이다. 바람직한 실시예로, 나노구체뿐만 아니라 코어 마이크로구체도 폴리스티렌으로 만들고, 약 0%∼30%의 디비닐벤젠을 함유한 다.
본 발명의 또 다른 목적은 카르복실레이트, 에스테르, 알코올, 카르바미드, 알데히드, 아민, 황 산화물, 질소 산화물, 할로겐화물과 같은 추가적인 표면 관능기를 함유할 수 있는 입자들을 제공하는 것이며, 이들은 분석 반응물 및/또는 입자-입자 결합의 결합을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 공유 결합 또는 다른 알려진 결합 수단, 예를 들면, 이온 결합, 수소결합에 의하거나, 또는 단순한 흡착에 의해 마이크로입자들을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 결합의 다른 방법으로는 흡착에 의한 결합 후, 본 발명품을 중합체 외각으로 감싸는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 형광염료인 염료들을 제공하는 것이다. 바람직하게는 이러한 염료는 소수성이며, 중합 입자들을 착색할 수 있다. 바람직한 염료들은 시아닌 염료이다. 항체와 같은 시약을 표지하거나 검출하기 위하여 플루오레세인(FITC)과 같은 친수성 염료를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 자외선 또는 가시광선의 파장에서 광방출 염료를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 적외선 또는 근적외선 영역에서 형광을 발하는 염료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약 450nm, 바람직하게는 약 480nm, 더욱 바람직하게는 500 nm보다 더 큰 파장에서 광을 방출하는 염료를 제공하는 것이다. 바람직한 염료로서는 폴리메틴 시아닌류 또는 스쿠아레인류이며, 이들은 약 500nm∼1000nm의 영역에서 파장을 갖는 형광을 방출한다. 바람직하게는 1 이상의 염료가 한 집단 이 상의 나노구체를 착색하는 데 사용될 때, 이들 염료들은 그들이 실질적으로 다른 방출 스펙트럼, 바람직하게는 10nm보다 더 크게 분리된 방출 정점, 더욱 바람직하게는 25nm보다 더 크게 분리된 방출 정점, 보다 더 바람직하게는 50nm보다 더 크게 분리된 것을 갖도록 선택된다. 염료들은 상업적으로 입수할 수 있는 필터에 맞는 여기 밴드를 갖거나 몇개의 여기 및 방출 밴드를 갖는 다중 형광체를 검출하도록 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 선행기술에서 알려진 각종 진단, 분석 및 산업적 응용을 위하여 이들 입자들을 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 검체의 검출에 사용하기에 적당한 장치를 제공하는 것이다. 바람직하게는 이 장치는 별개의 형광 시그널을 갖는 부착된 나노입자들을 갖는 마이크로입자 세트와, 검체들 중 하나와 특이적으로 결합할 수 있는 분석적 반응물을 포함한다. 이 장치는 또한 분석 시약과 동일한 검체에 결합하는 시약을 포함하는 2차 시약을 포함하며, 또한 이 장치는 형광 표지, 경쟁 분자, 대조 물질 및 세척 완충제, 필요한 플라스틱 웨어와 같이 표준 시약으로서 허용되는 다른 성분들을 포함할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 여러 가지 검체, 즉 좀 더 넓은 의미로 항원, 항체(모노클론 및 폴리클론), 수용체, 헵텐, 효소, 단백질, 펩티드, 핵산, 약물, 호르몬, 화학물질, 중합체, 병원체, 독소 또는 그의 조합물을 검출 분석하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 다색 입자들을 사용하는 샘플중의 검체의 다중 하부집단들을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 본 발명의 다른 목적들에 따라서, 샘플내에서 검체의 양상이나 부분을 검출, 차별화, 분류, 정량 및/또는 분석하는 바람직한 방법은 플로우 세포계측법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시각 검사, 디지털(CCD) 카메라, 비디오 카메라, 사진 필름; 또는 레이저 스캐닝 장치, 형광계, 광도계, 포토다이오드, 양자 계수기, 판독기(plate reader), 오피플루오로센(opifluorescence) 현미경, 스캐닝 현미경, 다초점 현미경(confocal microscopes), 모세관 전기영동 검출기와 같은 현재 사용되는 장치의 사용; 또는 광전 배증관 튜브와 같이 시그널을 증폭하는 다른 수단 또는 존재, 위치, 강도, 여기 및 방출 스펙트럼, 형광 편광, 형광 수명, 및 형광 시그널의 다른 물리적 성질을 검출할 수 있는 다른 광 검출기를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 검출 및 분석을 위한 다른 수단을 제공하는 것이다.
본 발명 특별한 구현예에서, 1차 직경을 갖는 마이크로입자와 첫 번째 직경보다 작은 2차 직경을 갖는 비드에 부착된 다수의 나노입자를 포함하는 물품을 제공한다. 본 발명의 구현예에서, 만일 소정 농도가 0∼최고값의 범위에 있을 수 있으면, 마이크로입자, 적어도 한 부분 이상의 나노입자 또는 둘 다 모두는 소정 농도의 적어도 한가지 타입 이상의 표지분자들을 가지며, 이 표지 분자들은 본 물품을, 다른 소정 농도의 적어도 한가지 타입 이상의 표지분자, 소정 농도의 하나 이상의 다른 타입의 표지 분자 또는 둘 모두를 갖는 다른 물품으로부터 구별하는데 효과적이다. 바람직한 구현예에서, 소정 농도는 얼마간의 0이 아닌값에서 최고값의 범위이다. 최고값은 다수의 인자들에 의해 결정되는데, 이 인자들에는 주어진 형태 의 표지 분자의 물리적 및 화학적 특징이 포함되며, 어떤 특성들은 마이크로입자, 나노입자 또는 둘 다에 도입되고, 결합되고 또는 통합될 수 있는 표지 분자의 농도의 상한을 제한할 수도 있다. 표지 분자가 형광 염료를 포함하는 경우에, 예를 들면 최고값에 효과적인 농도를 결정할 수 있는 염료의 특징 중 하나는 용해도 또는 흡착 및/또는 방출 특징을 포함하는 스펙트럼 성질이다. 변형 구현예에서, 최고값은 마이크로입자 또는 나노입자의 표면 또는 허용가능한 내부에서의 표지 분자의 포화점에 근접하거나 실질적으로 동등한 값이다.
본 발명의 좀더 바람직한 구현예에서 마이크로입자에 부착된 다수의 나노입자의 수 또는 양 또한 기결정된다. 게다가, 어떤 경우에는, 다수의 나노입자들이 마이크로입자에 공유결합적으로 부착된다.
본 발명의 다른 목적은 여기에 개시된 것을 고려하면 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명을 개시하고 설명하기 전에, 본 발명은 여기 개시된 특정 공정 단계 및 물질에 한정되지 않으며 공정 단계 및 물질 그 자체는 다소 변경될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 여기에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로만 사용되었으며 본 발명의 범위는 단지 첨부된 특허청구범위 및 그의 동등물에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하고자 의도된 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 것처럼, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 그 내용이 명백히 다른 것을 규정하지 않는다면 복수의 지시물을 포함한다. 그러므로, 예를 들면 "a 염료"로 "a 입자"를 착색하는 방법을 참고하면 이는 하나 이상의 염료 및 하나 이상의 입자의 혼합물을 포함할 수도 있다.
입 자
담체 마이크로입자들에 결합된 형광 중합체 나노구체를 설명한다. 나노구체들의 염료 양을 변화시켜 형광적으로 구별가능한 입자 세트를 얻는다. 마이크로입자에 결합된 나노구체의 바람직한 수, 및 담체 입자의 표면에서 다르게 염색된 나노구체들의 비는 특별한 목적에 따라 선택된다.
본 발명에서 사용된 나노구체는 약 10nm ∼ 약 100,000nm 직경 범위의 크기로 상업적으로 입수할 수 있다. 가장 바람직한 직경은 약 10∼1,000nm, 바람직하게는 200∼500nm이다. 본 발명에서 나노구체가 결합된 담체 입자로 사용된 중합체 마이크로구체는 보통은 0.01∼1000㎛의 직경 범위에 있다. 마이크로입자는 어떤 크기라도 가능하지만, 바람직한 크기는 0.1∼500㎛, 더욱 바람직하게는 1∼200㎛ 및 보다 더 바람직하게는 2∼12㎛이다. 입자들은 균일(대략 동일한 크기)하거나 또는 다른 크기일 수 있으며 그러한 차이들은 광 산란 또는 광 굴절과 같은 크기 결정 성질에 의해 결정될 수 있다.
입자들은 어떠한 규칙적인 형상 물질로도 만들어진다. 바람직한 형상은 구형이나; 다른 형상의 입자들이 사용될 수 있으며, 이는 이 매개변수가 본 발명의 성질에 중요하지 않기 때문이다. 입자의 형상은 추가적인 식별 매개변수로서 작용할 수 있으며, 이는 플로우 세포계측법, 예를 들면 높은 분해능 슬릿-스캐닝 방법에 의해 식별된다.
통상 담체 입자뿐만 아니라 나노구체들은 폴리스티렌 또는 라텍스와 같은 동일 물질로 만들어진다. 그러나, 다른 중합 물질이 사용될 수 있으며, 그의 예로서는 탄화수소 중합체, 폴리지방족 알코올, 폴리(비닐)중합체, 폴리아크릴산, 폴리유기산, 폴리아미노산, 공중합체, 블록 공중합체, tert-중합체, 폴리에테르, 천연 생산 중합체, 폴리이미드, 계면활성제, 폴리에스테르, 가지 중합체, 시클로-중합체, 폴리알데히드 및 그의 혼합물로 이루어진 화학물의 군으로부터 선택된 중합체들 들 수 있다. 좀더 상세하게는, 브롬화폴리스티렌, 폴리아크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아크릴아미드, 폴리아크로레인, 폴리부타디엔, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리이소프렌, 폴리우레탄, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐벤질클로라이드, 폴리비닐톨루엔, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리비닐벤젠, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리액타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리언하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리포소파즈, 또는 이들의 조합물들이 바람직하다. 중합체 입자들로 구성된 대표적인 결합 중합체로는 예를 들면 폴리-(스티렌-코-비닐벤질 클로라이드-코-아크릴산)(85:10:5 몰 비), 폴리(스티렌-코-아크릴산)(99:1 몰비), 폴리(스티렌-코-메타크릴산)(90:10 몰비), 폴리(스티렌-코-부틸아크릴레이트-코메타크릴산)(89:10:1 몰비), 폴리-(스티렌-코-2-카르복시에틸 아크릴레이트)(90:10 몰비), 폴리(메틸 메타크릴레이트 -코-아크릴산) (70:30 몰비) 및 폴리(스티렌-코-부틸 아크릴레이트-코-메타크릴레이트-코-아크릴산)(45:45:10 몰비)를 포함한다. 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트 또는 라텍스와 같은 합성 중합체로부터 형성된 대부분의 비드들은 현재 바이오-라드 실험실(Bio-Rad Laboratories; 리치몬드, 캘리포니아) 및 LKB 제조사(스톡홀름, 스웨덴)과 같은 수많은 곳로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 아가로우스, 가교 아가로오스, 글로불린, 데옥시리보스 핵산, 및 리포좀과 같이 자연적 맥크로분자 및 입자들로부터 형성된 비드는 바이오-라드 래보러토리즈, 파마시아(Bio-Rad laboratories, Pharmacia; Piscataway, NJ) 및 IBF(프랑스)와 같은 곳으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 폴리아크릴아미드 및 아가로오스의 공중합체로부터 형성된 비드는 IBF 및 파마시아와 같은 곳으로부터 입수할 수 있다.
이들 중합체들은 또한 자석, 또는 초상자성, 상자성 또는 강자성 금속 산화물로 이루어진 군으로부터 선택된 자성적으로 반응성인 금속 산화물을 배합할 수도 있다. 자성 비드들은 다이널 주식회사(Dynal Inc.; 그레이트 넥, NY)와 같은 곳에서 상업적으로 입수하거나 또는 공지의 방법, 예를 들면 미국 특허 번호 제4,358,388호, 제4,654,267호, 제4,774,265호, 제5,320,944호, 제5,356,713호에 개시된 것과 같은 방법에 준하여 제조할 수 있다.
탄수화물, 예를 들면 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 단백질 중합체, 폴리펩티드, 진핵 및 원핵 세포, 바이러스, 지질, 금속, 수지, 고무, 규토, 실리콘, 예를 들면, 폴리디메틸디페닐 실록산, 유리, 세라믹 등과 같은 다른 물질들이 동일하게 사용될 수 있다.
나노입자들은 바람직하게는 마이크로입자와 같은 물질로 만들어진다. 그러나, 필요에 따라, 이들은 다른 물질로 만들어질 수 있다. 본 명세서에서 마이크로입자 및 나노입자들을 구성하는 중합체 종류에 이용된 것으로써 "첫 번째" 및 "두 번째"라는 용어는 단지 확인을 목적으로 사용된 것이며 어떠한 우선 순위를 나타낸 것은 아니다.
마이크로구체는 또한 디비닐벤젠, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸롤프로판 트리메타크릴레이트 또는 N,N'메틸렌-비스-아크릴아미드와 같은 가교제 또는 기존의 기능적으로 동등한 다른 시약을 대략 0%∼50% 포함하는 것이다. 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 탄수화물 중합체의 가교는 아디프산, 세바신산, 숙신산, 시트르산, 1,2,3,4-부탄테트라카르복실산 또는 1,10-데칸디카르복실산으로 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 코어 마이크로구체 및 나노구체는 폴리스티렌으로 만들어지고 약 0%∼30%의 디비닐벤젠을 함유한다.
입자들은 부착 및 결합을 용이하게 하기 위하여 추가적으로 표면 관능기를 가질 수도 있다. 이들 기들은 카르복실레이트, 에스테르, 알코올, 카르바미드, 알데히드, 아민, 황 산화물, 질소 산화물, 또는 할로겐화물을 포함할 수도 있다. 카르복실화된 라텍스 입자들은, 예를 들면 미국 특허 번호 제 4,181,638호에 기술된 바와 같이, 진단시약의 제조용으로 사용되어 왔다. 여기에 기술된 것처럼, 표면 카르복실기를 갖는 입자에 면역학적 반응성 종을 공유 결합적으로 부착시키는 종래 방법은 수용성 카보디이미드를 사용하는 것을 포함한다. 많은 실질적인 응용에서 중합체 입자들은 반응성 아민- 또는 술피드릴- 함유 화합물의 부착에 이용할 수 있는 표면 카르복실기를 갖는 것이 중요하다. 그러한 기는 그러한 기들를 포함하는 단량체를 중합체(예를 들면, 아크릴산, 메타크릴산, 이타콘산 등)에 결합시킴으로써, 입자에 첨가하는 것이 바람직하다. 선택적으로 그들은 카르복실기로 전환될 수 있는 다른 전구적 반응기를 갖는 중합체의 또 다른 화학 반응(예를 들면, 말레인산 무수물과 같은 무수물의 가수분해, 또는 표면 메티올 또는 알데히드 말단기의 산화)에 의해 입자에 첨가될 수 있다. 디아민, 디히드라지드, 메르캅토알킬아민 및 디메르캅탄 등의 화합물은 약물, 효소 또는 나노구체와 같은 다른 반응성 종류들의 추후 부착을 위한 연결 잔부로 사용될 수 있다. 바람직한 부착 또는 결합 방법은 공유결합이지만 흡착과 같은 다른 방법들이 동등하게 사용될 수 있다. 마이크로입자-나노입자 복합체를 중합 외각으로 감싸는 것과 같은 다른 새로운 방법이 또한 허용될 수 있다.
염 료
본 발명에서 사용된 형광 염료들은 550nm와 900nm 사이의 방출 파장을 갖는 시아닌 염료로 알려진 일반적 종류의 것이다. 이들 염료는 메틴기를 포함할 수도 있으며, 이들의 수는 염료의 스펙트럼 성질에 영향을 미친다. 피리딘류인 모노메틴 염료는 전형적으로 청색에서 청녹색의 형광 방출을 갖는 반면, 퀴놀린류는 녹색에서 황녹색 형광 방출을 갖는다. 트리메틴 염료 유사물은 실질적으로 적색 파장쪽으로 시프트되고, 펜타메틴 염료는 훨씬 많이 시프트되어 때때로 적외선 형광 방출을 나타낸다(예를 들면 미국 특허 제5,760,201호를 참조).
그러나, 유기 용매에 용해가능한 염료라면 어떤 것도 사용될 수 있다. 스쿠아르산(squaric acid)계 형광 염료는 문헌에 기술된 방법으로 합성될 수 있다. 예를 들면, Sprenger et al. Angew, Chem., 79,581(1967); Angew, Chem., 80,541(1968); 및 Marks et al., Angew Chem. Intern. Edit., 5, 888(1966)에 준하여 합성할 수 있다. 또한, 비대칭 치환 스쿠아르산 화합물은 Law et al., J. Org. Chem. 57,3278,(1992)에 기재된 것에 준하여 합성될 수 있다. 이들 염료를 제조하는 구체적인 방법은 당분야에 공지이며, 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,795,981호; 제5,656,750호; 제5,492,795호; 제4,677,045호; 제5,237,498호; 및 5,354,873호를 들 수 있다. 상기 기술된 형광 염료, 예를 들면, 프탈로시아닌, 2,3-나프탈로시아닌, 스쿠아레인(squaraine) 및 크로콘산 유도체를 실질적으로 사용하는 것이 Krutak 등의 미국 특허 제5,525,516호에 개시되어 있다.
바람직한 구현예에 사용된 현광 염료외에 관련된 염료들은 시클로부텐디온 유도체, 치환 세팔로스포린 화합물, 플루오르화된 스쿠아레인 화합물, 대칭 및 비대칭 스쿠아레인, 알킬알콕시 스쿠아레인 또는 스쿠아리륨(squarylium) 화합물로부터 선택될 수 있다. 이들 염료의 일부는 약 1,000nm까지 방출 스펙트럼 범위가 효과적으로 팽창될 적외선 파장뿐만 아니라 근적외선에서도 형광을 발할 수 있다. 스쿠아레인, 즉 스쿠아르산으로부터 유도된 스쿠아레인외에, 프탈로시아닌 및 나프탈로시아닌과 같은 소수성 염료는 좀더 긴 파장에서 작동하도록 또한 선택될 수 있다. 형광색소의 다른 종류들은 본 발명에 따른 염료로서 사용되기에 적당하다. 이들 염료중 일부는 여기에 기재한다; 3-하이드록시피렌 5,8,10-트리술폰산, 5-하이드록시 트립타민, 5-하이드록시 트립타민(5-HT), 산 퓨신(Acid Fuhsin), 아크리딘 오렌지, 아크리딘 레드, 아크리딘 엘로우, 아크리플라빈, AFA(아크리플라빈 포일겔 SITSA), 알리카린 컴플렉손(Alizarin Complexon), 알리자린 레드, 알로피코시아닌, ACMA, 아미노액티노마이신 D, 아미노쿠마린, 안트로일 스테아레이트(Anthroyl stearate), 아릴- 또는 헤테로아릴-치환 폴리올레핀, 아스트라존, 브릴리언트 레드 4G, 아스트라존 오렌지 R, 아스트라존 레드 6B, 아스트라존 엘로우 7 GLL, 아타브린(Atabrine), 오라민(Auramine), 오로포스핀(Aurophosphine), 오로포스핀 G, BAO 9(비스아미노페닐옥사디아졸), BCECF, 베르베린 술페이트, 비스벤즈아미드, BOBO 1, 블랑코포 FFG 용액(Blancophor FFG solution), 블랑코포 SV, 보디피 FI(Bodipy F1), BOPRO 1, 브릴리언트 술포플라빈 FF, 칼시엔 블루, 칼슘 그린, 칼코플루오르(Calcofluor) RW 용액, 칼코플루오르 화이트, 칼코포 화이트 ABT 용액, 칼코포 화이트 표준 용액, 카르보시아닌, 카르보스티릴, 캐스캐이드 블루, 캐스캐이드 엘로우, 카테콜아민(Catecholamine), 키나크린, 코리포스핀 O, 쿠마린, 쿠마린-팔로이딘, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, 댄스(1-디메틸 아미노 나팔린 5 술폰산), 단사(디아미노 나프틸 술폰산), 댄실 NH-CH3, DAPL, 디아미노 페닐 옥시디아졸(DAO), 디메닐아미노-5-술폰산, 디피로메덴보론 디플루오라이드, 디페닐 브릴리언트 플라빈 7GFF, 도파민, 데오신, 에오신, 에리토신 ITC, 브롬화에티듐, 유크리신(euchrysin), FIF(포름알데히드 유도 형광), 플라조 오렌지, 플루오 3, 플루오레스아민(fluorescamine), 푸라-2(Fura-2), 겐아크릴 브릴리언트 레드 B, 겐아크릴 브릴리언트 엘로우 10GF, 겐아크릴 핑크 3G, 겐아크릴 엘로우 5GF, 글록살산, 그랜뉴얼(granular) 블루, 해마토포르피린(Haematoporphyrin), 훽스트 33258, 인도-1, 인트라화이트 Cf 리퀴드, 루코포 PAF(Leucophor PAF), 루코포 SF, 루코포 WS, 리스사민 로다민 B200(Lissamine Rhodamine B200; RD200), 루시퍼 엘로우 CH, 루시퍼 엘로우 VS, 막달라 레드, 마리나 블루, 맥실론 브릴리언트 플라빈 10 GFF, 맥실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF, MPS(메틸 그린 피로닌 스틸벤), 미트라마이신, NBD 아민, 닐 레드, 니트로벤족사디돌, 노라드레날린, 뉴클레어 패스트 레드, 뉴클레어 엘로우, 나일로산 브릴리언트 플라빈 E8G(Nylonsan Brilliant Flavin E8G), 오레곤 그린, 옥사진, 옥사졸, 옥사디아졸, 퍼시픽 블루, 파라로산린(포일겐), 포르화이트 AR 용액, 포르화이트 BKL, 포르화이트 Rev, 포르화이트 RPA, 포스핀 3R, 프탈로시아닌, 피코크리트린 R, 폴리아자인다센 폰토크롬 블루 블랙(Polyazaindacene Pontochrome Blue Black), 포피린, 프리뮬린(Primuline), 프로시온 엘로우, 요오드화프로피듐, 피로닌, 피로닌 B, 피로잘 브릴리언트 플라빈 7GF, 퀸아크린 머스타드, 로다민 123, 로다민 5 GLD, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 B 200, 로다민 B 엑스트라, 로다민 BB, 로다민 BG, 로다민 WT, 로즈 벤갈, 세로토닌, 세브론 브릴리언트 레드 2B, 세브론 브릴리언트 레드 4G, 세브론 브릴리언트 레드 B, 세브론 오렌지, 세브론 엘로우 L, SITS(프리뮬린), SITS(스티벤 아이소티오술폰산; Stilbene Isothiosulphonic acid), 스티벤, 스나프 1, 술포 로다민 B 캔 C, 술포 로다민 G 엑스트라, 테트라시클린, 텍사스 레드, 티아진 레드 R, 티오플라빈 S, 티오플라빈 TCN, 티오플라빈 5, 티올라이트(Thiolyte), 티오졸 오렌지, 티노폴 CBS, TOTO1, TOTO 3, 트루 블루, 울트라라이트, 우라민 B(Uramine B), 우비텍스 SFC, 크실렌 오렌지, XRITC, YO PRO 1 또는 그의 결합물. 선택적으로 그러한 염료들은 활성화된 에스테르, 이소티오시아네이트, 아민, 히드라진, 할라이드, 산, 아지드, 말레이미드, 알코올, 아크릴아미드, 할로아세트아미드, 페놀, 티올, 산, 알데히드 및 케톤을 포함하는 중합체또는 유생 분자에서 전형적으로 발견된 관능기들을 갖는 안정한 형광 생성물을 형성할 수 있는 관능기를 포함할 것이다.
당업자는 소수성 성질뿐만 아니라 방출 및 흡착 성질을 원하기만 하면 그러한 염료중에서 어떤 것이 적당한지는 잘 알 것이다. 형광 염료의 스펙트럼 성질은 여기 파장과 강도면에서 플루오레세인 또는 로다민 유도체와 충분히 유사하여야만 동일한 플로우 세포계측 장치를 사용할 수 있다. 그러나 이 염료들이 유기 용매에서 좀 더 높은 용해도를 갖고 개선된 광안정성 및 양자 산출량을 갖는 것이 바람직하다.
좀 더 바람직하게는 이 염료들은 동일하거나 중첩되는 여기 스펙트럼을 가지나, 구별되는 방출 스펙트럼을 갖는다. 고체 상태 검출기, 광전배증관 튜브, 사진 필름 또는 눈을 포함하여, 어떠한 검출 시스템도 두 개의 염료 사이의 스펙트럼 특징의 차이를 검출하는데 사용될 수 있으며, 그중 어떤 것은 분광계, 광도계 현미경, 판독기, 형광 스캐너, 플로우 세포계측기 또는 그의 결합과 같은 추가적 장치를 결합시켜 사용하여 검출 시스템을 완성할 수도 있다. 염료들은 그들이 실질적으로 다른 스펙트럼, 바람직하게는 10nm보다 더 크게 분리된 방출 정점, 더욱 바람직하게는 25nm보다 더 크게 분리된 방출 정점, 보다 더 바람직하게는 50nm보다 더 크게 분리된 방출 정점을 갖는 것으로 선택되는 것이 바람직하다. 두 개의 염료 사이의 차별화가 시각 검사로 이루어질 때, 두 개의 염료들은 시각적 식별을 높이기 위하여 인지할 수 있는 다른 색채의 방출 파장을 갖는 것이 바람직하다. 기계적 방법을 사용하여 두 개의 염료 사이를 차별화하는 것이 바람직할 때, 다양한 필터와 회절 격자는 각각의 방출 정점을 독립적을 검출할 수 있게 한다. 두 개의 염료가 유사 정점을 갖는 것으로 선택될 때, 기계적 식별력은 두 개 염료의 스펙트럼이 유사한 융합된 진폭, 유사한 밴드폭을 갖도록 확실히 함으로써 증가될 수 있으며, 기계적 시스템의 최적 처리량은 두 개의 염료의 방출 범위를 가로지르는 것과 동등하다. 기계적 식별력은 또한 넓은 밴드폭보다는 좁은 밴드폭을 갖는 염료를 선택함으로써 증가될 수 있으나, 그러한 염료들은 필연적으로 높은 진폭 방출을 가져야만 하거나 또는 통합된 시그널 강도의 손실이 시그널 검출에 불리하지 않을 정도로 충분한 농도로 존재하여야만 한다.
착색 과정
본 기술은 당업자가 독특한 형광 특징을 갖는 일련의 다색의 형광입자들을 만들고 다수 검체의 다중매개변수 분석에 그러한 입자들을 사용할 수 있게 하는 기술이 개시된다. 이 기술에 따라 마이크로입자 및 나노입자들 모두 별개의 염료로 형광 착색될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 나노입자들은 착색되고 보다 더 바람직하게는 하나 이상의 나노입자 세트가 제조되는데 이것은 하나 이상의 별개의 형광 염료로 착색된다. 중합체 입자의 형광 착색은 당업자에 친숙한 어떠한 기술로도 할 수 있다. 형광 입자를 만드는 세 개의 별개 수단이 선행 기술에 개시되었으며, 여기에는; (i)입자 표면상에 염료를 공유결합적으로 부착, (ii)입자 중합화 동안 염료의 내부 결합, 및 (iii) 입자가 이미 중합화 된 후에 염색,
(i) 미국 특허 번호 제5,194,300호 정(Cheung); 제4,774,189호 스와르츠는, 예를 들어 1 이상의 형광 염료를 그의 표면에 공유 결합으로 부착함으로써 코팅된 형광 마이크로구체를 개시하였다.
(ii) 미국 특허 번호 제5,073,498호 스와르츠; 제 4,717,655 호 풀윌러(Fulwyler)는 입자 중합중에 첨가된 형광 염료를 개시하였다.
(iii) 세번째 방법, 즉 입자가 중합된 후 내부적으로 염료를 파묻거나 방산하는 방법의 원리는 원래 엘. 비. 뱅(Uniform Latex Particle; Seragen Diagnostics Inc. 1984, p. 40)에 의해 기술되었다. 호글랜드(haugland)등에게 발행된 미국 특허 번호 제5,723,218호는 본질적으로 뱅의 방법과 유사한 방법을 사용하여, 하나 이상의 디피로메텐보론 디플루오라이드 염료로 마이크로입자들을 염색하는 것을 장황하게 개시하였다. 상기 방법들을 결합하는 것 또한 가능하며, 이들 예를 설명하나 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 그러한 기술중 하나를 여기에 설명한다:
나노구체의 1% w/w 용액(300nm 직경 폴리스티렌, 아미노 기능화)을 환저 플라스크에서 교반한다. 여기에 클로로포름과 같은 유기 용매의 염료 용액을 첨가한다. 이 염료 용액이 더 이상 나노구체에 흡착되지 않을 때 염료의 첨가를 중지하고 용매를 감압하에서 제거한다.
다른 구현예에서는, 두 개의 형광 염료, 예를 들면 1,3-비스[(1,3-디하이드로-1,3,3,-트리메틸-2H-인돌-2-일리덴)메틸]-2,4-디하이드록시-시클로부텐디일륨, 비스(내부염)인 레드 스쿠아레인 염료 및 2-(3,5-디메틸피롤-2-일)-4-(3,5-디메틸-2H-피롤-2-일리덴)-3-하이드록시-2-시클로부텐-1-온인 오렌지 스쿠아레인이 사용된다. 이들 염료는 두 개의 별개의 나노구체 집단을 착색하기 위하여 사용된다. 선택적으로, 나노구체의 한 집단과 담체 마이크로구체가 착색된다. 다른 대안으로서, 두 개의 염료가 주어진 집단의 동일 입자내에서 다른 비로 결합된다.
개개 염료로 하는 최적의 착색은 평가된 성질뿐만 아니라 개개 염료 또는 중합체 물질의 물리적 화학적 성질 및 염료 매체에 달려있다. 배양 기간은 원하는 결과, 염료 및 입자의 농도 및 반응 조건에 따라 광범위하게 변화할 수도 있다. 최적 기간은 염료로 인한 다른 모든 불필요한 형광 시그널 모두를 최소화하고 전 기간에 걸쳐 염료의 분해를 피하면서 가장 높은 특정 시그널을 얻기 위하여 사용된 농도에서 통상 염색을 위해 필요한 최소 기간이다.
총 염료량은 입자 중량에 대해 약 0.00001∼15 중량 %이다. 이 제한은 그러나 상기 염료로 가득찬 입자가 안정하고 의도한 목적에 적당한한 본 발명에 별로 중요하지 않다.
양쪽 염료 모두 동일한 흡착 파장, 예를 들면 자외선에서 약 800nm까지의 범위에서 여기되는 것이 바람직하며, 두 개의 구별된, 본질적으로 각각 서로 적어도 10nm, 바람직하게는 30nm, 보다 더 바람직하게는 적어도 50nm가 분리된 겹치지 않은 파장에서 형광을 방출하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 염료 #1의 방출 피크는 585nm에서이고, 염료 #2의 방출 피크는 630nm에서이다.
선택적으로, 본 발명의 염료는 문제의 염료와 결합하여 사용되기를 바라는 다른 시약의 것과는 다른 검출가능한 반응을 나타내기 위하여 선택된다. 예를 들면 600nm 밖에서 여기하는 복합체를 형성하는 염료들은 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 피코크리트린으로 표지된 것과 같은 통상 사용된 형광 항체와 결합되어 사용될 수 있다.
어떠한 플루오레세인 검출 시스템(시각 검사를 포함)도 민감도의 정도를 차별화하여, 염료들 사이의 스펙트럼 성질의 차이를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러한 차이는 여기 정점의 차이, 방출 정점의 차이, 형광 수명의 차이, 동일 여기 파장 또는 다른 파장에서 형광 방출 강도의 차이, 흡착도의 차이, 형광 편광의 차이, 목적물질과 결합시 형광성 증진의 차이, 또는 그의 결합들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 검출 가능하게 다른 염료는 다른 스펙트럼 성질 및 다른 선택성을 갖는 본 발명의 염료중 하나이다. 본 발명의 한 태양에서, 염료-입자 복합체 및 추가적 검출시약은 동일하거나 겹쳐진 여기 스펙트럼을 가지나, 시각적으로 다른 방출 스펙트럼, 일반적으로 >10nm, 바람직하게는 >20nm, 더욱 바람직하게는 >50nm에 의해 분리된 방출 정점을 갖는다. 모든 형광 시약의 동시적 여기는 각 시약에 대해 차선적이지만 시약들의 결합에 대해서는 최적인 파장에서 샘플의 여기를 요구할 수도 있다. 선택적으로, 추가 시약은 문제염료를 여기하는데 사용된 것과는 다른 파장에서 동시에 또는 연속적으로 여기될 수 있다. 또 다른 변형에서, 하나 이상의 추가 시약을 사용하여 염료 방출을 억제하거나 부분적으로 억제한다.
바람직한 구현예에서, 염소화된 용매, 보다 바람직하게는 클로로포름이 사용되어 염료를 용해한다. 그러나, 적당한 용매는 관심있는 특정 종류의 소수성 염료를 용해할 수 있는 능력을 기초로 선택된다. 이 용매들로는 아실, 지방족, 지환족, 방향족, 또는 복소환 탄화수소일 수 있으며; 용매들은 말단기 또는 환이나 사슬의 인티그럴 부분에 할로겐, 산소, 황, 질소 및/또는 인을 갖거나 갖지 않을 수도 있다. 구체적으로, 알코올, 에틸아세테이트, 톨루엔, 크실렌, 헥산, 펜탄, 벤젠, 에테르, 아세톤, 오일 사염화탄소, 이황화탄소, DMSO 또는 메틸렌클로라이드와 같은 용매들이 사용될 수 있다. 선행기술에서 알려진 다른 용매들이 사용될 수 있으며 머크 인덱스(11판, MISC-63∼68 참조)에 기재된 여러 용매들 중에서 선택될 수도 있다.
제조된 염색된 나노구체들은 카르보디이미드 결합(이하, 참고)과 같이 잘 알려진 결합 반응 어느 것으로도 염색되거나 염색되지 않은 마이크로입자들에 결합될 수도 있다. 카르복실레이트, 에스테르, 알코올, 카르바미드, 알데히드, 아민, 황 산화물, 질소 산화물 또는 할라이드를 사용하는 다른 결합 방법들이 또한 선행기술에서 잘 알려진 방법에 의해 사용될 수 있다.
본 발명품을 사용하는 방법
본 발명은 다중 형광 시그널을 갖는 하나 이상의 나노입자들을 운송하는 담체 마이크로 입자를 포함하는 형광 중합체 물품을 제공한다. 선택적으로, 본 발명의 담체 마이크로입자는 또한 별개의 형광 염료로 착색될 수 있다. 이러한 본 발명품을 얻기 위하여는, 담체 입자는 형상과 조성에 관계없이 약 100∼500 nm 의 평균입경을 갖는 다수의 좀 더 작은 형광 입자(나노입자들)로 코팅된다(공유결합적으로 또는 흡착에 의함). 이 물품은, 광 흡착 및 방출 특성에 영향을 미치지 않는 방법으로 선택된, 얇은 중합 외각으로 더 덮이거나 코팅될 수 있다. 이것은 이후 기술된 두 개의 별개 방법에 의해 완성된다.
본 발명의 형광 나노입자들은 단일 형광 염료를 배합하고 상이한 비율로 1종 이상의 나노입자 집단을 결합함으로써 제조될 수 있다. 다른 방법으로는, 동일 입자 내에서 2종 이상의 형광 염료를 조합하여 다중 형광 나노입자들을 얻을 수 있다. 이들 형광 나노입자들의 형광 강도는 배합된 형광 염료의 양을 변화시켜 조절될 수 있다. 두 가지 타입의 입자들의 표면을 추가로 변성시켜 관능기 또는 화학결합을 부착을 허용하는 소망의 표면 특성을 제공할 수 있다.
플로우 세포계측법 보정 목적외에 이들 특성을 갖는 형광 입자들은 생물의학적 적용에 광범위하게 유용하다. 이 분석방법은 본 발명에 의해 얻어진 다색 형광 마이크로입자를 사용하는 것을 기초로 하여 이루어진다. 적어도 둘 이상의 형광 시그널에 의해 특징되는 이러한 각각의 마이크로입자 집단이 임상 또는 실험 샘플에서 특정 검체를 결합할 수 있는 분석 반응물과 결합될 때, 강력한 분석 도구가 얻어지며, 이는 정성 및 정량 아세이 결과를 제공할 수 있다. 샘플내의 다수 검체의 복잡한 분석을 정확하게 얻기 위하여, 형광 시그널의 제 3 형태, 예를 들면 녹색 형광 시그널(FITC)가 제공되며, 검체를 결합시킬 수 있는 표지 시약으로 통상 발견된다. 그러므로 여기에 정의된 바로는 표지 시약은 두 가지 기능, 즉, 본 발명품의 형광시그널로부터 현저히 구분되는 검체와의 반응능 및 형광시그널을 제공하는 능력을 갖는다. 통상의 플로우 세포계측법은 초당 20,000 입자이하의 스펙트럼 성질(형광 시그널)을 분석할 수 있으며, 실시간 스케일에서 신뢰할 수 있는 정량적 데이터를 제공할 수 있다. 그러므로 다색 마이크로입자를 제조 방법, 마이크로입자 그 자체, 그러한 마이크로입자의 다중 세트 및 샘플에서 다수의 검체를 분석하는 복합 방법을 본 발명에서 청구되었다.
본 발명의 형광 물품은 생물학적 물질, 즉 햅텐, 항체, 효소 또는 핵산과 같은 검체 또는 분석 반응물을 수동적 또는 공유결합적으로 결합하는데 사용될 수 있으며, 면역분석법, 핵산(DNA 또는 RNA) 분석법, 친화 정제법, 세포분리 및 기타 의학적, 진단적 그리고 산업적 응용과 같이 여러 가지 타입의 검체 분석법에 사용될 수 있다.
백개 이상의 아미노산의 단백질, 백개의 아미노산 보다 적은 펩티드, 다당류, 핵산, 유기약품, 무기약품, 세포 및 조직을 포함하는 다양한 검체를 검출하는 수많은 프로토골이 있다. 이 프로토콜은 직접 또는 간접적으로 검출될 수도 있는, 표지 결합체를 포함하는 시그널 발생계의 사용을 포함한다. 이들 기술은 염료, 효소, 효소 기질 또는 그의 공동-인자, 효소 저해제, 형광물질, 화학발광, 입자 등을 사용할 수도 있다.
검체 및 검체 반응물 쌍은, 예를 들어, 다음 결합물 중 어느 것이라도 선택될 수 있으며, 여기서 그 쌍의 다른 구성원은 검체 및 다른 결합 짝, 예를 들면, 항원 및 특정 항체; 호르몬 및 호르몬 수용체; 헵텐 및 항헵텐; 폴리뉴클레오티드 및 상보 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질; 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘; 효소 및 효소 조인자; 및 렉틴 및 특정 탄수화물일 수 있다. 이후 사용된 용어, 검체는 측정되는 화합물 또는 조성물이며, 이는 1가- 또는 다가, 즉 하나 또는 다수의 결정 사이트, 햅텐 및 항원, 단일 화합물 또는 적어도 하나 이상의 공통의 항원결정인자 또는 결정 부위를 나누어 갖는 다수의 화합물; 또는 수용체를 갖는다. 이후 사용된 용어, 수용체는 분자의 특정 공간적 및 극성적 조직, 즉 항원결정인자 또는 결정 부위를 인지할 수 있는(증강된 결합 친화력을 갖는) 맥크로분자 화합물 또는 조성물이다. 수용체 예로는 천연 생산의 수용체, 예를 들면, 티록신 결합 글로불린, 항체, 효소, 면역글로블린(Fab) 조각, 렉틴, 세포의 표면에서 발견된 각종 단백질(분화 덩어리 또는 CD 분자) 등을 포함한다. CD 분자들은 진핵 세포의 표면상의 기지의 그리고 미지의 단백질을 의미하며, 예를 들면, CD4는 기본적으로 헬퍼 T 임파구를 규정하는 분자이다. 여기서 항체가 예로서 사용되며 좀더 일반적으로는 수용체를 지칭한다. 환언하면, 리간드란 용어는 자연에 존재하거나 제조될 수 있는 수용체를 위한 화합물 또는 물질이다.
헵텐은 천연 생성의 호르몬, 천연 생성의 약품, 합성 약품, 오염물, 알레르겐, 작용인자 분자(affector molecule), 성장 인자, 케모킨(chemokines), 시토킨, 림포킨, 아미노산, 올리고펩티드, 화학 중간체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 이러한 화합물은 남용 약물의 검출, 치료적 투약 체크, 건강 상태, 장기 이식 목적에 맞는 기증자, 임신(예를 들면, hCG 또는 알파-페토프로테인), 질병 검출, 예를 들면, 엔도톡신, 암 항원, 병원균 등의 검출에 사용될 수도 있다. 치료적 약물은 항에이즈 물질, 항암물질, 항생물질, 항바이러스 물질, 효소 억제제, 신경독소(neurotoxin), 오피오이드, 최면제, 항히스타민, 진정제, 항경련제, 근육 이완제 및 항파킨슨 물질, 항경련 및 근육 수축제, 동공 수축제 및 항콜린제, 면역억제제(예를 들면, 사이클로스포린), 항녹내장 용질, 구충제 및/또는 항원충제 용질, 고혈압치료제, 진통제, 해열제 및 항염제(NSAID와 같은), 국소 미취제, 점안제, 프로스타글란딘, 항우울제, 항정신병 치료물질, 진토제, 영상화제, 특정 목적화제, 신경전달물질, 단백질 및 세포 반응 변경자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질은 세포집단, 혈액 타입, 병원균, 병원균에 대한 면역 반응, 면역 복합체, 다당류, 렉틴, 자연적으로 발생한 수용체 등을 검출하는 것과 같이, 광범위하게 다양한 진단에서 중요하다. 수용체는 헵텐, 단백질, 다른 수용체 등에 결합할 때; 또는 병원균 존재, 생리적인 유체내 특정 단백질의 정도, 광범위하게 다양한 샘플(생리적 유동액, 공기, 진행 흐름, 물 등과 같은)에서의 헵텐의 존재를 검출하는데 사용될 수도 있다. 핵산은 또한 핵산 등에 특이적으로 결합하고 있는 단백질, 상보적 가닥의 검출에 사용될 수도 있다.
분석적 반응물은 예를 들면, 반 덴 엥(van den Engh)등에 발행된 미국 특허 번호 제5,747,349호에 개시된 것처럼 생리적 유체, 공기, 물 및 그와 같은 것들, 예를 들면, O2, CO2, pH, Ca++, Na+, K+ 또는 Cl+의 성질을 규정하는 각종 다양한 무기 검체들과 반응할 수 있는 형광 보고 분자(fluorescent reporter molecule)들 가운데서 또한 선택될 수 있다.
특히 중요한 것은 미생물 및 세포의 결합이며, 이에는 바이러스, 원핵 및 진핵 세포, 단세포 및 다세포 생물 세포, 예를 들면, 진균, 동물, 포유류 등 또는 그의 파편이 포함된다. 통상 이들 큰 집단들은 특정 결합쌍 구성원복합체를 통하여 표면에 비공유결합적으로 결합될 것이다. 그 표면에 결합된 결합 부분이 높은 강도를 갖게됨으로써, 세포, 바이러스 또는 파편을 매우 강하게 고정시키는 세포 또는 바이러스는 다수의 결합쌍 구성원에 의해 복합체가 될 수도 있다. 그리고 나서 특이적으로 결합된 실체를 제거하지 않고 이 시스템을 격렬하게 처리하면, 비특이적으로 결합된 물질은 쉽게 제거될 수도 있다.
본 발명의 것은 또한 병원균을 검출하는데 사용될 수도 있다. 모노클론 항체는 표면에 결합되어 항체를 포획하는데 사용될 수도 있다. 그리고 나서 이 샘플이 첨가되고 항체에 의해 인지된 에피토우프를 갖는 세포는 표면위의 항체에 결합할 것이다. 비특이적으로 결합된 병원균은 제거되어 실질적으로 특이적으로 결합된 것들만 남는다. 포획하는 항체에 의해 인지된 에피토우프외 다른 에피토우프에 특이적인 표지된 모노클론 항체가 이후 첨가된다. 용어, 에피토우프는 용어 항원 결정인자와 동의어이며 여기에 사용된 것처럼 반응의 결합 사이트로 작용하는 분자상의 규정된 도메인을 의미한다. 분자는 하나 이상의 에피토우프를 가질 수도 있다. 예를 들면, 첫 번째 에피토우프는 검체가 각각의 분석적 반응물과 반응물과 결합할 수 있게 하고 두 번째 에피토브는 표지 시약을 위한 결합 사이트 또는 도메인을 제공할 것이다. 대조적으로, 경쟁 분자는 결합하는 검체-분석적 반응물 쌍의 형성을 방해(경쟁)할 것이다. 항체와 병원균 사이의 반응이 이루어지도록 배양한 후, 비특이적으로 결합된 항체를 제거하고 표준 검출 방법에 따라 표지분자의 존재가 결정된다. 관심있는 병원균은 헤프페스바이러스, 폭스바이러스, 토가바이러스,오르토마이바이러스(orthomyvirus),파라마익소바이러스(paramyxovirus), 라브도바이러스(Rhabdovirus),코로나바이러스(coronavirus),아레나바이러스(Arenavirus) 및 레트로바이러스와 같은 바이러스일 수도 있다. 그들은 또한 대장균, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 쥐티프스, 표피포도상구균, 적변세균(serratia marcescens), 미코박테리움 보비스(mycobacterium bovis), 항메티실린 황색포도산구균 및 프로테우스 불가리스를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 병원균의 예는 상기 병원균에 한정되지 않으며 당업자는 미생물 및 기생충의 어떤 특정 종류가 특별히 중요하다는 것을 잘 알 것이다. 이들 유기체와 관련 질병의 대체적인 명단은 와리너(Warinner)에 발행된 미국특허 제 5,795,158 호에 예로서 찾아볼 수 있으며, 참고로 여기에 함께 기재하였다.
분석하고자 하는 목적 분자의 검출 또는 정량을 위하여, 마이크로입자를 포함하는 용액을 샘플과 결합시키고, 그 마이크로입자 상의 마크로분자를 검체와 반응시키고, 그 마이크로입자를 샘플에서 결합되지 않은 성분으로부터 분리하고, 결합된 분자들을 포함하는 마이크로 입자들을 종래의 방법으로 검출한다. 형광적으로 착색된 마이크로입자들이 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 플로우 세포계측 분석법에 가장 적당하다.
본 발명의 방법에 사용되는 담체 입자의 코팅은, 예를 들면 선행 기술의 표준 방법을 사용할 때 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 예를 들자면, 면역 분석 절차시 사용되는 항체를 갖는 코팅 입자 시스템에 대표적인 기술로는 프렌겐(Frengen, in Clin, Chem, 39(1993), pp 2174∼2181)에 개시된 것 및 여기에 기재된 참고문헌 및 린드모(Lindmo, in J. Immunol, Methods 126 (1990), pp 183∼189)에 의해 기재된 것이 있다.
본 발명의 입자를 사용하는 분석법은 소변, 뇌척수 유동액, 늑막 유동액, 활액(synovial fluid), 복막액, 위액, 혈액, 혈청, 플라즈마, 림프액, 간질액, 조직 파쇄액, 세포 추출액, 타액, 가래, 대변, 생리적 분비물, 눈물, 점액, 땀, 우유, 정액, 질분비물, 궤양 및 다른 표면 발진액, 물집, 및 종기 및 정상의 세포검사를 포함하는 조직 추출액, 악성, 및 혐의 조직 또는 관심있는 검체를 포함하는 신체의 다른 구성물과 같이 분리되거나 여과되지 않은 생물학적 유동액을 포함하는 생물학적 유동액에서 수행될 수 있다. 세포나 조직 배양물 또는 배양즙과 같은 다른 유사 견본이 또한 중요하다. 선택적으로, 이 샘플은 토양, 물, 또는 공기와 같은 환경적 출처; 또는 폐유, 수원지, 공급라인 또는 생산 부지와 같은 산업적 출처로부터 얻어진다. 산업적 출처는 생물학적 반응물과 같은 발효매체 또는 양조와 같은 식품 발효로부터; 또는 고기, 수렵동물, 농산물, 또는 유제품과 같은 식료품을 포함한다. 이 실험 샘플은 혈액으로부터 플라즈마 제조, 점착성 유동액 희석 등과 같이 사용전에 미리 처리될 수 있으며; 처리 방법은 여과, 증류, 농축, 간섭 화합물 불활성 및 시약의 첨가를 포함할 수 있다.
고체 지지체에 결합된 검체 각각에 대해 상보적인 결합 부분을 사용하는 샘플에서 검체의 다중 하부집단을 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 각 검체와 그의 상보적 결합 부분은 특이적 결합쌍의 첫 번째 및 두 번째 구성원들을 각각 포함한다. 이 방법은 상기 상보적 결합 부분의 다중 하부집단들을 알려진 비로 혼합물을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 각 하부집단은, 혼합물을 샘플과 접촉하게 하여 특정 결합 쌍이 고체 지지체 상에 형성되고 샘플에서 관심있는 검체의 존재를 나타내게 하는 다른 상보적 결합 부분을 포함한다(Lehnen의 미국특허 제 5,567,637 호).
본 발명의 목적을 위하여, 표지 또는 검출될 수 있는 형광 시약은 샘플중 검체의 존재와 관련된 시그널을 제공하여야만 하며, 그 결과, 전자기적 방사, 특히 자외선, 가시광선 또는 적외선 범위의 빛이 검출된다.
분석법은 여러 가지 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 본 발명에 따르면, 샘플을 당면 고체 기질과 접촉시키고, 갖가지 시약의 첨가, 배양, 세척 등과 같은 다양한 작용을 수행할 수도 있다. 본 평가법의 최종 결과는 관심있는 검체의 존재 또는 양과 관련된 광 흡착 또는 광 방출에 의해 빛을 흡수하거나 생산하는 생성물의 양의 변화일 것이다. 통상, 이것은 특정 결합쌍의 상보적 구성원들 사이에 특정 결합 복합체가 형성된 결과이며, 여기서 구성원들 중 하나는 다리로서 작용하여 샌드위치("샌드위치" 분석법에서처럼)를 형성하거나, 단일 복합체가 있을 수 있으며, 또는 복합체들이 S. aureus 단백질 A, 류머티스 인자, 면역복합체에 특이적인 면역글로불린 등과 같은 복합체 결합 단백질에 결합될 수도 있다.
형광 입자, 형광 공액 항체 등과 같은 형광 마커를 지니므로써, 샘플은 형광물질에 의해 흡수된 빛 및 광 측정장치에 의해 측정된 방출된 빛을 조사한다. 염료는 표지로서 사용되거나 반응, 예를 들면 효소적으로 촉매화된 반응의 결과로서 생성된다.
유사하게, 하이브리드를 포함하는 핵산 분석법으로, 필요 절차를 거쳐 상보적 서열이 존재하는지를 결정할 수 있으며, 각종 프로토콜을 사용하여, 색채 또는 형광표지 또는 표지 생성물을 제공할 수 있으며, 이는 상보적 서열의 존재여부를 나타낼 것이다.
예를 들면, 아미노 관능기를 부착하여 분석을 수행하기 전에 바로 표면을 활성화하고, 공유결합적으로 결합되도록 그 활성화된 표면에 핵산 샘플을 첨가하고, 서열에 상보적인 서열을 가지며, 예를 들면 비오틴 표지를 가짐으로써 기능화 된 프로우브를 사용할 수 있다. 하이브리드 단계를 완결한 후, 아비딘에 결합된 효소 또는 형광 색소를 첨가할 수 있으며, 이는 하이브리드를 통해 표면에 결합된 비오틴에 결합할 수 있을 것이다. 비특이적으로 결합된 아비딘을 세척한 후, 형광 색소를 직접적으로 측정하거나, 또는 효소에 대한 기질을 첨가하며, 생성물의 형성은 상보적 서열의 존재 및 양을 표시할 것이다.
세포 수용체에 의해 인지된 항원을 사용하는 변형도 가능할 것이다. 항원은 세포와 그 세포를 표지하기 위하여 사용된 표지된 항원을 포획하기 위하여 그 표면에 결합된다. 수용체는 표면 면역글로불린일 수 있다. 이 방법에서 특이적으로 결합된 세포의 존재가 확인될 수 있으며, 이로 인해 표면에 결합된 수용체에 상보적인 항원을 갖고, 그러한 항원에 특이적인 면역글로불린을 갖는 세포가 확인될 수 있다. 항원을 갖는 대신에, 항원을 비공유결합적으로 표면에 결합시키기 위하여 표면에 결합된 항원에 대응하는 항체를 사용할 수도 있다.
본 물품은 또한 혈액 플라즈마 단백질, 성장 인자, 응고 인자, 항응고 인자 등과 같은 관심 있는 여러 가지 생산물을 분리하는데 사용될 수도 있으며, 이는 그후 여러 가지 염 용액에 의해 복합체로부터 방출될 수도 있다. 본 발명품은 여러 가지 다양한 다른 목적으로 사용될 수도 있으며, 표면에서 고밀도로 배향된 분자를 제조하거나, 반응 사건들을 시각화하거나, 또는 빛의 즉석 전송을 제공하고자 하면 언제든지 가능하며, 여기서 검체 물질은 고체표면에 대해 비확산적으로 결합된다.
실시예 1. 입자를 형광착색하는 일반적인 개요
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수용성 매체 내의 나노구체(300nm 폴리스티렌, 아미노 기능화됨) 원료 1%를 환저 플라스크에 피펫으로 가한 다음, 클로로포름과 같은 유기 용매중의 염료 용액(하나 이상의 염료로 구성됨)을 첨가한다. 염료 용액이 나노구체에 의해 더 이상 흡수되지 않을 때까지 현탁액을 방치한다. 감압(진공펌프)하에서 용매를 제거한다. 수용성 매체를 착색된 나노구체에 첨가하고, 초음파 분해하고 저장 용기로 옮긴다.
본 발명의 한 실시예에서, 하나 이상의 나노입자 세트를 제조하고, 각 세트를 소정 농도의 별개 염료로 착색한다. 본 발명의 다른 구현예에서는, 담체 마이크로구체 그 자체를 하나 이상의 형광 염료로 착색한다.
단색 나노입자 세트를 소망의 비율로 혼합하고 그들을 붙이거나 결합시켜 담 체 마이크로구체를 제조한다. 이 구성이 본 발명품이다. 얻어진 형광 물품을 시험하여 제제의 형광 활성/강도를 결정한다. 나노입자-마이크로입자 결합물의 각 세트 또는 집단은 특정 세트 또는 집단의 물품에 대해 독특한 시각적 문양 또는 형광 시그널("시각적 기호")를 나타낸다. 물품의 다른 집단은 예를 들면 동일한 총 수의 형광 나노입자를 갖지만, 그들은 상이한 비율로 혼합된다. 그러므로 단지 두 개의 염료만을 가지고 독특한 형광 시그널을 갖는 많은 수의 약품 세트를 제조할 수 있다. 또 다른 염료로 착색된 마이크로입자의 제제물을 가지고 좀 더 많은 수의 다색 약품을 얻을 수 있다. 이것은 선행기술보다 현저한 개선이다. 본 발명자들은 처음으로 본 발명을 실행시켜 간단히 하였다.
실시예 2. 두 개의 염료로 동시에 착색
2 개의 상이한 염료를 포함하는 단일 용액을 제조하고 이를 사용하여 동일 입자를 착색한다. 한가지 염료는 붉은 형광 염료 1,3-비스[(1,3-디하이드로-1,3,3-트리메틸-2H-인돌-2-일리덴)메틸]-2,4-디하이드록시-시클로부텐디일륨, 비스(내부 염)이고, 두 번째 염료는 오렌지 형광 염료로 2-(3,5-디메틸피롤-2-일)-4-(3,5-디메틸-2H-피롤-2-일리덴)-3-하이드록시-2-시클로부텐-1-온일 수 있다. 염료 #1의 방출 피크는 585nm이고, 염료 2#의 방출 피크는 630nm이다. 이들 염료는 그들이 사용된 측정장치인 벡톤 딕킨슨 FAC스켄 플로우 세포계측기(Becton Dickinson FACScan flow cytometer)의 형광 채널 두 개의 중심안에 떨어지기 때문에 선택된다. 그러나, 형광 채널의 선택은 다른 플로우 세포계측 장치가 상이한 구성을 가질 수 있 기 때문에 상대적이고 무의미하다.
상이한 비율로 혼합된 2개의 염료로 착색된 마이크로입자 또는 나노입자의 제제를 가지고 실시예 1에서 기재된 것보다 더 많은 수의 다색 물품을 얻을 수 있다.
실시예 3. 현저한 입자 집단의 다중 세트 또는 집단의 조제
이론적으로 이러한 세트는 지금까지는 복잡한 분석(예를 들어, McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes", In Methods in Cell Biology, 42, Part B, (Academic Press, 1994) 참조)에 매우 가치 있는 것으로 생각되었으나 실체적인, 다색 비드의 실행을 단순화하거나 단순화를 설명한 선행 기술예는 알려진바 없다. 기껏해야 단지 하나 그리고 아마도 두 개의 염료를 여러 가지 비로 포함하는 최고 5의 비드 집단만이 가능하였다. 예를 들면, 미국특허 제4,717,655호는 그러한 비드를 개시하나, 그러나, 이 개시는 가능하지 않았으며 그러한 비드를 제조하는 방법뿐만 아니라 구성 문제는 본 발명과 관련이 없다. 대조적으로, 본 발명에 의하여 현재 완전히 현저하게 구별되는 다중 하부세트를 기술적으로 얻는 것이 가능하다.
다른 형광 특성을 갖는 상이한 집단의 비드를 많들기 위하여 적색/오렌지색 염료를 갖는 나노입자 집단의 비율을, 적당하게 비율을 증가 변형하여서 변화시키기 때문에 얻어진 비는 시각적으로 기존비와 중첩되니 않는다. 본 발명은 2개의 현저하게 상이한 염료를 가지고 착색된 단지 2 집단의 나노입자의 비를 변형하여 시 각적으로 별개의 수많은 담체 비드 세트들를 제공한다. 이 실시예는 당업자라면 누구나 쉽게 본 가르침을 사용하여 좀더 적거나 많은 수의 비드 하부세트를 제조할 수 있기 때문에 발명을 제한하는 방법은 아니다. 또한 단지 하나의 나노비드 집단을 사용하고, 그 또한 착색되는 담체입자에 대한 비를 변형시킬 수 있다. 당업자는 이러한 성공에 가까운 것은 실질적으로 실행될 수 있는 것은 어떤 것도 없다는 것을 인정할 것이다. 선행기술은 당업자에게 어떻게 거기에 도달하였는지를 알려주는데 실패하였다.
실시예 4. 항체에 대한 형광 염료의 결합
형광 염료 5(6)-카르복시플루오레세인을 5(6)-카르복시플루오레세인-N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 사용하여 항체와 결합된다. 이 에스테르를 제조하기 위하여, N-하이드록시숙신이미드(2.1 mM)와 디사이클로헥실카보디이미드(2.1 mM)를 테트라하이드로퓨란에 용해된 5(6)-카르복시 플루오레세인(2.0 mM)에 첨가한다. 얻어진 반응 혼합물을 4℃의 차가운 상태로 3일 동안 방치하여 에스테르를 형성한다. 5(6)-카르복시플루오레세인-N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 0.1M NaCl을 포함하는 0.1M NaHCO3(3㎖; pH 8.6)에 용해된 정제된 1차 항체 IgG(10mg)와 반응시킨다. 얻어진 플루오레세인 표지된 1차 항체를 겔 여과와 같이 알려진 방법으로 정제시킨다.
실시예 5. 분석적 반응물을 마이크로입자 및/또는 나노입자에 결합
이후 집단적으로 분석적 반응물로 명명한, 일련의 항체, 항원 또는 핵산을 다음에 기술된 것과 같은 다수의 종래 방법으로 비드에 결합시킨다: Colvin et al., "The Covalent Binding of Enzymes and Immumoglobulins to Hydrophilic Microspheres" in Microspheres: Medical and Biological Applications, 1-13, CRC, Boos Raton, FL, 1988; Cantarero et al., "The Adsorptive Characteristics of Proteins for Polystyrene and Their Significance in Solid-Phase Immunoassays", Anal Biochem, 105, 375-382 (1980); and Illum et al., "Attachment of Monoclonal Antibodies to Microspheres", Methods in Enzymol, 112, 67-84(1985) 112, 67-84(1985).
이 실시예에서 검체에 대해 배양된 토끼 항체를 마이크로입자에 결합시킨다. 항체를 인산염 완충 식염수(PBS), pH 8 내로 투석하여, 280nm의 흡광도에서 약 3mg/㎖의 농도로 측정되었다. 6mg의 항체는 1.5㎖ 메탄올의 1.5mg SPDP 용액을 사용하여, 30분 동안 SPDP(3-(2-피리딜디티오 프로피온산 N-하이드록시숙시이미드 에스테르, 시그마 화학 주식회사, 세인트 루이스, 미주리)를 사용하여 유도된다. 1M 아세트산나트륨, pH 4.5를 첨가하고 1M 디티오트레이톨(DTT)을 첨가한다. 이 용액을 실온에서 30분 더 교반하고 나서 세파덱스 G- 25 컬럼(SEPHADEX G-25 column, 파마시아 LKB 바이오테크놀로지 주식회사)에 설치하여 유리 DTT를 제거하고 이 유도된 항체를 pH 8 결합 완충액(50mM 트리스 베이스, 50mM 아세트산나트륨, 50mM 염화나트륨 및 1mM EDTA)에 넣는다. 이 항체 조제물을 100nM 말레이미드 당 1mg 항체 의 비로. 사용전에 바로 트리스로 pH 8로 맞추어놓은 마이크로입자와 혼합한다. 이 혼합물을 2 시간동안 배양한다. 기능화된 입자를, 30mM MOPSO, 10mM EDTA, 100mM 글루코스, 및 0.2% 소듐 아지드, pH 6.8로 평형이 유지된, 세파로스 컬럼(SEPHAROSE column, 파마시아 LKB 바이오테크놀로지 주식회사)의 유리 항체로부터 분리한다. 마일스 펜텍스 프랙션 V BSA(Miles Pentex Fraction V BSA)를 첨가하여 최종 1%의 w/v농도로 만든다. 효소, 아비딘, 비오틴 또는 다당류와 같은 아민 함유 화합물 및 다른 단백질은 상기 또는 선행기술에서 잘 알려진 유사 표준 기술을 사용하여 여러 가지 입자에 공유결합될 수 있다.
반응물을 비드 표면에 부착한 후, 각 하부세트로부터의 분취량을 혼합하여 각 하부세트내의 기지량의 비드를 포함하는 풀(pool)을 만든다. 이 풀 세트는 각 하부세트로부터 동일 부피의 비드로 만들어지는 것이 바람직하므로 그 세트는 각 하부세트 또는 집단으로부터 대략 동일 수의 비드를 포함한다. 이 풀을 혈청 또는 플라즈마와 같은 관심있는 유동액 샘플로 배양하여 비드 상의 항체와 반응성인 유동액 안의 항원(검체)의 존재를 시험한다. 그러한 배양은 일반적으로 비드 표면에 검체를 갖는 유동액 샘플 안에서 분석적 반응물의 특정 반응을 용이하게 하는 온도, pH, 이온 농도 등의 조건 하에서 수행된다. 충분한 시간이 경과 후, 혼합물의 비드는, 예를 들면, 토끼 항체의 결합 에피토우프와 다른 에피토우프(검체의 항체-결합 파편)를 통해 검체와 결합하는 플루오레세인-표지된 염소 항체와 같은 "표지 시약"과 함께 추가 기간동안 배양된다. 이차적 항체 또는 표지 시약은 검체에 결합될 것이며, 이는 토끼 항체를 획득하는 것에 의해 비드에 결합된다. 세척 후(또는 세척없이), 비드를 플로우 세포계측기로 가공하고 광 산란, 측면광 산란, 붉은색 형광 및 오렌지색 형광의 4개의 분류 변수를 측정하고 이를 사용하여 각 비드가 속한 하부세트 또는 집단을 확인한다. 각 비드에 대해 녹색 형광(표지 시약과 관련된 측정 변수)을 동시 측정하여 비드가 그에 결합된 항체를 갖는지의 여부를 결정할 수 있게 한다. 비드가 속한 하부세트가 특정 항원, 예를 들면 일련의 풀 알레르겐(grass allergen), 여러 가지 물질 남용 약물, 병원체 세트의 존재와 상호관련이 있기 때문에, 비드에 결합된 항체의 특이성은 그것이 속한 하부세트의 함수로서 쉽게 결정할 수 있다.
풀 알레르겐은 두두러기쑥 및 혼합풀 꽃가루 추출물(디모데, 과수원, 6월 및 초원 풀)을 포함한다. 측정 및 비교연구를 위하여 대조물질로서 사용되는 이들 풀 알레르겐의 샘플은 그린 래보러토리즈(Green Laboratories; Lenoir, N.C.)로부터 구입할 수 있다. 약물 남용과 억제물질의 구체적인 예로는 암페타민; 에탐페타민(ethamphetamine); 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈 및 바르비탈과 같은 바르비투르산염; 리브리엄 및 밸륨과 같은 벤조디아제핀; 해쉬쉬 및 마리주아나(marijuana)와 같은 커나비노이드(cannabinoid); 코카인; 펜타닐; LSD; 메타풀아론(methapualone); 헤로인, 몰핀, 코데인, 하이드로모르폰(hydromorphone), 하이드로코돈 (hydrocodone), 메타돈(methadone), 옥시코돈(oxycodone), 옥시모르폰(oxymorphone) 및 아편과 같은 아편제; 프로폭시헨(propoxyhene);등을 들 수 있다. 이들 물질들은 대조물질뿐만 아니라, 검체로 사용할 수 있다.

실시예 6. 카르보디이미드 부착
이 실시예는 검체, 예를 들면 항체를 알려진 카르보디이미드 화학을 사용하여 입자에 부착하는 방법을 개시한다. 담체 마이크로입자에 입자적 검체뿐만 아니라 나노입자를 부착하기 위하여 동일 방법을 사용한 것을 주목하라.
모노클론 항체를 바깥 표면 위에 늘어진 카르복실기를 갖는 중합체 입자에 공유결합적으로 부착한다. 이 입자는 폴리(스티렌-코-메타크릴산)(90:10 몰비)로 이루어진다. 중합체 입자의 샘플(30mg 건조 중량)을 카르보디이미드와 혼합하고, 1.5mg의 항체를 첨가한다. 이 부착반응은 실온에서 회전시키면서 24시간 동안 혼합물을 배양함으로써 이루어진다. 이 반응 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠렛(pellet)을 인산완충식염수(pH 7.4)로 한번 세척하고, 식염수 용액에 재부유시킨다. 각 라텍스 조제물에 결합된 항체 덩어리는, 입자에 결합된 3배로 강화한 소 감마 글로불린을 갖는 평형화된 샘플의 방사능 카운트 수를 계측함으로서 결정된다. 전체에 대한 공유결합의 비는 소듐 도데실술페이트 계면활성제로 배양한 후, 계산된다. 이 기술과 관련하는 상세한 설명은 예로서 수톤(Sutton)등의 미국특허 제 5,397,695 호에서 찾을 수 있다.
나노입자들을 상기와 같이 본질적으로 유사한 방법으로 담체 마이크로입자에 공유결합적으로 부착한다. 얻어진 결합 입자를 중합껍질, 예를 들면 입자를 코팅하기에 충분한 시간동안 입자들을 단일체 스티렌(0%∼80%) 및 디비닐벤젠(20%∼100%)에 혼합하여 형성된 중합 껍질로 다시 코팅될 수 있다. 이 껍질을 얻는 다른 방법 은 다가 분자에 의해 표면 관능기와 함께 가교하는 것이다. 예를 들면, 1,1.1-트리스(아미노에틸)프로피오니트릴은 적어도 세 개의 카르복실산 부분을 입자 표면 위에 씌운다. 껍질 표면을 더 변형하여 카르복실산으로 니트릴기를 산화하거나 아민으로 환원시킴으로써 각각의 관능기를 제조한다.
실시예 7. FITC-표지된 알부민 마이크로입자의 제조
단백질성 물질을 포함하는 중합체 물질이라면 어느 것으로도 담체 마이크로입자를 만들 수 있다. 이 실시예는 그러한 담체 입자를 형광적으로 착색하는 방법을 기술한다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, Signma 사)를 공액 입자를 형성시키는 중합체의 존재하에서 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합시킨다. 유리 FITC를 입자로부터 세척 제거하고, 이 입자들을 NaOH에 재용해시켜 유리 FITC가 없을 때 FITC-표지된 HSA를 생산한다.
FTC(6.2㎍)를 탄산염 완충액(pH 10) 2㎖에 용해시킨다. 이 용해된 FITC를 HSA(25%) 1㎖와 결합시키고 25% PVP와 25% PEG를 포함하는 중합체 용액 6㎖를 와류시키면서 0.1M 아세트산나트륨 pH 5.0에 첨가한다. 이 혼합물을 연속해서 실온, 37℃, 및 58℃에서 각각 30분씩 배양한다. 공액 입자가 그 결과로서 형성된다. 이 혼합물을 14,000rpm으로 마이크로퓨즈에서 원심분리하며, 상청액을 제거하고, 그 입자들을 탈이온수(각각 10㎖씩)로 세 번 세척한다. 이 입자들을 10㎖ 탈이온수에 재부유시킨다. 재부유된 입자들을 형광 현미경으로 가시화한다. 모든 형광이 그 입자와 결합된다. 어떤 유리 형광도 관찰되지 않으며, 이는 FITC의 모든 것이 알부민에 결합되어 있으며 유리 FITC 분자는 하나도 없다는 것을 나타낸다.
실시예 8. 부착된 올리고뉴클레오티드 프로우브로 마이크로입자 형성
첫 번째 단계에서, DNA 서열을 검출하기에 적당한 프로우브를 선택한다. 공지의 선행기술(예를 들면, 상기의 카르보디이미드 결합, 또는 다른 방법 참조)로 프로우브를 입자에 결합시켜 여기에 결합된 공지의 올리고뉴클레오티드를 갖는 각각의 부분의 비드를 생산한다. 올리고뉴클레오티드는 분석시 특정 혼성을 이루기에 충분할 만큼의 길이, 예를 들면, 일반적으로 약 5∼500 뉴클레오티드 사이, 바람직하게는 약 10∼50 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 20∼30 뉴클레오티드 길이를 가져야만 한다. 바람직한 구현예에서, 포화량의 올리고뉴클레오티드를 비드에 결합시킨다. 각 비드에 부착된 서열의 전부 또는 일부에 상보적인, 형광 올리고뉴클레오티드를 또한 제조한다. 다음에, 비드에 결합된 올리고뉴클레오티드에 대응하는 서열을 포함하는 샘플에서 DNA의 특정 영역을 확대하는데 사용되는 PCR 프라이머를 선택한다. 이중 가닥(ds)이나 단일 가닥(ss) PCR 기술이 사용될 수도 있다. 만약 이중 가닥 생성물(dsDNA)이 생산된다면, 확대된 PCAR 생산물은 충분한 온도로 그리고 충분한 시간동안 가열되어 단일 가닥으로 되어 잘 알려진 선행기술에 따라 dsDNA를 변성한다. 이 혼합물을 냉각하고, 비드를 첨가하고 혼성화가 입자상의 올리고뉴클레오티드와 PCR 생성물 사이에서 일어나기에 적당한 조건(예를 들면, 실온에서 약 10분간)하에서 PCR 생산물과 함께 배양한다. 혼성화 시간은 원하는 결과에 따라서 다양하며 예를 들면 24시간 이상 더 지속될 수 있다. 형광 DNA 프로우브를 첨가하고 전체 혼합물을 경쟁적 혼성화가 일어나기에 적당한 혼성화 조건하에서 배양한다. 당업자들이 알 수 있는 것처럼, 사용되는 PCR 생성물 및 형광 탐침의 농도는 변화될 수도 있으며 반응을 최적화하도록 조절될 수도 있다. 프로우브, 목표물 및 경쟁 분자들의 순서는 변할 수도 있으며 여기 기술된 것과 같을 필요가 없다.
일반적으로, 사용되는 PCR 생성물 및 형광 프로우브의 농도는 완전한 상보성과 하나 이상의 뉴클레오티드 짝들 사이를 식별하는 분석 능력을 희생하지 않고 경쟁적 억제로부터 발생하는 형광 검출가능한 손실을 최고로 활용하기 위하여 조절된다. 퇴화한 프로우브 분석에서처럼 고의로 부적당한 짝을 제조할 수도 있다. 예시적 분석법에서, 비드에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 PCR 생성물의 농도는 사용된 형광 브로브 농도의 1∼10 배이다. 만약 PCR 생성물이 비드 결합된 올리고뉴클레오티드보다 많이 길다면, PCR 생성물의 양은 비드 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 DNA 근처의 상대적인 몰 농도 반영에 따라서 증가된다. 형광 프로우브는 비드상의 상보적 올리곤뉴클레오티드를 포화시키기에 충분한 양, 예를 들면 비드에 결합된 뉴클레오티드 농도의 약 1∼1000 배, 바람직하게는 2∼100 배 또는 더욱 바람직하게는 20∼50 배를 첨가하는 것이 바람직하다.
형광 올리고뉴클레오티드 프로우브는 여기에 참고적으로 함께 기술된 미국 특허 제 5,403,711 호에 기술된 것과 같이 잘 알려진 방법 또는 다른 잘 알려진 선행기술에 의해 제조될 수도 있다.
실시예 9. 경쟁 분자를 사용하는 치환 또는 경쟁 분석법
임상 실험실에서 많은 물질의 분석은 특정 리간드-라이게이트(ligate) 또는 항원-항체 상호작용을 갖는 간섭에 기초한다. 이들 분석에서 리간드-라이게이트 쌍 중 하나는 형광단 또는 형광색소로 표지되며 하나는 비드에 고정된다. 리간드나 라이게이트 중 어느 것일 수도 있는 용해가능하고, 표지되지 않은 검체를 반응 혼합물에 첨가하여 표지된 성분과 고정 성분의 상호작용을 경쟁적으로 방해한다. 통상 이 쌍의 어느 구성원이 표지되고 어느 구성원이 고정되는가는 중요하지 않는다; 그러나, 어떤 분석법에서는, 기능적 편리함으로 성분들이 혼합되는 것에 따라 분석 또는 서열의 순서를 지시할 수도 있다.
이러한 타입의 분석 예에서, 각 비드 하부세트는 항원을 갖도록 제조된다. 항원-코팅된 비드를 비드 표면의 항원에 특이적인 표지된 항체와 반응시킨다. 가용성 검체(억제제)를 함유하는 시험 유체를 계속 첨가하면 가용성 검체의 농도에 정비례로 비드로부터 표지된 항체를 옮겨놓을 것이다. 기지의 검체 농도의 표준 곡선은 시험 샘플에서 검체의 정확한 정량을 주기 위하여 사용된다. 정확하게 하기 위하여 표준 곡선을 세우는데 사용된 기지 농도의 검체는 대조물질로서 간주된다. 이 대조물질은 통상 그리고 본질적으로 검체 또는 검체 분자의 일부와 동등하다.
만약 PCR 생성물이 완전하게 비드의 올리고뉴클레오티드에 상보적이라면, PCR 생성물이 완전히 상보적이 아닌 경우에 관찰될 것보다 더 고도의 결합 친화력을 갖는 것으로 경쟁적으로 혼성화될 것이다. 그러므로 PCR 생성물은 PCR 생성물의 상보성 정도에 따라 다소간 능률적으로 비드에 대한 형광 상보적인 올리고뉴클레오티드의 결합을 감소시킨다.

실시예 10. 핵산 분석
이 분석법에 사용된 핵산은 변형되지 않은 견본, 예를 들면, 혈액 세포 또는 병원균에서 발견된 것과 같은 천연적으로 발생하는 핵산이며, 또는 선택적으로 플라즈마의 클로닝의 결과와 같은 증폭된 핵산 또는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)의 결과로서 얻어질 수 있다.
PCR의 힘과 민감성을 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열의 검출이 필요한 광범위하게 다양한 분석학적 문제에 이용한다. PCR 기술이 갖는 큰 어려움은 최종 생성물, 즉 증폭된 DNA를 측정하고 분석하는 방법의 귀찮은 성질이다. 플로우 세포계측 비드계 혼성 분석법으로 매우 빠르고 정확하게 관심있는 유전학적 서열을 검출할 수 있게된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 관심있는 핵산 단편이 결합된 비드를 제조한다. 관심있는 PCR 생성물(또는 다른 어떤 DNA 또는 cDNA 단편, PCR 절차로 얻어질 필요는 없다)은 비드의 핵산 단편과 상보적 형광 DNA 프로우브 사이의 혼성화를 경쟁적으로 방해하는 그의 능력에 의해 검출된다. 이 방법은 민감하고 정확하며 관심있는 PCR 생성물 또는 DNA의 검출가능한 1점 돌연변이를 허용한다. 복잡한 DNA 분석 방법은 특정 다형성 또는 돌연변이를 위하여 관심있는 PCR 생성물 또는 다른 DNA를 검출하는 데 사용할 수 있으며, 당업자는, 질병에 민감하게 관련된 조직불적합성 대립 유전자의 존재, 유전병과 관련된 돌연변이, 자기면역 질병, 또는 종양 유전자 또는 종양 또는 종양 위험과 관련된 유전자의 돌연변이와 같이 수많은 응용을 생각할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 상기 명명된 조건과 관련 된 몇 가지 유전자들로는 낭성 섬유증 유전자(cystic fibrosis gene), 다중 내분비성 종양 유전자 타입 2a(multiple endocrine neoplasia type 2a; MEN2a), 다중 내분비성 종양 유전자 타입 2b(MEN 2b), 다중 내분비성 종양 유전자 타입 1(MEN 1), 레트 원종양유전자(ret proto-oncogen), 저밀도 리포프로테인(LDL) 수용체, 뉴로피브로마토시스 타입 1(neurofibromatosis type 1; NF1), 뉴로피브로마토시스 타입 2(NF 2), 유방 및 난소 암 민감성 타입 1(BRCA 1), 유방 및 난소암 민감성 타입 2(BRCA 2), 유방 및 나소암 민감성 타입 3(BRCA 3), 선종성용종 콜리(adenomatous polyposis coli; APC), 아데노신 데아미나제, 피부건조증 피그멘토섬 그룹 A 정정 유전자(xeroderma pigmentosum group A correcting gene; XPAC), 절단 수리 교차 보완하는 궤양 수리 결함 보완 그룹 6(ERCC6), 연약한 X 정신장애 단백질 1(fmr 1), 뒤센형 근육 이영양증 유전자(Duchenne muscular dystrophy gene), 근긴장성이영양증(myotonic dystrophy) 프로테인 키나아제, 안드로겐 수용체, 헌팅톤 질병관련 유전자, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보트란스퍼라제(HPRT), 아폴리오프로테인 E, 베타-헥소사미니다제 알파 사슬(HEXA), 스테로이드 21-하이드록시라제, 안지오텐신, 인간 결절성 혼합 림프와 조직 세포 미스매치 리페어(hN㎖H 1 and 2), 레티노블라스토마 민감성(Rb), 변형-관련 단백질 53(p53), 래스(ras), 브레이크포인트 클러스터리젼/티로신-프로테인키나아제(breakpoint cluster region/tyrosine-protein kinase; ber/abl), B-세포 백혈병/림프종 2(bcl-2), 유전자 암호화 이온 수송자, 및 그의 결합들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이들 유전자들은 인간의 근긴장증, 파라마이오토니아 컨제니타(paramyotonia congenita), 칼륨과다혈 증 주기적 마비(hyperkalemic periodic paralysis), 비대성 심근증(hypertrophic cardiomyopathy), 유전적 난형적혈구 세포(hereditary ovalocytic red blood cell), 유전적 구상적혈구증(hereditary spherocytosis), 글루코스/갈락토스 흡수장애, 가족성 콜레스테롤과다혈증, 결절성경화증(tuberous sclerosis), 심각한 복합면역결핍증, 자가면역 질병, 인슐린 의존성 당뇨병, 카케인 증후군(Cockayne's syndrome), 가시근 및 구근 위측증(spinal and bulbar muscular atrophy), 페츠-제프 증후군(Peutz-Jegher's syndrome), 레슈니안증후근(Lesch-Nyhan syndrome), 데이삭스병(Tay-Sachs disease), 알츠하이머병, 선천적 부신 과다형성증(congenital adrenal hyperplasia) 및 고혈압증, 본질적인 고혈압증, 유전적 비플립증 결장암(hereditary non-polyposis colon cancer), 유전적 결장암, 결장암, 가족성 망막모세포종(familial retinoblastoma), 리프라우멘니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 만성적 척수 백혈병(chronic myelogenous leukamia), 난포 및 확산 림프종(follicular and diffuse lymphoma), 악성 림프종, 백혈병, 피부암, 폐암, 췌장암 및 그의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상적 장애 및 질병과 관련이 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
상기 명명된 악성질병외에 다른 형태의 암이 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골형성 육종(osteogenic sarcoma), 척삭종(chordoma), 맥관육종(angiosarcoma), 내피종 (endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종 (lymphangioendotheliosarcoma), 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 에윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 결장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 기저세포암종(basal cell carcinoma), 선암, 땀샘암종(sweat gland carcinoma), 지방샘암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상암종(papillary carcinoma), 유두상선암종(papillary adenocarcinoma), 낭선종암종 (cystadenocarcinoma), 골수암종(medullary carcinoma), 기관지원성암종 (bronchogenic carcinoma), 신세포암종, 간종양, 담관암종(bile duct carcinoma), 육모암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생성암종(embryonal carcinoma), 윌름즈 종양(Wilms' tumor), 경부암(cervical cancer), 고환종양, 소세포 폐 암종(small cell lung carcinoma), 방광암종, 상피암종(epithelial carcinoma), 신경교종, 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두 개인두종(craniopharyngioma), 뇌질피복세포증(ependymoma), 송과체종 (pineaioma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 수막종(meningioma), 레티노블라스토마(reinoblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma) 또는 골수종을 포함할 수도 있다.
같은 방법으로 박테리아, 바이러스 진균, 마이코플라즈마, 리케치아, 클라미디아, 또는 원생동물 병원균과 같은 병원 유기체의 돌연변이된 또는 자연 형태(돌연변이 되지 않은) 핵산 단편이 동시에 검출된다.
실시예 11. 효소 분석
본 발명은 또한 효소, 효소 억제자, 효소기질, 락테이트와 같은 효소 신진대사물, ATP, 글루코스 및 다른 관련된 진단적으로 중요한 검체를 측정하는데 또한 유용하다. 예를 들면, 비드 소집단은 비드로부터 효소적으로 나누어진 선택된 형광 물질을 발생시켜, 형광 손실을 일으킨다. 본 발명을 사용하여 검출되고 측정될 수 있는 효소로는 프로테아제, 하이드로라제, 옥시도리닥타제, 트랜스퍼라제, 리아제, 리가제, 합성효소, 아이소머라제, 글리코시다제 및 뉴클레오티다제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 선택된 결합 분할이 일어나는 효소라면 어느 것이라도 측정될 수 있다. 선택적으로, 비드-결합된 기질 상의 효소 작용은 반응 혼합물에 존재하는 형광 리간드에 대해 결합쌍(리게이트)을 형성하거나 확인한다. 변형된 기질을 갖는 비드는 새롭게 형성된 리게이트에 형광 리간드를 결합시켜 형광이 되게 한다. 독특한 기질을 갖는 각각 형태의 비드를 구별할 수 있기 때문에, 비드 소집단의 혼합물은 동일 반응 혼합물에서 서너 가지 효소 활성을 동시에 측정하는데 사용된다.
효소 억제자는 효소반응을 억제하는 물질이다. 그들 중 많은 수는 임상적 응용에서 중요하다. 효소 억제자의 예로는 에드로포늄 클로라이드(edrophonium chloride), N-메틸피소스티그민, 브롬화네오스티그민, 황산피소스티그민, 타크린, 타크린 1-하이드록시 말레이트, 요드튜버로이딘(iodotuberoidin), 10-(a-디에틸아미노프로피오닐)-페노티아진, 칼미다졸륨(calmidazolium), 헤미콜리늄-3,3,5-디니트로카테콜, 디아실글리세롤 키나아제 억제자 I, 디아실글리세롤 억제자 II, 3-페닐프로파길아미니, N-모노메틸-L-아르기닌, 카르비도프(carbidop), 3-하이드록시벤 질히드라진, 히드랄라진, 크롤기린(clorgyline), 데프레닐하이드록시아민, 아이프로니아지드 포스페이트, 6-MeO-테트라하이드로-9H-피리도 인돌, 니알아미드, 파길린, 퀸아크린, 세미카바지드, 트라닐사이프로민(tranylcypromine), N,N-디에틸아미노에틸-2,2-디페닐발레르에이트하이드로클로라이드,3-이소부틸-1-메틸크산틴,파파버린(papaverine), 인도메타신, 2-사이클로옥틸-2-하이드록시에틸아민, 2,3-디클로로-a-메틸벤질아민(DCMB), 8,9-디클로로-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-20벤즈아제핀, p-아미노글루테티미드, p--아미노글루테티미드 주석산염, p-아미노글루테티미드 주석산염, 3-요드티로신, 알파-메틸티로신, L-, 알파-메틸티로신, L-, 아세타졸아미드, 디클로펜아미드, 6-하이드록시-2-벤조티아졸술폰아미드, 및 알로푸리놀 (allopurinol)를 포함한다.
상기 예들은 대부분의 보통의 면역진단, 효소, 약품, 및/또는 핵산 분석을 설명하고 수행하는데 사용된다. 새로운 약품을 발견하기 위한 결합 화학 도서관의 대량 검색, 오염물질의 환경적 검색, 식품 안정성 관련 검사, 농업적 필수품을 위한 다수의 검체 시험 등과 같은 다른 응용은 선행기술에서 알려진 표준 절차에 따라 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 다른 형광 염료로 착색된 다수의 좀더 작은 중합체 입자 또는 나노입자를 그의 표면에 갖는 코어 또는 담체 입자를 포함하는 새로운 형광 물품을 제공한다. 광원에 의해 여기될 때 그들은 다수의 형광 방출을 동시에 나타내며, 이는 샘플 내 다수 검체의 복합 분석에 유용하다. 형광 나노입자를 그의 표면에서 수송하는 결합된 복합체 입자, 그러한 중합체 물품을 제조하는 방법, 및 그러한 입자를 사용하는 여러 가지 응용 및 방법을 개시하는 유용한 발명이다.

Claims (29)

  1. 적어도 하나 이상의 형광 염료로 표지된 소정량의 나노입자를 부착시킨 담체 마이크로입자를 포함하는 마이크로입자.
  2. 제 1항에 있어서, 담체 마이크로입자 또는 나노입자, 또는 담체 마이크로입자 및 나노입자 모두가 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 담체 마이크로입자가 약 0.1∼1,000㎛ 사이의 직경을 갖는 중합체 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 담체 마이크로입자가 적어도 하나 이상의 형광 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 나노입자가 약 1∼100,000nm 사이의 직경을 갖는 중합체 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 중합체가 가교제의 0∼50 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 중합체가 자석 또는 자성적으로 반응성인 금속 산화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 중합체가 관능기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로입자.
  9. 별개의 형광 시그널을 각각 갖는 적어도 하나 이상의 중합체 나노입자 세트를 담체 중합체 마이크로입자에 부착하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 물품의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 별개의 형광 시그널이 적어도 하나 이상의 형광 염료에 의해 제공하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 형광 염료가 담체 중합체 마이크로입자에 결합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 나노입자가 상기 담체 마이크로입자에 공유결합적으로 부착하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 세트의 나노입자가 상기 담체 마이크로입자에 흡착에 의해 부착하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 9항에 있어서, 상기 형광 약품이 중합체 껍질에 의해 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 샘플에서 적어도 하나 이상의 검체가 존재하는지의 여부를 결정하는 방법에 있어서,
    (a) 샘플과, 각각의 검체와 결합하거나 반응하는 적어도 하나 이상의 분석 반응물과 적어도 하나 이상의 형광적으로 표지된 나노입자를 그 위에 배치한 마이크로입자의 기지량을 혼합하여 반응 혼합물을 형성하는 단계와; 그리고
    (b) 반응되거나 결합된 검체를 갖는 마이크로입자를 분석하여 샘플내 검체의 존재여부를 확인하는 단계
    로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 혼합 단계(a)가 반응 혼합물에 예정량의 경쟁 분자를 더 혼합하는 단계를 포함시킴을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 분석 단계(b)가 플로우 세포계측법에 의해 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 기지량의 대조 물질과 상기 검체를 비교하는 단계(c)를 다시 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 15항에 있어서, 검체가 항원, 항체, 수용체, 햅텐, 효소, 단백질, 펩티드, 핵산, 약품, 호르몬, 화학물질, 중합체, 병원균, 독소 및 그의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 15항에 있어서, 분석적 반응물이 검체의 결합쌍을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16항에 있어서, 경쟁 분자가 검체와 각각의 분석적 반응물과의 결합을 방해하는 분자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 대조물질이 각각의 분석적 반응물과 결합하는 검체와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 각각의 분석적 반응물에 의해 각각 인지된 다수의 반응물을 샘플에서 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 샘플을, 샘플내 검체중 하나와 특이적으로 결합하는 별개의 분석적 반응물과 별개의 형광 시그널을 각각 갖는 다수의 형광 물품 집단과 접촉시키고;
    (b) 표지 시약을 제공하고;
    (c) 분석적 반응물에 대한 검체의 결합을 나타내는, 표지를 검출하는 물품을 분석하고; 동시에
    (d) 각각의 상기 집단과 관련된 별개의 형광 시그널의 함수로서 결합된 각각의 검체를 갖는 물품 집단을 측정하는 단계
    로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 방법이 플로우 세포계측법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 형광물품 집단을 그들의 크기와 형상에 따라 다시 측정함을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23항에 있어서, 상기 표지 시약이 형광 표지 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 다수의 검체의 검출에 사용하기에 적당한 킷트에 있어서,
    (a) 별개의 형광 시그널을 갖는 부착된 나노입자를 갖는 일련의 마이크로입자와 검체중 하나와 특이적으로 결합할 수 있는 분석 반응물을 상기 일련의 입자내에 갖는 각 부재;
    (b) 분석 반응물과 동일한 검체에 결합하는 시약을 포함하는 2차 시약; 및
    (c) 상기 2차 시약에 또는 그로 인해, 또는 이와 관련되어 제조된 형광 표지를 포함하는 킷트로서,
    상기 킷트를 사용할 때, 분석 반응물이 특이적 결합을 통해 검체와 관계되고, 이 2차 시약은 특이적 분석적 반응물에 대한 검체의 결합 함수로서 형광 물품에 관계될 수 있으며, 상기 형광 표지의 시그널이 마이크로입자의 형광시그널과 독립적으로 다른 시그널 검출 방법에 의해 검출될 수 있는 킷트.
  28. 제 27항에 있어서, 분석적 반응물과 검체의 특이적 결합 상호작용을 방해할 수 있는 경쟁 분자를 다시 포함하는 킷트.
  29. 제 27항에 있어서, 각각의 분석적 반응물과 결합시 검체와 동일한 대조물질을 다시 포함하는 킷트.
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