KR100692227B1

KR100692227B1 - 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 항원의 융합 단백질 및이의 용도

Info

Publication number: KR100692227B1
Application number: KR1020007011196A
Authority: KR
Inventors: 스케이키예서에이더블유; 앨더슨마크; 캠포스-네토안토니오
Original assignee: 코릭사 코포레이션
Priority date: 1998-04-07
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2007-03-09
Anticipated expiration: 2019-04-07
Also published as: NO332500B1; JP4227302B2; KR20060064698A; PL202844B1; KR100797876B1; CN1629185B; NZ507378A; IL138809A0; CA2326598A1; NO20005050D0; PL344142A1; JP2002510494A; WO1999051748A3; WO1999051748A2; CZ302870B6; CZ20003652A3; BR9909472A; TR200002938T2; CA2326598C; JP2006273858A

Abstract

본 발명은 2종 이상의 마이코박테리아 튜베르쿨로시스 항원을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 특히 2종의 개개 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 2-융합 단백질, 3종의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 3-융합 단백질, 4종의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 4-융합 단백질, 및 5종의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 5-융합 단백질과, 결핵 감염의 진단, 치료 및 예방에 있어서 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

마이코박테리움 튜베르쿨로시스 항원의 융합 단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEINS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ANTIGENS AND THEIR USES}

본 발명은 2종 이상의 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원을 함유하는 융합 단백질에 관한 것이다. 특히 2종의 개개 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 2-융합 단백질, 3종의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 3-융합 단백질, 4종의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 4-융합 단백질, 및 5종의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 5-융합 단백질과, 결핵 감염의 진단, 치료 및 예방에 있어서 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

결핵은 M.튜베르쿨로시스로 감염되어 유발되는 만성 감염성 질병이다. 개발도상국에서 주요 질병일 뿐 아니라 세계 선진국에서도 그 심각성이 증가하고 있으며, 매년 약 8백 만명의 환자가 새로 발병하며 약 3백 만명의 환자가 사망한다. 감염되어도 상당한 시간동안 증상이 없을 수 있지만, 이 질병은 가장 통상적으로 폐의 급성 염증으로 나타나서 열 및 비생산적 기침을 초래한다. 치료하지 않으면, 통상적으로 심각한 합병증을 초래하고 사망에 이르게 된다.

결핵은 일반적으로 연장된 항생제 치료를 이용하여 제어할 수 있지만, 이러한 치료는 질병의 유포를 예방하기에 충분하지 않다. 감염된 개체는 무증상일 수 있지만, 때로는 전염성이 있다. 또한, 치료법에 따르는 것이 중요하지만, 환자 행동을 모니터하기가 어렵다. 일부 환자는 치료 과정을 끝내지 않아서, 비효과적인 치료와 약물 내성을 형성하게 될 수 있다.

결핵이 유포되는 것을 제어하기 위해서, 효과적인 예방 접종 및 질병의 정확한 초기 진단이 가장 중요하다. 현재, 생박테리아를 이용한 예방 접종은 보호성 면역을 유도하는 가장 효과적인 방법이다. 이러한 용도로 사용되는 가장 통상적인 마이코박테리움은 M.보비스(M. bovis)의 비독성 균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG)이다. 그러나, BCG의 안전성 및 효능은 논쟁의 근원이며, 미국과 같은 일부 국가에서는 이러한 제제를 일반 대중에게 예방접종하지 않는다.

결핵은 보통 피부 테스트를 사용하여 진단하는데, 이 테스트는 튜베르쿨린 PPD(단백질 정제형 유도체)에 대한 피내 노출을 포함한다. 항원 특이적 T 세포 반응은 주사 48∼72 시간 후에 주사 부위에서 측정가능한 경화를 초래하는데, 이는 마이코박테리아 항원에 노출되었음을 제시하는 것이다. 그러나, 감수성 및 특이성은 이 시험이 갖는 문제이며, BCG로 예방 접종한 개체는 감염된 개체와 구별할 수 없다.

대식세포는 M.튜베르쿨로시스 면역성의 기본적인 효과기로서 작용하는 것으로 보이지만, T 세포는 이러한 면역성의 주요 유발자이다. M.튜베르쿨로시스 감염에 대한 보호에 있어서 T 세포의 주요 역할은, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염과 관련된 CD4⁺ T 세포의 고갈로 인한 후천성 면역결핍 증후군 환자에서 M.튜베르쿨 로시스의 빈번한 발생으로 예시된다. 마이코박테리움 반응성 CD4⁺ T세포는 감마 인터페론(IFN-γ)의 유효 생산자인 것으로 보이며, 이는 마우스에서 대식세포의 항마이코박테리아 효과를 촉발하는 것으로 확인되었다. 인간의 경우 IFN-γ의 역할은 덜 명확하지만, 연구 결과 1,25-디히드록시-비타민 D3는 단독으로 또는 IFN-γ또는 종양 괴사 인자 알파와 함께 인간 대식세포를 활성화시켜 M.튜베르쿨로시스 감염을 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, IFN-γ는 인간 대식세포를 자극하여 1,25-디히드록시-비타민 D3을 만드는 것으로 알려져있다. 유사하게, 인터루킨-12(IL-12)는 M.튜베르쿨로시스 감염에 대한 내성을 자극하는데 역할을 하는 것으로 확인되었다. M.튜벨르쿨로시스 감염의 면역학에 대해서는 Chan 및 Kaufmann의 문헌[1994, Tuberculosis:Pathogenesis, Protection and Control, Bloom(ed.), ASM 프레스, 미국 워싱톤 디씨] 참고.

따라서, 개선된 백신과, 결핵을 진단, 예방 및 치료하기 위한 개선된 방법이 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 M.튜베르쿨로시스 항원의 융합 단백질에 관한 것이다. 특히, 2종 이상의 M.튜베르쿨로시스 항원을 함유하는 융합 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, M.튜베르쿨로시스 감염의 진단, 치료 및 예방에 있어서 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명은 부분적으로는 2 내지 5종의 M.튜베르쿨로시스 암호화 서열을 함유 하는 폴리뉴클레오티드가 개개의 성분의 면역원성 및 항원성을 보유하는 재조합 융합 단백질을 생산한다는 발명자들의 발견에 기초한 것이다. 본원에 개시된 융합 단백질은 T 세포 증식, 시토킨 생성 및 항체 생성에 의해 측정되는 바와 같이 T 세포 및 B 세포 반응을 모두 유도하였다. 또한, 융합 단백질은 생체내 보조제와 면역원으로서 사용되어 M.튜베르쿨로시스에 대한 세포 매개된 면역성 및 체액 면역성을 유발하였다. 또한, 융합 단백질은 융합 작제물에 의해 만들어져서 보조제와 함께 백신 제제로 사용하여 결핵의 형성에 대항하여 동물을 장기간 보호하였다. 융합 단백질은 개개의 단백질 성분의 혼합물보다 더욱 효과적인 면역원이었다.

본 발명의 특정 양태에서, 분리되거나 정제된 본 발명의 M.튜베르쿨로시스 폴리펩티드는 M.튜베르쿨로시스 감염의 예방 및/또는 치료시 검체에게 투여하기 위해서 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 융합 단백질의 면역원성은 보조제를 포함하면 개선될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 분리되거나 또는 정제된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 시험관내 재조합 융합 폴리펩티드 항원을 생성할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 DNA 백신으로서 검체에게 직접 투여하여 검체내 항원 발현과 이에 따른 항M.튜베르쿨로시스 면역 반응의 유도를 유발할 수 있다.

본 발명의 목적은 폴리펩티드를 질병 진행의 모니터 또는 감염 진단을 위해 M.튜베르쿨로시스에 대항하는 체액 항체 또는 세포 매개된 면역성을 검출하기 위한 시험관내 분석에서 사용하는 것이다. 추가로, 폴리펩티드는 피내 피부 테스트의 형태로 시험관내 진단제로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 면역원으로 서 사용하여 항M.튜베르쿨로시스 항체를 인간이 아닌 동물에서 형성할 수 있다. 항체를 사용하여 생체내 및 시험관내 표적 항원을 검출할 수 있다.

도 1A 및 도 1B: 3-융합 단백질 Ra12-TbH9-Ra35(Mtb32A로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 및 아미노산 서열(서열 번호 2).

도 2: 3-융합 단백질 Erd14-DPV-MTI(Mtb39A로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3) 및 아미노산 서열(서열 번호 4).

도 3A 내지 도 3D: 3-융합 단백질 TbRa3-38kD-Tb38-1의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5) 및 아미노산 서열(서열 번호 6).

도 4A 내지 도 4D: 2-융합 단백질 TbH9-Tb38-1의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 7) 및 아미노산 서열(서열 번호 8).

도 5A 내지 도 5J: 4-융합 단백질 TbRa3-38kD-Tb38-1-DPEP(TbF-2로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 9) 및 아미노산 서열(서열 번호 10).

도 6A 및 도 6B: 5-융합 단백질 Erd14-DPV-MTI-MSL-MTCC2(Mtb88f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 11) 및 아미노산 서열(서열 번호 12).

도 7A 및 도 7B: 4-융합 단백질 Erd14-DPV-MTI-MSL(Mtb46f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 13) 및 아미노산 서열(서열 번호 14).

도 8A 및 도 8B: 4-융합 단백질 DPV-MTI-MSL-MTCC2(Mtb71f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 15) 및 아미노산 서열(서열 번호 16).

도 9A 및 도 9B: 3-융합 단백질 DPV-MTI-MSL(Mtb31f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 17) 및 아미노산 서열(서열 번호 18).

도 10A 및 도 10B: 3-융합 단백질 TbH9-DPV-MTI(Mtb61f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 19) 및 아미노산 서열(서열 번호 20).

도 11A 및 도 11B: 3-융합 단백질 Erd14-DPV-MTI(Mtb36f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 21) 및 아미노산 서열(서열 번호 22).

도 12A 및 도 12B: 2-융합 단백질 TbH9-Ra35(Mtb59f로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 23) 및 아미노산 서열(서열 번호 24).

도 13A 및 도 13B: 2-융합 단백질 Ra12-DPPD(Mtb24로 명명)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 25) 및 아미노산 서열(서열 번호 26).

도 14A 내지 도 14F: 2종의 융합 단백질 및 개개 성분으로 자극한 경우 6 PPD+ 검체의 T 세포 증식 반응.

도 15A 내지 도 15F: 2종의 융합 단백질 및 개개 성분으로 자극한 경우 6 PPD+ 검체의 IFN-γ생성.

도 16A 내지 도 16F: 융합 단백질 또는 개개 성분과 보조제로 면역화한 마우스의 T 세포 증식.

도 17 : 융합 단백질 또는 개개 성분과 보조제로 면역화한 마우스의 IFN-γ 생성.

도 18 : 융합 단백질 또는 개개 성분과 보조제로 면역화한 마우스의 IL-4 생성.

도 19A 내지 도 19F: 융합 단백질 또는 개개 성분과 보조제로 면역화한 마우 스의 혈청 항체 농도.

도 20A 내지 도 20C: M.튜베르쿨로시스의 에어로졸 항원 투여 후에 기니아 피그의 생존율. 융합 단백질, Mtb32A 및 Mtb39A는 보조제 SBAS1c(20A), SBAS2(20B) 또는 SBAS7(20C)중에서 제형화하였고, 박테리아로 항원투여하기 전에 기나아 피그에서 면역원으로서 사용하였다. BCG는 양성 대조군이다.

도 21A 및 도 21B: 융합 단백질 TbH9-Tb38-1에 의한 TbH9-특이적 T 세포에서 증식 및 IFN-γ 생성 자극.

도 22A 및 도 22B: 융합 단백질 TbH9-Tb38-1에 의한 Tb38-1-특이적 T 세포에서 증식 및 IFN-γ 생성 자극.

도 23A 및 도 23B: 융합 단백질 TbH9-Tb38-1에 의한 TbH9 및 Tb38-1 항원에 반응하는 것으로 이미 밝혀진 T 세포에서 증식 및 IFN-γ 생성의 자극.

발명의 상세한 설명

본 발명은 결핵의 치료 또는 예방에 유용한 항원, 이 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항원은 M.튜베르쿨로시스 항원의 융합 폴리펩티드 및 이의 변형체이다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 항원은 거대한 융합 폴리펩티드 분자로 융합되는 2종 이상의 M.튜베르쿨로시스의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 항원은 항원의 면역원성을 증강시키거나, 또는 예컨대 항원의 한 단부에서 히스티딘 잔기의 연신체를 첨가하여 항원을 분리시키는 기타 양태에서 이들 항원을 개선시키는 것으로 고안된 기타 성분을 추가로 포함할 수 있다.

5.1. M.튜베르쿨로시스 특이적 항원

항원의 상동체 및 변형체를 비롯하여 본 발명의 항원은 도 1A 내지 도 13B에서 예시되어 있다. 이들 항원은, 예컨대 하기 개시된 링커 펩티드 서열을 첨가하여 변형시킬 수 있다. 이들 링커 펩티드는 도 1A 내지 도 13B에 제공된 융합 단백질 각각을 구성하는 1종 이상의 폴리펩티드 사이로 삽입할 수 있다. 본 발명의 기타 항원은 이미 언급한 38 kD(서열 번호 27) 항원과 같은 M.튜베르쿨로시스의 공지된 항원에 결합되어 있는 도 1A 내지 도 13B에 개시된 항원이다(Andersen 및 Hansen, 1989, Infect, Immun. 57:2481-2488; 젠뱅크 수탁 번호 M30046).

5.2 면역원성 분석

본원에 개시된 항원 및 이의 면역원성 부분은 면역원 반응을 유발하는 능력이 있다. 더욱 구체적으로, 항원은 M.튜베르쿨로시스 면역 개체에서 유래한 T 세포, NK 세포, B 세포 및/또는 대식세포에서 증식 및/또는 시토킨 생성(즉, 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12 생성)을 유도하는 능력을 갖는다. 항원에 대한 면역원성 반응을 평가하는데 사용하기 위한 세포 유형의 선별은 목적하는 반응에 따라 다르다. 예를 들어, 인터루킨-12 생성은 B 세포 및/또는 대식세포를 함유하는 제제를 사용하여 가장 쉽게 평가된다. M.튜베르쿨로시스 면역 개체는 M.튜베르쿨로시스에 대한 효과적인 T 세포 반응을 착수하여 결핵 형성에 대한 내성이 있는 것으로 간주되는(즉, 질병 증상이 거의 없는) 개체이다. 이러한 개체는 결핵 단백질(PPD)에 대한 강한 양성(즉, 약 10 mm 이상의 직경으로 경화) 피내 피부 테스트 반응와 결핵 질병의 임의의 증후 또는 증상의 부재를 기초로 확인할 수 있다. M.튜베르쿨로시스 면역 개체에서 유래된 T 세포, NK 세포, B 세포 및 대식세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, PBMC(즉, 말초 혈액 단핵 세포) 제제를 성분 세포의 추가의 분리없이 사용할 수 있다. PBMC는, 예컨대 "피콜(FICOLL)"(미국 뉴욕주 윈트롭 래보러터리즈)을 통한 밀도 원심분리를 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 개시된 분석에 사용하기 위한 T 세포는 PBMC로부터 직접 정제할 수 있다. 대안적으로, 마이코박테리아 단백질에 대항하여 반응성이 있는 풍부한 T 세포주, 또는 개개 마이코박테리아 단백질에 대한 반응성이 있는 T 세포 클론을 사용할 수 있다. 이러한 T 세포 클론은, M.튜베르쿨로시스 면역 개체에서 유래한 PBMC를 2∼4주 동안 마이코박테리아 단백질과 함께 배양하여 형성할 수 있다. 이는 마이코박테리아 단백질 특이적 T 세포만을 팽창시켜, 이러한 세포로만 구성된 세포주를 형성한다. 그 다음 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이들 세포를 클로닝하고 개체 단백질로 시험하여 더욱 정확하게 개체의 T 세포 특이성을 규정하였다. 일반적으로 M.튜베르쿨로시스 면역 개체에서 유래한 T 세포, NK 세포, B 세포 및/또는 대식세포를 사용하여 수행된 증식 및/또는 시토킨 생성(즉, 인터페론 γ및/또는 인터루킨-12 생성)에 대한 분석에서 시험 양성인 항원은 면역원성으로 간주된다. 이러한 분석은, 예컨대 하기에 개시된 대표적인 절차를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 항원의 면역원성 부분은 유사한 분석을 사용하여 확인할 수 있으며, 본원에 개시된 폴리펩티드내에 존재할 수 있다.

폴리펩티드(예, 면역원성 항원 또는 이의 일부 또는 기타 변형체)가 세포 증식을 유도하는 능력은 세포(예, T 세포 및/또는 NK 세포)를 폴리펩티드와 접촉시키 고, 이 세포의 증식을 측정하여 평가한다. 일반적으로, 약 10⁵ 세포를 평가하기에 충분한 폴리펩티드의 양은 약 10 ng/㎖∼약 100 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 10 ㎍/㎖이다. 세포와 폴리펩티드의 항온 처리는 통상적으로 약 6일 동안 37℃에서 수행한다. 세포와 폴리펩티드의 항원처리후에, 세포는 증식 반응에 대해 분석하였으며, 증식 반응은 방사능표지된 티미딘의 펄스에 세포를 노출하는 단계 및 세포내 DNA내로의 표지의 혼입을 측정하는 단계와 같이 당업계에 공지된 방법으로 평가할 수 있다. 일반적으로 배경(즉, 폴리펩티드 없이 배양된 세포에 대해 관찰된 증식)보다 3배 이상의 증가를 초래하는 폴리펩티드는 증식을 유도할 수 있는 것으로 생각된다.

폴리펩티드가 세포내에서 인터페론 γ및/또는 인터루킨-12의 생성을 자극하는 능력은, 폴리펩티드와 세포를 접촉시키는 단계 및 세포가 생성한 인터페론-γ 또는 인터루킨-12의 레벨을 측정하는 단계로서 평가할 수 있다. 일반적으로, 약 10⁵ 세포의 평가에 충분한 폴리펩티드의 양은 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 10 ㎍/㎖이다. 폴리펩티드는, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시된 바와 같이 비드 또는 생분해성 미소구와 같은 고체 지지체에 고정시킬 수 있지만, 반드시 그럴 필요가 있는 것은 아니다. 세포와 폴리펩티드의 항온 처리는 통상적으로 약 6일 동안 37℃에서 수행한다. 폴리펩티드와 세포를 항온처리한 후에, 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12(또는 이의 1 이상의 서브유닛)에 대해 분석하는데, 이는 효소 결합형 면역흡착 분석(ELISA) 또는 IL-12 P70 서브유닛의 경우에 T 세포의 증식을 측정하는 분석과 같은 생분석 등의 당업계에 공지된 방법으로 평가할 수 있다. 일반적으로 배양된 상청액(㎖당 10⁴∼10⁵ T 세포를 포함) 1 ㎖ 당 50 pg 이상의 인터페론-γ의 생성을 초래하는 폴리펩티드는 인터페론-γ의 생성을 자극할 수 있는 것으로 간주된다. 10⁵ 대식세포 또는 B 세포(또는 3 ×10⁵ PBMC) 당 10 pg/㎖ 이상의 IL-12 P70 서브유닛 생성, 및/또는 100 pg/㎖의 IL-12 P40 서브유닛 생성을 자극하는 폴리펩티드는 IL-12의 생성을 자극할 수 있는 것으로 간주된다.

일반적으로, 면역원성 항원은 약 25% 이상의 M.튜베르쿨로시스 면역 개체에서 유래한 T세포, NK 세포, B 세포 및/또는 대식세포에서 증식 및/또는 시토킨 생성(즉, 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12 생성)을 자극하는 항원이다. 이들 면역원성 항원 중에서, 우수한 치료 특성을 갖는 폴리펩티드는 상기 분석에 있어서 반응 크기와 반응이 관찰되는 개체의 백분율을 기초로 하여 구별할 수 있다. 또한, 우수한 치료 특성을 갖는 항원은 M.튜베르쿨로시스 면역이 없는 개체의 약 25% 이상으로부터 유래된 세포에서 시험관내 증식 및/또는 시토킨 생성을 자극하지 않으며, 따라서 M.튜베르쿨로시스 반응성 세포로 인한 특이적이 아닌 반응을 제거할 수 있다. M.튜베르쿨로시스 면역 개체에서 유래한 고비율의 T 세포, NK 세포, B 세포 및/또는 대식세포 제제에서 반응을 유도하는 항원(기타 개체에서 유래한 세포 제제에서는 반응의 발생률이 낮음)은 우수한 치료 특성이 있다.

우수한 치료 특성이 있는 항원은, 백신으로서 투여하는 경우 실험 동물에서 M.튜베르쿨로시스 감염의 중증 정도를 감소시키는 능력을 기초로 확인할 수도 있 다. 실험 동물에 사용하기 위한 적절한 백신 제제는 하기에 개시되어 있다. 효능은 감염 실험 후 약 50% 이상의 박테리아 수 감소 및/또는 약 40% 이상의 사망율 감소를 제공하는 항원의 능력을 기초로 결정할 수 있다. 적절한 실험 동물로는 마우스, 기나아 피그 및 영장류가 있다.

5.3. 암호화 서열의 분리

본 발명은 M.튜베르쿨로시스의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 하기 섹션 6의 실시예의 특정 양태에서, 13개의 M.튜베르쿨로시스 융합체를 암호화하는 서열을 작제하였다. 본 발명에 따라서, 융합 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 암호화 서열의 발현을 유도하는 재조합 분자를 형성할 수 있다.

전길이 암호화 서열 또는 상동성 변형체를 클로닝하여 융합 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해서, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보체의 일부로부터 고안된 표지된 DNA 프로브를 사용하여 M.튜베르쿨로시스의 각종 균주로부터 제조된 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 검색하여 각 개별 성분의 암호화 서열을 확인하였다. 암호화 서열의 분리는, 본원에 개시된 암호화 서열을 기초로 고안된 2개의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머 푸울을 사용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 수행할 수도 있다.

본 발명은, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 분리되고 정제된 폴리뉴클레오티드와, 이의 상보 서열에 선택적으로 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직한 양태 에서, 저 엄중 조건하에서 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25의 서열 또는 이의 상보 서열에 하이브리드화하고 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 융합 단백질의 면역원성을 보유하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 비제한적인 예로서, 예시적인 저 엄중 조건은 다음과 같다(Shilo 및 Weinberg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6789-6792 참조): DNA를 함유하는 필터는 35% 포름아미드, 5 X SSC, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% 피콜, 1% BSA, 및 500 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액중 40℃에서 6 시간 동안 전처리한다. 동일한 용액에서 다음과 같은 변형을 가하여 하이브리드화시킨다: 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.2% BSA, 100 ㎍/㎖ 연어 정자 DNA, 10%(wt/vol) 덱스트란 설페이트 및 5∼20 × 10⁶ cpm ³²P 표지된 프로브를 사용한다. 필터를 하이브리드화 혼합물에서 18∼20 시간 동안 40℃에서 항온처리한 다음 2X SSC, 25mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 함유하는 용액 중에서 55℃에서 1.5 시간 동안 세척하였다. 세척 용액을 새로운 용액으로 대체하고 추가의 1.5 시간 동안 60℃에서 항온처리하였다. 필터를 건조 블롯팅하고, 자가방사선 사진을 위해 노출시켰다. 필요에 따라, 65∼68 ℃에서 세번째로 세척하고, 필름에 재노출시켰다. 사용할 수 있는 기타의 저 엄중 조건은 당업계에 공지되어 있다(예, 교차 종 하이브리드화에 대해 사용된 바와 같은 조건).

또 다른 바람직한 양태에서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25의 암호화 서열 또는 이의 상보 서열에 고 엄중 조건하에서 하이브리드화하고 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 융합 단백질의 면역원성을 보유하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 비제한적인 예로서, 예시적인 고 엄중 조건은 다음과 같다. DNA를 함유하는 필터의 예비하이브리드화는 6 ×SSC, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.02% BSA 및 500 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA로 구성된 완충액 중에서 65℃에서 밤새 8 시간 동안 수행한다. 필터는 100 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA 및 5∼20 ×10⁶ cpm의 ³²P-표지된 프로브를 함유하는 예비하이브리드화 혼합물에서 48 시간 동안 65℃에서 하이브리드화한다. 필터의 세척은 2 X SSC, 0.01% PVP, 0.01% 피콜, 및 0.01% BSA를 함유하는 용액내 37℃에서 1 시간 동안 수행한다. 그 다음 자가방사선 사진법을 수행하기 전에 45 분 동안 50℃에서 0.1 ×SSC에서 세척한다. 사용할 수 있는 기타 고 엄중 조건은 당업계에 공지되어 있다.

또 다른 바람직한 양태에서, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25의 암호화 서열 또는 이의 상보 서열에 중간 엄중 조건하에서 하이브리드화하고 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 융합 단백질의 면역원성을 보유하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.중간 엄중 조건의 예는 다음과 같다: DNA를 함유하는 필터는 6 X SSC, 5X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에서 55℃에서 6 시간 동안 예비처리하였다. 동일한 용액에서 하이브리드화를 수행하고 5∼20 ×10⁶ cpm ³²P 표지된 프로브를 사용한다. 필터는 55℃에서 18∼20 시간 동안 하이브리드화 혼합물에서 항온처리한 다음, 1 ×SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 용액 중에서 60℃에서 30분 동안 2회 세척하였다. 필터를 건조 블롯팅하고 자가방사선 사진을 위해 노출시킨다. 사용할 수 있는 기타 중간 엄중 조건은 당업계에 공지되어 있다. 필터 세척은 2 X SSC, 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 1 시간 동안 37℃에서 수행한다.

5.4. 암호화 서열이 암호화하는 폴리펩티드

본 발명에 따라서, 융합 단백질, 이의 단편 또는 이의 기능 등가물을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 융합 단백질, 이의 단편 또는 이의 기능 단편의 발현을 적절한 숙주 세포내에서 유도하는 재조합 핵산 분자를 형성할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 융합 폴리펩티드 생성물은 암호화 서열의 분자 조작에 의해 변경할 수 있다.

유전자 코드의 고유 축퇴성으로 인하여, 거의 동일하거나 또는 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 암호화하는 기타 DNA 서열은 융합 폴리펩티드의 발현을 위해 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 상기 섹션 5.3.에 개시한 저 엄중 조건, 중간 엄중 조건 또는 고 엄중 조건하에서 암호화 서열 또는 그의 보체에 하이브리드화할 수 있는 것들을 포함한다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 변경된 뉴클레오티드 서열은, 동일하거나 또는 기능적으로 등가인 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 형성하는 상이한 뉴클레오티드 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 포함한다. 유전자 생성물 자체는 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 포함하며, 침묵 변화를 초래하여 기능적으로 등가인 항원성 에피토프를 생성할 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성에 있어서 유사성을 기초로 만들 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있고; 양으로 하전된 아미노산으로는 리신, 히스티딘 및 아르기닌이 있으며; 친수성 값이 유사한 하전되지 않은 극성 헤드기를 갖는 아미노산으로는 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신이 있으며; 비극성 헤드기를 보유한 아미노산으로는 알라닌, 발린, 이소로이신, 로이신, 페닐알라닌, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판 등이 있다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 비제한적인 예로서 유전자 생성물의 프로세싱 및 발현을 변형시키는 변경을 비롯하여 각종 단부에 대한 융합 단백질 암호화 서열을 변경시키기 위해서 공학적으로 조작할 수 있다. 예를 들어, 공지된 방법, 예컨대 부위 지향족 돌연변이 유발법을 사용하여 돌연변이를 도입하여 신규 제한 부위를 삽입하고, 글리코실화 패턴, 인산화 등을 변경시킬 수 있다.

본 발명의 별도의 양태에서, 융합 단백질의 암호화 서열은 당업계에 공지된 화학적 방법을 사용하여 전체 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 예컨대 Caruthers 등, 1980, Nuc. Acids Res.Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 180, Nuc.Acids Res. 9(10):2331; Matteucci 및 Caruthers, 1980, Tetrahedron Letter 21:719; 및 Chow and Kempe, 1981, Nuc.Acids Res. 9(12):2807-2817 참고. 대안적으로, 폴리펩티드 자체는 화학적 방법을 사용하여 생성하여 전체적으로 또는 부분적으로 아미노 산 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 고상 기법을 사용하여 합성하고, 수지로부터 절단한 다음, 예비용 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다. (Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp50-60 참조). 합성 폴리펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열 분석으로 확인할 수 있다(예, Edman degradation procedure; Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., pp 34-49 참조).

추가로, 융합 단백질의 암호화 서열을 시험관내 또는 생체내 돌연변이시켜 해독, 개시 및/또는 종결 서열을 형성 및/또는 파괴하거나, 또는 암호화 영역에서 변형을 형성하고/또는 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 선재의 것을 파괴하여 시험관내 변형을 용이하게 할 수 있다. 화학적 돌연변이 유발법, 시험관내 부위 지향족 돌연변이 유발법(Hutchinson, C., 등, 1978, J.Biol.Chem 253:6551), TAB(등록상표) 링커(파마시아)의 사용 등을 비롯하여 당업계에 공지된 돌연변이 유발 기법을 사용할 수 있다. 조작 과정에서 융합 폴리펩티드의 면역원성을 파괴하지 않는 것이 중요하다.

또한, 비전형적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체는 서열내로 치환체 또는 삽입체로서 도입할 수 있다. 비전형적인 아미노산의 비제한적인 예로는 보통 아미노산의 D 이성질체, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥사논산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르로이신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사코신, 시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 설계 아미노산, 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산 및 일반적으로 아미노산의 유사체가 있다. 또한, 아미노산은 D(우선성) 또는 L(좌선성)일 수 있다.

특정 양태에서, 융합 단백질에서 각 항원의 암호 서열은 임의의 순서의 펩티드 결합을 통해 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 연결되어 있다. 대안적으로, 펩티드 링커 서열은, 결핵을 예방 및 치료하는데 항원성 효과를 최대화하는 2차 구조 및 3차 구조로 폴리펩티드를 중첩시켜 이를 유지하기에 충분한 거리로 융합 폴리펩티드를 구성하는 개개의 폴리펩티드를 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 융합 단백질내로 혼입한다. 적절한 폴리펩티드 링커 서열은 다음 인자를 기준으로 선택할 수 있다. (1) 가요성의 연장된 구조를 채택하는 능력; (2) 1차 및 2차 폴리펩티드상의 작용 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택하는 능력이 없음; (3) 폴리펩티드 작용 에피토프와 반응하는 소수성 또는 하전된 잔기의 결핍. 바람직한 펩티드 링커 서열로는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 기타 거의 중성인 아미노산은 링커 서열에 사용할 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[Maratea 등, Gene 40:39-46, 1985; Murphy 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 링커 서열은 길이가 1 내지 약 50개인 아미노산일 수 있다. 펩티드 서열은, 제1 및 제2 폴리펩티드가 기능성 도메인을 분리하고 입체 방해를 방지하는데 사용할 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우 필요하지 않다. 예를 들어, 융합 단백질 중 항원은 1 내지 3회 반복되는 Gly-Cys-Gly 또는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser과 같은 가요성 폴리링커로 연결될 수 있다(Bird 등, 1988, Science 242:423-426; Chaudhary 등, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 87:1066-1070).

일양태에서, 이러한 단백질은 단백질을 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 생성된다. 이러한 융합 생성물은 당업계에 공지된 방법으로 적절한 암호 프레임내에서 목적하는 아미노산 서열을 암호화하는 적절한 핵산 서열을 서로 결찰시키고, 당업계에 공지된 방법으로 생성물을 발현하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 이러한 생성물은, 예컨대 펩티드 합성기를 사용하여 단백질 합성 기법으로 제조할 수 있다. 시토킨 또는 보조제와 같은 기타 분자에 대한 암호화 서열을 또한 융합 폴리뉴클레오티드에 첨가할 수 있다.

5.5. 융합 단백질의 생성

본 발명의 M.튜베르쿨로시스 융합 단백질을 생성하기 위해서, 단백질 또는 기능적 등가물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호화 서열의 전사 및 해독에 대한 필수 성분을 함유하는 벡터내로 삽입한다. 재조합 발현 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포 또는 세포주를 각종 용도로 사용할 수 있다. 이들의 비제한적인 예로는 융합 단백질의 대규모 생성이 있다.

당업계에 공지된 방법을 사용하여 융합체 암호화 서열 및 적절한 전사/해독 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법의 예로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합 등이 있다(예컨대 Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 및 Ausubel 등, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 RNA는 화학적으로 합성할 수도 있다(Gait 편저, 1984, Oligonucleotide Synthesis, 미국 옥스포드 IRL 프레스).

5.5.1. 발현계

각종 숙주 발현 벡터계를 사용하여 융합 단백질 암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 이들의 비제한적인 예로는, 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예, E.콜리, B.서브틸리스)와 같은 미생물; 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예, 사카로마이시스, 피치아); 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 포유류 세포계(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포) 등이 있다. 이들 계의 발현 성분은 강도 및 특이성에 따라 다양하다.

이용된 숙주/벡터계에 따라서, 구조 프로모터 및 유도 프로모터를 비롯하여 임의의 다수의 적절한 전사 및 해독 성분을 발현 벡터내에 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아계에서 클로닝한 경우, 유도성 프로모터, 예컨대 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터; 시토메갈로바이러스 프로모터) 등을 사용할 수 있다. 곤충 세포계에서 클로닝하는 경우, 바큘로바이러스 폴리헤드론 프로모터와 같은 프로모터를 사용할 수 있다. 식물 세포계에서 클로닝하는 경우, 식물 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예, 열 충격 프로모터; RUBISCO의 작은 서브유닛용 프로모터; 클로로필 α/β 결합 단백질용 프로모터) 또는 식물 바이러스 유래의 프로모터(예, CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 코트 단백질 프로모터)를 사용할 수 있다. 포유류 세포계에서 클로닝하는 경우, 포유류 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스 유래의 프로모터(예, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시나 바이러스 7.5 K 프로모터)를 사용할 수 있다. 항원 암호화 서열의 다중 카피를 포함하는 세포주를 형성하는 경우, SV40-, BPV- 및 EBV-계 벡터를 적절한 선별 마커와 함께 사용할 수 있다.

M.튜베르쿨로시스 항원의 발현의 경우 박테리아계가 바람직하다. 생체내 전달의 경우, 바실러스-칼메트-구에린과 같은 박테리아를 공학적으로 조작하여 본 발명의 융합 폴리펩티드를 세포 표면에서 발현할 수 있다. 다수의 기타 박테리아 발현 벡터는 발현된 생성물을 위해 목적하는 용도에 따라 선택하는 것이 유용하다. 예를 들어, 약학 조성물 제제용으로 다량의 융합 단백질을 생산하고자 하는 경우, 용이하게 정제되는 고레벨의 융합 단백질 생성물 발현을 유도하는 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터의 비제한적인 예로는 암호화 서열이 lacZ 암호 영역이 있는 틀내에서 벡터내로 결찰되어 하이브리드 단백질을 형성할 수 있는 E.콜리 발현 벡터 pUR278(Ruther 등, 1983, EMBO J. 2:1791); pIN 벡터(Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J.Biol.Chem. 264:5503-5509) 등이 있다. pGEX 벡터를 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 함께 사용하여 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비이드에 흡착시키고 유리 글루타티온의 존재하에 용출시켜 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 고안하여 해당 클로닝된 융합 폴리펩티드를 GST 부분으로부터 방출시킬 수 있다.

5.5.2. 단백질 정제

일단 재조합 단백질이 발현되면, 생성물의 방사능 표지를 비롯하여 생성물의 물리적 또는 기능적 특성을 기초로 분석한 후, 겔 전기 영동, 방사능 면역 흡착법, ELISA, 생분석 등의 분석으로 확인할 수 있다.

일단 암호화된 단백질이 확인되면, 크로마토그래피(예, 고 성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환, 친화도 및 크기별 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도를 비롯한 표준 기법, 또는 단백질 정제에 대한 임의의 기타 표준 기법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다. 사용된 실제 조건은, 부분적으로는 순 전하, 소수성, 친수성 등의 인자에 따라 좌우되며, 당업자에게는 자명할 것이다. 기능적 특성은 임의의 적절한 분석, 예컨대 항체 결합, T 세포 증식 유도, IL-2, IL-4 및 IFN-γ와 같은 시토킨 생성 자극을 이용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 실시를 위하여, 각 융합 단백질은 기타 단백질로부터 80% 이상 정제된 것이 바람직하다. 90% 이상 정제된 것이 더욱 바람직하다. 생체내 투여의 경우, 단백질이 95% 이상 정제 된 것이 바람직하다.

5.6. 융합 단백질 암호화 서열의 용도

본 발명의 융합 단백질 암호화 서열을 사용하여 M.튜베르쿨로시스에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 증강시키는데 면역원으로서 사용하기 위한 단백질 생성물을 암호화할 수 있다. 또한, 이러한 암호화 서열은 시토킨과 같은 또 다른 분자의 암호화 서열 또는 보조제와 함께 결찰시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 DNA 백신으로서 생체내에서 사용할 수 있다(미국 특허 제5,589,466; 5,679,647; 5,703,055). 본 발명의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역 반응을 직접 유도하는 수용체에서 암호화된 단백질을 발현한다. 폴리뉴클레오티드를 천연 검체에게 주사하여 암호화된 생성물에 대한 면역 반응을 감작시키거나, 또는 감염되거나 면역화된 검체에게 투여하여 2차 면역 반응을 증강시킬 수 있다.

바람직한 양태에서, 치료 조성물은 발현 벡터의 일부인 융합 단백질 암호화 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 특히, 이러한 폴리뉴클레오티드는 암호 영역에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하는데, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이거나 또는 구조 프로모터이고, 임의적으로 조직 특이적이다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 게놈내 소정의 부위에서 상동성 재조합을 촉진하는 영역과 인접한 암호화 서열을 포함하며, 따라서 암호화 서열의 염색체내 발현을 제공한다(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra 등, 1989, Nature 342:435-438).

핵산의 검체내로의 전달은, 검체가 핵산 또는 핵산 보유 벡터에 직접 노출되 는 경우 직접적이거나, 또는 세포가 시험관내에서 핵산으로 먼저 형질전환된 후 검체내로 이식되는 경우에는 간접적일 수 있다. 이들 2가지 방법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 전달법으로서 공지되어 있다.

특정 양태에서, 핵산은 생체내 직접 투여되고, 이것이 발현되면 암호화된 융합 단백질 생성물을 생성한다. 이는 당업계에 공지된 여러 방법, 예컨대 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제한 다음 투여하여 세포내가 되도록 하는 방법, 예컨대 결핍성 또는 약화된 레트로바이러스 또는 기타 바이러스 벡터를 사용하여 감염시키는 방법(미국 특허 제4,980,286호), 또는 나출 DNA의 직접 주사법, 또는 미소입자 충격(예, 유전자 총, 바이오리스틱, 듀퐁), 또는 지질 또는 세포 표면 수용체로 또는 형질감염제로 코팅, 리포좀, 미세입자 또는 미소캡슐내로 캡슐화 이용(미국 특허 제5,407,609호, 제5,853,763호, 제5,814,344호 및 제5,820,883호), 또는 핵으로 유입하는 것으로 알려진 펩티드와 연결시켜 투여하는 방법, 또는 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하는데 사용할 수 있는 수용체 매개된 세포이물흡수에 대한 리간드 검체와 결합하여 투여하는 방법(예컨대 Wu 및 Wu, 1987, J.Biol.Chem. 262:4429-4432 참고) 등으로 수행할 수 있다. 또 다른 양태에서, 리간드가 방추균원성 바이러스 펩티드를 포함하는 핵산-리간드 복합체를 형성하여 엔도솜을 파괴하여 핵산이 라이소좀 분해되는 것을 피할 수 있다. 또 다른 양태에서, 핵산은 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해서 특이적 수용체를 표적화함으로써 생체내에서 표적화될 수 있다(예컨대 1992년 4월 16일자 PCT 공보 WO92/06180; 1992년 12월 23일자 WO 92/22635; 1992년 11월 26일자 WO92/20316호; 1993년 7월 22일자 WO93/14188호; 1993년 10월 14일자 WO 93/20221호 참조). 대안적으로, 핵산은 세포내로 도입하고 상동성 재조합에 의해 발현시키기 위해서 숙주 세포 DNA내로 혼입시킬 수 있다(Koller and Smithies, 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra 등, 1989, Nature 342:435-438).

특정 양태에서, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용할 수 있다(Miller 등, 1993, Meth.Enzymol. 217:581-599). 레트로바이러스 벡터를 변형하여 바이러스 게놈의 패키징 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 위해 필요하지 않은 레트로바이러스 서열을 결실시켰다. 융합 암호화 서열을 벡터내로 클로닝하는데, 이는 수용체내로의 핵산 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 더욱 상세한 설명은 문헌[Boesen 등, 1994, Biotherapy 6:291-302]에서 찾아볼 수 있는데, 이 문헌에는 화학 치료에 더욱 내성이 있는 간세포를 제조하기 위해서 조혈간세포에 mdr1유전자를 전달하는데 있어서 레트로바이러스 벡터의 용도에 관하여 개시되어 있다. 유전자 치료에 있어서 레트로바이러스 벡터의 용도를 예시한 기타 문헌으로는 Clowes 등, 1994, J.Clin.Invest. 93:644-651; Kiem 등, 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; 및 Grossman and Wilson, 1993, Curr.Opin.in Genetics and Devel. 3:110-114 등이 있다.

아데노바이러스는 유전자 치료에 사용할 수 있는 또 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 유전자를 호흡 상피세포에 전달하는데 특히 유용한 매개체이다. 아데노바이러스는 자연적으로 호흡 상피세포를 감염시켜 온화한 질병을 유발한 다. 아데노바이러스계 전달계의 기타 표적은 간, 중추신경계, 내피세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 장점이 있다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 생체내 유전자 전달에 사용하기 위해서 제안되었다(Walsh 등, 1993, Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 204:289-300)

또 다른 방법은 전기사출법, 리포펙션, 인산칼슘 매개형 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법으로 조직 배양액내 세포에 작제물을 전달하는 것을 포함한다. 일반적으로, 전달 방법은 선별 마커를 세포에 전달하는 것을 포함한다. 그 다음 세포를 선별하에 위치시켜 전달된 유전자를 흡수하여 발현하는 세포를 분리한다. 그 후, 이들 세포를 검체에게 전달한다.

이 양태에서, 핵산은 생성 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포내로 도입한다. 이러한 도입은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 비제한적인 예로서 형질감염, 전기사출, 미세주입(microinjection), 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지로 감염, 세포 융합, 염색체 매개된 유전자 전달, 미세세포 매개된 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등의 방법으로 수행할 수 있다. 외래 유전자를 세포내로 도입하기 위한 여러 기법은 당업계에 공지되어 있으며(예컨대 Loeffler and Behr, 1993, Meth, Enzymol, 217:599-618; Cohen 등, 1993, Meth.Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92 참고), 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 환자내 M.튜베르쿨로시스에 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 결핵 진단에 사용할 수 있다. 이러한 검출은, 예컨대 박테리아로 감염된 것으로 추정되는 환자로부터 취한 생물학적 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하여 수행할 수 있다. 생물학적 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 분리시, 1 이상의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 본 발명의 표지된 폴리뉴클레오티드는, 당업계에 공지된 핵산 하이브리드화 기법을 사용하여 생물학적 시료내 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 하이브리드화는 고체 지지체상에 하나의 하이브리드화 대응부를 사용하거나 또는 용액내에서 수행할 수 있다.

5.7. 융합 단백질의 치료 및 예방 용도

정제되거나 부분적으로 정제된 융합 단백질 또는 이의 단편을 백신 또는 치료 조성물로서 제형화할 수 있다. 이러한 조성물은 보조제를 포함하여 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 오일 에멀젼에 추가로 현탁시켜 주사시 생체내에서 단백질을 더 서서히 방출시킬 수 있다. 제제내 각 성분의 최적 비율은 당업계에 공지된 기법으로 결정할 수 있다.

임의의 각종 보조제를 본 발명의 백신에 사용하여 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 대부분의 보조제는 급속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질, 예컨대 수산화알루미늄 또는 광유와 면역반응의 비특이적 자극제, 예컨대 지질 A, 보르타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 튜베르쿨로시스를 포함한다. 적절한 보조제는 시판되고 있으며, 그 예로는 프로인트 불완전 보조제 및 프로인터 완전 보조제(디프코 래보러터리즈) 및 머크 보조제 65(미국 뉴저지주 래웨이에 소재하는 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드) 등이 있다. 기타 적절 한 보조제로는 명반, 생분해성 미소구, 일인산화 지질 A, 퀴일 A, SBAS1c, SBAS2(Ling 등, 1997, Vaccine 15:1562-1567), SBAS7 및 Al(OH)₃ 등이 있다.

본 발명의 백신에서, 보조제는 Th1 측면을 포함하는 면역반응을 유도하는 것이 바람직하다. 적절한 보조제 시스템의 예로는 일인산화 리질 A, 바람직하게는 3-데-O-아크릴화된 일인산화 지질 A(3D-MLP)와 알루미늄 염의 조합물이 있다. 증강된 시스템은 일인산화 지질 A 및 사포닌 유도체, 특히 WO94/00153에 개시되어 있는 3D-MLP 및 사포닌 QS21의 조합, 또는 WO96/33739에 개시된 바와 같이 콜레스테롤로 QS2을 급냉시킨 반응원성이 적은 조성물을 포함할 수 있다. 이전의 실험으로 체액 및 Th1 유형 세포 면역 반응의 유도에 있어서 3D-MLP 및 QS21의 명백한 상승 효과가 있음을 입증하였다. 유중수 에멀젼내 QS21, 3D-MLP 및 토코페롤을 비롯한 특히 유효한 보조제 형성은 WO95/17210호에 개시되어 있으며, 바람직한 제제이다.

본 발명의 항원을 포함하는 제제를 그 자체로 또는 약학 또는 치료 조성물의 형태로 투여할 수 있다. 단백질을 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 연화(levigating), 에멀션화, 캡슐화, 포집화 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 약학 조성물은 약학적으로 사용할 수 있는 제제내로 폴리펩티드의 처리를 용이하게 하는 1 이상의 생리학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.

국소 투여용으로, 단백질은 당업계에 공지된 용액, 겔, 연고, 크림, 현탁액 등으로 제형화할 수 있다.

전신용 제제는, 주사 예컨대 피하, 정맥내, 근육내, 기관내 또는 복강내 주사 투여용으로 고안된 것 뿐 아니라 경피, 경점막, 경구 또는 폐 투여용으로 고안된 것을 포함한다.

주사를 위해서, 단백질은 수성 용액, 바람직하게는 생리적으로 적합한 완충액, 예컨대 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염수 완충액에서 제형화할 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 분말 형태일 수 있으며, 사용전에 적절한 부형제, 무균 무피로겐수를 사용하여 구성할 수 있다.

경점막 투여의 경우, 침투시키고자 하는 차단막에 적절한 침투제를 제제에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 조성물은 당업계에 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 단백질을 혼합하여 쉽게 제형화할 수 있다. 이러한 담체는, 치료하고자 하는 검체가 경구 섭취할 수 있는 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 지질, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 단백질을 제형화할 수 있다. 경구용 고체 제제, 예컨대 분말, 캡슐 및 정제를 위해서, 적절한 부형제로는, 당, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니콜 및 소르비톨 등의 충전제; 셀룰로스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 크래거컨스검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP); 과립제; 및 결합제 등이 있다. 필요에 따라, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가 또는 알긴산이나 알긴산나트륨과 같은 이의 염 등의 붕해제를 첨가할 수 있다.

필요에 따라, 고체 투여 형태는 표준 기법으로 당 코팅 또는 장용 코팅할 수 있다.

경구용 액체 제제, 예컨대 현탁액, 엘릭시르 및 용액을 위해서, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제로는 물, 글리콜, 오일, 알코올 등이 있다. 또한, 향료제, 보존제, 착색제 등을 첨가할 수 있다.

협측 투여를 위해서, 단백질은 통상의 방식으로 제형화된 정제, 로젠지 등의 형태를 취할 수 있다.

흡입 투여를 위해서, 본 발명의 단백질은 적절한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체를 사용하여 연무기 또는 가압 팩으로부터 에어로졸 분무의 형태로 통상적으로 전달한다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위체는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정할 수 있다. 락토스나 전분과 같은 적절한 분말 베이스 및 단백질의 분말 혼합물을 포함하는, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지를 제형화할 수 있다.

단백질은, 예컨대 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드와 같은 종래의 좌약 베이스를 함유하는 좌약 또는 보유 관장제와 같은 직장 또는 질내 조성물로 제형화할 수 있다.

전술한 제제외에, 단백질은 데포 제제로서 제형화할 수도 있다. 이렇게 장기간 작용하는 제제는 이식(예컨대 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사로 투여할 수 있다. 따라서, 예컨대 단백질은 적절한 중합체 또는 소수성 재료(예컨대 허용가능 한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 가용성이 적은 유도체, 예컨대 가용성이 적은 염으로서 제형화할 수 있다.

대안적으로, 기타 약학 전달계를 사용할 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 항원을 전달하는데 사용할 수 있는 전달 부형제의 공지된 예이다. 디메틸설폭시드와 같은 일부 유기 용매를 사용할 수 있지만, 일반적으로 독성이 크다. 융합 단백질은 미소구내에서 캡슐화될 수 있다(미국 특허 제5,407,609호; 제5,853,763호; 제5,814,344호 및 제5,820,883호). 또한, 단백질은 표준 방출 시스템, 예컨대 고체 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는 치료제 또는 백신제를 사용하여 전달할 수 있다. 각종 서방형 물질이 설정되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 서방형 캡슐은, 화학 특성에 따라 수 주 내지 최대 100일 동안 단백질을 방출할 수 있다. 시약의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질을 안정화시키는 추가의 방법을 사용할 수 있다.

검체에게서 면역 반응을 유도하는 융합 단백질의 유효량의 결정은, 당업자의 능력 범위 내에서 이루어지며, 특히 본원에 제공된 상세한 설명의 견지에서 이루어진다.

유효량은 시험관내 분석으로부터 초기에 추정할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 면역 반응의 유도를 달성하는 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 당업자는 동물 데이타를 기초로 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있다. 투여량 및 간격은 개별적으로 조정할 수 있다. 예를 들어, 백신으로서 사용한 경우, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드는 약 1∼36주 동안 약 1∼3 회 용량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 3회 용량을 약 3∼4 개월 간격으로 투여하고, 추가 예방접종은 그 후 주기적으로 제공할 수 있다. 대안적인 프로토콜은 개개의 환자에게 적합하게 할 수 있다. 적절한 용량은, 전술한 바와 같이 투여한 경우, 1∼2년 이상 동안 M.튜베르쿨로시스 감염으로부터 환자를 보호하기에 충분하게 면역화된 환자에게서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 폴리펩티드 또는 DNA의 양이다. 일반적으로 투여량내 존재하는 폴리펩티드의 양(또는 투여량내 DNA에 의해 동일계 생성됨)은 숙주 1 kg 당 약 1 pg 내지 약 100 ㎎, 전형적으로 약 10 pg 내지 약 1 ㎎, 바람직하게는 약 100 pg 내지 약 1 ㎍일 수 있다. 적절한 용량은 환자의 크기에 따라 다양하지만, 전형적으로는 약 0.1∼약 5 ㎖이다.

5.8 융합 단백질의 진단 용도

본 발명의 융합 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내 결핵 감염의 진단에 유용하다. 세포 증식 또는 시토킨 생성을 유도하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력은 상기 섹션 5.2에 개시된 방법으로 분석할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 생체내 피부 테스트를 사용하여 결핵을 진단하는데 있어서 1 이상의 융합 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, 피부 테스트는 전술한 바와 같이 1 이상의 폴리펩티드의 경피 주사 후 지연형 과민(DTH) 반응(예컨대 팽윤, 적색화 또는 피부염)을 측정하는 환자에게 직접 수행되는 임의의 분석법이다. 예컨대 투베르쿨린 주사기 또는 1 ㎖ 주사기와 같이 환자의 피부 세포와 폴리펩티드를 접촉시키기에 충분한 임의의 적절한 장치를 사용하여 주사할 수 있다. 바람직하게는, 반응은 주사한 지 48시간 후, 더욱 바람 직하게는 약 48∼약 72시간 후에 측정한다.

DTH 반응은 세포 매개형 면역 반응이며, 테스트 항원(즉, 사용된 폴리펩티드의 면역원성 부분, 또는 이의 변형체)에 이미 노출된 환자의 경우 더 크다. 반응은 자를 사용하여 가시적으로 측정할 수 있다. 일반적으로 결핵 반응의 지표인 직경이 약 0.5 cm, 바람직하게는 약 1.0 cm 보다 큰 반응은 양성 반응이며, 이는 활성 질병으로서 명백할 수도 아닐 수도 있다.

폴리펩티드 및 생리적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물로서 피부 테스트에 사용하기 위해서 본 발명의 융합 폴리펩티드를 제형화하였다. 이러한 조성물은 통상적으로 0.1 ㎖의 부피내 약 1∼100 ㎍, 바람직하게는 약 10∼약 50 ㎍ 양으로 상기 1종 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 약학 조성물내 사용된 담체는, 페놀 및/또는 트윈 80과 같은 적절한 보존제를 포함하는 염수 용액이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 결핵 진단에 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 이 측면에서, 융합 폴리펩티드를 단독으로 또는 조합하여 사용한 생물학적 시료내 M.튜베르쿨로시스 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, "생물학적 시료"는 환자에게서 얻은 임의의 항체 함유 시료이다. 바람직하게는, 시료는 전혈, 담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 요이다. 더욱 바람직하게는 시료는 환자 또는 혈액 공급물로부터 얻은 혈액, 혈청 또는 혈장 시료이다. 폴리펩티드(들)는 전술한 바와 같이 분석에 사용하여 소정의 컷오프 값과 비교하여 시료내 폴리펩티드(들)에 대한 항체의 존재 또는 부재를 결정한다. 이러한 항체의 존재는 결핵의 지표일 수 있는 마이코박테리아 항원에 대해 이미 감작화되었음을 의미한다.

1 이상의 융합 단백질을 사용하는 양태에서, 사용된 폴리펩티드는 상보적인 것이 바람직하다(즉, 하나의 성분 폴리펩티드는 또 다른 성분 폴리펩티드에 의해 감염이 검출되지 않는 시료내에서 감염을 검출하는 경향이 있다). 상보성 폴리펩티드는 일반적으로 M.튜베르쿨로시스로 감염된 것으로 알려진 일련의 환자로부터 얻은 혈청 시료를 평가하기 위해서 각 폴리펩티드를 개별적으로 사용하여 확인할 수 있다. 각 폴리펩티드로(전술한 바와 같이) 양성인 시료를 결정한 후에, 시험된 시료의 거의 또는 전부에서 감염을 검출할 수 있는 2 이상의 융합 폴리펩티드의 조합물을 제형화할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 상보적이다. 결핵 감염된 개체로부터 유래한 대략 25∼30%의 혈청은 임의의 단일 단백질에 대해 항체가 음성이다. 따라서, 상보성 폴리펩티드는 진단 시험의 감수성을 개선시키기 위해서 조합하여 사용할 수 있다.

1 이상의 폴리펩티드를 사용하여 시료내 항체를 검출하는 당업계에 공지된 각종 분석 형식이 있다. 예컨대 본원에서 참고로 인용한 Harlow and Lane의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조. 바람직한 양태에서, 분석은 고체 지지체상에 고정된 폴리펩티드를 사용하여 시료에 결합시키고 시료로부터 항체를 제거하는 단계를 포함한다. 리포터기를 포함한 검출 시약을 사용하여 결합된 항체를 검출할 수 있다. 적절한 검출 시약으로는 항체/폴리펩티드 복합체에 결합하는 항체와 리포터기(예, 반경쟁적 분석)로 표지된 유리 폴리펩티드를 포함한다. 대안적으로, 폴리펩티드에 결합하는 항체를 리포터기로 표지하고 시료로 항원의 항온처리 후에 고정된 항원에 결합시키기는 경쟁 분석을 사용할 수 있다. 시료의 성분이 폴리펩티드에 대한 표지된 항체의 결합을 억제하는 정도는 고정된 폴리펩티드와 시료의 반응성의 지표이다.

고체 지지체는 항원이 부착된 당업계에 공지된 임의의 고체 물질일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 미량역가 평판 또는 니트로셀룰로스 또는 기타 적절한 막내 시험 웰일 수 있다. 대안적으로 지지체는 비이드 또는 디스크, 예컨대 유리, 유리섬유, 라텍스 또는 폴리스티렌이나 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 지지체는 미국 특허 제5,359,681호에 개시된 바와 같은 자성 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다.

폴리펩티드는 당업계에 공지된 각종 기법을 사용하여 고체 지지체에 결합할 수 있다. 본 발명에서, "결합된"이란 비공유 회합, 예컨대 흡착과 공유 결합(지지체 상의 작용기와 항원간의 직접적인 결합, 또는 가교제에 의한 결합일 수 있음)을 의미한다. 미량역가 평판에서 웰 또는 막에의 흡착에 의한 결합이 바람직하다. 이 경우, 흡착은 적절한 완충액내에서 폴리펩티드를 적절한 시간 동안 고체 지지체와 접촉시켜 달성할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만, 통상적으로 약 1시간 내지 1일이다. 일반적으로, 약 10 ng 내지 약 1 ㎍, 바람직하게는 약 100 ng의 폴리펩티드 양과 플라스틱 미량역가 평판(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 접촉시키면 적량의 항원을 결합시키는 데 충분하다.

고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 공유 결합은 일반적으로 지지체 및 작용 기, 예컨대 히드록실 또는 아미노기와 폴리펩티드상에서 반응하는 이작용성 시약과 지지체를 먼저 반응시켜 달성할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 지지체상의 알데히드기와 폴리펩티드상의 아민 및 활성 수소를 축합반응시켜 또는 벤조퀴논을 사용하여 적절한 중합체 코팅을 갖는 지지체에 결합시킬 수 있다(Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13).

일부 양태에서, 분석은 효소 결합형 면역흡착 분석(ELISA)이다. 이 분석은 고체 지지체, 통상은 미량역가 평판의 웰상에 고정된 융합 폴리펩티드 항원을 시료와 먼저 접촉시켜 시료내 폴리펩티드에 대한 항체가 고정된 폴리펩티드에 결합되도록 하여 수행할 수 있다. 결합되지 않은 시료를 고정된 폴리펩티드로부터 제거하고, 고정된 항체-폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 검출 시약을 첨가한다. 고체 지지체에 결합된 검출 시약의 양은 특이적 검출 시약에 대한 적절한 방법을 사용하여 결정한다.

더욱 구체적으로, 일단 폴리펩티드가 전술한 바와 같이 지지체상에 고정되면, 지지체상에 잔여 단백질 결합 부위는 통상적으로 차단된다. 당업계에 공지된 임의의 적절한 차단제, 예컨대 소 혈청 알부민 또는 트윈 20^TM(미국 미조리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 캄파니)을 사용할 수 있다. 고정된 폴리펩티드를 시료와 함께 항온처리하고, 항체를 항원에 결합시킨다. 시료는 항온처리 전에 적절한 담체, 예컨대 인산염 완충 염수(PBS)로 희석할 수 있다. 일반적으로, 적절한 접촉 시간은 M.튜베르쿨로시스 감염된 시료내 항체의 존재를 검출하기에 충분한 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 항체와 결합되지 않은 항체사이의 평 형에서 달성될 결합 레벨의 95% 이상을 달성하는데 충분한 시간이다. 당업자라면, 평형을 달성하는데 필요한 시간은 일정 기간 동안 발생하는 결합 레벨을 분석하여 쉽게 결정할 수 있음을 인식할 것이다. 실온에서, 약 30분 동안의 항온처리는 일반적으로 충분하다.

결합되지 않은 시료는 0.1% 트윈 20^TM을 함유하는 PBS와 같은 적절한 완충액으로 고체 지지체를 세척하여 제거할 수 있다. 검출 시약을 고체 지지체에 첨가할 수 있다. 적절한 검출 시약은 고정된 항체-폴리펩티드 복합체에 결합하고 당업계에 임의의 공지된 각종 방법으로 검출할 수 있는 임의의 화합물이다. 바람직하게는, 검출 시약은 리포터기에 콘쥬게이트된 결합제(예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 렉틴 또는 유리 항원)를 포함한다. 바람직한 리포터기로는 효소(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제), 기질, 조인자, 억제제, 염료, 방사성 핵종, 발광기, 형광기, 비오틴 및 콜로이드 입자, 예컨대 콜로이드 금 및 셀레늄 등이 있다. 리포터기에 대한 결합제의 콘쥬게이션은 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 달성할 수 있다. 여러 시판 회사(예, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재하는 자이메드 래보러터리즈 및 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스)로부터 각종 리포터기에 콘쥬게이트된 일반 결합제를 구입할 수 있다.

그 다음 검출 시약은 결합된 항체를 검출하는데 충분한 양으로 고정된 항체-폴리펩티드 복합체와 함께 항온처리한다. 적절한 시간은 일반적으로 제조업자의 지시로부터 또는 시간 경과에 따라 발생하는 결합 레벨을 분석하여 결정할 수 있다. 결합되지 않은 검출 시약을 제거하고, 결합된 검출 시약은 리포터기를 사용하여 검 출한다. 리포터기를 검출하기 위해서 사용되는 방법은 리포터기의 특성에 따라 좌우된다. 방사능기의 경우, 신틸레이션 계수 또는 자가방사선 사진법이 일반적으로 적당하다. 분광 분석법을 사용하여 염료, 발광기 및 형광기를 검출할 수 있다. 상이한 리포터기(통상적으로 방사능 또는 형광기 또는 효소)에 결합된 비오틴은 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터기는 일반적으로 기질(보통 특정 시간 동안)을 첨가한 다음 반응 생성물의 분광 분석 또는 기타 분석을 수행하여 검출할 수 있다.

시료내 항M.튜베르쿨로시스 항체의 존재 또는 부재를 결정하기 위해서, 고체 지지체에 결합되어 있는 리포터기로부터 검출된 신호를 일반적으로 소정의 컷오프 값에 해당하는 신호와 비교한다. 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 고정된 항원이 감염되지 않은 환자로부터 얻은 시료와 함께 항온처리하는 경우 얻어진 평균 중간 시그널이다. 일반적으로, 소정의 컷오프 값 위의 3 표준 편차인 신호를 형성하는 시료는 결핵에 대해 양성인 것으로 간주된다. 별도의 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 문헌[Sackett 등, 1985, Clinical Epidemiology; A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., pp 106-107]에 개시된 방법에 따라 수용 작동기 곡선을 사용하여 결정한다. 간단히 요약하면, 이 양태에서, 컷오프 값은 진단 시험 결과에 대해 각각의 가능한 컷오프 값에 해당하는 진정 양성율(즉, 감수성) 및 가성 양성율(100% 특이성) 쌍의 플롯으로부터 결정할 수 있다. 좌측 상부 코너(즉 최대 면역을 포함하는 값)에 가장 근접한 플롯상의 컷오프 값은 가장 정확한 컷오프 값이며, 이 방법으로 결정된 컷오프보다 더 큰 신호를 생성하는 시료는 양성인 것으로 생각할 수 있다. 대안적으로, 컷오프 값은 플롯을 따라 좌측으로 이동하여 가성 양성율을 최소화하거나, 또는 우측으로 이동하여 가성 음성율을 최소화할 수 있다. 일반적으로, 이 방법으로 결정된 컷오프 값보다 큰 신호를 형성하는 시료는 결핵에 대해 양성인 것으로 간주된다.

관련 양태에서, 분석은 급속한 병류(flow-through) 또는 스트립 시험 방식으로 수행할 수 있는데, 여기서 항원은 니트로셀룰로스와 같은 막에 고정한다. 병류 시험에서, 시료내 항체는, 시료가 막을 통과할 때 고정된 폴리펩티드에 결합한다. 검출 시약(예, 단백질 A-콜로이드 골드)은, 검출 시약을 함유하는 용액이 막을 통과하여 흐를 때 항체-폴리펩티드 복합체에 결합한다. 결합된 검출 시약의 검출은 전술한 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 방식에서, 폴리펩티드가 결합한 막의 한 단부는 시료를 함유하는 용액내에 침지시킨다. 시료는 검출 시약을 함유하는 영역을 통해 고정된 폴리펩티드 영역으로 막을 따라 이동한다. 폴리펩티드에서 검출 시약의 농도는 시료내 항M.튜베르쿨로시스 항체의 존재를 제시하는 것이다. 통상적으로, 그 부위에서의 검출 시약의 농도는 가시적으로 판독할 수 있는 선과 같은 패턴을 형성한다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 제시한다. 일반적으로 막에 고정된 폴리펩티드의 양은, 전술한 바와 같이 ELISA로 양성 신호를 형성하기에 충분한 레벨의 항체를 생물학적 시료가 함유하는 경우 가시적으로 구별할 수 있는 패턴을 형성하도록 선별한다. 바람직하게는, 막에 고정된 폴리펩티드 양의 범위는 약 5 ng 내지 약 1 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 50 ng 내지 약 500 ng이다. 이러한 시험은 통상적으로 매우 소량(1 소적)의 환자 혈청 또는 혈액으로 수행할 수 있다.

본 발명을 기술하였지만, 하기 실시예는 예시를 위해서 제공된 것이며 이를 제한하는 것은 아니다.

6. 실시예

개개 성분의 면역원성을 보유하는 M.튜베르쿨로시스 항원의 융합 단백질

6.1. 재료 및 방법

6.1.1. 융합 단백질의 작제

M.튜베르쿨로시스 항원의 암호화 서열은 융합 단백질의 융합 및 발현을 용이하게 하기 위해서 PCR로 변형시켰다. DNA 증폭은 10 ㎕ 10X Pfu 완충액, 2 ㎕ 10 mM dNTP, 10 μM 농도에서 PCR 프라이머 각 2 ㎕, 81.5 ㎕ 물, 1.5 ㎕ Pfu DNA 폴리머라제(미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 스타라타젠) 및 70 ng/㎕(TbRa3 항원의 경우) 또는 50 ng/㎕(38 kD 및 Tb38-1 항원의 경우)에서 1 ㎕ DNA를 사용하여 수행하였다. TbRa3 항원의 경우, 94℃에서의 변성을 2분 동안 수행한 다음, 15초 동안 96℃에서, 1분 동안 72℃에서 40 사이클을 수행한 다음 마지막으로 4분 동안 72℃에서 처리하였다. 38 kD 항원의 경우, 96℃에서의 변성을 2분 동안 수행한 다음, 30초 동안 96℃에서, 15초 동안 68℃에서, 3분 동안 72℃에서 40 사이클을 수행하고 마지막으로 4분 동안 72℃에서 처리하였다. Tb38-1 항원의 경우, 2분 동안 94℃에서의 변성을 수행한 후 96℃에서 15초 동안, 68℃에서 15초 동안, 72℃에서 1.5분 동안 10 사이클을 수행하고, 96℃에서 15초 동안, 64℃에서 15초 동안, 72℃에서 1.5분 동안 10 사이클을 수행하고 마지막으로 72℃에서 4분 동안 처리하 였다.

제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 소정의 점착 말단 또는 평할 말단을 생성한 후에, 각 융합 폴리펩티드에 특이적인 폴리뉴클레오티드를 발현 플라스미드내로 결찰시켰다. 각 생성 플라스미드는 각 융합 폴리펩티드의 개개 항원의 암호화 서열을 포함하였다. 사용된 발현 벡터는 pET-12b 및 pT7^L2 IL1이었다.

항원 Ra12, TbH9 및 Ra35에 대한 3개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 1 및 2)(도 1A 및 도 2B). 항원 Erd14, DPV 및 MTI에 대한 또 다른 3개의 암호화 서열을 결찰시켜 제2 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 3 및 4)(도 2). 항원 TbRa3, 38kD 및 Tb38-1에 대한 3개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 5 및 6)(도 3A 내지 도 3D). 항원 TbH9 및 Tb38-1에 대한 2개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 7 및 8)(도 4A 내지 도 4D). 항원 TbRa3, 38kD, Tb38-1 및 DPEP에 대한 4개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 9 및 10)(도 5A 내지 도 5J). 항원 Erd14, DPV, MTI, MSL 및 MTCC2에 대한 5개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 11 및 12)(도 6A 및 도 6B). 항원 Erd14, DPV, MTI 및 MSL에 대한 4개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 13 및 14)(도 7A 및 도 7B). 항원 DPV, MTI, MSL 및 MTCC2에 대한 4개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 15 및 16)(도 8A 및 도 8B). 항원 DPV, MTI 및 MSL에 대한 3개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 17 및 18)(도 9A 및 도 9B). 항원 TbH9, DPV 및 MTI에 대한 3개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 19 및 20)(도 10A 및 도 10B). 항원 Erd14, DPV 및 MTI에 대한 3개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 21 및 22)(도 11A 및 도 11B). 항원 TbH9 및 Ra35에 대한 2개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 23 및 24)(도 12A 및 도 12B). 항원 Ra12 및 DPPD에 대한 2개의 암호화 서열을 결찰시켜 하나의 융합 단백질을 암호화하였다(서열 번호 25 및 26)(도 13A 및 도 13B).

재조합 단백질은 pET 플라스미드 벡터(pET-17b) 및 T7 RNA 폴리머라제 발현계(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 노바겐)을 사용하여 아미노 말단 부분 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 이.콜리에서 발현시켰다. 이.콜리 균주 BL21(DE3) pLysE(노바겐)을 고 레벨의 발현을 위해 사용하였다. 재조합체(His-Tag) 융합 단백질은 8M 우레아의 존재하에 한 단계 QLAexpress Ni-NTA 아가로스 매트릭스(미국 캘리포니아주 캐츠워스에 소재하는 퀴아겐)를 사용하여 친화도 크로마토그래피로 IPTG 유도된 회분식 배양물 500 ㎖의 가용성 상청액 또는 불용성 봉입체로부터 정제하였다. 간단히 요약하면, pET 작제물을 함유하는 BL21의 밤새 포화된 배양액 20 ㎖를 앰피실린 50 ㎍/㎖ 및 클로람페니콜 34 ㎍/㎖을 함유하는 500 ㎖의 2 ×YT 배지내로 첨가하고, 진탕하면서 37℃에서 증식시켰다. 박테리아 배양물은 OD560 0.3에서 2 mM IPTG로 유도하고, 추가의 3시간 동안 증식시켰다(OD=1.3 내지 1.9). 세포는 원심분리하여 500 ㎖ 회분식 배양물로부터 수거하고, 25 ㎖ 당 2 mM PMSF 및 20 ㎍/㎖ 류펩틴과 하나의 완전한 프로테아제 억제제 정제(뵈링거 만하임)를 함유하는 20 ㎖ 결합 완충액(0.1 M 인산나트륨, pH8.0; 10 mM 트리스-HCl, pH8.0)에 재현탁시켰다. 이.콜리를 냉동-해동으로 세포용해시키고 간단히 초음파 처리한 다음, 12 k rpm에서 30분 동안 회전시켜 봉입체를 펠렛화하였다.

봉입체는 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 중 1% CHAPS에서 3회 세척하였다. 이 단계는 오염 LPS 레벨을 상당히 감소시켰다. 봉입체는 8 M 우레아를 함유하는 결합 완충액 20 ㎖ 중에서 최종적으로 가용화시키거나, 또는 8M 우레아를 가용성 상청액내에 직접 첨가하였다. His-Tag 잔기가 있는 재조합 융합 단백질은 1시간 동안 실온에서 고정시켜 Ni-NTA 아가로스 수지(500 ㎖ 당 5 ㎖ 수지 유도)에 회분식 결합시키고, 복합체를 컬럼에 통과시켰다. 병류식으로 동일한 컬럼을 2회 통과시키고, 8M 우레아를 함유하는 30 ㎖의 각 세척 완충액(0.1 M 인산나트륨 및 10 mM 트리스-HCl, pH6.3)으로 컬럼을 3회 세척하였다. 결합된 단백질은 세척 완충액 중 150 mM 이미다졸 30 ㎖로 용출시키고, 5 ㎖의 분획을 수거하였다. 각 재조합 융합 단백질을 함유하는 분획을 모으고, Ni-NTA 매트릭스에 1회 이상 결합된 10 mM 트리스HCl(pH 8.0)에 대해 투석하고, 용출시킨 다음 10 mM 트리스-HCl(pH7.8)에서 투석하였다. 재조합 단백질의 수율은 순도가 98% 이상인 유도된 박테리아 배양물 1 ℓ당 25∼150 ㎎이다. 재조합 단백질은 리물러스(Rimulus) 분석(BioWhittaker)을 사용하여 내독소 오염에 대해 분석하였으며, < 10 E.U.Img를 함유하는 것으로 밝혀졌다.

6.1.2. T-세포 증식 분석

정제된 융합 폴리펩티드는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 제조시 T-세포 증식을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. PPD 피부 시험 양성으로 알려진 공여자로부터 유래한 PBMC와 그의 T-세포는 PPD에 반응하여 증식시키는 것으로 확인되었으며, M.튜베르쿨로시스 유래의 미정제 가용성 단백질은 10% 수집된 인간 혈청 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신으로 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. 정제된 폴리펩티드는 0.5∼10 ㎍/㎖의 농도에서 이중으로 첨가하였다. 배지 부피가 200 ㎕, 50 ㎕인 96웰 둥근 바닥 평판에서 6일 동안 배양한 후에, 하기 섹션 6.1.3.에 개시된 바와 같이 IFN-γ 레벨의 측정을 위해서 50 ㎕ 배지를 각 웰로부터 제거하였다. 그 다음 추가의 18 시간 동안 분쇄된 티미딘 1 μCi/웰로 펄스시키고, 수거한 다음, 기체 신틸레이션 계수기를 사용하여 삼중 수소 흡수량을 측정하였다. 단독 배지에서 배양된 세포에서 관찰되는 증식보다 3배 이상 증식을 복제시 초래하는 분획을 양성으로 간주하였다.

6.1.3. 인터페론-γ 분석

마우스 유래의 비장을 무균적으로 제거하고, 적혈구 용해 후 완전 RPMI 중에서 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 배양물을 지정된 재조합 단백질로 24시간 동안 자극하고 상청액을 IFN-γ에 대해 분석하였다.

상청액 IFN-γ의 레벨은 파밍엔에서 입수가능한 항체쌍 및 절차를 사용하여 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 표준 곡선은 재조합 마우스 시토킨을 사용하여 형성하였다. ELISA 평판(코닝)은 50 ㎕/웰(1 ㎍/㎖, 0.1 M 중탄산염 코팅 완충액 중, pH 9.6)의 시토킨 포집 mAb(래트 항마우스 IFN-γ(파밍엔; 카탈로그 번호 18181D)) 로 코팅하고, 실온에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 평판 내용물을 진탕하고 4℃에서 밤새 PBS-0.05% 트윈, 1.0% BSA(200 ㎕/웰)로 차단하고, PBS-0.1% 트윈로 6회 세척하였다. PBS-0.05% 트윈, 0.1% BSA에서 희석된 표준물(마우스 IFN-γ) 및 상청액 시료를 실온에서 2 시간 동안 첨가하였다. 평판을 상기한 같이 세척한 다음, PBS-0.05% 트윈, 0.1% BSA 중에서 희석된 0.5 ㎍/㎖에서 100 ㎕/웰의 제2 항체(비오틴 래트 α 마우스 IFN-γ(카탈로그 번호 18112 D; 파밍엔))와 함께 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 세척한 후에, 평판은 PBS-0.05% 트윈, 0.1% BSA 중 1:2500 희석액에서 스트렙타비딘-HRP(자임드) 100 ㎕/웰과 함께 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 평판을 1회 세척하고, 100 ㎕/웰 TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, 미국 매릴랜드주 게터스버그 커크가드 앤드 페리)로 전개하고, 색상을 형성한 후에 H₂SO₄ 50 ㎕/웰로 반응을 종결하였다. 기준 파장으로서 570 nm를 사용하여 450 nm에서 흡광도(OD)를 측정하고, 표준 곡선을 사용하여 시토킨 농도를 평가하였다.

6.2. 결과

6.2.1. 3-융합 단백질이 유도하는 면역 반응

M.튜베르쿨로시스 항원에 대한 3 암호화 서열을 융합 단백질을 생성하기 위해서 발현 벡터내로 삽입하였다. Ra12, TbH9 및 Ra35로 명명된 항원은 하나의 재조합 융합 단백질로서 생성하였다(도1A 및 도 1B). 항원 Erd14, DPV 및 MTI는 제2 융합 단백질로서 생성하였다(도 2). 2개의 융합 단백질은 시험관내 및 생체내 분석에 사용하기 위해서 친화도 정제하였다.

2개의 융합 단백질을 6개의 PPD⁺검체 유래의 T 세포 반응을 자극하는 능력에 대해 검사하였다. T 세포 증식을 측정한 경우, 양 융합 단백질은 개개의 성분으로서 유사한 반응성 패턴을 나타내었다(도 14A 내지 도 14F). IFN-γ 생성을 측정한 경우 유사한 결과를 얻었다(도 15A 내지 도 15F). 예를 들어, 검체 D160은 각각 항원 TbH9 및 MT1에 대해 반응하였다. 검체 D160은 또한 이들 항원을 함유하는 융합 단백질에 대해 반응하였다(도 14B 및 도 15B). 대조적으로, D160 유래의 T 세포 반응은 기타 항원 각각에 대해서는 관찰되지 않았다. 또 다른 검체 D201은 항원 Erd14, DPV 또는 MTI와 각각 반응하지 않았는데, 이들 항원을 함유하는 융합 단백질에도 반응성이 없었다. 2개의 융합 단백질의 각 성분에 대한 T 세포 반응이 특별히 강하지 않은 경우, 융합 단백질은 대부분의 경우에 개개 항원이 유도하는 것과 동일하거나 또는 높은 반응을 자극하였음에 유의해야 한다.

Ra12-TbH9-Ra35 3-융합 단백질을 생체내 면역원으로서 시험하였다. 이들 실험에서, 융합 단백질은 면역화를 위해 마우스 발바닥으로 주사하였다. 3마리의 마우스 각 그룹에게 상이한 보조제, 즉 SBAS1c, SBAS2(Ling 등, 1997, Vaccine 15:1562-1567), SBAS7 및 AL(OH)₃ 중에서 단백질을 투여하였다. 3주 간격을 두고 2회의 피하 면역화 후에, 동물을 1주일 후에 사망시키고, T 세포 증식 및 시토킨 생성 분석에서 반응자 세포로서 사용하기 위해 배수 림프절을 회수하였다.

보조제를 면역화에 사용하였는지 여부에 상관없이, TbH9를 개별 항원으로서 사용한 경우 강한 T 세포 증식 반응이 TbH9에 대해 유도되었다(도 16A). Ra35 및 Ra12에 대해 약한 반응이 유도되었다(도 16B 및 도 16C). Ra12-TbH9-Ra35 융합 단백질을 면역원으로서 사용한 경우, 개별 성분에 대해 유사한 반응이 관찰되었다.

시토킨 생성을 관찰하면, 보조제 SBAS1c 및 SBAS2는 유사한 IFN-γ(도 17) 및 IL-4 반응(도 18)을 생성하였다. 그러나, SBAS7 및 수산화알루미늄의 조합은 3개 모든 항체에 대해 가장 강력한 IFN-γ 반응과 최저 레벨의 IL-4 생성을 형성하였다. 생체내 체액 항체 반응에 대하여, 도 19A 내지 도 19F는 3가지 보조제 중 임의의 보조제와 함께 사용한 경우 융합 단백질이 IgG₁ 및 IgG_2a 항원 특이적 반응을 모두 유발함을 도시한다.

추가로, C57BL/6 마우스는 Ra12-TbH9-Ra35(Mtb32A) 또는 Erd14-DPV-MTI(Mtb39A) 암호화 서열을 DNA백신으로서 각각 함유하는 2개의 발현 작제물의 조합으로 면역화시켰다. 면역화된 동물은 그 후에 생박테리아를 에어로졸 형태로 항원투여하였을 때 결핵에 대해 상당한 보호를 나타내었다. 이들 결과를 기초로, Mtb32A 및 Mtb39A 암호화 서열의 융합 작제물을 제조하고, 암호화된 생성물을 기니아 피그 장기간 보호 모델에서 시험하였다. 이들 연구에서, 기니아 피그는 보조제를 함유하는 제제내 단일 재조합 융합 단백질 또는 Mtb32A 및 Mtb39A 단백질의 혼합물로 면역화시켰다. 도 20A-20C는 SBAS1c 또는 SBAS2 중 융합 단백질로 면역화된 기니아 피그가, 동일한 보조제 제제내 혼합물 중 2개의 항원으로 면역화된 동물과 비교하여 후속 항원 투여시 결핵 형성에 대해 더 우수하게 보호됨을 도시한다. SBA2 제제내 융합 단백질은 동물에서 최대의 보호성을 제공하였다. 따라서, 각종 M.튜베르쿨로시스 항원의 융합 단백질은 개개 성분의 혼합물보다 백신 제제에서 더 우수한 면역원으로서 사용할 수 있다.

6.2.2. 2-융합 단백질이 유도하는 면역반응

힌지 서열없이 TbH-9 및 Tb38-1 항원을 함유하는 2-융합 단백질을 재조합 방법으로 생성하였다. TbH9-Tb38-1 융합 단백질이 T 세포 증식 및 IFN-γ 생성을 유도하는 능력을 검사하였다. 3 공여자 유래의 PBMC를 사용하였다. 제1 공여자는 이미 TbH9에는 반응을 보였으나 Tb38-1에는 반응을 나타내지 않았다(공여자 131); 제2 공여자는 Tb38-1에는 반응을 보였으나 TbH9에는 반응을 나타내지 않았다(공여자 184); 제3 공여자는 양 항원에 반응을 보였다(공여자 201). 이들 연구 결과는 융합 단백질내 양 항원의 기능 활성을 입증하였다(도 21A 및 도 21B, 도 22A 및 도 22B, 도 23A 및 도 23B).

6.2.3. 결핵 환자 혈청과 반응하는 4-융합 단백질

TbRa3, 38KD 항원, Tb38-1 및 DPEP를 함유하는 융합 단백질을 재조합 방법으로 생성하였다. TbF-2로서 언급되는 4-융합 단백질과 M.튜베르쿨로시스 감염 환자 유래의 혈청의 반응성을 ELISA로 검사하였다. 이들 연구 결과(표 1)는 모두 4개의 항원이 각각 융합 단백질내에서 기능함을 입증하였다.

당업자라면 각 융합 단백질내 개개 항원의 순서를 변화시킬 수 있으며, 비교 활성을 예측할 수 있지만, 단 각 에피토프가 기능적으로 이용가능하여야 함을 이해할 것이다. 또한, 활성 에피토프를 함유하는 단백질의 절단 형태를 융합 단백질의 작제에 사용할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 일 측면을 예시하기 위한 실시 양태에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 등가인 임의의 클론, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 본 발명의 범위내에 있다. 실제로, 본원에 개시된 것 이외에 본 발명의 각종 변형이 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게는 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구 범위내에 포함된다. 뉴클레오티드에 대해 제공된 모든 염기쌍 크기는 대략적인 것이며 설명을 목적으로 사용함을 이해해야 한다.

본원에 인용된 모든 공개 문헌은 그 전문을 참고로 인용한 것이다.

Claims

(i) 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하고 선택적으로 N-말단에 히스티딘 잔기의 연신체가 없는, 서열 번호 2의 아미노산 서열; 또는

(ii) 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하고 선택적으로 N-말단에 히스티딘 잔기의 연신체가 없는, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 면역성 폴리펩티드.
(i) 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하고 선택적으로 N-말단에 히스티딘 잔기의 연신체가 없는, 서열 번호 2의 아미노산 서열; 또는

(ii) 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하고 선택적으로 N-말단에 히스티딘 잔기의 연신체가 없는, 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 정제된 면역성 폴리펩티드.
서열 번호 2 및 24 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 정제된 면역성 폴리펩티드.
서열 번호 2 및 24 중에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 정제된 면역성 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 1 및 23 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 동일하거나 기능적으로 등가인 유전자 생성물을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 1 및 23 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 동일하거나 기능적으로 등가인 유전자 생성물을 암호화하는 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 1 및 23 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드.
제9항에 있어서, 가용성 폴리펩티드인 것인 폴리펩티드.
제9항에 있어서, 재조합 DNA법에 의해 생성되는 것인 폴리펩티드.
제9항에 있어서, 화학적 합성 방법으로 생성되는 것인 폴리펩티드.
제9항에 있어서, 항체 반응을 유도하는 것인 폴리펩티드.
제9항에 있어서, T 세포 반응을 유도하는 것인 폴리펩티드.
제9항에 있어서, 제2의 이종 폴리펩티드와 융합되는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 포함하는, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 감염을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제18항에 있어서, 바이러스 벡터인 것인 발현 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 및 보조제를 포함하는 백신 조성물
제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.