KR101390966B1 - Ｈｉｆｌａ의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 항암 조성물 - Google Patents
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Abstract
Hif1α 전사체 (mRNA transcript) 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포내에서 Hif1α의 발현을 억제함과 동시에 면역반응을 유발하지 않는 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA) 및 상기 siRNA의 암의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도가 제공된다. 상기 Hif1α을 암호화하는 mRNA와 상보 결합할 수 있는 siRNA는 리보핵산 매개 간섭현상 (RNA interference, RNAi)에 의해 거의 모든 암세포에 공통적으로 과발현되는 Hif1α의 발현을 억제하여 암세포의 증식 및 전이를 저해 할 수 있으므로, 항암제로서 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 Hif1α 전사체 (mRNA transcript) 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포내에서 Hif1α의 발현을 억제함과 동시에 면역반응을 유발하지 않는 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA) 및 상기 siRNA의 암의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.
Hif1(Hypoxia inducible factor 1)은 헤테로다이머 전사인자로 Hif1의 실질적 활성을 조절하는 Hif1α와 핵 수송(nuclear transporter) 역할을 하는 Hif-1β로 이루어져 있다. Hif1α는 basic-helix-loop-helix-PAS(PER-ARNT-SIM) superfamily에 속하는 전사인자로 정상산소상태(normoxia)에서는 ODD(oxygen-degradation domain)의 Pro594와 Pro402 잔기에 하이드록실화가 일어나 VHL(von Hippel Lindau)-ubiquitin E3 ligase 복합체에 의해 분해되나, 다양한 고형 암에서 주로 발생하는 저산소상태(hypoxia:산소비율 5%이하 상태)에서는 하이드록실화가 억제되어 분해되지 않고 다이머 상태로 세포질에서 핵으로 이동하여 HRE(hypoxia response element)에 결합하여 혈관신생(angiogenesis) 및 해당과정(glycolysis), 세포성장과 분화에 관여하는 유전자 발현을 유도한다(Veronica A. et al., Cancer Research, 66(12), 6264-70, 2006; Semenza GL. et al ., Nature Review Cancer 3, 721-32, 2003).
따라서, Hif1α가 활성화되는 경로는 다양하기 때문에 이들 경로를 타겟으로 하는 것보다 Hif1α mRNA를 타겟으로 하는 siRNA를 이용하여 Hif1α의 발현량을 근본적으로 억제하는 것이 가장 좋은 방법이라 생각된다.
최근 리보핵산 매개 간섭현상이 기존의 방법으로는 의약적으로 불가능(non-druggable)한 타겟에 대해서도 정밀한 유전자 선택성을 보이는 선도물질을 신속히 도출함에 따라 합성 의약 개발 시 발생되는 제한된 타겟 및 비선택성에 대한 해결책을 제시하고 화학합성 의약품의 한계를 극복할 수 있는 기술로 여겨지면서 기존의 방식으로는 치료가 어려운 각종 질병, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
리보핵산 매개 간섭현상(RNAi)은 이중나선 구조를 가진 21-25개 염기로 이루어진 리보핵산이 표적 유전자의 전사체(mRNA transcript)에 상보적으로 결합하여 해당 전사체를 분해하여 특정 유전자의 발현을 억제하는 현상이다(Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004).
그러나, siRNA(small interfering RNA)가 초기 면역반응을 유도하며, 예상했던 것보다 비특이적인 RNAi효과를 빈번하게 유도한다는 것을 발견하게 되었다.
포유 동물 세포에서 길이가 긴 이중가닥의 siRNA는 유해한 인터페론 반응을 유도할 수 있고, 길이가 짧은 이중가닥 siRNA 역시 인체나 세포에 유해한 초기 인터페론 면역 반응을 일으키는 것으로 보고되고 있으며, 예상했던 것보다 높은 비특이적인 RNAi효과를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Kleirman et al. Nature, 452:591-7, 2008).
암의 진행에 중요한 역할을 하는 Hif1α을 타겟으로 한 siRNA 항암제 개발이 시도되고 있으나 현재까지 그 성과는 미미한 수준이다. siRNA의 개별 시퀀스의 유전자 억제 효능에 대해 제시된 바 없고, 특히 면역활성에 대한 고려가 전혀 되어 있지 않은 실정이다.
siRNA는 높은 활성과 뛰어난 타겟 특이성 등의 장점으로 새로운 치료제로서 무한한 가능성을 보여주고 있으나, 혈액내 핵산분해효소에 의한 분해되어 혈중 안정성이 낮고, 음전하를 띠기 때문에 세포막 통과가 불가능하고 신속히 배설되어 혈액중 반감기가 짧아서 조직내 분포가 제한적이고, 면역체계 활성화 도는 다른 유전자 조절기전에 영향을 미치는 off-target effect를 유발하는 등의 문제가 있어서, 약물로서의 개발에 장애가 되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 서열 특이성이 높아 표적 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하여 RNAi 효율성을 증가시키며, 면역 독성을 유발하지 않는 siRNA를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일례는 Hif1α 전사체 염기서열에 상보적으로 결합하여 Hif1α의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 Hif1α의 합성 및/또는 발현 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 Hif1α을 발현하는 세포와 접촉시켜, Hif1α의 합성 및/또는 발현을 억제하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터의 Hif1α을 발현하는 세포에서의 Hif1α의 합성 및/또는 발현 억제를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 Hif1α을 발현하는 암세포에 접촉시켜 암세포의 성장을 억제하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터의 Hif1α을 발현하는 암세포에서의 암세포의 성장 억제를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 치료적 유효량으로 투여하여 암을 예방 및/또는 치료하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 Hif1α 전사체 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 Hif1α의 합성 및/또는 발현을 억제하는 siRNA, 이를 포함하는 의약 조성물, 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 Hif1α의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 Hif1α의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 Hif1α 합성 및/또는 발현 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 Hif1α의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 암세포 성장 저해제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물(항암 조성물)을 제공한다.
본 발명은 사람을 포함하는 포유 동물의 Hif1α mRNA, 이의 선택적 스플라이싱 형태(alternative splice form), 및/또는 같은 계통의 Hif1α 유전자의 발현을 저해하는 기술과 관련된 것이며, 이는 본 발명에서 제공되는 siRNA의 특정 용량을 환자에게 투여했을 때 타겟 mRNA가 감소함으로써 성취되는 것일 수 있다.
이하, 이를 보다 상세히 설명한다.
상기 Hif1α는 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 Hif1α 및 그의 스플라이싱 구조체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유전자 또는 mRNA가 사람의 Hif1α 유전자 또는 이로부터 유래하는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 의미하는 것으로, 구체적으로, 사람, 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, Hif1α를 코딩하는 mRNA에 해당하는 센스 가닥의 cDNA 서열은 서열번호 1 일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA는 Hif1α의 mRNA 또는 cDNA (예컨대, 서열번호 1) 내부의 연속하는 15 내지 25 bp, 바람직하게는 연속하는 18 내지 22 bp로 이루어진 영역, 구체적으로, 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열(cDNA 상의 염기서열)에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 것일 수 있다. 상기 바람직한 cDNA 상의 표적 영역을 아래의 표 1에 정리하였다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서, 서열번호 1의 Hif1α cDNA 영역 중 서열번호 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 siRNA를 제공한다. 예컨대, 서열번호 6, 10, 및 12으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 siRNA을 제공한다.
| 서열 목록 | 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | Hif1α 유전자 내의 시작 뉴클레오타이드 |
| Hif1α cDNA상의 target 영역, 17개 | 2 | GTTTGAACTAACTGGACAC | 372 |
| 3 | TGATTTTACTCATCCATGT | 399 | |
| 4 | CATGAGGAAATGAGAGAAA | 421 | |
| 5 | GAGAAATGCTTACACACAG | 434 | |
| 6 | CGAGGAAGAACTATGAACA | 532 | |
| 7 | GAACATAAAGTCTGCAACA | 546 | |
| 8 | TGATACCAACAGTAACCAA | 603 | |
| 9 | TCAGTGTGGGTATAAGAAA | 624 | |
| 10 | GCTGATTTGTGAACCCATT | 663 | |
| 11 | GCCGCTCAATTTATGAATA | 815 | |
| 12 | GCATTGTATGTGTGAATTA | 1001 | |
| 13 | TCAGGATCAGACACCTAGT | 1482 | |
| 14 | ATTTAGACTTGGAGATGTT | 1667 | |
| 15 | AGAGGTGGATATGTCTGGG | 931 | |
| 16 | CACCAAAGTGGAATCAGAA | 1125 | |
| 17 | TTCAAGTTGGAATTGGTAG | 1591 | |
| 18 | AAAGTCGGACAGCCTCACCAA | 1988 |
본 명세서에서 사용된 '표적 mRNA'라 함은 사람의 Hif1α mRNA, 사람과 같은 계통의 Hif1α mRNA, 이의 선택적 스플라이싱 구조체를 지칭한다. 구체적으로, Human: NM_001530, NM_181054(NM_001530에서 염기서열 2203~2248가 삭제된 스플라이싱 형태), Mus musculus: NM_0010431, Macaca fascicularis: AB169332 등이 포함된다. 따라서, 본 발명의 siRNA은 사람 또는 사람과 같은 계통의 Hif1α mRNA나 이의 선택적 스플라이싱 형태를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 'mRNA (또는 cDNA) 영역을 표적으로 한다'고 함은 siRNA가 상기 mRNA (또는 cDNA) 영역 염기서열 중의 전부 또는 일부, 예컨대 염기서열의 85-100%와 상보적인 염기서열을 가져서, 상기 mRNA (또는 cDNA) 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 '상보적'이라 함은 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥이 염기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보적 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥은 왓슨-크릭 방식으로 염기쌍을 형성하여 이중가닥을 형성한다. 본 발명에서 염기 U가 언급되는 경우, 별다른 언급이 없는 한 염기 T로 치환가능하다.
본 발명의 약학적 조성물의 Hif1α 합성 및/또는 발현 억제 효과와 암 치료 효과는 Hif1α의 효과적인 합성 및/또는 발현 억제에 의하여 성취되는 것이므로, 상기 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 siRNA는 상기 특정 mRNA 영역들 중 하나 이상을 표적으로 하는 15-30 bp의 이중가닥 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 돌출부가 없는 평활(blunt) 말단을 갖는 대칭 구조이거나, 또는 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양 말단에 1-5개의 뉴클레오타이드(nt)의 돌출부를 가지는 구조일 수 있다. 상기 돌출부 뉴클레오타이드는 어떠한 서열이어도 상관이 없으나 dT(디옥시티미딘) 2 내지 4개, 예컨대 2개를 붙일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 siRNA는 서열번호 19 내지 22, 25 내지 44, 및 53 내지 115의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 siRNA는 아래의 표 2에 나타낸 siRNA 1, siRNA 2, siRNA 4 내지 siRNA 13, 및 siRNA 18 내지 siRNA 50으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | 가닥 | siRNA 표시 | Modification | |
| 2가닥 대칭 siRNA (17개) |
19 | GUUUGAACUAACUGGACACdTdT | Sense | siRNA 1 | |
| 20 | GUGUCCAGUUAGUUCAAACdTdT | Antisense | |||
| 21 | UGAUUUUACUCAUCCAUGUdTdT | Sense | siRNA 2 | ||
| 22 | ACAUGGAUGAGUAAAAUCAdTdT | Antisense | |||
| 23 | CAUGAGGAAAUGAGAGAAAdTdT | Sense | siRNA 3 | ||
| 24 | UUUCUCUCAUUUCCUCAUGdTdT | Antisense | |||
| 25 | GAGAAAUGCUUACACACAGdTdT | Sense | siRNA 4 | ||
| 26 | CUGUGUGUAAGCAUUUCUCdTdT | Antisense | |||
| 27 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdTdT | Sense | siRNA 5 | ||
| 28 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdTdT | Antisense | |||
| 29 | GAACAUAAAGUCUGCAACAdTdT | Sense | siRNA 6 | ||
| 30 | UGUUGCAGACUUUAUGUUCdTdT | Antisense | |||
| 31 | UGAUACCAACAGUAACCAAdTdT | Sense | siRNA 7 | ||
| 32 | UUGGUUACUGUUGGUAUCAdTdT | Antisense | |||
| 33 | UCAGUGUGGGUAUAAGAAAdTdT | Sense | siRNA 8 | ||
| 34 | UUUCUUAUACCCACACUGAdTdT | Antisense | |||
| 35 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdTdT | Sense | siRNA 9 | ||
| 36 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdTdT | Antisense | |||
| 37 | GCCGCUCAAUUUAUGAAUAdTdT | Sense | siRNA 10 | ||
| 38 | UAUUCAUAAAUUGAGCGGCdTdT | Antisense | |||
| 39 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdTdT | Sense | siRNA 11 |
||
| 40 | UAAUUCACACAUACAAUGCdTdT | Antisense | |||
| 41 | UCAGGAUCAGACACCUAGUdTdT | Sense | siRNA 12 |
||
| 42 | ACUAGGUGUCUGAUCCUGAdTdT | Antisense | |||
| 43 | AUUUAGACUUGGAGAUGUUdTdT | Sense | siRNA 13 |
||
| 44 | AACAUCUCCAAGUCUAAAUdTdT | Antisense | |||
| 45 | AGAGGUGGAUAUGUCUGGGdTdT | Sense | siRNA 14 |
||
| 46 | CCCAGACAUAUCCACCUCUdTdT | Antisense | |||
| 47 | CACCAAAGUGGAAUCAGAAdTdT | Sense | siRNA 15 |
||
| 48 | UUCUGAUUCCACUUUGGUGdTdT | Antisense | |||
| 49 | UUCAAGUUGGAAUUGGUAGdTdT | Sense | siRNA 16 |
||
| 50 | CUACCAAUUCCAACUUGAAdTdT | Antisense | |||
| 51 | AAAGUCGGACAGCCUCACCAA | Sense | siRNA 17 | ||
| 52 | UUGGUGAGGCUGUCCGACUUU | Antisense | |||
| 2 가닥 비대칭 siRNA (3개) |
53 | GGAAGAACUAUGAACA | Sense | siRNA 18 | |
| 28 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdTdT | Antisense | |||
| 54 | GAUUUGUGAACCCAUU | Sense | siRNA 19 | ||
| 36 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdTdT | Antisense | |||
| 55 | UUGUAUGUGUGAAUUA | Sense | siRNA 20 | ||
| 40 | UAAUUCACACAUACAAUGCdTdT | Antisense | |||
| 화학적변형 siRNA (30개) |
56 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA21 | siRNA5 -mod1 |
| 57 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 58 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA22 | siRNA5 -mod2 |
|
| 59 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 60 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA23 | siRNA5 -mod3 |
|
| 61 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 62 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA24 | siRNA5 -mod4 |
|
| 63 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 64 | CGAGGAAGAACuAuGAACAdT*dT | Sense | siRNA25 | siRNA5 -mod5 |
|
| 65 | UGuuCAuAGUUCuuCCuCGdT*dT | Antisense | |||
| 66 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA26 | siRNA5 -mod6 |
|
| 67 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 68 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA27 | siRNA5 -mod7 |
|
| 69 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 70 | cGAGGAAGAAcuAuGAAcAdT*dT | Sense | siRNA28 | siRNA5 -mod8 |
|
| 71 | uGuucAuAGUcuuccucGdT*dT | Antisense | |||
| 72 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA29 | siRNA5 -mod9 |
|
| 73 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 74 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA30 | siRNA5 -mod10 |
|
| 75 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 76 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA31 | siRNA9 -mod1 |
|
| 77 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 78 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA32 | siRNA9 -mod2 |
|
| 79 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 80 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA33 | siRNA -mod3 |
|
| 81 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 82 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA34 | siRNA9 -mod4 |
|
| 83 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 84 | GCuGAuuuGuGAACCCAuudT*dT | Sense | siRNA35 | siRNA9 -mod5 |
|
| 85 | AAuGGGuuCACAAAuCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 86 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA36 | siRNA9 -mod6 |
|
| 87 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 88 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA37 | siRNA9 -mod7 |
|
| 89 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 90 | GcuGAuuuGUGAAcccAuudT*dT | Sense | siRNA38 | siRNA9 -mod8 |
|
| 91 | AAuGGGuucACAAAucAGcdT*dT | Antisense | |||
| 92 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA39 | siRNA9 -mod9 |
|
| 93 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 94 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA40 | siRNA9 -mod10 |
|
| 95 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 96 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA41 | siRNA 11 -mod1 |
|
| 97 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 98 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA42 | siRNA 11 -mod2 |
|
| 99 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 100 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA43 | siRNA 11 -mod3 |
|
| 101 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 102 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA44 | siRNA 11 -mod4 |
|
| 103 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 104 | GCAuuGuAuGuGuGAAuuAdT*dT | Sense | siRNA45 | siRNA 11 -mod5 |
|
| 105 | UAAuuCACACAuACAAuGCdT*dT | Antisense | |||
| 106 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA46 | siRNA 11 -mod6 |
|
| 107 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 108 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA47 | siRNA 11 -mod7 |
|
| 109 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 110 | GcAuuGuAuGuGuGAAuuAdT*dT | Sense | siRNA48 | siRNA 11 -mod8 |
|
| 111 | uAAuucAcACAuAcAAuGcdT*dT | Antisense | |||
| 112 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA49 | siRNA 11 -mod9 |
|
| 113 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 114 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA50 | siRNA 11 -mod10 |
|
| 115 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense |
| 표기법 | 도입된 화학적 변형 |
| * | 포스포디에스테르 결합 → 포스포로티오에이트 결합 |
| 밑줄 | 2'-OH → 2'-O-Me |
| 소문자 | 2'-OH → 2'-F |
| 굵은 글씨 | ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged nucleotide) |
| 구조 이름 | siRNA 화학적 구조 변형 |
| mod1 | 안티센스 가닥의 1,2번 핵산의 리보스 환에 2'위치의 -OH기(이하, 2'-OH)를 2'-O-Me로 치환 |
| mod2 | Mod1의 구조변형과 함께 센스 가닥의 1,2번 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 2'-O-Me로 치환 |
| mod3 | Mod2의 구조변형과 함께 센스 가닥에서 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환에서 2‘-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod4 | Mod3의 구조변형과 함께 안티센스 가닥의 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod5 | Mod1의 구조변형과 함께 센스, 안티센스 가닥에서 염기 G를 가진 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 모두 2'-O-Me로, 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 모두 2'-F로 치환 |
| mod6 | Mod1의 구조변형과 함께 센스 가닥의 5’말단에 ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged nucleotide)로 치환 |
| mod7 | 안티센스 가닥의 5’말단의 2번 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me으로 치환 |
| mod8 | 센스 및 안티센스 가닥의 염기 U와 C의 2'-OH를 모두 2’-F로 치환 |
| mod9 | 센스 가닥의 염기 G 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me으로 치환하고, 안티센스 가닥의 염기서열 GU의 U와, UUU의 첫째 U, 그리고 UU의 첫째 U의 2'-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod10 | 센스 가닥의 짝수 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me로 치환하고, 안티센스 가닥의 홀수 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me로 치환 |
상기 표 4에 있어서, mod1부터 mod7까지는 안티센스 가닥의 10번 및 11번 위치의 염기에는 변형을 가하지 않고, mod 1부터 mod 10까지의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 dTdT(포스포디에스테르 결합)을 포스포로티오에이트 결합 (3'-dT*dT, *:Phosphorothioate bond)으로 치환한다.
상기 siRNA는 Hif1α 전사체 (mRNA transcript) 염기서열의 특정 표적 영역에 대한 서열 특이성이 높아서, 표적 유전자의 전사체에 특이적으로 상보적 결합하여 RNA 간섭 효율성을 증가되어 세포내에서 Hif1α의 발현 및/또는 합성 억제 효율이 우수하다. 또한, 면역 유발 활성이 최소화된 것을 특징으로 한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 siRNA는 서열번호 1의 Hif1α cDNA 영역 중 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 영역에 대한 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, 바람직하게는 서열번호 19 내지 22, 25 내지 44, 및 53 내지 115의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA, 더 바람직하게는 서열번호 19 내지 22, 25 내지 44, 및 53 내지 115로 이루어진 45종의 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 siRNA는 리보핵산 서열 자체, 또는 이를 발현하는 재조합 벡터 (발현 벡터) 형태를 모두 포함하는 개념이다. 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스, 백시니아바이러스, 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서 siRNA와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 경우를 포함한다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 이 분야에 통상적으로 사용되는 모든 담체를 포함하며, 예컨대, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 siRNA 또는 약학적 조성물의 투여 대상 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트)일 수 있으며, 특히 Hif1α의 발현과 관련되는 질병이나 증상을 가지거나, Hif1α 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨대, 사람일 수 있다.
Hif1α억제에 유효한 효과를 얻으면서 면역 반응 등의 바람직하지 않은 부반응을 최소화하기 위하여, 조성물 내의 siRNA의 농도 또는 사용 또는 처리 농도는, 0.001 내지 1000nM, 바람직하게는 0.01 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10nM로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료 가능한 암은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 식도암, 전립선암, 및 뇌암 등의 각종 고형암, 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이하 siRNA의 구조, 설계 과정 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 siRNA는 RNAi 기전에 의해 Hif1α mRNA의 분해를 일으켜 Hif1α 단백질의 발현을 유발하지 않거나 감소시키는 기능을 한다.
일실시예에서, siRNA는 RNA interference (RNAi) 경로를 유발하는 작은 저해 RNA 이중가닥 (small inhibitory RNA duplexes)을 의미한다. 구체적으로, siRNA는 센스 RNA 가닥과 그에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며, 양 가닥이 15-30bp, 구체적으로는 15-25bp, 더 구체적으로는 15-22bp 를 포함하는 RNA 이중 가닥이다. siRNA는 이중가닥 영역을 포함하며 단일 가닥이 헤어핀(hairpin) 또는 stem-loop 구조를 형성하는 구조이거나, 2개의 분리된 가닥의 이중가닥일 수 있다. 센스 RNA 가닥은 표적 유전자의 mRNA 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열을 가지며, 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥이 서로 왓슨과 크릭의 상보적인 염기서열 결합에 의해서 이중 가닥을 이루고 있다. siRNA의 안티센스 가닥은 RISC(RNA-Induced Silencing Complex)에 포집되어 RISC가 안티센스 가닥과 상보적인 목표 mRNA를 확인한 후 절단 또는 번역(translational) 저해를 유도하게 한다.
일실시예에서, 이중가닥 siRNA는 3' 말단, 5' 말단 또는 양쪽 말단에 1 내지 5 뉴클레오티드의 돌출부(overhang)를 가질 수 있다. 또는, 양 말단이 절단된 형태의 평활 말단(blunt end)을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로는 US20020086356, 및 US7056704에 개시된 siRNA일 수 있다 (상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).
본 발명의 일실시예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없는 평활 말단을 갖는 대칭 구조, 또는 적어도 하나, 예컨대 1-5개의 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지는 비대칭 구조일 수 있다. 돌출부 뉴클레오타이드는 어떠한 서열이어도 상관이 없으나 dT(디옥시티미딘) 2 내지 4개, 예컨대 2개를 붙일 수 있다.
상기 안티센스 가닥은 생리학적 조건에서 서열번호 1의 mRNA의 표적 영역에 혼성화한다. '생리학적 조건에서의 혼성화'라 함은 siRNA의 안티센스 가닥이 in vivo에서 mRNA의 특정 표적 영역과 혼성화하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 안티센스 가닥은 mRNA의 표적 영역, 바람직하게는 상기 표 1의 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14의 염기서열 중 하나 이상과 85% 이상의 서열 상보성을 갖는 것일 수 있으며, 더 구체적으로 상기 안티센스 가닥은 서열번호 1의 염기서열 내의 연속하는 15 내지 30 bp 염기서열, 바람직하게는 연속하는 15 내지 25 bp 염기서열, 보다 바람직하게는 연속하는 15 내지 22 bp의 염기서열, 더욱 바람직하게는 상기 표 1의 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14의 염기서열에서 선택된 하나 이상에 완전 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 일 실시예에서, siRNA는 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로, 19 내지 21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15 내지 19nt의 센스 가닥(단, 안티센스 가닥이 19nt인 경우 센스 가닥은 19nt가 아니다)으로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부(overhang)(예컨대, (dT)n, n=1-5, 바람직하게는 2-4의 정수)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 WO09/078685에 개시된 siRNA일 수 있다.
siRNA를 이용한 치료에서 가장 먼저 고려되어야 할 점은 표적화된 유전자의 염기서열에서 가장 큰 활성을 가지는 최적의 염기서열을 선정하는 것이 필요하다. 구체적으로, 일실시예에서, 전임상 시험과 임상 시험간의 관련성을 높이기 위하여 종간 보존된 서열을 포함하는 Hif1α siRNA를 디자인하는 것이 바람직하다. 또한, 일실시예에서, RISC에 결합하는 안티센스 가닥이 RISC와 결합력이 높도록 디자인하는 것이 바람직하다. 따라서, 센스 가닥과 안티센스 가닥의 열역학적 안정성에 차이가 나도록 디자인 되어 센스 가닥은 RISC와 결합하지 않고 가이드 서열인 안티센스 가닥이 RISC와 결합력을 높이도록 한다. 구체적으로, 센스 가닥의 GC 서열이 60%가 넘지 않으며, 센스 가닥의 5' 말단에서부터 15번째 및 19번째 사이에는 아데닌/구아닌 염기가 3개 이상 있고, 센스 가닥의 5' 말단에서부터 1~7번째 사이에는 G/C 염기가 많은 것일 수 있다.
또한 반복 염기 서열로 인해 siRNA 자체 내부 염기 서열끼리 결합하여 mRNA에 상보적으로 결합하는 능력을 떨어뜨릴 수 있으므로, 4개 이상의 반복 염기 서열이 있도록 디자인하는 것은 피하는 것이 바람직하다. 또한, 19개 염기로 이루어진 센스 서열의 경우, 표적 유전자의 mRNA에 결합하여 전사체 분해를 잘 일으키기 위해서는 센스가닥의 5' 말단에서부터 3번째, 10번째, 및 19번째 염기서열이 아데닌일 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에서, siRNA는 비특이적 결합 및 면역 유발 활성이 최소화된 것을 특징으로 한다. siRNA에 의한 인터페론 등의 면역반응 유도는 주로 항원을 제시하는 면역세포의 endosome에 존재하는 TLR7(Toll-like receptor-7)을 통해 일어나며, siRNA의 TLR7과의 결합(binding)은 GU가 풍부한 서열과 같이 서열 특이적으로 일어나므로 TLR7에 의해 인지되지 않는 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 5'-GUCCUUCAA-3'와 5'-UGUGU-3'와 같은 면역유발 서열을 가지지 않으며, Hif1α 이외의 다른 유전자와의 상보성이 최소 70% 이하일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 Hif1α cDNA 표적 서열의 예는 상기 표 1에 기재한 서열의 뉴클레오타이드를 포함한다. 표 1의 표적 서열을 기초로 siRNA의 길이를 표적 서열의 길이보다 더 길거나 짧게 디자인하거나, 상기 DNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드를 더하거나 빼고 siRNA 서열을 디자인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없거나, 적어도 하나의 말단이 1-5 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지며, 상기 안티센스 가닥은 생리학적 조건에서 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14, 바람직하게는 서열번호 6, 10, 12에 대응하는 mRNA 영역에 혼성화한다. 즉, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14, 바람직하게는 서열번호 6, 10, 12의 상보적인 서열을 포함한다. 즉, 본 발명의 Hif1α siRNA 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 유해한 인터페론 반응을 유도하지 않으면서 Hif1α 유전자의 발현을 저해시키는 특징을 가진다.
본 발명은 서열번호 6 (5'-CGAGGAAGAACTATGAACA-3'), 서열번호 10 (5'-GCTGATTTGTGAACCCATT-3'), 및 서열번호 12 (5'-GCATTGTATGTGTGAATTA-3')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열에 대응하는 mRNA 영역에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 Hif1α의 발현을 억제한다.
본 발명에 구체예에 따른 Hif1α siRNA는 상기 표 2에 기재한 바와 같다.
일실시예에서, 상기 Hif1α siRNA는 서열번호 27의 센스 서열 및 서열번호 28의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 5, 서열번호 35의 센스 서열 및 서열번호 36의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 9, 서열번호 39의 센스 서열 및 서열번호 40의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 11, 서열번호 53의 센스 서열 및 서열번호 28의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 18, 서열번호 54의 센스 서열 및 서열번호 36의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 19, 서열번호 55의 센스 서열 및 서열번호 40의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 20으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
넉다운(Hif1α 발현 억제)은 정량 PCR(qPCR) 증폭, bDNA (branched DNA) assay, 웨스턴 블롯, ELISA 등의 방법으로 mRNA 또는 단백질 수준의 변화를 측정하여 확인할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 리포좀 복합체를 제조하여 종양 세포주에 처리한 다음 리보핵산 매개에 의한 발현 간섭현상을 mRNA 단계에서 bDNA 측정법을 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 siRNA서열은 Hif1α의 합성 또는 발현을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라 면역 유발 활성이 낮다는 특징을 가진다.
본 발명의 일실시에에서, 면역독성은 사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에 siRNA-DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium metylsulfate) 복합체(complex)를 처리한 후 배양액 중에 유리된 사이토카인인 인터페론 알파 및 감마 (INF-α 및 INF-γ), 종양괴사인자(Tumor necrosis factor-α: TNF-α), 인터류킨-12(Interleukin-12, IL-12) 등의 증가 여부를 측정하여 확인할 수 있다.
siRNA는 자연에 존재하는(변형되지 않은) 리보핵산 단위구조를 가질 수 있으며, 하나 이상의 리보핵산의 당 구조나 염기 구조, 리보핵산 간의 결합 부위가 하나 이상의 화학적 변형(modification)을 가지도록 합성되는 등의 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 상기와 같은 siRNA의 화학적 변형을 통해, siRNA의 본래의 RNAi 능력에 영향을 미치지 않고, 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수(uptake) 증가, 세포 표적화(타겟 특이성) 향상, 안정성 증가, 또는 인터페론 활성 감소, 면역 반응 및 센스(sense) 효과와 같은 타겟 이외 효과 (off-target effect) 감소 등의 효과를 얻을 수 있다.
siRNA의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a webbased tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120).
siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 센스 또는 안티센스 가닥의 포스포디에스테르 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하여 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 일례로, siRNA 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양 말단, 바람직하게는 RNA의 종결 위치, 예컨대, 3' 말단 돌출부(예컨대 (dT)n, n=1-5, 바람직하게는 2-4의 정수)에만 도입할 수 있다.
다른 일례로, siRNA 센스(sense) 또는 안티센스 가닥의5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 혹은 LNA(Locked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있으며, 바람직하게는 siRNA 센스(sense) 가닥의 5' 말단에 도입할 수 있다. 이를 통해 RNAi 능력에영향을 미치지 않고 siRNA 안정성을 증가시키고 면역 반응 및 비특이적 억제 효과를 줄일 수 있다.
또 다른 일례로, 리보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH2(아미노기), -C-allyl(알릴기), -F(플루오로기), 또는 -O-Me(또는 CH3, 메틸기)로 치환하는 화학적 변형을 가할 수 있다. 예컨대, 센스 가닥의 1번 및 2번 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 2'-O-Me로 치환하거나, 안티센스 가닥의 2번 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 2'-O-Me로 치환, 또는 구아닌(G) 또는 유리딘(U)을 포함하는 일부 뉴클레오타이드에서 리보스 환의 2'-OH를 2'-O-Me(메틸기) 또는 2'-F(플루오로기)로 치환할 수 있다.
상술한 화학적 변형 외에도 다양한 화학적 변형을 가할 수 있으며, 이러한 화학적 변형은 어느 한 가지 형태의 변형만 이루어질 수도 있고, 여러 가지 화학적 변형이 함께 이루어질 수도 있다.
본 발명의 일례에서, 화학적 변형은 상기한 표 4의 화학적 변형 중 하나 일 수 있으며, 표 4에 있어서, mod1부터 mod7까지는 안티센스 가닥의 10번 및 11번 위치의 염기에는 변형을 가하지 않고, mod 1부터 mod 10까지의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 dTdT(포스포디에스테르 결합)을 포스포로티오에이트 결합 (3'-dT*dT, *:Phosphorothioate bond)으로 치환할 수 있다.
상기 화학적 변형에 있어, siRNA 이중 가닥구조를 안정화시키는 동시에, 유전자 발현 저해활성을 감소시키지 않는 것이 바람직하므로, 최소한의 변형이 바람직하다.
또한, siRNA에 콜레스테롤, 비오틴, 세포 침투 성질을 가지는 펩타이드(cell penetrating peptide)와 같은 리간드(ligand)를 센스가닥의 5'- 또는 3'- 말단에 붙이는 것도 가능하다.
본 발명의 siRNA는 화학적 합성, in vitro 전사 또는 다이서(Dicer)나 기타 유사한 활성을 가지는 뉴클리에이즈로 긴 이중 가닥 RNA를 절단하여 제조할 수 있다. 또는, 상기한 바와 같이, siRNA를 플라즈미드나 바이러스성 발현 벡터 등을 통하여 발현시켜 사용할 수 있다.
siRNA 특정 서열이 인터페론을 유도하는지 여부를 수지상 세포를 포함하는 사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에서 실험적으로 확인한 후 면역반응을 유발하지 않는 서열을 선별하여 후보 siRNA 서열로 선정할 수 있다.
이하, 상기 siRNA의 전달을 위한 약물전달시스템(DDS)을 설명한다.
siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)이 활용될 수 있다.
세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체에는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 마이셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등이 있다. 바이러스 벡터 (viral vector)로 전달 효율이 높고 지속 시간이 긴 이점이 있다. 상기 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 백시니아바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이러스 벡터 등이 포함된다. 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 플라스미드를 포함할 수 있다. 그 외에도 리포좀, 양이온성 고분자, 마이셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달을 위한 양이온성 고분자에는 키토산, 아텔로콜라겐(atelocollagen), 양이온성 폴리펩타이드(cationic polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly(L-lysin), 선형 또는 분지형 PEI(polyethylene imine), 사이클로덱스트린계열 다가양이온(cyclodextrin-based polycation), 덴드리머(dendrimer) 등과 같은 합성고분자가 포함된다.
본 발명의 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체(약학적 조성물)는 암의 치료를 위해 in vivo 또는 ex vivo 상에서 세포 내로 도입될 수 있다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체를 세포 내에 도입하게 되면 표적 단백질인 Hif1α의 발현을 선택적으로 감소시켜 암의 생성에 관여하는 Hif1α의 발현이 억제되어 암세포가 사멸하고 암의 치료가 가능하게 된다.
본 발명의 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 국소, 경구 또는 비경구적 등으로 투여하기 위해서 제제화할 수 있다. 구체적으로, siRNA의 투여는 눈의 점막, 질, 또는 항문 내 투여 포함을 하는 국소 투여, 또는 폐, 기관지, 비강, 외피, 내피 투여, 정맥, 동맥, 피하, 복강, 근육, 두개 (뇌경막 또는 뇌실) 등의 비경구 투여, 또는 경구 투여 등의 경로를 통할 수 있다. 국소 투여를 위하여, siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 패치와 연고, 로션, 크림, 젤, 적제, 좌약, 스프레이, 용액, 파우더 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비경구적 투여, 뇌경막 혹은 뇌실 내 투여를 위하여, siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 버퍼, 희석제, 투과 촉진제, 기타 통상적으로 약제학적으로 사용 가능한 전달체 혹은 부형제와 같은 적절한 첨가제을 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 siRNA를 주사용 조성물과 혼합하여 종양이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 경피 경로로 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다. 상기 주사용 조성물은 특별한 제한은 없지만 등장성 수용액 또는 현탁액 형태인 것이 바람직하고, 멸균처리, 및/또는 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 및/또는 리포좀 제제)를 함유할 수 있다. 상기 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 통상적인 겔 제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 상기 경피흡수용 점착 조성물은 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 암 치료용 약학적 조성물은 Hif1α의 발현을 억제하는 siRNA 외에 종래에 공지된 항암 화학요법제를 추가적으로 포함함으로써, 병용 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 Hif1α의 발현을 억제하는 siRNA와 병용투여가 가능한 항암 화학요법제는 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 발루비신(valubicin), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 세툭시맵(cetuximab), 라파티닙(lapatinib), 트라투쮸맵(trastuzumab), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 베바시쮸맵(bevacizumab), 보르테조밉(bortezomib), 템시로리무스(temsirolimus), 에베로리무스(everolimus),보리노스타트(vorinostat),이리노테칸(irinotecan),토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 이와 같은 화학요법제와의 병용과 함께 또는 별개로, Hif1α siRNA와 함께 각종 성장인자 (VEGF, EGF, PDGF 등), 성장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여러 경로를 동시에 차단함으로써 항암효과를 극대화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 Hif1α의 합성 및/또는 발현 억제를 위한 유효량의 상기 Hif1α siRNA를 Hif1α을 발현하는 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 Hif1α 발현 및/또는 합성을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 Hif1α을 발현하는 모든 세포로서, 예컨대 암세포일 수 있고, 동물, 바람직하게는 포유 동물, 예컨대, 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트 등) 등의 생체 내 세포이거나 생체로부터 분리된 세포일 수 있다. 예컨대, 상기 Hif1α 발현 및/또는 합성을 억제하는 방법은 동물의 생체로부터 분리된 Hif1α를 발현하는 세포를 준비하는 단계; 및 본 발명에 따른 siRNA를 상기 생체에서 분리된 Hif1α를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 Hif1α를 발현하는 세포는 생체에서 분리된 Hif1α를 발현하는 세포를 인공적으로 배양한 것일 수 있다.
또 다른 예는 Hif1α의 합성 및/또는 발현 억제를 위한 유효량의 상기 Hif1α siRNA를 Hif1α을 발현하는 암세포에 접촉시켜 암세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 암세포는 동물, 바람직하게는 포유 동물, 예컨대, 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트 등) 의등 생체 내 존재하는 세포이거나 생체로부터 분리된 세포일 수 있다. 예컨대, 상기 암세포의 성장을 억제하는 방법은 동물의 생체로부터 분리된 Hif1α를 발현하는 암세포를 준비하는 단계; 및 본 발명에 따른 siRNA를 상기 생체에서 분리된 Hif1α를 발현하는 암세포와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 예는 상기 치료학적 유효량의 Hif1α siRNA 및 또는 이의 발현벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 전에 암의 예방 및/또는 치료가 필요한 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서 치료 가능한 암은 대부분의 고형암 (폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 식도암, 전립선암, 뇌암), 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트 등) 등일 수 있으며, 특히 Hif1α의 발현과 관련되는 질병이나 증상 (예컨대, 암)을 가지거나, Hif1α 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨대, 사람일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA의 유효량은 Hif1α 발현 또는 합성 억제 또는 이로 인한 암세포 성장 저해 및 암 치료 효과를 얻기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 증상의 정도, 투여되는 siRNA의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료 기간, 동시 사용되는 화학 항암제 등의 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 예컨대, 1일 투여 용량은 0.001 mg/kg ~ 100 ㎎/kg인 것이 좋고, 상기 용량은 한 번에 모두 투여되거나 수회에 걸쳐서 분량하여 투여될 수 있다.
본 발명의 Hif1α 전사체(mRNA)의 염기서열에 상보적인 siRNA는 리보핵산 매개 간섭현상(RNA-mediated interference, RNAi)에 의해 암세포에 공통적으로 발현되는 Hif1α의 발현을 억제하여 암세포를 사멸시키므로, 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 면역 반응을 최소한으로 유발할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서 채택한 리보핵산 매개 간섭현상을 이용한 RNAi 기술이 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 Hif1α의 발현을 선택적으로 저해하는 가장 효과적인 방법으로 제시되고 있으며, 기존의 대부분의 약물이 이미 발현된 단백질의 기능을 억제하는 데 반하여, 인체에 존재하는 유전자 조절 (natural gene silencing pathway) 기전인 RNAi 기술은 특정 질병 유발 단백질의 발현을 선택적으로 저해할 수 있을 뿐 아니라, 단백질이 합성되기 전 단계인 mRNA를 분해하므로 부작용을 유발하지 않고 암의 성장과 전이를 억제하여 보다 근원적인 암 치료 기술이 될 것으로 기대한다.
또한, siRNA와 함께 화학요법을 병용하여 화학요법제에 대한 민감도를 높임으로써 치료효과를 극대화하고, 부작용을 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, Hif1α siRNA와 함께 각종 성장인자 (VEGF, EGF, PDGF 등), 성장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여러 경로를 동시에 차단함으로 항암효과를 극대화 할 수 있는 부가적인 이점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
Hif1
α 발현 억제용
siRNA
가 결합할 수 있는
타겟
염기서열의 디자인
siDesign Center (Dharmacon), BLOCK-iTTM RNAi Designer (Invitrogen), AsiDesigner (KRIBB), siDirect (University of Tokyo) 및 siRNA Target Finder (Ambion)의 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 Hif1α mRNA 서열(NM_001530) 가운데 siRNA가 결합할 수 있는 표적 염기서열을 도출하였다. 아래의 표 5에 표적 염기서열로서 cDNA 서열로 표현된 서열을 나타내었다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') |
| 2 | GTTTGAACTAACTGGACAC |
| 3 | TGATTTTACTCATCCATGT |
| 4 | CATGAGGAAATGAGAGAAA |
| 5 | GAGAAATGCTTACACACAG |
| 6 | CGAGGAAGAACTATGAACA |
| 7 | GAACATAAAGTCTGCAACA |
| 8 | TGATACCAACAGTAACCAA |
| 9 | TCAGTGTGGGTATAAGAAA |
| 10 | GCTGATTTGTGAACCCATT |
| 11 | GCCGCTCAATTTATGAATA |
| 12 | GCATTGTATGTGTGAATTA |
| 13 | TCAGGATCAGACACCTAGT |
| 14 | ATTTAGACTTGGAGATGTT |
| 15 | AGAGGTGGATATGTCTGGG |
| 16 | CACCAAAGTGGAATCAGAA |
| 17 | TTCAAGTTGGAATTGGTAG |
| 18 | AAAGTCGGACAGCCTCACCAA |
실시예
2.
Hif1
α 발현 억제용
siRNA
의 제조
실시예 1에서 디자인한 표적 염기서열에 결합할 수 있는 siRNA 20종을 에스티팜(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다. 20종의 siRNA의 서열은 표 6과 같이 하되, 양 가닥의 3' 말단에 dTdT를 포함하도록 하였다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | 가닥 | siRNA 표시 |
| 19 | GUUUGAACUAACUGGACACdTdT | Sense | siRNA 1 |
| 20 | GUGUCCAGUUAGUUCAAACdTdT | Antisense | |
| 21 | UGAUUUUACUCAUCCAUGUdTdT | Sense | siRNA 2 |
| 22 | ACAUGGAUGAGUAAAAUCAdTdT | Antisense | |
| 23 | CAUGAGGAAAUGAGAGAAAdTdT | Sense | siRNA 3 |
| 24 | UUUCUCUCAUUUCCUCAUGdTdT | Antisense | |
| 25 | GAGAAAUGCUUACACACAGdTdT | Sense | siRNA 4 |
| 26 | CUGUGUGUAAGCAUUUCUCdTdT | Antisense | |
| 27 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdTdT | Sense | siRNA 5 |
| 28 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdTdT | Antisense | |
| 29 | GAACAUAAAGUCUGCAACAdTdT | Sense | siRNA 6 |
| 30 | UGUUGCAGACUUUAUGUUCdTdT | Antisense | |
| 31 | UGAUACCAACAGUAACCAAdTdT | Sense | siRNA 7 |
| 32 | UUGGUUACUGUUGGUAUCAdTdT | Antisense | |
| 33 | UCAGUGUGGGUAUAAGAAAdTdT | Sense | siRNA 8 |
| 34 | UUUCUUAUACCCACACUGAdTdT | Antisense | |
| 35 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdTdT | Sense | siRNA 9 |
| 36 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdTdT | Antisense | |
| 37 | GCCGCUCAAUUUAUGAAUAdTdT | Sense | siRNA 10 |
| 38 | UAUUCAUAAAUUGAGCGGCdTdT | Antisense | |
| 39 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdTdT | Sense | siRNA 11 |
| 40 | UAAUUCACACAUACAAUGCdTdT | Antisense | |
| 41 | UCAGGAUCAGACACCUAGUdTdT | Sense | siRNA 12 |
| 42 | ACUAGGUGUCUGAUCCUGAdTdT | Antisense | |
| 43 | AUUUAGACUUGGAGAUGUUdTdT | Sense | siRNA 13 |
| 44 | AACAUCUCCAAGUCUAAAUdTdT | Antisense | |
| 45 | AGAGGUGGAUAUGUCUGGGdTdT | Sense | siRNA 14 |
| 46 | CCCAGACAUAUCCACCUCUdTdT | Antisense | |
| 47 | CACCAAAGUGGAAUCAGAAdTdT | Sense | siRNA 15 |
| 48 | UUCUGAUUCCACUUUGGUGdTdT | Antisense | |
| 49 | UUCAAGUUGGAAUUGGUAGdTdT | Sense | siRNA 16 |
| 50 | CUACCAAUUCCAACUUGAAdTdT | Antisense | |
| 51 | AAAGUCGGACAGCCUCACCAA | Sense | siRNA 17 |
| 52 | UUGGUGAGGCUGUCCGACUUU | Antisense | |
| 53 | GGAAGAACUAUGAACA | Sense | siRNA 18 |
| 28 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdTdT | Antisense | |
| 54 | GAUUUGUGAACCCAUU | Sense | siRNA 19 |
| 36 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdTdT | Antisense | |
| 55 | UUGUAUGUGUGAAUUA | Sense | siRNA 20 |
| 40 | UAAUUCACACAUACAAUGCdTdT | Antisense |
실시예
3.
siRNA
를 이용한 종양 세포주에서의
Hif1
α의 발현억제 시험
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA를 이용하여, 종양 세포주인 인간 폐암 세포주(A549, ATCC)를 형질전환시키고, 형질전환된 종양 세포주에서 Hif1α의 발현양상을 측정하였다.
실시예
3-1. 종양 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암 세포주(A549)를 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린(100units/ml) 및 스트렙토마이신(100ug/ml)을 포함한 RPMI 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA)에서 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예
3-2.
Hif1
α 발현 억제용
siRNA
와
리포좀의
복합체 제조
실시예 1에서 디자인하여 합성 제조한 siRNA 1 내지 20의 20개 siRNA에 대해 Hif1α 발현 억제용 siRNA와 이를 전달해주는 리포좀 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)과의 복합체를 제조하였다.
siRNA 10nM을 포함한 Opti-MEM 배지 (Gibco) 25ul와 웰(well)당 0.4ul의 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 포함한 Opti-MEM 배지를 같은 부피로 혼합하여 상온에서 20분간 반응시켜 siRNA와 리포좀과의 복합체를 제조하였다.
실시예
3-3.
Hif1
α
타겟
siRNA
를 이용한 종양 세포주에서의
Hif1
α
mRNA
발현 억제
상기 실시예 3-1에서 배양한 폐암 세포주를 96웰-플레이트에 각각 웰당 세포를 104 세포수씩 분주(seeding)하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 Opti-MEM 배지를 웰(well)당 50μl씩 첨가하였다. 상기 실시예 3-2에서 제조한 siRNA와 리포좀의 복합체 조성물 50μl를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5%(v/v) 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에 배양하였다.
Hif1α mRNA 발현이 50% 저해되는 약물농도인 IC50 수치의 계산을 위해서 A549 세포주에 각각의 siRNA를 0.001nM 내지 10nM 사이의 7개의 농도 범위로 처리하였다.
실시예
3-4.
Hif1
α
mRNA
의 정량 분석_폐암세포
siRNA 리포좀 복합체에 의해 발현 억제된 Hif1α mRNA의 발현 정도는 Quantigene 2.0 system(Panomics 사)를 이용한 bDNA 측정법으로 측정하였다.
siRNA 리포좀 복합체를 세포에 24시간 처리한 후, mRNA를 정량 하였다. 제조사의 프로토콜대로 96-웰 플레이트 한 웰(well)당 100μl의 Lysis mixture(Panomics, Quantigene 2.0 bDNA kit)를 처리하여 50℃에서 1시간 동안 세포를 용해시켰다. Panomics 사에서 Hif1α의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브(Panomics, Cat.# SA-11598)를 구매하여, 얻어진 세포 샘플 중 80μl와 함께 96웰 플레이트에 혼합하였다. mRNA가 웰에 고정되고 프로브와 결합할 수 있도록 55℃에서 16시간 내지 20시간 동안 반응을 시켰다. 이어 각 웰에 키트의 증폭 작용 시약 100μl를 넣고 55℃에서 반응을 시키고 wash하는 과정을 두 단계 수행하였다. 세 번째 증폭 작용 시약 100μl를 넣고 50℃에서 반응을 시킨 후 발광을 유도하는 시약을 100μl 넣고 5분 후에 형광 및 발광 측정기(Bio-Tek, Synergy-HT)에 넣고 발광값을 측정하여 lipofectamine만 처리한 대조군의 발광값(100%)에 대한 백분율 값을 산출하였다. 이 백분율은 대조군과 각 siRNA를 처리한 시험군에서의 Hif1α mRNA의 발현율을 나타낸다.
인간 폐암 세포주인 A549 에서 리포좀만 처리한 대조군의 발광(luciferin) 측정치에 대비하여 10nM의 Hif1α siRNA 리포좀 복합체를 처리한 실험군의 발광(luciferin) 측정치의 상대적인 값을 계산하여, siRNA로 형질전환시킨 A549 세포주에서 발현되는 Hif1α mRNA의 수준을 측정하였으며, 그 결과를 아래의 표 7에 나타내었다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | siRNA번호 | Hif1α mRNA발현율 (%) |
| 2 | GTTTGAACTAACTGGACAC | 1 | 50.3 |
| 3 | TGATTTTACTCATCCATGT | 2 | 56.0 |
| 4 | CATGAGGAAATGAGAGAAA | 3 | 80.5 |
| 5 | GAGAAATGCTTACACACAG | 4 | 46.2 |
| 6 | CGAGGAAGAACTATGAACA | 5 | 29.6 |
| 7 | GAACATAAAGTCTGCAACA | 6 | 45.1 |
| 8 | TGATACCAACAGTAACCAA | 7 | 46.4 |
| 9 | TCAGTGTGGGTATAAGAAA | 8 | 53.8 |
| 10 | GCTGATTTGTGAACCCATT | 9 | 26.1 |
| 11 | GCCGCTCAATTTATGAATA | 10 | 49.9 |
| 12 | GCATTGTATGTGTGAATTA | 11 | 27.8 |
| 13 | TCAGGATCAGACACCTAGT | 12 | 46.9 |
| 14 | ATTTAGACTTGGAGATGTT | 13 | 56.3 |
| 15 | AGAGGTGGATATGTCTGGG | 14 | 81.7 |
| 16 | CACCAAAGTGGAATCAGAA | 15 | 73.7 |
| 17 | TTCAAGTTGGAATTGGTAG | 16 | 66.7 |
| 18 | AAAGTCGGACAGCCTCACCAA | 17 | 57.4 |
표 7에서 서열번호 2, 3, 및 5 내지 14 (siRNA번호 1, 2 및 4 내지 13)은 본 발명의 실시예에 해당하고, 서열번호 4, 15 내지 18 (siRNA번호 3, 14 내지 17)은 비교예로서 제시된 것이다. 표 7에서 보듯이, 총 17종의 siRNA에 의하여 형질전환된 세포주에서 Hif1α mRNA의 발현 정도를 살펴본 결과, 본 발명의 12종의 siRNA가 비교예의 5종의 siRNA보다 우수한 억제 효과를 보였다. 구체적으로, 본 발명의 12종의 siRNA 중에서 Hif1α 발현의 억제율이 40% 초과 70% 이하(발현율이 30%이상 60% 미만)인 siRNA가 9종, 억제율이 70% 이상(발현율이 30% 미만)인 siRNA가 3종임을 확인하였다.
상기 표 7에서 우수한 유전자 발현 억제 효과를 가지는 3종의 siRNA인 siRNA 5, 9, 및 11번에 대해 A549 세포주를 사용하여 10nM에서 0.001nM 범위에서 Hif1α mRNA 발현감소효과를 조사하여 IC50을 구하여 아래의 표 8에 나타내었다. IC50 수치는 Spectra Max 190 (ELISA 기기) 모델에서 지원되는 SofrMax pro software Biotek(Synergy-HT사 ELISA 기기)모델에서 지원되는 KC4 software 를 이용하여 계산하였다. siRNA 5, 9 및 11의 IC50 수치를 siRNA 3 및 16과 비교하였을 때, 4내지 500배 가량 우수함을 알 수 있다.
| siRNA 서열번호 |
siRNA 번호 | 대응 mRNA 서열번호 |
A549 (IC50 : nM) |
| 27, 28 | 5 | 6 | 0.02 |
| 35, 36 | 9 | 10 | 0.04 |
| 39, 40 | 11 | 12 | 0.02 |
| 23, 24 | 3 | 4 | >10 |
| 49, 50 | 16 | 17 | 0.16 |
실시예
3-5. 비대칭 구조
siRNA
의
Hif1
α
mRNA
억제효과_폐암세포
서열번호 6, 10, 또는 12를 표적으로 하는, 대칭 구조의 siRNA 5, 9, 및 11과 센스가닥이 안티센스 가닥보다 짧은 비대칭구조의 siRNA인 siRNA 18, 19, 및 20을 각각 10nM의 농도로 폐암 세포주인 A549에 각각 처리하고 Hif1α mRNA 억제효능을 조사하여 아래의 표 9에 나타내었다. 실험 방법은 실시예 3-4에서와 같은 방식으로 하였다.
| siRNA 서열번호 |
siRNA 번호 | 구조적 특징 | Hif1α mRNA % |
| 27, 28 | 5 | 대칭 | 12.4 |
| 53, 28 | 18 | 비대칭 | 18.8 |
| 35, 36 | 9 | 대칭 | 9.2 |
| 54, 36 | 19 | 비대칭 | 6.2 |
| 39, 40 | 11 | 대칭 | 27.4 |
| 55, 42 | 20 | 비대칭 | 30.1 |
표 9에 나타난 바와 같이, 서열번호 6, 10, 및 12를 표적으로 하는 경우, 비대칭 구조 siRNA에서도 대칭구조 siRNA와 유사한 정도로 Hif1α 발현을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
실시예
4.
siRNA
의 화학적 구조 변형
siRNA 번호 5, 9, 및 11의 화학적 구조 변형체를 제작하였다.
표 10에서 보듯이 siRNA의 화학적 구조 변형은 10가지 형태로 만들었으며, 2'-O-Me, 포스포로티오에이트 결합, 2'-F를 이용한 화학적 구조 변형, 혹은 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid)를 도입한 화학적 구조변형을 하였다. 디자인한 화학적 구조 변형 siRNA는 삼천리 제약(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | 가닥 | siRNA 표시 | Modification | |
| 화학적변형 siRNA (30개) |
56 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA21 | siRNA5 -mod1 |
| 57 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 58 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA22 | siRNA5 -mod2 |
|
| 59 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 60 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA23 | siRNA5 -mod3 |
|
| 61 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 62 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA24 | siRNA5 -mod4 |
|
| 63 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 64 | CGAGGAAGAACuAuGAACAdT*dT | Sense | siRNA25 | siRNA5 -mod5 |
|
| 65 | UGuuCAuAGUUCuuCCuCGdT*dT | Antisense | |||
| 66 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA26 | siRNA5 -mod6 |
|
| 67 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 68 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA27 | siRNA5 -mod7 |
|
| 69 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 70 | cGAGGAAGAAcuAuGAAcAdT*dT | Sense | siRNA28 | siRNA5 -mod8 |
|
| 71 | uGuucAuAGUcuuccucGdT*dT | Antisense | |||
| 72 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA29 | siRNA5 -mod9 |
|
| 73 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 74 | CGAGGAAGAACUAUGAACAdT*dT | Sense | siRNA30 | siRNA5 -mod10 |
|
| 75 | UGUUCAUAGUUCUUCCUCGdT*dT | Antisense | |||
| 76 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA31 | siRNA9 -mod1 |
|
| 77 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 78 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA32 | siRNA9 -mod2 |
|
| 79 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 80 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA33 | siRNA9 -mod3 |
|
| 81 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 82 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA34 | siRNA9 -mod4 |
|
| 83 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 84 | GCuGAuuuGuGAACCCAuudT*dT | Sense | siRNA35 | siRNA9 -mod5 |
|
| 85 | AAuGGGuuCACAAAuCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 86 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA36 | siRNA9 -mod6 |
|
| 87 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 88 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA37 | siRNA9 -mod7 |
|
| 89 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 90 | GcuGAuuuGUGAAcccAuudT*dT | Sense | siRNA38 | siRNA9 -mod8 |
|
| 91 | AAuGGGuucACAAAucAGcdT*dT | Antisense | |||
| 92 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA39 | siRNA9 -mod9 |
|
| 93 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 94 | GCUGAUUUGUGAACCCAUUdT*dT | Sense | siRNA40 | siRNA9 -mod10 |
|
| 95 | AAUGGGUUCACAAAUCAGCdT*dT | Antisense | |||
| 96 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA41 | siRNA 11 -mod1 |
|
| 97 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 98 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA42 | siRNA 11 -mod2 |
|
| 99 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 100 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA43 | siRNA 11 -mod3 |
|
| 101 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 102 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA44 | siRNA 11 -mod4 |
|
| 103 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 104 | GCAuuGuAuGuGuGAAuuAdT*dT | Sense | siRNA45 | siRNA 11 -mod5 |
|
| 105 | UAAuuCACACAuACAAuGCdT*dT | Antisense | |||
| 106 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA46 | siRNA 11 -mod6 |
|
| 107 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 108 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA47 | siRNA 11 -mod7 |
|
| 109 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 110 | GcAuuGuAuGuGuGAAuuAdT*dT | Sense | siRNA48 | siRNA 11 -mod8 |
|
| 111 | uAAuucAcACAuAcAAuGcdT*dT | Antisense | |||
| 112 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA49 | siRNA 11 -mod9 |
|
| 113 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense | |||
| 114 | GCAUUGUAUGUGUGAAUUAdT*dT | Sense | siRNA50 | siRNA 11 -mod10 |
|
| 115 | UAAUUCACACAUACAAUGCdT*dT | Antisense |
| 표기법 | 도입된 화학적 변형 |
| * | 포스포디에스테르 결합 → 포스포로티오에이트 결합 |
| 밑줄 | 2'-OH → 2'-O-Me |
| 소문자 | 2'-OH → 2'-F |
| 굵은 글씨 | ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged nucleotide) |
| 구조 이름 | siRNA 화학적 구조 변형 |
| mod1 | 안티센스 가닥의 1,2번 핵산의 리보스 환에 2'위치의 -OH기(이하, 2'-OH)를 2'-O-Me로 치환 |
| mod2 | Mod1의 구조변형과 함께 센스 가닥의 1,2번 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 2'-O-Me로 치환 |
| mod3 | Mod2의 구조변형과 함께 센스 가닥에서 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환에서 2‘-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod4 | Mod3의 구조변형과 함께 안티센스 가닥의 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod5 | Mod1의 구조변형과 함께 센스, 안티센스 가닥에서 염기 G를 가진 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 모두 2'-O-Me로, 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 모두 2'-F로 치환 |
| mod6 | Mod1의 구조변형과 함께 센스 가닥의 5’말단에 ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged nucleotide)로 치환 |
| mod7 | 안티센스 가닥의 5’말단의 2번 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me으로 치환 |
| mod8 | 센스 및 안티센스 가닥의 염기 U와 C의 2'-OH를 모두 2’-F로 치환 |
| mod9 | 센스 가닥의 염기 G 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me으로 치환하고, 안티센스 가닥의 염기서열 GU의 U와, UUU의 첫째 U, 그리고 UU의 첫째 U의 2'-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod10 | 센스 가닥의 짝수 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me로 치환하고, 안티센스 가닥의 홀수 핵산의 2'-OH를 2'-O-Me로 치환 |
단, mod1부터 mod7까지는 안티센스 가닥의 10번 및 11번 위치의 염기에는 변형을 가하지 않고, mod 1부터 mod 10까지의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 dTdT(포스포디에스테르 결합)을 포스포로티오에이트 결합(3'-dT*dT, *:Phosphorothioate bond)으로 치환한다.
실시예
5. 화학적 구조 변형
siRNA
의 종양 세포주에서의
mRNA
억제 효과
실시예 4의 화학적 구조 변형된 siRNA의 종양 세포주에서 mRNA 억제 효능이 유지되는지를 확인하고자 화학적 구조변형 하지 않은 siRNA (siRNA 5, 9, 및 11)와 구조변형을 한 siRNA 21 내지 50의 30개 siRNA를 실시예 3-2와 같이 리포좀 복합체를 제조하여 인간 폐암 세포주(A549, ATCC)를 형질전환 시키고 (10nM siRNA), 형질 전환된 종양 세포주에서 Hif1α의 발현양상을 실시예 3-4와 동일하게 정량분석하고, 그 결과를 아래의 표 13에 나타내었다.
| siRNA 5번 | siRNA 9번 | siRNA 11번 | |
| mod0 | 14.9 | 8.1 | 8.9 |
| mod1 | 46.3 | 8.6 | 17.6 |
| mod2 | 37.2 | 7.9 | 16.2 |
| mod3 | 23.0 | 61.3 | 10.9 |
| mod4 | 16.3 | 67.1 | 35.9 |
| mod5 | 6.2 | 20.2 | 8.0 |
| mod6 | 5.6 | 6.5 | 12.9 |
| mod7 | 4.1 | 7.0 | 11.1 |
| mod8 | 4.0 | 7.8 | 10.1 |
| mod9 | 6.0 | 6.7 | 8.9 |
| mod10 | 7.7 | 9.6 | 8.8 |
(화학적 구조 변형을 하지 않은 원래 siRNA는 mod0로 표시하였다.)
표 13에서 보듯이 siRNA 5, 9, 및 11를 화학적 구조 변형을 시켰을 때에도 종양 세포주에서 mRNA 억제 효능이 유지됨을 알 수 있었다. 특히, mod5, mod6, mod7, mod8, mod9, 및 mod10의 경우 화학적 구조 변형을 하지 않은 siRNA와 비교할 때 동등 이상의 효능을 보였다.
실시예
6.
siRNA
에 의한 면역 활성 사이토카인 유리 억제 효과
본 발명의 siRNA가 면역독성이 있는지를 평가하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.
실시예
6-1.
말초혈액단핵세포
준비
사람의 말초혈액단핵세포 (PBMC)는 시험 당일 건강한 지원자로부터 공급받은 혈액에서 Histopaque 1077 시약(Sigma, St Louis, MO, USA)을 사용하여 density gradient centrifugation법을 이용하여 분리하였다(Boyum A. Seperation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest 21(Suppl97):77, 1968). 혈액은 1:1 비율(중량기준)로 서로 섞이지 않도록 15ml 튜브에 분주된 Histopaque 1077 시약 위에 조심스럽게 넣었다. 400 x g, 상온에서 30분간 원심분리한 후, 멸균 파이펫으로 PBMC가 포함된 층만을 분리하였다. 분리된 PBMC가 담긴 튜브에 10ml의 인산염 완충액 (Phosphate buffered saline: PBS)를 넣은 다음 250 x g에서 10분간 원심분리하고, 5ml의 PBS로 두 번 더 PBMC를 씻어 주었다. 분리된 PBMC는 혈청이 포함되지 않은 배지인 x-vivo 15 배지(Lonza, Walkersville, MD, USA)로 4 x 106 세포/ml가 되도록 부유시킨 다음 96-웰 플레이트에 웰(well)당 100ul씩 분주하였다.
실시예
6-2.
siRNA
-
DOTAP
복합체 제조
상기 실시예 6-1에서 준비된 PBMC 세포에 분주하기 위한 siRNA-DOTAP 복합체를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. DOTAP 트랜스펙션(transfection) 시약(ROCHE, Germany) 5ul와 x-vivo 15 배지 45ul 및 siRNA 번호 5, 9, 11의 mod1 내지 mod10의 화학적 변형체 1ul(50uM)와 x-vivo 15배지 49ul를 각각 혼합하여 제조한 다음 10분간 실온에서 반응시켰다. 10분 후 DOTAP이 포함된 용액과 siRNA가 포함된 용액을 혼합한 후 20분간 20 내지 25℃ 온도에서 반응시켜 siRNA-DOTAP 복합체를 제조하였다.
실시예
6-3. 세포의 배양
실시예 6-1의 분주된 PBMC 배양액 100ul에 실시예 6-2의 방법에 따라 제조된 siRNA-DOTAP 복합체를 웰당 100ul씩 첨가한 후(siRNA 최종 농도 250nM), 37℃의 CO2 세포배양기에서 18시간 배양 후 배양하였다. 대조군으로 siRNA-DOTAP 복합체를 처리하지 않은 세포 배양군 및 siRNA를 포함하지 않은 채 DOTAP만이 처리된 세포 배양군을 사용하였으며, 양성대조군으로는 siRNA 대신 면역반응을 유발한다고 알려진 물질인 Poly I:C (Polyinosinic-polycytidylic acid postassium salt, Sigma, USA) 및 siApoB-1 siRNA (sense GUC AUC ACA CUG AAU ACC AAU (서열번호 116), antisense : *AUU GGU AUU CAG UGU GAU GAC AC, *: 5' phosphates (서열번호 117), 삼천리제약)을 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 DOTAP과 복합체를 만들어 처리한 세포 배양군을 사용하였다. 배양 후 세포 상층액만을 분리하였다.
실시예
6-4. 면역활성의 측정
면역독성 정도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6-3에서와 같이 siRNA-DOTAP 복합체를 말초혈액단핵세포(PBMC)에 처리하여 유리되는 사이토카인을 정량하였다. 상층액 내에 포함되어 있는 인터페론 알파(INF-α) 및 인터페론 감마(INF- γ), 종양괴사인자(TNF-α), 및 인터류킨-12(IL-12)의 함량을 Procarta Cytokine assay kit (Affimetrix, USA)를 사용하여 측정하였다. 즉, cytokine에 대한 항체가 부착된 bead (antibody bead) 50ul를 필터 플레이트 (filter plate)에 옮겨 세정 완충액 (wash buffer)으로 1회 세척한 후 50ul의 PBMC 배양액의 상층액 및 cytokine 표준액을 분주하여 상온에서 60분간 500rpm에서 흔들면서 배양하였다. 상기 사이토카인에 대한 항체가 부착된 비드, 세정 완충액, 사이토카인 표준액 등의 측정 기구 및 시료는 모두 상기 Procarta Cytokine assay kit에 포함된 것을 사용하였다.
이후, 세정 완충액으로 1회 세척하고, 키트내 포함된 검출용(detection) 항체 25ul를 분주하여 500rpm에서 흔들면서 30분간 상온에서 반응시켰다. 다시 감압 하에 반응액을 제거하고 세정한 후 키트내 포함된 streptavidin-PE(streptavidin phycoerythrin) 50ul를 분주하여 500rpm에서 흔들면서 상온에서 30분간 반응시킨 후 감압 하에 반응액을 제거하고 3회 세정을 하는 단계를 거쳤다. 120ul의 측정 완충액(reading buffer)을 분주하여 500rpm에서 5분간 흔들어 준 후에 Luminex 기기(Bioplex luminex system, Biorad, USA)를 사용하여 각 cytokine bead별 PE 형광 정도를 측정하였다. PBMC에 siRNA를 각각 250nM 처리했을 때 유리된 세포 배양액 중의 사이토카인 농도(pg/ml)를 아래의 표 14에 나타내었다. 시료중의 Cytokine 농도는 1.22~20,000 pg/ml 범위의 표준검량곡선으로부터 계산하였다.
| 시험군 | INF-alpha | INF-gamma | IL-12 | TNF-alpha | |
| MEDIUM | 2.56 | <2.44 | 4.82 | 10.9 | |
| DOTAP | 50.42 | <2.44 | 24.04 | 50.59 | |
| siApoB-1 | 713.03 | 3.06 | 51.36 | 77.4 | |
| Poly I:C | 255.95 | 38.86 | 2435.26 | 8629.78 | |
| siRNA 5 | mod 1 | 122.31 | <2.44 | 33.14 | 46.05 |
| mod 2 | 167.79 | <2.44 | 22.96 | 42.66 | |
| mod 3 | 45.29 | <2.44 | 42.18 | 30.33 | |
| mod 4 | 77.75 | <2.44 | 41.39 | 36.81 | |
| mod 5 | 54.52 | <2.44 | 39.8 | 38.17 | |
| mod 6 | 168.97 | <2.44 | 41.39 | 42.66 | |
| mod 7 | 121 | <2.44 | 46.04 | 46.49 | |
| mod 8 | 27.4 | <2.44 | 42.18 | 31.9 | |
| mod 9 | 47.65 | <2.44 | 40.6 | 31.43 | |
| mod 10 | 77.75 | <2.44 | 35.69 | 33.75 | |
| siRNA 9 | mod 1 | 119.69 | <2.44 | 31.39 | 37.87 |
| mod 2 | 56.75 | <2.44 | 33.14 | 46.05 | |
| mod 3 | 56.19 | <2.44 | 34.85 | 40.88 | |
| mod 4 | 64.34 | <2.44 | 37.36 | 39.83 | |
| mod 5 | 55.64 | <2.44 | 31.39 | 35.9 | |
| mod 6 | 87.59 | <2.44 | 61.75 | 63.18 | |
| mod 7 | 117.93 | <2.44 | 27.77 | 45.47 | |
| mod 8 | 65.4 | <2.44 | 40.6 | 48.97 | |
| mod 9 | 57.85 | <2.44 | 44.51 | 48.97 | |
| mod 10 | 48.82 | <2.44 | 27.77 | 47.81 | |
| siRNA 11 | mod 1 | 513.7 | <2.44 | 25.89 | 42.81 |
| mod 2 | 187.98 | <2.44 | 51.97 | 48.1 | |
| mod 3 | 107.21 | <2.44 | 47.55 | 35.59 | |
| mod 4 | 46.48 | <2.44 | 61.75 | 36.81 | |
| mod 5 | 52.26 | <2.44 | 83.96 | 44.59 | |
| mod 6 | 456.65 | <2.44 | 36.53 | 56.43 | |
| mod 7 | 454.57 | <2.44 | 21.95 | 48.68 | |
| mod 8 | 81.24 | <2.44 | 30.5 | 37.87 | |
| mod 9 | 79.75 | <2.44 | 50.51 | 47.08 | |
| mod 10 | 37.96 | <2.44 | 34.85 | 36.51 |
표 14에서 'Medium'은 아무 것도 처리하지 않은 대조군, 'DOTAP'은 DOTAP 단독처리군, 'POLY I:C' 또는 'siApoB-1'는 양성대조물질 처리군, 'siRNA 5'는 서열번호 27 및 28의 siRNA를 처리한 시험군, 'siRNA 9'는 서열번호 35 및 36의 siRNA 및 'siRNA 11'은 서열번호 39 및 40의 siRNA를 표시된 바와 같이 화학 변형시킨 시험군을 나타낸다.
상기에서, 화학적 구조변형 된 mod 1~10의 경우 인터페론 알파의 수치가 낮은 증가만을 보이며, 그 외 나머지 사이토카인들은 큰 변화가 없거나 매우 낮은 수준의 증가만을 나타내었다. 인터페론 알파의 수치가 mod1-> mod 2 -> mod 3, mod4, mod5, mod8, mod9, mod10의 순으로 현저히 감소하여 DOTAP 단독처리군의 수준으로 떨어지므로, 본 발명 siRNA 번호 5, 9 및 11의 화학적 구조변형체는 면역활성을 감소시킬 수 있다.
실시예
7. 화학적 구조 변형
siRNA
의
sense
가닥에 의한
off
-
target
effect
의 억제 효과
본 발명의 siRNA의 화학적 구조 변형을 통해 센스 가닥에 의한 off-target 효과를 제거할 수 있는지를 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.
센스 가닥에 의한 off-target 효과가 일어나는 정도는, 센스 가닥이 RISC 와 결합하여 센스 가닥과 상보적인 염기서열을 가진 서열에 작용할 경우에, 센스 가닥의 상보적인 서열을 가진 반딧불이 루시페라제 플라즈미드에 의해 발현되는 루시페라제 양이 siRNA를 처리하지 않은 세포에 비해서 감소함을 확인함으로써 알 수 있다. 또한 안티센스의 상보적인 서열을 가진 반딧불이 루시페라제 플라즈미드를 처리한 세포에 대해서는 siRNA에 의해서 나타나는 루시페라제의 감소 정도로 안티센스에 의한 siRNA의 효능이 화학적 구조변형을 한 후에 어느 정도 유지되는지를 확인할 수 있다.
실시예
7-1. 반딧불이
루시페라제
벡터(
firefly
luciferase
vector
) 준비
반딧불이 루시페라제를 발현하는 pMIR-REPORT(Ambion) 벡터에 각각의 siRNA에 대해, 안티센스 가닥에 상보적인 서열 및 센스 가닥에 상보적인 서열을 각각 클로닝해 넣어 두 개의 다른 plasmid를 각각 준비하였다. 상기 상보적인 서열은 코스모진텍에 의뢰하여 양쪽 끝에 SpeI과 HindIII의 enzyme site overhang을 가지도록 디자인하여 합성한 후에 pMIR-REPORT 벡터의 SpeI과 HindIII enzyme site를 이용하여 클로닝해 넣었다.
실시예
7-2.
siRNA
의 화학적 구조변형을 통한
off
-
target
효과의 억제 측정
상기 실시예 7-1에서 준비된, siRNA의 센스와 안티센스 각 가닥의 상보적인 서열이 포함된 플라즈미드를 이용하여 siRNA의 안티센스와 센스 가닥의 효능 정도를 측정하였다.
구체적으로, 실시예 7-1에서 준비된 반딧불이 루시페라제 벡터(firefly luciferase vector)를 siRNA와 함께 A549 세포(ATCC) 내에 트랜스팩션(transfection) 시킨 후에 발현되는 반딧불이 루시페라제의 양을 루시페라제 어세이(luciferase assay)로 측정하였다. 트랜스펙션(transfection) 하루 전에 A549 세포주를 24well plate에 6*10^4 cells/well로 준비하였다. 상보적인 염기서열이 클로닝된 루시페라제 벡터 (100ng)를 siRNA (10nM)와 보정 벡터인 레닐라 루시페라제(renilla luciferase)를 발현하는 pRL-SV40벡터(2ng, Promega)와 함께 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 이용하여 Opti-MEM 배지(Gibco)에서 트랜스펙션시켰다. 세포들은 트랜스펙션 24시간 후에 자연형 용해 버퍼(Passive lysis buffer, Promega)를 이용하여 용해(lysis)시킨 후 듀얼 루시페라제 어세이 키트(Dual luciferase assay kit, Promega)로 루시페라제 활성(luciferase activity)을 측정하였다.
반딧불이 루시페라제 측정치는 레닐라 루시페라제(renilla luciferase) 측정치로 트랜스펙션 효율을 보정한 후, siRNA 없이 각 가닥의 상보적인 서열을 클로닝해 넣은 반딧불이 루시페라제 벡터와 레닐라 루시페라제 벡터만 트랜스펙션시킨 대조군의 보정된 루시페라제 수치(100%)에 대한 백분율 값을 산출하여 하기 표 15에 나타냈다.
| siRNA 번호 |
화학적변형 구조명 |
%루시퍼라제활성 | |
| 센스가닥에상보적인 서열포함플라즈미드 |
안티센스가닥에상보적인 서열포함플라즈미드 |
||
| 5 | mod0 | 84.2 | 18.6 |
| mod1 | 15.6 | 85.7 | |
| mod2 | 67.1 | 42.9 | |
| mod3 | 80.0 | 18.4 | |
| mod4 | 81.7 | 142.7 | |
| mod5 | 29.0 | 40.2 | |
| mod6 | 68.7 | 32.0 | |
| mod7 | 37.3 | 21.1 | |
| mod8 | 73.7 | 40.9 | |
| mod9 | 102.0 | 20.0 | |
| mod10 | 120.1 | 45.1 | |
| 9 | mod0 | 51.2 | 4.4 |
| mod1 | 4.4 | 4.9 | |
| mod2 | 110.7 | 2.0 | |
| mod3 | 55.4 | 98.0 | |
| mod4 | 113.7 | 116.8 | |
| mod5 | 5.9 | 35.9 | |
| mod6 | 96.5 | 4.6 | |
| mod7 | 62.7 | 2.2 | |
| mod8 | 9.1 | 4.3 | |
| mod9 | 72.4 | 13.2 | |
| mod10 | 109.7 | 7.7 | |
| 11 | mod0 | 89.9 | 2.9 |
| mod1 | 85.9 | 12.8 | |
| mod2 | 106.5 | 13.7 | |
| mod3 | 93.7 | 12.7 | |
| mod4 | 74.3 | 26.5 | |
| mod5 | 81.5 | 5.8 | |
| mod6 | 57.4 | 15.5 | |
| mod7 | 55.5 | 6.0 | |
| mod8 | 95.0 | 8.8 | |
| mod9 | 76.2 | 4.8 | |
| mod10 | 79.4 | 5.0 | |
(화학적 구조 변형을 하지 않은 원래 siRNA는 mod0로 표시하였다.)
상기 표 15에서 보듯이 사람의 폐암 세포주에서는 siRNA 5, 11의 경우 화학적 구조 변형을 하지 않은 siRNA(mod0) 그 자체로도 센스 가닥에 의한 off-target 효과가 없었다. 그러나, siRNA 9번은 센스 가닥에 상보적인 서열을 가지는 반딧불이 루시퍼라제의 활성이 감소하는 것을 통해 약간의 센스 가닥에 의한 off-target 효과를 보였다. siRNA 9번의 화학적 구조 변형을 시켰을 때, mod2, 6, 7, 9, 10에서 off-target 효과가 감소하고, antisense target에 대한 효과는 유지되었다.
<110> SAMYANG BIOPHARMACEUTICALS CORPORATION
<120> siRNA for inhibition of Hif1alpha expression and anticancer
composition containing the same
<130> DPP20116450KR
<150> KR10-2010-0139391
<151> 2010-12-30
<160> 117
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 2481
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of ORF region(cDNA) of human Hif1alpha gene(NM_001530)
<400> 1
atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa 60
aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt 120
gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg 180
aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt 240
gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt 300
atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg 360
ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac 420
catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa 480
caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga 540
actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta 600
tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg 660
gtgctgattt gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag 720
actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc 780
gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat 840
gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc 900
accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa 960
gcaactgtca tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac 1020
gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc 1080
cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca 1140
gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg 1200
gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact 1260
gatgaccagc aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac 1320
gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag 1380
ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca 1440
aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt 1500
ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt 1560
ttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt 1620
gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag 1680
atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg 1740
tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca 1800
gtattccagc agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc 1860
actgatgaat taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca 1920
tctccatctc ctacccacat acataaagaa actactagtg ccacatcatc accatataga 1980
gatactcaaa gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca 2040
gaaaaatctc atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca 2100
gttcctgagg aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga 2160
aaaatggaac atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag 2220
ccagacgatc atgcagctac tacatcactt tcttggaaac gtgtaaaagg atgcaaatct 2280
agtgaacaga atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt 2340
agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt 2400
gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga 2460
gctttggatc aagttaactg a 2481
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 2
gtttgaacta actggacac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 3
tgattttact catccatgt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 4
catgaggaaa tgagagaaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 5
gagaaatgct tacacacag 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 6
cgaggaagaa ctatgaaca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 7
gaacataaag tctgcaaca 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 8
tgataccaac agtaaccaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 9
tcagtgtggg tataagaaa 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 10
gctgatttgt gaacccatt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 11
gccgctcaat ttatgaata 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 12
gcattgtatg tgtgaatta 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 13
tcaggatcag acacctagt 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 14
atttagactt ggagatgtt 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 15
agaggtggat atgtctggg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 16
caccaaagtg gaatcagaa 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 17
ttcaagttgg aattggtag 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA target region on Hif1alpha cDNA
<400> 18
aaagtcggac agcctcacca a 21
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 1, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 19
guuugaacua acuggacac 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 1, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 20
guguccaguu aguucaaac 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 2, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 21
ugauuuuacu cauccaugu 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 2, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 22
acauggauga guaaaauca 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 3, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 23
caugaggaaa ugagagaaa 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 3, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 24
uuucucucau uuccucaug 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 4, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 25
gagaaaugcu uacacacag 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 4, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 26
cuguguguaa gcauuucuc 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 5, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 27
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 5, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 28
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 6, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 29
gaacauaaag ucugcaaca 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 6, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 30
uguugcagac uuuauguuc 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 7, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 31
ugauaccaac aguaaccaa 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 7, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 32
uugguuacug uugguauca 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 8, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 33
ucaguguggg uauaagaaa 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 8, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 34
uuucuuauac ccacacuga 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 9, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 35
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 9, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 36
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 10, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 37
gccgcucaau uuaugaaua 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 10, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 38
uauucauaaa uugagcggc 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 11, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 39
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 11, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 40
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 12, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 41
ucaggaucag acaccuagu 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 12, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 42
acuagguguc ugauccuga 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 13, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 43
auuuagacuu ggagauguu 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 13, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 44
aacaucucca agucuaaau 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 14, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 45
agagguggau augucuggg 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 14, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 46
cccagacaua uccaccucu 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 15, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 47
caccaaagug gaaucagaa 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 15, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 48
uucugauucc acuuuggug 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 16, wherein 'dTdT' is attached to 3' end
<400> 49
uucaaguugg aauugguag 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 16, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end
<400> 50
cuaccaauuc caacuugaa 19
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 17
<400> 51
aaagucggac agccucacca a 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 17
<400> 52
uuggugaggc uguccgacuu u 21
<210> 53
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 18
<400> 53
ggaagaacua ugaaca 16
<210> 54
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 19
<400> 54
gauuugugaa cccauu 16
<210> 55
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 20
<400> 55
uuguaugugu gaauua 16
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 21, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond
<400> 56
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 21, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
group of ribose of 1st and 2nd nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 57
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 22, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of ribose of 1st and 2nd nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 58
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 22, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of ribose of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 59
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 23, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of ribose of 1st and 2nd nucleic acids and 2'-OH groups of
riboses of all U containing nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 60
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 23, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of ribose of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 61
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 24, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of ribose of 1st and 2nd nucleic acids and 2'-OH groups of
riboses of all U containing nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 62
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 63
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 24, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids and all U
containing nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 63
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 64
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 25, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, 2'-OH groups of
riboses of all G or U containing nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me(G case) or 2'-F(U case)
<400> 64
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 65
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 25, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, 2'-OH groups
of riboses of 1st & 2nd n/a and all G or U containing n/a are
substituted with 2'-O-Me(1st & 2nd and G case) or 2'-F(U case)
<400> 65
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 26, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 5' end of
sense strand is substituted with ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged
nucleotide)
<400> 66
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 26, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 67
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 27, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond
<400> 68
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 69
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 27, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
group of 2nd nucleic acid of 5' end is substituted with 2'-O-Me
<400> 69
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 28, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of all U or C containing nucleic acids are substituted with 2'-F
<400> 70
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 71
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 28, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of all U or C containing nucleic acids are substituted
with 2'-F
<400> 71
uguucauagu cuuccucg 18
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 29, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of all G containing nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 72
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 29, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and2'-OH
groups of all nucleic acids containing U of GU, or 1st U of UUU
or UU are substituted with 2'-O-Me
<400> 73
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 30, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of even-numbered nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 74
cgaggaagaa cuaugaaca 19
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 30, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of odd-numbered nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 75
uguucauagu ucuuccucg 19
<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 31, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond
<400> 76
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 31, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 77
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 32, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 78
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 79
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 32, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 79
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 33, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of riboses of 1st and 2nd nucleic acids and 2'-OH groups of
riboses of all U containing nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 80
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 33, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 81
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 34, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of ribose of 1st and 2nd nucleic acids and 2'-OH groups of
riboses of all U containing nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 82
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 34, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids and all U
containing nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 83
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 35, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of riboses of all G or U containing nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me(G case) or 2'-F(U case)
<400> 84
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 35, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st & 2nd n/a and all G or U containing n/a
are substituted with 2'-O-Me(1st & 2nd and G case) or 2'-F(U
case)
<400> 85
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 36, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 5' end of
sense strand is substituted with ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged
nucleotide)
<400> 86
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 21, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 87
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 37, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond
<400> 88
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 37, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
group of 2nd nucleic acid of 5' end is substituted with 2'-O-Me
<400> 89
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 21, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of all U or C containing nucleic acids are substituted with 2'-F
<400> 90
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 38, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of all U or C containing nucleic acids are substituted
with 2'-F
<400> 91
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 39, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of all G containing nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 92
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 21, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and2'-OH
groups of all nucleic acids containing U of GU, or 1st U of UUU
or UU are substituted with 2'-O-Me
<400> 93
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 40, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of even-numbered nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 94
gcugauuugu gaacccauu 19
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 40, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of odd-numbered nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 95
aauggguuca caaaucagc 19
<210> 96
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 41, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond
<400> 96
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 21, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 97
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 42, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 98
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 42, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 99
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 100
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 43, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of riboses of 1st and 2nd nucleic acids and 2'-OH groups of
riboses of all U containing nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 100
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 43, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 101
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 102
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 44, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of ribose of 1st and 2nd nucleic acids and 2'-OH groups of
riboses of all U containing nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 102
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 103
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 44, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids and all U
containing nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 103
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 104
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 45, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of riboses of all G or U containing nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me(G case) or 2'-F(U case)
<400> 104
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 45, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st & 2nd n/a and all G or U containing n/a
are substituted with 2'-O-Me(1st & 2nd and G case) or 2'-F(U
case)
<400> 105
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 46, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 5' end of
sense strand is substituted with ENA(2'-O, 4'-C ethylene bridged
nucleotide)
<400> 106
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 46, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of riboses of 1st and 2nd nucleic acids are substituted
with 2'-O-Me
<400> 107
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 47, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond
<400> 108
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 47, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
group of 2nd nucleic acid of 5' end is substituted with 2'-O-Me
<400> 109
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 48, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of all U or C containing nucleic acids are substituted with 2'-F
<400> 110
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 48, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of all U or C containing nucleic acids are substituted
with 2'-F
<400> 111
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 49, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH groups
of all G containing nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 112
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 49, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and2'-OH
groups of all nucleic acids containing U of GU, or 1st U of UUU
or UU are substituted with 2'-O-Me
<400> 113
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 114
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siRNA 50, wherein 'dTdT' is attached to 3' end,
and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of even-numbered nucleic acids are substituted with
2'-O-Me
<400> 114
gcauuguaug ugugaauua 19
<210> 115
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siRNA 50, wherein 'dTdT' is attached to 3'
end, and the 'dTs' are linked by phosphorothioate bond, and 2'-OH
groups of odd-numbered nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 115
uaauucacac auacaaugc 19
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense strand of siApoB-1 siRNA
<400> 116
gucaucacac ugaauaccaa u 21
<210> 117
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense strand of siApoB-1 siRNA
<400> 117
auugguauuc agugugauga cac 23
Claims (17)
- 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 이루어지며, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6의 Hif1α cDNA 단편의 19개 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 이중가닥 siRNA (small interfering RNA).
- 삭제
- 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 이루어지며, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 6의 Hif1α cDNA 단편의 19개 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지며,
3' 말단, 또는 5' 말단, 또는 양 말단에 1 내지 5 뉴클레오타이드(nt)로 이루어진 돌출부를 추가로 포함하는, 이중가닥 siRNA (small interfering RNA). - 삭제
- 제3항에 있어서,
서열번호 27의 센스 서열 및 서열번호 28의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 5, 및 서열번호 53의 센스 서열 및 서열번호 28의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 18로 이루어진 군에서 선택된 것인, siRNA. - 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것인, siRNA.
- 제6항에 있어서, 상기 화학적 변형은
백본의 포스포디에스테르 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하는 것, 및
리보스 환(ribose ring)의 2'-OH 위치에 메틸기 (2'-O-methyl) 또는 플루오르기 (2'-fluoro)를 도입하는 것
으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, siRNA. - 제7항에 있어서, 상기 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)는 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양 말단에 도입되는 것인, siRNA.
- 제6항에 있어서, 상기 siRNA는 다음의 표 10에 기재된 siRNA 21 내지 30으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, siRNA:
[표 10]
상기 표 10에서,
화학적 변형(modification)의 표기법은 다음과 같으며:
변형(modification)의 내용은 다음과 같으며, 단, mod1부터 mod7까지는 안티센스 가닥의 10번 및 11번 위치의 염기에는 변형을 가하지 않고, mod 1부터 mod 10까지의 모든 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 dTdT(포스포디에스테르 결합)이 포스포로티오에이트 결합(3'-dT*dT, *:Phosphorothioate bond)으로 치환됨:
- 제1항, 제3항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 포함하는 발현 벡터.
- 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 및 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것인, 발현 벡터.
- 제1항, 제3항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 siRNA를 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 포함하는, 항암 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 핵산 전달체는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 마이셀(micelle), 에멀젼, 및 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 항암 조성물.
- 제12항에 있어서,
항암 화학요법제, 또는
성장인자, 성장 인자 수용체, 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 및 항암제 내성 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것의 발현을 저해하는 siRNA
를 추가로 포함하는, 항암 조성물. - 동물의 생체로부터 분리된, Hif1α를 발현하는 세포를 준비하는 단계; 및
제1항, 제3항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 상기 생체에서 분리된 Hif1α를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계
를 포함하는, Hif1α의 합성 또는 발현을 억제하는 방법. - 동물의 생체로부터 분리된, Hif1α를 발현하는 암세포를 준비하는 단계; 및
제1항, 제3항, 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 상기 생체에서 분리된 Hif1α를 발현하는 암세포와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 암세포의 성장을 억제하는 방법.
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