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KR101507402B1 - 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 증가시키는 방법 - Google Patents

폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 증가시키는 방법

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KR101507402B1
KR101507402B1 KR1020097026743A KR20097026743A KR101507402B1 KR 101507402 B1 KR101507402 B1 KR 101507402B1 KR 1020097026743 A KR1020097026743 A KR 1020097026743A KR 20097026743 A KR20097026743 A KR 20097026743A KR 101507402 B1 KR101507402 B1 KR 101507402B1
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KR
South Korea
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polypeptide
seq
cellulose
amino acid
soluble
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키이스 맥파랜드
폴 해리스
Original Assignee
노보자임스 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 첨가하는 것을 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스-함유 물질을 분해 또는 전환하는 조성물, 방법, 및 발효 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
셀룰로오스, 가수분해, 2가 금속 양이온

Description

폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 증가시키는 방법{METHODS OF INCREASING THE CELLULOLYTIC ENHANCING ACTIVITY OF A POLYPEPTIDE}
서열목록에 관한 언급
본 출원은 컴퓨터 판독가능한 형태로 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독가능한 형태는 본원에 참고자료로서 포함된다.
생물학적 물질의 기탁에 관한 언급
본 출원은 생물학적 물질의 기탁에 관한 언급을 담고 있으며, 기탁사항은 본원에 참고자료로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
셀룰로오스는 베타-1,4-결합에 의하여 공유-결합된 단당 글루코오스의 고분자이다. 다수의 미생물이 베타-결합된 글루칸을 가수분해하는 효소를 생산한다. 이러한 효소는 엔도글루카나아제, 셀로비오히드롤라아제, 및 베타-글루코시다아제를 포함한다. 엔도글루카나아제는 셀룰로오스 고분자를 임의의 위치에서 절단하여 셀로비오히드롤라아제가 공격할 수 있는 틈을 만든다. 셀로비오히드롤라아제는 이어 서 셀룰로오스 고분자의 말단으로부터 셀로비오스 분자를 순차적으로 방출한다. 셀로비오스는 수용성 베타-1,4-결합된 글루코오스 이량체이다. 베타-글루코시다아제는 셀로비오스를 글루코오스로 가수분해한다.
셀룰로오스성 공급 원료의 에탄올로의 전환은 대량 공급 원료의 편리한 활용성, 물질의 소각이나 매립을 피하려는 소망, 및 에탄올 연료의 청정성에 관해 이점을 가진다. 목재, 농업 부산물, 초본 작물, 및 도시 고형 폐기물이 에탄올 생산의 공급 원료로서 고려되어 왔다. 이러한 재료들은 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및 리그닌으로 구성된다. 셀룰로오스가 글루코오스로 전환되면, 글루코오스는 효모에 의하여 쉽게 발효되어 에탄올이 된다.
WO 2005/074647은 Thielavia terrestris로부터의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 및 그것의 폴리뉴클레오티드를 개시한다. WO 2005/ 074656은 Thermoascus aurantiacus로부터의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 및 그것의 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 미국 공개 출원 번호 제2007/0077630호는 Trichoderma reesei로부터의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 및 그것의 폴리뉴클레오티드를 개시한다.
본 분야에서는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 개선하는 것이 유리할 것이다.
본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 첨가하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물의 유효량으로 셀룰로오스-함유 물질을 처리하는 단계를 포함하는 셀룰로오스-함유 물질을 분해 또는 전환하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재한다.
게다가, 본 발명은 (a) 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물의 유효량으로 셀룰로오스-함유 물질을 당화하는 단계로, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하는 단계; (b) 단계 (a)의 당화된 셀룰로오스-함유 물질을 하나 이상의 발효 미생물과 함께 발효시켜 발효 산물을 생산하는 단계; 및 (c) 발효에 의한 발효 산물을 회수하는 단계 를 포함하는 발효 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
게다가, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
도 1은 pMJ04의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 2는 pCaHj527의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 3은 pMT2188의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 4는 pCaHj568의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 5는 pMJO5의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 6은 pSMai130의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 7은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 천연 신호 서열의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:57 및 58).
도 8은 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:61 및 62)
도 9는 pSMai135의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 10은 pSMai140의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 11은 pSaMe-F1의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 12A, 12B, 12C, 및 12D는 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG 융합 단백질의 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:25 및 26).
도 13은 pSaMe-FX의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 14A, 14B, 14C, 및 14D는 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질의 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:27 및 28).
도 15는 pAlLo47의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 16은 Trichoderma reesei 셀룰로오스 가수분해 효소, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질, 및 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 The -rmoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드를 포함하는 발효 육즙을 포함하는 혼합물 에 10mM의 최종 농도로 다양한 가용성 2가 금속 이온을 첨가한 경우에 전처리된 옥수수 대 중의 셀룰로오스의 글루코오스와 셀로비오스로의 전환을 나타낸다.
도 17은 Trichoderma reesei 셀룰로오스 가수분해 효소, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제를 포함하고, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Thermoa -scus aurantiacus GH61A 폴리펩티드를 첨가한 발효 육즙과 첨가하지 않은 발효 육즙을 포함하는 혼합물에 10mM의 최종 농도로 다양한 가용성 2가 금속 이온을 첨가한 경우에 전처리된 옥수수 대 중의 셀룰로오스의 글루코오스와 셀로비오스로의 전환을 나타낸다.
도 18은 Trichoderma reesei 셀룰로오스 가수분해 효소, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질, 및 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 The -rmoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드를 포함하는 탈염된 발효 육즙 또는 탈염되지 않은 발효 육즙을 포함하는 혼합물에 0.0001 내지 10mM의 최종 농도로 MgCl2 및 MnSO4를 첨가한 경우에 전처리된 옥수수 대 중의 셀룰로오스의 글루코오스와 셀로비오스로의 전환을 나타낸다.
정의
셀룰로오스 가수분해 증진 활성:
용어 "셀룰로오스 가수분해 증진 활성"은 셀룰로오스 가수분해 활성을 갖는 단백질에 의하여 셀룰로오스-함유 물질의 가수분해를 증진시키는 생물학적 활성으로서 본원에서 정의된다. 본 발명의 목적을 위해, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성은 하기 조건에서 셀룰로오스 가수분해 단백질에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 가수분해로 인한 환원당의 증가 또는 셀로비오스와 글루코오스의 총량의 증가를 측정함으로써 결정된다: PCS 중에 셀룰로오스 1g 당 80-99.5% w/w 셀룰로오스 가수분해 단백질 및 0.5-20% w/w 단백질의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 함유하는 총 단백질 1-50mg, 50℃에서 1-7일간, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성은 없이 동일한 총 단백질 로딩량을 갖는 대조군(PCS 중에 셀룰로오스 1g 당 셀룰로오스 가수분해 단백질 1-50mg)와 비교. 바람직한 양태에서, 셀룰라아제 단백질 로딩량의 3% Asperg -illus oryzae 베타-글루코시다아제(WO 02/095014에 따라서 Aspergillus oryzae에서 재조합 생성) 또는 3% Aspergillus fumigatus 베타-글루코시다아제(WO 02/095014의 실시예 22에 따라서 Aspergillus oryzae에서 재조합 생성)의 존재하에 CELLUCLAST? 1.5L(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)의 혼합물이 셀룰로오스 가수분해 활성의 기준물질로서 사용된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14의 성숙한 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 더 가장 바람직하게는 적어도 100%를 가진다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 동일한 정도의 가수분해에 도달하는데 필요한 셀룰로오스 가수분해 효소의 양을 바람직하게 적어도 0.1-배, 더 바람직하게는 적어도 0.2-배, 더 바람직하게는 적어도 0.3-배, 더 바람직하게는 적어도 0.4-배, 더 바람직하게는 적어도 0.5-배, 더 바람직하게는 적어도 1-배, 더 바람직하게는 적어도 3-배, 더 바람직하게는 적어도 4-배, 더 바람직하게는 적어도 5-배, 더 바람직하게는 적어도 10-배, 더 바람직하게는 적어도 20-배, 더욱 바람직하게는 적어도 30-배, 가장 바람직하게는 적어도 50-배, 더 가장 바람직하게는 적어도 100-배 감소시킴으로써 셀룰로오스 가수분해 활성을 갖는 단백질에 의해 촉매되는 셀룰로오스-함유 물질의 가수분해를 증진시킨다.
셀룰로오스 가수분해 활성: 용어 "셀룰로오스 가수분해 활성"은 셀룰로오스-함유 물질을 가수분해하는 셀룰라아제 활성(예컨대, 엔도글루카나아제(들), 셀로비오히드롤라아제(들), 베타-글루코시다아제(들) 또는 이들의 조합)으로서 본원에서 정의된다. 셀룰로오스 가수분해 단백질은 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 가수분해하여 인큐베이션 혼합물의 점도를 감소시킬 수 있다. 결과의 점도 감소는 진동 점도계(예컨대, Sofraser(프랑스)의 MIVI 3000)로 측정될 수 있다. 셀룰라아제 활성의 측정은 셀룰라아제 점도 단위(CEVU)로 측정되며, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 용액의 점도를 감소시키는 샘플의 능력을 측정함으로써 샘플에 존재하는 촉매 활성의 양을 정량한다. 이 분석은 셀룰로오스 가수분해 단백질 및 기질에 적합한 온도 및 pH에서 수행한다.
본 발명의 목적을 위해, 셀룰로오스 가수분해 활성은 하기 조건에서 셀룰로오스 가수분해 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 가수분해의 증가를 측정함으로써 결정된다: PCS 중에서 셀룰로오스 1g 당 셀룰로오스 가수분해 단백질 1-50mg, 50℃에서 1-7일간, 셀룰로오스 가수분해 단백질을 첨가하지 않은 대조군의 가수분해와 비교.
엔도글루카나아제: 용어 "엔도글루카나아제"는 엔도-1,4-(1,3;1,4)-베타-D-글루칸 4-글루카노히드롤라아제(E.C. No. 3.2.1.4)로서 본원에서 정의되며, 이것은 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체(카르복시메틸 셀룰로오스 및 히드록시에틸 셀룰로오스 등), 리케닌, 시리얼 베타-D-글루칸 또는 자일로글루칸과 같은 혼성 베타-1,3 글루칸 중의 베타-1,4-결합, 및 셀룰로오스 성분을 함유하는 다른 식물 물질들에서 1,4-베타-D-글리코시드 결합의 엔도가수분해를 촉매한다. 본 발명의 목적을 위해, 엔도글루카나아제 활성은 Ghose, 1987, Pure and Appl . Chem . 59:257-268의 과정에 따라서 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 가수분해를 사용하여 측정된다.
셀로비오히드롤라아제: 용어 "셀로비오히드롤라아제"는 1,4-베타-D-글루칸셀로비오히드롤라아제(E.C.3.2.1.91)로서 본원에서 정의되며, 이것은 셀룰로오스, 셀로올리고당, 또는 어떤 베타-1,4-결합된 글루코오스 함유 고분자 중의 1,4-베타-D-글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하여 쇄의 환원 또는 비-환원 말단으로부터 셀로비오스를 방출한다. 본 발명의 목적을 위해, 셀로비오히드롤라아제 활성은 Lever et al ., 1972, Anal . Biochem. 47:273-279, 및 van Tilbeurgh et al, 1982, FEBS Letters 149:152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187:283 -288에 설명된 과정에 따라서 측정된다. 본 발명에서는 Lever et al .의 방법을 사용하여 옥수수 대 중의 셀룰로오스의 가수분해를 평가하는 한편, van Tilbeurgh et al.의 방법을 사용하여 형광 이당류 유도체에 대한 셀로비오히드롤라아제의 활성을 측정하였다.
베타-글루코시다아제: 용어 "베타-글루코시다아제"는 베타-D-글루코시드 글루코히드롤라아제(E.C.3.2.1.21)로서 본원에서 정의되며, 이것은 말단 비환원 베타-D-글루코오스 잔기의 가수분해를 촉매하여 베타-D-글루코오스를 방출한다. 본 발명의 목적을 위해, 베타-글루코시다아제 활성은 본원에 설명된 상이한 조건을 사용하여 Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42:55-66에 설명된 기본 과정에 따라서 측정된다. 베타-글루코시다아제 활성 1 유닛은 100mM 소듐 시트레이트, 0.01% TWEEN? 20 중에서 기질인 4mM p-니트로페닐-베타-D-글루코피라노시드로부터 50℃, pH 5에서 1분 당 생성되는 p-니트로페놀 1.0μmol로서 정의된다.
패밀리 7, 12, 45, 또는 61 글리코시드 히드롤라아제:
용어 "패밀리 7 글리코시드 히드롤라제" 또는 "패밀리 GH7", "패밀리 12 글리코시드 히드롤라아제" 또는 "패밀리 GH12", "패밀리 45 글리코시드 히드롤라제" 또는 "패밀리 GH45", 및 "패밀리 61 글리코시드 히드롤라제" 또는 "패밀리 GH61"은 Henrissat(1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem . J. 280:309-316) 및 Henrissat B., and Bairoch A.(1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316:695-696 )에 따라서 글리코시드 히드롤라제 패밀리 7, 패밀리 12, 패밀리 45, 및 패밀리 61에 각각 속하는 폴리펩티드로서 본원에서 정의된다. 현재 Henrissat 리스트에서 GH61 패밀리는 미분류된 상태이며, 이것은 이 패밀리에 속하는 폴리펩티드에 대한 메커니즘, 촉매 친핵체/염기, 촉매 양성자 도너, 및 3-D 구조 등의 특성이 아직 밝혀지지 않았음을 나타낸다. 또한, GH7, GH12, 또는 GH45 단백질은 각각 CEL7, CEL12, 또는 CEL45 단백질이라고도 한다.
셀룰로오스-함유 물질: 바이오매스의 1차 세포벽 중의 주된 다당류는 셀룰로오스이고, 두 번째로 가장 풍부한 것은 헤미-셀룰로오스이고, 세 번째는 펙틴이다. 세포가 성장을 멈춘 후 생성되는 2차 세포벽 또한 다당류를 함유하며, 이것은 헤미-셀룰로오스에 공유 가교-결합된 고분자 리그닌에 의해 강화된다. 셀룰로오스는 안히드로셀로비오스의 동종고분자이며, 따라서 선형 베타-(1-4)-D-글루칸이지만, 헤미-셀룰로오스는 광범한 치환체를 가진 복잡한 분기 구조의 자일란, 자일로글루칸, 아라비노자일란, 및 만난과 같은 다양한 화합물을 포함한다. 일반적으로는 다형성이지만, 셀룰로오스는 평행 글루칸 쇄의 불용성 결정 매트릭스로서 주로 식물 조직에서 발견된다. 헤미-셀룰로오스는 일반적으로 셀룰로오스 및 다른 헤미-셀룰로오스와 수소 결합하며, 이것은 세포벽 매트릭스 안정화에 기여한다.
셀룰로오스-함유 물질은 셀룰로오스를 함유하는 어떤 물질일 수 있다. 셀룰로오스는, 예를 들면 줄기, 잎, 외피, 껍질, 및 식물 또는 잎의 속, 가지, 및 나무의 목질에서 일반적으로 발견된다. 셀룰로오스-함유 물질은 초본 물질, 농업 부산물, 임업 부산물, 도시 고형 폐기물, 폐지, 및 펄프 및 제지 부산물이 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 셀룰로오스-함유 물질은 목재 공급원, 도시 고형 폐기물, 폐지, 농작물 및 농작물 부산물을 포함하는 않는 어떤 종류의 바이오매스일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다(예컨대, Wiselogel et al., 1995, in Handbook on Bioethanol(Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Taylor & Francis, Wash-ington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50:3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25:695-719; Mosier et al ., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, New York 참조). 본원에서 셀룰로오스-함유 물질은 바람직하게는 리그노셀룰로오스, 예를 들어 혼성 매트릭스 안에 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 함유하는 식물 세포벽 물질의 형태라는 것이 이해된다.
바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 옥수수 대이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 옥수수 섬유이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 옥수수 속이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 스위치그래스이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 볏짚이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 종이 및 펄프 가공 폐기물이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 목재 또는 초본 식물이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 버개스(bagasse)이다.
셀룰로오스-함유 물질은 그대로 사용되거나, 또는 본 분야에 알려진 종래 방법을 사용하여 전처리할 수 있다. 예를 들면, 물리적 전처리 기술은 다양한 형태의 제분, 조사(irradiation), 증기처리/증기폭발 및 열가수분해를 포함할 수 있고; 화학적 전처리 기술은 희석 산, 알칼리성, 유기 용매, 암모니아, 이산화황, 이산화탄소, 및 pH-조절 열가수분해를 포함할 수 있고; 생물학적 전처리 기술은 리그닌-가용화 미생물의 적용을 포함할 수 있다(예컨대, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and Biological treatments for enzymatic/microbial con-version of lignocellulosic biomass, Adv . Appl . Microbiol. 39:295-333; McMill-an, J. D., 1994, Pretreating Lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic conversion of Biomass for Fules Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol Production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelbe-rg, Germany, 65:207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentati-on of Lignocellulosic hydrolysates for Ethanol Production, Enz . Microb. Tech. 18:312-331; and Vallander, L., and Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of Ethanol from Lignocellulosic materials: State of the art, Adv . Biochem . Eng ./ Biotechnol. 42:63-95 참조).
전처리된 옥수수 대:
용어 "PCS" 또는 "전처리된 옥수수 대"는 열 및 희석 산 처리에 의해서 옥수수 대로부터 유래된 셀룰로오스-함유 물질로서 본원에서 정의된다. 본 발명의 목적을 위해, PCS는 실시예 20에 설명된 방법에 의해, 또는 이 방법에서 시간, 온도 및 산의 양을 변형하여 제조된다.
분리된 폴리펩티드: 본원에서 사용된 용어 "분리된 폴리펩티드"는 공급원으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SDS-PAGE에 의하여 측정하는 경우, 적어도 1% 순수, 바람직하게는 적어도 5% 순수, 더 바람직하게는 적어도 10% 순수, 더 바람직하게는 적어도 20% 순수, 더 바람직하게는 적어도 40% 순수, 더 바람직하게는 적어도 60% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수하다.
실질적으로 순수한 폴리펩티드: 본원에서 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 본래 또는 재조합적으로 회합된 다른 폴리펩티드 물질을 10중량% 이하, 바람직하게는 8중량% 이하, 더 바람직하게는 6중량% 이하, 더 바람직하게는 5중량% 이하, 더 바람직하게는 4중량% 이하, 더 바람직하게는 3중량% 이하, 더욱 바람직하게는 2중량% 이하, 가장 바람직하게는 1중량% 이하, 더 가장 바람직하게는 0.5중량% 이하로 함유하는 폴리펩티드 제조물을 말한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 제조물에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 적어도 92중량%, 바람직하게는 적어도 94중량%, 더 바람직하게는 적어도 95중량%, 더 바람직하게는 적어도 96중량%, 더 바람직하게는 적어도 96중량%, 더 바람직하게는 적어도 97중량%, 더 바람직하게는 적어도 98중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 99중량%, 가장 바람직하게는 적어도 99.5중량%, 더 가장 바람직하게는 100중량%가 순수한 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태인 것, 즉 폴리펩티드 제조물이 본래 또는 재조합적으로 회합된 다른 폴리펩티드 물질을 본질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다.
성숙한 폴리펩티드: 용어 "성숙한 폴리펩티드"는 생물학적 활성, 예컨대 효소 활성을 갖는 폴리펩티드로서 본원에서 정의되며, 이것은 번역, 및 어떤 번역 후 변형, 예컨대 N-말단 가공, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등에 따른 최종 형태로 존재한다.
성숙 폴리펩티드 암호화 서열: 용어 "성숙 폴리펩티드 암호화 서열"은 생물학적 활성을 갖는 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서 본원에서 정의된다.
동일성: 두 아미노산 서열 간의 또는 두 뉴클레오티드 서열 간의 관련성은 "동일성"이라는 파라미터로 설명된다.
본 발명의 목적을 위해, 두 아미노산 서열 간의 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277), 바람직하게 3.0.0 이상 버전의 Needle 프로그램에서 이행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 파라미터는 갭 개방 패널티 10, 갭 확장 패널티 0.5 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)이 동일성 퍼센트로서 사용되며, 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 10O)/(정렬 길이 - 정렬 내 갭의 총 수)
본 발명의 목적을 위해, 두 데옥시리보뉴클레오티드 서열 간의 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상기 참조), 바람직하게 3.0.0 이상 버전의 Needle 프로그램에서 이행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, 상기 참조)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 파라미터는 갭 개방 패널티 10, 갭 확장 패널티 0.5 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)이 동일성 퍼센트로서 사용되며, 하기와 같이 계산된다:
(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 x 10O)/(정렬 길이 - 정렬 내 갭의 총 수)
상동 서열: 용어 "상동 서열"은 BLOSUM62 매트릭스, 글자크기 3, 갭 존재 코스트 11 , 갭 확장 코스트 1, 낮은 복잡성 여과 없음, 및 쿼리로서 성숙 단백질 서열을 사용하여 blastp(단백질 데이터베이스) 또는 tblastn(핵산 데이터베이스) 알고리즘을 사용했을 때, 0.001 미만의 E 값(또는 기대값)을 갖는 서열로서 본원에서 정의된다. Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 참조.
폴리펩티드 단편: 용어 "폴리펩티드 단편"은 성숙한 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단으로부터 결실된 하나 이상(다수)의 아미노산을 갖는 폴리펩티드, 또는 그것의 상동 서열로서 본원에서 정의되며, 이때 단편은 그것의 성숙한 폴리펩티드와 같은 활성을 가진다.
하위서열: 용어 "하위서열"은 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 5' 및/또는 3' 말단으로부터 결실된 하나 이상(다수)의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상동 서열로서 본원에서 정의되며, 이때 하위서열은 그것의 성숙한 폴리펩티드와 같은 활성을 갖는 폴리펩티드 단편을 암호화한다.
대립 변이체: 본원에서 용어 "대립 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 점유하는 유전자의 둘 이상의 대안적 형태를 말한다. 대립 변이체는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하며, 집단 내에 다형성(polymorphism)을 야기할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵성(암호화된 폴리펩티드에 변화 없음)이거나, 또는 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립 변이체는 유전자의 대립 변이체에 의하여 암호화된 폴리펩티드이다.
분리된 폴리뉴클레오티드:
본원에서 사용된 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 공급원으로부터 분리된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아가로스 전기영동에 의해서 측정했을 때, 적어도 1% 순수, 바람직하게 는 적어도 5% 순수, 더 바람직하게는 적어도 10% 순수, 더 바람직하게는 적어도 20% 순수, 더 바람직하게는 적어도 40% 순수, 더 바람직하게는 적어도 60% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수하다.
실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드: 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"는 다른 외인성 또는 원치않는 뉴클레오티드가 없는 유전자 조작된 단백질 생산 시스템에서 사용하기에 적합한 형태의 폴리뉴클레오티드 제조물을 말한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 본래 또는 재조합적으로 회합된 다른 폴리뉴클레오티드 물질을 10중량% 이하, 바람직하게는 8중량% 이하, 더 바람직하게는 6중량% 이하, 더 바람직하게는 5중량% 이하, 더 바람직하게는 4중량% 이하, 더 바람직하게는 3중량% 이하, 더욱 바람직하게는 2중량% 이하, 가장 바람직하게는 1중량% 이하, 더 가장 바람직하게는 0.5중량% 이하로 함유한다. 그러나, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연발생 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 적어도 90중량% 순수, 바람직하게는 적어도 92중량% 순수, 더 바람직하게는 적어도 94중량% 순수, 더 바람직하게는 적어도 95중량% 순수, 더 바람직하게는 적어도 96중량% 순수, 더 바람직하게는 적어도 97중량% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 98중량% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 99중량%, 더 가장 바람직하게는 적어도 99.5중량% 순수한 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 형태인 것, 즉 폴리뉴클레오티드 제조물이 본래 또는 재조합적으로 회합된 다른 폴리뉴클레오티드 물질을 본질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원(origin) 또는 이들의 어떤 조합일 수 있다.
cDNA: 용어 "cDNA"는 진핵 세포로부터 얻어진 성숙한 스플라이스된 mRNA 분자로부터의 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자로서 본원에서 정의된다. cDNA는 상응하는 게놈 DNA에 일반적으로 존재하는 인트론 서열을 결여하고 있다. 초기 1차 RNA 전사체는 성숙한 스플라이스된 mRNA로서 출현하기 전에 일련의 단계를 거쳐 가공되는 mRNA의 전구체이다. 이들 단계는 스플라이싱이라고 불리는 과정에 의한 인트론 서열의 제거를 포함한다. 따라서 mRNA로부터 유래된 cDNA는 어떤 인트론 서열을 결여한다.
핵산 구조체: 본원에서 사용된 용어 "핵산 구조체"는 자연발생 유전자로부터 분리되거나, 또는 자연에는 존재하지 않는 방식으로 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형되거나 합성된 단일- 또는 이중-가닥 핵산 분자를 말한다. 용어 핵산 구조체는 핵산 구조체가 본 발명의 암호화 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유하는 경우에는 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.
제어 서열:
용어 "제어 서열"은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 성분을 포함한다고 본원에서 정의된다. 각 제어 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 자생적이거나 외인성일 수 있고, 또는 서로 자생적이거나 외인성일 수 있다. 이러한 제어 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 최소한 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 제어 서열에는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입하기 위한 링커가 제공될 수 있다.
작동가능하게 연결된: 본원에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 폴리펩티드 서열의 암호화 서열에 대하여 적합한 위치에 배치됨으로써 제어 서열이 폴리펩티드의 암호화 서열의 발현을 지시할 수 있게 된 형태를 말한다.
암호화 서열: 본원에서 사용된 용어 "암호화 서열"은 그것의 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 특정하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임에 의해 결정되는데, 이것은 일반적으로 ATG 개시 코돈 또는 GTG 및 TTG와 같은 대안적 개시 코돈에서 시작하여, TAA, TAG 및 TGA와 같은 종결 코돈에서 종결된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA, 합성 또는 재조합 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
발현: 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하는 폴리펩티드의 생산에 수반되는 어떤 단계를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 그것의 발현을 위해 제공되는 추가의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 선형 또는 원형 DNA 분자로서 본원에서 정의된다.
숙주 세포: 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체 또는 발현 벡터에 의한 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등을 받아들일 수 있는 어떤 세포 타입을 포함한다.
변형: 본원에서 용어 "변형"은 성숙한 폴리펩티드 또는 그것의 상동 서열의 어떤 화학적 변형뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 유전자 조작을 의미한다. 변형은 하나 이상(다수)의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입뿐만 아니라 하나 이상(다수)의 아미노산 측쇄의 교체일 수 있다.
인공 변이체: 본원에서 사용된 용어 "인공 변이체"는 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 변형된 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 상동 서열을 발현하는 유기체에 의해서 생산된 폴리펩티드를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드 서열은 인간의 개입을 통하여 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그것의 상동 서열을 변형함으로써 얻어진다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 첨가하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물의 유효량으로 셀룰로오스-함유 물질을 처리하는 단계를 포함하는 셀룰로오스-함유 물질을 분해 또는 전환하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재한다.
게다가, 본 발명은 (a) 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물의 유효량으로 셀룰로오스-함유 물질을 당화하는 단계로, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하는 단계; (b) 단계 (a)의 당화된 셀룰로오스-함유 물질을 하나 이상의 발효 미생물과 함께 발효시켜 발효 산물을 생산하는 단계; 및 (c) 발효에 의한 발효 산물을 회수하는 단계를 포함하는 발효 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
2가 금속 양이온
모든 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++, Co++, Mg++, Ca++ 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Co++이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mg++이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Ca++이다. 다른 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++, Co++, Mg++ 및 Ca++로 구성되는 군으로부터 선택된 2종 이상(다수)의 양이온이다. 가장 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mg++이다.
가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질을 분해 또는 전환하는 동안 바람직하게는 약 0.001mM 내지 약 50mM, 더 바람직하게는 약 0.01mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 더욱 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 5mM, 가장 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 2.5mM, 더 가장 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 1mM의 유효 농도로 첨가된다.
바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도로 첨가된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 0.01mM 내지 약 25mM의 유효 농도로 첨가된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.1mM 내지 약 25mM의 유효 농도로 첨가된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.1mM 내지 약 10mM의 유효 농도로 첨가된다. 더욱 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.3mM 내지 약 5mM의 유효 농도로 첨가된다. 가장 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.3mM 내지 약 2.5mM의 유효 농도로 첨가된다. 더 가장 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.3mM 내지 약 1mM의 유효 농도로 첨가된다.
가용성 활성화 2가 금속 양이온은 바람직하게 가용성 염, 예를 들어 황산염, 탄산염, 염화물, 시트르산염, 질산염, 아질산염, 불화물, 또는 요오드화물 염으로서 첨가된다. 그러나, 셀룰로오스성 바이오매스가 다수의 2가 금속 양이온을 포함할 수 있다는 것이 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, F. B. Salisbury and C. W. Ross: Plant Physiology, Wadsworths Publishing Company, Belmont, California (1992)를 참조한다. 따라서, 셀룰로오스성 바이오매스가 금속 양이온의 공급원으로서 부분적으로 또는 전체적으로 사용될 수 있다. 활성화 2가 금속 양이온은 가용성 또는 불용성일 수 있다. 용어 "가용성 활성화 2가 금속 양이온"은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위해 용액 중에서 이용할 수 있는 2가 금속 양이온으로서 본원에서 정의된다. 용어 "불용성 활성화 2가 금속 양이온"은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위해 용액 중에서 이용할 수 없는 2가 금속 양이온으로서 본원에서 정의된다. 이 2가 금속 양이온은, 예컨대 EDTA 또는 EGTA 등에 의해 킬레이트화되거나, 또는 셀룰로오스성 바이오매스의 성분, 예를 들면 피로인산염과 착물을 형성하기 때문에 이용될 수 없다.
또한, 셀룰로오스성 바이오매스는 셀룰로오스 가수분해를 억제하는 가용성 2가 금속 양이온("가용성 억제성 2가 금속 양이온")을 공급할 수 있다. 예를 들어, 억제성 2가 금속 양이온은 Zn++ 또는 Fe++이다. 따라서, 셀룰로오스 가수분해를 활성화하는 어떤 것과 셀룰로오스 가수분해를 억제하는 다른 것의 가용성 2가 금속 양이온의 혼합물이 존재하는 조건에서는 억제성 2가 금속 양이온의 억제 효과를 극복하기 위해 과량의 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 첨가된다. 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 대한 억제성 2가 금속 양이온의 악영향을 방지해야 하는 이러한 상황에서, 본 발명의 방법은 셀룰로오스-함유 물질을 분해 또는 전환하기에 충분한 기간 동안 바람직하게는 약 0.001mM 내지 약 50mM, 더 바람직하게는 약 0.01mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 더욱 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 5mM, 가장 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 2.5mM, 더 가장 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 1mM의 범위로 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 유효 농도가 유지되도록 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도를 보충하는 단계를 더 포함한다.
바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.001mM 내지 약 50mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.01mM 내지 약 25mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.1mM 내지 약 25mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다. 더 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.1mM 내지 약 10mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다. 더욱 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.3mM 내지 약 5mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다. 가장 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.3 mM 내지 약 2.5mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다. 더 가장 바람직한 양태에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도는 셀룰로오스-함유 기질의 분해 또는 전환 동안 약 0.3mM 내지 약 1mM의 유효 농도가 유지되도록 보충된다.
셀룰로오스성 바이오매스 중의 2가 금속 양이온의 농도는 원자흡착, 전기화학 전극, 금속이온 바이오센서, 또는 광학센서, 또는 킬레이트화에 의한 적정과 같은 본 분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, Methods in Enzymology, v.158(multiple chapters), Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th ed.; Molecular Probes, Inc.: Eugene, OR, 1996., Thompson et al.Anal. Chem., 70(22), 4717-4723, 1998, Inductively Cou-pled Plasma Mass Spectrometry, Akbar Montaser (Editor) May 1998 참조).
본 발명의 방법에서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 바람직하게 적어도 0.1-배, 더 바람직하게는 적어도 0.2-배, 더 바람직하게는 적어도 0.3-배, 더 바람직하게는 적어도 0.4-배, 더 바람직하게는 적어도 0.5-배, 더 바람직하게는 적어도 1-배, 더 바람직하게는 적어도 3-배, 더 바람직하게는 적어도 4-배, 더 바람직하게는 적어도 5-배, 더 바람직하게는 적어도 10-배, 더 바람직하게는 적어도 20-배, 더욱 바람직하게는 적어도 30-배, 가장 바람직하게는 적어도 50-배, 더 가장 바람직하게는 적어도 100-배 증가시킨다.
셀룰로오스 가수분해 효소 조성물
또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 바람직하게 약 0.001mM 내지 약 50mM, 더 바람직하게는 약 0.01mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 더욱 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 5mM, 가장 바람직하게 약 0.3mM 내지 약 2.5mM, 더 가장 바람직하게 약 0.3mM 내지 약 1mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 관한 것으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 바람직하게는 약 0.001mM 내지 약 50mM, 더 바람직하게는 약 0.01mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 25mM, 더 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 더욱 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 5mM, 가장 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 2.5mM, 더 가장 바람직하게는 약 0.3mM 내지 약 1mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재는 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드에 비하여 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시킨다.
본 발명의 방법에서 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 셀룰로오스-함유 물질을 글루코오스로, 또는 헤미셀룰로오스를 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스, 및 아라비노오스로 가공하는데 연루된 어떤 단백질, 이들의 고분자, 또는 하기 설명된 대로 이들로부터 유래된 산물을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 엔도글루카나아제, 셀로비오히드롤라아제, 베타-글루코시다아제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 셀룰로오스-함유 물질의 분해를 개선하기 위한 하나 이상의 추가 효소 활성을 더 포함한다. 바람직한 추가의 효소는 헤미셀룰라아제, 에스테라아제(예를 들어, 리파아제, 포스포리파아제 및/또는 큐티나아제), 프로테아제, 락카아제, 퍼옥시다아제, 또는 이들의 혼합물이다.
셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 일성분 제조물, 예를 들어 엔도글루카나아제, 다성분 제조물, 예를 들어 엔도글루카나아제(들), 셀로비오히드롤라아제(들) 및 베타-글루코시다아제(들), 또는 일성분과 다성분 단백질 제조물의 조합일 수 있다. 셀룰로오스 가수분해 단백질은 활성, 즉 산성, 중성 또는 알칼리성 pH 범위에서 셀룰로오스-함유 물질을 가수분해하는 활성을 가질 수 있다.
상기 언급한 대로, 본 발명에서 사용된 셀룰로오스 가수분해 단백질은 일성분 제조물, 즉 다른 셀룰로오스 가수분해 성분을 본질적으로 함유하지 않는 성분일 수 있다. 단일 성분은 재조합 성분, 즉 그 단일 성분을 암호화하는 DNA 서열의 클로닝하고, 이어서 세포를 DNA 서열로 형질전환하여 숙주에서 발현시킴으로써 제조된 성분일 수 있다(예를 들어, WO 91/17243 및 WO 91/17244 참조). 숙주 세포는 이종성 숙주(효소가 숙주에 외인성이다)일 수 있거나, 또는 숙주는 야생형 숙주(효소가 숙주에 자생적이다)일 수 있다. 또한, 일성분 셀룰로오스 가수분해 단백질은 발효 육즙으로부터 이러한 단백질을 정제함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 효소는 본원에 설명된 과정에서 사용하기에 적합한 모든 형태일 수 있으며, 예를 들어 세포가 있거나 없는 미정제 발효 육즙, 건조 분말 또는 과립, 비-분진성 과립, 액체, 안정화된 액체, 또는 보호된 효소 등이 있다. 과립은, 예컨대 미국특허 제4,106,991호 및 제4,661,452호에 개시된 대로 제조될 수 있으며, 본 분야에 공지된 과정에 의해 선택적으로 코팅될 수 있다. 액체 효소 제조물은, 예를 들어 확립된 과정에 따라서 당, 당 알콜 또는 다른 폴리올, 및/또는 락트산 또는 다른 유기산과 같은 안정제를 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238,216에 개시된 과정에 따라서 제조될 수 있다.
셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 모든 속의 미생물로부터 얻어질 수 있다. 용어 "로부터 얻어진"은 본원에서 효소가 천연 효소로서 효소를 자연적으로 생산하는 유기체로부터 분리된 것일 수 있음을 의미한다. 또한, "로부터 얻어진"은 본원에서 효소가 숙주 유기체에서 재조합적으로 생산된 것일 수 있음을 의미하며, 이때 재조합적으로 생산된 효소는 숙주 유기체에 자생적 또는 외인성이거나, 또는 변형된 아미노산 서열, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는 서열을 가지는데, 즉 재조합적으로 생산된 효소는 천연 아미노산 서열의 돌연변이 및/또는 단편이거나, 또는 본 분야에 공지된 핵산 셔플링 과정에 의해서 생산된 효소이다. 천연 효소의 의미에는 자연적 변이체가 포함되고, 외인성 효소의 의미에는 화학적 또는 재조합 돌연변이, 예컨대 부위-지정 돌연변이 또는 셔플링에 의해 얻어진 변이체가 포함된다. 따라서, 셀룰로오스 가수분해 단백질의 화학적으로 변형된 또는 단백질 조작된 돌연변이도 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 주어진 공급원으로부터 얻어진 폴리펩티드는 세포외 분비된다.
셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 박테리아 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 이 폴리펩티드는 그람 양성 박테리아 폴리펩티드, 예컨대 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Bacillus, Streptococcus , Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, 또는 Oceanobacillus 폴리펩티드, 또는 그람 음성 박테리아 폴리펩티드, 예컨대 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, 또는 Ureaplasma 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus brevis , Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans , Bacillus firmus , Bacillus lautus, Bacillus lentus , Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium , Bacillus pumilus , Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, 또는 Bacillus thuringiensis 폴리펩티드이다.
다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Streptococcus equisimilis , Streptococcus pyogenes , Streptococcus uberis , 또는 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus 폴리펩티드이다.
다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, 또는 Streptomyceslividans 폴리펩티드이다.
셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 또한 진균 폴리펩티드, 더 바람직하게는 효모 폴리펩티드, 예컨대 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, 또는 Yarrowia 폴리펩티드, 또는 더 바람직하게는 사상 진균 폴리펩티드, 예컨대 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, 또는 Xylaria 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, 또는 Saccharomyces oviformis 폴리펩티드이다.
다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense,Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, 또는 Trichophaeasaccata 폴리펩티드이다.
본 발명의 방법에서, 어떤 엔도글루카나아제, 셀로비오히드롤라아제, 및/또는 베타-글루코시다아제뿐만 아니라 어떤 다른 셀룰로오스 가수분해 효소라도 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 박테리아 엔도글루카나아제의 예는, 제한되지는 않지만 Acidothermus cellulolyticus 엔도글루카나아제(WO 91/05039; WO 93/15186; 미국특허 제5,275,944호; WO 96/02551; 미국특허 제5,536,655호, WO 00/70031, WO 05/093050); Thermobifida fusca 엔도글루카나아제 III(WO 05/093050); 및 Thermo -bifida fusca 엔도글루카나아제 V(WO 05/093050)를 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 진균 엔도글루카나아제의 예는, 제한되지는 않지만 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(Penttila et al ., 1986, Gene 45:253 -263; GenBank™ 수탁번호 M15665); Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II(Sal-oheimo et al ., 1988, Gene 63:11-22; GenBank™ 수탁번호 M19373); Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 III(Okada et al ., 1988, Appl . Environ . Microbiol . 64: 555-563; GenBank™ 수탁번호 AB003694); Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 IV (Saloheimo et al ., 1997, Eur . J. Biochem . 249:584-591; GenBank™ 수탁번호 Y11113); 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(Saloheimo et al ., 1994, Mo -lecular Microbiology 13:219-228; GenBank™ 수탁번호 Z33381); Aspergillus aculeatus 엔도글루카나아제(Ooi et al ., 1990, Nucleic Acids Research 18:5884); Aspergillis kawachii 엔도글루카나아제(Sakamoto et al ., 1995, Current Genetics 27:435-439); Chrysosporium sp. C1(미국특허 제6,573,086호; GenPept 수탁번호 AAQ38150); Corynascus heterothallicus(미국특허 제6,855,531호; GenPept 수탁번호 AAY00844); Erwinia carotovara 엔도글루카나아제(Saarilahti et al ., 1990, Gene 90:9-14); Fusarium oxysporum 엔도글루카나아제(GenBank™수탁번호 L29381); Humicola grisea var.thermoidea 엔도글루카나아제(GenBank™ 수탁번호 AB003107); Melanocarpus albomyces 엔도글루카나아제(GenBank™ 수탁번호 MAL515703); Neuro -spora crassa 엔도글루카나아제(GenBank™ 수탁번호 XM_324477); Piromyces equi (Eberhardt et al , 2000 Microbiology 146:1999-2008; GenPept수탁번호 CAB92325); Rhizopus oryzae(Moriya et al ., 2003, J. Bacteriology 185:1749-1756; GenBank™ 수탁번호 AB047927, AB056667 및 AB056668); 그리고 Thielavia terrestris(WO 2004 /053039; EMBL 수탁번호 CQ827970)를 포함한다.
다른 엔도글루카나아제는 Henrissat B.(1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem . J. 280:309-316), 및 Henrissat B., and Bairoch A.(1996, Updating the sequence-based clas-sification of glycosyl hydrolases, Biochem . J. 316:695-696)에 따른 분류를 사용한 13개를 넘는 글리코실 히드롤라아제 패밀리에 개시된다.
바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제I(CEL7B)이다. 다른 바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II(CEL5A). 다른 바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Trich -oderma reesei 엔도글루카나아제 III(CEL12A)이다. 다른 바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(CEL45A)이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Myceliophthora thermophila CEL7 엔도글루카나아제이다. 다른 바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Chrysosporium luckn -owense CEL12 엔도글루카나아제이다. 다른 바람직한 양태에서, 엔도글루카나아제는 Chrysosporium lucknowense CEL45 엔도글루카나아제이다.
더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제I(CEL7B)은 SEQ ID NO:74의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II(CEL5A)는 SEQ ID NO:76의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 III(CEL12A)는 SEQ ID NO:78의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(CEL45A)는 SEQ ID NO:80의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, My -celiophthora thermophila CEL7 엔도글루카나아제는 SEQ ID NO:82의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Myceli -ophthora thermophila CEL12 엔도글루카나아제는 SEQ ID NO:84의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Mycelioph -thora thermophila CEL45 엔도글루카나아제는 SEQ ID NO:86의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다.
다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(CEL7B)은 SEQ ID NO:73의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II(CEL5A)는 SEQ ID NO:75의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichod -erma reesei 엔도글루카나아제 III(CEL12A)는 SEQ ID NO:77의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(CEL45A)는 SEQ ID NO:79의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Myceliophthora thermophila CEL7 엔도글루카나아제는 SEQ ID NO:81의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Chrysosporium CEL12 엔도글루카나아제는 SEQ ID NO:83의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Chrysosporium CEL45 엔도글루카나아제는 SEQ ID NO:85의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다.
Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(CEL7B)는 Penttila et al ., 1986, Gene 45:253-263에 따라서 얻어질 수 있다. Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II(CEL5A)는 Saloheimo et al ., 1988, Gene 63:11-22에 따라서 얻어질 수 있다. Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 III(CEL12A)는 Okada et al ., 1988, Appl . Environ. Microbiol . 64:555-563에 따라서 얻어질 수 있다. Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(CEL45A)는 Saloheimo et al ., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228에 따라서 얻어질 수 있다. Myceliophthora thermophila CEL7 엔도글루카나아제는 WO 95/024471에 따라서 얻어질 수 있다. Chrysosporium lucknowense CEL12 엔도글루카나아제는 WO 2001/25468에 따라서 얻어질 수 있다. Chrysosporium luck -nowense CEL45 엔도글루카나아제는 WO 2000/20555에 따라서 얻어질 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 셀로비오히드롤라아제는 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A)이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀로비오히드롤라아제는 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A)이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀로비오히드롤라아제는 셀룰로오스 결합 도메인을 가진 Chrysosporium luckn -owense CEL7 셀로비오히드롤라아제이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀로비오히드롤라아제는 셀룰로오스 결합 도메인이 없는 Myceliophthora thermophila CEL7 셀로비오히드롤라아제이다. 다른 바람직한 양태에서, 셀로비오히드롤라아제는 Thielavia terrestris 셀로비오히드롤라아제이다.
다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I( CEL7A)는 SEQ ID NO:88의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A)는 SEQ ID NO:90의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 결합 도메인을 가진 Chrysosporium lucknow -ense CEL7 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:92의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 결합 도메인이 없는 Myceliophthora thermophila CEL7 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:94의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Thielavia terrestris 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:96의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다.
다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I( CEL7A) 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:87의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A) 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:89의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 결합 도메인을 가진 Ch -rysosporium lucknowense CEL7 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:91의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 결합 도메인이 없는 Myceliophthora thermophila CEL7 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:93의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Thielavia terrestris 셀로비오히드롤라아제는 SEQ ID NO:95의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다.
Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A)는 Shoemaker et al ., 1983, Biotechnology(NY) 1:691-696에 따라서 얻어질 수 있다. Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A)는 Terri et al ., 1987, Gene 51:43-52에 따라서 얻어질 수 있다. 셀룰로오스 결합 도메인을 가진 Chrysosporium lucknowense CEL7 셀로비오히드롤라아제는 WO 2001/79507에 따라서 얻어질 수 있다. 셀룰로오스 결합 도메인이 없는 Myceliophthora thermophila CEL7 셀로비오히드롤라아제는 WO 2003/ 000941에 따라서 얻어질 수 있다. Thielavia terrestris 셀로비오히드롤라아제는 WO 2006/074435에 따라서 얻어질 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제가 Aspergillus oryzae로부터 얻어진다. 다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제가 Aspergillus fumigatus로부터 얻어진다. 다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제가 Penicillium brasilianum, 예를 들어 Penicillium brasilianum 균주 IBT 20888로부터 얻어진다. 다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제가 Aspergillus niger로부터 얻어진다. 다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제가 Aspergillus aculeatus로부터 얻어진다.
더 바람직한 양태에서, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:16의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspergillus fumigatus 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:18의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Penicillium brasilianum 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:20의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspe -rgillus niger 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:22의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspergillus aculea -tus 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:24의 성숙 폴리펩티드 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체이다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:15의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspergillus fumiga -tus 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:17의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Pe -nicillium brasilianum 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:19의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspergillus niger 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:21의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다. 다른 더 바람직한 양태에서, Aspergillus aculeatus 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:23의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 그것의 오르토로그 또는 변이체에 의해 암호화된다.
베타-글루코시다아제 활성을 갖는 Aspergillus oryzae 폴리펩티드는 WO 2002 /095014에 따라서 얻어질 수 있다. 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 Aspergillus fumigatus 폴리펩티드는 WO 2005/047499에 따라서 얻어질 수 있다. 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 Penicillium brasilianum 폴리펩티드는 WO 2007/019442에 따라서 얻어질 수 있다. 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 Aspergillus niger 폴리펩티드는 Dan et al ., 2000, J. Biol . Chem . 275:4973-4980에 따라서 얻어질 수 있다. 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 Aspergillus aculeatus 폴리펩티드는 Kawaguchi et al ., 1996, Gene 173:287-288에 따라서 얻어질 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에서, SEQ ID NO:16의 성숙 폴리펩티드는 E. coli DSM 14240에 함유된 플라스미드에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 다른 바람직한 양태에서, SEQ ID NO:18의 성숙 폴리펩티드는 E. coli NRRL B-30695에 함유된 플라스미드 pEJG113에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 다른 바람직한 양태에서, SEQ ID NO:20의 성숙 폴리펩티드는 E. coli NRRL B-30860에 함유된 플라스미드 pKKAB에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:26의 Aspergill -us oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG 융합 단백질이다. 다른 바람직한 양태에서, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG 융합 단백질은 SEQ ID NO: 25에 의해 암호화된다. 다른 바람직한 양태에서, 베타-글루코시다아제는 SEQ ID NO:28의 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질이다. 다른 바람직한 양태에서, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질은 SEQ ID NO:27의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 베타-글루코시다아제의 예는, 제한되지는 않지만, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제(WO 02/095014; WO 04/099228); Aspergillus aculeatus 베타-글루코시다아제(Kawaguchi et al , 1996, Gene 173:287 -288); Aspergillus avenaceus 베타-글루코시다아제(GenBank™수탁번호 AY943971); Aspergillus fumigatus 베타-글루코시다아제(GenBank™ 수탁번호 XM745234); Aspe -rgillus kawachii 베타-글루코시다아제(GenBank™수탁번호 AB003470); Aspergillus niger 베타-글루코시다아제(GenBank™ AJ132386); Magnaporthe grisea 베타-글루코시다아제(GenBank™ 수탁번호 AY849670); Phanerochaete chrysosporium 베타-글루코시다아제(GenBank™ 수탁번호 AB253327); Talaromyces emersonii 베타-글루코시다아제(GenBank™ 수탁번호 AY072918) 및 Trichoderma reesei 베타-글루코시다아제 (GenBank™ 수탁번호 U09580, AB003110, AY281374, AY281375, AY281377, AY281378 및 AY281379)를 포함한다. 또한, WO 04/099228에 설명된 것들과 같은 베타-글루코시다아제의 변이체도 사용될 수 있다.
다른 베타-글루코시다아제는 Henrissat B.(1991, A classification of gly-cosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem . J. 280: 309-316), 및 Henrissat B., and Bairoch A.(1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem . J. 316:695-696)에 따른 분류를 사용한 13개를 넘는 글리코실 히드롤라아제 패밀리에 개시된다.
상기 언급된 종들에 대하여 본 발명이 완전한 상태와 불완전한 상태를 모두 포함하며, 알려진 종 명칭에 관계없이 다른 분류학적 동등물, 예를 들어 무성생식형도 포함한다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 적합한 동등물의 정체를 쉽게 인식할 것이다.
이들 종에 속하는 균주는 다수의 배양물 수집기관에서 공개적으로 쉽게 입수할 수 있으며, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC), 도이치 잠룽 폰 마크로오가니스먼 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSM), 센트럴뷰로 보르 슈멜컬쳐즈(CBS) 및 애그리컬쳐럴 리서치 서비스 페이턴트 컬쳐 컬렉션, 노던 레지오널 리서치 센터(NRRL) 등이 있다.
또한, 이러한 폴리펩티드는 상기 언급된 프로브를 사용하여 자연물(예컨대, 토양, 퇴비, 물 등)로부터 분리된 미생물을 포함하는 다른 공급원으로부터 확인하여 얻어질 수 있다. 자연 서식지로부터 미생물을 분리하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 다음에, 이러한 미생물의 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 유수하게 스크리닝함으로써 폴리뉴클레오티드가 얻어질 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 프로브(들)를 사용하여 일단 검출되면, 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 분리하거나, 또는 클로닝할 수 있다(예를 들어, Sambrook et al ., 1989, supra).
더욱이, 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 이 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 그것의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 또 다른 폴리펩티드가 융합된 융합 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 융합 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(또는 그 일부분)에 또 다른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(또는 그 일부분)을 융합함으로써 제조된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 기술은 본 분야에 공지되어 있으며, 폴리펩티드들이 프레임 안에 있게 되고, 융합 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들)와 터미네이터의 제어하에 있게 되도록 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열들을 라이게이션하는 것을 포함한다.
더욱이, 융합 폴리펩티드는 절단 부위를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 분비시 이 부위가 절단되어 융합 단백질로부터 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드가 방출된다. 절단 부위의 예는, 제한되지는 않지만, 디펩티드 Lys-Arg를 암호화하는 Kex2 부위(Martin et al, 2003, J. Ind . Microbiol . Biotechnol . 3:568-76; Svetina et al ., 2000, J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al ., 1997, Appl . Environ . Microbiol . 63:3488-3493; Ward et al ., 1995, Bio -technology 13:498-503; 및 Contreras et al, 1991, Biotechnology 9:378-381), 아르기닌 잔기 뒤에서 인자 Xa 프로테아제에 의해 절단되는 Ile-(Glu 또는 Asp)-Gly-Arg 부위(Eaton et al ., 1986, Biochem . 25:505-512); 리신 뒤에서 엔테로키나아제에 의해 절단되는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 부위(Collins-Racie et al ., 1995, Biotec -hnology 13:982-987); 게네나아제 I에 의해 절단되는 His-Tyr-Glu 부위 또는 His-Tyr-Asp 부위(Carter et al ., 1989, Proteins : Structure , Function , and Genetics 6:240-248); Arg 뒤에서 트롬빈에 의해 절단되는 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser 부위( Stevens, 2003, Drug Discovery World 4:35-48 ); Gln 뒤에서 TEV 프로테아제에 의해 절단되는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 부위(Stevens , 2003, supra); 및 Gln 뒤에서 인간 리노바이러스 3C 프로테아제의 유전자 조작 형태에 의해 절단되는 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro 부위(Stevens , 2003, supra)를 포함한다.
바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 베타-글루코시다아제; Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A), Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A), 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(CEL7B)를 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 베타-글루코시다아제; Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A), Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A), 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(CEL 7B)를 포함하고, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II(CEL5A), Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(CEL45A), 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 III (CEL12A)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 더 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 베타-글루코시다아제; Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A), Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A), 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(CEL 7B)를 포함하고, Thielavia terrestris 셀로비오히드롤라아제를 더 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 베타-글루코시다아제; Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A), Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 II(CEL6A), 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I(CEL 7B)를 포함하며, (1) Trichoderma reesei 엔도글루카나아제II(CEL5A), Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V(CEL45A), 및 Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 III (CEL12A)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 더 포함하고, 및/또는 (2) Thielavia terrestris 셀로비오히드롤라아제를 더 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 엔도글루카나아제 활성을 갖는 Myceliophthora thermophila CEL7 폴리펩티드, 엔도글루카나아제 활성을 갖는 Chrysosporium lucknowense CEL12 폴리펩티드, 엔도글루카나아제 활성을 갖는 Chrysosporium lucknowense CEL45 폴리펩티드, 셀룰로오스 결합 도메인을 가진 셀로비오히드롤라아제 활성을 갖는 Chrysosporium lucknowense CEL7 폴리펩티드, 및 셀룰로오스 결합 도메인이 없는 셀로비오히드롤라아제 활성을 갖는 Myceli -ophthora thermophila CEL7 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상(다수)의 성분을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 엔도글루카나아제 활성을 갖는 Myceliophthora thermophila CEL7 폴리펩티드, 엔도글루카나아제 활성을 갖는 Chrysosporium lucknowense CEL12 폴리펩티드, 엔도글루카나아제 활성을 갖는 Chrysosporium lucknowense CEL45 폴리펩티드, 셀룰로오스 결합 도메인을 가진 셀로비오히드롤라아제 활성을 갖는 CEL7 폴리펩티드 및 셀룰로오스 결합 도메인이 없는 셀로비오히드롤라아제 활성을 갖는 Myceliophthora thermophila CEL7 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 하나 이상(다수)의 폴리펩티드를 더 포함한다.
또한, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물은 시판 제조물일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 시판되는 셀룰로오스 가수분해 효소 제조물의 예는, 예를 들어 CELLUCLAST™(Novozymes A/S에서 입수) 및 NOVOZYM™ 188(Novozymes A/S에서 입수)을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 시판 제조물은 CELLUZYME™, CEREFLO™ 및 ULTRAFLO™(Novozymes A/S), LAMINEX™ 및 SPEZYME™ CP(Genencor Int.), ROHAMENT™ 7069 W(Rohm GmbH), 및 FIBREZYME? LDI, FIBREZYME? LBR, 또는 VISCOSTAR? 150L(Dyadic International, Inc., Jupiter, FL, USA)을 포함한다.
본 발명에서 유용할 수 있는 다른 셀룰로오스 가수분해 단백질들이 EP 495,257, EP 531,315, EP 531,372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96 /11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/0439 80, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/ 093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, 미국특허 제4,435,307호, 미국특허 제5,457,046호, 미국특허 제5,648,263호, 미국특허 제5,686,593호, 미국특허 제5,691,178호, 미국특허 제5,763, 254호, 및 미국특허 제5,776,757호에 설명된다.
본 발명의 방법에서 사용된 셀룰로오스 가수분해 단백질은 본 분야에 공지된 과정을 이용하여 적합한 탄소 및 질소 공급원과 무기염을 함유하는 영양 배지에서 상기 주지된 미생물 균주를 발효시킴으로써 생산될 수 있다(예를 들어, Bennett J. W. and LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991 참조). 적합한 배지는 상업적 공급자로부터 입수하거나, 또는 공개된 조성(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그)에 따라서 제조될 수 있다.
성장 및 셀룰로오스 가수분해 단백질 생산에 적합한 온도 범위 및 다른 조건들은 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Bailey, J.E., and Ollis, D.F., Bioch -emical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986 참조).
발효는 세포를 배양하고, 그 결과 셀룰로오스 가수분해 단백질을 발현 또는 분리하는 어떤 방법일 수 있다. 따라서, 발효는 셀룰로오스 가수분해 단백질의 발현 또는 분리를 허용하는 조건하에 적합한 배지 중에서 수행되는, 쉐이크 플라스크 배양, 또는 실험실 또는 산업용 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효(연속, 배치, 페드-배치, 또는 고체 상태 발효를 포함한다)를 포함하는 것으로서 이해될 수 있다. 상기 설명된 방법에 의해 생산된 얻어진 셀룰로오스 가수분해 단백질은 발효 배지로부터 회수되어 본원에 설명된 종래의 과정에 의해 정제될 수 있다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드
제 1 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 하기 모티프:
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV] 를 포함하며, 여기서 X는 어떤 아미노산이고, X(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 어떤 아미노산이고, X(4)는 4개 연속 위치된 어떤 아미노산이다.
상기 나타낸 모티프를 포함하는 분리된 폴리펩티드는 또한
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], 또는
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] 및
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X- [ILV]
를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 어떤 아미노산이고, X(1,2)는 1개 위치된 또는 2개 연속 위치된 어떤 아미노산이고, X(3)는 3개 연속 위치된 어떤 아미노산이고, X(2)는 2개 연속 위치된 어떤 아미노산이다. 상기 모티프에서, 승인된 IUPAC 단일 문자 아미노산 축약어가 사용된다.
바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 또한 H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] 및 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]를 포함한다.
제 2 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 하기 모티프:
[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]
를 포함하며, 여기서 x는 어떤 아미노산이고, x(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 어떤 아미노산이고, x(3)는 3개 연속 위치된 어떤 아미노산이다. 상기 모티프에서, 승인된 IUPAC 단일 문자 아미노산 축약어가 사용된다.
제 3 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14의 성숙 폴리펩티드에 대하여 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 더 가장 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 가지며, 이들은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 가진다(이후 "상동 폴리펩티드"). 바람직한 양태에서, 상동 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14의 성숙 폴리펩티드와 10개 아미노산, 바람직하게는 5개 아미노산, 더 바람직하게는 4개 아미노산, 바람직하게 3개 아미노산, 가장 바람직하게는 2개 아미노산, 더 가장 바람직하게는 1개 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 가진다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 20 내지 326, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 20 내지 326을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 그것의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 20 내지 326 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 20 내지 326으로 구성된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 18 내지 240, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 18 내지 240을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 18 내지 240 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 18 내지 240으로 구성된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 20 내지 258, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 20 내지 258을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 20 내지 258 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 20 내지 258로 구성된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 19 내지 226, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 19 내지 226을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 19 내지 226 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 19 내지 226으로 구성된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 20 내지 304, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 20 내지 304를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 20 내지 304 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 20 내지 304로 구성된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 23 내지 250, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 23 내지 250을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 23 내지 250 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 23 내지 250으로 구성된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 성숙 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 20 내지 249, 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 20 내지 249를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 20 내지 249 또는 그것의 대립 변이체; 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 이들의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 20 내지 249로 구성된다.
바람직하게, SEQ ID NO:2의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 277 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 적어도 287 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 297 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:4의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 185 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 적어도 195 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 205 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:6의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 200 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 적어도 212 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 224 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:8의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 175 아미노산 잔기, 더 바람직하게 적어도 185 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 195 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:10의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 240 아미노산 잔기, 더 바람직하게 적어도 255 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 270 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:12의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 175 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 적어도 190 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 205 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:14의 성숙 폴리펩티드의 단편은 적어도 200 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 적어도 210 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 220 아미노산 잔기를 함유한다.
바람직하게, SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 831 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 861 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 891 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:3의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 555 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 585 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 615 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:5의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 600 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 636 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 672 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 525 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 555 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 585 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:9의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 720 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 765 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 810 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 67 내지 796의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 525 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 570 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 615 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직하게, SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 600 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 630 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 660 뉴클레오티드를 함유한다.
제 4 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 적어도 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 적어도 낮은 긴축 조건, 더 바람직하게는 적어도 중간 긴축 조건, 더 바람직하게는 적어도 중상 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 적어도 높은 긴축 조건, 가장 바람직하게는 적어도 매우 높은 긴축 조건에서 (i) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 함유된 cDNA 서열, 또는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, (iii) (i) 또는 (ii)의 하위서열, 또는 (iv) (i), (ii) 또는 (iii)의 전장 상보 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다(J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, supra). SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 하위서열은 적어도 100개 연속 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 적어도 200개 연속 뉴클레오티드를 함유한다. 더욱이, 하위서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 단편을 암호화할 수 있다. 바람직한 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 388 내지 1332, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 98 내지 821, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 126 내지 978, SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 55 내지 678, SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 58 내지 912, SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 67 내지 796, 또는 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 77 내지 766이다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 서열, 또는 이들의 하위서열; 및 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열, 또는 그것의 단편을 사용하여 핵산 프로브를 설계하여 상기 설명된 대로 상이한 속 또는 종의 균주들로부터 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 확인하고 클로닝할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 혼성화는 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 함유된 cDNA 서열, 또는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 그것의 전장 상보 가닥, 또는 이들의 하위서열에 상응하는 표지된 핵산 프로브와 상기 설명된 대로 매우 낮은 긴축 조건 내지 매우 높은 긴축 조건에서 혼성화하는 것을 의미한다.
한 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 388 내지 1332이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1이다. 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30699에 함유된 플라스미드 pEJG120에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이것의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30699에 함유된 플라스미드 pEJG120에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:3의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 98 내지 821이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:4의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:3이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30813에 함유된 플라스미드 pTter61C에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이것의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30813에 함유된 플라스미드 pTter61C에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:5의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 126 내지 978이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:6의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:5이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30812에 함유된 플라스미드 pTter61D에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이것의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30812에 함유된 플라스미드 pTter61D에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 55 내지 678이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:8의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:7이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30814에 함유된 플라스미드 pTter61E에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이것의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30814에 함유된 플라스미드 pTter61E에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:9의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 58 내지 912이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:10의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:9이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30811에 함유된 플라스미드 pTter61G에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이것의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30811에 함유된 플라스미드 pTter61G에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 67 내지 796이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:12의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:11이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30704에 함유된 플라스미드 pDZA2-7에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이들의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30704에 함유된 플라스미드 pDZA2-7에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 77 내지 766이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:14의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하위서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:13이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30878에 함유된 플라스미드 pTr333에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이때 이것의 폴리뉴클레오티드 서열은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 E. coli NRRL B-30878에 함유된 플라스미드 pTr333에 함유된 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열이다.
적어도 100개 뉴클레오티드 길이의 긴 프로브에 대하여, 매우 낮은 긴축 조건 내지 매우 높은 긴축 조건은 본원에 정의된 바와 같다.
적어도 100개 뉴클레오티드 길이의 긴 프로브에 대하여, 담체 물질은 본원에 정의된 대로 최종적으로 세정된다.
약 15개 뉴클레오티드 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브에 대하여, 긴축 조건은 본원에 정의된 바와 같다.
약 15개 뉴클레오티드 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브에 대하여, 담체 물질은 본원에 정의된 대로 세정된다.
제 5 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성 정도가 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 더 가장 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 구성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되며, 이들은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 활성 폴리펩티드를 암호화한다.
바람직한 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 388 내지 1332, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 98 내지 821, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 126 내지 978, SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 55 내지 678, SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 58 내지 912, SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 67 내지 796, 또는 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 77 내지 766이다. 본원의 폴리뉴클레오티드 부문 참조.
제 6 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14의 하나 이상(다수)의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 인공 변이체; 또는 그것의 상동 서열이다. 이러한 인공 변이체를 제조하는 방법은 상기 설명된다.
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:14의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 총 수는 10개, 바람직하게 9개, 더 바람직하게는 8개, 더 바람직하게는 7개, 더 바람직하게는 6개 이하, 더 바람직하게는 5개, 더 바람직하게는 4개, 더욱 바람직하게는 3개, 가장 바람직하게는 2개, 더 가장 바람직하게는 1개이다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 공급원
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 어떤 속의 미생물로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 양태에서, 주어진 공급원으로부터 얻어진 폴리펩티드는 세포외 분비된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 박테리아 폴리펩티드일 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, 또는 Oceanobacillus 폴리펩티드와 같은 그람 양성 박테리아 폴리펩티드, 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria, 또는 Ureaplasma와 같은 그람 음성 박테리아 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus culans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, 또는 Bacillus thuringiensis 폴리펩티드이다.
다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, 또는 Streptococcus equi subsp . Zooepidemicus 폴리펩티드이다.
다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, 또는 Streptomyces lividans 폴리펩티드이다.
또한, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드는 진균 폴리펩티드일 수 있으며, 더 바람직하게는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, 또는 Yarrowia 폴리펩티드와 같은 효모 폴리펩티드; 또는 더 바람직하게는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Acremonium , Agaricus , Alternaria , Aspergillus , Aureobasidium , Botryospaeria, Ceriporiopsis , Chaetomidium , Chrysosporium , Claviceps , Cochliobolus, Coprinopsis , Coptotermes , Corynascus , Cryphonectria , Cryptococcus, Diplodia , Exidia , Filibasidium , Fusarium , Gibberella , Holomastigotoides, Humicola , Irpex , Lentinula , Leptospaeria , Magnaporthe , Melanocarpus, Mehpilus , Mucor , Myceliophthora , Neocalllmastix , Neurospora , Paecilomyces, Penlcillium , Phanerochaete , Piromyces , Poitrasia , Pseudoplectania, Pseudotrichonympha , Rhizomucor , Schizophyllum , Scytalidium , Talaromyces, Thermoascus , Thielavia , Tolypodadium , Trichoderma , Trichophaea , Verticillium, Volvariella, 또는 Xylaria 폴리펩티드와 같은 사상 진균 폴리펩티드이다.
바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, 또는 Saccharomyces oviformis 폴리펩티드이다.
다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Acremonium cellulolyticus , Aspergillus aculeatus , Aspergillus awamori , Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger , Aspergillus oryzae , Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense , Chrysosporium tropicum , Chrysosporium merdarium , Chrysosporium inops , Chrysosporium pannicola , Chrysosporium queenslandicum , Chrysosporium zonatum , Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum , Fusarium graminearum, Fusarium graminum , Fusarium heterosporum , Fusarium negundi , Fusarium oxysporum , Fusarium reticulatum , Fusarium roseum , Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum , Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum , Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Humicola grisea , Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Irpex lacteus, Mucor miehei , Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa , Penicillium funiculosum , Penicillium purpurogenum , Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica , Thielavia albomyces , Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis , Thielavia fimeti , Thielavia microspore , Thielavia ovispora , Thielavia peruviana , Thielavia spededonium , Thielavia setosa, Thielavia subthermophila , Thielavia terrestris , Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum , Trichoderma reesei, Trichoderma viride , 또는 Trichophaea saccata 폴리펩티드이다.
더 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Trichoderma terrestris 폴리펩티드이다. 가장 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Trielavia terrestris NRRL 8126 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 또는 10의 성숙 폴리펩티드, 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 그것의 단편이다.
다른 더 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 Thermoascus aurantiacus 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO:12의 성숙 폴리펩티드이다.
다른 더 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Trichoderma reesei 폴리펩티드이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Trichoderma reesei RutC30(ATCC 56765) 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO:14의 성숙한 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 그것의 단편이다.
상기 언급된 종들에 대하여 본 발명이 완전한 상태와 불완전한 상태를 모두 포함하며, 알려진 종 명칭에 관계없이 다른 분류학적 동등물, 예를 들어 무성생식형도 포함한다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 적합한 동등물의 정체를 쉽게 인식할 것이다.
이들 종에 속하는 균주는 다수의 배양물 수집기관에서 공개적으로 쉽게 입수할 수 있으며, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC), 도이치 잠룽 폰 마크로오가니스먼 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSM), 센트럴뷰로 보르 슈멜컬쳐즈(CBS) 및 애그리컬쳐럴 리서치 서비스 페이턴트 컬쳐 컬렉션, 노던 레지오널 리서치 센터(NRRL) 등이 있다.
또한, 이러한 폴리펩티드는 본원에 설명된 대로 상기 언급된 프로브를 사용하여 자연물(예컨대, 토양, 퇴비, 물 등)로부터 분리된 미생물을 포함하는 다른 공급원으로부터 확인하여 얻어질 수 있다.
더욱이, 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 본원에 설명된 대로 이 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 그것의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 또 다른 폴리펩티드가 융합된 융합 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드를 포함하며, 이들은 절단 부위를 더 포함할 수 있다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것의 폴리뉴클레오티드에 대한 더욱 상세한 내용은 WO 2005/074647, WO 2005/074656 및 미국 공개 출원 제2007/0077630호를 참조하며, 이들은 본원에 참고자료로 포함된다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 설명된 대로 분리되고, 본 발명의 방법을 실시하는데 이용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성 정도가 바람직하게 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 더 가장 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이들은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다.
바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30699에 함유된 플라스미드 pEJG120에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30699에 함유된 플라스미드 pEJG120에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:1와 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:2의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:1의 하위서열에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30813에 함유된 플라스미드 pTter61C에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30813에 함유된 플라스미드 pTter61C에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:3과 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:4의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:3의 하위서열에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30812에 함유된 플라스미드 pTter61D에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30812에 함유된 플라스미드 pTter61D에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:5와 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:6의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:5의 하위서열에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:7을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30814에 함유된 플라스미드 pTter61E에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30814에 함유된 플라스미드 pTter61E에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:7과 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:8의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:7의 하위서열에 관한 것이다.
다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:9를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30811에 함유된 플라스미드 pTter61G에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:9의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30811에 함유된 플라스미드 pTter61G에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:9와 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:10의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:9의 하위서열에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:11을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30704에 함유된 플라스미드 pDZA2-7에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30704에 함유된 플라스미드 pDZA2-7에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:11과 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:12의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:11의 하위서열에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:13을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30878에 함유된 플라스미드 pTr3337에 함유된 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Escherichia coli NRRL B-30878에 함유된 플라스미드 pTr3337에 함유된 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포괄하며, 이것은 유전 암호의 축퇴로 인해 SEQ ID NO:13 또는 그것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열과 상이하다. 또한, 본 발명은 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 SEQ ID NO:14의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO:13의 하위서열에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 성숙 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 이때 성숙 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14의 성숙 폴리펩티드를 암호화한다. 바람직한 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 20 내지 326, SEQ ID NO:4의 아미노산 18 내지 240, SEQ ID NO:6의 아미노산 20 내지 258, SEQ ID NO:8의 아미노산 19 내지 226, 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 20 내지 304, SEQ ID NO:12의 아미노산 23 내지 250, 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 20 내지 249이다. 다른 바람직한 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 388 내지 1332, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 98 내지 821, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 126 내지 978, SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 55 내지 678, SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 58 내지 912, SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 67 내지 796, 또는 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 77 내지 766이다.
앞서 설명한 바와 같이, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 분리하거나 또는 클로닝하는데 사용되는 기술은 본 분야에 공지되어 있으며, 게놈 DNA로부터의 분리, cDNA로부터의 제조, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또한, 폴리뉴클레오티드는, 본원에 정의된 대로, 적어도 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게 적어도 낮은 긴축 조건, 더 바람직하게는 적어도 중간 긴축 조건, 더 바람직하게는 적어도 중상 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 적어도 높은 긴축 조건, 가장 바람직하게는 적어도 매우 높은 긴축 조건에서 (i) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 함유된 cDNA 서열, 또는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:13의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥; 또는 이들 대립 변이체 및 하위서열(Sambrook et al., 1989, supra)과 혼성화하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 바람직한 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 388 내지 1332, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 98 내지 821, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 126 내지 978, SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 55 내지 678, SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 58 내지 912, SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 67 내지 796, 또는 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 77 내지 766이다.
핵산 구조체
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 제어 서열과 양립가능한 조건에서 적합한 숙주 세포 내에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 구성함으로써 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있는 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라서는 벡터로의 삽입 전에 폴리뉴클레오티드 서열을 조작하는 것이 바람직하거나 필수적일 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 기술이 본 분야에 잘 공지되어 있다.
제어 서열은 적합한 프로모터 서열, 즉 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해서 인식되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이, 절단형 및 혼성 프로모터를 포함하여 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 상동 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.
특히 박테리아 숙주 세포에서 핵산 구조체의 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예는 E. coli lac 오페론, Streptomyces coelicolor 아가라아제 유전자(dagA), Bacillus subtilis 레반수크라아제 유전자(sacB), Bacillus licheniformis 알파-아밀라아제 유전자(amyL), Bacillus stearothermophilus 말토겐 아밀라아제 유전자( amyM), Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라아제 유전자(amyQ), Bacillus lic -heniformis 페니실리나아제 유전자(penP), Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자 및 원핵생물 베타-락타마아제 유전자(Villa-Kamaroff et al, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)로부터 얻어진 프로모터들, 뿐만 아니라 tac 프로모터(DeBoer et al ., 1983, Proceedings of the National Ac -ademy of Sciences USA 80:21-25)이다. 더 이상의 프로모터들이 "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94; 및 Sambrook et al ., 1989, supra에 설명된다.
사상 진균 숙주 세포에서 핵산 구조체의 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예는 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제, Rhizomucor miehei 아스파르트 프로테이나아제, Aspergillus niger 중성 알파-아밀라아제, Aspergillus niger 산 안정성 알파-아밀라아제, Aspergillus niger 또는 Aspergillus awamori 글루코아밀라아제 (glaA), Rhizomucor miehei 리파아제, Aspergillus oryzae 염기성 프로테아제, As -pergillus oryzae 트리오스 포스페이트 아이소머라아제, Aspergillus nidulans 아세타미나아제, Fusarium venenatum 아밀로글루코시다아제(WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn(WO 00/56900), Fusarium oxysporum 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787), Trichoderma reesei 베타-글루코시다아제, Trichoderma reesei 셀로바이오히드롤라아제 I, Trichoderma reesei 셀로바이오히드롤라아제 II, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 I, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 II, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 III, Trichod -erma reesei 엔도글루카나아제 IV, Trichoderma reesei 엔도글루카나아제 V, Tri -choderma reesei 자일라나아제 I, Trichoderma reesei 자일라나아제 II, Trichode -rma reesei 베타-자일로시다아제의 유전자로부터 얻어진 프로모터들, 뿐만 아니라 NA2-tpi 프로모터(Aspergillus niger 중성 알파-아밀라아제 및 Aspergillus oryzae 트리오스 포스페이트 아이소머라아제의 유전자로부터의 프로모터들의 혼성체); 및 이들의 돌연변이, 절단형, 및 혼성 프로모터이다.
효모 숙주에서 유용한 프로모터는 Saccharomyces cerevisiae 에놀라아제(ENO -1), Saccharomyces cerevisiae 갈락토키나아제(GAL1), Saccharomyces cerevisiae 알콜 데히드로게나아제/글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제(ADH1,ADH2/ GAP), Saccharomyces cerevisiae 트리오스 포스페이트 이소머라아제(TPI), Saccha -romyces cerevisiae 메탈로티오네인(CUP1), 및 Saccharomyces cerevisiae 3-포스포글리세레이트 키나아제의 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포에서 유용한 다른 프로모터들이 Romanos et al ., 1992, Yeast 8:423-488에 설명된다.
또한, 제어 서열은 적합한 전사 터미네이터 서열, 즉 전사를 종료하도록 숙주 세포에 의해 인식되는 서열일 수 있다. 터미네이터 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 어떤 터미네이터가 본 발명에서 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포의 바람직한 터미테이터는 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제, Aspergillus niger 글루코아밀라아제, Aspergillus nidulans 안트라닐레이트 신타제, Aspergillus niger 알파-글루코시다아제 및 Fusarium oxysporum 트립신-유사 프로테아제의 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포에서 바람직한 터미네이터는 Saccharomyces cerevisiae 에놀라아제, Saccharomyces cerevisiae 시토크롬 C(CYC1) 및 Saccharomyces cerevisiae 글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제의 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포에서 유용한 다른 터미네이터들이 Romanos et al, 1992, supra에 설명된다.
또한, 제어 서열은 적합한 리더 서열, 즉 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 어떤 리더 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에서 바람직한 리더 서열은 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제 및 Aspergillus nidulans 트리오스 포스페이트 아이소머라아제의 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포에서 적합한 리더 서열은 Saccharomyces cerevisiae 에놀라아제(ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-포스포글리세레이트 키나아제, Saccharo -myces cerevisiae 알파-인자, 및 Saccharomyces cerevisiae 알콜 데히드로게나아제/글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제(ADH2/GAP)의 유전자로부터 얻어진다.
게다가, 제어 서열은 폴리아데닐화 서열, 즉 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 서열일 수 있으며, 이것은 전사시 숙주 세포에 의해서 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하라는 신호로서 인식된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 어떤 폴리아데닐화 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에서 바람직한 폴리아데닐화 서열은 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제, Aspergillus niger 글루코아밀라아제, Aspergillus nidulans 안트라닐레이트 신타제, Fusarium oxysporum 트립신-유사 프로테아제 및 Aspergillus niger 알파-글루코시다아제의 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포에서 유용한 폴리아데닐화 서열들이 Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990에 설명된다.
또한, 제어 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 암호화하고, 암호화된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 보내는 신호 펩티드 암호화 서열일 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 암호화 서열의 5' 말단은 분비되는 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열의 세그먼트를 가진 번역 리딩 프레임에 본래 연결된 신호 펩티드 암호화 서열을 본래 함유할 수 있다. 또는 달리, 암호화 서열의 5' 말단은 암호화 서열에 외인성인 신호 펩티드 암호화 서열을 함유할 수 있다. 외인성 신호 펩티드 암호화 서열은 암호화 서열이 신호 펩티드 암호화 서열을 본래 함유하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 또는 달리, 외인성 신호 펩티드 암호화 서열은 천연 신호 펩티드 암호화 서열을 단순히 대체함으로써 폴리펩티드의 분비를 증진시킬 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 보내는, 즉 배양 배지로 분비하는 어떤 신호 펩티드 암호화 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에서 효과적인 신호 펩티드 암호화 서열은 Bacillus NCIB 11837 말토겐 아밀라아제, Bacillus stearothermophilus 알파-아밀라아제, Bacill-us licheniformis 섭틸리신, Bacillus licheniformis 베타-락타마아제, Bacillus stear-othermophilus 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM), 및 Bacillus subtilisprsA의 유전자로부터 얻어진 신호 펩티드 암호화 서열이다. 더 이상의 신호 펩티드들이 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137에 설명된다.
사상 진균 숙주 세포에서 효과적인 신호 펩티드 암호화 서열은 Aspergillus oryzae TAKA 아밀라아제, Aspergillus niger 중성 아밀라아제, Aspergillus niger 글루코아밀라아제, Rhizomucor miehei 아스파르트 프로테이나아제, Humicola inso -lens 셀룰라아제, Humicola insolens 엔도글루카나아제 V, 및 Humicola lanuginosa 리파아제의 유전자로부터 얻어진 신호 펩티드 암호화 서열이다.
바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 19를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 330 내지 387을 포함하거나 또는 구성된다.
다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 1 내지 17을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 47 내지 97을 포함하거나 또는 구성된다.
다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 1 내지 19를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 69 내지 125를 포함하거나 또는 구성된다.
다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 1 내지 18을 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 1 내지 54를 포함하거나 또는 구성된다.
다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 1 내지 19를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:9의 뉴클레오티드 1 내지 57을 포함하거나 또는 구성된다.
다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:12의 아미노산 1 내지 22를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 1 내지 66을 포함하거나 또는 구성된다.
다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 1 내지 19를 포함하거나 또는 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 20 내지 76을 포함하거나 또는 구성된다.
효모 숙주 세포에서 유용한 신호 펩티드는 Saccharomyces cerevisiae 알파-인자 및 Saccharomyces cerevisiae 인베르타아제의 유전자로부터 얻어진다. 다른 유용한 신호 펩티드 암호화 서열들이 Romanos et al ., 1992, supra에 설명된다.
또한, 제어 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 암호화하는 프로펩티드 암호화 서열일 수 있다. 얻어진 폴리펩티드는 프로효소 또는 프로폴리펩티드(또는 어떤 경우 자이모겐)로 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이며, 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매 또는 자기촉매 분열에 의해서 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 암호화 서열은 Bacillus subtilis 알칼리성 프로테아제(aprE), Bacillus subtilis 중성 프로테아제(nprT), Saccharomyces cerevisiae 알파-인자, Rhizomucor miehei 아스파르트 프로테이나아제, 및 Myceliophthora thermophila 락카아제의 유전자로부터 얻어질 수 있다(WO 95/33836).
신호 펩티드 및 프로펩티드 서열이 모두 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단의 옆에 위치하고, 신호 펩티드 서열은 프로펩티드 서열의 아미노 말단의 옆에 위치한다.
또한, 숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드 발현의 조절을 가능하게 하는 조절 서열을 부가하는 것이 바람직하다. 조절 시스템의 예는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자 발현을 작동하게 하거나 또는 중단시키는 것들로서, 조정 화합물의 존재를 포함한다. 원핵생물 시스템에서 조절 시스템은 lac , tac , 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서는 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에서는 TAKA 알파-아밀라아제 프로모터, Aspergillus niger 글루코아밀라아제 프로모터, 및 Aspergillus oryzae 글루코아밀라아제 프로모터가 조절 서열로서 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 것들이다. 진핵생물 시스템에서 이런 조절 서열은 메토트렉사이트의 존재하에 증폭되는 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자, 및 중금속과 함께 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이러한 경우, 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열은 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 벡터
본원에 설명한 다양한 핵산 및 제어 서열이 함께 결합되어 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터가 제조될 수 있다. 발현 벡터는 하나 이상의 편리한 제한 부위를 포함할 수 있으며, 이로써 이러한 부위에 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 치환이 가능하게 된다. 또는 달리, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이 서열을 포함하는 핵산 구조체를 발현을 위한 적합한 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 백터를 만드는데 있어서, 암호화 서열이 발현을 위한 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 암호화 서열이 벡터 내에 위치된다.
재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 과정을 편리하게 수행할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 가져올 수 있는 어떤 벡터(예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 벡터가 도입될 숙주 세포의 양립성에 의존할 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 고리형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 자기 복제 벡터, 즉 그 복제가 염색체 복제에 독립적인 염색체외 존재, 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체로서 존재하는 벡터일 수 있다. 이 벡터는 자가-복제를 확보하기 위한 어떤 수단을 함유할 수 있다. 또는 달리, 벡터는 숙주 세포에 도입되었을 때 게놈에 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포의 게놈에 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포손이 사용될 수 있다.
벡터는 바람직하게 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등이 된 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 선택성 마커를 함유한다. 선택성 마커는 그 산물이 살균 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구균주에 대한 기본영양성 등을 제공하는 유전자이다.
박테리아 선택성 마커의 예는 Bacillus subtilis 또는 Bacillus lichenifor -mis로부터의 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라시클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커이다. 효모 숙주 세포에서 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 및 URA3이다. 사상 진균 숙주 세포에서 사용하기 위해 선택가능한 마커는 amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제), niaD(니트레이트 리덕타아제), pyrG(오르티딘-5'-포스페이트 디카르복실라아제), sC(황산염 아데닐트랜스퍼라아제) 및 trpC(안트라닐레이트 신타제) 및 이들의 동등물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. Aspergi -llus 세포에는 Aspergillus nidulans나 Aspergillus oryzae의 amdS 및 pyrG 유전자 및 Streptomyces hygroscopicus의 bar 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
벡터는 숙주 세포의 게놈에 벡터의 통합이나, 또는 게놈에 독립적인 세포에서 벡터의 자가 복제를 가능하게 하는 요소(들)를 함유하는 것이 바람직하다.
숙주 세포 게놈으로의 통합을 위해, 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열, 또는 상동 또는 비-상동 재조합에 의한 게놈으로의 통합에 알맞은 어떤 다른 벡터 요소에 의존할 수 있다. 또는 달리, 벡터는 염색체(들)의 정확한 위치(들)에서 상동 재조합에 의한 숙주 세포 게놈으로의 통합을 지시하기 위한 추가의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 정확한 위치에서 통합될 가능성을 증가시키기 위해서, 통합 요소는 바람직하게 상응하는 표적 서열과 높은 정도의 동일성을 가지는 충분한 수의 핵산, 예를 들어 100 내지 10,000 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 10,000 염기쌍, 가장 바람직하게는 800 내지 10,000 염기쌍을 함유해야 하며, 이로써 상동 재조합의 가능성이 증진된다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈에 있는 표적 서열과 상동인 어떤 서열일 수 있다. 또한, 통합 요소는 뉴클레오티드 서열을 비암호화 또는 암호화할 수 있다. 한편, 벡터는 비-상동 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
자가 복제를 위해, 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터가 자가 복제할 수 있도록 하는 복제 기원을 더 포함할 수 있다. 복제 기원은 세포에서 기능하는 자가 복제를 매개하는 어떤 플라스미드 레플리케이터일 수 있다. 용어 "복제 기원" 또는 "플라스미드 레플리케이터"는 플라스미드나 벡터의 생체내 복제를 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열로서 본원에서 정의된다.
박테리아 복제 기원의 예는 E. coli에서 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184, 및 Bacillus에서 복제를 허용하는 pUB110, pE194, pTA1060, 및 pAMβ1의 복제 기원이다.
효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 기원의 예는 2 마이크론 복제 기원, 즉 ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, 및 ARS4와 CEN6의 조합이다.
사상 진균 세포에서 유용한 복제 기원의 예는 AMA1 및 ANS1이다(Gems et al, 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-75; WO 00/24883). AMA1 유전자의 분리 및 이 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구성은 WO 00/24883에 개시된 방법에 따라서 달성될 수 있다.
이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피가 숙주 세포에 삽입되어 폴리펩티드의 생산을 증가시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드 카피 수의 증가는 적어도 하나의 추가의 서열 카피를 숙주 세포 게놈에 통합시킴으로써, 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 증폭가능한 선택성 마커 유전자를 포함시킴으로써 얻어질 수 있으며, 이 경우 선택성 마커 유전자의 증폭된 카피를 함유하는 세포와 이에 따른 추가의 폴리뉴클레오티드 카피가 적합한 선택성 제제의 존재하에 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.
상기 설명된 요소들을 라이게이션하여 재조합 발현 벡터를 구성하는데 사용되는 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook et al., 1989, supra 참조).
숙주 세포
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포는 폴리펩티드의 재조합 제조에 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 벡터가 앞서 설명된 대로 염색체 통합체로서 또는 자기-복제형 염색체외 벡터로서 유지되도록 숙주 세포에 도입된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인하여 모세포와 동일하지 않게 된 모세포의 어떤 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 및 그것의 공급원에 크게 의존할 것이다.
숙주 세포는 단세포 미생물, 예컨대 원핵생물, 또는 비-단세포 미생물, 예컨대 진핵생물일 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 어떤 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 그람 양성 박테리아는, 제한되지는 않지만, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, 및 Oceanobacillus를 포함한다. 그람 음성 박테리아는, 제한되지는 않지만, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, 및 Ureaplasma.를 포함한다.
박테리아 숙주 세포는 어떤 Bacillus 세포일 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 Bacillus 세포는, 제한되지는 않지만, Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis , Bacillus circulans , Bacillus clausii, Bacillus coagulans , Bacillus firmus , Bacillus lautus , Bacillus lentus , Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium, Bacillus pumilus , Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, 및 Bacillus thuringiensis 세포를 포함한다.
바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus 또는 Bacillussubtilis 세포이다. 더 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Bacillusamyloliquefaciens 세포이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Bacillusclausii 세포이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Bacilluslicheniformis 세포이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Bacillussubtilis 세포이다.
또한, 박테리아 숙주 세포는 어떤 Streptococcus 세포일 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 Streptococcus 세포는, 제한되지는 않지만, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes , Streptococcus uberis , 및 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus 세포를 포함한다.
바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptococcus equisimilis 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptococcus pyogenes 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptococcus uberis 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus 세포이다.
또한, 박테리아 숙주 세포는 어떤 Streptomyces 세포일 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 Streptomyces 세포는, 제한되지는 않지만, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, 및 Streptomyceslividans 세포를 포함한다.
바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptomyces achromogenes 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptomyces coelicolor 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptomyces avermitilis 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptomyces griseus 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 Streptomyceslividans 세포이다.
Bacillus 세포에 DNA의 통합은, 예컨대 원형질체 형질전환(예를 들어, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115 참조), 컴페턴트 세포 사용(예를 들어, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221 참조), 전기천공(예를 들어, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742 -751 참조), 또는 컨쥬게이션(예를 들어, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5271-5278 참조)에 의해 행해질 수 있다. E. coli 세포에 DNA의 도입은, 예컨대 원형질체 형질전환(예를 들어, Hanahan, 1983, J. Mol . Biol . 166: 557-580 참조) 또는 전기천공(예를 들어, Dower et al ., 1988, Nucleic Acids Res . 16:6127-6145 참조)에 의해 행해질 수 있다. Streptomyces 세포에 DNA의 도입은, 예컨대 원형질체 형질전환 및 전기천공(예를 들어, Gong et al ., 2004, Folia Mic -robiol. ( Praha ) 49:399-405 참조), 컨쥬게이션(예를 들어, Mazodier et al, 1989, J. Bacteriol . 171:3583-85 참조), 또는 형질도입(예를 들어, Burke et al ., 2001, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 98:6289-6294 참조)에 의해 행해질 수 있다. Pseudo -monas 세포에 DNA의 도입은, 예컨대 전기천공(예를 들어, Choi et al ., 2006, J. Microbiol. Methods 64:391-397 참조) 또는 컨쥬게이션(예를 들어, Pinedo and Smets, 2005, Appl . Environ . Microbiol . 71:51-57 참조)에 의해 행해질 수 있다. Streptococcus 세포에 DNA의 도입은, 예컨대 자연적 컴페턴스(예를 들어, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect . Immun . 32:1295-1297 참조), 원형질체 형질전환(예를 들어, Catt and Jollick, 1991, Microbios . 68:189-2070 참조), 전기천공(예를 들어, Buckley et al ., 1999, Appl . Environ . Microbiol . 65:3800-3804 참조), 또는 컨쥬게이션(예를 들어, Clewell, 1981, Microbiol . Rev . 45:409-436 참조)에 의해 행해질 수 있다. 그러나, 숙주 세포에 DNA를 도입하기 위한 본 분야에 공지된 어떤 방법도 사용될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 진핵생물, 예컨대 포유동물, 곤충, 식물, 또는 진균 세포일 수 있다.
바람직한 양태에서, 숙주 세포는 진균 세포이다. 본원에서 사용된 "진균"은 자낭균문, 담자균문, 통곰팡이문, 및 접합균문(Hawksworth et al ., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK에 정의됨), 뿐만 아니라 난균문(Hawksworth et al., 1995, supra, page 171에 인용됨) 및 모든 불완전 진균류(Hawksworth et al ., 1995, supra)를 포함한다.
더 바람직한 양태에서, 진균 숙주 세포는 효모 세포이다. 본원에서 사용된 "효모"는 자낭균 효모류(효모균목), 담자균 효모류, 및 불완전 균류(불완전 효모균강)에 속하는 효모를 포함한다. 앞으로 효모 분류가 변할 수 있으므로, 본 발명의 목적을 위해, 효모는 Biology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc . App . Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980)에 설명된 대로 정의하도록 한다.
더욱 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 Candida, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, 또는 Yarrowia 세포이다.
가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, 또는 Saccharomyces oviformis 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 Kluyveromyces lactis 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 Yarrowia lipolytica 세포이다.
또 다른 더 바람직한 양태에서, 진균 숙주 세포는 사상 진균 세포이다. "사상 진균"은 진균문 및 난균문의 세분된 사상 형태를 포함한다(Hawksworth et al ., 1995, supra에 정의됨). 사상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로오스, 글루칸, 키토산, 만난 및 그 밖의 복합 다당류로 이루어진 균사 세포벽에 의해 특정된다. 영양생장은 균사 신장에 의한 것이며, 탄소이화는 절대적으로 호기성이다. 대조적으로, Saccharomyces cerevisiae와 같은 효모에 의한 영양생장은 단세포 엽상체(thallus)의 발아에 의한 것이며, 탄소이화는 발효에 의한 것일 수 있다.
더욱 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosproium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces,Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, 또는 Trichoderma 세포이다.
가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger 또는 Aspergillus oryzae 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, 또는 Fusarium venenatum 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense,Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, 또는 Trichoderma viride 세포이다.
진균 세포는 원래 공지된 방식으로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포벽의 재생을 수반하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. Aspergillus 및 Tri-choderma 숙주 세포의 형질전환에 적합한 방법은 EP 238023 및 Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474에 개시된다. Fusarium 종의 형질전환에 적합한 방법은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 및 WO 96/00787에 설명된다. 효모는 Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, p 182-187, Academic Press, Inc., New York; lto et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; 및 Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75:1920에 설명된 과정을 사용하여 형질전환될 수 있다.
제조 방법
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 (a) 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건에서 세포의 야생형이 폴리펩티드를 생성할 수 있는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
또는 달리, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 (a) 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
제조 방법에서, 세포는 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드의 제조에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 폴리펩티드를 발현 및/또는 분리할 수 있는 조건에서 적합한 배지 중에서 수행되는, 쉐이크 플라스크 배양, 및 실험실 또는 산업용 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효(연속, 배치, 페드-배치, 또는 고체 상태 발효를 포함한다)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 본 분야에 공지된 과정을 사용하여 탄소 및 질소 공급원과 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 행한다. 적합한 배지는 상업적 공급자로부터 입수하거나, 또는 공개된 조성(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그)에 따라서 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지로 분비되는 경우, 폴리펩티드를 배지로부터 직접 회수할 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되지 않는 경우, 이것은 세포 용해물로부터 회수할 수 있다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성 또는 셀룰로오스 가수분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 본원에 설명된 방법을 사용하여 검출된다.
얻어진 육즙은 그대로 사용될 수 있거나, 또는 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드가 회수될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는, 제한되지는 않지만 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 종래의 과정에 의해서 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
폴리펩티드는, 제한되지는 않지만 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동법(예컨대, 예비 등전집속), 용해도차(예컨대, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출(예컨대, Protein Puri -fication, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함하는 본 분야에 공지된 다양한 과정에 의해 정제되어 실질적으로 순수한 폴리펩티드가 얻어질 수 있다.
셀룰로오스-함유 물질의 가공 방법
본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 셀룰로오스-함유 물질, 예컨대 리그노셀룰로오스를 발효가능한 당으로 가수분해(당화)하고, 발효가능한 당을 많은 유용한 물질, 예컨대 화학물질 및 연료로 전환할 수 있다. 셀룰로오스-함유 물질로부터 원하는 발효 산물을 제조하는 것은 전형적으로 전처리, 효소 가수분해(당화) 및 발효를 수반한다.
본 발명에 따른 셀룰로오스-함유 물질의 가공은 본 분야에 공지된 과정을 사용하여 달성될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 본 발명에 따라서 작동되도록 구성된 어떤 바이오매스 가공 장치를 사용하여 실시될 수 있다.
별도의 또는 동시의 가수분해(당화) 및 발효는, 제한되지는 않지만, 분리된 가수분해 및 배양(SHF), 동시적 당화 및 발효(SSF), 동시적 당화 및 공발효(SSCF), 혼성 가수분해 및 발효(HHF), SHCF(분리된 가수분해 및 공발효), HHCF(혼성 가수분해 및 발효), 및 직접 미생물 전환(DMC)을 포함한다. 전처리, 효소 가수분해(당화), 발효 또는 이들의 조합을 포함하는 본 분야에 공지된 어떤 방법도 본 발명의 방법을 실시하는데 사용될 수 있다는 것이 본원에서 이해된다.
종래의 장치는 페드-배치식 교반 반응기, 배치식 교반 반응기, 한외여과 연속 유동 교반 반응기, 및/또는 연속 관류형 컬럼 반응기(Fernanda de Castilhos Corazza, Flavio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the Cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25:33-38; Gusakov, A. V., and Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Em . Microb . Technol. 7:346-352), 마모 반응기(Ryu S. K., and Lee, J. M., 1983, Byconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol . Bioeng. 25:53-65), 또는 전자기장에 의해 유도되는 집중 교반 반응기(Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Davydkin I.Y., Davydkin V.Y., Protas O.V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl . Biochem . Biotechnol. 56:141-153)를 포함할 수 있다. 추가의 반응기 종류는, 예컨대 가수분해 및/또는 발효를 위한 유동층, 상향류 블랭킷, 고정형, 및 압출기 타입 반응기를 포함한다.
전처리
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 본 분야에 알려진 어떤 전처리 과정을 사용하여 셀룰로오스-함유 물질의 식물 세포벽 성분을 붕괴시킬 수 있다. 또한, 본 분야에 알려진 방법을 사용하여 전처리하기 전에 셀룰로오스-함유 물질에 프리-소킹, 습윤화 또는 컨디셔닝을 실시할 수 있다. 종래의 전처리는 스팀 전처리(폭발과 함께 또는 없이), 희석 산 전처리, 열수 전처리, 석회 전처리, 습식 산화, 습식 폭발, 암모니아 섬유 폭발, 오르가노솔브 전처리 및 생물학적 전처리를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 추가의 전처리는 초음파, 전기천공, 마이크로파, 초임계 이산화탄소, 초임계 물, 암모니아 침출을 포함한다.
가수분해 및/또는 발효 전에 셀룰로오스-함유 물질을 전처리할 수 있다. 전처리는 가수분해 전에 수행하는 것이 바람직하다. 또는 달리, 전처리는 가수분해와 동시에, 예를 들어 하나 이상의 셀룰로오스 가수분해 효소 또는 다른 효소 활성으로 셀룰로오스-함유 물질을 처리하는 것과 동시에 수행할 수 있으며, 이로써 글루코오스 및/또는 말토오스와 같은 발효가능한 당이 방출된다. 대부분의 경우, 전처리 단계 자체가 바이오매스의 발효가능한 당으로의 전환을 야기한다(효소 부재시에도).
스팀 전처리: 스팀 전처리에서는 셀룰로오스-함유 물질을 가열하여 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스와 같은 식물 세포벽 성분을 붕괴시켜서 셀룰로오스 및 다른 분획을, 예컨대 효소에 접근가능한 헤미 셀룰라아제로 만든다. 셀룰로오스 물질은 스팀을 주입하여 필요한 온도 및 압력으로 온도를 증가시킨 반응 용기를 통과하거나 거치며, 그 안에서 원하는 반응 시간 동안 체류한다. 스팀 전처리는 바람직하게는 140-230℃, 더 바람직하게는 160-200℃, 가장 바람직하게는 170-190℃에서 행하며, 이때 최적 온도 범위는 화학 촉매의 첨가에 따른다. 스팀 전처리를 위한 체류 시간은 바람직하게는 1-15분, 더 바람직하게는 3-12분, 가장 바람직하게는 4-10분이며, 이때 최적 체류 시간은 온도 범위 및 화학 촉매의 첨가에 따른다. 스팀 전처리는 비교적 높은 고형분 로딩을 허용하며, 따라서 셀룰로오스-함유 물질은 일반적으로 전처리 동안 약간 수분이 있는 상태이다. 스팀 전처리는 대체로 전처리 후 물질의 폭발성 방출과 조합되기도 하며, 이것은 스팀 폭발로서 알려져 있는데, 즉 물질을 대기압 및 난류로 신속하게 플래싱(flashing)하여 단편화에 의해 접근가능한 표면적을 증가시킨다(Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl . Microbiol . Biotechnol. 59:618-628; 미국 특허출원 제20020164730호).
H2SO4 또는 SO2(전형적으로 0.3 내지 3% w/w)와 같은 촉매를 스팀 전처리 전에 가하며, 이것은 시간 및 온도를 낮추고, 회수율을 증가시키고, 효소 가수분해를 개선한다(Ballesteros et al, 2006, Appl . Biochem . Biotechnol. 129-132:496-508; Varga et al, 2004, Appl . Biochem . Biotechnol. 113-116:509-523; Sassner et al, 2006, Enzyme Microb . Technol. 39:756-762).
화학적 전처리: 용어 "화학적 전처리"는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및/또는 리그닌의 분리 및/또는 방출을 촉진하는 어떤 화학적 전처리를 의미한다. 적합한 화학적 전처리 과정의 예는, 예컨대 희석 산 전처리, 석회 전처리, 습식 산화, 암모니아 섬유/동결 폭발(AFEX), 암모니아 침출(APR) 및 오르가노솔브 전처리를 포함한다.
희석 산 전처리에서는 셀룰로오스-함유 물질을 희석 산, 통상 H2SO4 및 물과 혼합하여 슬러리를 형성하고, 스팀에 의해 원하는 온도로 가열하고, 체류 시간 후 대기압으로 플래싱한다. 희석 산 전처리는 다수의 반응기 디자인, 예를 들어 관류형 반응기, 역류 반응기 또는 연속 역류 수축층 반응기를 사용하여 수행할 수 있다 (Duff and Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv . Biochem . Eng . Biotechnol. 65:93-115).
알칼리성 조건에서 몇 가지 전처리 방법이 사용될 수 있다. 이러한 알칼리성 전처리는 석회 전처리, 습식 산화, 암모니아 침출(APR), 및 암모니아 섬유/동결 폭발(AFEX)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
석회 전처리는 탄산칼슘, 수산화나트륨 또는 암모니아를 사용하여 85-150℃의 저온 및 1시간 내지 수 일의 체류 시간에서 수행된다(Wyman et al., 2005, Bio -resource Technol. 96:1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900 및 WO 2006/110901에 암모니아를 사용한 전처리 방법이 개시된다.
습식 산화는 통상 180-200℃에서 5-15분 동안 과산화수소 또는 과압의 산소와 같은 산화제를 첨가하여 수행되는 열적 전처리이다(Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64:139-151; Palonen et al., 2004, Appl . Biochem . Biote -chnol. 117:1-17; Varga et al ., 2004, Biotechnol . Bioeng. 88:567-74; Martin et al., 2006, J. Chem . Technol . Biotechnol. 81:1669-1677). 이 전처리는 바람직하게는 1-40 건조 물질%, 더 바람직하게는 2-30 건조 물질%, 가장 바람직하게는 5-20 건조 물질%에서 수행되며, 대체로 탄산나트륨과 같은 알칼리를 첨가하여 초기 pH를 증가시킨다.
습식 폭발(습식 산화와 스팀 폭발의 조합)로서 알려진 습식 산화 전처리 방법의 변형은 최대 30%의 건조 물질을 취급할 수 있다. 습식 폭발에서는 일정한 체류 시간 후 전처리 동안 산화제가 도입된다. 그 다음 대기압으로의 플래싱에 의해 전처리가 종료된다(WO 2006/032282).
암모니아 섬유 폭발(AFEX)은 90-100℃와 같은 중간 온도 및 17-20bar와 같은 고압에서 5-10분 동안 액체 또는 가스 암모니아로 셀룰로오스-함유 물질을 처리하는 것을 포함하며, 이 경우 건조 물질 함량이 60% 정도로 높다(Gollapalli et al., 2002, Appl . Biochem . Biotechnol. 98:23-35; Chundawat et al, 2007, Biotechnol . Bioeng. 96:219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl . Biochem . Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96:2014-2018).
오르가노솔브 전처리는 160-200℃에서 30-60분 동안 수성 에탄올(40-60% 에탄올)을 사용하여 추출에 의해 셀룰로오스-함유 물질을 처리한다(Pan et al, 2005, Biotechnol. Bioeng. 90:473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol . Bioeng. 94:851-861; Kurabi et al., 2005, Appl . Biochem . Biotechnol. 121:219-230). 일반적으로 황산이 촉매로서 첨가된다. 오르가노솔브 전처리에서는 헤미셀룰로오스의 대부분이 제거된다.
적합한 전처리 방법의 다른 예가 Schell et al., 2003, Appl . Biochem . and Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85, 및 Mosier et al., 2005, Bioresource Tech -nology 96:673-686, 및 미국 공개 특허 제2002/0164730호에 설명된다.
한 양태에서, 화학적 전처리는 바람직하게 산 처리이며, 더 바람직하게는 연속 희석 산 및/또는 약산 처리로서 수행된다. 산은 전형적으로 황산이지만, 아세트산, 시트르산, 질산, 인산, 타르타르산, 숙신산, 염산 또는 이들의 혼합물과 같은 다른 산도 사용될 수 있다. 약산 처리는 바람직하게는 1-5, 더 바람직하게는 1-4, 가장 바람직하게는 1-3의 pH 범위에서 수행된다. 한 양태에서, 산 농도는 바람직하게는 0.01 내지 20wt% 산, 더 바람직하게는 0.05 내지 10wt% 산, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5wt% 산, 가장 바람직하게는 0.2 내지 2.0wt% 산의 범위이다. 산을 셀룰로오스-함유 물질과 접촉시키고, 예컨대 160-220℃, 바람직하게는 165-195℃ 범위의 온도에서, 수초 내지 수분 범위의 시간 동안, 예컨대 1초 내지 60분 동안 유지한다.
또 다른 양태에서, 전처리는 암모니아 섬유 폭발 단계(AFEX 전처리 단계)로서 수행된다.
또 다른 양태에서, 전처리는 수성 슬러리에서 수행된다. 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질은 전처리 동안 바람직하게는 10-80wt%, 더 바람직하게는 20-70wt%, 가장 바람직하게는 30-60wt%, 예를 들어 약 50wt%의 양으로 존재한다. 전처리된 셀룰로오스-함유 물질은 본 분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여, 예를 들어 물을 사용하여 세정될 수 있거나, 또는 세정되지 않을 수도 있다.
기계적 전처리: 용어 "기계적 전처리"는 다양한 타입의 그라인딩 또는 밀링을 말한다(예컨대, 건식 밀링, 습식 밀링 또는 진동 볼 밀링).
물리적 전처리: 용어 "물리적 전처리"는 셀룰로오스-함유 물질로부터 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및/또는 리그닌의 분리 및/또는 방출을 촉진하는 어떤 전처리를 의미한다. 예를 들어, 물리적 전처리는 조사(예컨대, 마이크로파 조사), 스팀처리/스팀 폭발, 수소화열분해 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
물리적 전처리는 고압 및/또는 고온을 수반할 수 있다(스팀 폭발). 한 양태에서, 고압은 바람직하게는 약 300 내지 약 600psi, 더 바람직하게는 약 350 내지 약 550psi, 가장 바람직하게는 약 400 내지 약 500psi, 예를 들어 약 450psi 범위의 압력을 의미한다. 다른 양태에서, 고온은 약 100 내지 약 300℃, 바람직하게는 약 140 내지 약 235℃ 범위의 온도를 의미한다. 바람직한 양태에서, 기계적 전처리는 상기 정의한 고압 및 고온을 사용하는 배치-공정, 스팀 건 가수분해기 시스템, 예를 들어 Sunds Defibrator AB(Swedend)로부터 입수가능한 Sunds Hydrolyzer에서 수행된다.
물리적 및 화학적 전처리 조합: 셀룰로오스-함유 물질은 물리적으로 그리고 화학적으로 모두 전처리될 수 있다. 예를 들어, 전처리 단계는 희석 산 또는 약산 처리와 고온 및/또는 고압 처리를 포함할 수 있다. 물리화학적 전처리는 원하는 바에 따라서 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 또한, 기계적 전처리도 포함될 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에서, 기계적, 화학적 또는 물리적 전처리, 또는 이들의 어떤 조합을 셀룰로오스-함유 물질에 실시하여 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및/또는 리그닌의 분리 및/또는 방출을 촉진한다.
생물학적 전처리: 용어 "생물학적 전처리"는 셀룰로오스-함유 물질로부터 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및/또는 리그닌의 분리 및/또는 방출을 촉진하는 어떤 생물학적 전처리를 의미한다. 생물학적 전처리 기술은 리그닌-가용화 미생물의 적용을 포함할 수 있다(예를 들어, Hsu, T.-A.. 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization , Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulo-sic biomass, Adv . Appl . Microbiol. 39:295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretre-ating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong C.S., Cao N.J., Du J., and Tsao, G.T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65:207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18:312-331; 및 Vallander and Erik-sson 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv . Biochem . Eng ./ Biotechnol. 42:63-95 참조).
당화
당화라고도 하는 가수분해 단계에서는 전처리된 셀룰로오스-함유 물질을 가수분해하여 셀룰로오스 및 또는 헤미셀룰로오스도 글루코오스, 자일로오스, 자일룰로오스, 아라비노오스, 말토오스, 만노오스, 갈락토오스 및/또는 가용성 올리고당 같은 발효가능한 당으로 분해한다. 가수분해는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 본 발명의 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물을 사용하여 효소적으로 수행된다. 또한, 조성물의 효소 성분은 순차적으로 첨가될 수도 있다.
효소 가수분해는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 조건에서 적합한 수성 환경 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 가수분해는 효소(들)의 활성에 적합한 조건, 즉 효소(들)에 최적인 조건에서 수행된다. 가수분해는 배치식 또는 연속식 공정으로서 수행될 수 있으며, 이 경우 전처리된 셀룰로오스-함유 물질(기질)이, 예를 들면 효소 함유 가수분해 용액에 점진적으로 공급된다.
당화는 일반적으로 제어된 pH, 온도 및 혼합 조건에서 교반-탱크 반응기 또는 발효기에서 수행된다. 적합한 공정 시간, 온도 및 pH 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들면, 당화는 최대 200시간 지속될 수 있지만, 전형적으로 바람직하게 약 12 내지 약 96시간, 더 바람직하게는 약 16 내지 약 72시간, 가장 바람직하게는 약 24 내지 약 48시간 동안 수행된다. 온도는 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 70℃, 더 바람직하게는 약 3O℃ 내지 약 65℃, 더 바람직하게는 약 40℃ 내지 60℃, 특히 약 50℃의 범위이다. pH는 바람직하게 약 3 내지 약 8, 더 바람직하게는 약 3.5 내지 약 7, 가장 바람직하게는 약 4 내지 약 6, 특히 약 pH 5의 범위이다. 건조 고형분 함량은 바람직하게는 약 5 내지 약 50wt%, 더 바람직하게는 약 10 내지 약 40wt%, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 30wt%의 범위이다.
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 효소 및 폴리펩티드의 최적량은, 제한되지는 않지만, 셀룰로오스 가수분해 단백질의 성분, 셀룰로오스성 기질, 셀룰로오스성 기질의 농도, 셀룰로오스성 기질의 전처리(들), 시간, pH, 및 포함된 발효 미생물(예컨대, 동시적 당화 및 발효를 위한 효모)을 포함하는 다수의 요인들에 의존한다.
바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질에 대한 셀룰로오스 가수분해 단백질(들)의 유효량은 셀룰로오스-함유 물질 1g 당 약 0.5 내지 약 50mg, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 40mg, 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 25mg, 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 20mg, 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 15mg, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10mg, 가장 바람직하게는 약 2.5 내지 약 10mg이다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질에 대한 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드의 유효량은 셀룰로오스-함유 물질 1g 당 약 0.5 내지 약 50mg, 바람직하게 약 0.5 내지 약 40mg, 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 25mg, 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 20mg, 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 15mg, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10mg, 가장 바람직하게는 약 2.5 내지 약 10mg이다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스-함유 물질에 대한 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드(들)의 유효량은 셀룰로오스-함유 물질 1g 당 약 0.01 내지 약 50.0mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 40mg, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 약 30mg, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 약 20mg, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10mg, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 약 5mg, 더 바람직하게는 약 0.025 내지 약 1.5mg, 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 1.25 mg, 더 바람직하게 약 0.075 내지 약 1.25 mg, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1.25mg, 더욱 바람직하게는 약 0.15 내지 약 1.25mg, 가장 바람직하게는 약 0.25 내지 약 1.0mg이다.
다른 바람직한 양태에서, 셀룰로오스 가수분해 단백질(들)에 대한 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 폴리펩티드(들)의 유효량은 셀룰로오스 가수분해 단백질(들) 1g 당 약 0.005 내지 약 1.0g, 바람직하게 약 0.01 내지 약 1.0g, 더 바람직하게는 약 0.15 내지 약 0.75g, 더 바람직하게는 약 0.15 내지 약 0.5g, 더 바람직하게 약 0.1 내지 약 0.5g, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.5g, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.2g이다.
발효
전처리 및 가수분해된 셀룰로오스-함유 물질로부터 얻어진 발효가능한 당은 이 당을 직접 또는 간접적으로 원하는 발효 산물로 발효시킬 수 있는 하나 이상의 발효 미생물에 의해서 배양될 수 있다. "발효" 또는 "발효 과정"은 어떤 발효 과정 또는 발효 단계를 포함하는 어떤 과정을 말한다. 또한, 발효 과정은 바이오연료 산업, 소비 알콜 산업(예컨대, 맥주 및 와인), 낙농 산업(예컨대, 발효 유제품), 가죽 산업 및 담배 산업에 사용되는 발효 과정을 포함한다. 발효 조건은 원하는 발효 산물 및 발효 유기체에 따라서 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
발효 단계에서, 전처리 및 효소 가수분해 단계의 결과로서 셀룰로오스-함유 물질로부터 방출된 당이 효모와 같은 발효 유기체에 의해서 산물, 예컨대 에탄올로 발효된다. 가수분해(당화) 및 발효는 개별적 또는 동시적일 수 있다. 이러한 방법은 분리된 가수분해 및 발효(SHF), 동시적 당화 및 발효(SSF), 동시적 당화 및 공발효(SSCF), 혼성 가수분해 및 발효(HHF), SHCF(분리된 가수분해 및 공발효), HHCF (혼성 가수분해 및 발효), 및 직접 미생물 전환(DMC)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명을 실시하는데 있어서, 어떤 적합한 가수분해된 셀룰로오스-함유 물질을 발효 단계에 사용할 수 있다. 본 분야에 공지된 대로, 이 물질은 일반적으로 원하는 발효 산물, 즉 발효로부터 얻어지는 물질, 및 사용된 과정에 기초하여 선택된다.
용어 "발효 배지"는 발효 미생물(들)이 첨가되기 전의 배지, 예를 들어 당화 과정에서 생긴 배지뿐만 아니라, 예를 들어 동시적 당화 및 발효 과정(SSF)에서 사용되는 배지를 말하는 것으로 본원에서 이해된다.
"발효 미생물"은 발효 산물을 생산할 수 있는 원하는 발효 과정에 사용하기에 적합한 박테리아 및 진균 유기체를 포함하는 어떤 미생물을 말한다. 발효 유기체는 C6 및/또는 C5 발효 유기체, 또는 이들의 조합일 수 있다. C6 및 C5 발효 유기체는 모두 본 분야에 잘 공지되어 있다. 적합한 발효 미생물은 당, 예를 들어 글루코오스, 자일로오스, 자일룰로오스, 아라비노오스, 말토오스, 만노오스, 갈락토오스 또는 올리고당을 원하는 발효 산물로 직접 또는 간접적으로 발효, 즉 전환할 수 있다.
에탄올을 생산하는 박테리아 및 진균 발효 유기체의 예가 Lin et al., 2006, Appl. Microbiol . Botechnol. 69:627-642에 설명된다.
C6 당을 발효시킬 수 있는 발효 미생물의 예는 박테리아 및 진균 유기체, 예를 들어 효모를 포함한다. 바람직한 효모는 Saccharomyces spp .의 균주, 바람직하게는 Sacch - aromyces cerevisiae를 포함한다.
C5 당을 발효시킬 수 있는 발효 유기체의 예는 박테리아 및 진균 유기체, 예를 들어 효모를 포함한다. 바람직한 C5 배양 효모는 Pichia의 균주, 바람직하게는 Pichia stipitis CBS 5773와 같은 Pichia stipitis; Candida의 균주, 바람직하게는 Candida boidinii , Candida brassicae , Candida sheatae , Candida diddensii , Candida pseudotropicalis, 또는 Candida utilis를 포함한다.
다른 발효 유기체는 Zymomonas mobilis와 같은 Zymomonas의 균주; Hansenula anomala와 같은 Hansenula의 균주; K. fragilis와 같은 Klyveromyces의 균주; S. pombe와 같은 Schizosaccharomyces의 균주; 및 E. coli의 균주, 특히 에탄올의 수율이 증가하도록 유전자 조작된 E. coli 균주를 포함한다.
바람직한 양태에서, 효모는 Saccharomyces spp .이다. 더 바람직한 양태에서, 효모는 Saccharomyces cerevisiae이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Sacch -aromyces distaticus이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Saccharomyces uva -rum이다. 다른 바람직한 양태에서, 효모는 Kluyveromyces이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Kluyveromyces marxlanus이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Kluyveromyces fragilis이다. 다른 바람직한 양태에서, 효모는 Candida이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Candida boidinii이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Candida brassicae이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Candida diddensii이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Candida pseudotroplcalis이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Candida utilis이다. 다른 바람직한 양태에서, 효모는 Clavispora이다. 또 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Clavispora lusitaniae이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Clavispora opuntiae이다. 다른 바람직한 양태에서, 효모는 Pachysolen이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Pachysolen tannophilus이다. 다른 바람직한 양태에서, 효모는 Pichia이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Pichia stipitis이다. 다른 바람직한 양태에서, 효모는 Bretannomyces이다. 또 다른 더 바람직한 양태에서, 효모는 Bretannomyces clausenii이다(Philippidis, G. P., 1996, Cellulose byconversion technology, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).
헥소오스 및 펜토오스를 에탄올로 효과적으로 발효시키는 박테리아는, 예컨대 Zymomonas mobilis 및 Clostridium thermocellum을 포함한다(Philippidis 1996, supra).
바람직한 양태에서, 박테리아는 Zymomonas이다. 더 바람직한 양태에서, 박테리아는 Zymomonas mobilis이다. 다른 바람직한 양태에서, 박테리아는 Clostridium이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 박테리아는 Clostridium thermocellum이다.
에탄올 제조에 적합한 시판 효모는, 예컨대 ETHANOL RED™ 효모(Fermentis/ Lesaffre, USA로부터 입수가능), FALI™(Fleischmann's Yeast, USA로부터 입수가능), SUPERSTART™ 및 THERMOSACC™ 프레쉬 효모(Ethanol Technology, WI, USA로부터 입수가능), BIOFERM™ AFT 및 XR(NABC-North American Byproducts Corporation, GA, USA로부터 입수가능), GERT STRAND™(Gert Strand AB, Sweden로부터 입수가능), 및 FERMIOL™(DSM Specialties로부터 입수가능)을 포함한다.
바람직한 양태에서, 발효 미생물은 자일로오스 활용, 아라비노오스 활용, 및 자일로오스와 아라비노오스 동시-활용 미생물과 같은 펜토스 당을 발효시키는 능력을 제공하도록 유전자 조작된다.
다양한 발효 미생물로의 이종 유전자의 클로닝은 헥소오스 및 펜토오스를 에탄올로 전환(공발효)할 수 있는 유기체를 구성한다(Chen and Ho, 1993, Saccharo -myces cerevisiae에서 Pichia stipitis 자일로스 리덕타아제 유전자의 발현의 클로닝 및 개선, Appl . Biochem . Biotechnol. 39-40:135-147; Ho et al., 1998, 글루코오스 및 자일로오스를 효과적으로 공배양할 수 있는 유전자 조작된 Saccharomyces 효모, Appl . Environ . Microbiol . 64:1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Sacc -haromyces cerevisiae에 의한 자일로오스 발효, Appl . Microbiol . Biotechnol . 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, 펜토오스 포스페이트 경로 효소 트랜스케톨라아제 및 트랜스알도라아제를 암호화하는 TKL1 및 TAL1 유전자를 과발현하는 자일로오스-대사 Saccharomyces cerevisiae 균주, Appl . Environ . Microbiol. 61:4184-4190; Kuyper et al., 2004, 효과적인 혐기 자일로오스 발효를 위한 Saccharomyces cerevisiae의 최소 대사 공학: 원리의 증거, FEMS Yeast Research 4:655-64; Beall et al., 1991, 재조합 Escherichia coli에 의한 자일로스 및 다른 당으로부터 에탄올 생산의 모수 연구, Biotech . Bioeng . 38:296-303; Ingram et al.. 1998, 에탄올 생산을 위한 박테리아의 대사 공학, Biotechnol . Bioeng. 58:204-214; Zhang et al., 1995, 에탄올 생산 Zymomonas mobilis에서 펜토오스 대사 경로의 대사 공학, Science 267:240-243; Deanda et al., 1996, 대사 경로 공학에 의한 아라비노오스-발효 Zymomonas mobilis 균주의 개발, Appl . Environ . Microbiol. 62:4465-4470).
바람직한 양태에서, 유전자 조작 발효 미생물은 Saccharomyces cerevisiae이다. 다른 바람직한 양태에서, 유전자 조작 발효 미생물은 Zymomonas mobilis이다. 다른 바람직한 양태에서, 유전자 조작 발효 미생물은 Escherichia coli이다. 다른 바람직한 양태에서, 유전자 조작 발효 미생물은 Klebsiella oxytoca이다.
발효 미생물(들)은 전형적으로 분해된 셀룰로오스 또는 가수분해물에 첨가되며, 발효는 약 8 내지 약 96시간, 예컨대 약 24 내지 약 60시간 동안 수행된다. 온도는 전형적으로 약 26℃ 내지 약 60℃, 특히 약 32℃ 또는 50℃이고, pH는 약 pH 3 내지 약 pH 8, 예컨대 약 pH 4-5, 6 또는 7이다.
바람직한 양태에서, 발효 미생물(들)은 분해된 셀룰로오스 또는 가수분해물에 적용되며, 발효는 약 12 내지 약 96시간, 예컨대 통상적으로 24-60시간 동안 수행된다. 바람직한 양태에서, 온도는 바람직하게 약 2O℃ 내지 약 6O℃, 더 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 5O℃, 가장 바람직하게는 약 32℃ 내지 약 5O℃, 특히 약 32℃ 또는 5O℃이고, pH는 일반적으로 약 pH 3 내지 약 pH 7, 바람직하게는 약 pH 4-7이다. 그러나, 일부 유기체, 예컨대 박테리아 발효 유기체는 더 높은 발효 온도 최적 조건을 가진다. 발효 미생물(들)은 발효 육즙 1ml 당 대략 105 내지 1012, 바람직하게는 대략 107 내지 1010, 특히 대략 2 x 108 생육성 세포 수의 양으로 적용되는 것이 바람직하다. 발효를 위해 효모를 사용하는 것에 관한 추가의 지침은, 예컨대, "The Alcohol Textbook"(Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D. R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999)에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 참고자료로서 포함된다.
에탄올 제조를 위해서는 발효 후에 발효된 슬러리를 증류하여 에탄올을 추출한다. 본 발명의 방법에 따라서 얻어진 에탄올은, 예컨대 연료 에탄올, 음용 에탄올, 즉 음용 중성 주정, 또는 산업용 에탄올로 사용될 수 있다.
본원에 설명된 효소 과정 중 어느 것과 조합하여 발효 시뮬레이터가 사용될 수 있으며, 이로써 발효 과정, 특히, 발효 미생물의 성능, 예컨대 증진 속도 및 에탄올 수율이 추가로 개선될 수 있다. "발효 시뮬레이터"는 발효 미생물, 특히 효모의 성장에 대한 시뮬레이터를 말한다. 성장에 대한 바람직한 발효 시뮬레이터는 비타민 및 미네랄을 포함한다. 비타민의 예는 멀티비타민, 바이오틴, 판토테인산염, 니코틴산, 메소-이노시톨, 티아민, 피리독신, 파라-아미노벤조산, 폴산, 리보플라빈, 및 비타민 A, B, C, D, 및 E를 포함한다. 예컨대, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag(2002)를 참조하며, 이것은 본원에 참고자료로서 포함된다. 미네랄의 예는 P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, 및 Cu를 포함하는 양분을 공급할 수 있는 미네랄 및 미네랄 염을 포함한다.
발효 산물
발효 산물은 발효로부터 유래된 어떤 물질일 수 있다. 발효 산물은, 제한되지는 않지만, 알콜(예컨대, 아라비니톨, 부탄올, 에탄올, 글리세롤, 메탄올, 1,3-프로판디올, 소르비톨 및 자일리톨); 유기산(예컨대, 아세트산, 아세톤산, 아디프산, 아스코르브산, 시트르산, 2,5-디케토-D-글루콘산, 포름산, 글루카르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루타르산, 3-히드록시프로피온산, 이타콘산, 락트산, 말산, 말론산, 옥살산, 프로피온산, 숙신산 및 자일론산); 케톤(예컨대, 아세톤); 알데히드 (예컨대, 포름알데히드); 아미노산(예컨대 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 리신, 세린 및 트레오닌); 및 가스(예컨대, 메탄, 수소(H2), 이산화탄소(CO2) 및 일산화탄소(CO))일 수 있다. 또한, 발효 산물은 고부가가치 산물인 단백질일 수 있다.
바람직한 양태에서, 발효 산물은 알콜이다. 용어 "알콜"은 하나 이상의 히드록실 부분을 함유하는 물질을 포괄하는 것으로 이해된다. 더욱 바람직한 양태에서, 알콜은 아라비니톨이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 부탄올이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 에탄올이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 글리세롤이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 메탄올이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 1,3-프로판디올이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 소르비톨이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알콜은 자일리톨이다. 예를 들어, Gong C.S., Cao N. J., Du J., and Tsao G. T., 1999, Ethanol production from renewable resour-ces, in Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology , Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65:207-241; Silveira, M. M., and Jonas R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl . Microbiol . Biotechnol. 59:400-408; Nigam P., and Singh D., 1995, Processes for fermenta-tive production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30(2): 117-124; Ezeji, T. C, Qureshi, N. and Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckli BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6):595-603를 참조한다.
다른 바람직한 양태에서, 발효 산물은 유기산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 아세트산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 아세톤산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 아디프산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 아스코르브산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 시트르산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 2,5-디케토-D-글루콘산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 포름산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 푸마르산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 글루카르산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 글루콘산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 글루쿠론산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 글루타르산이다. 다른 바람직한 양태에서, 유기산은 3-히드록시프로피온산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 이타콘산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 락트산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 말산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 말론산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 옥살산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 프로피온산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 숙신산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 자일론산이다. 예를 들어, Chen R., and Lee Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid produ-ction from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65:435-448를 참조한다.
다른 바람직한 양태에서, 발효 산물은 케톤이다. 용어 "케톤"은 하나 이상의 케톤 부분을 함유하는 물질을 포괄하는 것으로 이해된다. 다른 더 바람직한 양태에서, 케톤은 아세톤이다. 예를 들어, Qureshi and Blaschek, 2003, supra를 참조한다.
다른 바람직한 양태에서, 발효 산물은 알데히드이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 알데히드는 포름알데히드이다.
다른 바람직한 양태에서, 발효 산물은 아미노산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 유기산은 아스파르트산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 아미노산은 글루탐산이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 아미노산은 글리신이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 아미노산은 리신이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 아미노산은 세린이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 아미노산은 트레오닌이다. 예를 들어, Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechn -ology and Bioengineering 87(4):501-515를 참조한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 발효 산물은 가스이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가스는 메탄이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가스는 수소이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가스는 이산화탄소이다. 다른 더 바람직한 양태에서, 가스는 일산화탄소이다. 예를 들어, Kataoka, N., A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing an-aerobic bacteria, Water Science and Technology 36(6-7):41-47; 및 Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy , Vol. 13(1-2), p. 83-114, 1997, Anaerobic dige-stion of biomass for methane production: A review를 참조한다.
회수
발효 산물(들)은, 제한되지는 않지만 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동법(예컨대, 예비 등전집속), 용해도차(예컨대, 황산암모늄 침전), 증류 또는 추출을 포함하는 본 분야에 알려진 어떤 방법을 사용하여 발효 배지로부터 선택적으로 회수될 수 있다. 예컨대, 에탄올은 발효된 셀룰로오스-함유 물질로부터 분리되어 종래의 증류 방법에 의해서 정제된다. 순도가 최대 약 96vol.%인 에탄올을 얻을 수 있으며, 이것은 예컨대 연료 에탄올, 음용 에탄올, 즉 음료 중성 주정 또는 산업용 에탄올로서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 추가로 설명되나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
재료
버퍼 및 기질로서 사용하는 화학물질은 최소한 시약 등급의 시판 제품이다.
DNA 시퀀싱
염료 터미네이터 화학을 사용하는 Applied Biosystems Model 3130X 유전자 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 DNA 시퀀싱을 수행하였다(Giesecke et al., 1992, Journal of Virol . Methods 38:47-60). 서열 특이적 프라이머를 가진 phred/phrap/consed(University of Washington, Seattle, WA, USA)을 사용하여 서열을 조립하였다.
배지
NNCYP 배지는 리터당 5.0g NH4NO3, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.3g CaCl2, 2.5g 시트르산, 1.0g 박토 펩톤, 5.0g 효모 추출물, COVE 미량금속 용액, 및 약 5.4의 최종 pH를 달성하기에 충분한 K2HPO4로 이루어졌다.
COVE 미량금속 용액은 리터당 0.04g Na2B4O7·10H2O, 0.4g CuSO4·5H2O, 1.2g FeSO4·7H2O, 0.7g MnSO4·H2O, 0.8g Na2MoO2·2H2O, 및 10g ZnSO4·7H2O로 이루어졌 다.
YP 배지는 리터당 10g 효모 추출물 및 20g 박토 트립톤으로 이루어졌다.
셀룰라아제-유도 배지는 리터당 20g 셀룰로오스, 10g 콘 스티프(corn steep) 고형분, 1.45g (NH4)2SO4, 2.08g KH2PO4, 0.28g CaCl2, 0.42g MgSO4·7H2O, 및 0.42ml 미량금속 용액으로 이루어졌다.
미량금속 용액은 리터당 216g FeCl3·6H2O, 58g ZnSO4·7H2O, 27g MnSO4·H2O, 10g CuSO4·5H2O, 2.4g H3BO3, 및 336g 시트르산으로 이루어졌다.
STC는 1M 소르비톨, 10mM CaCl2, 및 10mM Tris-HCl, pH 7.5로 이루어졌다.
COVE 플레이트는 리터당 342g 수크로스, 10ml COVE 염 용액, 10ml 1M 아세트아미드, 10ml 1.5M CsCl, 및 25g Noble 한천으로 이루어졌다.
COVE 염 용액은 리터당 26g KCl, 26g MgSO4, 76g KH2PO4, 및 50ml COVE 미량금속 용액으로 이루어졌다.
COVE2 플레이트는 리터당 30g 수크로스, 20ml COVE 염 용액, 25g Noble 한천 및 10ml 1M 아세트아미드로 이루어졌다.
PDA 플레이트는 리터당 39g 감자 덱스트로스 한천으로 이루어졌다.
LB 배지는 리터당 10g 트립톤, 5g 효모 추출물, 5g 염화나트륨으로 이루어졌다.
2X YT-Amp 플레이트는 리터당 10g 트립톤, 5g 효모 추출물, 5g 염화나트륨 및 15g 박토 한천으로 이루어지며, 오토클레이빙 후 50mg/ml 암피실린의 필터-멸균 용액 2ml가 뒤따른다.
MDU2BP 배지는 리터당 45g 말토스, 1g MgSO4·7H2O, 1g NaCl, 2g K2HSO4, 12g KH2PO4, 2g 우레아 및 500μl AMG 미량 금속 용액으로 이루어지며, pH를 5.0로 조정하고, 이어서 0.22μm 여과 유닛으로 필터 멸균하였다.
AMG 미량금속 용액은 리터당 3g 시트르산, 14.3g ZnSO4·7H2O, 2.5g CuSO4·5H2O, 0.5g NiCl2·6H2O, 13.8g FeSO4·H2O, 및 8.5g MnSO4·7H2O로 이루어졌다
최소배지 플레이트는 리터당 6g NaNO3, 0.52 KCl, 1.52g KH2PO4, 1ml COVE 미량금속 용액, 20g Noble 한천, 20ml 50% 글루코스, 2.5ml 20% MgSO4·7H2O, 및 20ml 비오틴 스톡 용액으로 이루어졌다.
비오틴 스톡 용액은 리터당 0.2g 비오틴으로 이루어졌다.
SOC 배지는 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 0.5% 효모 추출물, 및 2% 트립톤으로 이루어졌고, 오토클레이빙 후 20mM까지의 여과-멸균 글루코오스가 뒤따른다.
실시예 1: pMJ04 발현 벡터의 구성
하기 나타낸 바와 같이 프라이머 993429(안티센스) 및 993428(센스)를 사용하여 Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA로부터 Trichoderma reesei 엑소셀로비오히드롤라아제 1 유전자(cbh1, CEL7A) 터미네이터를 PCR 증폭시켜 발현 벡터 pMJ04 을 구성했다. 안티센스 프라이머는 센스 프라이머의 5'-말단에 Pac I 부위를 가지고, 3'-말단에 Spe I 부위를 가지도록 조작되었다.
프라이머 993429(안티센스):
5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3' (SEQ ID NO:29)
프라이머 993428(센스):
5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3' (SEQ ID NO:30)
Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA를 DNEASY? 플랜트 맥시 키트(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하여 분리하였다.
1X ThermoPol 반응 버퍼(New England Biolabs. Beverly, MA, USA), 0.3mM dNTPs, 100ng Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA, 0.3μM 프라이머 993429, 0.3μM 프라이머 993428, 및 2 유닛의 Vent DNA 폴리머라아제(New England Biolabs, Beverly, MA1 USA)로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안 각각 5 사이클, 이어서 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 25 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333(Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA)에서 반응물을 인큐베이션했다(5분 최종 확장). 40mM Tris 염기-20mM 아세트산 나트륨-1mM 이나트륨 EDTA(TAE) 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 반응 산물을 분리하였는데, 229bp 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트(QIAGEN Inc., Val-encia, CA, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
얻어진 PCR 단편을 Pac I과 SpeI로 분해하고, Rapid 라이게이션 키트(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 동일한 제한 효소로 분해된 pAILo1과 라이게이션하여(WO 05/067531) pMJ04를 만들었다(도 1).
실시예 2: pCaHj568 의 구성
pCaHj170(미국특허 제5,763,254호) 및 pMT2188로부터 플라스미드 pCaHj568을 구성했다. 플라스미드 pCaHj170는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V(CEL45A) 전장 암호화 영역(SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 암호화)을 포함한다. 하기 나타낸 프라이머 142779 및 142780을 사용하여 pCaHj483(WO 98/00529)로부터 pUC19 복제 기원을 PCR 증폭함으로써 pMT2188의 구성을 시작하였다. 프라이머 142780는 PCR 단편에 Bbu I 부위를 도입한다. .
프라이머 142779:
5'-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3' (SEQ ID NO:33)
프라이머 142780:
5'-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3' (SEQ ID NO:34)
EXPAND? PCR 시스템(Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland)을 제조자의 지시에 따라 증폭에 사용했다. PCR 산물을 아가로오스 겔 상에서 분리하고, Jetquick 겔 추출 스핀 키트(Genomed, Wielandstr, Germany)를 사용하여 1160 bp 단편을 분리하고 정제하였다.
EXPAND? PCR 시스템을 사용하여 하기에 나타낸 프라이머 140288 및 142778를 사용하여 일반적인 Saccharomyces cerevisiae 클로닝 벡터 pYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로부터 URA3 유전자를 증폭하였다. 프라이머 140288은 PCR 단편 에 Eco Rl 부위를 도입하였다.
프라이머 140288:
5'-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3' (SEQ ID NO:35)
프라이머 142778:
5'-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3'(SEQ ID NO:36)
PCR 산물을 아가로오스 겔 상에서 분리하고, Jetquick 겔 추출 스핀 키트를 사용하여 1126bp 단편을 분리하고 정제하였다.
오버랩 스플라이싱법에 의해 하기에 나타낸 142780 및 140288 프라이머를 사용하여 혼합 및 증폭함으로써 두 PCR 단편을 융합했다(Horton et al., 1989, Gene 77:61-68). PCR 산물을 아가로오스 겔 상에서 분리하고, Jetquick 겔 추출 스핀 키트를 사용하여 2263bp 단편을 분리하고 정제하였다.
얻어진 단편을 Eco Rl 및 Bbu I으로 분해하고, 표준 프로토콜을 사용하여 동일한 제한 효소로 분해된 pCaHj483의 최대 단편과 라이게이션했다. 라이게이션 혼합물을 Mandel and Higa, 1970, J. Mol . Biol. 45:154의 방법에 의해 컴페턴트 제조된 pyrF-음성 E. coli 균주 DB6507(ATCC 35673)로 형질전환하였다. 리터당 1g 카사미노산, 500μg 티아민 및 10mg 카나마이신 보충된 고형분 M9 배지(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 상에서 형질전환주를 선택하였다. 한 형질전환주로부터 플라스미드를 분리하여 pCaHj527로 칭하였다(도 2).
pCaHj527 상에 존재하는 NA2-tpi 프로모터에 EXPAND? PCR 시스템을 사용하 여 제조자의 지시에 따라 PCR에 의해 부위-지정 돌연변이를 실시하였다. 하기 나타낸 돌연변이유발 프라이머 141223을 사용하여 뉴클레오티드 134-144가 GTACTAAAACC (SEQ ID NO:37)에서 CCGTTAAATTT(SEQ ID NO:38)로 전환되었다.
프라이머 141223:
5'-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3' (SEQ ID NO:39)
하기 나타낸 돌연변이유발 프라이머 141222를 사용하여 뉴클레오티드 423-436가 ATGCAATTTAAACT(SEQ ID NO:40)에서 CGGCAATTTAACGG(SEQ ID NO:41)로 전환되었다.
프라이머 141222:
5'-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3' (SEQ ID NO:42)
얻어진 플라스미드를 pMT2188로 칭하였다(도 3).
Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 암호화 영역을 Bam HI-Sal I 단편인 pCaHj170로부터 Bam HI 및 Xho I로 분해되는 pMT2188으로 전달하여 pCaHj568을 만들었다(도 4). 플라스미드 pCaHj568는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 전장 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 돌연변이 NA2-tpi 프로모터를 포함한다.
실시예 3: pMJO5 의 구성
하기 나타낸 프라이머 HiEGV-F 및 HiEGV-R를 사용하여 pCaHj568로부터 915bp Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 전장 암호화 영역을 PCR 증폭하여 플라스미드 pMJ05를 구성하였다.
프라이머 HiEGV-F(센스):
5'-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' (SEQ ID NO:43)
프라이머 HiEGV-R(안티센스):
5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (SEQ ID NO:44)
1X ThermoPol 반응 버퍼(New England Biolabs, Beverly, MA, USA), 0.3mM dNTPs, 10ng/μl pCaHj568, 0.3μM HiEGV-F 프라이머, 0.3μM HiEGV-R 프라이머 및 2 유닛 Vent DNA 폴리머라아제(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안 각각 5 사이클, 이어서 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 25 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(5분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 937bp 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
937bp 정제된 단편을 하기 프라이머와 함께 후속 증폭을 위한 주형 DNA로서 사용하였다:
프라이머 HiEGV-R(안티센스):
5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'(SEQ ID NO:45)
프라이머 HiEGV-F-오버랩(센스):
5'-ACCGCGGACTGCGCATC ATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' (SEQ ID NO:46)
이탤릭체의 프라이머 서열은 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자(cbh1)(WO 91/17243)의 프로머터의 17bp과 상동성이고, 밑줄친 프라이머 서열 은 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 암호화 영역의 29bp와 상동성이다. 프로모터와 암호화 서열 간의 36bp 오버랩은 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 암호화 영역을 포함하는 918bp 단편에 Trichoderma reesei cbM 프로모터를 포함하는 994bp 단편을 정확하게 융합시켰다.
증폭 반응물(50μl)은 1X ThermoPol 반응 버퍼, 0.3mM dNTPs, 10μl 정제된 937bp PCR 단편, 0.3μM HiEGV-F-오버랩 프라이머, 0.3μM HiEGV-R 프라이머 및 2 유닛 Vent DNA 폴리머라아제로 이루어졌다. 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안 각각 5 사이클, 이어서 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 25 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(5분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 945bp 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
하기 나타낸 프라이머를 사용해 별도의 PCR을 수행하여 Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA로부터 유전자의 ATG 개시 코돈 상류의 994bp로부터 확장된 Trich -oderma reesei cbh1 프로모터 서열을 증폭하였다(센스 프라이머는 5'-말단에 Sal I 제한 부위를 가지도록 조작되었다). Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA를 DNEASY? DNeasy 플랜트 맥시 키트를 사용하여 분리하였다.
프라이머 TrCBHIpro-F(센스):
5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (SEQ ID NO:47)
프라이머 TrCBHIpro-R(안티센스):
5'-GATGCGCAGTCCGCGGT-3' (SEQ ID NO:48)
1X ThermoPol 반응 버퍼, 0.3mM dNTPs, 10ng/μl Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA, 0.3μM HiEGV-F-오버랩 프라이머, 0.3μM TrCBHIpro-FHiEGV-R 프라이머 및 2 유닛 Vent DNA 폴리머라아제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 반응물을 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 50 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 인큐베이션했다(5분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 998 bp 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
정제된 998bp PCR 단편을 하기 나타낸 프라이머를 사용하는 후속 증폭을 위한 주형 DNA로서 사용하였다.
프라이머 TrCBHIpro-F:
5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (SEQ ID NO:49)
프라이머 TrCBHIpro-R-오버랩:
5'-GGAGGGGGGAGGAACGCAT GATGCGCAGTCCGCGGT-3' (SEQ ID NO:50)
이탤릭체의 프라이머 서열은 Trichoderma reeseicbh1 프로모터의 17bp과 상동성이고, 밑줄친 프라이머 서열은 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 암호화 영역의 29bp와 상동성이다. 프로모터와 암호화 서열 간의 36bp 오버랩은 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 전장 암호화 영역을 포함하는 918bp 단편에 Tricho-derma reesei cbh1 프로모터를 포함하는 994bp 단편을 정확히 융합시켰다.
1X ThermoPol 반응 버퍼, 0.3mM dNTPs, 1μl 정제된 998pb PCR 단편, 0.3μM TrCBH1pro-F 프라이머, 0.3μM TrCBH1pro-R-오버랩 프라이머, 및 2 유닛 Vent DNA 폴리머라제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안 각각 50 사이클, 이어서 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 25 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(5분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 1017bp 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
1017bp Trichoderma reesei cbh1 프로모터 PCR 단편 및 945bp Humicola ins -olens 엔도글루카나아제 V PCR 단편을 하기 프라이머를 사용하는 후속 증폭을 위한 주형 DNA로서 사용하여 994bp cbM 프로모터를 918bp 엔도글루카나아제 V 전장 암호화 영역에 오버래핑 PCR을 사용하여 정확하게 융합하였다.
프라이머 TrCBHIpro-F:
5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (SEQ ID NO:51)
프라이머 HiEGV-R:
5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (SEQ ID NO:52)
1X ThermoPol 반응 버퍼, 0.3mM dNTPs, 0.3μM TrCBH1pro-F 프라이머, 0.3μM HiEGV-R 프라이머 및 2 유닛 Vent DNA 폴리머라제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안 각각 5 사이클, 이어서 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 25 사이클로 프 로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(5분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 1926bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
ZEROBLUNT? TOPO? PCR 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 얻어진 1926bp 단편을 pCR?-Blunt-II-TOPO? 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA1 USA)로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 Not I와 Sal I로 분해하고, 1926bp 단편을 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 겔 정제하고, T4 DNA 리가아제(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여, 동일한 두 제한 효소로 분해된 pMJ04과 라이게이션하여 pMJ05를 만들었다(도 5). 플라스미드 pMJ05는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 전장 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.
실시예 4: pSMai130 발현 벡터의 구성
Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 전장 암호화 서열(cDNA 서열에 대해 SEQ ID NO:15, 추론된 아미노산 서열에 대해 SEQ ID NO:16; E. coli DSM 14240)의 ATG 개시 코돈부터 TAA 종결 코돈에 걸친 2586bp DNA 단편을 주형인 pJaL660(WO 2002/095014)로부터 하기 나타낸 프라이머 993467(센스) 및 993456(안티센스)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. Spe I 부위를 안티센스 프라이머의 5' 말단에서 조작하여 라이게이션을 용이하게 하였다. 이탤릭체의 프라이머 서열은 Trichoderma reeseicbh1 프로모터의 24bp과 상동성이고, 밑줄친 서열은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 암호화 영역의 22bp와 상동성이다.
프라이머 993467:
5'-ATAGTCAACCGCGGCTGCGCATC ATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3' (SEQ ID NO:53)
프라이머 993456:
5'-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (SEQ ID NO:54)
증폭 반응물(50μl)은 Pfx 증폭 버퍼(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.25 mM dNTPs, 10ng pJaL660, 6.4μM 프라이머 993467, 3.2μM 프라이머 993456, 1mM MgCl2 및 2.5유닛의 Pfx DNA 폴리머라제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 이루어졌다. 반응물을 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 3분 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 인큐베이션했다(15분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 2586bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
하기 나타낸 프라이머 993453(센스) 및 프라이머 993463(안티센스)을 사용해 별도의 PCR을 수행하여 유전자의 ATG 개시 코돈 상류의 1000bp로부터 확장된 Tri-choderma reeseicbh1 프로모터 서열을 증폭하여 1000bp PCR 단편을 발생시켰다.
프라이머 993453:
5'-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3' (SEQ ID NO:55)
프라이머 993463:
5'- CCTCGATCCAACCAAGCTTCAT GATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3' (SEQ ID NO:56)
이탤릭체의 프라이머 서열은 Trichoderma reeseicbh1 프로모터의 24bp와 상동성이고, 밑줄친 프라이머 서열은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 전장 암호화 영역의 22bp와 상동성이다. 프로모터와 암호화 서열 간의 46bp 오버랩은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 암호화 영역을 포함하는 2586bp 단편에 Trichoderma reesei cbh1 프로모터를 포함하는 1000bp 단편을 정확히 융합시켰다.
Pfx 증폭 버퍼, 0.25mM dNTPs, 100ng Trichoderma reesei RutC30 게놈 DNA, 6.4μM 프라이머 993453, 3.2μM 프라이머 993463, 1mM MgCl2, 및 2.5 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 3분 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(15분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 1000bp 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
정제된 단편을 상기 나타낸 프라이머 993453(센스) 및 프라이머 993456(안티센스)을 사용하는 PCR 오버래핑에 의한 후속 증폭을 위한 주형 DNA로서 사용하여 Trichoderma reeseicbh1 프로모터를 포함하는 1000bp 단편을 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 전장 암호화 영역을 포함하는 2586bp 단편에 정확하게 융합시켰다.
Pfx 증폭 버퍼, 0.25mM dNTPs, 1mM MgCl2, 6.4μM 프라이머 99353, 3.2μM 프라이머 993456, 및 2.5 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 4분 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(15분 최종 확장).
얻어진 3586bp 단편을 Sal I와 Spe I로 분해하고, 동일한 두 제한 효소로 분해된 pMJ04과 라이게이션하여 pSMai130을 만들었다(도 6). 플라스미드 pSMai130은 Aspergillus oryzae 천연 베타-글루코시다아제 신호 서열 및 암호화 서열(즉, 전장 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 암호화 서열)에 작동가능하게 연결된 Tr -ichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.
실시예 5: pSMai135 의 구성
Lys-20에서부터 TAA 종결 코돈까지의 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 성숙 암호화 영역(천연 신호 서열 없음, 도 7 참조; 신호 펩티드 및 그것의 암호화 서열에 대해 SEQ ID NO:57 및 58)을 주형인 pJaL660로부터 하기 나타낸 프라이머 993728(센스) 및 프라이머 993727(안티센스)을 사용하여 PCR 증폭하였다.
프라이머 993728:
5'-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCC AAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3' (SEQ ID NO:59)
프라이머 993727:
5'-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (SEQ ID NO:60)
이탤릭체의 서열은 Humicofa insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열의 20bp와 상동성이고, 밑줄친 서열은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 암호화 영역의 22bp와 상동성이다. Spe I 부위를 안티센스 프라이머의 5' 말단에서 조작하였다.
증폭 반응물(50μl)은 Pfx 증폭 버퍼, 0.25mM dNTPs, 10ng/μl pJaL660, 6.4μM 프라이머 993728, 3.2μM 프라이머 993727, 1mM MgCl2, 및 2.5 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 이루어졌다. 반응물을 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 3분 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 인큐베이션했다(15분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 2523bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
하기 나타낸 프라이머 993724(센스) 및 프라이머 993729(안티센스)를 사용해 별도의 PCR 증폭을 수행하여 Trichoderma reesei cbh1 프로모터의 1000bp 및 Humi -cola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열의 63bp(Ala-21에 대한 ATG 개시 코돈, 도 8, SEQ ID NO:61 및 62)를 증폭하였다.
프라이머 993724:
5'-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3' (SEQ ID NO:63)
프라이머 993729:
5'-GGGAGTACGCGAGATCATCCTT GGCAAGGGCCAACACCGGCA-3' (SEQ ID NO:64)
이탤릭체의 프라이머 서열은 Humicofa insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열의 20bp와 상동성이고, 밑줄친 서열은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 암호화 영역의 22bp와 상동성이다.
cbh1 프로모터의 제어하에 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 암호화 영역을 포함하는 플라스미드 pMJO5를 주형으로 사용하여 Trichoderma reesei cbh1 프로모터 및 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열 단편을 포함하는 1063 bp 단편을 발생시켰다. 오버랩의 42bp가 Trichoderma reesei cbh1 프로모터와 Hum -icola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 성숙 암호화 서열 간에 공유되어 2523bp의 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 암호화 영역의 프로모터와 ATG 개시 코돈 간에 완전한 결합을 제공하였다.
증폭 반응물(50μl)은 Pfx 증폭 버퍼, 0.25mM dNTPs, 10ng/μl pMJ05, 6.4μM 프라이머 993728, 3.2μM 프라이머 993727, 1mM MgCl2, 및 2.5 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 이루어졌다. 반응물을 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 4분 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 인큐베이션했다(15분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 1063bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
정제된 오버래핑 단편을 증폭을 위한 주형으로서 사용하고, 상기 설명한 프라이머 993724(센스)와 프라이머 993727(안티센스)를 사용하여 Trichoderma reesei cbh1 프로모터 및 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열을 포함하는 1063bp 단편을 PCR 오버래핑에 의해 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 성숙한 암호화 영역 프레임을 포함하는 2523bp 단편에 정확하게 융합시켰다.
Pfx 증폭 버퍼, 0.25mM dNTPs, 1mM MgCl2, 6.4μM 프라이머 993724, 3.2μM 프라이머 993727, 및 2.5 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 4분 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다(15분 최종 확장). 반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 3591bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
얻어진 3591bp 단편을 Sal I와 Spe I로 분해하고, 동일한 제한 효소로 분해된 pMJ04와 라이게이션하여 pSMai135을 만들었다(도 9). 플라스미드 pSMai135는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 성숙한 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.
실시예 6: Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 분비 신호를 갖는 Asper - gillus oryzae 베타- 글루코시다아제의 발현
Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 분비 신호에 연결된 성숙한 Aspergi-llus oryzae 베타-글루코시다아제를 암호화하는 플라스미드 pSMai135(도 8)를 PEG-매개 형질전환에 의해 Trichoderma reesei RutC30에 도입하였다(Penttila et al., 1987, Gene 61:155-164). 플라스미드는 Aspergillus nidulansamdS 유전자를 함유했으며, 이로써 형질전환주가 단일 질소원인 아세트아미드 상에서 성장할 수 있었다.
Trichoderma reesei RutC30을 27℃ 및 90rpm에서 2%(w/v) 글루코스 및 10 mM 유리딘 보충된 25ml YP 배지에서 17시간 동안 배양했다. 진공 유도 분배 여과 시스템(Vacuum Driven Disposable Filtration System)(Millipore, Bedford, MA1 USA)을 사용하여 여과에 의해 균사체를 수집하고, 탈이온수로 2회 1.2M 소르비톨로 2회 세정하였다. 세정한 균사체를 1ml 당 15mg GLUCANEX?(Novozymes AJS, Bagsvasrd, Denmark) 및 1ml 당 0.36 유닛 키티나제(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 함유하는 20ml 1.2M 소르비톨에 현탁하고, 15-25분 동안 34℃에서 90rpm로 가볍게 쉐이킹하면서 인큐베이션하여 원형질체를 발생시켰다. 400x g에서 7분 동안 원심분리하여 원형질체를 수집하고, 차가운 1.2M 소르비톨로 2회 세정하였다. 혈구측정기를 사용하여 원형질체를 계수하고, STC에 1ml 당 최종 농도 1X 108 원형질체로 재현탁하였다. 남은 원형질체는 Cryo 1℃ 냉동용기(Nalgene, Rochester, NY, USA)에 -80℃에서 저장하였다.
Pme I로 분해된 pSMai135 약 7μg을 100μl 원형질체 용액에 첨가하고, 가볍게 혼합한 후 260μl PEG 버퍼를 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 다음에, STC(3ml)을 첨가하여 혼합하고, Aspergillus nidulans amdS 선택을 사용하는 COVE 플레이트 위에 형질전환 용액을 평판하였다. 플레이트를 28℃에서 5-7일 동안 인큐베이션했다. 형질전환주를 COVE2 플레이트 위에 계대-배양하고, 28℃에서 성장시켰다.
pSMai135를 사용하여 얻어진 SMA135로 칭해진 67개의 형질전환주를 아세트아미드를 함유하는 신선한 플레이트 위에 계대-배양하고, 7일 동안 28℃에서 포자형성하였다.
67개의 SMA135 Trichoderma reesei 형질전환주를 pH 6.0에서 형질전환주 포자를 접종한 25ml 셀룰라아제-유도 배지를 함유하는 125ml의 배플 쉐이크 플라스크에서 배양하고, 28℃ 및 200rpm에서 7일 동안 인큐베이션했다. Trichoderma reesei RutC30는 대조군으로서 수행하였다. 배양 육즙 샘플을 7일째에 제거하였다. 각 배양 육즙 1ml를 15,700x g에서 5분 동안 마이크로-원심분리기에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 효소 분석시까지 샘플을 4℃에 보관하였다. 기질로서 p-니트로페닐-베타-D-글루코피라노시드를 사용하여 하기 설명한 바와 같이 상청액을 베타-글루코시다아제 활성에 대하여 분석하였다.
50mM 숙시네이트 pH 5.0 중에서 기질로서 0.5mg/ml p-니트로페닐-베타-D-글루코피라노시드의 200μl 중에서, 50mM 숙시네이트 pH 5.0에 1:10으로 희석된 배양 상청액의 25μl 분액을 사용하여 주위 온도에서 베타-글루코시다아제 활성을 측정 하였다. 15분 인큐베이션 후, 100μl 1M Tris-HCl pH 8.0을 첨가하여 반응을 정지시키고, 405nm에서 분광광도계로 흡광도를 판독하였다. 베타-글루코시다아제 활성의 1 유닛은 분당 리터당 pH 5.0, 주변 온도에서 1μmol p-니트로페닐의 생산에 해당하였다. Aspergillus niger 베타-글루코시다아제(NOVOZYM™ 188, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)를 효소 표준으로서 사용하였다.
다수의 SMA135 형질전환주가 Trichoderma reesei RutC30에 비하여 몇 배 더 높은 베타-글루코시다아제 활성을 야기했다. 선별된 SMA135 형질전환주 중에서 형질전환주 SMA135-04가 가장 높은 베타-글루코시다아제 활성을 야기했다.
CRITERION? 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 CRITERION? Tris-HCl (5% 용해) 겔(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 제7일의 상청액(상기 참조) 5μl를 2X 농도의 Laemmli 샘플 버퍼(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 현탁하고, 5% 베타-메르캅토에탄올의 존재하에서 3분 동안 가열하였다. 상청액 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 러닝 버퍼로서 1X Tris/글리신/SDS(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 얻어진 겔을 BIO-SAFE? 쿠마시 색소(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 염색하였다.
전체적으로 38개의 Trichoderma reesei SMA135 형질전환주 중에서 26개가 대조군인 Trichoderma reesei Rut30에서는 볼 수 없었던 약 110kDa의 단백질을 생산하였다. 형질전환주 Trichoderma reesei SMA135-04가 가장 높은 수준의 베타-글루코시다아제를 생산하였다.
실시예 7: 발현 벡터 pSMai140 의 구성
Nco I로 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 전장 암호화 영역(SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 암호화하는 SEQ ID NO:25)을 보유하는 플라스미드 pSATe111BG41을 분해하여 발현 벡터 pSMai140을 구성하였다(WO 04/099228). 얻어진 1243bp 단편을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하고, QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
발현 벡터 pSMai135를 Nco I로 분해하고 8286bp 단편을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하고, QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. 다음에, 1243bp Nco I 분해된 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 단편을 T4 DNA 리가아제(Roche, Indiana-polis, IN, USA)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 8286bp 벡터 단편과 라이게이션하여 발현 벡터 pSMai140를 만들었다(도 10). 플라스미드 pSMai140는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 성숙 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A) 유전자 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.
실시예 8: pSMai140 을 사용한 Trichoderma reesei RutC30 의 형질전환
Pme I을 사용하여 플라스미드 pSMai140을 선형화하고, 실시예 6에 설명된 대로 Trichoderma reesei RutC30 균주로 형질전환하였다. 4회의 독립적 형질전환 실험에서 총 100개의 형질전환주를 얻었으며, 이들 모두를 쉐이크 플라스크에서 셀룰라아제-유도 배지 상에서 배양했고, 실시예 6에 설명된 대로 베타-글루코시다아제 활성을 형질전환주의 배양 배지로부터 측정하였다. 다수의 Trichoderma reesei SMA 140 형질전환주가 Trichoderma reesei RutC30에 비하여 몇 배 더 높은 베타-글루코시다아제 활성을 나타냈다.
효소 활성이 분석된 13개의 동일한 배양 상청액으로부터의 실시예 6에 설명된 바와 같은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 쿠마시 염색에 의해서 배양 배지 중의 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 단백질의 존재를 검출하였다. 13개 형질전환주가 모두 높은 베타-글루코시다아제 활성을 가졌으며, 또한 대략 110KDa Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41를 다양한 수율로 발현하였다.
베타-글루코시다아제 활성 분석 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 평가한 바에 따르면, 가장 높은 베타-글루코시다아제 변이체 발현 형질전환주를 Trichoderma reesei SMA140-43로 칭하였다.
실시예 9: 발현 벡터 pSaMe -F1의 구성
209bp의 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터 및 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 유전자의 코어 영역(SEQ ID NO:31의 뉴클레오티드 1 내지 702, SEQ ID NO:32의 아미노산 1 내지 234를 암호화; WO 91/17243)을 함유하는 DNA 단편을 주형인 pMJO5 및 하기 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
프라이머 995103:
5'-cccaagcttagccaagaaca-3' (SEQ ID NO:65)
프라이머 995137:
5'-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3' (SEQ ID NO:66)
증폭 반응물(50μl)은 1X Pfx 증폭 버퍼, 10mM dNTPs, 50mM MgSO4, 10ng/μl pMJ05, 50피코몰 995103 프라이머, 50피코몰 995137 프라이머 및 2 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 이루어졌다. 반응물을 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 60초 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 인큐베이션했다(3분 최종 확장).
반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 911bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
806bp Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 유전자를 함유하는 DNA 단편을 주형인 pSMai140 및 하기 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
프라이머 995133:
5'-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3' (SEQ ID NO:67)
프라이머 995111:
5'-ccaagcttgttcagagtttc-3' (SEQ ID NO:68)
1X Pfx 증폭 버퍼, 10mM dNTPs, 50mM MgSO4, 50 피코몰 995103 프라이머, 50 피코몰 995111 프라이머, 100ng pSMai140 및 2 유닛의 Pfx DNA 폴리머라제로 증폭 반응물(50μl)이 이루어졌다. 반응물을 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 120초 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 인큐베이션했다(3분 최종 확장).
반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 806bp 산물 밴드를 겔로부터 제거하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
다음에, 상기 두 PCR 단편의 오버래핑 PCR 수행하였다. 정제된 오버래핑 단편을 주형으로서 사용하고, 상기 설명된 프라이머 995103(센스)와 프라이머 995111 (안티센스)를 사용하여, 오버래핑 PCR에 의해 209bp Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터 및 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어 서열을 포함하는 702bp 단편을 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 암호화 영역의 일부를 포함하는 806bp 단편에 정확하게 융합하였다.
증폭 반응물(50μl)은 1X Pfx 증폭 버퍼, 10mM dNTPs, 50mM MgSO4, 2.5μl의 각 단편(20ng/μl), 50 피코몰 995103 프라이머, 50 피코몰 995111 프라이머 및 2 유닛의 고충실도 Pfx DNA 폴리머라제로 이루어졌다. 95℃에서 3분의 초기 변성, 이어서 변성 1분, 60℃에서 아닐링 1분 및 72℃에서 3분 확장으로 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333에서 반응물을 인큐베이션했다.
반응 산물을 TAE 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였는데, 1.7kb 산물 밴드를 겔로부터 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
1.7kb 단편을 pCR?4 Blunt 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 제조자의 지시에 따라 라이게이션하였다. 다음에, 이 구조체를 ONE SHOT? TOP10 화학적으로 컴페턴트인 E. coli 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 제조자의 신속한 화학적 형질전환 과정에 따라 형질전환하였다. 콜로니를 선별하고, 플라스미드 분리 및Hind III를 사용한 분해에 의해 분석하여 1.7kb 오버래핑 PCR 단편을 방출하였다.
또한, 플라스미드 pSMai140를 Hind III로 분해하여 플라스미드를 선형화하였다. 두 분해된 단편을 DNA 라이게이션 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 라이게이션 반응으로 조합하여 pSaMe-F1를 만들었다(도 11).
E coli XL1-블루 서브클로닝-등급 컴페턴트 세포(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 라이게이션 산물로 형질전환하였다. 구조체의 동일성을 형질전환된 E coli로부터 정제된 플라스미드로부터의 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터, Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열, Humicola inso -lens 엔도글루카나아제 V 코어, Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 및 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 터미네이터 서열의 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 재조합 플라스미드를 함유하는 한 클론을 pSaMe-F1으로 칭하였다. 플라스미드 pSaMe-F1는 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터 및 터미네이터, 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 성숙 암호화 서열에 직접 연결된 Humicola insolens 엔도글루카나아제V 신호 펩티드에 직접 융합된 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어 폴리펩티드에 직접 연결된 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 펩티드 서열을 포함한다. Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG 융합 단백질을 도 12A, 12B, 12C, 및 12D(각각 SEQ ID NO:25 및 26)에 나타낸다.
실시예 10: pSaMe -F1을 사용한 Trichoderma reesei RutC30 의 형질전환
2% 글루코스 및 10mM 유리딘이 보충된 YP 배지 25ml를 함유하는 쉐이크 플라스크를 Trichoderma reesei RutC30의 5X 107 포자로 접종하였다. 27℃, 90rpm에서 대략 16시간 동안 밤새 인큐베이션한 후, 균사체를 진공 유도 분배 여과 시스템을 사용하여 수집하였다. 균사체를 100ml 탈이온수에서 2회 그리고 1.2M 소르비톨에서 2회 세정하였다. 실시예 6에 설명한 바와 같이 원형질체를 발생시켰다.
Pme I로 선형화된 pSaMe-F1 DNA 2마이크로그램, 100μl Trichoderma reesei RutC30 원형질체 및 50% PEG(4000)을 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 다음에, 3ml STC를 첨가하고, 내용물을 10mM 유리딘 보충된 COVE 플레이트 위에 부었다. 계속해서, 플레이트를 28℃에서 인큐베이션했다. 제6일에 형질전환주가 보이기 시작했고, COVE2 플레이트에 선별하여 28℃에서 6일 동안 성장시켰다. 22개의 Trichoderma reesei 형질전환주를 회수하였다.
형질전환주를 쉐이크 플라스크에서 셀룰라아제-유도 배지 상에서 배양했고, 실시예 6에 설명된 대로 베타-글루코시다아제 활성을 측정하였다. 다수의 pSaMe-F1 형질전환주가 베타-글루코시다아제 활성을 야기했다. Trichoderma reesei SaMeFI-9 로 칭해진 한 형질전환주가 가장 높은 양의 베타-글루코시다아제를 생성하였으며, 이것은 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체를 발현하는 균주의 활성의 두배였다(실시예 9).
Beguin(1983, Analytical Biochem. 131(2):333-336)에 따라서 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC) 오버레이 분석을 사용하여 엔도글루카나아제 활성을 분석했다. 5개의 육즙 샘플(가장 높은 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 것들)로부터 총 단백질 5μg을 Native Sample Buffer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 중에 희석하고, 10X Tris/글리신 러닝 버퍼(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 CRITERION? 8-16% Tris-HCl 겔(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 상에서 러닝한 다음, 겔을 1% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 함유하는 플레이트의 맨 위에 놓았다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 겔을 0.1% 콩고 레드로 20분 동안 염색하였다. 다음에, 플레이트를 1M NaCl을 사용하여 탈색시켜 엔도글루카나아제 활성을 분명히 나타내는 영역을 확인하였다. 2개의 명확한 구역을 볼 수 있는데, 상부 구역의 약 110kDa와 하부 구역의 약 25kDa이다. Humicola insolens 엔도글루카나아제 V와 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 융합의 예상되는 단백질 크기는, 두 단백질이 절단되지 않고 단일 폴리펩티드로서 남아있는 경우 118kDa이다. 각 엔도글루카나아제 V 코어 도메인의 글리코실화 및 베타-글루코시다아제의 글리코실화는 1차 서열로부터 예상되는 것보다 더 높은 mw에서 각 단백질의 이동을 유발한다. 두 단백질이 절단될 경우에는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어 도메인의 예상 크기는 24kDa, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41의 예상 크기는 94kDa 이다. 110kDa에 명백한 구역이 존재했으므로, 이 결과는 최소한 엔도글루카나아제와 베타-글루코시다아제 융합 단백질의 집단이 하나의 큰 단백질로서 온전히 남는다는 것을 나타냈다. 하부의 명백한 구역은 내인성 엔도글루카나아제 활성을 나타내는 것 같은데, 아마도 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제로부터 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어 도메인의 부분 절단으로 인한 추가적인 결과일 수 있다.
이 결과는 Humicola insolens 엔도글루카나아제V 코어는 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제에 연결되었다 해도 활성이었음을 입증했다. 또한, 베타-글루코시다아제 활성의 증가는 비-융합 베타-글루코시다아제의 분비 효율에 비해 증가된 단백질 분비로 인한 결과인 것으로 보였다. Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 서열을 효과적으로 분비된 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어에 연결함으로써 베타-글루코시다아제가 더 많이 분비되었다.
실시예 11: 벡터 pSaMe - FX 의 구성
pSaMe-F1을 변형시켜 플라스미드 pSaMe-FX를 구성하였다. 플라스미드 pSaMe-F1을 Bst Z17 및 Eco R1로 분해하여 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 암호화 서열을 함유하는 1kb 단편 및 플라스미드의 나머지를 함유하는 9.2kb 단편을 발생시켰다. TAE 버퍼를 사용하는 1.0% 아가로스 겔 전기영동에 의해 단편을 분리하고, 9.2 kb 단편을 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. 또, 플라스미드 pSMai135도 Bst Z17 및 Eco R1로 분해하여 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 암호화 서열과 상동인 염기를 함유하는 1kb 단편 및 플라스미드의 나머지를 함유하는 8.5kb 단편을 발생시켰다. 1kb 단편을 상기와 같이 분리하고 정제하였다.
9.2kb 및 1kb 단편을 Rapid DNA 라이게이션 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 라이게이션 반응에서 조합하여 pSaMe-FX를 만들었으며, 이것은 변이체 성숙 암호화 서열보다는 야생형 베타-글루코시다아제 성숙 암호화 서열을 함유한다는 것을 제외하고 pSaMe-F1과 동일하다.
E. coli SURE? 컴페턴트 세포(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 라이게이션 산물로 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli로부터 정제된 플라스미드의 DNA 시퀀싱에 의해 구성물의 정체를 확인하였으며, 이것은 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 프로모터, Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열, Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어 서열, Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열, Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 성숙 암호화 서열 및 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I 유전자 터미네이터 서열의 존재를 입증하였다. 재조합 플라스미드를 함유하는 한 클론을 pSaMe-FX로 칭하였다(도 12). Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질의 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 도 14A, 14B, 14C 및 14C에 나타낸다(각각 SEQ ID NO:27 및 28).
실시예 12: Trichoderma 형질전환주의 형질전환 및 발현
pSaMe-FX 구조체를 실시예 10에 설명된 대로 Pme I로 선형화하고, Trichod -erma reesei RutC30 균주로 형질전환하였다. 총 63개의 형질전환주를 한 번의 형질전환에서 얻었다. 쉐이크 플라스크에서 셀룰라아제-유도 배지 상에서 형질전환주를 배양하고, 실시예 6에 설명된 대로 베타-글루코시다아제 활성을 측정하였다. 다수의 pSaMe-FX 형질전환주가 베타-글루코시다아제 활성을 야기했다. SaMe-FX16로 칭해진 한 형질전환주는 Trichoderma reesei SaMeF 1-9에 비하여 2배 양의 베타-글루코시다아제 활성을 야기했다(실시예 10).
실시예 13: Trichoderma reesei 형질전환주의 분석
Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어(자신의 자생 신호 서열을 함유)를 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열에 연결된 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 성숙 암호화 서열과 융합함으로써 실시예 9에 설명된 대로 융합 단백질을 구성하였다. 이 융합 구조체는 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열에 연결된 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 성숙 암호화 서열에 비해 베타-글루코시다아제 활성 분비가 2배 증가하였다. Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 신호 서열에 연결된 Aspergillus oryzae 야생형 베타-글루코시다아제 암호화 서열과 융합된 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어(자신의 신호 서열 함유)로 구성된 제 2 융합 구조체를 실시예 11에 설명된 대로 제조하였으며, 이것은 베타-글루코시다아제 활성을 더욱더 개선시켰다. 이 야생형 융합체로 형질전환된 균주는 베타-글루코시다아제 변이체 BG41 융합체로 형질전환된 균주에 비해 베타-글루코시다아제 활성 분비가 2배였다.
실시예 14: Aspergillus oryzae 발현 백터로 베타- 글루코시다아제 융합 단백질 암호화 서열의 클로닝
하기 나타낸 두 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하여 베타-글루코 시다아제 융합 단백질을 암호화하는 pSaMeFX로부터의 전장 오픈 리딩 프레임을 PCR 증폭하였다.
PCR 순방향 프라이머:
5'-GGACTGCGCAGCATGCGTTC-3' (SEQ ID NO:69)
PCR 역방향 프라이머:
5'-AGTTAATTAATTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (SEQ ID NO:70)
굵은 문자는 암호화 서열을 나타낸다. 순방향 프라이머의 밑줄친 "G"는 Sph I 제한 부위를 생성하도록 도입된 염기 변화를 나타낸다. 나머지 서열은 pSaMeFX의 삽입 부위와 비교하여 서열 동일성을 함유한다. 역방향 프라이머의 밑줄친 서열은 발현 벡터 pAILo2로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 첨가된 Pac I 제한 부위를 나타낸다(WO 04/099228).
상기 프라이머를 각각 50 피코몰씩 최종 부피 50μl 중에 50ng pSaMeFX DNA, 1X Pfx 증폭 버퍼, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 10mM 블렌드 6μl, 2.5 유닛의 PLATINUM? Pfx DNA 폴리머라제 및 50mM MgSO4 1μl을 함유하는 PCR 반응물에 사용했다. 98℃에서 2분 동안 1 사이클; 96℃에서 30초 동안, 61℃에서 30초 동안, 및 68℃에서 3분 동안 각각 35 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333을 사용하여 단편을 증폭하였다. 35 사이클 후, 반응물을 68℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 다음 처리시까지 10℃에서 냉각시켰다. 3.3kb PCR 반응 산물을 TAE 버퍼 및 1ml 당 0.1μg 에티듐 브로마이드를 사용한 0.8% GTG-아가로스 겔(Cambrex Bioproducts One Meadowlands Plaza East Rutherford, NJ, USA) 상에서 분리했다. DNA를 DARK READER™(Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA)을 사용하여 가시화하여 UV-유도 돌연변이를 회피하였다. 3.3kb DNA 밴드를 일회용 면도날로 절제하고, ULTRAFREE?-DA 스핀 컵(Miilipore, Billerica, MA, USA)으로 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
정제된 3.3kb PCR 산물을 pCR? 4Blunt-TOPO? 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 클로닝하였다. 4마이크로리터의 정제된 PCR 산물을 1μl의 2M 염화나트륨 용액 및 1μl의 TOPO? 벡터와 혼합하였다. 반응물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 2μl 반응물을 사용하여 One Shot? TOP10 화학적 컴페턴트 E. coli 세포를 제조자의 지시에 따라 형질전환하였다. 각 형질전환 반응물의 83μl씩의 3개 분획을 1ml 당 100μg 암피실린으로 보충된 3개의 150mm 2X YT 플레이트에 스프레드하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션했다.
8개 재조합 콜로니를 사용하여 1ml 당 100μg 암피실린으로 보충된 LB 배지 3ml를 함유하는 액체 배양액을 접종했다. BIOROBOT? 9600(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)을 사용하여 이들 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. Pac I로 제한 효소 분해에 의하여 클론을 분석하였다. 각 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 Pac I로 분해하고, TAE 버퍼를 사용하는 1.0% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 8개 클론 모두 예상된 제한 분해 패턴을 가졌으며, 클론 5, 6, 7 및 8을 선택해서 시퀀싱하여 클로닝된 삽입체에 돌연변이가 존재하지 않는다는 것을 확인하였다. 이들의 5' 및 3' 말단의 서열 분석은 4개 클론이 모두 정확한 서열을 가진다 는 것을 나타내었다. 클론 5 및 7를 선택하여 더 시퀀싱하였다. 두 클론을 40을 초과하는 Phred Q 값으로 시퀀싱하여 PCR 유도된 에러가 없다는 것을 확실히 하였다. 클론 5 및 7은 예상된 서열을 가지는 것으로 나타났고, 클론 5를 선택하여 pAILo2으로 재-클로닝하였다.
클론 5로부터의 플라스미드 DNA를 Sph I로 분해하여 선형화하였다. 다음에, 선형화된 클론에 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 10mM 블렌드 1.2μl 및 6 유닛의 T4 DNA 폴리머라제(New England Bioloabs, Inc., Ipswich, MA, USA)를 첨가하여 평활-말단화하였다. 혼합물을 12℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 1μl의 0.5M EDTA를 첨가하고 75℃에서 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화함으로써 반응을 중단시켰다. 베타-글루코시다아제 융합 단백질을 암호화하는 3.3kb 단편을 상기 설명된 대로 겔 전기영동 및 한외여과에 의해 정제하였다.
벡터 pAILo2를 Nco I로 분해하여 선형화하였다. 다음에, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 10mM 블렌드물 0.5μl 및 1 유닛의 DNA 폴리머라제 I을 첨가하여 선형화된 벡터를 평활-말단화하였다. 혼합물을 25℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 1μl의 0.5M EDTA를 첨가하고 75℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화함으로써 반응을 중단시켰다. 다음에, 벡터를 Pac I로 분해하였다. 평활-말단화된 벡터를 상기 설명된 대로 겔 전기영동 및 한외여과에 의해 정제하였다.
베타-글루코시다아제 융합 단백질을 암호화하는 3.3kb 단편의 선형화되고 정제된 pAILo2 벡터로의 클로닝을 Rapid 라이게이션 키트를 사용하여 수행하였다. 1μl의 반응 샘플을 사용하여 제조자의 지시에 따라 E. coli XL10 SOLOPACK? Gold 세포(Stratagene, La JoIIa, CA, USA)를 형질전환하였다. 회수 기간 후, 형질전환 반응으로부터의 두 100μl 분액을 1ml 당 100μg 암피실린으로 보충된 두 150mm 2X YT 플레이트에 평판하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 8개의 잠정적 재조합 클론 세트를 선별 플레이트로부터 무작위 선별하고, BIOROBOT? 9600을 사용하여 각각으로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. 클론 1-4를 선택하여 pAILo2-특이적 프라이머와 함께 시퀀싱하여 벡터/삽입체 접합부가 정확한 서열을 가졌음을 확인하였다. 클론 3은 완전한 벡터/삽입체 접합부를 가졌고, 이것을 pAILo47로 칭하였다(도 13).
마커-프리 발현 균주를 생성하기 위해, 제한효소 엔도뉴클레아제 분해를 행하여 발현 구조체의 나머지로부터 항생제인 암피실린에 대한 내성을 부여하는 blaA 유전자를 분리하였다. pAILo47 30마이크로그램을 Pme I로 분해하였다. 다음에, 분해된 DNA를 상기 설명된 대로 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 발현 구조체는 함유하고 blaA 유전자는 결핍된 6.4kb DNA 밴드를 면도날로 절제하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트로 정제하였다.
실시예 15: Aspergillus oryzae JaL355 에서 Humlcola Insolens / Asperglllus oryzae cel45Acore - cel3A 융합 유전자의 발현
Aspergillus oryzae JaL355(WO 00/240694) 원형질체를 Christensen et al, 1988, Bio / Technology 6:1419-1422의 방법에 따라서 제조하였다. 실시예 14의 정제된 발현 구조체 10마이크로리터를 사용하여 Aspergillus oryzae Jal355 원형질체를 형질전환하였다. Aspergillus oryzae JaL355의 형질전환은 대략 90개의 형질전환주 를 생성하였다. 50개의 형질전환주를 개별 PDA 플레이트에 분리하고, 5일 동안 34℃에서 인큐베이션했다.
48개의 컨플루언트 포자 플레이트를 3ml 0.01% TWEEN? 80으로 세정하고, 포자 현탁물을 사용하여 125ml 유리 쉐이크 플라스크 안의 25ml MDU2BP 배지를 접종하였다. 형질전환주 배양액을 34℃에서 200rpm로 일정하게 쉐이킹하면서 인큐베이션했다. 5일 후, 각 배양액의 1ml 분액을 12,000x g으로 원심분리하고 이들의 상청액을 수집하였다. 각 상청액 5μl을 동일한 부피의 2X 로딩 버퍼(10% 베타-메르캅토에탄올)와 혼합하고, 1.5mm 8%-16% Tris-글리신 SDS-PAGE 겔 위에 로딩하여 BIO-SAFE? 쿠마시 블루 G250 단백질 색소(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 염색하였다. 배양 육즙의 SDS-PAGE 프로파일은 48개 형질전환주 중 33개가 예상된 118kDa에 매우 근접한 겉보기 분자량을 갖는 새로운 단백질을 발현할 수 있었다는 것을 나타냈다. 형질전환주 21이 최고 수율을 야기했으며, 추후 연구를 위해 선택되었다.
실시예 16: Aspergillus oryzae JaL355 형질전환주 21의 단일 포자 분리
Aspergillus oryzae JaL355 형질전환주 21 포자를 PDA 플레이트 위에 스프레드하고 5일 동안 34℃에서 인큐베이션했다. 컨플루언트 포자 플레이트의 작은 면적을 0.5ml 0.01% TWEEN? 80으로 세정하여 포자를 재현탁하였다. 포자 현탁액 100μl 분액을 0.01% TWEEN? 80로 0.5ml 최종 농도로 희석하였다. 혈구측정기를 사용하여 포자 농도를 측정하고, 1마이크로리터 당 0.1 포자의 최종 농도로 희석하였다. 포자 희석액 200μl 분액을 150mm 최소 배지 플레이트에 스프레드하고 2-3일 동안 34℃에서 인큐베이션했다. 출현한 콜로니를 플레이트로부터 절제하여 PDA 플레이트 로 옮기고 3일 동안 34℃에서 인큐베이션했다. 다음에, 포자를 플레이트를 가로질러 스프레드하고 다시 5일 동안 34℃에서 인큐베이션했다.
컨플루언트 포자 플레이트를 3ml 0.01% TWEEN? 80으로 세정하고, 포자 현탁물을 사용하여 125ml 유리 쉐이크 플라스크 안의 25ml MDU2BP 배지를 접종하였다. 단일-포자 배양액을 34℃에서 200rpm로 일정하게 쉐이킹하면서 인큐베이션했다. 5일 후, 각 배양액 1ml 분액을 12,000x g으로 원심분리하고 이들의 상청액을 수집하였다. 각 상청액 5μl을 동일한 부피의 2X 로딩 버퍼(10% 베타-메르캅토에탄올)와 혼합하고, 1.5mm 8%-16% Tris-글리신 SDS-PAGE 겔 위에 로딩하여 BIO-SAFE? 쿠마시 블루 G250 단백질 색소로 염색하였다. 배양 육즙의 SDS-PAGE 프로파일은 8개 형질전환주가 모두 매우 높은 수준으로 베타-글루코사다아제 융합 단백질을 발현할 수 있었다는 것을 나타내었고, Aspergillus oryzae JaL355AlLo47로 칭해진 배양물 중 하나가 최고 수율을 나타냈다.
실시예 17: pCW087 의 구성
하기 나타낸 두 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하여 플라스미드 pDZA2-7로부터 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드 유전자를 PCR 증폭하였다(WO 2005/074656). 순방향 프라이머는 평활한 5' 말단으로 되고, 역방향 프라이머는 3' 말단에 Pac I 부위가 통합된다.
순방향 프라이머:
5'-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3' (SEQ ID NO:71)
역방향 프라이머:
5'-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3' (SEQ ID NO:72)
상기 프라이머를 각각 50피코몰씩 최종 부피 50㎕ 중에 50ng pDZA2-7, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 10mM 블렌드 1μl, 1OX ACCUTAQ™ DNA 폴리머라제 버퍼 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5μl, 및 5 유닛의 ACCUTAQ™ DNA 폴리머라제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO1 USA)로 구성된 PCR 반응물에 사용했다. 95℃에서 3분 동안 1 사이클; 94℃에서 45초 동안, 55℃에서 60초 동안, 및 72℃에서 1분 30초 동안 각각 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF? MASTERCYCLER? 5333을 사용하여 DNA 단편을 증폭하였다. 25 사이클 후, 반응물을 72℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 처리시까지 4℃에서 냉각시켰다. Thermoascus aurantiacus GH61A PCR 단편의 3' 말단을 Pac I을 사용하여 분해하였다. 분해 산물을 MINELUTE™ 반응 클린업 키트(QIAGEN Inc., Valencia, CA1 USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
평활한 Nco I 부위를 사용하여 5' 말단에서 그리고 Pac I 부위를 사용하여 3' 말단에서 GH61A 단편을 pSMai155으로 직접 클로닝하였다(WO 2005/074647). 플라스미드 pSMai155를 Nco I 및 Pac I로 분해하였다. 다음에, Nco I 부위를 Klenow 효소를 사용하여 평활하게 하여 5' 홈형 Nco I 부위를 채웠다. Klenow 반응물은 20μl pSma155 분해 반응 믹스 + 1mM dNTPs 및 1μl Klenow 효소로 구성되었으며, 이것을 실온에서 잠깐 인큐베이션했다. 새로 선형화된 pSMai155 플라스미드를 MINELUTE™ 반응 클린업 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. 이들 반응은 새롭게 발생된 GH61A 단편에 양립가능한 5' 평활 말단 및 3' Pac I 부위를 생성하 였다. 다음에, Rapid DNA 라이게이션 키트(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 GH61A 단편을 pSMai155 발현 벡터로 클로닝하였다. E. coli XL1-Blue 계대 배양-등급 컴페턴트 세포(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 라이게이션 산물로 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli로부터 정제된 플라스미드로부터의 GH61A 암호화 서열의 DNA 시퀀싱에 의해 구조체의 정체를 확인하였다. 재조합 플라스미드를 함유하는 한 E. coli 클론을 pCW087-8로 칭하였다.
실시예 18: pSaMe - Ta61A 의 구성
플라스미드 pMJ09를 분해하여 발현 벡터 pSaMe-Ta61을 구성하였는데(WO 2005 /056772), 이것은 Nsi I와 함께 amdS 선택성 마커를 숨기고 있으며, 이것은 2.7kb amdS 단편을 유리시켰다. 다음에, 2.7kb amdS 단편을 TAE 버퍼를 사용하는 1.0% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다.
발현 벡터 pCW087을 Nsi I로 분해한 다음, 4.7kb 단편을 TAE 버퍼를 사용하는 1.0% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 QIAQUICK? 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 다음에, T4 DNA 리가아제(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 2.7kb amdS 단편을 제조자의 프로토콜에 따라 4.7kb 벡터 단편과 라이게이션하여 발현 벡터 pSaMe-Ta61A를 생성하였다. 플라스미드 pSaMe-Ta61A는 Thermoascus aur -antiacus GH61A 성숙 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 Trichoderma reesei 셀로비오히드롤라아제 I(CEL7A) 유전자 프로모터 및 터미테이터를 포함한다.
실시예 19: Trichoderma reesei 균주 SaMe - MF268 의 구성
동시-형질전환에 의하여 플라스미드 pSaMe-FX와 pSaMe-Ta61A를 Trichoderma reesei RutC30에 도입하였다. 플라스미드 pSaMe-FX와 pSaMe-Ta61A를 PEG-매개 형질전환에 의하여 Trichoderma reesei RutC30에 도입하였다(Penttila et al., 1987, supra). 각 플라스미드는 Aspergillus nidulansamdS 유전자를 함유했으며, 이로써 형질전환주가 단일 질소원인 아세트아미드 상에서 성장할 수 있었다.
Trichoderma reesei RutC30를 27℃ 및 90rpm에서 2%(w/v) 글루코스 및 10mM 유리딘으로 보충된 25ml YP 배지에서 17시간 동안 배양하였다. 진공 유도 분배 여과 시스템을 사용하여 여과에 의해 균사체를 수집하고 탈이온수로 2회 그리고 1.2M 소르비톨로 2회 세정하였다. 세정한 균사체를 1ml 당 15mg GLUCANEX?(Novozymes A/S, Bagsvasrd, Denmark) 및 1ml 당 0.36 유닛의 키티나제(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 함유하는 20ml의 1.2M 소르비톨에 현탁하고, 15-25분 동안 34℃에서 90rpm로 가볍게 쉐이킹하면서 배양하여 원형질체를 발생시켰다. 원형질체를 7분 동안 400x g에서 원심분리하여 수집하고, 차가운 1.2M 소르비톨로 2회 세정하였다. 원형질체를 혈구측정기를 사용하여 계수하고, 1ml 당 1X 108 원형질체의 최종 농도로 STC에 재현탁하였다. 남은 원형질체는 Cryo 1℃ 냉동용기(Nalgene, Roc-hester, NY1 USA)에 -80℃에서 보관하였다.
대략 4μg의 각 플라스미드 pSaMe-FX 및 pSaMe-Ta61A을 Pme I로 분해하여 항생제 내성 마커, ampR의 제거를 용이하게 하였다. Pme I로 분해한 후에 선형 단편을 TAE 버퍼를 사용하는 1% 아가로스 겔 상에서 러닝하여 여러 단편을 분리하였다. pSaMe-FX로부터 7.5kb 단편과 pSaMe-Ta61A로부터 4.7kb 단편을 겔로부터 절단하고, QIAquick 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. 이들 정제된 단편은 amdS 선택성 마커 카세트, Trichoderma reesei chb1 유전자 프로모터 및 터미네이터를 함유하며, 추가적으로 단편은 Humicola insolens EGV 코어/Aspergillus oryzae BG 융합 암호화 서열 또는 T. aurantiacus GH61A 암호화 서열을 포함한다. 이 겔 정제 단계에 의해 ampR 단편이 제거되었기 때문에, 형질전환에 사용되는 단편은 항생제 내성 마커를 함유하지 않았다. 다음에, 정제된 단편을 100μl 원형질체 용액에 첨가하고 가볍게 혼합한 후, 260μl PEG 버퍼를 혼합하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 다음에, STC(3ml)를 첨가하여 혼합하고, amdS 선별을 사용하여 형질전환 용액을 COVE 플레이트 위에 평판하였다. 플레이트를 28℃에서 5-7일 동안 인큐베이션했다. 형질전환주를 COVE2 플레이트 위에 계대 배양하고 28℃에서 성장시켰다.
400개 이상의 형질전환주를 아세트아미드를 함유하는 신선한 플레이트 위에 계대 배양하고, 7일 동안 28℃에서 포자형성되도록 하였다.
형질전환주 포자로 접종되고, 28℃ 및 200rpm에서 5일 동안 인큐베이션된 pH 6.0의 셀룰라아제-유도 배지 25ml를 함유하는 125ml 배플 쉐이크 플라스크에서 Tr -ichoderma reesei 형질전환주를 배양하였다. Trichoderma reesei RutC30를 대조군으로서 수행하였다. 배양 육즙 샘플을 5일째에 제거하였다. 각 배양 육즙 1ml를 15,700x g에서 5분 동안 마이크로-원심분리기에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다.
CRITERION? Tris-HCl(5% 용해) 겔을 사용하여 CRITERION? 시스템에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 5일째의 상청액(상기 참조) 5μL를 2X 농도의 Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 현탁하고, 5% 베타-메르캅토에탄올의 존재하에 3분 동안 가열하였다. 상청액 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 러닝 버퍼로서 1X Tris/글리신/SDS(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 얻어진 겔을 BIO-SAFE? 쿠마시 색소로 염색하였다. SDS-PAGE 겔 상의 밴드의 가시화에 의해 보이는 대로 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제와 융합된 Humicola insolens 엔도글루카나아제 V 코어(Cel45A)로 구성된 융합 단백질을 모두 발현하는 것으로 나타난 형질전환주를 PCS 가수분해 반응에서 테스트하여 최고 가수분해 육즙을 생산한 균주를 확인하였다.
실시예 20: Trichoderma reesei 균주 SaMe - MF268 의 확인
Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질을 모두 발현하는 것으로 나타난 형질전환주를 형질전환주 포자로 접종되고 28℃ 및 200rpm에서 5일 동안 인큐베이션된 pH 6.0의 셀룰라아제-유도 배지 25ml를 함유하는 125ml 배플 쉐이크 플라스크에서 배양하였다.
쉐이크 플라스크 배양 육즙을 6000x g으로 원심분리하고 STERICUP™ EXPRESS™(Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 0.22μm으로 여과한 후에 가수분해하였다. pH 6.0에서 배양 육즙의 활성을 환원 말단의 화학적 분석에 의해서 PCS를 가수분해하고 검출가능한 당을 생산하는 능력에 의하여 측정하였다.
미 국립재생에너지연구소(NREL)(Boulder, CO, USA)에서 희석된 황산을 사용하여 옥수수 대를 전처리하였다. 전처리에 하기 조건을 사용하였다: 0.048g 황산/g 건조 바이오매스 19O℃ 및 25% w/w 건조 고형분으로 약 1분 동안. 전처리된 옥수수 대(PCS) 중의 수불용성 고형분은 글루코오스 및 셀로비오스를 방출하는 PCS의 제한 분해에 의해 측정되었을 때 59.2%의 셀룰로오스를 함유한다. 효소 가수분해 전에, PCS를 다량의 이중 탈이온수로 세정하였고; 수세된 PCS의 건조 중량은 17.73%인 것으로 판명되었다.
1kg 양의 PCS를 대략 20리터의 이중 탈이온수에 현탁하고, PCS를 가라앉히고 물을 디캔팅하였다. 이것을 세정수가 pH 4.0 이상일 때까지 반복하였고, 이때 환원당은 리터당 0.06g 미만이었다. 적은 부피 분석을 위해서(예컨대 1ml) 가라앉은 슬러리를 100메쉬 체로 걸러서 피펫을 사용할 수 있도록 하였다. 샘플을 105℃ 오븐에서 적어도 24시간 동안 건조하고(일정한 중량까지) 습 중량과 비교함으로써 세정된 PCS의 퍼센트 건조 중량 함량을 결정하였다.
ALPS 300™ 자동 랩 플레이트 밀봉제(ABgene Inc., Rochester, NY, USA)로 가열 밀봉된 96-딥-웰 플레이트(Axygen Scientific)에서 1ml 부피로 PCS 가수분해를 행하였다. PCS 농도는 50mM 아세트산나트륨 pH 5.0에서 리터당 10g이었다. 설명된 대로 샘플링 동안을 제외하고 추가의 교반 없이 PCS 가수분해를 5O℃에서 행하였다. 각 반응을 3회 행하였다. 방출된 환원당을 하기 설명된 대로 p-히드록시 벤조산 히드라지드(PHBAH) 시약으로 분석하였다.
0.8ml 부피의 PCS(물에서 리터당 12.5g)를 96-딥-웰 플레이트의 각 웰에 피 펫팅하고, 0.10ml 0.5M 아세트산나트륨 pH 5.0과 0.10ml 희석된 효소 용액으로 차례로 피페팅하여, 1.0ml의 최종 반응 부피 및 리터당 10g PCS 농도에서 반응을 시작하였다. 플레이트를 밀봉하였다. 가수분해 시작시 및 각 샘플 시점을 취하기 전에 딥-웰 플레이트를 반전시킴으로써 반응 혼합물을 혼합하였다. 각 샘플 시점에서 플레이트를 혼합한 다음, 딥-웰 플레이트를 2000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 (Sorvall RT7 with RTH-250 로터), 20μl 가수분해물(상청액)을 제거하고, 180μl 0.4% NaOH을 96-웰 마이크로플레이트에 첨가하였다. 필요한 경우, 이 중단된 용액을 적절한 범위로 더 희석하였다. 방출된 환원당을 파라-히드록시 벤조산 히드라지드 시약(PHBAH, Sigma, 4-히드록시 벤질히드라지드)으로 분석하고: 50μl PHBAH 시약(1.5%)을 V-형 바닥 96-웰 THERMOWELL™ 플레이트(Costar 6511)에서 100μl 샘플과 혼합하고, 95℃의 플레이트 가열 블록 상에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 50μl 이중 탈이온수를 각 웰에 첨가하여 혼합하고, 100μl을 다른 편평 바닥 96-웰 플레이트(Costar 9017)로 옮겨서 410nm에서 흡광도를 판독하였다. 동일한 조건에서의 셀룰로오스 검정곡선을 사용하여 환원당을 산출하였다. 환원당에 대한 셀룰로오스의 전환 퍼센트를 하기와 같이 산출하였다:
전환 % = 환원당(mg/ml)/(첨가한 셀룰로오스(mg/ml) x 1.11)
인수 1.11은 셀룰로오스의 글루코오스로의 가수분해에서 중량 증가를 보정한다.
1ml PCS 가수분해 테스트 후, 가장 위의 후보를 다음 프로토콜에 따라서 발효기에서 2배 성장시켰다. 다음의 쉐이크 플라스크 배지 100ml를 500ml 쉐이크 플 라스크에 첨가했다. 쉐이크 플라스크 배지는 리터당 20g 덱스트로오스, 10g 콘 스티프 고형분, 1.45g (NH4)2SO4, 2.08g KH2PO4, 0.36g CaCl2, 0.42g MgSO4·7H2O, 및 0.42ml 미량금속 용액으로 이루어졌다. 미량금속 용액은 리터당 216g of FeCl3·6H2O, 58g ZnSO4·7H2O, 27g MnSO4·H2O, 10g CuSO4·5H2O, 2.4g H3BO3, 및 336g 시트르산으로 이루어졌다. 쉐이크 플라스크를 Trichoderma reesei SMA135-04의 고체 평판 배양물로부터의 두 플러그로 접종하고, 오비탈 쉐이커에서 200rmp으로 48시간 동안 28℃에서 인큐베이션했다. 쉐이크 플라스크 육즙 50ml를 사용하여 리터당 30g 셀룰로오스, 4g 덱스트로오스, 10g 콘 스티프 고형분, 3.8g (NH4)2SO4, 2.8g KH2PO4, 2.64g CaCl2, 1.63g MgSO4·7H2O, 1.8ml 거품방지제, 및 0.66ml 미량금속 용액으로 이루어진 발효 배치 배지를 1.8리터 함유하는 3리터 발효 용기를 접종했다. 미량금속 용액은 리터당 216g FeCl3·6H2O, 58g ZnSO4·7H2O, 27g MnSO4·H2O, 10g CuSO4·5H2O, 2.4g H3BO3, 및 336g 시트르산으로 이루어졌다. 발효 공급 배지는 덱스트로오스 및 셀룰로오스로 이루어졌고, 이것은 165시간 동안 1 내지 4g/l/hr의 속도로 제공되었다. 발효 용기는 28℃로 유지하였고, pH는 4.75 +/- 0.1의 세트-포인트로 조절하였다. 1vvm의 속도로 공기를 용기에 첨가하였고, 1100 내지 1300rpm으로 회전하는 Rushton 추진기에 의해 육즙을 교반하였다.
총 단백질 농도를 측정하고, 하기 설명된 대로 50g PCS 가수분해 반응에서 육즙을 재테스트하였다. 각 실험 전에 스톡 효소 용액으로부터 신선한 효소 희석액 을 제조하였고, 이를 4℃에 보관하였다.
총 반응물 질량 50g을 사용하여 NREL 실험실 분석 프로토콜 #008에 따라서 125ml 나선형-뚜껑 Erlenmeyer 플라스크(VWR, West Chester, PA, USA)를 사용하여 PCS의 가수분해를 수행하였다. 이 프로토콜에서는 상기 설명된 2리터 발효 육즙 샘플을 상이한 단백질 로딩량(셀룰로오스 그램 당 단백질의 mg으로 표시됨)으로 사용하여 PCS(PCS 중 약 11.4% 및 수성 50mM 아세트산나트륨 pH 5.0 버퍼 중 6.8% 셀룰로오스) 가수분해를 수행하였다. INNOVA? 4080 인큐베이터(New Brunswick Scien-tific, Edison, NJ, USA)를 사용하여 50℃에서 150rpm로 오비탈 쉐이킹하면서 PCS 가수분해 성능 테스트를 수행하였다. 가수분해 과정 동안에 72, 120 및 168시간에서 분액을 취하여 원심분리하고, SORVALL?RT7 플레이트 원심분리기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 2000rpm으로 10분 동안 원심분리함으로써 MULTISCREEN? HV 0.45μm 멤브레인(Millipore, Bill-erica, MA, USA)을 사용하여 상청액을 여과했다. 즉시 사용하지 않을 경우, 여과된 당 분액을 -20℃에서 냉동시켰다. 0.005M H2SO4에 희석된 샘플의 당 농도를 65℃에서 4.6 x 250mm AMINEX? HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로부터 분당 0.4ml의 유속으로 0.005M H2SO4에 의해 용리한 후 측정하였고, 순수한 당 샘플에 의해 보정한 CHEMSTATION? AGILENT? 1100 HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 굴절률 지수 검출로부터 글루코오스 및 셀로비오스 신호를 적분하여 정량했다. 얻어진 당량을 사용하여 각 반응물에 대한 셀룰로오스 전환 퍼센트를 계산했다.
글루코오스 + 셀로비오스 당으로의 셀룰로오스 전환 정도(전환율, %)를 하기 식을 사용하여 계산했다:
전환율(%) = (글루코오스 + 셀로비오스 x 1.053)(mg/ml) x 100 x 162 / (셀룰로오스(mg/ml) x 180) =
(글루코오스 + 셀로비오스 x 1.053)(mg/ml) x 100 / (셀룰로오스(mg/ml) x 1.111)
이 식에서 인수 1.111은 셀룰로오스의 글루코오스로의 전환에서 중량 증가를 반영하며, 인수 1.053은 셀로비오스의 글루코오스로의 전환에서 중량 증가를 반영한다.
상기 설명된 50g 플라스크 분석에서 PCS 가수분해 반응물의 결과를 표 1에 나타낸다. 최대 성능 육즙을 생산하는 한 균주를 Trichoderma reesei SaMe-MF268로 칭하였다.
Figure 112009079254448-pct00001
실시예 21: Thermoascus aurantiacus 폴리펩티드 GH61A 와 Apergillus oryzae 베타- 글루코시다아제 융합 단백질을 함유하는 Trichoderma reesei 육즙의 제조
실시예 20에 설명된 대로 제조한 발효 육즙 샘플을 9500x g에서 대략 20분간 원심분리하여 세포 파편을 제거했다. 다음에, 깨끗해진 육즙 샘플을 MILLEX? GP Express™ 멤브레인, 폴리에테르술폰, 0.22㎛(Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 여과했다. 다음에, 여과된 육즙 샘플을 HIPREP™ 26/10 탈염 칼럼(TKTA™, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 탈염했다. 탈염된 물질의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정했으며, 단백질 기준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하였고, 여과된 육즙 중의 단백질에 대해 계산하였다. 전형적으로, 분액을 8-16% CRITERION™ SDS-PAGE 겔(Bio-Rad, Her-cules, CA; 200V, 1시간) 상에서 분석했으며, PRECISION PLUS PROTEIN™ 분자량 기준물질(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)이 포함되었다. 겔을 BIO-SAFE™ 코마시 염색 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 단백질에 대해 염색하였고, 탈이온수를 사용하여 탈색시켰다. 염색된 겔을 스캔하여 정량함으로써 또는 EXPERION™ 모세관 전기영동(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의한 분석 후의 최고 크기에 의해 Ther -moascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드 및 Humicola insolens GH45 코어 단백질과 Apergillus oryzae 베타-글루코시다아제를 포함하는 융합 단백질의 양에 대한 추정치를 얻었다.
실시예 22: 금속 이온 및 Thermoascus aurantiacus 폴리펩티드 GH61A 와 조합되었을 때 Apergillus oryzae 베타- 글루코시다아제 융합 단백질을 함유하는 Trich -oderma reesei 육즙에서 셀룰로오스 가수분해 활성의 증가
미 국립재생에너지연구소(NREL)(Boulder, CO, USA)에서 희석된 황산을 사용하여 옥수수 대를 전처리하였다. 전처리에 하기 조건을 사용하였다: 195℃에서 4.5분 동안 1.4wt% 황산. 과잉의 셀룰라아제 효소를 사용한 제한 분해에 따르면, 전처리된 옥수수 대(PCS) 중의 수-불용성 고형분은 59.2% 셀룰로오스를 함유했다. 효소 가수분해 전에 PCS를 가용성 산 및 당이 제거될 때까지 다량의 탈이온수로 세정하였다. 수세된 PCS의 건조 중량은 19.16%인 것으로 판명되었다.
125ml 스크류-탑 Erlenmeyer 플라스크에서 총 반응물 질량 50g을 사용하여 NREL 실험실 분석 프로토콜 #008에 따라서 PCS의 가수분해를 수행하였다. 이 프로토콜에서는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질을 함유하는 Trichoderma reesei 발효 육즙을 상이한 단백질 로딩량(셀룰로오스 그램 당 단백질 mg으로 표시)으로 사용하고, 또 표 1에 나타낸 형태의 2가 금속 이온을 10mM의 최종 농도로 첨가한 것과 첨가하지 않은 것으로 하여 PCS(PCS 중 약 11.3% 및 수성 50mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0 버퍼 중 6.7 셀룰로오스)의 가수분해를 수행하였다. INNOVA? 4080 인큐베이터(New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA)를 사용하여 150rpm으로 오비탈 쉐이킹하면서 50℃에서 PCS 가수분해 능력에 대한 테스트를 수행하였다. 가수분해 과정 동안 72시간 및 120시간에서 분액을 취하였다. 분액을 원심분리하고, 상청액을 SORVALL? RT7 플레이트 원심분리기를 사용하여 15분 동안 2000rpm으로 원심분리함으로써 MULTISCREEN? HV 0.45㎛ 멤브레인을 사용하여 여과하였다. 즉시 사용하지 않을 경우, 여과된 당 분액을 -20℃에서 냉동시켰다. 0.005M H2SO4에 희석된 샘플의 당 농도를 65℃에서 4.6x 250mm AMINEX? HPX-87H 칼럼으로부터 분당 0.4ml의 유속으로 0.005M H2SO4에 의해 용리한 후 측정하였고, 순수한 당 샘플로 보정한 CHEMSTATION? AGILENT? 1100 HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 굴절률 지수 검출로부터 글루코오스 및 셀로비오스 신호를 적분하여 정량했다. 얻어진 당량을 사용하여 각 반응물에 대한 셀룰로오스 전환 퍼센트를 계산했다.
글루코오스 + 셀로비오스 당으로의 셀룰로오스 전환 정도(전환율, %)를 하기 식을 사용하여 계산했다:
전환율(%) = (글루코오스 + 셀로비오스 x 1.053)(mg/ml) x 100 x 162 / (셀룰로오스(mg/ml) x 180) =
(글루코오스 + 셀로비오스 x 1.053)(mg/ml) x 100 / (셀룰로오스(mg/ml) x 1.111)
이 식에서 인수 1.111은 셀룰로오스의 글루코오스로의 전환에서 중량 증가를 반영하며, 인수 1.053은 셀로비오스의 글루코오스로의 전환에서 중량 증가를 반영한다. PCS 중의 셀룰로오스를 PCS의 제한 분해에 의해 글루코오스 및 셀로비오스를 방출시켜 측정하였다.
각 실험 전에 4℃에 보관한 스톡 효소 용액으로 효소 희석물을 신선하게 제조했다.
표 2에 나타낸 결과는 10mM MnSO4의 첨가가 4 내지 8mg/g 셀룰로오스의 단백질 수준의 등량의 발효 육즙에만 의해서 얻어진 것 이상으로 글루코오스로의 전환을 증가시켰음을 입증한다. 유사하게, 10mM까지 첨가된 CaCl2, MgCl2, 또는 CoCl2도 4 내지 8mg/g 셀룰로오스의 단백질 수준의 등량의 발효 육즙만에 의해서 얻어진 것 이상으로 글루코오스로의 전환을 증가시켰다. 10mM ZnCl2 또는 FeS04와 같은 다른 2가 금속염의 첨가 또는 2가 양이온의 킬레이터인 10mM EDTA의 첨가는 글루오코스 및 셀로비오스의 수율을 감소시켰다. 72시간 가수분해 결과를 도 16에 나타낸다.
따라서, 셀룰라아제-함유 용액에 10mM MnSO4 , CaCl2, MgCl2, 또는 CoCl2의 첨가는 다른 금속염을 첨가한 것과 비교하여 산-전처리된 옥수수 대(PCS)의 가수분해시 글루코오스 및 셀로비오스의 수율을 증가시켰다.
실험 효소와 금속의
혼합물		 실제 바이오매스 함량 % (w/w) 실제 셀룰로오스 함량 %(w/w) 실제 총 단백질 mg/g 셀룰로오스 72hr
전환		 120hr
전환
1 SaMe MF268 11.32 6.70 4.00 74.10 84.62
2 SaMe MF268 11.32 6.70 6.00 84.59 91.94
3 SaMe MF268 11.32 6.70 8.00 88.68 95.20
7 SaMe MF268 Ca++ 11.32 6.70 4.00 74.79 86.14
8 SaMe MF268 Ca++ 11.32 6.70 6.00 85.77 95.11
9 SaMe MF268 Ca++ 11.32 6.70 8.00 89.54 96.29
10 SaMe MF268 Mg++ 11.32 6.70 4.00 75.31 87.08
11 SaMe MF268 Mg++ 11.32 6.70 6.00 86.99 95.12
12 SaMe MF268 Mg++ 11.32 6.70 8.00 90.49 97.56
13 SaMe MF268 Mn++ 11.32 6.70 4.00 79.30 86.77
14 SaMe MF268 Mn++ 11.33 6.70 6.00 91.65 95.23
15 SaMe MF268 Mn++ 11.32 6.70 8.00 98.03 98.70
16 SaMe MF268 Zn++ 11.32 6.70 4.00 56.00 63.38
17 SaMe MF268 Zn++ 11.32 6.70 6.00 65.79 75.03
18 SaMe MF268 Zn++ 11.32 6.70 8.00 74.88 84.22
19 SaMe MF268 Fe++ 11.32 6.70 4.00 33.80 35.83
20 SaMe MF268 Fe++ 11.32 6.70 6.00 42.50 44.88
21 SaMe MF268 Fe++ 11.32 6.70 8.00 49.74 50.21
22 SaMe MF268 Co++ 11.33 6.70 4.00 75.98 85.88
23 SaMe MF268 Co++ 11.32 6.70 6.00 87.86 94.33
24 SaMe MF268 Co++ 11.32 6.70 8.00 94.26 97.05
25 SaMe MF268 EDTA 11.31 6.69 4.00 57.94 65.94
26 SaMe MF268 EDTA 11.32 6.70 6.00 67.67 74.35
27 SaMe MF268 EDTA 11.32 6.70 8.00 72.85 77.69
실시예 23: 금속 이온과 조합되었을 때 탈염된 Trichoderma reesei 육즙 Ap -ergillus oryzae 베타- 글루코시다아제의 셀룰로오스 가수분해 활성의 증가는 폴리 펩티드 GH61A 를 함유하는 혼합물에 특이적이다
셀룰로오스 증진 활성을 갖는 Thermoascus aurantiacus 폴리펩티드 GH61A을 WO 2005/074656에 따라서 Aspergillus oryzae JaL250에서 재조합 제조했다. Asper -gillus oryzae 베타-글루코시다아제 및 Trichoderma reesei 셀룰라아제를 발현하는 진균 육즙을 Trichoderma reesei 균주 SMA135-04에서 재조합 제조했다. 발효는 각 단백질에 대해 하기 설명된 대로 수행하였다.
Aspergillus oryzae가 포함된 발효에서는 500ml 쉐이크 플라스크에 100ml 쉐이크 플라스크 배지를 첨가했다. 쉐이크 플라스크 배지는 리터당 50g 수크로오스, 10g KH2PO4, 0.5g CaCl2, 2g MgSO4·7H2O, 2g K2SO4, 2g 유레아, 10g 효모 추출물, 2g 시트르산, 및 0.5ml 미량금속 용액으로 이루어졌다. 미량금속 용액은 리터당 13.8g FeSO4·7H2O, 14.3g ZnSO4·7H2O, 8.5g MnSO4·H2O, 2.5g CuSO4·5H2O, 및 3g 시트르산으로 이루어졌다. 쉐이크 플라스크를 Aspergillus oryzae의 고체 평판 배양물로부터의 두 플러그로 접종하고, 24시간 동안 200rpm으로 오비탈 쉐이커에서 34℃에서 인큐베이션했다. 쉐이크 플라스크 육즙 50ml를 사용하여 리터당 10g 효모 추출물, 24g 수크로오스, 5g (NH4)2SO4, 2g KH2PO4, 0.5g CaCl2·2H2O, 2g MgSO4·7H2O, 1g 시트르산, 2g K2SO4, 0.5ml 거품방지제, 및 0.5ml 미량금속 용액으로 이루어진 발효 배치 배지를 1.8리터 함유하는 3리터 발효 용기를 접종했다. 미량금속 용액은 리터당 13.8g FeSO4·7H2O, 14.3g ZnSO4·7H2O, 8.5g MnSO4·H2O, 2.5g CuSO4·5H2O, 및 3g 시트르산으로 이루어졌다. 발효 공급 배지는 말토오스와 거품방지제로 이루어졌다. 발효 공급 배지를 185시간 동안 0 내지 4.4g/l/hr의 속도로 공급하였다. 발효 용기는 34℃의 온도에 유지하였고, ph는 6.1 +/- 0.1의 세트-포인트로 조절하였다. 1vvm의 속도로 용기에 공기를 첨가했고, 1100 내지 1300rpm으로 회전하는 Rushton 추진기에 의해 육즙을 교반하였다.
Trichoderma reesei가 포함된 발효는 실시예 20에 설명된 대로 수행하였다.
9500x g에서 약 20분 동안 원심분리하여 조 육즙 샘플에서 세포 파편을 제거하였다. 다음에, 깨끗해진 육즙 샘플을 MILLEX? GP Express™ 멤브레인, 폴리에테르술폰, 0.22㎛를 사용하여 여과했다. 다음에, 여과된 육즙 샘플을 HIPREP™ 26/ 10 탈염 칼럼을 사용하여 탈염하였다. 탈염된 물질의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정했는데, 소 혈청 알부민을 단백질 표준물질로 사용했으며, 여과된 육즙 중의 단백질에 대해 계산했다. 전형적으로, 분액을 8-16% CRITERION™SDS-PAGE 겔(200V, 1hr) 상에서 분석했는데, PRECISION PLUS PROTEIN™ 분자량 표준물질이 포함되었다. 겔을 BIO-SAFE™ 코마시 염색을 사용하여 염색하고, 탈이온수를 사용하여 탈색하였다. 또한, 상기와 마찬가지로 탈염하여 단백질을 제조함으로써 발효 육즙에 용해된 금속 이온을 제거하였으며, 표 3 및 4에 나타낸 대로 접두어 ds에 의해 표시한다.
PCS의 가수분해를 NREL 실험실 분석 프로토콜 #008에 따라서 125ml 스크류-탑 Erlenmeyer 플라스크에서 50g의 총 반응물 질량을 사용하여 수행하였다. 이 프로토콜에서는 PCS(PCS 중 약 11.3% 및 수성 50mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0 버퍼 중 6.7% 셀룰로오스)의 가수분해를 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제를 함유하는 Trichoderma reesei 육즙을 함유하는 발효 육즙을 일정한 총 단백질 로딩량 (셀룰로오스 그램당 효소 mg으로 표시)으로 사용하고, 또 Thermoascus aurantiacus 폴리펩티드 GH61A를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것에 표 2에 나타낸 형태의 2가 금속 이온을 1mM의 최종 농도로 첨가한 것과 첨가하지 않은 것으로 하여 수행하였다. 실시예 22에 설명된 대로 PCS 가수분해 능력에 대한 테스트를 수행하였다. 글루코오스 + 셀로비오스 당으로의 셀룰로오스 전환 정도(전환 %)를 실시예 22에 설명된 식을 사용하여 계산하였다.
각 실험 전에 4℃에 보관한 스톡 효소 용액으로부터 효소 희석물을 신선하게 제조했다.
표 3에 나타낸 결과는 1mM 2가 양이온만의 첨가로는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드를 포함하지 않는 등량의 발효 육즙에 의해 얻어진 것 이상으로 글루코오스 전환을 증가시키지 않았다는 것을 입증한다. 유사하게, 2가 금속 양이온을 첨가하지 않고 GH61A 폴리펩티드를 포함시킨 것도 글루코오스 전환을 증가시키지 않았다. 72시간 가수분해 결과를 도 17에 그래프로 나타낸다.
따라서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드를 가진 셀룰라아제-함유 용액에 1mM MnSO4 or CaCl2의 첨가는 산-전처리된 옥수수 대(PCS)의 가수분해시 글루코오스 및 셀로비오스의 수율을 증가시켰다. 이 증가는 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드의 존재에 좌우되었다. Zn++ 및 Fe++와 같은 다른 금속의 1mM의 첨가 또는 1mM EDTA에 의한 금속의 킬레이션은 산-전처리된 옥수수 대(PCS)의 가수분해시 글루코오스 및 셀로비오스의 수율을 감소시켰다.
실험 효소와 금속의 혼합물 72hr 전환 120hr 전환
56 dsSMA135 54.42 62.65
58 dsSMA135 Ca++ 55.48 61.52
60 dsSMA135 Mn++ 45.19 60.11
62 dsSMA135 EDTA 49.65 59.52
64 dsSMA135 Zn++ 37.61 43.59
65 dsSMA135 + GH61A 56.97 76.41
66 dsSMA135 + GH61A Ca++ 63.23 77.79
67 dsSMA135 + GH61A Mn++ 67.43 84.02
68 dsSMA135 + GH61A EDTA 49.03 57.49
69 dsSMA135 + GH61A Zn++ 47.39 58.01
실시예 24: MnSO 4 및 MgCl 2 와 조합되었을 때 Apergillus oryzae 베타- 글루코시다아제 융합 단백질 및 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드를 함유하는 Trichoderma reesei 육즙에서 셀룰로오스 가수분해 활성의 증가
셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드 및 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제를 가진 Humicola insolens GH 45A로 구성된 융합 단백질을 실시예 20에 설명된 대로 Trichoderma reesei SaMe MF268에서 재조합 제조하였다.
9500x g에서 약 20분 동안 배양물을 원심분리하여 조 육즙 샘플에서 세포 파편을 제거하였다. 다음에, 깨끗해진 육즙 샘플을 MILLEX? GP Express™ 멤브레인, 폴리에테르술폰, 0.22㎛를 사용하여 여과했다. 다음에, 여과된 육즙 샘플을 HIPREP™ 26/10 탈염 칼럼을 사용하여 탈염하였다. 탈염된 물질의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정했는데, 소 혈청 알부민을 단백질 표준물질로서 사용했으며, 여과된 육즙 중의 단백질에 대해 계산하였다. 전형적으로, 분액을 8-16% CRITERION™ SDS-PAGE 겔(200V, 1hr) 상에서 분석했으며, PRECISION PLUS PROTEIN™ 분자량 표준물질이 포함되었다. 겔을 BIO-SAFE™ 코마시 염색을 사용하여 단백질에 대해 염색하고, 탈이온수를 사용하여 탈색하였다. 또한, 단백질을 상기와 마찬가지로 탈염하여 제조하여 발효 육즙에 용해된 금속 이온을 제거하였다.
PCS의 가수분해를 NREL 실험실 분석 프로토콜 #008에 따라서 125ml 스크류-탑 Erlenmeyer 플라스크에서 50g의 총 반응물 질량을 사용하여 수행하였다. 이 프로토콜에서는 PCS(PCS 중 약 11.3% 및 수성 50mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0 버퍼 중 6.7% 셀룰로오스)의 가수분해를 표 4에 나타낸 MnSO4 및 MgCl2의 최종 농도를 증가시키면서 Thermoascus aurantiacus GH61A 폴리펩티드는 없이 Aspergillus oryzae 베타-글루코시다아제 융합 단백질을 함유하는 탈염된 또는 탈염되지 않은 Tricho -derma reesei 발효 육즙을 일정한 총 단백질 로딩량(셀룰로오스 그램 당 효소 mg으로 표시)으로 사용하여 수행하였다. PCS 가수분해 능력에 대한 테스트를 실시예 22에 설명된 대로 수행하였다. 글루코오스 + 셀로비오스 당으로의 셀룰로오스 전환 정도(전환 %)를 실시예 22에 설명된 식을 사용하여 계산하였다.
각 실험 전에 4℃에 보관된 스톡 효소 용액으로부터 효소 희석물을 신선하게 제조했다.
표 4에 나타낸 결과는 0.001, 0.01, 0.1, 1 또는 10mM로 MnSO4 및 MgCl2의 농도를 증가시켜 첨가한 것이 MnSO4가 없는 등량의 Trichoderma reesei SaMe MF268에 의해 얻어진 것 이상으로 글루코오스 전환을 증가시켰음을 입증한다. 유사하게, 0.001, 0.01, 0.1, 1 또는 10mM의 증가 농도로 MnSO4를 첨가하는 것은 탈염된 Tri -choderma reesei SaMe MF268 발효 육즙에 첨가되었을 때는 약 1mM까지는 증가가 없는 것으로 나타났다. 72시간 가수분해 결과를 도 18에 나타낸다.
따라서, Trichoderma reesei SaMe MF268 발효 육즙을 함유하는 용액에 각 금속 이온의 0.001, 0.01, 0.1, 1 또는 10mM의 최종 농도로 MnSO4 및 MgCl2을 첨가하는 것은 산-전처리된 옥수수 대(PCS)의 가수분해시 글루코오스 및 셀로비오스의 수율을 증가시켰다. 따라서, 탈염된 Trichoderma reesei SaMe MF268 발효 육즙을 함유하는 용액에 1mM 또는 10mM의 최종 농도로 MnSO4 및 MgCl2를 첨가하는 것은 산-전처리된 옥수수 대(PCS)의 가수분해시 글루코오스 및 셀로비오스의 수율을 증가시켰다.
실험 Mixture of enzymes and metal 실제 바이오매스 함량 % (w/w) 실제 셀룰로오스 함량 % (w/w) 실제 총 단백질 mg/g 셀룰로오스 72hr
전환		 120hr
전환
46 SaMe MF268 11.32 6.70 4.03 69.20 80.61
47 SaMe MF268 0.01mM 이온 11.32 6.70 4.03 73.56 82.98
48 SaMe MF268 0.1mM 이온 11.31 6.69 4.03 74.59 84.82
49 SaMe MF268 1mM 이온 11.21 6.63 4.03 75.62 84.56
50 SaMe MF268 10mM 이온 10.29 6.09 4.03 76.02 84.45
51 dsSaMe MF268 11.32 6.70 4.02 70.93 79.11
52 dsSaMe MF268 0.01mM 이온 11.32 6.70 4.02 71.16 83.63
53 dsSaMe MF268 0.1mM 이온 11.31 6.69 4.02 70.88 83.30
54 dsSaMe MF268 1mM 이온 11.21 6.63 4.02 74.90 83.22
55 dsSaMe MF268 10mM 이온 10.29 6.09 4.02 74.17 79.01
생물학적 물질의 기탁
다음 생물학적 물질을 부다페스트 조약에 의거 애그리컬쳐럴 리서치 서비스 페이트 컬쳐 컬렉션, 노던 리저널 리서치 센터(1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604)에 기탁하였으며, 다음의 수탁번호를 부여받았다:
기탁 승인 번호 기탁일
E. coli 균주 pEJG120 NRRL B-30699 2003년 12월 19일
E. coli 균주 pTter61C NRRL B-30813 2005년 1월 21일
E. coli 균주 pTter61D NRRL B-30812 2005년 1월 21일
E. coli 균주 pTter61E NRRL B-30814 2005년 1월 21일
E. coli 균주 pTter61G NRRL B-30811 2005년 1월 21일
E. coli 균주 pDZA2-7 NRRL B-30704 2004년 1월 30일
E. coli 균주 pTr3337 NRRL B-30878 2005년 9월 20일
E. coliTOP10(pEJG113) NRRL B-30695 2003년 10월 17일
E. coliTOP1O pKKAB NRRL B-30860 2005년 7월 8일
NN049573 DSM 14240 2001년 4월 19일
균주는 특허 출원이 되는 동안 37 C. F. R. §1.14 및 35 U. S. C. §122에 의거한 특허 및 상표의 관서장이 결정한 자가 배양물을 입수 가능한 상태로 기탁되었다. 기탁은 기탁된 균주의 실질적으로 순수한 배양물을 나타낸다. 이 기탁물은 대상 발명의 상대방 국가인 외국법에 의하여 요구되는 바대로 사용되거나 또는 이들의 승계인도 기록된다. 그러나, 기탁물의 사용은 정부에 의하여 수여된 특허권을 훼손하기 위하여 증명서를 사용하는 것으로 활용되어서는 아니 된다는 것을 이해하여야 한다.
본원에 기재되고 청구된 발명은 본 발명의 특정 특징에 의하여 범위를 제한하는 것이 아니며, 이는 본 발명의 몇몇 특징을 설명하기 위하여 의도된 것이기 때문이다. 모든 동등한 특징을 본 발명의 범위에 포함하는 것으로 의도되었다. 물론, 본원에서 기재하고 나타낸 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명에 의하여 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명하다. 이러한 변형은 첨부한 청구 범위의 범위 내에 포함되는 것을 의도하였다. 분쟁이 발생하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서를 대조한다.
다양한 참고자료를 본원에서 인용하였으며, 이 문헌들은 전체로서 본원에서 참고자료로 포함되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Novozymes, Inc. McFarland, Keith Harris, Paul <120> Methods of increasing the cellulolytic enchancing activity of a polypeptide <130> 11232.204-WO <150> 60/941,243 <151> 2007-05-31 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1846 <212> DNA <213> Thielavia terrestris <400> 1 aattgaagga gggagtggcg gagtggccac caagtcaggc ggctgtcaac taaccaagga 60 tgggaacagt tcggctcgcc ttgcccgagg gcagcgttcc ctgatgggga cgaaccatgg 120 gactggggtc agctgctgta taaaagttca aatcgatgat ctctcagatg gcgctgctgg 180 ggtgttctgc gcttttccat cctcgcaacc tggtatccca ctagtccagc gttcggcacc 240 atgaagtcgt tcaccattgc cgccttggca gccctatggg cccaggaggc cgccgcccac 300 gcgaccttcc aggacctctg gattgatgga gtcgactacg gctcgcaatg tgtccgcctc 360 ccggcgtcca actcccccgt caccaatgtt gcgtccgacg atatccgatg caatgtcggc 420 acctcgaggc ccaccgtcaa gtgcccggtc aaggccggct ccacggtcac gatcgagatg 480 caccaggttc gcacgcctct ctgcgtaggc cccccagcta ctatatggca ctaacacgac 540 ctccagcaac ctggcgaccg gtcttgcgcc aacgaggcta tcggcggcga ccactacggc 600 cccgtaatgg tgtacatgtc caaggtcgat gacgcggtga cagccgacgg ttcatcgggc 660 tggttcaagg tgttccagga cagctgggcc aagaacccgt cgggttcgac gggcgacgac 720 gactactggg gcaccaagga cctcaactcg tgctgcggca agatgaacgt caagatcccc 780 gaagacatcg agccgggcga ctacctgctc cgcgccgagg ttatcgcgct gcacgtggcc 840 gccagctcgg gcggcgcgca gttctacatg tcctgctacc agctgaccgt gacgggctcc 900 ggcagcgcca ccccctcgac cgtgaatttc ccgggcgcct actcggccag cgacccgggc 960 atcctgatca acatccacgc gcccatgtcg acctacgtcg tcccgggccc gaccgtgtac 1020 gcgggcggct cgaccaagtc ggctggcagc tcctgctccg gctgcgaggc gacctgcacg 1080 gttggttccg gccccagcgc gacactgacg cagcccacct ccaccgcgac cgcgacctcc 1140 gcccctggcg gcggcggctc cggctgcacg gcggccaagt accagcagtg cggcggcacc 1200 ggctacactg ggtgcaccac ctgcgctgta agttccctcg tgatatgcag cggaacaccg 1260 tctggactgt tttgctaact cgcgtcgtag tccgggtcta cctgcagcgc cgtctcgcct 1320 ccgtactact cgcagtgcct ctaagccggg agcgcttgct cagcgggctg ctgtgaagga 1380 gctccatgtc cccatgccgc catggccgga gtaccgggct gagcgcccaa ttcttgtata 1440 tagttgagtt ttcccaatca tgaatacata tgcatctgca tggactgttg cgtcgtcagt 1500 ctacatcctt tgctccactg aactgtgaga ccccatgtca tccggaccat tcgatcggtg 1560 ctcgctctac catctcggtt gatgggtctg ggcttgagag tcactggcac gtcctcggcg 1620 gtaatgaaat gtggaggaaa gtgtgagctg tctgacgcac tcggcgctga tgagacgttg 1680 agcgcggccc acactggtgt tctgtaagcc agcacacaaa agaatactcc aggatggccc 1740 atagcggcaa atatacagta tcagggatgc aaaaagtgca aaagtaaggg gctcaatcgg 1800 ggatcgaacc cgagacctcg cacatgactt atttcaagtc aggggt 1846 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Thielavia terrestris <400> 2 Met Lys Ser Phe Thr Ile Ala Ala Leu Ala Ala Leu Trp Ala Gln Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala His Ala Thr Phe Gln Asp Leu Trp Ile Asp Gly Val Asp 20 25 30 Tyr Gly Ser Gln Cys Val Arg Leu Pro Ala Ser Asn Ser Pro Val Thr 35 40 45 Asn Val Ala Ser Asp Asp Ile Arg Cys Asn Val Gly Thr Ser Arg Pro 50 55 60 Thr Val Lys Cys Pro Val Lys Ala Gly Ser Thr Val Thr Ile Glu Met 65 70 75 80 His Gln Gln Pro Gly Asp Arg Ser Cys Ala Asn Glu Ala Ile Gly Gly 85 90 95 Asp His Tyr Gly Pro Val Met Val Tyr Met Ser Lys Val Asp Asp Ala 100 105 110 Val Thr Ala Asp Gly Ser Ser Gly Trp Phe Lys Val Phe Gln Asp Ser 115 120 125 Trp Ala Lys Asn Pro Ser Gly Ser Thr Gly Asp Asp Asp Tyr Trp Gly 130 135 140 Thr Lys Asp Leu Asn Ser Cys Cys Gly Lys Met Asn Val Lys Ile Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ile Glu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Val Ile Ala 165 170 175 Leu His Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Met Ser Cys 180 185 190 Tyr Gln Leu Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ser Thr Val 195 200 205 Asn Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Ser Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn 210 215 220 Ile His Ala Pro Met Ser Thr Tyr Val Val Pro Gly Pro Thr Val Tyr 225 230 235 240 Ala Gly Gly Ser Thr Lys Ser Ala Gly Ser Ser Cys Ser Gly Cys Glu 245 250 255 Ala Thr Cys Thr Val Gly Ser Gly Pro Ser Ala Thr Leu Thr Gln Pro 260 265 270 Thr Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Cys Thr Ala Ala Lys Tyr Gln Gln Cys Gly Gly Thr Gly Tyr Thr Gly 290 295 300 Cys Thr Thr Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Pro Pro 305 310 315 320 Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 325 <210> 3 <211> 880 <212> DNA <213> Thielavia terrestris <400> 3 accccgggat cactgcccct aggaaccagc acacctcggt ccaatcatgc ggttcgacgc 60 cctctccgcc ctcgctcttg cgccgcttgt ggctggccac ggcgccgtga ccagctacat 120 catcggcggc aaaacctatc ccggctacga gggcttctcg cctgcctcga gcccgccgac 180 gatccagtac cagtggcccg actacaaccc gaccctgagc gtgaccgacc cgaagatgcg 240 ctgcaacggc ggcacctcgg cagagctcag cgcgcccgtc caggccggcg agaacgtgac 300 ggccgtctgg aagcagtgga cccaccagca aggccccgtc atggtctgga tgttcaagtg 360 ccccggcgac ttctcgtcgt gccacggcga cggcaagggc tggttcaaga tcgaccagct 420 gggcctgtgg ggcaacaacc tcaactcgaa caactggggc accgcgatcg tctacaagac 480 cctccagtgg agcaacccga tccccaagaa cctcgcgccg ggcaactacc tcatccgcca 540 cgagctgctc gccctgcacc aggccaacac gccgcagttc tacgccgagt gcgcccagct 600 ggtcgtctcc ggcagcggct ccgccctgcc cccgtccgac tacctctaca gcatccccgt 660 ctacgcgccc cagaacgacc ccggcatcac cgtgagtggg cttccgttcc gcggcgagct 720 ctgtggaaat cttgctgacg atgggctagg ttgacatcta caacggcggg cttacctcct 780 acaccccgcc cggcggcccc gtctggtctg gcttcgagtt ttaggcgcat tgagtcgggg 840 gctacgaggg gaaggcatct gttcgcatga gcgtgggtac 880 <210> 4 <211> 478 <212> PRT <213> Thielavia terrestris <400> 4 Met Arg Phe Asp Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala 1 5 10 15 Gly His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Pro 20 25 30 Gly Tyr Glu Gly Phe Ser Pro Ala Ser Ser Pro Pro Thr Ile Gln Tyr 35 40 45 Gln Trp Pro Asp Tyr Asn Pro Thr Leu Ser Val Thr Asp Pro Lys Met 50 55 60 Arg Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Glu Leu Ser Ala Pro Val Gln Ala 65 70 75 80 Gly Glu Asn Val Thr Ala Val Trp Lys Gln Trp Thr His Gln Gln Gly 85 90 95 Pro Val Met Val Trp Met Phe Lys Cys Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser 100 105 110 His Gly Asp Gly Lys Gly Trp Phe Lys Ile Asp Gln Leu Gly Leu Trp 115 120 125 Gly Asn Asn Leu Asn Ser Asn Asn Trp Gly Thr Ala Ile Val Tyr Lys 130 135 140 Thr Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ile Pro Lys Asn Leu Ala Pro Gly Asn 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Arg His Glu Leu Leu Ala Leu His Gln Ala Asn Thr Pro 165 170 175 Gln Phe Tyr Ala Glu Cys Ala Gln Leu Val Val Ser Gly Ser Gly Ser 180 185 190 Ala Leu Pro Pro Ser Asp Tyr Leu Tyr Ser Ile Pro Val Tyr Ala Pro 195 200 205 Gln Asn Asp Pro Gly Ile Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gly Gly Leu Thr 210 215 220 Ser Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Val Trp Ser Gly Phe Glu Phe Met 225 230 235 240 Arg Phe Asp Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala Gly 245 250 255 His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Pro Gly 260 265 270 Tyr Glu Gly Phe Ser Pro Ala Ser Ser Pro Pro Thr Ile Gln Tyr Gln 275 280 285 Trp Pro Asp Tyr Asn Pro Thr Leu Ser Val Thr Asp Pro Lys Met Arg 290 295 300 Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Glu Leu Ser Ala Pro Val Gln Ala Gly 305 310 315 320 Glu Asn Val Thr Ala Val Trp Lys Gln Trp Thr His Gln Gln Gly Pro 325 330 335 Val Met Val Trp Met Phe Lys Cys Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser His 340 345 350 Gly Asp Gly Lys Gly Trp Phe Lys Ile Asp Gln Leu Gly Leu Trp Gly 355 360 365 Asn Asn Leu Asn Ser Asn Asn Trp Gly Thr Ala Ile Val Tyr Lys Thr 370 375 380 Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ile Pro Lys Asn Leu Ala Pro Gly Asn Tyr 385 390 395 400 Leu Ile Arg His Glu Leu Leu Ala Leu His Gln Ala Asn Thr Pro Gln 405 410 415 Phe Tyr Ala Glu Cys Ala Gln Leu Val Val Ser Gly Ser Gly Ser Ala 420 425 430 Leu Pro Pro Ser Asp Tyr Leu Tyr Ser Ile Pro Val Tyr Ala Pro Gln 435 440 445 Asn Asp Pro Gly Ile Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gly Gly Leu Thr Ser 450 455 460 Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Val Trp Ser Gly Phe Glu Phe 465 470 475 <210> 5 <211> 1000 <212> DNA <213> Thielavia terrestris <400> 5 ctcctgttcc tgggccaccg cttgttgcct gcactattgg tagagttggt ctattgctag 60 agttggccat gcttctcaca tcagtcctcg gctcggctgc cctgcttgct agcggcgctg 120 cggcacacgg cgccgtgacc agctacatca tcgccggcaa gaattacccg gggtgggtag 180 ctgattattg agggcgcatt caaggttcat accggtgtgc atggctgaca accggctggc 240 agataccaag gcttttctcc tgcgaactcg ccgaacgtca tccaatggca atggcatgac 300 tacaaccccg tcttgtcgtg cagcgactcg aagcttcgct gcaacggcgg cacgtcggcc 360 accctgaacg ccacggccgc accgggcgac accatcaccg ccatctgggc gcagtggacg 420 cacagccagg gccccatcct ggtgtggatg tacaagtgcc cgggctcctt cagctcctgt 480 gacggctccg gcgctggctg gttcaagatc gacgaggccg gcttccacgg cgacggcgtc 540 aaggtcttcc tcgacaccga gaacccgtcc ggctgggaca tcgccaagct cgtcggcggc 600 aacaagcagt ggagcagcaa ggtccccgag ggcctcgccc ccggcaacta cctcgtccgc 660 cacgagttga tcgccctgca ccaggccaac aacccgcagt tctacccgga gtgcgcccag 720 gtcgtcatca ccggctccgg caccgcgcag ccggatgcct catacaaggc ggctatcccc 780 ggctactgca accagaatga cccgaacatc aaggtgagat ccaggcgtaa tgcagtctac 840 tgctggaaag aaagtggtcc aagctaaacc gcgctccagg tgcccatcaa cgaccactcc 900 atccctcaga cctacaagat tcccggccct cccgtcttca agggcaccgc cagcaagaag 960 gcccgggact tcaccgcctg aagttgttga atcgatggag 1000 <210> 6 <211> 516 <212> PRT <213> Thielavia terrestris <400> 6 Met Leu Leu Thr Ser Val Leu Gly Ser Ala Ala Leu Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Ala Ala Ala His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Ala Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Pro Gly Tyr Gln Gly Phe Ser Pro Ala Asn Ser Pro Asn Val Ile 35 40 45 Gln Trp Gln Trp His Asp Tyr Asn Pro Val Leu Ser Cys Ser Asp Ser 50 55 60 Lys Leu Arg Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asn Ala Thr Ala 65 70 75 80 Ala Pro Gly Asp Thr Ile Thr Ala Ile Trp Ala Gln Trp Thr His Ser 85 90 95 Gln Gly Pro Ile Leu Val Trp Met Tyr Lys Cys Pro Gly Ser Phe Ser 100 105 110 Ser Cys Asp Gly Ser Gly Ala Gly Trp Phe Lys Ile Asp Glu Ala Gly 115 120 125 Phe His Gly Asp Gly Val Lys Val Phe Leu Asp Thr Glu Asn Pro Ser 130 135 140 Gly Trp Asp Ile Ala Lys Leu Val Gly Gly Asn Lys Gln Trp Ser Ser 145 150 155 160 Lys Val Pro Glu Gly Leu Ala Pro Gly Asn Tyr Leu Val Arg His Glu 165 170 175 Leu Ile Ala Leu His Gln Ala Asn Asn Pro Gln Phe Tyr Pro Glu Cys 180 185 190 Ala Gln Val Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Ala Gln Pro Asp Ala Ser 195 200 205 Tyr Lys Ala Ala Ile Pro Gly Tyr Cys Asn Gln Asn Asp Pro Asn Ile 210 215 220 Lys Val Pro Ile Asn Asp His Ser Ile Pro Gln Thr Tyr Lys Ile Pro 225 230 235 240 Gly Pro Pro Val Phe Lys Gly Thr Ala Ser Lys Lys Ala Arg Asp Phe 245 250 255 Thr Ala Met Leu Leu Thr Ser Val Leu Gly Ser Ala Ala Leu Leu Ala 260 265 270 Ser Gly Ala Ala Ala His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Ala Gly 275 280 285 Lys Asn Tyr Pro Gly Tyr Gln Gly Phe Ser Pro Ala Asn Ser Pro Asn 290 295 300 Val Ile Gln Trp Gln Trp His Asp Tyr Asn Pro Val Leu Ser Cys Ser 305 310 315 320 Asp Ser Lys Leu Arg Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asn Ala 325 330 335 Thr Ala Ala Pro Gly Asp Thr Ile Thr Ala Ile Trp Ala Gln Trp Thr 340 345 350 His Ser Gln Gly Pro Ile Leu Val Trp Met Tyr Lys Cys Pro Gly Ser 355 360 365 Phe Ser Ser Cys Asp Gly Ser Gly Ala Gly Trp Phe Lys Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Gly Phe His Gly Asp Gly Val Lys Val Phe Leu Asp Thr Glu Asn 385 390 395 400 Pro Ser Gly Trp Asp Ile Ala Lys Leu Val Gly Gly Asn Lys Gln Trp 405 410 415 Ser Ser Lys Val Pro Glu Gly Leu Ala Pro Gly Asn Tyr Leu Val Arg 420 425 430 His Glu Leu Ile Ala Leu His Gln Ala Asn Asn Pro Gln Phe Tyr Pro 435 440 445 Glu Cys Ala Gln Val Val Ile Thr Gly Ser Gly Thr Ala Gln Pro Asp 450 455 460 Ala Ser Tyr 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tggctggtac gccgaggacc tagacctggg cttcatctcc cctgaccaat acaccacgcc 240 cgacattgtc tgtcacaaga acgcggcccc aggtgccatt tctgccactg cagcggccgg 300 cagcaacatc gtcttccaat ggggccctgg cgtctggcct cacccctacg gtcccatcgt 360 tacctacgtg gctgagtgca gcggatcgtg cacgaccgtg aacaagaaca acctgcgctg 420 ggtcaagatt caggaggccg gcatcaacta taacacccaa gtctgggcgc agcaggatct 480 gatcaaccag ggcaacaagt ggactgtgaa gatcccgtcg agcctcaggc ccggaaacta 540 tgtcttccgc catgaacttc ttgctgccca tggtgcctct agtgcgaacg gcatgcagaa 600 ctatcctcag tgcgtgaaca tcgccgtcac aggctcgggc acgaaagcgc tccctgccgg 660 aactcctgca actcagctct acaagcccac tgaccctggc atcttgttca acccttacac 720 aacaatcacg agctacacca tccctggccc agccctgtgg caaggctaga tccaggggta 780 cggtgttggc gttcgtgaag tcggagctgt tgacaaggat atctgatgat gaacggagag 840 gactgatggg cgtgactgag tgtatatatt tttgatgacc aaattgtata cgaaatccga 900 acgcatggtg atcattgttt atccctgtag tatattgtct ccaggctgct aagagcccac 960 cgggtgtatt acggcaacaa agtcaggaat ttgggtggca atgaacgcag gtctccatga 1020 atgtatatgt gaagaggcat cggctggcat gggcattacc agatataggc cctgtgaaac 1080 atatagtact tgaacgtgct actggaacgg atcataagca agtcatcaac atgtgaaaaa 1140 acactacatg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1172 <210> 14 <211> 249 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 14 Met Lys Ser Cys Ala Ile Leu Ala Ala Leu Gly Cys Leu Ala Gly Ser 1 5 10 15 Val Leu Gly His Gly Gln Val Gln Asn Phe Thr Ile Asn Gly Gln Tyr 20 25 30 Asn Gln Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr Tyr Gln Lys Gln Asn Thr Gly 35 40 45 His Phe Pro Asn Val Ala Gly Trp Tyr Ala Glu Asp Leu Asp Leu Gly 50 55 60 Phe Ile Ser Pro Asp Gln Tyr Thr Thr Pro Asp Ile Val Cys His Lys 65 70 75 80 Asn Ala Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ser Asn 85 90 95 Ile Val Phe Gln Trp Gly Pro Gly Val Trp Pro His Pro Tyr Gly Pro 100 105 110 Ile Val Thr Tyr Val Val Glu Cys Ser Gly Ser Cys Thr Thr Val Asn 115 120 125 Lys Asn Asn Leu Arg Trp Val Lys Ile Gln Glu Ala Gly Ile Asn Tyr 130 135 140 Asn Thr Gln Val Trp Ala Gln Gln Asp Leu Ile Asn Gln Gly Asn Lys 145 150 155 160 Trp Thr Val Lys 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ccatgagttt atctatccct 2160 ggatcaactc taccgacctg aaggcatcgt ctgacgattc taactacggc tgggaagact 2220 ccaagtatat tcccgaaggc gccacggatg ggtctgccca gccccgtttg cccgctagtg 2280 gtggtgccgg aggaaacccc ggtctgtacg aggatctttt ccgcgtctct gtgaaggtca 2340 agaacacggg caatgtcgcc ggtgatgaag ttcctcagct gtacgtttcc ctaggcggcc 2400 cgaatgagcc caaggtggta ctgcgcaagt ttgagcgtat tcacttggcc ccttcgcagg 2460 aggccgtgtg gacaacgacc cttacccgtc gtgaccttgc aaactgggac gtttcggctc 2520 aggactggac cgtcactcct taccccaaga cgatctacgt tggaaactcc tcacggaaac 2580 tgccgctcca ggcctcgctg cctaaggccc agtaaggggc aagtcctgat tgtacagagc 2640 atttcgagat ttatgatgta catgtttatg aatgacctag ggtagggtaa tacttagtag 2700 ggttagttct aattcttgga gtcaagtatt gactcactgg gccgataaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa a 2771 <210> 16 <211> 861 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 16 Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Val Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser 20 25 30 Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp 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atgagattcg gttggctcga ggtggccgct ctgacggccg cttctgtagc caatgcccag 60 gtttgtgatg ctttcccgtc attgtttcgg atatagttga caatagtcat ggaaataatc 120 aggaattggc tttctctcca ccattctacc cttcgccttg ggctgatggc cagggagagt 180 gggcagatgc ccatcgacgc gccgtcgaga tcgtttctca gatgacactg gcggagaagg 240 ttaaccttac aacgggtact gggtgggttg cgactttttt gttgacagtg agctttcttc 300 actgaccatc tacacagatg ggaaatggac cgatgcgtcg gtcaaaccgg cagcgttccc 360 aggtaagctt gcaattctgc aacaacgtgc aagtgtagtt gctaaaacgc ggtggtgcag 420 acttggtatc aactggggtc tttgtggcca ggattcccct ttgggtatcc gtttctgtga 480 gctatacccg cggagtcttt cagtccttgt attatgtgct gatgattgtc tctgtatagc 540 tgacctcaac tccgccttcc ctgctggtac taatgtcgcc gcgacatggg acaagacact 600 cgcctacctt cgtggcaagg ccatgggtga ggaattcaac gacaagggcg tggacatttt 660 gctggggcct gctgctggtc ctctcggcaa atacccggac ggcggcagaa tctgggaagg 720 cttctctcct gatccggttc tcactggtgt acttttcgcc gaaactatca agggtatcca 780 agacgcgggt gtgattgcta ctgccaagca ttacattctg aatgaacagg agcatttccg 840 acaggttggc gaggcccagg gatatggtta caacatcacg gagacgatca gctccaacgt 900 ggatgacaag accatgcacg agttgtacct ttggtgagta gttgacactg caaatgagga 960 ccttgattga tttgactgac ctggaatgca ggccctttgc agatgctgtg cgcggtaaga 1020 ttttccgtag acttgacctc gcgacgaaga aatcgctgac gaaccatcgt agctggcgtt 1080 ggcgctgtca tgtgttccta caatcaaatc aacaacagct acggttgtca aaacagtcaa 1140 actctcaaca agctcctcaa ggctgagctg ggcttccaag gcttcgtcat gagtgactgg 1200 agcgctcacc acagcggtgt cggcgctgcc ctcgctgggt tggatatgtc gatgcctgga 1260 gacatttcct tcgacgacgg actctccttc tggggcacga acctaactgt cagtgttctt 1320 aacggcaccg ttccagcctg gcgtgtcgat gacatggctg ttcgtatcat gaccgcgtac 1380 tacaaggttg gtcgtgaccg tcttcgtatt ccccctaact tcagctcctg gacccgggat 1440 gagtacggct gggagcattc tgctgtctcc gagggagcct ggaccaaggt gaacgacttc 1500 gtcaatgtgc agcgcagtca ctctcagatc atccgtgaga ttggtgccgc tagtacagtg 1560 ctcttgaaga acacgggtgc tcttcctttg accggcaagg aggttaaagt gggtgttctc 1620 ggtgaagacg ctggttccaa cccgtggggt gctaacggct gccccgaccg cggctgtgat 1680 aacggcactc ttgctatggc ctggggtagt ggtactgcca acttccctta ccttgtcacc 1740 cccgagcagg ctatccagcg agaggtcatc agcaacggcg gcaatgtctt tgctgtgact 1800 gataacgggg ctctcagcca gatggcagat gttgcatctc aatccaggtg agtgcgggct 1860 cttagaaaaa gaacgttctc tgaatgaagt tttttaacca ttgcgaacag cgtgtctttg 1920 gtgtttgtca acgccgactc tggagagggt ttcatcagtg tcgacggcaa cgagggtgac 1980 cgcaaaaatc tcactctgtg gaagaacggc gaggccgtca ttgacactgt tgtcagccac 2040 tgcaacaaca cgattgtggt tattcacagt gttgggcccg tcttgatcga ccggtggtat 2100 gataacccca acgtcactgc catcatctgg gccggcttgc ccggtcagga gagtggcaac 2160 tccctggtcg acgtgctcta tggccgcgtc aaccccagcg ccaagacccc gttcacctgg 2220 ggcaagactc gggagtctta cggggctccc ttgctcaccg agcctaacaa tggcaatggt 2280 gctccccagg atgatttcaa cgagggcgtc ttcattgact accgtcactt tgacaagcgc 2340 aatgagaccc ccatttatga gtttggccat ggcttgagct acaccacctt tggttactct 2400 caccttcggg ttcaggccct caatagttcg agttcggcat atgtcccgac tagcggagag 2460 accaagcctg cgccaaccta tggtgagatc ggtagtgccg ccgactacct gtatcccgag 2520 ggtctcaaaa gaattaccaa 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gacgtgcttt 120 gacttgacta attgttttac atacagcccg gatttctgca cgggccccaa gccatagaat 180 cgttctcaga accgttctac ccgtcgccct ggatgaatcc tcacgccgag ggctgggagg 240 ccgcatatca gaaagctcaa gattttgtct cgcaactcac tatcttggag aaaataaatc 300 tgaccaccgg tgttgggtaa gtctctccga ctgcttctgg gtcacggtgc gacgagccac 360 tgactttttg aagctgggaa aatgggccgt gtgtaggaaa cactggatca attcctcgtc 420 tcggattcaa aggattttgt acccaggatt caccacaggg tgttcggttc gcagattatt 480 cctccgcttt cacatctagc caaatggccg ccgcaacatt tgaccgctca attctttatc 540 aacgaggcca agccatggca caggaacaca aggctaaggg tatcacaatt caattgggcc 600 ctgttgccgg ccctctcggt cgcatccccg agggcggccg caactgggaa ggattctccc 660 ctgatcctgt cttgactggt atagccatgg ctgagacaat taagggcatg caggatactg 720 gagtgattgc ttgcgctaaa cattatattg gaaacgagca ggagcacttc cgtcaagtgg 780 gtgaagctgc gggtcacgga tacactattt ccgatactat ttcatctaat attgacgacc 840 gtgctatgca tgagctatac ttgtggccat ttgctgatgc cgttcgcgct ggtgtgggtt 900 ctttcatgtg ctcatactct cagatcaaca actcctacgg atgccaaaac agtcagaccc 960 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ctcaccatga accagtacat gcccagcagc 360 tctggcggct acagcagcgt ctctcctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420 gtgatgctga agctcaacgg ccaggagctg agcttcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480 tgtggagaga acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgccaaccag 540 tataacacgg ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600 acatggagga acggcaccct caacactagc caccagggct tctgctgcaa cgagatggat 660 atcctggagg gcaactcgag ggcgaatgcc ttgacccctc actcttgcac ggccacggcc 720 tgcgactctg ccggttgcgg cttcaacccc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780 cccggagata ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840 aacggctcgc cctcgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900 gacatcccca gcgcccagcc cggcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960 tacggcggcc tcgccaccat gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020 atttggaacg acaacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080 agcagcaccg agggcaaccc atccaacatc ctggccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140 ttctccaaca tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc gcccccgccc 1200 ccgcctgcgt ccagcacgac gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260 ccgagctgca cgcagactca ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag 1320 acgtgcacgt cgggcactac gtgccagtat agcaacgact actactcgca atgcctt 1377 <210> 74 <211> 459 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 74 Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ala Arg Leu Val Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val 35 40 45 Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His 50 55 60 Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr 65 70 75 80 Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly 85 90 95 Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr 100 105 110 Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser 115 120 125 Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys 130 135 140 Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser 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Trichoderma reesei <400> 78 Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr 20 25 30 Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys 35 40 45 Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp 50 55 60 Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln 65 70 75 80 Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro 85 90 95 Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val 100 105 110 Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser 115 120 125 Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly 130 135 140 Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp 145 150 155 160 Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val 165 170 175 Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe 180 185 190 Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val 195 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aaggttcaga accagtggta ctcccagtgt 720 cttcct 726 <210> 80 <211> 242 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 80 Met Lys Ala Thr Leu Val Leu Gly Ser Leu Ile Val Gly Ala Val Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Lys Ala Thr Thr Thr Arg Tyr Tyr Asp Gly Gln Glu Gly Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Gly Ser Ser Ser Gly Ala Phe Pro Trp Gln Leu Gly Ile 35 40 45 Gly Asn Gly Val Tyr Thr Ala Ala Gly Ser Gln Ala Leu Phe Asp Thr 50 55 60 Ala Gly Ala Ser Trp Cys Gly Ala Gly Cys Gly Lys Cys Tyr Gln Leu 65 70 75 80 Thr Ser Thr Gly Gln Ala Pro Cys Ser Ser Cys Gly Thr Gly Gly Ala 85 90 95 Ala Gly Gln Ser Ile Ile Val Met Val Thr Asn Leu Cys Pro Asn Asn 100 105 110 Gly Asn Ala Gln Trp Cys Pro Val Val Gly Gly Thr Asn Gln Tyr Gly 115 120 125 Tyr Ser Tyr His Phe Asp Ile Met Ala Gln Asn Glu Ile Phe Gly Asp 130 135 140 Asn Val Val Val Asp Phe Glu Pro Ile Ala Cys Pro Gly Gln Ala Ala 145 150 155 160 Ser Asp Trp Gly Thr Cys Leu Cys Val Gly Gln Gln Glu Thr Asp Pro 165 170 175 Thr Pro Val Leu Gly Asn Asp Thr Gly Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser 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acgtcacccc cttcatcaac 600 ggcctcggca acatcgaggg caagggcgcg tgctgcaacg agatggatat ctgggaggcc 660 aacgcgcggg cgcagcacat cgcgccgcac ccgtgcagca aggcggggcc gtacctgtgc 720 gagggcgccg agtgcgagtt cgacggcgtg tgcgacaaga acggctgcgc ctggaacccg 780 taccgggtca acgtgacgga ctactacggc gagggcgccg agttcagggt ggacacgacc 840 cggcccttct cggtcgtcac gcagttccgc gccggcggcg acgcgggggg cggcaagctc 900 gagagcatct accggctctt cgtccaggac ggcagggtga ttgagtcgta cgtcgtcgac 960 aagcccggcc tgcccccgac ggaccgcatg acggacgagt tctgcgccgc caccggcgcc 1020 gcccgcttca cggagctcgg cgccatggag gccatgggcg acgccctgac gcgcggcatg 1080 gtcctcgccc tcagcatctg gtggagcgag ggcgacaaca tgaactggct cgactcgggc 1140 gaggccggcc cctgcgaccc ggacgagggc aacccgtcca acatcatccg cgtccagccc 1200 gacccggagg tcgtcttcag caacctgcgc tggggcgaga tcggctcaac ctacgagtcc 1260 gccgtcgacg ggcccgtcgg caagggcaag ggcaagggca agggcaaggc tcccgccggc 1320 gacggcaacg ggaaggagaa gagcaatggc aagcgcttca ggaggttctg a 1371 <210> 82 <211> 456 <212> PRT <213> Myceliophthora thermophila <400> 82 Met Gly Arg Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Ala Ser Leu Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ala Lys Ala Gln Thr Pro Gly Glu Gly Glu Glu Val His Pro Gln 20 25 30 Ile Thr Thr Tyr Arg Cys Thr Lys Ala Asp Gly Cys Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Asn Tyr Ile Val Leu Asp Ala Leu Ser His Pro Val His Gln Val Asp 50 55 60 Asn Pro Tyr Asn Cys Gly Asp Trp Gly Gln Lys Pro Asn Glu Thr Ala 65 70 75 80 Cys Pro Asp Leu Glu Ser Cys Ala Arg Asn Cys Ile Met Asp Pro Val 85 90 95 Ser Asp Tyr Gly Arg His Gly Val Ser Thr Asp Gly Thr Ser Leu Arg 100 105 110 Leu Lys Gln Leu Val Gly Gly Asn Val Val Ser Pro Arg Val Tyr Leu 115 120 125 Leu Asp Glu Thr Lys Glu Arg Tyr Glu Met Leu Lys Leu Thr Gly Asn 130 135 140 Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn 145 150 155 160 Ser Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Asp Ala Thr Gly Ala Arg Ser Glu 165 170 175 Leu Asn Pro Gly Gly Ala Thr Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln 180 185 190 Cys Tyr Val Thr Pro Phe Ile Asn Gly Leu Gly Asn Ile Glu Gly Lys 195 200 205 Gly Ala Cys 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Ser Ala Val Asp Gly Pro Val Gly Lys Gly Lys Gly Lys 420 425 430 Gly Lys Gly Lys Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asn Gly Lys Glu Lys Ser 435 440 445 Asn Gly Lys Arg Phe Arg Arg Phe 450 455 <210> 83 <211> 744 <212> DNA <213> Chrysosporium lucknowense <400> 83 atgcagccgt ttctgctctt gttcctctcg tcggtcacgg cggcgagccc cctgacggcg 60 ctcgacaagc ggcagcaggc gacgttgtgc gagcagtacg gctactggtc gggcaacggt 120 tacgaggtca acaacaacaa ctggggcaag gattcggcct cgggcggcca tcagtgcacc 180 tacgtcgaca gcagcagctc cagcggcgtc gcctggcaca cgacctggca gtgggaagga 240 ggccagaacc aggtcaagag cttcgccaac tgcggcctgc aggtgcccaa gggcaggacc 300 atctcgtcca tcagcaacct gcagacctcc atctcgtggt cctacagcaa caccaacatc 360 cgcgccaacg tggcctacga cctcttcacc gcggcagacc cgaaccacgc gaccagcagc 420 ggcgactacg agctcatgat ctggctggcg agattcggcg acgtctaccc catcggctcg 480 tcccagggcc acgtcaacgt ggccggccag gactgggagc tgtggacggg cttcaacggc 540 aacatgcggg tctacagctt cgtagcgccc agcccccgca acagcttcag cgccaacgtc 600 aaggacttct tcaactatct ccagtccaac cagggcttcc 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ggcgctcccc cgaacggctg gggcgaccgc tacggcggca tccattccaa ggaagagtgc 540 gaatccttcc cggaggccct caagcccggc tgcaactggc gcttcgactg gttccaaaac 600 gccgacaacc cgtcggtcac cttccaggag gtggcctgcc cgtcggagct cacgtccaag 660 agcggctgct cccgttaa 678 <210> 86 <211> 225 <212> PRT <213> Chrysosporium lucknowense <400> 86 Met His Leu Ser Ala Thr Thr Gly Phe Leu Ala Leu Pro Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ala Gln Leu Ser Gly Ser Gly Gln Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys 20 25 30 Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ser Ser Pro Val 35 40 45 Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Leu Asn Asp Gly Gly Ser Thr 50 55 60 Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Ser Gln 65 70 75 80 Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val 85 90 95 Lys Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ser Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu 100 105 110 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Ile Val Gln 115 120 125 Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Ala 130 135 140 Ile Pro Gly Gly Gly Val 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ctctacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540 ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600 aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660 ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720 gctcttaccc cccacccttg cacgactgtc ggccaggaga tctgcgaggg tgatgggtgc 780 ggcggaactt actccgataa cagatatggc ggcacttgcg atcccgatgg ctgcgactgg 840 aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900 accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960 tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020 aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080 tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140 atgagtctgt gggatgatta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca 1200 aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag ctccggtgtc 1260 cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa catcaagttc 1320 ggacccattg 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Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln 355 360 365 Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp 370 375 380 Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr 385 390 395 400 Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr 405 410 415 Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys 420 425 430 Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn 435 440 445 Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr 450 455 460 Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln 465 470 475 480 Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val 485 490 495 Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln 500 505 510 Cys Leu <210> 89 <211> 1413 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 89 atgattgtcg gcattctcac cacgctggct acgctggcca cactcgcagc tagtgtgcct 60 ctagaggagc ggcaagcttg ctcaagcgtc tggggccaat gtggtggcca gaattggtcg 120 ggtccgactt gctgtgcttc cggaagcaca tgcgtctact ccaacgacta ttactcccag 180 tgtcttcccg gcgctgcaag ctcaagctcg tccacgcgcg ccgcgtcgac gacttctcga 240 gtatccccca caacatcccg gtcgagctcc gcgacgcctc cacctggttc tactactacc 300 agagtacctc cagtcggatc gggaaccgct acgtattcag gcaacccttt tgttggggtc 360 actccttggg ccaatgcata ttacgcctct gaagttagca gcctcgctat tcctagcttg 420 actggagcca tggccactgc tgcagcagct gtcgcaaagg ttccctcttt tatgtggcta 480 gatactcttg acaagacccc tctcatggag caaaccttgg ccgacatccg caccgccaac 540 aagaatggcg gtaactatgc cggacagttt gtggtgtatg acttgccgga tcgcgattgc 600 gctgcccttg cctcgaatgg cgaatactct attgccgatg gtggcgtcgc caaatataag 660 aactatatcg acaccattcg tcaaattgtc gtggaatatt ccgatatccg gaccctcctg 720 gttattgagc ctgactctct tgccaacctg gtgaccaacc tcggtactcc aaagtgtgcc 780 aatgctcagt cagcctacct tgagtgcatc aactacgccg tcacacagct gaaccttcca 840 aatgttgcga tgtatttgga cgctggccat gcaggatggc ttggctggcc ggcaaaccaa 900 gacccggccg ctcagctatt tgcaaatgtt tacaagaatg catcgtctcc gagagctctt 960 cgcggattgg caaccaatgt cgccaactac aacgggtgga acattaccag ccccccatcg 1020 tacacgcaag gcaacgctgt ctacaacgag aagctgtaca tccacgctat tggacctctt 1080 cttgccaatc acggctggtc caacgccttc ttcatcactg atcaaggtcg atcgggaaag 1140 cagcctaccg gacagcaaca gtggggagac tggtgcaatg tgatcggcac cggatttggt 1200 attcgcccat ccgcaaacac tggggactcg ttgctggatt cgtttgtctg ggtcaagcca 1260 ggcggcgagt gtgacggcac cagcgacagc agtgcgccac gatttgactc ccactgtgcg 1320 ctcccagatg ccttgcaacc ggcgcctcaa gctggtgctt ggttccaagc ctactttgtg 1380 cagcttctca caaacgcaaa cccatcgttc ctg 1413 <210> 90 <211> 471 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 90 Met Ile Val Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly 20 25 30 Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly 35 40 45 Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser Arg 65 70 75 80 Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro Gly 85 90 95 Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly Ser Gly Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Ser Gly Asn Pro Phe Val Gly Val Thr Pro Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr 115 120 125 Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala Ile Pro Ser Leu Thr Gly Ala Met 130 135 140 Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val Pro Ser Phe Met Trp Leu 145 150 155 160 Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu Met Glu Gln Thr Leu Ala Asp Ile 165 170 175 Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly Asn Tyr Ala Gly Gln Phe Val Val 180 185 190 Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu 195 200 205 Tyr Ser Ile Ala Asp Gly Gly Val Ala Lys Tyr Lys Asn Tyr Ile Asp 210 215 220 Thr Ile Arg Gln Ile Val Val Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Thr Leu Leu 225 230 235 240 Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly Thr 245 250 255 Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Asn Tyr 260 265 270 Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala 275 280 285 Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gln Asp Pro Ala Ala 290 295 300 Gln Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala Leu 305 310 315 320 Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn Ile Thr 325 330 335 Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lys Leu 340 345 350 Tyr Ile His Ala Ile Gly Pro Leu Leu Ala Asn His Gly Trp Ser Asn 355 360 365 Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr Gly 370 375 380 Gln Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly 385 390 395 400 Ile Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe Val 405 410 415 Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser Ala 420 425 430 Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro Asp Ala Leu Gln Pro Ala 435 440 445 Pro Gln Ala Gly Ala Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Val Gln Leu Leu Thr 450 455 460 Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu 465 470 <210> 91 <211> 1648 <212> DNA <213> Chrysosporium lucknowense <220> <221> misc_feature <222> (1162)..(1162) <223> N=A,C,G, OR T <400> 91 atgtacgcca agttcgcgac cctcgccgcc cttgtggctg gcgccgctgc tcagaacgcc 60 tgcactctga ccgctgagaa ccacccctcg ctgacgtggt ccaagtgcac gtctggcggc 120 agctgcacca gcgtccaggg ttccatcacc atcgacgcca actggcggtg gactcaccgg 180 accgatagcg ccaccaactg ctacgagggc aacaagtggg atacttcgta ctgcagcgat 240 ggtccttctt gcgcctccaa gtgctgcatc gacggcgctg actactcgag cacctatggc 300 atcaccacga gcggtaactc cctgaacctc aagttcgtca ccaagggcca gtactcgacc 360 aacatcggct cgcgtaccta cctgatggag agcgacacca agtaccagag taagttcctc 420 tcgcacccgg ccgccgggag atgatggcgc ccagcccgct gacgcgaatg acacagtgtt 480 ccagctcctc ggcaacgagt tcaccttcga tgtcgacgtc tccaacctcg gctgcggcct 540 caatggcgcc ctctacttcg tgtccatgga tgccgatggt ggcatgtcca agtactcggg 600 caacaaggca ggtgccaagt acggtaccgg ctactgtgat tctcagtgcc cccgcgacct 660 caagttcatc aacggcgagg ccaacgtaga gaactggcag agctcgacca acgatgccaa 720 cgccggcacg ggcaagtacg gcagctgctg ctccgagatg gacgtctggg aggccaacaa 780 catggccgcc gccttcactc cccacccttg caccgtgatc ggccagtcgc gctgcgaggg 840 cgactcgtgc ggcggtacct acagcaccga ccgctatgcc ggcatctgcg accccgacgg 900 atgcgacttc aactcgtacc gccagggcaa caagaccttc tacggcaagg gcatgacggt 960 cgacacgacc aagaagatca cggtcgtcac ccagttcctc aagaactcgg ccggcgagct 1020 ctccgagatc aagcggttct acgtccagaa cggcaaggtc atccccaact ccgagtccac 1080 catcccgggc gtcgagggca actccatcac ccaggactgg tgcgaccgcc agaaggccgc 1140 cttcggcgac gtgaccgact tncaggacaa gggcggcatg gtccagatgg gcaaggccct 1200 cgcggggccc atggtcctcg tcatgtccat ctgggacgac cacgccgtca acatgctctg 1260 gctcgactcc acctggccca tcgacggcgc cggcaagccg ggcgccgagc gcggtgcctg 1320 ccccaccacc tcgggcgtcc ccgctgaggt cgaggccgag gcccccaact ccaacgtcat 1380 cttctccaac atccgcttcg gccccatcgg ctccaccgtc tccggcctgc ccgacggcgg 1440 cagcggcaac cccaacccgc ccgtcagctc gtccaccccg gtcccctcct cgtccaccac 1500 atcctccggt tcctccggcc cgactggcgg cacgggtgtc gctaagcact atgagcaatg 1560 cggaggaatc gggttcactg gccctaccca gtgcgagagc ccctacactt gcaccaagct 1620 gaatgactgg tactcgcagt gcctgtaa 1648 <210> 92 <211> 526 <212> PRT <213> Chrysosporium lucknowense <220> <221> MISC_FEATURE <222> (365)..(365) <223> X=ANY AMINO ACID <400> 92 Met Tyr Ala Lys Phe Ala Thr Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gln Asn Ala Cys Thr Leu Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr 20 25 30 Trp Ser Lys Cys Thr Ser Gly Gly Ser Cys Thr Ser Val Gln Gly Ser 35 40 45 Ile Thr Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Arg Thr Asp Ser Ala 50 55 60 Thr Asn Cys Tyr Glu Gly Asn Lys Trp Asp Thr Ser Tyr Cys Ser Asp 65 70 75 80 Gly Pro Ser Cys Ala Ser Lys Cys Cys Ile Asp Gly Ala Asp Tyr Ser 85 90 95 Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Asn Leu Lys Phe 100 105 110 Val Thr Lys Gly Gln Tyr Ser Thr Asn Ile Gly Ser Arg Thr Tyr Leu 115 120 125 Met Glu Ser Asp Thr Lys Tyr Gln Met Phe Gln Leu Leu Gly Asn Glu 130 135 140 Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn Gly 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr 165 170 175 Ser Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser 180 185 190 Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val Glu 195 200 205 Asn Trp Gln Ser Ser Thr Asn Asp Ala Asn Ala Gly Thr Gly Lys Tyr 210 215 220 Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Asn Met Ala 225 230 235 240 Ala Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Trp Val Ile Gly Gln Ser Arg Cys 245 250 255 Glu Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Tyr Ala Gly 260 265 270 Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Gln Gly Asn 275 280 285 Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys Ile 290 295 300 Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Lys Asn Ser Ala Gly Glu Leu Ser Glu 305 310 315 320 Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Glu 325 330 335 Ser Thr Ile Pro Gly Val Glu Gly Asn Ser Ile Thr Gln Asp Trp Cys 340 345 350 Asp Arg Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Val Thr Asp Xaa Gln Asp Lys 355 360 365 Gly Gly Met Val Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val Leu 370 375 380 Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Val Asn Met Leu Trp Leu Asp 385 390 395 400 Ser Thr Trp Pro Ile Asp Gly Ala Gly Lys Pro Gly Ala Glu Arg Gly 405 410 415 Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala 420 425 430 Pro Asn Ser Asn Val Ile Phe Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly 435 440 445 Ser Thr Val Ser Gly Leu Pro Asp Gly Gly Ser Gly Asn Pro Asn Pro 450 455 460 Pro Val Ser Ser Ser Thr Pro Val Pro Ser Ser Ser Thr Thr Ser Ser 465 470 475 480 Gly Ser Ser Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Val Ala Lys His Tyr Glu 485 490 495 Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr Gly Pro Thr Gln Cys Glu Ser Pro 500 505 510 Tyr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 515 520 525 <210> 93 <211> 1353 <212> DNA <213> Myceliophthora thermophila <400> 93 atgaagcagt acctccagta cctcgcggcg accctgcccc tggtgggcct ggccacggcc 60 cagcaggcgg gtaacctgca gaccgagact caccccaggc tcacttggtc caagtgcacg 120 gccccgggat cctgccaaca ggtcaacggc gaggtcgtca tcgactccaa ctggcgctgg 180 gtgcacgacg agaacgcgca gaactgctac gacggcaacc agtggaccaa cgcttgcagc 240 tctgccaccg actgcgccga gaattgcgcg ctcgagggtg ccgactacca gggcacctat 300 ggcgcctcga ccagcggcaa tgccctgacg ctcaccttcg tcactaagca cgagtacggc 360 accaacattg gctcgcgcct ctacctcatg aacggcgcga acaagtacca gatgttcacc 420 ctcaagggca acgagctggc cttcgacgtc gacctctcgg ccgtcgagtg cggcctcaac 480 agcgccctct acttcgtggc catggaggag gatggcggtg tgtcgagcta cccgaccaac 540 acggccggtg ctaagttcgg cactgggtac tgcgacgccc aatgcgcacg cgacctcaag 600 ttcgtcggcg gcaagggcaa catcgagggc tggaagccgt ccaccaacga tgccaatgcc 660 ggtgtcggtc cttatggcgg gtgctgcgct gagatcgacg tctgggagtc gaacaagtat 720 gctttcgctt tcaccccgca cggttgcgag aaccctaaat accacgtctg cgagaccacc 780 aactgcggtg gcacctactc cgaggaccgc ttcgctggtg actgcgatgc caacggctgc 840 gactacaacc cctaccgcat gggcaaccag gacttctacg gtcccggctt gacggtcgat 900 accagcaaga agttcaccgt cgtcagccag ttcgaggaga acaagctcac ccagttcttc 960 gtccaggacg gcaagaagat tgagatcccc ggccccaagg tcgagggcat cgatgcggac 1020 agcgccgcta tcacccctga gctgtgcagt gccctgttca aggccttcga tgaccgtgac 1080 cgcttctcgg aggttggcgg cttcgatgcc atcaacacgg ccctcagcac tcccatggtc 1140 ctcgtcatgt ccatctggga tgatcactac gccaatatgc tctggctcga ctcgagctac 1200 ccccctgaga aggctggcca gcctggcggt gaccgtggcc cgtgtcctca ggactctggc 1260 gtcccggccg acgttgaggc tcagtaccct aatgccaagg tcatctggtc caacatccgc 1320 ttcggcccca tcggctcgac tgtcaacgtc taa 1353 <210> 94 <211> 450 <212> PRT <213> Myceliophthora thermophila <400> 94 Met Lys Gln Tyr Leu Gln Tyr Leu Ala Ala Thr Leu Pro Leu Val Gly 1 5 10 15 Leu Ala Thr Ala Gln Gln Ala Gly Asn Leu Gln Thr Glu Thr His Pro 20 25 30 Arg Leu Thr Trp Ser Lys Cys Thr Ala Pro Gly Ser Cys Gln Gln Val 35 40 45 Asn Gly Glu Val Val Ile Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Asp Glu 50 55 60 Asn Ala Gln Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Gln Trp Thr Asn Ala Cys Ser 65 70 75 80 Ser Ala Thr Asp Cys Ala Glu Asn Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asp Tyr 85 90 95 Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asn Ala Leu Thr Leu Thr 100 105 110 Phe Val Thr Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr 115 120 125 Leu Met Asn Gly Ala Asn Lys Tyr Gln Met Phe Thr Leu Lys Gly Asn 130 135 140 Glu Leu Ala Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Val Glu Cys Gly Leu Asn 145 150 155 160 Ser Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Val Ser Ser 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp 180 185 190 Ala Gln Cys Ala Arg Asp Leu Lys Phe Val Gly Gly Lys Gly Asn Ile 195 200 205 Glu Gly Trp Lys Pro Ser Thr Asn Asp Ala Asn Ala Gly Val Gly Pro 210 215 220 Tyr Gly Gly Cys Cys Ala Glu Ile Asp Val Trp Glu Ser Asn Lys Tyr 225 230 235 240 Ala Phe Ala Phe Thr Pro His Gly Cys Glu Asn Pro Lys Tyr His Val 245 250 255 Cys Glu Thr Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp Arg Phe Ala 260 265 270 Gly Asp Cys Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly 275 280 285 Asn Gln Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Lys 290 295 300 Phe Thr Val Val Ser Gln Phe Glu Glu Asn Lys Leu Thr Gln Phe Phe 305 310 315 320 Val Gln Asp Gly Lys Lys Ile Glu Ile Pro Gly Pro Lys Val Glu Gly 325 330 335 Ile Asp Ala Asp Ser Ala Ala Ile Thr Pro Glu Leu Cys Ser Ala Leu 340 345 350 Phe Lys Ala Phe Asp Asp Arg Asp Arg Phe Ser Glu Val Gly Gly Phe 355 360 365 Asp Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ser Thr Pro Met Val Leu Val Met Ser 370 375 380 Ile Trp Asp Asp His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Ser Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Lys Ala Gly Gln Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro Cys Pro 405 410 415 Gln Asp Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ala Gln Tyr Pro Asn Ala 420 425 430 Lys Val Ile Trp Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Val 435 440 445 Asn Val 450 <210> 95 <211> 1446 <212> DNA <213> Thielavia terrestris <400> 95 atggctcaga agctccttct cgccgccgcc cttgcggcca gcgccctcgc tgctcccgtc 60 gtcgaggagc gccagaactg cggttccgtc tggagccaat gcggcggcat tggctggtcc 120 ggcgcgacct gctgcgcttc gggcaatacc tgcgttgagc tgaacccgta ctactcgcag 180 tgcctgccca acagccaggt gactacctcg accagcaaga ccacctccac caccaccagg 240 agcagcacca ccagccacag cagcggtccc accagcacga gcaccaccac caccagcagt 300 cccgtggtca ctaccccgcc gagtacctcc atccccggcg gtgcctcgtc aacggccagc 360 tggtccggca acccgttctc gggcgtgcag atgtgggcca acgactacta cgcctccgag 420 gtctcgtcgc tggccatccc cagcatgacg ggcgccatgg ccaccaaggc ggccgaggtg 480 gccaaggtgc ccagcttcca gtggcttgac cgcaacgtca ccatcgacac gctgttcgcc 540 cacacgctgt cgcagatccg cgcggccaac cagaaaggcg ccaacccgcc ctacgcgggc 600 atcttcgtgg tctacgacct tccggaccgc gactgcgccg ccgccgcgtc caacggcgag 660 ttctccatcg cgaacaacgg ggcggccaac tacaagacgt acatcgacgc gatccggagc 720 ctcgtcatcc agtactcaga catccgcatc atcttcgtca tcgagcccga ctcgctggcc 780 aacatggtga ccaacctgaa cgtggccaag tgcgccaacg ccgagtcgac ctacaaggag 840 ttgaccgtct acgcgctgca gcagctgaac ctgcccaacg tggccatgta cctggacgcc 900 ggccacgccg gctggctcgg ctggcccgcc aacatccagc cggccgccaa cctcttcgcc 960 gagatctaca cgagcgccgg caagccggcc gccgtgcgcg gcctcgccac caacgtggcc 1020 aactacaacg gctggagcct ggccacgccg ccctcgtaca cccagggcga ccccaactac 1080 gacgagagcc actacgtcca ggccctcgcc ccgctgctca ccgccaacgg cttccccgcc 1140 cacttcatca ccgacaccgg ccgcaacggc aagcagccga ccggacaacg gcaatgggga 1200 gactggtgca acgttatcgg aactggcttc ggcgtgcgcc cgacgacaaa caccggcctc 1260 gacatcgagg acgccttcgt ctgggtcaag cccggcggcg agtgcgacgg cacgagcaac 1320 acgacctctc cccgctacga ctaccactgc ggcctgtcgg acgcgctgca gcctgctccg 1380 gaggccggca cttggttcca ggcctacttc gagcagctcc tgaccaacgc caacccgccc 1440 ttttaa 1446 <210> 96 <211> 481 <212> PRT <213> Thielavia terrestris <400> 96 Met Ala Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ala Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ser Val Trp Ser 20 25 30 Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ser Gly 35 40 45 Asn Thr Cys Val Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn 50 55 60 Ser Gln Val Thr Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ser Thr Thr Thr Arg 65 70 75 80 Ser Ser Thr Thr Ser His Ser Ser Gly Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr 85 90 95 Thr Thr Ser Ser Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Ser Ile Pro 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Ser Thr Ala Ser Trp Ser Gly Asn Pro Phe Ser Gly 115 120 125 Val Gln Met Trp Ala Asn Asp Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu 130 135 140 Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Ala Met Ala Thr Lys Ala Ala Glu Val 145 150 155 160 Ala Lys Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile Asp 165 170 175 Thr Leu Phe Ala His Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Gln Lys 180 185 190 Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp Leu Pro 195 200 205 Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile Ala 210 215 220 Asn Asn Gly Ala Ala Asn Tyr Lys Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ser 225 230 235 240 Leu Val Ile Gln Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Phe Val Ile Glu Pro 245 250 255 Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Leu Asn Val Ala Lys Cys Ala 260 265 270 Asn Ala Glu Ser Thr Tyr Lys Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Gln Gln 275 280 285 Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala Gly 290 295 300 Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Asn Leu Phe Ala 305 310 315 320 Glu Ile Tyr Thr Ser Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala 325 330 335 Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Ser Leu Ala Thr Pro Pro Ser 340 345 350 Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Tyr Asp Glu Ser His Tyr Val Gln Ala 355 360 365 Leu Ala Pro Leu Leu Thr Ala Asn Gly Phe Pro Ala His Phe Ile Thr 370 375 380 Asp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Arg Gln Trp Gly 385 390 395 400 Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Thr 405 410 415 Asn Thr Gly Leu Asp Ile Glu Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly 420 425 430 Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asn Thr Thr Ser Pro Arg Tyr Asp Tyr 435 440 445 His Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly Thr 450 455 460 Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro Pro 465 470 475 480 Phe

Claims (27)

  1. 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 첨가하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 방법으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 0.001mM 내지 50mM의 유효 농도로 존재하며, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드의 존재는, 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드에 비하여, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시키고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++, Co++, Mg++, Ca++ 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 폴리펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, X(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(4)는 4개 연속 위치된 임의의 아미노산이다; 및
    (b) [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드, 여기서 x는 임의의 아미노산이고, x(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, x(3)은 3개 연속 위치된 임의의 아미노산이다;
    로 구성되는 군으로부터 선택되며,
    이때 [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는 선택적으로
    H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
    [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], 또는
    H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]와 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]
    를 더 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, X(1,2)는 1개 위치 또는 2개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(3)은 3개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(2)는 2개 연속 위치된 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물의 유효량으로 셀룰로오스-함유 물질을 처리하는 단계를 포함하는 셀룰로오스-함유 물질을 분해 또는 전환하는 방법으로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 0.001mM 내지 50mM의 유효 농도로 존재하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++, Co++, Mg++, Ca++ 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 폴리펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, X(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(4)는 4개 연속 위치된 임의의 아미노산이다; 및
    (b) [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드, 여기서 x는 임의의 아미노산이고, x(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, x(3)은 3개 연속 위치된 임의의 아미노산이다;
    로 구성되는 군으로부터 선택되며,
    이때 [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는 선택적으로
    H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
    [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], 또는
    H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]와 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]
    를 더 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, X(1,2)는 1개 위치 또는 2개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(3)은 3개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(2)는 2개 연속 위치된 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 셀룰로오스-함유 물질을 베타-글루코시다아제의 유효량으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 셀룰로오스-함유 물질을 헤미셀룰라아제, 에스테라아제, 프로테아제, 락카아제, 퍼옥시다아제 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 1개 이상의 효소의 유효량으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 유효 농도가 0.001 mM 내지 50mM로 유지되도록 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도를 보충하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 4 항에 있어서, 분해된 셀룰로오스-함유 물질을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. (a) 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 유효량으로 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물의 유효량으로 셀룰로오스-함유 물질을 당화하는 단계로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 0.001mM 내지 50mM의 유효 농도로 존재하는 단계; (b) 단계 (a)의 당화된 셀룰로오스-함유 물질을 하나 이상의 발효 미생물과 함께 발효시켜 발효 산물을 생성하는 단계; 및 (c) 발효에 의한 발효 산물을 회수하는 단계를 포함하고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 Mn++, Co++, Mg++, Ca++, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 발효 산물을 제조하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 폴리펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, X(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(4)는 4개 연속 위치된 임의의 아미노산이다; 및
    (b) [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드, 여기서 x는 임의의 아미노산이고, x(4,5)는 4 또는 5개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, x(3)은 3개 연속 위치된 임의의 아미노산이다;
    로 구성되는 군으로부터 선택되며,
    이때 [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] 및 [FW]-[TF]-K-[AIV]를 포함하는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는 선택적으로
    H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
    [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], 또는
    H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]와 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]
    를 더 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, X(1,2)는 1개 위치 또는 2개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(3)은 3개 연속 위치된 임의의 아미노산이고, X(2)는 2개 연속 위치된 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 셀룰로오스-함유 물질을 베타-글루코시다아제의 유효량으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 셀룰로오스-함유 물질을 헤미셀룰라아제, 에스테라아제, 프로테아제, 락카아제, 퍼옥시다아제 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 1개 이상의 효소의 유효량으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 유효 농도가 0.001 mM 내지 50mM로 유지되도록 가용성 활성화 2가 금속 양이온의 농도를 보충하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 포함하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 0.001mM 내지 50mM의 유효 농도로 존재하며, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드의 존재는, 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드에 비하여, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시키고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 Mn++, Co++, Mg++, Ca++ 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 폴리펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물.
  19. 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드와 가용성 활성화 2가 금속 양이온을 포함하는 조성물로서, 이때 가용성 활성화 2가 금속 양이온은 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환 동안 0.001mM 내지 50mM의 유효 농도로 존재하며, 가용성 활성화 2가 금속 양이온과 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드의 존재는, 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 없는 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드에 비하여, 셀룰로오스 가수분해 효소 조성물에 의한 셀룰로오스-함유 물질의 분해 또는 전환을 증가시키고, 가용성 활성화 2가 금속 양이온이 Mn++, Co++, Mg++, Ca++ 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 갖는 GH61 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 폴리펩티드; 및
    (b) SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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