KR101897001B1 - 비-간세포를 간세포로 리프로그래밍하기 위한 키트 및 방법 - Google Patents
비-간세포를 간세포로 리프로그래밍하기 위한 키트 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
기능적 간 약물 대사 및 수송 능력을 갖는 세포로의 간세포가 아닌 제1 유형의 세포(비-간세포)의 리프로그래밍을 유도하기 위한 방법이 개시된다. 비-간세포는 간 운명 전환 및 성숙 인자들을 발현 또는 과발현시키기 위해 유도되고, 간세포와 같은 특성들을 갖는 세포로 비-간세포를 전환하기 위해 충분한 시간 동안 체세포 배양 배지, 간세포 배양 배지 및 간세포 성숙 배지에서 배양된다. 본 명세서에 개시된 방법들에 따라 유도된 iHep들은 I 및 II 약물 대사 효소 및 단계 III 약물 수송체들을 발현시키고 종래의 방법들로 얻어진 ihep와 비교하여 뛰어난 약물 대사 활성을 보여준다는 점에서 기능적 유도 간세포(iHep)들이다. 따라서, iHep는 제약적 응용을 위한 세포 자원을 제공한다.
Description
본 발명은 일반적으로 진핵 세포를 간 세포로 리프로그래밍하기 위한 간세포 운명 전환 및 성숙 인자의 사용에 관한 것이다.
기능적 인간 세포 유형들은 재생 의학 및 의약품 개발 분야에서 수요가 많다. 이들은 병들고 손상된 조직들을 치료하거나 대체할 큰 가능성을 보여준다. 그러나, 기증자 부족으로 인해 이들 분야에서 기능적 인간 세포 유형들의 적용은 제한된다(Castell 등, Expert Opin . Drug Metab . Toxicol. 2:183-212 (2006)). 이러한 딜레마를 해결하기 위해, 기능적으로 성숙한 세포들을 생성하기 위한 새로운 전략들에 대한 수요가 높다. 최근에, 교차 분화(lineage reprogramming)가 체세포들의 운명을 변화시키기 위한 효과적인 방법으로 대두되고 있다(Vierbuchen and Wernig, Mol . Cell, 47: 827-838 (2012)). 원칙적으로, 하나의 세포 유형은 또 다른 세포 유형의 최종 성숙 상태로 바로 전환될 수 있어서 교차 분화(lineage reprogramming) 시 세포 유형의 중간 상태들을 무시할 수 있다. 결과적으로, 이러한 전략을 사용하여 기능적으로 성숙한 세포들을 얻을 수 있고 기능적 인간 세포들의 유망한 자원을 잠재적으로 제공할 수 있다.
기능적 인간 간세포들은 약물 대사를 평가하기 위한 가장 중요한 생체 외 모델이고 제약 개발에서 잠재적으로 광범위하게 적용된다. 간에 대한 용납할 수 없는 대사 및 독성 효과는 의약품 발견에서 신규 화학 물질의 실패의 주된 원인(Baranczewski 등, Pharmacol . Rep., 58:453-472 (2006))이기 때문에, 유리한 약물 동태를 표시하는 화합물들을 식별하기 위해, 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성 분석(ADME/Tox)에 인간 간에 가장 가까운 생체 외 모델로서의 역할을 하는 인간 간세포들을 사용하는 것은 필수적이다(Sahi 등, Curr . Drug Discov . Technol., 7:188-198 (2010)). 현재, 상이한 유전적 배경을 갖는 개인들로부터 유래된 일차 인간 간세포들이 의약품 개발에서 빈번하게 사용되고 있지만, 유전적 배경들의 결과로 초래된 다양성은 이들 세포를 사용한 제약 연구들로부터 얻은 결과들의 재현성을 방해한다. 또한, 인간 간 기증자들의 부족은 일차 인간 간세포의 사용을 크게 제한하고(Castell 등, Expert Opin . Drug Metab . Toxicol. 2:183-212 (2006)), 결과적으로, 높은 재현성을 갖는 인간 간세포들에 대한 대체 자원들이 의약품 발견에서의 사용을 위해 절실히 필요하다.
기능적 간세포들을 생성하기 위한 상이한 전략들이 연구되고 있다. 인간 간세포들은 직접 분화에 의해 인간 만능 줄기 세포들로부터 유래되었다(Cai 등, Hepatology , 45:1229-1239 (2007); Ogawa 등, Development, 140:3285-3296 (2013); Takebe 등, Nature, 499:481-484 (2013); Zhao 등, Cell Res., 23:157-161 (2013)). 만능 줄기 세포들로부터 유래된 세포들의 미성숙 표현형은 여전히 기술적 장애물이지만, 이러한 전략은 최근 몇 년 동안 빠르게 진행되었다. 원칙적으로, 전체 과정은 간세포 형성의 최종 단계에 영향을 미치는 여러 주요 단계들을 포함하기 때문에, 이러한 방법을 사용하여 완전히 기능적인 간세포들을 얻는 것은 상대적으로 어렵다. 그에 반해서, 교차 분화(lineage reprogramming)는 중간 상태를 거치지 않고 체세포의 계통 전환을 허용한다. 마우스 간세포들은 섬유아세포들로부터 전환분화되었지만(Huang 등, Nature, 475:386-389 2011; Sekiya and Suzuki, Nature , 475:390-393 (2011)), 이들 세포는 여전히 α-태아단백질(AFP)과 같은 몇 가지 간아세포 마커들을 발현시키고, 이들 세포에 대한 기능적 미성숙 표현형을 제안하는, 약물 대사에 대한 책임이 있는 몇 가지 주요 사이토크롬 P450 효소(CYP)들의 발현이 부족하다(Willenbring, Cell Stem Cell, 9:89-91 (2011)).
따라서, 알려진 유도 간세포와 비교했을 때, 향상된 간세포 기능 활성을 보여주는 기능적 유도 간세포들로 비-간세포들을 유도하는 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 대사 기능을 갖는 유도 간세포(iHep)로의 비-간세포의 전환을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 대사 기능을 갖는 유도 간세포들을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 의약품 개발, 생체 인공 간 시스템, 및 생체 내 및 생체 외 간 적용에 유도 간세포들을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 비-간세포를 iHep로 리프로그래밍하기 위한 키트들을 제공하는 것이다.
기능적 간 약물 대사 및 수송 능력으로 나타낸 바와 같이, 간세포와 같은 세포(hepatocyte-like cell)로의 간세포가 아닌 제1 유형의 세포(즉, 비-간세포)의 리프로그래밍을 유도하기 위한 방법이 개시된다. 이들 세포는 유도 간세포(iHep)로 본 명세서에 표시된다. 비-간세포는 간의 운명 전환 및 성숙 인자(통칭해서, "간세포 유도 인자")들을 상향조절하기 위해 처리되고, 체세포 배양 배지에서 배양되고(형질전환 단계), 간세포 배양 배지에서 증식되고(증식 단계), 간세포와 같은 특성들을 갖는 세포로 세포를 전환하기 위해 충분한 시간 동안 간세포 성숙 배지에서 추가 배양된다(성숙 단계).
바람직한 실시형태에서, 비-간세포는 다음의 간세포 유도 인자들 즉, 간세포 핵 인자 1-알파(HNF1A), 간세포 핵 인자 4-알파(HNF4A), 간세포 핵 인자 6-알파(HNF6), 활성화 전사 인자 5(ATF5), 프로스페로 호메오박스 단백질 1(PROX1), 및 CCAAT/인핸서-결합 단백질 알파(CEBPA) 중 적어도 하나를 과발현시키기 위해 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 세포는 간세포 유도 인자들 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개를 발현하기 위해 형질전환된다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 6개의 간세포 유도 인자 모두를 과발현시키기 위해 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 방법은 MYC를 상향조절하는 단계, 및/또는 p53 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 하향조절하는 단계를 더 포함한다. 이후, (간세포 유도 인자들을 상향조절하고, 선택적으로 MYC를 상향조절하고, 선택적으로 p53을 하향조절하기 위해 처리된) 비-간세포들은 iHep를 얻기 위해 생체 외에서 증식된다. 일 실시형태에서, 트랜스펙션된 세포들은 약 80%의 합류까지, 적어도 7일 동안 체세포 배양 배지, 예를 들어 DMEM에서 배양된다. 이후, 세포들은 약 15일 내지 30일, 바람직하게 약 18일 내지 30일, 더욱 바람직하게, 약 18일 동안 간세포 배양 배지(HCM)에서 리플레이트되어 증식되고, 그 다음에 세포들은 약 5일 동안 간세포 성숙 배지로 옮겨진다. 이러한 세포 배양 방식에 따라 유도 간세포(iHep)들이 얻어진다.
세포들은 간세포들의 알려진 구조적 및 기능적 특성들을 기반으로 하여 ihep로 식별된다.
또한, 기능적 유도 간세포(iHep)들이 개시된다. 바람직한 실시형태에서, 유도 간세포들은 인간 유도 간세포(hiHep)들이다. iHep들은 알부민, 사이토크롬 P450(Cyp)3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9 및 CYP2C19로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 간세포 마커를 발현한다. 바람직한 실시형태에서, iHep들은 CYPB6, CYP3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9 및 CYP2C19 중 적어도 2개, 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개를 발현시킨다.
이식된 hiHep들은 Tet-uPA/Rag2-/-γc-/- 마우스 간의 30%까지 재생하고, 생체 내에서 300 mg/ml 이상의 인간 알부민을 분비한다. 따라서, 약물 대사 기능을 갖는 인간 간세포들이 교차 분화(lineage reprogramming)로 생성될 수 있고, 따라서 간 질환/간부전의 맥락에서 생체 외 의약품 개발 및 생체 내 적용을 위한 세포 자원을 제공할 수 있다.
iHep로의 비-간세포의 리프로그래밍을 유도하기 위한 키트들이 또한 개시된다. 키트는 본 명세서에 개시된 간세포 유도 인자들을 상향조절하는 인자, 및 선택적으로, MYC를 상향조절하고 p53 유전자 발현 및/또는 단백질 수준을 하향조절하는 인자들을 포함한다.
도 1A는 F-HEP, HEF 및 3H 세포들에서의 ALB의 유전자 발현 분석을 보여주는 막대 그래프이다. n=2. 도 1B는 3H 세포, 태아 간 세포(FLC), 및 F-HEP들에서의 간 전사 인자들의 발현의 정량적 비교를 보여주는 막대 그래프이다. n = 2. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. 도 1C는 qRT-PCR에 의한 3H 세포, FLC 및 F-HEP들에서의 간 농축 전사 인자들의 유전자 발현 분석을 보여주는 막대 그래프이다. n=2. 도 1D는 4개의 개별 F-HEP에서의 풍부한 간 전사 인자들의 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. n = 2. 도 1E는 hiHep 리프로그래밍 다이어그램의 개략도이다. 도 1F는 상이한 단계에서의 유도 세포들의 증식 속도의 측정을 보여준다. 상부 패널: MTT 분석. 유도 세포들이 HCM (p53 siRNA-GFP 사일런스 이전) 또는 개량 WEM(p53 siRNA-GFP 사일런스 이후)으로 옮겨진 날이 0일로 설정된다. 하부 패널: (p53 siRNA-GFP 사일런스 이전) 증식 단계에서 유도 세포들의 배가 시간 계산. Td, 배가 시간. 도 1G는 hiHep, HEF, 및 F-HEP 중에서의 알부민(ALBUMIN) 발현의 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 도 1H 및 도 1I는 ALB 및 AAT에 의해 표시된 유동 세포 분석법으로 측정된 리프로그래밍 효율을 보여준다. n = 3. APC, 알로피코시아닌. 도 1J는 ELISA에 의한 hiHep, HEF 및 F-HEP 중에서의 알부민 분비의 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. n = 3. 도 1K는 qRT-PCR에 의해 검출된 개별 인자들의 제거 이후 간의 기능적 유전자들의 발현에 미치는 효과를 보여준다. n = 2. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 제공된다.
도 2A는 RT-PCR에 의한 hiHep에서의 섬유아세포 마커 및 간 전사 인자들의 내생 유전자 발현 분석을 보여준다. 도 2B는 RT-PCR에 의해 검출된 외생 유전자들의 발현억제(silence)를 보여준다. 7일, 감염 7일 후. 도 2C는 qRT-PCR에 의해 측정된 간 전환 과정 동안의 MYC의 상대적 발현을 보여준다. 7일과 14일, 감염 7일 후와 14일 후. n = 2.
도 3A 내지 도 3C는 HEF, HepG2 세포, ES-Hep, hiHep, 및 F-HEP에서의 약물 대사 단계 I (도 3A) 및 단계 II 효소(도 3B) 및 단계 III 수송체(도 3C) 발현의 정량적 분석을 보여준다. 각각의 유전자의 상대적 발현은 HEF로 표준화하였다; 검출되지 않는 경우, HepG2 세포들로 표준화하였다. n = 2. 1 = HEF; 2=HepG2 세포; 3 = ES-Hep; 4 = hiHep; 5 = F-Hep. 도 3D는 HEF, HepG2 세포, ES-Hep, hiHep 및 F-HEP에서의 약물 대사 단계 II 효소 및 단계 III 수송체들의 발현에 대한 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 각각의 유전자에 대한 상대적 발현은 HEF로 표준화하였다; 검출되지 않는 경우, HepG2 세포들로 표준화하였다. n = 2. 도 3E는 F-HEP에 대한 hiHep 및 HEF의 단계 I, 단계 II, 단계 III mRNA의 정량적 비교를 보여주는 막대 그래프이다. 도 3F는 F-HEP에 대한 hiHep의 핵 수용체 mRNA의 정량적 비교를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4A는 HPLC-MS에 의해 결정된 hiHep, ES-Hep, F-HEPs1, F-HEPs2, HepG2 세포 및 HEF에서의 CYP3A4(3A4-T, 테스토스테론; 3A4-M, 미다졸람), CYP1A2(페나세틴), CYP2B6(부프로피온), CYP2C9(디클로페낙), 및 CYP2C19[(S)-메페닐토인]의 대사 활성을 보여준다. n=3. 갓 분리된 일차 인간 간세포(F-HEPs1 및 F-HEPs2)의 두 배치가 양성 대조군으로 적용되었다. 결과들은 백만 개의 세포 당 pmol/min으로 제공된다. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 제공된다. 도 4B는 상이한 인듀서(inducer)로 처리된 hiHep에서의 CYP3A4, CYP1A2 및 CYP2B6의 배수 유도의 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. n=2. Rif, 리팜핀; PB, 페노바르비탈; ETOH, 에탄올; BNF, β-나프토플라본. 도 4C는 복수의 모델 헤파토톡신에 대한 hiHep의 민감도 분석을 보여주는 막대 그래프이다. F-HEP는 양성 대조군으로 사용되었다. 데이터는 평균으로 제공된다. n=3. 도 4D는 qRT-PCR에 의한 hiHep 형성 후 간 유전자들의 유전자 발현 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 상대적 발현은 0일의 발현으로 표준화되었다. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 제공된다.
도 5A는 ELISA에 의해 모니터링된 마우스 혈청에서의 인간 알부민의 수준을 보여주는 선 그래프이다.
도 5B는 ES-Hep(n = 16), hiHep(n = 5), 및 F-HEP(n = 6) 중에서의 마우스 혈청에서의 인간 ALB 분비를 비교한 막대 그래프이다.
도 5C는 hiHep들의 생착 효율의 유동 세포 분석을 보여준다. 마우스 1 및 마우스 2는 각각 267 ㎍/㎖ 및 313 ㎍/㎖의 인간 ALB를 분비하였다. HN, 인간 핵; PE, 피코에리트린.
도 2A는 RT-PCR에 의한 hiHep에서의 섬유아세포 마커 및 간 전사 인자들의 내생 유전자 발현 분석을 보여준다. 도 2B는 RT-PCR에 의해 검출된 외생 유전자들의 발현억제(silence)를 보여준다. 7일, 감염 7일 후. 도 2C는 qRT-PCR에 의해 측정된 간 전환 과정 동안의 MYC의 상대적 발현을 보여준다. 7일과 14일, 감염 7일 후와 14일 후. n = 2.
도 3A 내지 도 3C는 HEF, HepG2 세포, ES-Hep, hiHep, 및 F-HEP에서의 약물 대사 단계 I (도 3A) 및 단계 II 효소(도 3B) 및 단계 III 수송체(도 3C) 발현의 정량적 분석을 보여준다. 각각의 유전자의 상대적 발현은 HEF로 표준화하였다; 검출되지 않는 경우, HepG2 세포들로 표준화하였다. n = 2. 1 = HEF; 2=HepG2 세포; 3 = ES-Hep; 4 = hiHep; 5 = F-Hep. 도 3D는 HEF, HepG2 세포, ES-Hep, hiHep 및 F-HEP에서의 약물 대사 단계 II 효소 및 단계 III 수송체들의 발현에 대한 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 각각의 유전자에 대한 상대적 발현은 HEF로 표준화하였다; 검출되지 않는 경우, HepG2 세포들로 표준화하였다. n = 2. 도 3E는 F-HEP에 대한 hiHep 및 HEF의 단계 I, 단계 II, 단계 III mRNA의 정량적 비교를 보여주는 막대 그래프이다. 도 3F는 F-HEP에 대한 hiHep의 핵 수용체 mRNA의 정량적 비교를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4A는 HPLC-MS에 의해 결정된 hiHep, ES-Hep, F-HEPs1, F-HEPs2, HepG2 세포 및 HEF에서의 CYP3A4(3A4-T, 테스토스테론; 3A4-M, 미다졸람), CYP1A2(페나세틴), CYP2B6(부프로피온), CYP2C9(디클로페낙), 및 CYP2C19[(S)-메페닐토인]의 대사 활성을 보여준다. n=3. 갓 분리된 일차 인간 간세포(F-HEPs1 및 F-HEPs2)의 두 배치가 양성 대조군으로 적용되었다. 결과들은 백만 개의 세포 당 pmol/min으로 제공된다. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 제공된다. 도 4B는 상이한 인듀서(inducer)로 처리된 hiHep에서의 CYP3A4, CYP1A2 및 CYP2B6의 배수 유도의 정량적 분석을 보여주는 막대 그래프이다. n=2. Rif, 리팜핀; PB, 페노바르비탈; ETOH, 에탄올; BNF, β-나프토플라본. 도 4C는 복수의 모델 헤파토톡신에 대한 hiHep의 민감도 분석을 보여주는 막대 그래프이다. F-HEP는 양성 대조군으로 사용되었다. 데이터는 평균으로 제공된다. n=3. 도 4D는 qRT-PCR에 의한 hiHep 형성 후 간 유전자들의 유전자 발현 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 상대적 발현은 0일의 발현으로 표준화되었다. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 제공된다.
도 5A는 ELISA에 의해 모니터링된 마우스 혈청에서의 인간 알부민의 수준을 보여주는 선 그래프이다.
도 5B는 ES-Hep(n = 16), hiHep(n = 5), 및 F-HEP(n = 6) 중에서의 마우스 혈청에서의 인간 ALB 분비를 비교한 막대 그래프이다.
도 5C는 hiHep들의 생착 효율의 유동 세포 분석을 보여준다. 마우스 1 및 마우스 2는 각각 267 ㎍/㎖ 및 313 ㎍/㎖의 인간 ALB를 분비하였다. HN, 인간 핵; PE, 피코에리트린.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "배양물"은 배지에서 성장하고 선택적으로 계대 배양된 세포들의 개체군을 의미한다. 세포 배양물은 일차 배양물(예를 들어, 계대 배양되지 않은 배양물)이거나, 이차 또는 후속 배양물(예를 들어, 1회 이상 계대 배양된 세포들의 개체군)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "하향조절" 또는 "하향조절하다"는 세포가 외부 변수에 응답하여 세포 구성요소, 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질의 양 및/또는 활성을 감소시키는 과정을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "배아 줄기 세포(ESC) 유래 간세포(ES-Hep)"는 Zhao, 등, Cell Res., 23(1):157-161 (2013)에 개시된 방법들에 따라 유래된 유도 간세포들을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "기능적 유도 간세포(iHep)"는 동일한 유기체로부터 얻은 ES-Hep에서의 동일한 효소의 활성보다 50% 더 높은 수준에서 CYP3A4, CYP2C9, 또는 CYP2C19 중 적어도 하나의 활성을 보여주는 유도 간세포들을 나타낸다. 효소의 활성은 ES-Hep에서의 활성보다 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 벡터와 같은 재조합 뉴클레오티드가 도입될 수 있는 비-간세포인 진핵 세포들을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "유도 간세포(iHep)"는 자연적으로 발생하는 간세포가 아니라 비-간세포들로부터 인위적으로 유래되는 세포들을 나타낸다.
hiHEP를 나타낼 때, "분리된" 또는 "정제된"이라는 용어는 비-간세포들과 같은 세포 유형들을 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 오염시키지 않고 화학적으로 유도된 만능 줄기 세포들을 의미한다. 또한, 분리된 ihep들은 실질적으로 용해성이 없는 자연적으로 발생하는 분자들일 수 있다.
일반적으로, 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 변형되지 않은 RNA나 DNA, 또는 변형된 RNA나 DNA일 수 있는 모든 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오티드들은 특히, 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역들의 혼합인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 및 이중 가닥 영역들의 혼합인 RNA를 의미하고, 하이브리드 분자들은 단일 가닥 또는, 더욱 일반적으로, 이중 가닥일 수 있는 DNA 및 RNA, 또는 단일 및 이중 가닥 영역들의 혼합을 포함한다. 또한, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 위에서 정의된 바와 같이 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중 가닥 영역들을 나타낸다. 이러한 영역들의 가닥은 동일한 분자로부터 또는 상이한 분자들로부터 올 수 있다. 영역들은 하나 이상의 분자 전체를 포함할 수 있지만, 더욱 구체적으로 분자들의 일부의 영역만을 포함한다. 삼중 나선형 영역의 분자들 중 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 염기를 포함하는 전술한 바와 같은 DNA 또는 RNA들을 포함한다. 따라서, 안정성을 위해 또는 다른 이유들을 위해 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA들은 본 명세서에서 해당 용어가 의도되는 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 단지 2가지 예를 들면, 트리틸화된 염기와 같은 변형된 염기 또는 이노신과 같은 이상 염기들을 포함하는 DNA 또는 RNA들은 본 명세서에서 용어가 사용되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "퍼센트(%) 서열 동일성"은 필요하다면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 간격을 도입한 후에, 레퍼런스 핵산 서열에서의 뉴클레오티드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 속하는 다양한 방법으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 MegAlign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열들의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 모든 알고리즘들을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수들은 알려진 방법들에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서의 목적을 위해, (대안적으로, 주어진 서열 D에 대한 특정 % 서열 동일성을 포함하거나 갖는 주어진 서열 C로서 표현될 수 있는) 주어진 핵산 서열 D에 대한 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성은 다음과 같이 계산된다:
분수 W/Z의 100배,
여기서 W는 C 및 D의 해당 프로그램의 할당에서 서열 할당 프로그램에 의해 동일한 일치로 기록되는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 개수이고, Z는 D에서의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 총 개수이다. 서열 C의 길이는 서열 D의 길이와 동일하지 않고, D에 대한 C의 % 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 서열 동일성과 동일하지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "형질전환된" 및 "트랜스펙션된"은 당업계에 알려진 다수의 기술에 의한 세포로의 핵산(예를 들어, 벡터)의 도입을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 삽입된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 플라스미드, 파지, 또는 코스미드와 같은 리플리콘이다. 본 명세서에 기술된 벡터들은 발현 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 제어 서열들을 포함하는 벡터이다.
본 명세서에서 사용되는 "리프로그래밍(분화, Reprogramming)"은 하나의 특정 세포 유형에서 또 다른 특정 세포 유형으로의 전환을 나타낸다. 예를 들어, 간세포가 아닌 세포는 형태적으로 및 기능적으로 간세포와 같은 세포로 리프로그래밍될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포/세포들을 처리하는 단계"는 세포 구성요소, 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질의 양 및/또는 활성을 하향조절하거나 상향조절하기 위해 본 명세서에 개시된 핵산과 같은 인자들과 세포(들)을 접촉시키는 단계를 나타낸다. 또한, 이 구문은 관심의 유전자/단백질을 하향조절하거나 상향조절 할 수 있는 단백질 및 작은 분자들을 포함하는 임의의 인자들과 세포(들)을 접촉시키는 단계를 포함한다.
용어 "~의 발현을 상향조절하다"는, 예를 들어 발현 또는 활성을 유도하거나, 처리되지 않은 세포에 비해 증가된/더 큰 발현 또는 활성을 유도하기 위해, ~의 발현에 영향을 미치는 것을 의미이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "상향조절" 또는 "상향조절하다"는 세포가 외부 변수에 응답하여 세포 구성요소, 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질의 양 및/또는 활성을 증가시키는 과정을 나타낸다.
"변이"는 레퍼런스 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와는 상이하지만 필수 특성들은 여전히 유지하고 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 폴리펩티드의 전형적인 변이는 또 다른 레퍼런스 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 레퍼런스 폴리펩티드 및 변이의 서열이 많은 영역에서 동일하고 전반적으로 아주 유사하도록 차이는 제한된다. 변이 및 레퍼런스 폴리펩티드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 추가 및/또는 삭제)에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전코드에 의해 인코딩된 아미노산일 수도 아닐 수도 있다. 폴리펩티드의 변이는 대립유전자 변이와 같이 자연적으로 발생하는 변이이거나, 자연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 변이일 수 있다.
II. 조성물
A. 간세포와 같은 특성으로 비-간세포를 유도하는 인자
완전히 기능적인 세포 유형들을 얻는 것은 의약품 발견, 생체 인공 간 및 재생 의학의 주요 과제이다. 현재, 이러한 주요 문제에 대한 근본적인 솔루션은 아직 부족하다. 기능적 인간 유도 간세포(hiHep)들은 MYC 유전자 mRNA 또는 단백질 수준뿐만 아니라, HNF1A, HNF4A, HNF6, ATF5, PROX1 및 CEBPA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 인자를 상향조절함으로써 섬유아세포로부터 생성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 간세포 유도 인자들의 모든 알려진 기능적 변이 및 동형(isoform)들이 고려된다. 이들 알려진 서열은 미국 국립 생물공학 정보 센터의 유전자 은행 데이터베이스에서 쉽게 이용할 수 있다.
바람직하게, p53 활성은 추가적으로, p53 유전자, mRNA 및/또는 단백질 수준의 하향조절에 의해 표시되는 바와 같이 하향조절된다.
1. 간세포 유도 인자들을 인코딩하는 핵산
i. HNF1A
(TCF1으로도 알려진) HNF1A는 간 종양 형성에 관여하는 종양 억제 유전자이다. HNF1A는 10개의 엑손에 의해 인코딩된, 12번 염색체의 긴 팔에 위치하고, 간, 신장, 췌장 및 소화관을 포함하여 다양한 조직에서 발현된다. HNF1는 알부민, β-피브리노겐 및 α1 -안티트립신을 포함하여, 특정 간 특이적 유전자의 발현에 필요하고 간에서 간세포 분화에 관여하는 전사 인자 HNF1을 인코딩한다. Courtois, 등, Science, 30(4827:688-692 (1987). HNF1A 유전자는 침팬지, 붉은 털 원숭이, 개, 소, 마우스, 랫드, 닭, 제브라피시 및 개구리에 보존된다.
바람직한 실시형태에서, HNF1A를 인코딩하는 뉴클레오티드는 서열 번호 1로 아래에 표시된다.
(서열 번호 1)
HNF1A를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 1 또는 서열 번호 1의 기능적 분절 또는 변이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
HNF1A를 인코딩하는 핵산의 자연적으로 발생하는 다수의 변이 및 이들의 활성은 당업계에 알려져 있고, 유전자 은행 등록 번호 XM_005253931.1로 표시되는 HNF1A에 대한 전사 변이를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
ii. HNF6
HNF6는 원래 간, 뇌, 비장, 췌장 및 고환에서 발현되는 6-포스포프룩토-2-키나아제(pfk-2) 유전자의 간 프로모터의 전사 활성화인자로 특징지었다(Lannoy, 등, J. Biol . Chem., 273:13552-13562 (1998)). 대안적인 스플라이싱은 복수의 전사 변이를 초래한다.
일 실시형태에서, HNF6는 서열 번호 2로 표시된다.
(서열 번호 2)
HNF6를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 2 또는 서열 번호 2의 기능적 분절 또는 변이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
HNF6를 인코딩하는 핵산의 자연적으로 발생하는 다수의 변이 및 이들의 활성은 당업계에 알려져 있다. 인간 간세포 핵 인자 6(HNF6) 유전자는 NCBI 유전자 은행 등록 번호 AF035581에 설명되어 있다. 호모 사피엔스 전사 변이 mRNA는 유전자 은행 등록 번호 NM_004498.2에 개시된다.
iii. HNF4A
간세포 핵 인자 4 알파(HNF4-알파, NR2A1, 유전자 기호 HNF4A)는 리간드 의존성 전사 인자들의 핵 수용체(NR) 상과의 잘 보존된 구성원이다(Sladeck, 등, Genes Dev ., 4(12B): 2353-65 (1990). HNF4A1은 간(간세포), 신장, 소장 등에서 발현된다. HNF4A2는 간에서 가장 우세한 동형이다. HNF4A는 간에서 아포지질단백질 유전자 전체가 아닌 대부분을 조절하고, 많은 사이토크롬 P450 유전자(예를 들어, CYP3A4, CYP2D6) 및 Phase II 효소들의 발현을 조절하고, 따라서 약물 대사에서 역할을 할 수 있다(Gonzalez, 등, Drug Metab . Pharmacokinet., 23(1):2-7 (2008)).
일 실시형태에서, HNF4는 서열 번호 3으로 표시된다.
(서열 번호 3)
HNF4를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 3 또는 서열 번호 3의 기능적 분절 또는 변이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
HNF4를 인코딩하는 핵산의 자연적으로 발생하는 다수의 변이 및 이들의 활성은 당업계에 알려져 있다. 인간 간세포 핵 인자 4 유전자는 NCBI 유전자 은행 등록 번호 BC137539.1에 설명되어 있다.
iv. ATF5
ATF5는 활성화 전사 인자 5를 인코딩한다. ATF5 전사물 및 단백질은 매우 다양한 조직에서 발현되고, 특히 간에서 전사물이 높게 발현된다.
일 실시형태에서, ATF5는 서열 번호 4로 표시된다.
(서열 번호 4)
ATF5를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 4 또는 서열 번호 4의 기능적 분절 또는 변이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. ATF5를 인코딩하는 핵산의 자연적으로 발생하는 다수의 변이 및 이들의 활성은 당업계에 알려져 있다. 인간 ATF5 전사 변이 3(mRNA)는 유전자은행 등록 번호 NM_001290746.1에 설명되어 있다(Abe, 등, J. Biol . Chem., 289(7):3888-3900 (2014)).
v. PROX1
일 실시형태에서, PROX1은 서열 번호 5로 표시된다.
(서열 번호 5)
PROX1을 인코딩하는 핵산은 서열 번호 5 또는 서열 번호 5의 기능적 분절 또는 변이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. PROX1을 인코딩하는 핵산의 자연적으로 발생하는 다수의 변이 및 이들의 활성은 당업계에 알려져 있다.
vi. CEBPA
CEBPA는 특정 프로모터 및 인핸서들에 호모다이머로서 결합하는 기본 루이신 지퍼(bZIP) 전사 인자를 인코딩한다.
일 실시형태에서, CEBPA는 서열 번호 6으로 표시된다.
(서열 번호 6)
CEBPA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 6 또는 서열 번호 6의 기능적 분절 또는 변이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CEBPA를 인코딩하는 핵산의 자연적으로 발생하는 다수의 변이 및 이들의 활성은 당업계에 알려져 있다.
vii. MYC
Myc(c-Myc)는 세포 주기 진행, 세포사멸 및 세포 형질전환에서 역할을 하는 다기능 핵 인단백질(nuclear phosphoprotein)인 전사 인자를 코딩하는 조절 유전자이다.
일 실시형태에서, MYC는 서열 번호 7로 표시된다.
(서열 번호 7)
2. 간세포 유도 인자들을 인코딩하는 벡터
간세포 유도 인자들은 적합한 형질전환 벡터들을 사용하여 숙주 세포에 도입된다. 전술한 바와 같이, 핵산들은 세포에서의 발현을 위해 벡터들에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 삽입된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드와 같은 리플리콘이다. 벡터들은 발현 벡터일 수 있다. "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 제어 서열들을 포함하는 벡터이고, "발현 제어 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 제어하고 조절하는 DNA 서열이다.
벡터들의 핵산은 하나 이상의 발현 제어 서열들에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 발현 제어 서열들이 관심의 코딩 서열의 발현을 효과적으로 제어하도록 제어 서열이 유전적 구조물에 통합될 수 있다. 발현 제어 서열의 예로는 프로모터, 인핸서, 및 전사 종결 영역들을 포함한다. 프로모터는 (일반적으로, RNA 중합 효소 II에 대한 개시 부위 근처의) 전사가 시작되는 지점 상류의 전형적으로 100개의 뉴클레오티드 내의 DNA 분자의 영역으로 구성된 발현 제어 서열이다. 프로모터의 제어 하에서 코딩 서열을 가져오기 위해서, 프로모터 하류의 약 50개의 뉴클레오티드와 프로모터 사이에 폴리펩티드의 번역 판독 프레임의 번역 개시 부위를 배치할 필요가 있다. 인핸서는 시간, 위치 및 수준의 측면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 전사 부위로부터 다양한 거리에 위치할 때 기능할 수 있다. 또한, 인핸서는 전사 개시 부위로부터 하류에 위치할 수 있다. RNA 중합 효소가 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질로 전사될 수 있는 mRNA로 코딩 서열을 전사할 수 있을 때 코딩 서열은 세포에서 발현 제어 서열들의 "제어 하에" 있고 "작동 가능하게 연결"된다.
적합한 발현 벡터들은, 제한 없이, 예를 들어 박테리오파지, 바큘로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 포진 바이러스, 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스. 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터 및 플라스미드를 포함한다. 노바젠(매디슨, WI), 클론테크(팔로 알토, CA), 스트라타젠(라호야, CA), 및 인비트로젠 라이프 테크놀로지(칼스배드, CA) 등의 기업에서 많은 벡터 및 발현 시스템을 시판하고 있다.
B. 유도되는 세포
리프로그래밍될 수 있는 세포들은 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 섬유아세포, 지방 유래 줄기 세포(ADSC), 신경 유래 줄기 세포, 혈액 세포, 케라틴세포, 장 상피 세포 및 다른 비-간세포 체세포를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 비-간세포는 섬유아세포, 예를 들어 배아 섬유아세포(HEF) 또는 포피 섬유아세포이다. 바람직하게, 세포들은 포유류, 예를 들어 랫드, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 토끼, 말, 돼지로부터 얻어진다. 바람직하게, 세포들은 인간 대상으로부터 얻어진다.
C. 유도 간세포
예를 들어, 성숙 인자 ATF5, PROX1, 및 CEBPA와 함께 간 운명 전환 인자 HNF1A, HNF4A, 및 HNF6을 과발현시키기 위해 비-간세포를 처리하는 단계를 포함하는 방법으로 얻어지는 iHep가 개시된다. HNF1A, HNF4A, HNF6, ATF5, PROX1, 및 CEBPA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 간세포 유도 인자를 과발현시키기 위해 비-간세포가 처리된다. 일부 실시형태에서, 비-간세포는 간세포 유도 인자들 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개를 발현시키기 위해 형질전환되거나 과발현시키기 위해 처리된다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 6개의 간세포 유도 인자 모두를 과발현시키기 위해 형질전환된다.
iHep는 유도 세포를 얻은 유기체의 간세포들의 전형적이고 기능적인 특성들을 보여준다. 예를 들어, iHep는 일차 인간 간세포들에 대한 전형적인 형태를 보여준다. iHep는 알부민, 사이토크롬 P450(Cyp)3A4 및 CypB6로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 간 마커를 발현한다. 일차 인간 간세포처럼, hiHep는 단계 I 및 II 약물 대사 효소 및 단계 III 약물 수송체 및 알부민의 추가 스펙트럼을 발현한다. CYP3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9, 및 CYP2C19 중 적어도 하나의 대사 활성은 hiHep와 갓 분리된 일차 인간 간세포 사이에서 비교할 수 있다. 바람직하게, iHep는 동일한 유기체로부터 얻은 ES-Hep에서 동일한 효소의 활성보다 적어도 50% 높은 이들 효소의 대사 활성에 의해 결정된 바와 같이 기능적이다. 효소의 활성은 ES-Hep에서의 활성보다 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상 높을 수 있다. 더욱 바람직하게, hiHep에서 이들 CYP 효소 전부의 활성은 ES-Hep의 활성보다 적어도 100배 높다.
일부 실시형태에서, iHep에서의 MYC 발현 수준은 예를 들어, 정량적인 역 전사 효소 중합 효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 바와 같이 상응하는 유기체의 정상 간세포에서 발견되는 수준보다 낮다, 즉 유도될 비-간세포에 대한 기증자 유기체가 인간 대상인 경우, 수준은 인간에서 발견되는 정상 간세포와 비교된다.
또한, 기능적 hiHep는 UDP 글루쿠로노실전이효소(UGT)1 A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9, GSTA1, UGT2B7, UGT2515, 마이크로솜 글루타티온-S-전이효소 1(MGST1), 니코틴아미드 N-메틸전이효소(NNMT), NTCP, 유기 음이온 수송 폴리펩티드 1B3(OATP1B3), 다중약물 내성 단백질(MRP)6, MRP2, 플라빈 함유 모노옥시게나아제(Flavin-containing monooxygenase 5, FMO5), 모노아민 산화효소(MAO)A, MAOB, 및 에폭시드 가수분해효소 1(EPHX1)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 약물 대사 단계 II 효소 또는 단계 II 수송체를 발현할 수 있다. 바람직하게, 포크헤드 박스(FOX)A1 , FOXA2 , FOXA3 및 간 수용체 동족체 1(LRH1)의 내생 발현은 hiHep에서 활성화된다.
일부 실시형태에서, 유도되는 세포가 상피 세포가 아닌 경우 hiHep는 추가적으로 적어도 하나의 상피 세포 마커, 예를 들어 E-카데린을 발현하고, 유도되는 세포가 섬유아세포인 경우, 본 명세서에 개시된 방법들을 사용하여 섬유아세포들의 유도 후 얻어진 hiHep는 예를 들어 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이 COL1A1, PDGFRB, THY1 및 α-태아단백질과 같은 섬유아세포 마커 유전자들을 발현하지 않는다.
성숙한 간세포들과 연관된 기능적 특성들에 대하여, hiHep는 알부민 분비, LDL 흡수, 세포 배양 배지로부터의 인도시아닌 그린(ICG) 혼입 및 퇴약 후 흡수된 ICG의 배제, 글리코겐 합성과 저장, 및 지방 방울 축적으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 특성을 갖는다.
III. 제조 방법
Huang 등은 p19(Arf)의 비활성화 및, Gata4, Hnf1α 및 Foxa3의 형질도입에 의한 마우스 꼬리 끝 섬유아세포로부터의 간세포와 같은 세포의 직접 유도를 개시한다(Huang, 등, Nature, 475:386-389 (2011)). 유도 세포들은 전형적인 상피 형태를 보여준다. Sekiya 및 Suzuki 등은 생체 외에서 마우스 배아 및 성체 섬유아세포를 간세포를 닮은 세포로 전환할 수 있는 두 개의 전사 인자의 세 가지 특정 조합, Hnf4α+ Foxa1, Hnf4 + Foxa2, 또는 Hnf4 + Foxa3을 식별하였다(Sekiya 및 Suzuki, Nature, 475:390-393 (2011)). Cai 등은 무혈청 배지에서 간 세포로의 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 분화를 유도하는 3 단계 방법을 개시한다(Cai, 등, Hepatology, 45(5):1229-39 (2007)). 우선, 인간 ESCs는 3일의 액티빈 A 처리에 의해 최종 내배엽 세포로 분화되었다. 다음으로, 배양 배지에서의 섬유아세포 성장 인자-4 및 뼈 형태형성 단백질-2의 존재는 5일 동안 최종 내배엽 세포로부터 효율적인 간 분화 및 뒤이은 10일의 추가적인 생체 외 성숙을 유도하였다. Zhao 등은 PROX1 및 HNF6의 발현을 유도하여 간세포와 같은 특성을 갖는 세포로 hESC의 성숙을 촉진하는 방법을 개시한다(Zhao, 등, Cell Res., 23(1):157-161 (2013)).
본 명세서에 개시된 방법들에서, 비-간세포는 선택적으로 MYC는 상향조절하고 p53는 하향조절하는 단계와 함께, 세포의 간세포 유도 인자들을 상향조절하고, 세포를 간세포와 같은 특성을 갖는 세포로 전환하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같이 충분한 시간 동안 세포를 배양함으로써 iHep로 리프로그래밍된다. 유도되는 비-간세포들은 당업계에서 알려진 방법들을 사용하여 기증자 동물로부터 얻어진다. 세포들은 배양물에 배치되고 당업계에 알려진 방법들을 사용하여 배양된다.
리프로그래밍 방법은 다음 단계들, 즉 (a) 간세포 유도 인자들을 상향조절하기 위해 세포들을 처리하고 세포 배양 배지에서 세포들을 배양하는 단계(형질전환 단계); (b) HCM에 세포들을 리플레이트(replate)하여 배양하는 단계(증식 단계); 및 (c) 간세포 성숙 배지에서 세포들이 배양되는 성숙 단계를 포함한다. 개시된 방법에 대한 개략도가 도 1E에 도시된다. 형질전환 단계에서, 세포들은 HNF1A, HNF4A, HNF6, ATF5, PROX1, 및 CEBPA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 간세포 유도 인자를 상향조절하기 위해 처리된다. 바람직하게, 세포들은 MYC를 상향조절하기 위해 및/또는 p53을 하향조절하기 위해 추가적으로 처리된다.
형질전환 단계에서, 처리된 세포들은 기존의 세포 배양 배지, 예를 들어 둘베코(Dulbecco)의 개량된 이글 배지(DMEM)에서 충분한 시간 동안 배양된다. 바람직하게, 세포들은 약 80%의 합류까지 제1 단계에서 적어도 7일 동안 배양된다. 이후, 세포들은 HCM에 리플레이트되어 약 15일 내지 30일, 바람직하게 약 18일 내지 30일, 더욱 바람직하게 약 18일 동안 증식되고(증식 단계), 이후 약 5일 동안 개량된 윌리엄의 E 배지로 옮겨졌고(성숙 단계), 이후 유도 간세포들을 수확(harvest)한다. 바람직하게, p53 siRNA는 세포들이 개량된 윌리엄의 E 배지로 옮겨지기 전에, 예를 들어 감염 약 20일 내지 30일 후와 같은 시기의 증식 단계의 끝에서, 바람직하게 감염 약 25일 후에 하향조절된다(도 1E). 우리는 감염 약 25일 후에 p53 siRNA의 발현억제(silence)를 관찰한다. 발현억제(silence)는 주로 간 전사 인자들의 도입으로 야기된다. 예를 들어, HNF4A 및 CEBPA는 실질적으로 iHep의 증식 속도를 감소시킬 수 있다. 또한, 내생 간 성숙 시그널링 네트워크의 자가 확립은 다른 전사 인자들의 외생 발현의 신뢰성을 또한 약화시킨다(도 2).
방법은 유전자 발현뿐만 아니라 형태적 및 기능적 특성들을 사용하여 비-간세포가 간세포와 같은 특성을 획득했음을 확인하는 단계를 포함한다.
형태적 확인 방법들은 특히 글리코겐 과립의 존재 하에서 전자 현미경에 의해 관찰된 세포질에서의 과립 풍부 및 위상 현미경에 의해 관찰된 복수의 핵을 갖는 세포들과 같이 간세포에 대해 특이적인 형태적 특성들의 확인을 포함한다.
또한, 처리된 세포들은 다음의 특성 즉, 일차 인간 간세포의 능력과 비교할 만한 수준으로 ALB를 발현시키는 그들의 능력; 5 가지의 주요 사이토크롬 P450 효소들인 CYP3A4, CYP1A2, CYP2C9, CYPB6, 및 CYP2C19 중 하나 이상의 발현; UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9, GSTA1, UGT2B7, UGT2515, MGST1, NNMT, NTCP, OATP1B3, MRP6, MRP2, FMO5, MAOA, MAOB, 및 EPHX1으로 이루어진 군에서 선택되는 단계 II 효소 또는 단계 II 수송체의 발현 중 하나 이상을 사용하여 유도 간세포로서 식별될 수 있다. 성공적인 유도는 상피 마커의 존재 및 유도되는 세포에 대한 마커의 부재로 확인될 수 있다. 예를 들어, 유도되는 세포가 섬유아세포인 경우, 세포들이 간세포와 같은 세포로 유도되었다는 추가 표시는 적어도 하나의 상피 세포 마커, 예를 들어 E-카데린의 발현일 수 있고, 예를 들어 RT-PCR에 의해 측정되는 COL1A1, PDGFRB, THY1 및 α-태아단백질과 같은 섬유아세포 마커 유전자들의 발현의 부재일 수 있다.
A. 간세포 유도 인자 및
MYC의
상향조절
간세포 유도 인자 및 MYC는 간세포 유도 인자 및 MYC의 단백질 수준/활성 및/또는 유전자 발현을 상향 조절하는 인자들과 비-간세포를 접촉시킴으로써 상향 조절된다. 이들 인자는 핵산, 단백질 및 작은 분자들을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
예를 들어, 상향 조절은 비-간세포(숙주 세포)에 간세포 유도 인자(들) 및 선택적으로 MYC를 인코딩하는 핵산들을 외생적으로 도입함으로써 달성될 수 있다. 핵산은 동종 또는 이종일 수 있다. 핵산 분자는 DNA 또는 RNA, 바람직하게 mRNA일 수 있다. 바람직하게, 핵산 분자는 렌티바이러스 발현에 의해 비-간세포에 도입된다.
숙주 세포는 HNF1A, HNF4A, HNF6, ATF5, PROX1, 및 CEBPA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 간세포 유도 인자를 과발현시키기 위해 형질전환된다. 바람직하게, 세포는 증식 인자 MYC를 과발현시키기 위해 또한 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 세포는 간세포 유도 인자들의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개를 발현시키기 위해 형질전환된다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 6개의 간세포 유도 인자 모두를 과발현시키기 위해 형질전환된다.
발현되는 핵산들을 포함하는 벡터들은 숙주 세포들로 전달될 수 있다. 핵산들은, 예를 들어 인산칼슘 공침전법, DEAE-덱스트란 매개 형질주입(transfection), 리포펙션, 전기 천공법, 또는 미세 주입법을 포함한 기술들에 의해 포유류 세포로 형질주입(transfect) 될 수 있다. 본 명세서에 개시된 생체 외 방법들은 예를 들어, 대상/기증자로부터의 세포들을 수확(harvest)하는 단계, 세포를 배양하는 단계, 발현 벡터로 이들을 형질 변환하는 단계, 및 인코딩된 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 세포들을 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 방법은 분자 생물학 분야에서 잘 알려져있다.
또한, 상향 조절은 간세포 유도 인자/MYC를 인코딩하는 유전자들의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 인자 및/또는 해당 단백질 수준을 증가시키는 것으로 알려진 인자들로 세포들을 처리함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Zhao 등은 유도 인자 FGF7, BMP2 및 BMP4를 사용하여 hESC로부터 PROX1 및 HNF6-발현 세포들의 출현을 촉진하기 위한 방법을 개시한다(Zhao, 등, Cell Res., 23(1):157-161 (2013)). 단백질 수준 또는 간세포 유도 인자 유전자 발현을 상향 조절하는 단백질 및/또는 작은 분자들을 포함하는 알려진 인자들이 또한 사용될 수 있다.
B.
p53
하향조절
p53은 p53 유전자 발현, mRNA 수준 또는 단백질 수준을 하향 조절하기 위해 세포들을 처리함으로써 하향 조절될 수 있다. 이러한 단계는 핵산 분자, 작은 분자 및 단백질을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 p53 유전자 발현, mRNA 또는 단백질 수준을 하향 조절하는 것으로 알려져 있는 임의의 분자와 세포들을 접촉시키는 단계를 포함한다.
p53 유전자 발현은 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, EGS, 리보자임 및 앱타머들로 이루어진 군에서 선택되는, 이를 인코딩하는 벡터, 또는 기능적 핵산을 사용하여 억제될 수 있다. 바람직하게, p53 유전자 발현은 siRNA, shRNA, 또는 miRNA를 사용하여 억제된다.
1.
RNA
간섭
일부 실시형태에서, P53 유전자 발현은 RNA 간섭을 통해 억제된다. 또한, 유전 발현은 RNA 간섭(RNAi)을 통해 매우 구체적인 방법으로 효과적으로 발현억제(silencing)될 수 있다. 이러한 발현억제(silencing)은 원래 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 추가로 관찰되었다(Fire, 등 (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, 등 (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51). dsRNA가 세포에 들어가면, dsRNA는 RNase III와 같은 효소 다이서에 의해 3' 말단에 2 개의 뉴클레오티드 돌출부를 포함하는 21개 내지 23개의 뉴클레오티드를 갖는 이중 가닥의 소 간섭 RNA(siRNA)으로 절단된다(Elbashir, 등 (2001) Genes Dev., 15:188-200; Bernstein, 등 (2001) Nature, 409:363-6; Hammond, 등 (2000) Nature, 404:293-6). ATP 의존성 단계에서, siRNA는 타겟 RNA 서열로 siRNA를 안내하는, 일반적으로 RNAi 유도 발현억제(silencing) 복합체(RISC)로 알려진, 멀티-서브유닛 단백질 복합체로 통합된다(Nykanen, 등 (2001) Cell, 107:309-21). 일부 포인트에서, siRNA 듀플렉스가 풀리고, 안티센스 가닥이 RISC에 결합된 상태를 유지하고 엔도 및 엑소뉴클레아제의 조합에 의해 상보적 mRNA 서열의 저하를 유도하는 것으로 보인다(Martinez, 등 (2002) Cell, 110:563-74). 그러나, iRNA 또는 siRNA 또는 이들의 사용의 효과는 어떠한 유형의 메커니즘으로 한정되지 않는다.
소 간섭 RNA(siRNA)는 서열 특이적 전사 후 유전자 발현억제(silencing)를 유도함으로써 유전자 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA이다. 일 실시예에서, siRNA는 siRNA와 타겟 RNA 사이의 서열 동일성의 영역 내에서 mRNA와 같은 동종 RNA 분자들의 특이적 저하를 촉발한다. 예를 들어, WO 02/44321은 3' 돌출 말단과 염기 쌍을 이룬 경우 타겟 mRNA의 서열 특이적 저하를 가능하게 할 수 있는 siRNA를 개시하고, 이는 본 명세서에서 이러한 siRNA를 제조하는 방법에 대한 참조로 원용된다.
서열 특이적 유전자 발현억제(silencing)는 효소 다이서에 의해 생산된 siRNA를 흉내 낸 합성한 짧은 이중 가닥 RNA를 사용하여 포유류 세포들에서 달성될 수 있다(Elbashir, 등 (2001) Nature, 411:494 498) (Ui-Tei, 등 (2000) FEBS Lett 479:79-82). siRNA는 화학적으로 또는 생체 외 합성될 수 있고, 또는 세포 내부의 siRNA로 처리되는 짧은 이중 가닥 헤어핀과 같은 RNA(shRNA)의 결과일 수 있다. 합성 siRNA는 일반적으로 기존의 DNA/RNA 합성기 및 알고리즘들을 사용하여 설계된다. 공급업체는 암비온(오스틴, 텍사스), 캠젠(애슐랜드, 매사추세츠), 다마콘(라파예트, 콜로라도), 글렌 리서치(스털링, 버지니아), MWB 바이오텍(Esbersberg, 독일), 프롤리고(볼더, 콜로라도), 및 Qiagen(벤토, 네덜란드)을 포함한다. 또한, siRNA는 암비온의 SILENCER® siRNA 구성 키트와 같은 키트들을 사용하여 생체 외에서 합성될 수 있다.
벡터로부터의 siRNA의 생산은 짧은 헤어핀 RNAse(shRNA)의 전사를 통해 더욱 일반적으로 수행된다. shRNA를 포함하는 벡터들의 생산을 위한 키트는, 예를 들어 임제넥스의 GENESUPPRESSOR™ 구성 키트 및 인비트로젠의 BLOCK-IT™ 유도 가능한 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다.
2.
안티센스
p53 유전자 발현은 안티센스 분자들에 의해 억제될 수 있다. 안티센스 분자들은 전형적 또는 비전형적 염기 쌍을 통해 타겟 핵산 분자와 상호작용하도록 설계된다. 안티센스 분자와 타겟 분자의 상호작용은 예를 들어, RNAse H 매개 RNA-DNA 하이브리드 저하를 통해 타겟 분자의 파괴를 촉진하도록 설계된다. 대안적으로, 안티센스 분자는 전사 또는 복제와 같이, 타겟 분자에서 정상적으로 일어나는 처리 기능을 중단하도록 설계된다. 안티센스 분자들은 타겟 분자의 서열을 기반으로 하여 설계될 수 있다. 타겟 분자의 가장 잘 액세스할 수 있는 영역을 발견함으로써 안티센스 효율을 최적화하는 많은 방법들이 있다. 예시적인 방법들은 DMS 및 DEPC를 사용한 DNA 변형 연구 및 생체 외 선택 실험들을 포함한다. 안티센스 분자들이 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는 타겟 분자에 결합하는 것은 바람직하다.
"안티센스" 핵산 서열(안티센스 올리고뉴클레오티드)은 단백질을 인코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들어 이중 가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 p53 인코딩 mRNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산 서열 및 전달 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다(Goodchild , Curr . Opin . Mol. Ther ., 6(2):120-128 (2004); Clawson, 등, Gene Ther ., 11(17):1331-1341 (2004)). 안티센스 핵산은 타겟 서열의 전체 코딩 가닥 또는 그의 일부분에만 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 길이에 있어서 약 7개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 수 있다.
안티센스 핵산 서열은 전체 p53 mRNA 서열에 상보적이 되도록 설계될 수 있지만, p53 mRNA의 일부에 대해서만 안티센스인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 안티센스 핵산은 당업계에 알려진 절차들을 사용한 화학 합성 및 효소 결찰 반응들을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 또는 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드들이 사용될 수 있는, 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키거나 분자들의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 방향으로 아클론화(subcloning)되는 (즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA가 다음의 세부 항목에서 더 설명되는 관심의 타겟 핵산에 대한 안티센스 방향이 되는) 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다.
유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 다른 예들은 알파-아노머 핵산을 포함한다. 알파-아노머 핵산 분자는 보통의 베타 유닛들과 반대로, 가닥이 서로 평행한 상보적 RNA와 특이적 이중 가닥 하이브리드를 형성한다(Gaultier 등, Nucleic Acids . Res . 15:6625-6641 (1987)). 또한, 안티센스 핵산 분자는 2'-o-메틸리보뉴클레오티드(Inoue 등 Nucleic Acids Res . 15:6131-6148 (1987)) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue 등 FEBS Lett., 215:327-330 (1987))를 포함할 수 있다.
3.
앱타머
일부 실시형태에서, 억제 분자는 앱타머이다. 앱타머들은 가급적 특정 방법으로 타겟 분자와 상호 작용하는 분자이다. 앱타머들은 매우 높은 정도의 특이성으로 타겟 분자와 결합할 수 있다. 예를 들어, 타겟 분자와 분자의 하나의 위치에서만 상이한 또 다른 분자 간 결합 친화성의 차가 10,000배 이상인 앱타머들이 분리되었다. 이들의 단단한 결합 특성으로 인해, 및 앱타머 타겟들의 표면 특징들이 빈번하게 단백질 타겟의 기능적으로 관련이 있는 부분들에 해당하기 때문에, 앱타머들은 강력한 생물학적 길항제일 수 있다. 전형적으로, 앱타머들은 줄기 루프 또는 G-사중구조와 같이, 정의된 이차 및 4차 구조로 접힌15 개 내지 50개의 염기를 갖는 작은 핵산이다. 앱타머들은 역전사 효소 및 트롬빈과 같은 큰 분자뿐만 아니라, ATP 및 테오필린과 같은 작은 분자들을 결합시킬 수 있다. 앱타머들은 10-12 M 미만의 Kd를 갖는 타겟 분자와 매우 단단하게 결합할 수 있다. 앱타머들이 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 미만의 Kd를 갖는 타겟 분자들을 결합하는 것은 바람직하다. 앱타머가 백그라운드 결합 분자의 Kd보다 적어도 10배, 100배, 1000배, 10,000배, 또는 100,000배 낮은 타겟 분자의 Kd를 갖는 것은 바람직하다. 폴리펩티드와 같은 분자에 대한 비교를 수행할 때 백그라운드 분자가 상이한 폴리펩티드인 것은 바람직하다.
4.
리보자임
p53 유전자 발현은 리보자임들을 사용하여 억제될 수 있다. 리보자임은 분자 내에서 또는 분자 사이에서 화학 반응에 촉매 작용할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임들이 분자 간 반응에 촉매 작용을 하는 것은 바람직하다. 해머헤드 리보자임과 같이, 자연계에서 발견되는 리보자임들을 기반으로 하는 핵산가수분해효소 또는 핵산 중합 효소 형 반응에 촉매 작용을 하는 다수의 상이한 유형의 리보자임이 있다. 또한, 자연계에서 발견되지는 않지만, 처음부터 특정 반응에 촉매 작용을 하도록 설계된 다수의 리보자임이 있다. 바람직한 리보자임들은 RNA 또는 DNA 기질, 더욱 바람직하게 RNA 기질들을 절단한다. 전형적으로 리보자임들은 인식 및 후속 절단과 타겟 기질의 결합을 통해 핵산 기질들을 절단한다. 자주, 이러한 인식은 전형적 또는 비전형적 염기 쌍 상호작용을 주로 기반으로 한다. 타겟 기질의 인식은 타겟 기질 서열을 기반으로 하기 때문에, 이러한 특성은 리보자임을 특히 핵산의 타겟 특이적 절단을 위한 좋은 후보로 만든다.
5.
트리플렉스
형성 올리고뉴클레오티드
p53 유전자 발현은 트리플렉스 형성 분자들을 사용하여 억제될 수 있다. 트리플렉스 형성 기능적 핵산 분자들은 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 분자들이다. 트리플렉스 분자들이 타겟 영역과 상호작용할 때, 왓슨-크릭과 훅스틴 염기 쌍 둘 다에 의존하는 복합체를 형성하는 DNA의 세 가닥이 존재하는 트리플렉스라고 불리는 구조가 형성된다. 트리플렉스 분자들은 높은 친화성 및 특이성을 갖는 타겟 영역들과 결합할 수 있기 때문에 바람직하다. 트리플렉스 형성 분자들이 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 미만의 Kd를 갖는 타겟 분자와 결합하는 것은 바람직하다.
6. 외부 가이드 서열
p53 발현은 외부 가이드 서열들을 사용하여 억제될 수 있다. 외부 가이드 서열(EGS)은 타겟 분자를 절단하는 RNase P에 의해 인식되는 복합체를 형성하는 타겟 핵산 분자를 결합하는 분자이다. EGS는 선택의 RNA 분자를 특이적으로 겨냥하도록 설계될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 전달 RNA(tRNA)를 처리하는 과정에 도움이 된다. 박테리아 RNAse P는 타겟 RNA:EGS 복합체가 천연 tRNA 기질을 모방하도록 하는 EGS를 사용함으로써 사실상 모든 RNA 서열을 절단하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, RNA의 진핵 EGS/RNAse P 유도 절단은 진핵 세포 내의 원하는 타겟들을 절단하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 상이한 타겟 분자들의 절단을 용이하게 하는 EGS 분자를 제조하고 사용하는 방법에 대한 대표적인 예들은 당업계에 알려져 있다.
7.
ShRNA
p53 발현은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 shRNA를 발현시키기 위해 설계된 발현 구조체들을 사용하여 억제될 수 있다. shRNA의 전사는 중합 효소 III(pol III) 프로모터에서 개시되고, 4-5-티민 전사 종결 부위의 2번 위치에서 종료되는 것으로 생각된다. 발현 시, shRNA는 3' UU 돌출부를 갖는 줄기 루프 구조로 접히고, 나중에 이들 shRNA의 말단이 처리되어, shRNA들은 약 21개의 뉴클레오티드를 갖는 siRNA 같은 분자로 전환되는 것으로 생각된다(Brummelkamp 등, Science 296:550-553 (2002); Lee 등, Nature Biotechnol . 20:500-505 (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol . 20:497-500 (2002); Paddison 등, Genes Dev . 16:948-958 (2002); Paul 등, Nature Biotechnol . 20:505-508 (2002); Sui (2002) supra; Yu 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99(9):6047-6052 (2002).
C. 전달 매개체
안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, EGS, 리보자임, 및 앱타머와 같은 기능적 핵산들의 생체 내 발현을 위한 벡터들의 제조 및 사용 방법은 당업계에 알려져 있다.
예를 들어, 전달 매개체는, 예를 들어 아데노바이러스 벡터(주식회사 퀀텀 바이오테크놀로지(캐나다 퀘벡주 라발))와 같이 상업적으로 이용 가능한 제제인 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터 전달은 재조합 레트로바이러스 게놈을 패키징할 수 있는 레트로바이러스 벡터 시스템과 같은 바이러스 시스템을 통해서 할 수 있다. 이때, 재조합 레트로바이러스는 감염에 사용될 수 있고, 그로 인해 간세포 유도 인자(들)을 인코딩하는 핵산을 감염된 세포들에 전달할 수 있다. 물론, 숙주 세포에 변형된 핵산을 도입하는 정확한 방법은 레트로바이러스 벡터들의 사용에 한정되지 않는다. 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 위형화된 레트로바이러스 벡터, 및 (Soofiyani, 등, Advanced Pharmaceutical Bulletin, 3(2):249-255 (2013))에 기술된 다른 벡터들의 사용을 포함하여 다른 기술들을 본 절차를 위해 폭넓게 사용할 수 있다. 바이러스들은 안전성을 향상시키고, 특정 흡수를 증가시키고, 효율을 향상시키기 위해 변형될 수 있다(예를 들어, Zhang, 등, Chinese J Cancer Res ., 30(3):182-8 (2011), Miller, 등, FASEB J, 9(2):190-9 (1995), Verma, 등, Annu Rev Biochem ., 74:711-38 (2005) 참조).
리보솜 전달 및 수용체 매개 및 다른 내포작용(endocytosis) 메커니즘들과 같은 물리적 형질도입 기술들이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, Schwartzenberger 등, Blood, 87:472-478 (1996) 참조). LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE((주) GIBCO-BRL, 게이더스버그, 메릴랜드주), SUPERFECT((주) Qiagen 힐덴, 독일) 및 TRANSFECTAM((주) 프로메가 바이오텍, 매디슨, 위스콘신주)과 같은 상업적으로 이용 가능한 리보솜 제제들뿐만 아니라, 당업계의 표준 절차들에 따라 개발된 다른 리보솜들이 잘 알려져 있다. 또한, 간세포 유도 인자들을 인코딩하는 핵산 또는 벡터들은 세포 초음파 처리에 의해서뿐만 아니라 전기 천공법에 의해 생체 내에서 전달될 수 있다. 전기 천공법 동안, 막 횡단 전위차를 생성하기 위해 전기적 펄스가 세포막을 가로질러 인가되고, 이는 불안정해진 막을 통한 핵산의 형질도입(transfection) 및 과도 막 투과를 허용한다(Soofiyani, 등, Advanced Pharmaceutical Bulletin, 3(2):249-255 (2013)). 세포 초음파 처리는 혈관 및 조직의 투과성을 일시적으로 증가시키기 위해 기체 미세기포들의 혈관 내 또는 조직 내 투여와 초음파의 국부적 인가를 결합한다(Escoffre, 등, Curr Gene Ther ., 13(1):2-14 (2013)). 전기적 펄스 또는 초음파는 타겟 조직 또는 기관에 초점을 맞출 수 있고 이런 이유로 인해 유전자 전달 및 발현이 이에 국한되어야 하기 때문에, 전기 천공법 및 초음파 기반 기술들은 형질도입(transfection) 방법들을 목표로 하고 있다. 개시된 간세포 유도 인자들의 발현 또는 과발현은 이들 중 어느 하나 또는 유전자 총의 사용을 포함하지만, 유체역학 주입에 국한되지 않는 일반적으로 사용되는 유전자 전달 방법들로 달성된다.
IV
. 사용 방법
본 명세서에 개시된 연구들은 약물 대사 기능을 갖는 인간 간세포들이 교차 분화(lineage reprogramming)에 의해 생성될 수 있고, 따라서 제약적 응용을 위한 세포 자원을 제공할 수 있음을 보여준다.
A. 생체 외 및 연구 적용
(i) 약물 테스트
간은 약물의 대사 활성에서 가장 중요한 역할을 하기 때문에, 간 유세포들은 의약품 개발에서 중요한 역할을 한다. 현재, 의약품 후보의 주요 실패 원인은 약물의 ADME(흡수, 분포, 대사, 배설)이 이상적이지 않다는 것이다. 의약품 발견 연구의 필수적인 부분은 약물 대사의 완전한 참여에 의한 간 세포, 인간 간 유세포들에 대한 후보 의약품의 대사 및 독성 효과에 대한 것이다. 현재 생체 외 의약품 개발에 사용되는 주요 간세포들은 인간 성인 일차 간세포들이다. 이들의 제한된 자원 및 생체 외에서 일차 간세포 기능을 유지하기 어렵다는 유지의 어려움 때문에, 의약품 개발에서 이들의 적용은 매우 제한된다.
단계 I, 단계 II 및 단계 III 약물 대사 효소들을 발현하는 본 명세서에 개시된 hiHep들은 생체 외 약물 대사 연구에 사용될 수 있다.
(ii) 연구
감염성 질환과 관련된 연구들에서 발생하는 문제는 적절한 동물 모델의 부족이다. hiHep는 감염성 질환, 예를 들어 B형 간염 및 C형 간염 연구를 위한 인간화된 마우스 모델들을 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 동물 모델은 감염성 질환, 특히 간을 감염시키는 질환들을 치료하기 위한 백신 및 의약품 개발에 사용하기 위한 신뢰할 수 있는 생체 내 플랫폼을 제공할 수 있다.
B. 생체 내 적용
간 부전 및 기능 상실은 간 질환의 가장 심각한 결과들 중 하나이다. 질환의 빠른 발병, 빠른 진행으로 인해, 간 이식은 이들 질환의 주요한 치료 수단이다. 그러나, 기증자 부족은 심각한 문제를 제공하고 많은 환자들이 간 이식을 기다리는 동안 죽는다.
본 명세서에 개시된 연구들은 이식된 hiHep가 Tet-uPA/Rag2-/-γc-/- 마우스의 간을 최대 30%까지 재생하고 생체 내에서 300 ㎎/㎖ 이상의 인간 알부민을 분비한다는 것을 보여준다. 따라서, hiHep는, 예를 들어 간 부전 및 기능 상실 질환의 치료에 사용될 수 있다.
피부를 통한 또는 목의 정맥을 통한 주입으로 분리된 iHep를 문맥에 이식하는 단계, 및 비수 또는 복강에 주입하는 단계는 간 이식과 비교하여 외과적인 절차가 덜하다. 바람직하게, iHep는 치료되는 동일한 동물로부터 얻어진다. 숙주 간이 제거되거나 절제되지 않기 때문에, 이식편 기능의 상실이 간 기능을 악화시키지 않아야 한다. 또한, 분리된 iHep는 잠재적으로 언제든지 사용할 수 있도록 냉동 보관될 수 있다. iHep는 예를 들어, 간 종양에 대한 방사선 치료로 야기되는 방사선에 의한 간 손상으로부터 환자를 구하기 위해 생체 밖 유전자 치료를 위한 매개체로 사용될 수 있다. iHep는 간세포의 이식으로 알려진 매트릭스와 같은 담체를 사용하여 수용 유기체에 이식될 수 있다. 예를 들어, Zhou 등은 간세포 이식을 위한 담체로서의 탈세포화된 간 매트릭스(DLM)의 사용을 개시한다(Zhou, 등, Liver Transpl., 17(4):418-27(2011)). Schwartz 등은 조직 샘플들에서 간 및 췌장 세포를 분리하는 단계, 폴리-L-락트산 매트릭스에 접종하는 단계, 및 동일한 환자의 장간막에 다시 이식하는 단계를 개시한다(Schwartz, 등, Int. J. Gastroentrol., 10(1)).
또한, hiHep는 생체 인공 간 지원 시스템들에서 사용될 수 있다. 개시된 세포들을 기반으로 하는 생체 인공 간 지원 시스템은 이식에 적합한 기증자 자원을 사용할 수 있을 때까지, 환자의 내부 환경을 안정화시키고 향상시키기 위해 일시적으로 간부전의 주요 기능(유해 물질 제거, 간 합성 생물학적 활성 물질 제공)을 대체하기 위해 구성된다. 생체 인공 간을 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 출원 번호 제2008/0206733호에 개시된다.
V.
키트
비-간세포의 기능적 간세포 대사 특성들을 갖는 유도 간세포로의 생체 외 리프로그래밍을 유도하기 위한 키트가 개시된다. 키트는 간세포 유도 인자 HNF1A , HNF6 , HNF4A , ATF5 , PROX1 , CEPBA 및/또는 MYC를 상향조절하는 인자 및 p53 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 하향조절하는 인자들을 포함한다. 일 실시형태에서, 키트는 HNF1A , HNF6 , HNF4A , ATF5 , PROX1 , CEPBA 및/또는 MYC의 모든 DNA 서열 및 p53 유전자 발현을 하향 조절하는 DNA 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 키트는 HNF1A , HNF6 , HNF4A, ATF5 , PROX1 , CEPBA 및/또는 MYC 유전자를 과발현시키는 렌티바이러스, 및 p53 유전자 발현을 억제시키는 핵산을 포함한다.
실시예
재료 및 방법
인간 일차 세포 분리 및 배양
본 연구는 중국-일본 친선 병원의 임상 연구 윤리 위원회(윤리적 승인 번호: 2009-50), 북경 대학교의 줄기 세포 연구 감독(SCRO201103-03)의 승인을 받아서 헬싱키 선언의 원칙에 따라 실시되었다.
고지에 입각한 환자의 동의로 임신 14주된 인간 배아 피부 및 태아의 간 조직을 임신 중절로부터 얻었다. 태아의 간 세포들을 전술한 바와 같이 얻었다(Lilja 등, 64:1240-1248 (1997)). 1 ㎎/㎖의 콜라게나아제IV (Gibco)를 보충한 10 ml의 배지(RPMI 1640)에서의 소화를 위해 태아의 간 조직을 1 mm3 내지 3 mm3 파편으로 절단하였다. 15분 내지 20분 동안 37 ℃에서 소화시키고, 저속 원심분리로 적혈구를 제거하였다. RPMI 1640으로 세포를 3회 세척하였다. 트리판 블루 배제는 세포 생존율이 90%라고 추정하였다.
75%의 수성 에탄올로 신선한 인간 배아 피부 조직(HEF) 및 ex vivo 인간 성인 포피 조직(HFF)을 소독하고, 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 안과 가위를 사용하여 피하 조직에서 조직을 조심스럽게 분리하였다. 조직을 PBS로 여러 번 세척하고, 작은 조직 블록들을 페트리 접시에 접종하고, 37 ℃의 5% CO2 배양기에 넣었다. 2 시간 후, DMEM 높은 포도당 배지(Hyclone에서 구입, 제품 카탈로그 번호 SH30022.01B), 15%의 소 태아 혈청(FBS), 0.1 mM의 β-메르캅토에탄올, 1%의 비-필수 아미노산, 및 1 mM의 글루타메이트, 8 유닛/ml 겐타마이신을 추가하였다. 5분 동안 실온에서 0.25% 트립신 및 0.02% EDTA로 세포를 소화시켰다. 새로운 페트리 접시에서 높은 포도당 배지인 전술한 DMEM 에 1:3으로 세포들을 접종하였다. 2일 마다 배지를 교체해주었고, (배아 피부로부터 유래된) 인간 섬유아세포 및 (성인 포피로부터 유래된) 인간 섬유아세포를 얻기 위해 4일 마다 세포들을 1:3으로 계대 배양하였다. 인간 피부 섬유아세포들은 약 5일 내지 7일 동안의 세포 배양 후에 약 80%의 합류에 이른다.
고지에 입각한 동의 후, 간 이식을 위해 사용하지 않은 인간 기증자의 간에서 인간 일차 간세포를 분리하고(Seglen, 13:29-83 (1976)), HCM(LONZA)으로 배양하였다.
hiHep
의 생성
본 연구는 중국-일본 친선 병원의 임상 연구 윤리 위원회(윤리적 승인 번호: 2009-50), 북경 대학교의 줄기 세포 연구 감독(SCRO201103-03)의 승인을 받아서 헬싱키 선언의 원칙에 따라 실시되었다.
밤새 인간 섬유아세포들을 감염시키고, 1주일 동안 DMEM + 10% 소 태아 혈청에서 배양한 후, 증식을 위해 간세포 배양 배지(HCM)(Lonza)로 옮겨졌다.
바이러스 감염 하루 전에, 포유류 체세포 배양 배지를 포함하는 12-웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 20,000개 세포로 인간 섬유아세포를 접종하고, 12시간 동안 37 ℃ 및 5%의 CO2 배양물에서 배양한 후, 다음의 렌티바이러스 발현 벡터들, 즉 각각 HNF1A, HNF6, HNF4A, ATF5, PROX1, CEBPA 및 MYC를 발현시키는 렌티바이러스 발현 벡터 및 p53의 발현을 억제하기 위한 DNA(들)을 발현시키는 렌티바이러스를 HNF1A의 경우 10 ㎕, HNF6의 경우 10 ㎕, HNF4A의 경우 6㎕, ATF5의 경우 10㎕, PROX1의 경우 3㎕, CEBPA의 경우 3 ㎕, MYC의 경우 10㎕, 및 p53(p53의 발현을 억제하기 위한 렌티바이러스)의 경우 10 ㎕을 첨가하였다. 20시간 후에 배지를 교체한 후 매일 교체하였다. DMEM에서 7일 동안 배양한 세포들은 HCM으로 옮겨졌다.
3주 배양 후, HCM은 개량된 윌리엄의 E 배지(북경 바이탈스타 바이오테크놀로지)로 교체되었다. 세포를 4일마다 계대 배양하였고, 30일 후에 인간 간세포와 같은 세포들을 수확(harvest)하였다. hiHep 리프로그래밍에 대한 개략도는 도 1E에 도시된다.
성장 곡선 및 배가 시간
MTT 분석을 위해, 증식 단계 및 성숙 단계의 유도 세포들을 96-웰 플레이트에 (웰 당 1000개의 세포)로 플레이팅하고, 7일 동안 따로따로 HCM(p53 siRNA-GFP 발현억제 이전) 또는 개량된 WEM(p53 siRNA-GFP 발현억제 이후)에서 배양하였다. 제조업체의 지침(Vybrant® MTT 세포 증식 분석 키트, 인디트로겐)에 따라 매일 MTT 분석을 수행하였다. 증식 단계에서 유도 세포의 배가 시간을 계산하기 위해, (p53 siRNA-GFP 발현억제 이전) 증식 단계의 유도 세포들을 웰 당 30,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, 마트리겔로 코팅된 12-웰 플레이트에서 배양하였다. 시간의 함수로서 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 카운트하여 성장 속도는 결정하였다. 지수 성장 곡선을 얻기 위해 지수적 성장 단계의 데이터(12시간, 24시간, 36시간 및 48시간에서의 데이터 포인트)를 사용하였다. 이후, 식 Td= t*ln2/ln(Nt/N0)를 사용하여 배가 시간(Td)을 구하였고, 여기서, Nt는 시간 t에서의 세포 수이고, N0는 초기 시간에서의 세포 수이다.
간의 분화
인간 배아 줄기 세포(hESC, ES 세포주 H1, WiCell 연구소)는 hESCs 배지의 조사된 마우스 배아 섬유아세포에서 유지되었다(Thomson 등, Science 282:1145-1147 (1998)). hESC는 이전에 보고한 바와 같이 간세포로 분화되었다(Zhao 등, Cell Res 23:157-161 (2013)).
분자
클로닝
,
렌티바이러스
생산 및 형질도입
전사 인자들의 상보적 DNA들이 인간 전체 길이 TrueClones™ (Origene)로부터 증폭되고, 사용자의 매뉴얼에 따라 pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(시스템 바이오사이언스)에 삽입된다(HNF1A, HNF6, HNF4A, ATF5, PROX1, 및 CEBPA의 렌티바이러스 발현 벡터 각각에 대해, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6이 pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro의 제한 효소 부위에 각각 삽입된다). 발현 벡터 pLL-IRES-Puro(Zhao Y 등, Cell Stem Cell. 2008 Nov 6; 3(5): 475-9; 북경 바이오테크놀로지, Ltd. 또는 북경 대학으로부터 사용 가능)의 제한 효소 부위(Xho I 및 EcoR I)에 서열 번호 7을 삽입하여 MYC의 렌티바이러스 발현 벡터가 구성된다. 전체 서열 정보에 대해, http://www.sciencegateway.org/protocols/lentivirus/pllmap.html를 참조한다. p53의 발현을 억제하기 위한 DNA 분자가 발현 벡터 pll3.7 (Rubinson and Dillon 등, Nature Genetics, 2003; 북경 바이오테크놀로지, Ltd. 또는 북경 대학으로부터 사용 가능)의 제한 효소 부위(Hpa I 및 Xho I)에 삽입된다. 센스 사슬 (5'-TGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTC-3') 및 안티센스 사슬 (5'-TCGAGAAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATTACCACTGGAGTCA-3')로 어닐링하여 p53의 발현을 억제하기 위한 DNA 분자를 얻는다. 전술한 바와 같이 바이러스 패키지가 구성된다(Zhao 등, Cell Stem Cell, 3:475-479 (2008)). 10 ㎍/㎖의 폴리브렌을 포함하는 10% 소 태아 혈청을 갖는 DMEM(Hyclone)에서 12시간 동안 인간 섬유아세포들을 감염시킨다. 섬유아세포들은 감염 7일 후 다시 플레이팅되고 HCM(LONZA)에서 배양된다. GFP 리포터에 의해 표시된 바와 같이 p53 siRNA가 발현억제(silencing)되었을 때 감염 약 25일 후에, hiHep를 개량된 윌리엄의 E 배지(바이탈스타 바이로테크놀로지)에서 배양하였다.
알부민
ELISA
, 주기적 산-
시프
(
PAS
) 염색,
인도시아닌
그린(
ICG
) 흡수 및 방출, 저밀도 지질단백질(
LDL
) 흡수 및 오일
레드
염색
인간 알부민 ELISA 정량화 키트(Bethyl Laboratory)를 사용하여 인간 알부민을 측정하였다. PAS 염색 시스템은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 배양물들을 4% 파라포름알데히드(DingGuo)로 고정하고 제조업체의 지침에 따라 염색하였다. ICG 흡수 및 방출은 전술한 바와 같이 수행하였다(Cai 등, Hepatology 45:1229-1239 (2007)). LDL 흡수 분석을 위해, 10 ㎍/㎖의 DiI-Ac-LDL(Invitrogen)을 37 ℃에서 4시간 동안 hiHep로 배양하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 지질 검출을 위해, 배양물들을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 5분 동안 60% 이소프로판올로 처리하였다. 이후, 이소프로판올을 제거하고, 오일 레드 O 작업 용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이후, 오일 레드 O를 제거하고, 깨끗해질 때까지 배양물을 린스해주었다.
CYP
대사 분석
전술한 바와 같이 기존의 현탁법을 사용하여 약물 대사 활성을 평가하였다(Gebhardt 등, Drug Metab. Rev. 35:145-213 (2003)). hiHep를 50 mM 리팜피신, 50 mMb-나프토플라본, 및 1 mM의 페노바르비탈을 갖는 배지에서 72시간 동안 배양하였고 24시간마다 배지를 새로 교체해주었다. 해리된 hiHep, HepG2 세포, ES-Hep, 섬유아세포 및 갓 분리된 일차 인간 간세포의 세포 생존율을 트리판 블루로 측정하였다. 미리 데운 1ml의 배양 배지(윌리엄의 E 배지, 10 mM HEPES [pH 7.4], 2 mM GlutaMAX)를 1 3 106 전체 세포(세포 현탁물)마다 첨가하였다. 동일한 배양 배지[400 mM 테스토스테론, 10 mM 미다졸람, 200 mM 페나세틴, 1mM 부프로피온, 500 mM (S)-메페니토인, 50 mM 디클로페낙]로 기질 용액을 제조하였다. 반응은 5 ml 폴리스티렌 둥근 바닥 시험관(BD Falcon)에서 250 ml의 기질 용액과 250 ml의 세포 현탁액을 혼합함으로써 시작되었다. 시험관들을 배양기의 궤도 셰이커에 놓고, 셰이커 속도를 210 rpm으로 조정하였다. 37 ℃에서 15분 내지 240분 배양한 후, 실온에서 시험관들을 원심 분리하여 상청액을 수집하였다. 담금질 용매(메탄올) 부피의 3배를 포함하는 시험관에 샘플 부분 표본을 첨가하여 반응 중지시키고 -80 ℃에서 동결시켰다. 내부 표준으로서 동위 원소 표지된 레퍼런스 대사산물들을 사용하였다. 테스토스테론, 미다졸람, (S)-메페니토인, 디클로페낙, 부프로피온 및 페나세틴에 대한 내부 레퍼런스 대사 산물들은 각각 6b-하이드록시테스토스테론-[D7], 하이드록시미다졸람-[13C3], 40-하이드록시메페니토인-[D3], 40-하이드록시디클로페낙-[13C6], 하이드록시부프로피온-[D6] 및 아세토미도페놀-[13C2, 15N]이다. 대사 산물을 사용하여 대사 산물 분석을 위한 표준 곡선을 만들었다. 표준 대사 산물들은 6b-하이드록시테스토스테론, 10-하이드록시미다졸람, 하이드록시부프로피온, 40-하이드록시디클로페낙, (±)-40-하이드록시메페니토인, 및 아세트아미노펜이었다. 검증된 기존의 LC-MS 법을 사용하는 파마론(Pharmaron)으로 대사 산물들을 정량화하였다. 결과들은 분 당 및 백만 개의 세포 당 형성된 대사 산물의 피코몰로 표현된다. b-나프토플라본, 리팜피신, 테스토스테론, 미다졸람, 디클로페낙 및 페나세틴을 포함하여 화학 약품들은 시그마에서 구입하였다. 표준 대사 산물 및 내부 레퍼런스 대사 산물들은 BD 바이오사이언스에서 구입하였다. 페노바르비탈은 Jinning Lou사로부터 기증받았다.
qRT
-
PCR
및
RT
-
PCR
RNeasy Micro Kit(Qiagen)로 전체 RNA를 분리하고 나서 SuperScript® III First-Strand Synthesis(Invitrogen)으로 역전사시켰다. 제조업체의 지침에 따라 2×EasyTaq PCR SuperMix(TransGen)로 RT-PCR을 수행하였다. 내생 유전자 발현의 특이적 검출에 사용된 프라이머들이 표 1 및 표 2에 도시된다.
표 1: 도 2A의 내생 유전자들의 특이적 검출에 사용된
프라이머
표 2: 도 2B의
외생
유전자들의 특이적 검출에 사용된
프라이머
MX3000P 서열 검출 시스템(Stratagene)에서 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 표 3에 도시된다.
표 3: 도 3의 유전자
순방향
프라이머
(5'→3') 역방향
프라이머
(5'→3') 관련
qRT
-
PCR
에 사용된
프라이머
18srRNA에 대한 프라이머는 QIAGEN에서 구입하였다. 정량화된 값들은 두 개의 하우스키핑 유전자(GAPDH 또는 RRN18S)에 의해 결정된 입력에 대하여 표준화하였다. qRT-PCR에서의 양성 대조군의 경우, 갓 분리된 일차 인간 간세포의 다섯 가지 상이한 배치들을 RNAprotect(Qiagen)에서 수집하고 -20 ℃에 보관하였다. 전체 RNA를 분리하고 나서 전술한 바와 같이 cDNA로 역전사하였다. 갓 분리된 일차 인간 간세포들의 다섯 가지 상이한 배치로부터 얻은 cDNA의 동일한 부피를 양성 대조군으로 취하기 위해 혼합하였다.
면역 형광 및 유동 세포 측정 분석
세포 또는 조직 절편들을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(Dingguo)에서 고정하고, 실온에서 1시간 또는 4 ℃에서 밤새 0.25% 트리톤 X-100 및 5% 정상 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc)을 포함하는 PBS로 차단하였다. 샘플들을 4 ℃에서 밤새 일차 항체들로 배양하고, PBS로 3회 세척하고 나서, 어두운 실온에서 1시간 동안 적절한 2차 항체로 배양하였다. 핵을 DAPI(Roche)로 염색하였다. 실험을 3회 반복하였고 전형적인 결과들을 나타내었다. 면역 형광에 사용된 일차 항체들은 다음과 같다: 토끼 항체 CYP3A4, 토끼 항체 CYP2C9, 토끼 항체 YP1A2, 토끼 항체 CYP2E1, 토끼 항체 CYP2D6(모두 AbD Serotec로부터), 염소 항체 ALB(Bethyl Laboratories, INC), 토끼 항체 NR5A2/LRH1(Abcam), 토끼 항체 COL1A1(Abcam), 마우스 항체 E-CAD(Abcam), 마우스 항체 인간 핵(Millipore). 면역 형광에 사용된 이차 항체들은 다음과 같다: DyLight® 550 당나귀 항체 토끼 및 DyLight® 550 당나귀 항체 염소(Abcam으로부터), DyLight 488 당나귀 항체 염소, DyLight 549 당나귀 항체 염소, DyLight 488 당나귀 항체 마우스, DyLight 549 당나귀 항체 마우스, DyLight 488 당나귀 항체 토끼, DyLight 549 당나귀 항체 토끼(모두 잭슨 면역 연구소로부터). 유동 세포 측정 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다(Zhao 등, Cell Res., 23:157-161 (2013)).
RNA
서열 분석
HEF, HepG2 세포, ES-Hep, hiHep 및 갓 분리된 일차 인간 간세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 일루미나 TruSeq RNA 샘플 제조 키트를 사용하여 RNA 서열 라이브러리들을 제조하였다. 파편으로 만들어 무작위로 준비한 200-bp의 페어드-엔드 라이브러리들을 일루미나 HiSeq 2000 서열 시스템에서 서열화하였다.
독성 분석
배양 배지에 용해된 다양한 농도의 화합물을 사용하여 24시간 동안 hiHep를 배양하였다. 전술한 바와 같이 제조업체의 지침에 따라 MTT 분석법(Invitrogen)으로 세포 생존율을 측정하였다(Khetani and Bhatia, Nat Biotechnol 26, 120-126 (2008)).
동물 및 이식
BALB/c 백그라운드에서의 Tet-uPA/Rag2-/-/γc-/- 마우스들을 북경 바이탈스타 바이테크놀로지에서 구매하였다. hiHep, ES-Hep 및 일차 인간 간세포(2 x 106 세포/동물)를 마우스의 비장에 주입하였다. 혈액 샘플을 채집하고, 인간 알부민 ELISA 정량화 키트(베틸 연구소)를 사용하여 인간 알부민을 정량화하였다. 수용 마우스의 간을 OCT 화합물(Sakura)에 끼워 넣고 나서 액체 질소에서 동결시켰다. 동결 절편(10 mm)들을 염색하였다.
통계 분석
통계 분석을 위해, 양방 비쌍체 t 테스트(two-tailed unpaired t test)를 사용하였다. 결과들은 평균±표준 편차로 표현된다. 값들은 다음과 같다: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
등록 번호
RNA 서열 데이터는 등록 번호 GSE54066으로 NCBI 유전자 발현 옴니버스 데이터베이스에 등록되어 있다.
결과
간 운명을 유도하는 인자들의 식별
인간 배아 섬유아세포(HEF)를 간세포로 유도하는 전사 인자들의 조합을 식별하기 위해, 간세포 운명의 결정에 매우 중요하고, 이전에 인간 간세포들에서 발현되는 것으로 나타났던 전사 인자들의 풀(pool)(표 4)이 선택되었다(Nagaoka and Duncan, Prog . Mol . Biol Transl Sci , 97:79-101 (2010); Zaret, Nat . Rev . Genet., 9:329-340 (2008)).
표 4: 갓 분리된 일차 인간 세포에서 분석된 전사 인자
또한, 이전 연구들은 증식 저지 및 세포 사멸은 세포 리프로그래밍에 대한 일반적인 장벽이라는 것을 보여주었다(Huang 등, Nature, 475:386-389 (2011); Zhao 등, Cell Stem Cell , 3:475-479 (2008)). 따라서, 리프로그래밍 과정에 MYC뿐만 아니라 p53 소 간섭 RNA(siRNA)을 사용하였다. 간단히, HNF1A 및 HNF4A는 17개의 전사 인자들 사이에서 배아와 성인 간 모두에서 중요한 역할을 하기 때문에 우선적으로 고려된다. 이후, HNF1A 와 HNF4A의 조합에 한 번에 하나의 후보 인자의 추가에 의해 "2+1" 전략을 사용하여 추가 인자들을 스크리닝하였다.
데이터는 HNF4A 및 HNF1A와 협력하는 HNF6가 20일 내에 알부민(ALB) 양성 세포들의 높은 백분율을 야기할 수 있음을 보여주었다. 이러한 세 개의 인자는 글리코겐 합성 및 저밀도 지질 단백질(LDL) 흡수를 포함하여 몇 가지 간의 특성을 나타내는 간세포와 같은 세포(3H 세포)를 유도하였다(데이터 도시하지 않음). 그러나, 이들 세포에서 ALB의 발현 수준은 매우 낮았다(도 1A). 또한, 간세포에서 주요 사이토크롬 P450 효소들의 발현은 이들 세포에서 검출되지 않았다(데이터 도시하지 않음). 따라서, 3H 세포들은 기능적으로 성숙하지 않은 것으로 보이고, 이는 그들의 완전한 성숙을 위해서 추가 인자들이 필요함을 의미한다.
성숙한 간세포를 생성하는 인자들의 식별
간세포와 같은 세포들의 기능적 성숙을 유도할 수 있는 인자들을 식별하기 위해, 3H 세포, 갓 분리된 일차 인간 간세포(F-HEP) 및 태아 간 세포들에서 글로벌 유전자 발현 분석을 수행하였다. CEBPA, ATF5, 및 PROX1을 포함하여 여러 개의 간 전사 인자들의 차등 발현이 세 개의 샘플 중에서 관찰되었다(데이터 도시하지 않음). 이러한 세 개의 유전자는 성인 간세포에서의 수준과 비교하여 3H 세포 및 태아 간세포에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현되었다. 이러한 차이는 정량적인 PCR에 의해 또한 확인되었다(도 1B 및 도 1C). 이들 유전자 중에서, PROX1은 최근 연구에서 간세포의 대사적 성숙에서 중요한 핵심 전사 인자인 것으로 밝혀졌다(Zhao 등, Cell Res., 23:157-161 (2013)). CEBPA 및 ATF5는 간 기능에서의 전사 조절의 중요성을 표시하는 매우 풍부한 간-농축 전사 인자들이다. 또한, 유전자 발현 연구는 이러한 세 개의 유전자가 F-HEP에서 크게 발현된다는 것을 보여주었다(도 1D). 종합적으로, 이들 데이터는 이들 인자의 과발현이 3H 세포들의 기능적 성숙으로 이어질 수 있다는 것을 보여주었다.
섬유아세포로부터 성숙한 인간 간세포를 생성하기 위해, CEBPA, PROX1, 및 ATF5로 세 개의 인자가 조합되었고, 도 1E에 도시된 방식에 따라 HEF에서 과발현되었다. 상피 세포로의 섬유아세포의 극적인 형태 변화가 1주일 내에 관찰되었다. 이들 세포는 9시간에서 11시간까지의 배가 시간으로 간세포 배양 배지(HCM)에서 빠르게 증식하였다(도 1F). 감염 2주 후, 리플레이트된 세포들은 일차 인간 간세포의 전형적인 형태를 보여주었다(데이터 도시하지 않음). GFP 리포터에 의해 표시된 바와 같이, 감염 약 25일 후, p53 siRNA는 발현억제(silencing)되었고(데이터 도시하지 않음), 유도된 세포들은 개량된 윌리엄의 E 배지에 옮겨졌다(도 1E 및 도 1F). 정량적인 PCR 결과들은 유도된 간세포와 같은 세포들이 3H 세포들의 수준(도 1A)보다 상당히 높은 일차 인간 간세포의 수준(도 1G)과 비교할 만한 수준에서 ALB를 발현함을 보여주었다. 리프로그래밍 효율을 또한 분석하였고, 유도된 세포의 90%가 ALB 양성이고 거의 100%가 α-1 항트립신(AAT) 양성임을 발견하였다(도 1H 및 도 1I). ALB의 분비는 크게 향상되었고 일차 인간 간세포의 분비와 비교할 만하였다(도 1J). 또한, 4 개의 주요 사이토크롬 P450 효소 CYP3A4, CYP1A2, CYP2C9, 및 CYP2C19가 면역 염색에 의해 검출된 바와 같이 유도된 세포에서 또한 발현되었다(데이터 도시하지 않음). 이러한 6개 인자 중 어느 하나의 제거는 약물 대사 효소 및 수송체들의 발현을 실질적으로 감소시킨다(도 1K). 이들 결과는 기능적 간 특성들이 hiHep라 칭한 이들 유도된 간세포와 같은 세포에서 얻어졌음을 표시한다.
인간 간세포의 전형적 특성을 갖는
hiHep
간 운명 전환을 평가하기 위해, 전형적인 간의 특징들을 우선 분석하였다. 면역 형광 현미경 검사는 상피 마커 E-카데린(ECAD)이 hiHep에서 ALB와 함께 발현되었음을 보여주었다(데이터는 도시하지 않음). 또한, 섬유아세포 마커 COL1A1은 검출되지 않았다(데이터는 도시하지 않음). 이들 결과는 hiHep에서의 성공적인 간엽 상피 전이를 보여준다. 다음으로, RT-PCT를 사용하여 hiHep에서의 내생 간 전사 네트워크 활성화를 또한 조사하였다.
RT-PCR 결과들은 FOXA1, FOXA2, 및 FOXA3의 내생 발현(Zaret 등, Nat . Rev . Genet., 9:329-340 (2008))이 iHep에서 활성화되었음을 보여주었다(도 2A). 간 교차-조절 네트워크에 관여하는 또 다른 코어 전사 인자인 LRH1(Nagaoka and Duncan, Prog . Mol . Biol Transl Sci ., 97:79-101 (2010))가 hiHep에서 또한 내생적으로 발현하였다(도 2A).
면역 형광을 사용하여 FOXA2 및 LRH1의 발현을 확인하였다(데이터 도시하지 않음). 추가적으로, COL1A1, PDGFRB, 및 THY1을 포함하여 섬유아세포 마커 유전자들은 hiHep에서 검출되지 않았다(도 2A). p53 siRNA 발현억제(silencing)에 따라서, HNF1A, HNF6, HNF4A, ATF5, PROX1, 및 CEBPA의 외생 발현이 hiHep에서 발현억제(silencing)되었다(도 2B). 도 2A에서 사용된 프라이머들은 HNF1A, HNF4A, PROX1 및 CEBPA의 내생 전사물을 구체적으로 식별할 수 있다. 이들 프라이머는 서열들을 코딩하기 보다는 내생 전사물들의 고유 5'UTR 또는 3'UTR에 결합하도록 설계된다. 또한, 정략적 RT-PCR(qRT-PCR)에 의해 확인된 바와 같이, MYC는 갓 분리된 일차 인간 간세포의 수준보다 낮은 수준까지 iHep에서 감소되었다(도 2C). 종합적으로, 이들 데이터는 hiHep가 간 전사 네트워크를 얻게 된다는 것을 나타낸다.
다음으로, hiHep는 인간 간세포의 기능적 특성들에 대해 평가되었다. hiHep는 LDL 흡수에 대해 만족할 만하였다(데이터 도시하지 않음). 또한, hiHep는 배지로부터 인도시아닌 그린(ICG)을 포함하고, 퇴약(withdrawal) 후에 흡수된 ICG를 배제할 수 있다(데이터 도시하지 않음). hiHep에서의 오일 레드 O 염색은 지방 방울의 축적을 보여주었고, 주기적 산-쉬프(PAS) 염색은 글리코겐 합성을 표시하였다(데이터 도시하지 않음). 인간 성인 간세포와 마찬가지로, hiHep는 AFP 음성이었다(데이터 도시하지 않음). G 밴딩 분석은 hiHep가 7주 배양 후 정상적인 핵형을 가짐을 보여주었다(데이터 도시하지 않음). HEF 이외에, 동일한 인자들을 사용하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 성인 포피 섬유아세포들이 전환되었을 때 유사한 결과들을 얻었다(데이터 도시하지 않음). 결과적으로, 이들 결과는 hiHep가 전형적인 간 기능 특징을 나타냄을 보여준다.
hiHep 및 F-HEP에서의 글로벌 유전자 발현 패턴이 RNA 서열에 의해 비교되었다. 주 성분 분석 및 계층적 클러스터링 분석은 상이한 기증자들로부터 확립된 hiHep들이 인간 간세포들과 클러스트화되고 인간 섬유아세포, hepG2 세포 및 인간 배아 줄기 세포(ESC) 유래 간세포(ES-Hep)로부터 분리되었음을 밝혔다(데이터 도시하지 않음). 과연, hiHep에서 간 전사 인자들(도 2A에 도시된 바와 같이, 이들 인자는 FOXA1, FOXA2, FOXA3, CEBPA, HNF1A, HNF4A, PROX1 및 LRH1이다)은 상향조절되었고, 섬유아세포 시그네처 유전자(도 2A에 도시된 바와 같이, 이들 인자는 PDGFB1, THY1 및 COL1A1이다)들의 발현은 하향조절되었다(데이터 도시하지 않음). 추가적으로, hiHep는 지질 단백질, 콜레스테롤, 지방, 글루코오스 및 약물 대사에 관여하는 유전자들의 집합에서 간세포의 유전자 발현 패턴들을 표시하였다(데이터 도시하지 않음). 전적으로, 이들 결과는 hiHep가 일차 인간 간세포와 유사한 발현 양상을 보여줌을 나타낸다.
hiHep
에서 약물 대사의 중앙 네트워크 확립
약물 대사에서 hiHep가 주요 효소들을 발현하는지 여부를 평가하기 위해, hiHep에서 다섯 개의 주요 CYP 효소 CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, 및 CYP3A4의 hiHep에서의 발현을 정량적으로 확인하였다. 다섯 개의 주요 CYP는 인간 약물 산화의 60%를 처리하는 주요 단계 I 효소들이다(Zhou 등, Drug Metab. Rev., 41:89-295 (2009)). 양성 대조군으로서, 다섯 개인 기증자로부터 모은 F-HEP가 사용되었다. 인간 ESCs와 HepG2 세포로 부터 유래한 간세포에서의 그들의 발현과 대조적으로, 이들 주요 CYP의 비교할만한 mRNA 수준들이 hiHep 및 F-HEP에서 검출되었다(도 3A). 다음으로, 생체 이물 약물들의 배출에 중요한 단계 II 효소 및 단계 III 수송체들의 존재에 대해 hiHep를 분석하였다. 이들 유전자의 발현 수준은 F-HEP에서의 발현 수준과 유사하였다(도 3B 내지 도 3D). 추가적으로, hiHep들은 단계 I 및 단계 II 대사 효소 및 단계 III 수송체들의 광범위한 스펙트럼을 발현하였다(도 3E). 종합적으로, 이들 발견은 약물 대사의 중앙 네트워크가 hiHep에서 성공적으로 확립되었고, 모은 갓 분리된 일차 인간 간세포들의 것과 유사하다는 것을 보여준다.
갓 분리된 일차 인간 간세포들의 것과 비교할 만한
hiHep
에서의 주요 약물 대사 활성 수준
hiHep의 약물 대사 활성을 평가하기 위해, 연구들은 우선 CYP3A4에 초점을 맞추었다. 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 기술을 사용하여, hiHep에서 CYP3A4의 약물 대사 활성이 두 개의 구조적으로 상이한 기질 테스토스테론 및 미다졸람을 사용하여 검출되었다. 약물 클리어런스에서의 놀라운 개체간 가변성 때문에, 두 개의 갓 분리된 일차 인간 간세포 배치(batch)가 양성 대조군으로 사용되었다. HepG2 세포주, ES-Hep, 및 HEF와 대조적으로, hiHep는 두 개의 CYP3A4 선택적 기질을 효율적으로 대사시킬 수 있고, 대사 효율은 갓 분리된 간세포(F-HEP)에서 보여지는 대사와 비교할 만하다(도 4A). Zhao, 등는 ES-Hep가 25주의 오래된 태아 간세포 및 인간 성인 일차 간세포에서 보여지는 것보다 낮은 수준에서 활성을 갖는 CYP3A4를 발현한다고 개시한다(Zhao, 등, Cell Res., 23:157-161 (2013)). 또한, hiHep에서 CYP1A2 및 CYP2B6의 대사 활성은 F-HEP의 대사 활성과 비교할 만한 것으로 나타났다(도 4A). hiHep에서 CYP2C9 및 CYP2C19의 활성은 F-HEP의 약 30%이었다(도 4A). hiHep에서 이들 CYP 효소 모두의 대사 활성은 ES-Hep의 대사 활성보다 적어도 100배 높았다. 이들 데이터는 hiHep가 갓 분리된 일차 인간 간세포의 대사 활성과 비교할만한 주요 CYP 효소들의 대사 활성을 나타냄을 표시한다.
hiHep에서 약물 대사 산물의 기능적 중앙 네트워크를 또한 평가하기 위해, 효소들을 대사하는 발현을 조절하는 과정에서 중요한 HiHep와 F-Hep 사이에서의 핵 수용체들의 발현을 비교하였다. 생체 이물 대사 시스템에 책임이 있는 핵 수용체들이 hiHep에서 발현되었다(도 3F). 또한, hiHep는 mRNA 수준에서 CYP3A4, CYP1A2, 및 CYP2B6의 표준 인듀서에 응답하였다(도 4B). 종합하면, 이들 데이터는 hiHep에서 핵 수용체 네트워크의 기능적 확립을 보여준다.
간독성을 연구하는 과정에서의 hiHep의 응용 가능성을 평가하기 위해, 모델 헤파토톡신의 급성 독성을 정량화하였다. 간독성은 의약품 실패를 야기하는 가장 일반적인 부작용이기 때문에(Sahi 등, Curr . Drug Discov. Technol., 7:188-198 2010), 약물 독성의 민감도는 의약품 발견에서 인간 간세포의 응용 가능성에 대한 주요 색인이다. hiHep는 일련의 모델 헤파토톡신들로 배양된 경우의 일차 인간 간세포의 민감도 수준과 비교할 만한 민감도 수준을 보여주었고(도 4C), 이는 약물 독성을 테스트하기 위해 hiHep를 사용할 가능성이 있음을 보여주는 것이다.
hiHep
에 의한
Tet
-
uPA
/
Rag2
-/-
/γc
-/-
마우스 간의 재생
마우스 간을 재생시키는 hiHep의 능력을 조사하기 위해, Tet-uPA (우로키나아제형 플라스미노겐 활성화인자)/Rag2-/-/γc-/- 마우스가 hiHep와 함께 비장 내로 주입되었다(Song 등, Am . J. Pathol ., 175:1975-1983 (2009)). 마우스 혈청에서 인간 알부민의 분비는 점차적으로 증가하였고, 도달한 가장 높은 수준은 hiHep 이식 7주 후에 313 mg/ml이었고(도 5A 내지 도 5C), 이는 일차 인간 간세포에 비교할 만하고 ES-Hep보다 1000배 높았다(도 5B). 접종 효율을 분석하기 위해, 두 마리 마우스의 전체 간에서 간세포를 분리하여 유동 세포 측정 분석으로 측정하였다. 재생 효율은 313 mg/ml의 인간 알부민을 분비한 마우스에서 약 30%이었다(도 4C). hiHep 이식 2달 후에 종양 형성은 전혀 관찰되지 않았다. 또한, hiHep의 이식을 분석하였다. 이식 6주 후, 인간 ALB를 발현하는 세포들의 클러스터들이 수용체 마우스에서 관찰되었다(데이터 도시하지 않음). 생체 내에서의 hiHep의 대사 기능을 확인하기 위해 CYP 발현을 분석하였다. CYP3A4, CYP2C9, CYP1A2, CYP2E1, CYP2C19, 및 CYP2D6를 포함하여 주요 CYP들의 발현은 hiHep가 생체 내에서 기능적임을 보여주었다. 종합적으로, 이들 결과는 hiHep가 Tet-uPA/Rag2-/-/γc-/- 마우스 간을 강력하게 재생시킬 수 있고, 생체 내에서 기능적임을 보여준다.
논의
이러한 연구들은 인간 hiHep가 성숙 인자 ATF5, PROX1, 및 CEBPA와 함께 간 운명 전환 인자 HNF1A, HNF4A, 및 HNF6의 조합을 사용하여 HEF로부터 쉽고 재현적으로 생성된다는 것을 보여준다. 일차 인간 간세포와 마찬가지로, hiHep는 그들의 상피 형태, 간세포 특이적 마커의 발현, 간세포의 기본 기능적 특성, 및 글로벌 유전자 발현 패턴들을 포함하여 많은 전형적인 간의 특징들을 나타낸다. 중요하게, 단계 I과 단계 II 약물 대사 효소 및 단계 III 약물 수송체들의 통합 스펙트럼은 hiHep에서 잘 확립된다. 또한, 이식된 hiHep는 생체 내에서 300 mg/ml 이상의 인간 알부민을 분비하고 Tet-uPA/Rag2-/-/γc-/- 마우스 간의 30%까지 재생시킬 수 있다. 이러한 데이터는 약물 대사 기능들을 갖는 인간 간세포들이 교차 분화(lineage reprogramming)를 사용하여 섬유아세포들로부터 생성될 수 있음을 보여준다. 교차 분화(lineage reprogramming)에서 하나의 핵심 문제는 완전히 기능적인 세포들을 얻는 방법이다. 간의 전환분화에서, 마우스 유도 간세포와 같은 세포들은 섬유아세포에서의 간 운명 결정 인자들의 발현을 통해 여러 중요한 간 특성들을 가지고 생성되었다(Huang 등, 2011; Sekiya and Suzuki, Nature, 475:390-393 (2011)). 그러나, hiHep에 의한 특정 간아세포 마커들의 발현 및 불완전한 간세포 분화는 미숙하거나 간세포와 같은 상태와 호환 가능하다(Willenbring, Cell Stem Cell, 9:89-91 (2011)). 또한, 이들 연구는 해당 특정 간 운명 결정 인자들이 간세포와 같은 세포들로 HEF를 리프로그래밍할 수 있음을 보여준다. 그러나, 이들 세포는 세 개의 추가 인자들이 추가될 때까지 기능적이지 않다(도 1G 내지 도 1J). 추가적인 세 개의 인자는 hiHep의 대사 성숙을 또한 촉진한다(데이터 도시하지 않음). 따라서, 간 운명 결정 및 간 기능 성숙은 다소 서로 독립적이고 상이한 마스터 유전자들에 좌우될 수 있다. 완전환 기능 세포들을 얻기 위해, 세포 운명 결정 인자들의 이소성 발현이 충분하지 않을 수 있고, 추가적인 기능 성숙 인자들이 이 과정을 촉진할 필요가 있다.
인간 간세포들의 약물 대사 능력은 다른 계통들과 간세포들을 구별하고 의약품 개발에서의 광범위한 응용을 갖는 가장 중요한 기능들 중 하나이다. 인간 만능 줄기 세포들을 간세포로 분화하려는 노력들은 기능적으로 미성숙한 세포들을 초래하였다. 최근 연구는 인간 ES-Hep들이 CYP1A2 및 CYP3A4를 발현한다는 것을 보여주었다(Zhao 등, Cell Res., 23:157-161 (2013)). 그러나, 이러한 두 개의 CYP 효소의 활성은 일차 간세포들의 활성보다 상당히 낮았다. 또 다른 연구에서, 분화된 간세포들은 배양된 일차 간세포들의 것과 단지 비교할 만한 CYP3A4 및 CYP1A2 활성을 보여주었다(Ogawa 등, Development, 140:3285-3296 2013). 그러나, 다수의 간 필수 기능은 배양된 일차 간세포들에서 시간이 지남에 따라 점진적으로 손실되었다(Elaut 등, Curr . Drug Metab. 7:629-660 (2006)). 본 명세서에 개시된 연구들에서, 금본위제, 갓 분리된 일차 인간 간세포들이 양성 대조군으로 사용되었다. 본 명세서에 개시된 hiHep들은 갓 분리된 일차 인간 간세포들의 수준과 비교할 만한 수준으로 주요 단계 I(CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2B6, 및 CYP1A2) 및 단계 II 약물 대사 효소 및 단계 III 약물 수용체들을 발현한다. 중요하게, hiHep에서 다섯 개의 CYP 효소들의 대사 활성은 갓 분리된 일차 인간 간세포들에서의 다섯 개의 CYP 효소들의 대사 활성과 비교할 만하고, 이는 이들 CYP 효소에 의해 대사되는 약물들을 평가하는 과정에서 hiHep의 응용 가능성을 보여준다(도 4A). 이들 세포에서 생체 이물 대사 시스템과 관련된 내생 핵 수용체들의 발현이 또한 검출되었다(Nakata 등, Drug Metab . Pharmacokinet., 21:437-457 (2006))(도 3F). 또한, CYP3A4, CYP1A2, 및 CYP2B6의 발현은 표준 인듀서들에 의해 증가되었다(도 4B). 또한, 간세포들에서 통합된 대사 경로들(단계 I 및 단계 II 효소 및 단계 III 약물 수송체)이 의약품 발견을 위해 매우 중요하기 때문에(Castell 등, Expert Opin . Drug Metab . Toxicol. 2:183-212 (2006)), hiHep의 약물 대사 네트워크를 면밀히 분석하였다. 약물 대사 마커들을 인코딩하는 유전자들의 발현 패턴은 일차 인간 간세포들에서의 발현 패턴과 유사하고, 이는 hiHep에서의 약물 대사 네트워크의 상향조절을 의미한다(도 3A 내지 도 3F). 종합적으로, 이들 결과는 이들 세포를 임상전 스크리닝 분석을 위한 잠재적인 대안으로 만드는 hiHep에서 기능적인 약물 대사의 중앙 네트워크의 필수적인 확립을 나타낸다.
의약품 개발에서 인간 간세포들의 또 다른 주요 특성은 약물 독성에 대한 그들의 민감도이다. 인간 만능 줄기 세포들로부터 유래된 인간 간세포는 약물 독성에 대해 상대적으로 낮은 민감도를 갖는다(Zhao 등, Cell Res., 23:157-161 (2013)). 그에 반해서, 다수의 모델 헤파토톡신에 대한 본 명세서에 개시된 hiHep들의 민감도는 일차 인간 간세포들의 민감도와 비교할 만하다(도 4C). 따라서, hiHep들은 새로운 의약품 발견을 위한 간독성 분석에서 귀중한 대안적 세포 자원일 수 있다. 중요하게, 우리의 결과들은 유도 세포들이 초기 단계에서 큰 스케일로 증식될 수 있고(도 1F), hiHep의 기능은 16일 동안 유지될 수 있다는 것을 입증한다(도 4D). 리프로그래밍 효율을 고려하면(도 1H 및 도 1I), 섬유아세포의 104로부터 시작하는 1011 이상의 기능적 hiHep를 얻을 수 있다(데이터 도시하지 않음). 이들 결과는 hiHep가 제약 개발을 위한 실용적인 방법으로 사용될 수 있음을 보여준다.
간세포 이식은 정위 간 이식에 대한 유망한 대안이다(Dhawan 등, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 7:288-298 (2010)). 그러나, 양질의 세포들을 제공할 수 있는 기증자 장기의 제한된 공급은 주요 문제점으로 남아 있다. 본 명세서에 기재된 연구들에서, hiHep는 강력하게 마우스 간을 재생시킬 수 있고, 인간 배아 줄기 세포들로부터 유래된 인간 간세포를 사용한 최근의 연구들보다 100배 더 높은 최대 313 mg/ml의 인간 알부민을 분비하였다(도 5A 및 도 5B)(Takebe 등, Nature, 499:481-484 (2013); Woo 등, Gastroenterology, 142:602-611 (2012)). 또한, 이식된 hiHep는 주요 CYP 효소들을 발현하였고, 이는 hiHep가 생체 내에서의 약물 대사 능력을 보유하고 있음을 표시하는 것이다(데이터 도시하지 않음). 종합적으로, hiHep는 인간화된 마우스 모델 및 간세포 이식의 확립을 위한 잠재적인 세포 자원으로서의 역할을 할 수 있다.
결론적으로, 세포 운명 결정 인자 및 세포 성숙 인자들의 조합된 발현을 사용하여 약물 대사 기능을 갖는 인간 간세포들이 생성되었다. 교차 분화(lineage reprogramming)에 의한 기능적 인간 간세포들의 생성은 제약적 응용에 위해 잘 특성화되고 재생산 가능한 기능적 인간 간세포들을 얻는 방법을 제공한다.
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> HNF1A
<400> 1
atggtttcta aactgagcca gctgcagacg gagctcctgg cggccctgct cgagtcaggg 60
ctgagcaaag aggcactgat ccaggcactg ggtgagccgg ggccctacct cctggctgga 120
gaaggccccc tggacaaggg ggagtcctgc ggcggcggtc gaggggagct ggctgagctg 180
cccaatgggc tgggggagac tcggggctcc gaggacgaga cggacgacga tggggaagac 240
ttcacgccac ccatcctcaa agagctggag aacctcagcc ctgaggaggc ggcccaccag 300
aaagccgtgg tggagaccct tctgcaggag gacccgtggc gtgtggcgaa gatggtcaag 360
tcctacctgc agcagcacaa catcccacag cgggaggtgg tcgataccac tggcctcaac 420
cagtcccacc tgtcccaaca cctcaacaag ggcactccca tgaagacgca gaagcgggcc 480
gccctgtaca cctggtacgt ccgcaagcag cgagaggtgg cgcagcagtt cacccatgca 540
gggcagggag ggctgattga agagcccaca ggtgatgagc taccaaccaa gaaggggcgg 600
aggaaccgtt tcaagtgggg cccagcatcc cagcagatcc tgttccaggc ctatgagagg 660
cagaagaacc ctagcaagga ggagcgagag acgctagtgg aggagtgcaa tagggcggaa 720
tgcatccaga gaggggtgtc cccatcacag gcacaggggc tgggctccaa cctcgtcacg 780
gaggtgcgtg tctacaactg gtttgccaac cggcgcaaag aagaagcctt ccggcacaag 840
ctggccatgg acacgtacag cgggcccccc ccagggccag gcccgggacc tgcgctgccc 900
gctcacagct cccctggcct gcctccacct gccctctccc ccagtaaggt ccacggtgtg 960
cgctatggac agcctgcgac cagtgagact gcagaagtac cctcaagcag cggcggtccc 1020
ttagtgacag tgtctacacc cctccaccaa gtgtccccca cgggcctgga gcccagccac 1080
agcctgctga gtacagaagc caagctggtc tcagcagctg ggggccccct cccccctgtc 1140
agcaccctga cagcactgca cagcttggag cagacatccc caggcctcaa ccagcagccc 1200
cagaacctca tcatggcctc acttcctggg gtcatgacca tcgggcctgg tgagcctgcc 1260
tccctgggtc ctacgttcac caacacaggt gcctccaccc tggtcatcgg cctggcctcc 1320
acgcaggcac agagtgtgcc ggtcatcaac agcatgggca gcagcctgac caccctgcag 1380
cccgtccagt tctcccagcc gctgcacccc tcctaccagc agccgctcat gccacctgtg 1440
cagagccatg tgacccagag ccccttcatg gccaccatgg ctcagctgca gagcccccac 1500
gccctctaca gccacaagcc cgaggtggcc cagtacaccc acacgggcct gctcccgcag 1560
actatgctca tcaccgacac caccaacctg agcgccctgg ccagcctcac gcccaccaag 1620
caggtcttca cctcagacac tgaggcctcc agtgagtccg ggcttcacac gccggcatct 1680
caggccacca ccctccacgt ccccagccag gaccctgccg gcatccagca cctgcagccg 1740
gcccaccggc tcagcgccag ccccacagtg tcctccagca gcctggtgct gtaccagagc 1800
tcagactcca gcaatggcca gagccacctg ctgccatcca accacagcgt catcgagacc 1860
ttcatctcca cccagatggc ctcttcctcc cag 1893
<210> 2
<211> 1395
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> HNF6
<400> 2
atgaacgcgc agctgaccat ggaagcgatc ggcgagctgc acggggtgag ccatgagccg 60
gtgcccgccc ctgccgacct gctgggcggc agcccccacg cgcgcagctc cgtggcgcac 120
cgcggcagcc acctgccccc cgcgcacccg cgctccatgg gcatggcgtc cctgctggac 180
ggcggcagcg gcggcggaga ttaccaccac caccaccggg cccctgagca cagcctggcc 240
ggccccctgc atcccaccat gaccatggcc tgcgagactc ccccaggtat gagcatgccc 300
accacctaca ccaccttgac ccctctgcag ccgctgcctc ccatctccac agtctcggac 360
aagttccccc accatcacca ccaccaccat caccaccacc acccgcacca ccaccagcgc 420
ctggcgggca acgtgagcgg tagcttcacg ctcatgcggg atgagcgcgg gctggcctcc 480
atgaataacc tctatacccc ctaccacaag gacgtggccg gcatgggcca gagcctctcg 540
cccctctcca gctccggtct gggcagcatc cacaactccc agcaagggct cccccactat 600
gcccacccgg gggccgccat gcccaccgac aagatgctca cccccaacgg cttcgaagcc 660
caccacccgg ccatgctcgg ccgccacggg gagcagcacc tcacgcccac ctcggccggc 720
atggtgccca tcaacggcct tcctccgcac catccccacg cccacctgaa cgcccagggc 780
cacgggcaac tcctgggcac agcccgggag cccaaccctt cggtgaccgg cgcgcaggtc 840
agcaatggaa gtaattcagg gcagatggaa gagatcaata ccaaagaggt ggcgcagcgt 900
atcaccaccg agctcaagcg ctacagcatc ccacaggcca tcttcgcgca gagggtgctc 960
tgccgctccc aggggaccct ctcggacctg ctgcgcaacc ccaaaccctg gagcaaactc 1020
aaatccggcc gggagacctt ccggaggatg tggaagtggc tgcaggagcc ggagttccag 1080
cgcatgtccg cgctccgctt agcagcatgc aaaaggaaag aacaagaaca tgggaaggat 1140
agaggcaaca cacccaaaaa gcccaggttg gtcttcacag atgtccagcg tcgaactcta 1200
catgcaatat tcaaggaaaa taagcgtcca tccaaagaat tgcaaatcac catttcccag 1260
cagctggggt tggagctgag cactgtcagc aacttcttca tgaacgcaag aaggaggagt 1320
ctggacaagt ggcaggacga gggcagctcc aattcaggca actcatcttc ttcatcaagc 1380
acttgtacca aagca 1395
<210> 3
<211> 1392
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> HNF4A
<400> 3
atgcgactct ccaaaaccct cgtcgacatg gacatggccg actacagtgc tgcactggac 60
ccagcctaca ccaccctgga atttgagaat gtgcaggtgt tgacgatggg caatgacacg 120
tccccatcag aaggcaccaa cctcaacgcg cccaacagcc tgggtgtcag cgccctgtgt 180
gccatctgcg gggaccgggc cacgggcaaa cactacggtg cctcgagctg tgacggctgc 240
aagggcttct tccggaggag cgtgcggaag aaccacatgt actcctgcag atttagccgg 300
cagtgcgtgg tggacaaaga caagaggaac cagtgccgct actgcaggct caagaaatgc 360
ttccgggctg gcatgaagaa ggaagccgtc cagaatgagc gggaccggat cagcactcga 420
aggtcaagct atgaggacag cagcctgccc tccatcaatg cgctcctgca ggcggaggtc 480
ctgtcccgac agatcacctc ccccgtctcc gggatcaacg gcgacattcg ggcgaagaag 540
attgccagca tcgcagatgt gtgtgagtcc atgaaggagc agctgctggt tctcgttgag 600
tgggccaagt acatcccagc tttctgcgag ctccccctgg acgaccaggt ggccctgctc 660
agagcccatg ctggcgagca cctgctgctc ggagccacca agagatccat ggtgttcaag 720
gacgtgctgc tcctaggcaa tgactacatt gtccctcggc actgcccgga gctggcggag 780
atgagccggg tgtccatacg catccttgac gagctggtgc tgcccttcca ggagctgcag 840
atcgatgaca atgagtatgc ctacctcaaa gccatcatct tctttgaccc agatgccaag 900
gggctgagcg atccagggaa gatcaagcgg ctgcgttccc aggtgcaggt gagcttggag 960
gactacatca acgaccgcca gtatgactcg cgtggccgct ttggagagct gctgctgctg 1020
ctgcccacct tgcagagcat cacctggcag atgatcgagc agatccagtt catcaagctc 1080
ttcggcatgg ccaagattga caacctgttg caggagatgc tgctgggagg gtcccccagc 1140
gatgcacccc atgcccacca ccccctgcac cctcacctga tgcaggaaca tatgggaacc 1200
aacgtcatcg ttgccaacac aatgcccact cacctcagca acggacagat gtccacccct 1260
gagaccccac agccctcacc gccaggtggc tcagggtctg agccctataa gctcctgccg 1320
ggagccgtcg ccacaatcgt caagcccctc tctgccatcc cccagccgac catcaccaag 1380
caggaagtta tc 1392
<210> 4
<211> 846
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> ATF5
<400> 4
atgtcactcc tggcgaccct ggggctggag ctggacaggg ccctgctccc agctagtggg 60
ctgggatggc tcgtagacta tgggaaactc cccccggccc ctgcccccct ggctccctat 120
gaggtccttg ggggagccct ggagggcggg cttccagtgg ggggagagcc cctggcaggt 180
gatggcttct ctgactggat gactgagcga gttgatttca cagctctcct ccctctggag 240
cctcccttac cccccggcac cctcccccaa ccttccccaa ccccacctga cctggaagct 300
atggcctccc tcctcaagaa ggagctggaa cagatggaag acttcttcct agatgccccg 360
cccctcccac caccctcccc gccgccacta ccaccaccac cactaccacc agccccctcc 420
ctccccctgt ccctcccctc ctttgacctc ccccagcccc ctgtcttgga tactctggac 480
ttgctggcca tctactgccg caacgaggcc gggcaggagg aagtggggat gccgcctctg 540
cccccgccac agcagccccc tcctccttct ccacctcaac cttctcgcct ggccccctac 600
ccacatcctg ccaccacccg aggggaccgc aagcaaaaga agagagacca gaacaagtcg 660
gcggctctga ggtaccgcca gcggaagcgg gcagagggtg aggccctgga gggcgagtgc 720
caggggctgg aggcacggaa tcgcgagctg aaggaacggg cagagtccgt ggagcgcgag 780
atccagtacg tcaaggacct gctcatcgag gtttacaagg cccggagcca gaggacccgt 840
agctgc 846
<210> 5
<211> 2211
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> PROX1
<400> 5
atgcctgacc atgacagcac agccctctta agccggcaaa ccaagaggag aagagttgac 60
attggagtga aaaggacggt agggacagca tctgcatttt ttgctaaggc aagagcaacg 120
ttttttagtg ccatgaatcc ccaaggttct gagcaggatg ttgagtattc agtggtgcag 180
catgcagatg gggaaaagtc aaatgtactc cgcaagctgc tgaagagggc gaactcgtat 240
gaagatgcca tgatgccttt tccaggagca accataattt cccagctgtt gaaaaataac 300
atgaacaaaa atggtggcac ggagcccagt ttccaagcca gcggtctctc tagtacaggc 360
tccgaagtac atcaggagga tatatgcagc aactcttcaa gagacagccc cccagagtgt 420
ctttcccctt ttggcaggcc tactatgagc cagtttgata tggatcgctt atgtgatgag 480
cacctgagag caaagcgcgc ccgggttgag aatataattc ggggtatgag ccattccccc 540
agtgtggcat taaggggcaa tgaaaatgaa agagagatgg ccccgcagtc tgtgagtccc 600
cgagaaagtt acagagaaaa caaacgcaag caaaagcttc cccagcagca gcaacagagt 660
ttccagcagc tggtttcagc ccgaaaagaa cagaagcgag aggagcgccg acagctgaaa 720
cagcagctgg aggacatgca gaaacagctg cgccagctgc aggaaaagtt ctaccaaatc 780
tatgacagca ctgattcgga aaatgatgaa gatggtaacc tgtctgaaga cagcatgcgc 840
tcggagatcc tggatgccag ggcccaggac tctgtcggaa ggtcagataa tgagatgtgc 900
gagctagacc caggacagtt tattgaccga gctcgagccc tgatcagaga gcaggaaatg 960
gctgaaaaca agccgaagcg agaaggcaac aacaaagaaa gagaccatgg gccaaactcc 1020
ttacaaccgg aaggcaaaca tttggctgag accttgaaac aggaactgaa cactgccatg 1080
tcgcaagttg tggacactgt ggtcaaagtc ttttcggcca agccctcccg ccaggttcct 1140
caggtcttcc cacctctcca gatcccccag gccagatttg cagtcaatgg ggaaaaccac 1200
aatttccaca ccgccaacca gcgcctgcag tgctttggcg acgtcatcat tccgaacccc 1260
ctggacacct ttggcaatgt gcagatggcc agttccactg accagacaga agcactgccc 1320
ctggttgtcc gcaaaaactc ctctgaccag tctgcctccg gccctgccgc tggcggccac 1380
caccagcccc tgcaccagtc gcctctctct gccaccacgg gcttcaccac gtccaccttc 1440
cgccacccct tcccccttcc cttgatggcc tatccatttc agagcccatt aggtgctccc 1500
tccggctcct tctctggaaa agacagagcc tctcctgaat ccttagactt aactagggat 1560
accacgagtc tgaggaccaa gatgtcatct caccacctga gccaccaccc ttgttcacca 1620
gcacacccgc ccagcaccgc cgaagggctc tccttgtcgc tcataaagtc cgagtgcggc 1680
gatcttcaag atatgtctga aatatcacct tattcgggaa gtgcaatgca ggaaggattg 1740
tcacccaatc acttgaaaaa agcaaagctc atgttttttt atacccgtta tcccagctcc 1800
aatatgctga agacctactt ctccgacgta aagttcaaca gatgcattac ctctcagctc 1860
atcaagtggt ttagcaattt ccgtgagttt tactacattc agatggagaa gtacgcacgt 1920
caagccatca acgatggggt caccagtact gaagagctgt ctataaccag agactgtgag 1980
ctgtacaggg ctctgaacat gcactacaat aaagcaaatg actttgaggt tccagagaga 2040
ttcctggaag ttgctcagat cacattacgg gagtttttca atgccattat cgcaggcaaa 2100
gatgttgatc cttcctggaa gaaggccata tacaaggtca tctgcaagct ggatagtgaa 2160
gtccctgaga ttttcaaatc cccgaactgc ctacaagagc tgcttcatga g 2211
<210> 6
<211> 1074
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CEBPA
<400> 6
atggagtcgg ccgacttcta cgaggcggag ccgcggcccc cgatgagcag ccacctgcag 60
agccccccgc acgcgcccag cagcgccgcc ttcggctttc cccggggcgc gggccccgcg 120
cagcctcccg ccccacctgc cgccccggag ccgctgggcg gcatctgcga gcacgagacg 180
tccatcgaca tcagcgccta catcgacccg gccgccttca acgacgagtt cctggccgac 240
ctgttccagc acagccggca gcaggagaag gccaaggcgg ccgtgggccc cacgggcggc 300
ggcggcggcg gcgactttga ctacccgggc gcgcccgcgg gccccggcgg cgccgtcatg 360
cccgggggag cgcacgggcc cccgcccggc tacggctgcg cggccgccgg ctacctggac 420
ggcaggctgg agcccctgta cgagcgcgtc ggggcgccgg cgctgcggcc gctggtgatc 480
aagcaggagc cccgcgagga ggatgaagcc aagcagctgg cgctggccgg cctcttccct 540
taccagccgc cgccgccgcc gccgccctcg cacccgcacc cgcacccgcc gcccgcgcac 600
ctggccgccc cgcacctgca gttccagatc gcgcactgcg gccagaccac catgcacctg 660
cagcccggtc accccacgcc gccgcccacg cccgtgccca gcccgcaccc cgcgcccgcg 720
ctcggtgccg ccggcctgcc gggccctggc agcgcgctca aggggctggg cgccgcgcac 780
cccgacctcc gcgcgagtgg cggcagcggc gcgggcaagg ccaagaagtc ggtggacaag 840
aacagcaacg agtaccgggt gcggcgcgag cgcaacaaca tcgcggtgcg caagagccgc 900
gacaaggcca agcagcgcaa cgtggagacg cagcagaagg tgctggagct gaccagtgac 960
aatgaccgcc tgcgcaagcg ggtggaacag ctgagccgcg aactggacac gctgcggggc 1020
atcttccgcc agctgccaga gagctccttg gtcaaggcca tgggcaactg cgcg 1074
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<211> 1362
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> MYC
<400> 7
ctggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60
agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120
gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180
agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240
cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300
aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360
ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420
aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480
tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540
cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc 600
tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc 660
aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc 720
tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg 780
cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt 840
tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga 900
ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960
cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc 1020
aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc 1080
aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag 1140
aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa 1200
aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc 1260
gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa 1320
cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cg 1362
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
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<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 9
ccccaggatc aaaagtaatc cca 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 10
tactccttca accacccgtt c 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 11
gctatgccag acaaacccc 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 12
cctacgaaca ggtgatgcac t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 13
gatttcttct cccttgcgtc t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 14
cgccctacaa cttcaaccac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 15
gatcaggccc caagagcttc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 16
gcctcttcct cccagtaacc a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 17
tatcccacga agcagcgaca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 18
agaaagaggc agaccatcca 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 19
tccctgcata ctccttgaag c 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 20
gcagctccaa ttcaggcaac 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 21
catcatttgt cttgccaagt cg 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 22
cagatgccgg aaaacatgca a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 23
cttaagtcca ttggctcgga t 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 24
ggacaccacc ctcaagagcc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 25
gtcatgctct cgccgaacca g 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 26
attccatgcc gagtaacaga ccc 23
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 27
agttgaccac ctcattcccg at 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 28
gcgattatct acccacgtcc ac 22
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 29
acagaccatg tccgtgcta 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 30
ccgaactgcc tacaagagc 19
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 31
aaggcagaaa gaaaacaacc a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 32
tcttccagga gcgagatccc t 21
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 33
tggtcatgag tccttccacg at 22
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 34
tgcctcctga actgcgtcc 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 35
gctccgcctc gtagaagtcg 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 36
ccgtctaggt aagtttaaag ctc 23
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 37
ctccgggtag tagctccac 19
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 38
ccgtctaggt aagtttaaag ctc 23
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 39
gtgtcattgc ccatcgtca 19
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 40
ccgtctaggt aagtttaaag ctc 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 41
ccgatcgctt ccatggtcag 20
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 42
ccgtctaggt aagtttaaag ctc 23
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 43
cgtccttttc actccaatgt ca 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 44
ccgtctaggt aagtttaaag ctc 23
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 45
gtgaaatcaa ctcgctcagt c 21
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 46
gcacagaatc cttggtgaac ag 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 47
atggaaggtg aatgtttcag ca 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 48
acaagaacag caacgagtac cg 22
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 49
cattgtcact ggtcagctcc a 21
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 50
gtggctccag gatgttagga 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 51
aggcctgagt tcatgttgct 20
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 52
cgactggagc agctactatg c 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 53
tacgtgttca tgccgttcat 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 54
ctggccgagt ggagctacta 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 55
agggggatag ggagagctta 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 56
ccatcctcaa agagctggag 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 57
gtgctgctgc aggtaggact 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 58
ccaaaaccct cgtcgacatg 20
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 59
ttctcaaatt ccagggtggt gta 23
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 60
tgtggaagtg gctgcagga 19
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 61
tgtgaagacc aacctgggct 20
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 62
cgaacactct tcgccatctt c 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 63
gttgctgacg gttgtgagct c 21
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 64
acagggctct gaacatgcac 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 65
ggcattgaaa aactcccgta 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 66
cgagtgggcc aggagtagta 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 67
cggtaaatgt ggtcgaggat 20
<210> 68
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 68
cccgacaccc caatctc 17
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 69
caggcgttgc acagatagtg 20
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 70
ccaacttcca cctcttctaa ctcag 25
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 71
tcttgacccg aatacttgag ctc 23
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 72
ctatgaggtc cttgggggag 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 73
ctcgctcagt catccagtca 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 74
acagttggag aaaatcggca 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 75
atccgaggaa ctggtccttt 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 76
ttgatggaac cagaacaccc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 77
agctggacga tccagttgtt 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 78
gtgagctgga acagcaagtg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 79
ccaagcgctg tcttaactcc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 80
ggtctggatg taccgactgc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 81
aaaattggaa tggcaccaac 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 82
accccatcac ataggggttt 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 83
taatgtcagc gtcacttggc 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 84
ttgcccatcg aggaccagat 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 85
gtctccgcgt tgaacactgt 20
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 86
gtcccacctg cccctttg 18
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 87
agtggcgcct ctgagtcttg 20
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 88
caggatttca gactttggac cat 23
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 89
cttcaaccgc agaccctttc 20
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 90
agagatttcg caatccatcg g 21
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 91
actggtattc cgtaaagcca aag 23
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 92
acatcaccta cgccagtcg 19
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 93
cgcttggaag gatttgactt ga 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 94
tactgtcggt ttcagaaatg cc 22
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 95
gtcagcggac tctggattca g 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 96
gtgatccacg acatcgagac a 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 97
tgcacgctga tctccttgta g 21
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 98
ccttcagaac ccacagagat cc 22
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 99
acgctgcata gctcgttcc 19
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 100
tctccaatct ggatctgagt gaa 23
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 101
acagctctag ggtcacagaa g 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 102
ccaacggtgg caatgtgaaa t 21
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 103
ccaaggactc tcattcgtct ctt 23
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 104
ctgaccaccc tccggaacta t 21
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 105
ggccttgggt cttcctgagt 20
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 106
gtgtccaaca ggagatcgac g 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 107
cacctcatga atcacggcag t 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 108
gaagaggagc attgaggacc g 21
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 109
gcccaggatg aaagtgggat 20
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 110
gccacatgcc ctacacagat g 21
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 111
taatgtcaca ggtcactgca tgg 23
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 112
cttcgtaaac cagtggcagg 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 113
agggcttgtt aatggcagtg 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 114
agcctggtgc tcctctatct 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 115
cccttatggt aggacaaaat 20
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 116
ccggggatat ggtgtgatct t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 117
ccgaagtccc tcatagtggt c 21
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 118
gagttcctgt cactgttgcg 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 119
gtcctggcag gtgtttcatc 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 120
ccatcatgcc caatatggtt 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 121
ccacaattcc atgttctcca 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 122
gccaacagga agccactatc 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 123
cagcaattgc catagctttc 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 124
aacgggaagc cactatctca 20
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 125
tcagcaattg ccatagcttt c 21
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 126
aatttcctaa aggccggtca 20
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 127
ttgatcccaa agagaaaacc a 21
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 128
actatcccaa acccgtgatg 20
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 129
accacaattc catgttctcc a 21
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 130
aacgtaattg catcagccct 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 131
ggtcattctg gggtatccac 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 132
gttttctctg gggtcgatga 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 133
atttggcttc ttgccatcaa 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 134
cagcctagtt cctggttgct 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 135
ggatctggtg ctcaagaatg 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 136
ctgagatcct gagcctttgg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 137
aagccattgg tgtttccttg 20
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 138
ttcaatcatg gaccaaaatc aa 22
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 139
tgagtgacag agctgccaag 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 140
gaaaacaaga cgctgcaatg 20
<210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 141
tcctttctat ttgagtgatg gaaa 24
<210> 142
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 142
agggggacat gaacctcag 19
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 143
aggtccccat catagatccc 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 144
tgcaccacca actgcttagc 20
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 145
ggcatggact gtggtcatga g 21
Claims (27)
- 하기 단계를 포함하는 비-간세포들을 간세포와 같은 세포(iHep)들로 유도하는 방법:
(a) 다음의 간세포 유도 인자들을 상향조절하기 위해 비-간세포들을 처리하는 단계: 간세포 핵 인자 1-알파(HNF1A), 간세포 핵 인자 4-알파(HNF4A), 간세포 핵 인자 6-알파(HNF6), 성숙 인자들인 활성화 전사 인자 5(ATF5), 프로스페로 호메오박스 단백질 1(PROX1), 및 CCAAT/인핸서 결합 단백질 알파(CEBPA), 여기에서 간세포 유도 인자의 상향조절은 비-간세포에 상기 간세포 유도 인자들을 인코딩하는 핵산을 외생적으로 도입함으로써 달성되고;
(b) 체세포 배양 배지에서 상기 단계 (a)로부터의 비-간세포들을 배양하는 단계;
(c) 간세포 배양 배지에서 상기 단계 (b)로부터의 세포들을 증식시키는 단계; 및
(d) 간세포 성숙 배지에서 상기 단계 (c)로부터의 세포들을 배양하는 단계. - 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)는 비-간세포에 MYC를 인코딩하는 핵산을 외생적으로 도입함으로써 MYC를 상향조절하고, p53 siRNA를 발현하는 벡터로 상기 세포들을 트랜스펙션시킴으로써 p53를 하향조절하기 위해 상기 세포들을 처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 세포들은 각각 서열 번호 1 내지 서열 번호 7로 기재된 핵산들로 형질전환되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 세포들은 적어도 7일 동안 체세포 배양 배지에서 배양되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 상기 세포들은 15일 내지 30일 동안 간세포 배양 배지에서 배양되는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 상기 세포들은 18일 내지 30일 동안 간세포 배양 배지에서 배양되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 상기 세포들은 18일 동안 간세포 배양 배지에서 배양되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 상기 세포들은 적어도 5일 동안 간세포 성숙 배지에서 배양되는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 단계 (c)의 끝에서 p53 siRNA의 발현을 억제하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비-간세포들은 배아 줄기 세포(ESC), 유도된 만능 줄기 세포(iPSC), 섬유아세포, 지방 유래 줄기 세포(ADSC), 신경 유래 줄기 세포, 혈액 세포, 케라틴세포 및 장 상피 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비-간세포들은 포유류에서 유래되는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 랫드, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 토끼, 말 및 돼지로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 방법.
- 제1항에 있어서, 알부민, 사이토크롬 P450(CYP)3A4 및 CYPB6로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 간 마커의 발현, 글리코겐 합성 및 저장, 및/또는 지방 방울 축적을 검출하여 iHep들을 식별하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 iHep.
- 제16항에 있어서, 상기 iHep는 CYP3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 약물 대사 효소를 발현하는 것인 iHep.
- 제16항에 있어서, 상기 iHep에서의 MYC 발현 수준은 상응하는 유기체로부터 얻은 간세포에서 확인되는 MYC 발현 수준보다 낮은 iHep.
- 제16항에 있어서, 상기 비-간세포들은 섬유아세포이고, 상기 iHep는 E-카데린은 발현하고, 섬유아세포 마커 유전자인 COL1A1, PDGFRB, THY1 및 α-태아단백질은 발현하지 않는 iHep.
- 제16항에 있어서, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, UDP 글루쿠론산전이효소(UGT)1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9, GSTA1, UGT2B7, UGT2515, 마이크로솜 글루타티온-S-전이효소 1(MGST1), 니코틴아미드 N-메틸전이효소(NNMT), NTCP, 유기 음이온 수송 폴리펩티드 1B3(OATP1B3), 다제 내성 단백질(MRP)6, MRP2, 플라빈 함유 모노옥시게나아제 5(FMO5), 모노아민 산화효소(MAO)A, MAOB, 및 에폭사이드 가수분해효소 1(EPHX1)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 약물 대사 단계 I 효소 또는 단계 II 수송체를 발현하는 iHep.
- 제16항에 있어서, CYP3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9, 및 CYP2C19 중 적어도 하나의 대사 활성은 동일한 유기체로부터 얻은 ES-Hep에서의 동일한 효소의 활성보다 적어도 50% 높은 iHep.
- 제21항에 있어서, CYP3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9, 및 CYP2C19 중 적어도 하나의 대사 활성은 ES-Hep의 활성보다 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상 높은 iHep.
- 제21항에 있어서, CYP3A4, CYPB6, CYP1A2, CYP2C9, 및 CYP2C19 중 적어도 하나의 대사 활성은 ES-Hep의 대사 활성보다 적어도 100배 높은 iHep.
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