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KR20050062639A - 구조적으로 결정된 금속 구조체 및 그의 용도 - Google Patents

구조적으로 결정된 금속 구조체 및 그의 용도 Download PDF

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KR20050062639A
KR20050062639A KR1020057007332A KR20057007332A KR20050062639A KR 20050062639 A KR20050062639 A KR 20050062639A KR 1020057007332 A KR1020057007332 A KR 1020057007332A KR 20057007332 A KR20057007332 A KR 20057007332A KR 20050062639 A KR20050062639 A KR 20050062639A
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peptide
metal ion
metal
metal ions
peptides
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KR1020057007332A
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슈브 디. 샤르마
Original Assignee
로메드 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

생물학적, 치료용, 진단용, 영상화용 또는 방사선 치료용 약제로서 사용되며, 라이브러리 또는 컴비네이토리 케미스트리 방법에서 사용되는 펩티드일 수 있는 금속구조체가 제공된다. 이 구조체는 금속 이온과의 착물 형성에 의해 얻어지는 컨포메이션적으로 구속된 전체적으로 2차 구조를 갖고 있다. 이 펩티드 구조체는 다음 일반식을 갖는다:
R1-X-R2
식 중, X는 복수의 아미노산이고, 금속 이온을 착물화하기 위한 착물 형성 골격을 함유하며, 그 결과, 금속 이온과 X와의 착물 형성에 의해 해당 금속 이온의 원자가가 실질적으로 모두 만족되어, 전체적인 이차 구조의 일부분을 형성하는 특정의 국소적 이차 구조가 얻어지고; R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하며, 당해 아미노산은 금속이온과 X와의 착체형성에 의해 R1과 R2의 어느 한쪽 또는 양쪽의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 전체적으로 이차 구조의 나머지 부분을 형성하는 구조를 갖도록 선택된다. 사이크놀로직 또는 레그닐로직일 수 있는 전체적인 이차 구조의 전체 또는 일부분은 리간드를 형성하거나 또는 공지의 생물학적 기능 도메인을 모사할 수 있다. 이 구조체는, 금속이온에서의 표식화에 의해 표적에 대해 실질적으로 보다 높은 친화성을 갖는다.

Description

구조적으로 결정된 금속 구조체 및 그의 용도{STRUCTURALLY DETERMINED METALLO-CONSTRUCTS AND APPLICATIONS}
본 출원은 1995. 6. 7.자 출원된 미국 특허출원 제 08/476,652호 (발명의 명칭: 펩티드-금속 의약 구조체 및 그의 용도)의 일부 계속출원이다.
본 발명은, 특히 생물학적, 의약적 및 방사선 의약적 용도를 가진 리셉터(receptor) 특이적 조성물에 사용하기 위한 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 펩티드-유사 및 금속 구조체에 관한 것으로, 상기 구조체는 금속 이온 결합 골격이 금속 이온으로 표지되어 있고 일반적으로 그 표적에 대한 친화성이 증가한 생물학적 작용 도메인으로 구조형태적으로 고정되어 있다.
펩티드 의약품. 최근에 여러가지 생물학적 효과를 가지고 있는 수많은 펩티드류가 발견되었다. 이들 펩티드류는 여러가지 질병의 치료 또는 예방용 의약품으로서 발표되고 있다. 펩티드 의약품의 사용에는, 순환계로부터 매우 신속한 제거, 몇몇 펩티드와의 낮은 표적 친화성, 더 큰 펩티드 구조체의 면역원성(immunogenicity), 단백질 분해 효소(proteolytic enzyme)에 대한 안정성 결핍 등을 포함하여 많은 제한이 따른다. 그러나 피브리노겐 리셉터 길항제 등을 비롯한 여러가지 길항제는 물론 소마토스타틴(somatostatin) 동족체, 아르기닌 바소프레신, 옥시토신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬, 안티오텐신 전환 효소, 레닌 및 엘라스타제 저해제를 포함하는 여러가지 증상에 대하여 치료제로서 사용되거나 또는 연구되고 있는 펩티드류가 있다. 이에 더하여, 펩티도미메틱 항생제와 펩티드-기재 백신이 인체 의약품으로서 사용 또는 개발되고 있다.
면역원성과 짧은 순환 반감기의 문제점은 잘 알려져 있으며, 이러한 문제점들을 해결하기 위하여 펩티드-기재 의약에 대한 여러가지 개선점들이 제의되었다. 그 중에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 폴리프로필렌 글리콜(PPG)과 같은 여러가지 폴리머로써 펩티드 또는 단백질을 개량하는 방법이 포함된다. 따라서, 브라즈 제이에이 씨와 헤이페즈 에이에이치 씨의 미국 특허 제 5,091,176 호(생물학적 및 의약적 활성이 증진된 폴리머-변형 펩티드 의약)에는 면역원성이 낮고, 순환 반감기가 길어지고 효능이 높은 폴리머-변형 의약품의 제조방법이 개시되어 있다. 이와 상이한 방법은 사노 에이, 메다 에이치, 카이 와이와 원 케이 씨의 미국 특허 제 5,214,131 호(폴리에틸렌 글리콜 유도체 보강 펩티드 및 그 제조방법)에 개시되어 있다.
펩티드-기재 방사성 의약품. 특이 세포 표면 리셉터에 결합하는 펩티드인 생물학적 활성 펩티드는 방사선 의약 용도로 고려되고 있다. 캐나다 특허출원 제 2,016,235 호(감염 또는 염증의 중심 위치를 영상화하는 표지된 화학 주성(走性) 펩티드)에서는 표지 또는 치료적으로 접합된 화학 주성 펩티드의 투여에 의한 감염 또는 염증의 위치를 검색하는 방법과 이러한 감염 또는 염증을 치료하는 방법을 설명하고 있다. 이 출원에서 화학 주성 펩티드가 DTPA에 화학적으로 접합된 후 111In으로 표지된다. DTPA 킬레이트의 효용성은 폴리펩티드와 그 유사 물질에 공유 결합되는 것이며 이 기술분야에 잘 알려져 있다(예, 흐나토위치 디제이 씨의 미국 특허 제 4,479,930 호 및 4,668,503 호 참조). 방사성 표지 펩티드, 폴리펩티드, 단백질에 대한 기타 2 작용기성 킬레이트가 본 기술분야에 공지되어 있다. 생물학적 활성 펩티드는 올렉사 에스에이, 나이트 엘씨와 부드진스키 에이케트 씨의 미국 특허 제 4,427,646 호(생체내의 트롬비의 위치시키기 위한 가교 결합된 피브린에서 유도된 방사선 표지 펩티드의 용도)에 기술되어 있으며 여기서는 방사선 표지에 의한 요오드화 반응에 대해서 논술되어 있다. 미국 특허 제 5,371,184 호(방사선 표지 펩티드 화합물)에서는 킬레이트 리간드를 통하여 방사선 표지된 히루딘 리셉터 특이 펩티드에 대해 기술되어 있다. 모간 씨에이 주니어와 안데른손 디씨의 미국 특허 제 4,986,979 호에서는 킬레이트의 용도 및 직접 요오드화법이 기술되어 있다. 톨만 지엘의 미국 특허 4,732,864 호(메탈로티오네인의 표지 접합체와 표적 추적 생물학적 활성분자)에는 펩티드를 포함한 생물학적 활성분자에 접합된 메탈로티오네인 또는 메탈로티오네인 단편의 용도에 대해서 기술되어 있다. 딘 알티와 리스터 제임스 쥬니어의 국제 출원 PCT/US95/04794, 트롬버스 영상화용 Tc-99m 표지 펩티드, 딘 알티, 부트람 에스, 멕브라이드 더블유, 리스터 제임스 쥬니어와 시비텔로 이알의 국제 출원 PCT/US93/03687, 영상화용 Tc-99m 표지 펩티드, 딘 알티, 리스 알에스, 부트람 에스과 리스터 제임스 쥬니어의 국제 출원 PCT/US93/02320, 염증 영상화용 Tc-99m 표지 펩티드와 딘 알티, 멜브라이드 더블유와 부트람 에스의 국제 출원 PCT/US92/10716, 펩티드 구조체 영상화용 Tc-99m 표지 펩티드에 대해서 기술하고 있다. 한가지 또는 그 이상의 펩티드에 또는 다가 결합성분에 공유 또는 기타 방법으로 결합된 Tc-99m 결합성분 모두를 포함한다. 이들 종래의 방법들 모두가 상자성 대비제와 같은 방사선 핵종 또는 기타 의약적 용도의 금속 이온과의 표지를 위한 킬레이트 물질로 몇몇 접합수단을 이용한다. 다만 예외적인 것은 직접 방사선 요오드화법인데, 예를 들어 클로라민-T, 요오딘 모노클로라이드, 요오드겐 또는 락토퍼옥시다제 방법에 의한 티로신 또는 히스티딘 잔기를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 요오드 표지법이 잘 알려져 있다.
딘 알티, 리스터 제임스 쥬니어와 부트람 에스의 미국 특허 제 5,225,180 호(영상화용 Tc-99m 표지 소마토스타틴 유도 펩티드)에는 디설파이드의 환원을 통한 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 두개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드의 Tc-99m 표지 방법이 기술되어 있다. 기타 소마토스타틴 기초 방사선 의학은 미국 특허 제 5,382,654 호(방사선 표지 펩티드 화합물), 유럽 특허출원 제 EP94810008.6 호(킬레트기를 함유하는 소마토스타틴과 그들의 방사선 표지 조성물), 국제 출원 제 PCT/US94/08335 호(소마토스타틴 유도체와 그들의 방사선 표지 생성물)에 기재되어 있다. 일반적으로 소마토스타틴 동족체에 한정시키지 않는 펩티드 방사선 의학적 용도와 이들의 여러가지 실시예는 피슈만 에이제이, 바비크 제이더블유, 스트라우스 에이치더블유: Ticket to Ride; 펩티드 방사선 의학. J Nucl Med. 34:2253-2263, 1993에 기재되어 있다. 금속착물을 형성할 수 있고 비생물학적 활성위치에 펩티드에 직접 혼합되는 아미노산 서열을 이용하여 금속의 킬레이트화 방법은 공개되어 있다(미국 특허 제 5,464,934 호, 생물학적 활성 펩티드내의 공간 화합물로서 금속 킬레이트, 발명자: 던 티제이, 스리비바산 에이, 라일 엘알, 라자그팔판 알).
기타 생물학적 활성 펩티드는 뉴트로필에 결합하는 포르밀 펩티드 화학적 친화물질의 동족체를 포함한다. 이들 펩티드류는 서열 N-포르밀-Met-Leu-Phe를 기초로 한다. 포르밀화된 화학 주성 펩티드의 임상 및 진단 영상 포텐셜은 DTPA에 화학적으로 접합된후 111In로 표지된 화학 주성 펩티드를 사용하여 피슈만 씨등에 의해서 발표되었다(피슈만 에이제이, 파이크 엠씨, 크룬 디, 푸셀로 에이제이, 렉싱거 디, 텐케이트 씨, 윌킨슨 알, 루빈 알에이치와 스트라우스 에이치더블유: 인듐-111-표지 화학 주성 펩티드는 또한 티로신 아미노산을 함유하는 포르밀화된 펩티드를 합성시켜 방사선 요오드화시켰다. 이들 펩티드는 시험관내에 사용되며, 표지되지 않은 포르밀화된 펩티드로서 동일한 생물학적 기능을 가진다(제네크 에이에이치, 마라스코 더블유에이, 반 알텐 피제이와 월터 알비: 뉴트로필에 의해서 세포간처리와 포르밀 펩티드 화학적 친화물질의 결합에 대한 오토라디오그라픽 분석, J Cell Sci 94:155-168, 1989). 최종적으로 화학 주성 펩티드는 또한 니코티닐 히드라진 2 작용기 킬레이트 접근법을 이용하여 99mTc로써 표지된다(바비크 제이더블유, 그라함 더블유, 바로우 에스에이, 드라고테이크스 에스씨, 톰킨스 알지, 루빈 알에이치와 피슈만 에이제이: Tc-99m-표지 화학 주성 펩티드: 토끼의 급성 박테리아 감염부위의 인듐-111-표지 백혈구 세포와의 비교, J Nucl Med 34:2176-2181, 1993).
부착 서열 RGD를 함유하는 펩티드는 항트롬보제로서 활성검사를 받고 있다(이뮤라 와이, 스타센 에이-엠, 던팅 에스, 스토그칸스 에프, 및 콜렌 디: 햄스터 혈소판 페모랄 베인 토롬보시스 모델 내의 L-시스테인, N-(메르캅토아세틸)-D-Tyr-Arg-Gly-Asp-술폭사이드(G4120)의 안티트롬보 성질, Blood 80:1247-1253, 1992). 나이트의 수명(활성화된 혈소판에 모노클로날 항체의 결합영역에 기초한 Tc-99m 합성 펩티드로써 영상화시킨 트롬부스, J Nucl Med 35:282-288, 1994)은 경정맥과 대퇴골 정맥 내의 새로운 트롬비를 영상화시키기 위한 혈소판 글리코(당) 단백질 IIb/IIIa 착물에 결합하는 방사선 금속 결합서열 Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala를 함유하는 99mTc-합성 펩티드-메탈로티오네인 착물의 용도에 대해서 발표하였다. 기타 RGD 함유 서열은 스터틀 에이더블유제이 씨의 미국 특허 제 5,395,609 호(종양 검사용 합성 펩티드)에 개시되어 있다.
DTPA에 결합된 두가지 결합서열을 가진 방사선 표지 펩티드 구조체가 보고되었다. 다이머 111In-DTPA-표지 라미닌 서열을 암의 영상화를 위하여 제조하였다. 여기서 다이머는 DTPA 디안하이드라이드로써 단일 YIGSR을 함유하는 펩티드 서열을 반응시켜 얻는데, 식 DTPA-(GYIGSR-NH2)2로 나타내는 다이머를 얻었다. 예비 연구에서 다이머는 단일 YIGSR 서열을 가진 펩티드보다 효력이 강했다(스완스 디, 에펄리 엠, 브라운 엠엘 씨등: 악성 종양 검사용 In-111 라미닌 펩티드 단편, J Nucl Med 34:231P, 1993 (초록)). 또한 같은 형태의 111In-DTPA에 결합된 멜라노트로핀 동족체의 다이머는 전이 흑종용 영상화제로서 보고되었다(레이트 이피, 바드 디알, 모간 티에스 등, Br J Radiology 65:112-118, 1992; 및 바드 디알, 라이트 이피, 나이트 씨지: BisMSH-DTPA: 강력한 악성 종양용 영상화제, Ann NY Acad Sci 680:451-453, 1993).
펩티드의 구조. 매우 우수한 방법으로 굴절된 펩티드와 단백질 내의 직쇄 아미노산은 독특한 삼차원 구조에 대해 반응할 수 있다. 각 아미노산의 측쇄가 특수 이차 구조를 핵화 시키기 위한 바람직한 성질을 갖는다(초우 피와이와 파스만 지디: 아미노산 서열로 부터 단백질의 제지 구조의 규명, In Advances in Enzymology, Vol. 47 (1987) pp. 45-145, John Wiley & Sons, New York). 입체적 집합체와 고유한 수치료성과 같은 이들의 측쇄의 특성은 나선형, 쉬트형 또는 역회전형과 같은 굴절된 펩티드 사슬에 기인된다. 이들 국지적인 효과에 부가해서 또한 사슬 내의 인접한 아미노산은 물론 떨어진 아미노간의 공유 결합과 비공유 결합 모두 특수 삼차원 구조를 결정, 안정화 및 한방향으로 치우치게 하는데 중요한 역할을 한다. 비공유 결합 상호작용의 예로는 소수성 상호작용(반 데르 발스 힘)과 수소결합을 포함한다. 양전하 측쇄와 음전하 측쇄간의 염가교의 형태에서 정전기적 상호작용은 통상적인것이며 특수한 형태의 펩티드와 단백질을 안정화시킨다. 사슬 내의 두가지 아미노산 사이의 공유결합적 상호작용의 가장 중요한 형태는 분자 내의 특히 적합한 곳을 핵화시키는 두가지 Cys 잔기 사이의 디설파이드 결합을 형성하는 것이다. 이들 상호작용은 협소한 범위(국부 또는 지엽) 또는 광범위(전반적)하게 작용할 수 있다.
단백질과 펩티드를 자연적으로 생성시키는데 있어 적합한 물질을 유도 및 안정화시키는 대부분의 성분들은 우수하거나 좀 약한 특성을 갖는 여러가지 펩티드 동족체를 계획 및 합성하는데 사용된다. 구조적 편향과 한정을 야기시키기 위한 펩티드내의 구조적 변화의 예가 문헌에 논술되어 있다(흐루비 브이제이: 아미노산 측쇄기를 통한 생물학적 활성 펩티드의 제한, Life Sciences 31:189-199, 1981). 구조상 한정시킨 측쇄로서 Nα-메틸 또는 Cα-메틸 아미노산 또는 기타 계획한 아미노산과 같은 개질아미노산의 혼합으로 강력한 국지적인 구조 효과흘 나타낸다. 합성 펩티드에 있어 광범위 또는 전체 구조적 제한은 적당한 아미노산 말단기 또는 측쇄를 고리화시킴으로써 가능하다. 일반적으로 사용되는 고리형의 가교형태는 펩티드 사슬내의 두 개의 Cys 잔기와 관련 티오에스테르와 티오에테르 가교간의 디설파이드 가교 및 아미노산 측쇄 내의 적합한 화학기들 간의 락탐 또는 락톤 가교의 형성이다. 여러가지 생물학적 활성 펩티드의 여러 높은 효력을 가진 동족체는 이들의 유사한 물질을 사용하여 창출된다. 그예로는 소마토스타틴, 오피오이드 펩티드, 멜라노트로핀, 뉴로키닌, 글루카곤 및 ACTH 동족체와 같은 펩티드 호르몬류 등이 있다(흐루비 브제이, 샤르마 에스디, 콜린스 엔, 마쓰나가 티오와 러셀 케씨: 합성 펩티드의 응용, Synthetic Peptides, A User's Guide, Grant GA, editor, W.H. Freedman and Company, 1992, pp. 259-345).
펩티드-금속 이온의 상호작용. 특정 단백질에서와 같이 일정 아미노산 서열 내의 금속 이온의 착물화 반응은 또한 구조적 제한 효과를 나타낸다. 여러가지 DNA 전이 인자들 중의 소위 징크 핑거(Zinc Fingers)라 불리어 지는 특정 구조는 단백질 내의 특수 아미노산 서열로 Zu 이온을 착물화 반응 시킴으로써 얻어진다(발리 비엘과 올드 디에스: 아연 효소의 아연 배위결합, 기능 및 구조와 기타 단백질, 생화학 29:5648-5659, 1990, 아연 결합위치를 갖는 논메탈로티오네인 단백질의 일반 특성이 기술되어 있다. 이와 유사하게 칼모둘린과 관련 단백질을 포함하는 칼슘 결합 단백질 동족체는 칼슘 이온의 착물화를 위하여 영역을 잘 보호한다. 이들 금속 결합 단백질은 금속 이온이 이들에 결합한 후 나타나는 몸체 내에서 독특한 기능 역할을 하게 된다. 착물화 방법은 기능적인 반응이 단백질에 의해서 발휘되는 구조적 특성으로 인하여 전환이 일어나는 것으로 알려저 있다.
가장 흥미로운 것을 수용하는 펩티드-금속 이온의 착물화 반응 영역은 유전자 조절을 매개하는 전이 단백질 내의 특수 아연 결합 영역을 가진 자연 서열인 징크 핑거를 포함한다(로드스 디와 클러그 에이: 징크 핑거. Scientific American 268(2):56-65, 1993). 구조적 제한 및 펩티드 굴곡에 대한 금속 결합 특성에 대한 합성 및 연구가 수행되어 보고딘 징크 핑거는 이들이 이들의 징크 핑거를 결합시키는 전이 단백질과 유사한 수단으로 DNA와 국부 특이 상호작용이 일어날 수 있으므로 생물학적으로 적절하지 않다(크리제크 비에이, 아만 비티, 킬포일 브이제이, 머클 디엘과 버그 제이엠 씨: 교감 징크 핑거 펩티드: 디자인, 고친화성 금속 결합, pH 의존 구조와 His to Cys 서열 변화, J Amer Chem Soc 113:4518-4523, 1991).
합성 펩티드의 삼차 구조내의 금속 이온 유도 교체가 몇몇 모델의 연구에서 나타났다(라이드, 호지스와 공동 연구자, 쇼우 지에스, 호지스 알에스, 사이크스 비디: 칼슘 유도 펩티드 결합: 1H NMR 구조 확인. Science 259:280, 1990; 레이드 알이, 가리피 제이, 사운드 에이케이, 호지스 알에스: J Biol Chem. 256:2742, 1981). 자연 칼슘 결합 단백질에 관련된 펩티드 단편은 칼슘에 결합으로 인한 α-나선형 구조를 나타낸다. 이것은 중앙 펩티드 분절내의 칼슘 이온의 착물화에 의해 유발되는 각 단부에 위치한 두개의 나선형 펩티드 분절의 다이머화(이량체화)에 기인된다. 사사게와 그의 공동 연구자(리버만 엠, 사사끼 티: J Am Chem Soc 113:1470, 1991)는 α-나선 구조를 형성하기 위하여 저급 성질을 가진 펩티드의 일단부에 금속 결합 킬레이트 물질을 부착시켰다. 금속 이온으로 착물화 시킴으로써 3개의 펩티드-킬레이트 분자는 한개의 금속 이온과 착물화되어 나선형 다발을 형성한다. 착물화 금속 이온에 의해 일어나지만 이들 예들에서 존재하는 이차 구조의 삼차원 배열의 형성은 그것에의 전적으로 안정화시키지 못한다. 두개 또는 세개의 나선형 다발을 형성하는데 포함된 나선형 세그멘트는 양자 친화성이다. 이 경우에 착물 금속 이온의 주요 역할은 이들이 양자 친화작용을 통한 상호작용에 의해서 나선형 다발을 안정화시키도록 충분히 이들 양자 친화성 나선형 물질을 근접되게 운반시키는 것이다.
짧은 펩티드 내의 알파 나선형의 안정화는 교환-불활성 루테늄III 착물(가드리 엠알과 페른홀즈 에이케이: 펩티드 아키텍츄어. 신규 교환-불활성 RuIII 착물을 통한 안전한 α-나선형 금속 펩티드의 디자인. J Am Chem Soc 112:9633-9635, 1990) 또는 교환-불안정 Cu, Zn 또는 Cd 착물(가드리 엠알과 최 씨: 펩티드내의 이차 구조핵생성. 나선형 구조를 형성하는 성질을 가진 펩티드로써 천이 금속 이온 안정 α-나선형, J Am Chem Soc 112:1630-1632, 1990). 이들 17 아미노산-긴 펩티드 중에 두개의 His 잔기 또는 Cys와 하나의 His 잔기가 α-나선형에 두개의 연속적인 반전부의 동일 측면에 잔류하는 i 및 I+4 위치에 놓여 있으며 Zn, Cu 또는 Cd와 교환-불안정 착물 또는 cis[Ru(III)(NH3)4(H2O)2]2+와 교환-불활성 착물을 형성하였다. 이렇게 생성된 착물은 고도의 나선형 함유물인 환상디크로이즘 연구에 의해서 나타났다. 이러한 기술에 일반적으로 미국 특허 제 5,200,504 호 내에 포함되어 있으며, 안전한 이차 구조를 가진 금속 펩티드(가디리 엠알 씨의 발명), 가디리 엠알 씨의 미국 특허 제 5, 408,036 호, 분리된 금속 펩티드, 조성물 및 합성 방법, 미국 특허 제 5,410,020 호, 이차 구조를 가진 금속 펩티드의 제조 방법. 펩티드 분자는 금속 킬레이트 위치중의 두개만을 제공한다. 금속 배위자 구형의 기타 원자가는 NH3, H2O, 용매 또는 할로겐화물 원자와 같은 미확인 리간드에 의해서 충족되어 진다. 이 기술중의 다른 특별한 형태는 펩티드 내의 두개의 금속 착물화 위치가 두가지 이상의 아미노산에 의해서 분리된 멀리 떨어진(비접촉) 아미노산에 의해서 제공된다. 또한 이 방법은 3개의 나선형 내에 폴리펩티드의 금속 이온 보조 자체-어셈블리를 도입하기 위하여 사용된다(가디리 엠알, 소어스 씨, 최 씨: 단백질 디자인에 접근된 전환물. 삼중-나선형 다발 단백질 내의 폴리펩티드의 금속 이온 보조 자체 어셈블리, J Am Chem Soc 114:825-831, 1992)와 4개의 나선형 다발(가디리 엠알, 소어스 씨, 최 씨: 신규 루테늄(II)-보조 자체 어셈블리를 통한 인공 4-나선형 다발 메탈로 단백질의 디자인법, J Am Chem Soc 114:4000-4002, 1992). 두가지 경우에 N-단부에 부착된 금속 킬레이트와 α-나선형을 형성 하기 위한 성질로 디자인된 양자 친화성 폴리펩티드는 매우 고도의 나선형 물질로 삼량체 또는 사량체화 되게 하는 금속 이온에 착물화된다. 이렇게 생성된 나선형 다발은 등가 사슬을 구성하는 것이 명백하다. 헤테로형 폴리펩티드와 금속 이온 보조 나선형 다발의 형성은 아직 나타나지 않았다.
펩티드 라이브러리 및 결합 화학. 결합 화학 기술은 신속한 의약 개발용 기구들을 잘 인지하고 있다. 구조적으로 다양한 분자의 거대한 풀을 가진 펩티드 라이브러리와 기타 소분자들은 선도적 세대와 선도적인 낙천 주의자들에 잘 맞는다. 여러가지 분자 종류의 라이브러리는 문헌에 기술되어 있으며 의약 개발을 위해 선별되었다. 이들 분자 종류는 펩티드, 펩토이드, 펩티도미메틱, 올리고뉴클레오타이드, 벤조디아제핀, 기타 소유기 분자의 라이브러리를 포함한다.
구조적으로 다양한 화학적의 라이브러리를 구성하는데 이용되는 여러가지 시도는 화학 합성 및 유전 공학 방법을 포함한다. 화학적 합성 라이브러리는 가용성(용액 내에서 여러가지 화합물의 혼합) 및 고체(고체 표면상에 합성된 화합물)일 수 있다. 유전 공학 기구에 의해서 생성된 라이브러리는 펩티드 분자로 크게 구성되어 있으며, 펩티드 분자가 이들의 생산에 사용되는 벡터 또는 박테리아 파지의 표면에 전개시키거나 부착시킨 센스 내의 고체상 라이브러리와 유사하다.
펩티드 기초 라이브러리의 디자인, 합성, 선별 및 평가에 대한 선행기술은 다음 논문에서 검토되었으며 참고로 여기에 기재된다: 피닐라 씨 등: 가용성 펩티드 결합 라이브러리의 실용에 대한 검토. Biopolymers(Peptide Sci) 37:221-240, 1995; Holmes CP et al: The use of light-directed combinatorial peptide synthesis in epitope mapping. Biopolymers(Peptide Sci) 37:199-211, 1995; and, Moran EJ et al: Novel biopolymers for drug discovery. Biopolymers(Peptide Sci) 37:213-219, 1995.
비펩티드 라이브러리를 포함한 저분자 라이브러리 구성 및 선별에 있어서의 선행 기술은 최근에 Accounts of Chemical Sciences, 29:111-170, 1996에 나타난 “Special Issue on Combinatorial Libraries"에서 광범위하게 검토 되었다. 여기에 적용시킬 수 있는 논문은 다음과 같다: Czarnik AW: Guest Editorial, at 112-113; DeWitt SH et al: Combinatorial organic synthesis using Parke-Davis's DIVERSOMER method, at 114-122; Armstrong RW et al: Multiple-component condensation strategies for combinatorial library synthesis, at 123-131; Ellman JA: Design, synthesis, and evaluation of small molecule libraries, at 132-143; Gordon EM et al: Strategy and tactics in combinatorial organic synthesis. Applications to drug discovery, at 144-154; Still WC: Discovery of sequence selective peptide binding by synthetic receptors using encoded combinatorial libraries, at 155-163; and, Hsieh-Wilson LC et al: Lessons from the immune system: From catalysis to material sciences, at 164-170. Also of note is Thompson LA and Ellman JA: Synthesis and applications of small molecule libraries. Chem Rev 96:555-600, 1996. 상기 논문의 전문을 참고문헌으로 본 명세서에 포함시킨다.
파지 표시 라이브러리. 펩티드(106-108까지의 화학적으로 상이한 펩티드)의 큰 라이브러리의 파지 표시 방법은 현재 잘 확립되어 있다(Scott and Smith: Science 249:386-390, 1990: Devlin et al: Science 249:404-406, 1990; Cwirala et al: Proc Natl Acad Sci USA 87:6378-6382, 1990; and U.S. Patent Nos. 5, 432,018; 5,338,665; and 5,270,170). 이 라이브러리에서 각 펩티드는 박테리아 파지 또는 기타 적당한 벡터의 표면에 표시되어 표적 리셉터에 대한 선별 분석에 사용된다. 생물학계의 고유한 특성 때문에 일반적으로 이들 방법들은 다만 자연 아미노산으로 단순한 직쇄 펩티드 라이브러리의 구성에 국한된다. 또한 이들 방법들은 파지 표시 라이브러리의 구성후에 펩티드내의 화학적 개질에 대하여 더 허용되지 않는다.
고체 파지 결합 라이브러리의 공간 인식 병행 합성. 펩티드 또는 기타 소분자의 라이브러리의 화학적 구성에 대한 여러가지 방법도 역시 잘 확립되어 있다. 그중 한 방법은 고체 표면에 한 화합물의 위치 또는 서브세트가 알려지도록 고체상 또는 고체 표면에 평행하게 화합물의 공간적인 분리 합성 방법이 포함된다. 이러한 첫째 방법은 펩티드 에피토프 맵핑용으로 게이센(Geysen)에 의해 개발되었다(Geysen HM, Meloen Rh, Barteling SJ: Proc Natl Acad Sci USA 81:3998-4002, 1984). 이 방법은 예정된 형태의 다수의 폴리프로필렌 핀 팁에 대한 펩티드의 라이브러리의 여러 세트 또는 서브 세트의 합성을 포함한다. 이들 핀 기초 펩티드의 선별은 웰당 한개의 핀을 침지시켜 수행한다. 그 웰은 다중 웰 적정판내에 분석제와 성분들을 함유한다. 핀의 부하는 다중 생물학적 분석을 수행하는 충분한 100 nM - 50 μM 범위 조정한다. 그러나 이 방법에 의해서 10,000 분자량 보다 더 큰 라이브러리의 어셈블리는 성가신 것이고 시간 낭비이다. 보로 실리케이트 글래스 현미경 슬라이드와 같은 고체 표면상에 펩티드의 합성에 있어 광석판인쇄 기술을 이용한 “광직접 공간 인지 병행 합성”기술 (Fodor SPA et al: Science 251:767-773, 1991)이 예정된 형태내의 100,000보다 큰 공간 분리 화합물을 함유하는 라이브러리를 구성하는 보다 좋은 방법이다. 그러나 간단한 펩티드보다 더 다양한 구조를 가진 라이브러리의 합성은 상이한 광파장을 분열시킬 수 있는 직각 광불안정성 보호기를 개발할 필요가 있다. 이에 더하여 이들 라이브러리를 함유하는 고체 표면은 또한 라이브러리 선별 분석에 있어 결합 친화성에 대한 예정된 효과를 나타내는 것으로 보고 되었다(Cho CY et al: Science 261:1303-1305, 1993; Holmes CP et al: Biopolymers 37:199-211, 1995).
미국 안 아보 소재 워너-램버트 컴파니의 파크-데이비스 의약 연구부의 드위트와 공동 연구자들에 의해서 고안된 DIVERSOMERⓡ 장치는 고체상에서 작은 유기 분자 라이브러리의 편리하고 자동화된 병행 합성법을 제공한다(DeWitt SH et al: Proc Natl Acad Sci USA 90:6909-6913, 1993; U.S. Patent No. 5,324,483; DeWitt SH et al: Acc Chem Res 29:114-122, 1996). 작은 유기 분자 라이브러리의 고체상 합성용 다른 유사한 장치는 마이어스와 그 공동 연구인에 의해서 보고 되었다(Myers HV et al: Molecular Diversity 1:13-20, 1995). 또한 상업용 기구도 현재 입수 가능하다(Advanced Chem Tech Inc, Louisville, KY, USA). 이 기구는 병행 합성에서 96가지 상이한 화합물을 생산할 수 있으며 광범위한 반응 조건, 온도, 혼합시간 및 기타 변수에 적합하다.
풀링 및 분할 합성 방법. 화합물의 큰 라이브러리들은 각 합성 단계에서 반응물의 동일한 몰의 혼합물을 사용한 풀링 방법을 이용하여(Geysen HM et al: Mol Immunol 23:709-715, 1986) 또는 바람직하게는 각 카플링 반응에서 그들의 반응성에 따라 그 혼합물내의 여러가지 반응 물질의 상대 농도를 조절하여 (Ostresh JM et al: Biopolymers 34:1681-1689, 1994; US Patent 5,010,175 to Rytter WJ and Santi DV) 조성된다. 분할 합성 접근은 A. Furka 씨 의해 개척되었는데 (Furka A et al, (1988), 14차 생화학 국제 회의, Vol. 5, 초록 No. FR:013; Furka A et al: Int J Peptide Protein Res 37:487-493, 1991; Sebestyen F et al: BioMed Chem Lett 3: 413-418, 1993), 여기서 화합물의 동일한 몰의 혼합물을 같은 부분의 수지를 분할하여 얻으며 각 성분은 여러가지 단량체 시약의 각 성분과 분리시켜 반응시킨다. 수지를 혼합시켜 다음 카플링 반응을 위하여 처리한 다음 다시 각 시약과 분리 반응을 시키기 위하여 같은 분량으로 분할한다. 올리고머의 필요한 길이와 크기의 라이브러리를 얻는데 필요한 만큼 반복 처리한다. 또한 그 접근방법은 생물분석에서 타구상의 펩티드의 일차 구조를 확인하기 위하여 서열화한 아미노산을 이용한 램씨 등의 “one-bead one-peptide"법을 기초로 한다(Lam KS et al: Nature 354:82-84, 1991; Lam KS et al: Nature 360:768, 1992). 더 효율적인 이들 라이브러리의 분할합성을 성취시키기 위하여 자동화 시스템을 개발하였다(Zukermann RN et al: Peptide Res 5:169-174, 1992; Zukermann RN et al: Int J Peptide Protein Res 40:497-506, 1992). 이들 모든 수지 결합 라이브러리와 함께 경우에 따라 보여지는 일반 가공품은 전체적인 판단을 그르치게 하는 결과를 초래할 수 있는 생물분석물 중의 고체상결합물에 의해서 표적 특이 친화성을 변화시킨다. 이 문제를 극복하는 다른 고도의 성공적인 방법은 가용성 라이브러리의 구성이다(Houghten RA et al: Proc Natl Acad Sci USA 82:5131-5135, 1985; Berg et al: J Am Chem Soc 111:8024-8026, 1989; Dooley CT et al: Science 266:2019-2022, 1994; Blondelle SE: Antimicrob Agents Chemother 38:2280-2286, 1994; Panilla C: Biopolymers 37:221-240, 1995). 이 방법은 모든 불규칙적으로 선택한 아미노산 위치가 한정될 때까지 반복적으로 재합성과 생물분석의 디콘볼류션(deconvolution) 방법을 포함한다. 또한 이 방법에 대한 여러가지 개선점이 제의되었다. 예를들면 직각의 풀을 포함하는 두가지 라이브러리의 공통 합성법(타타르씨외 공동 연구자에 의해서 발표된)은 반복적인 재합성과 평가의 필요성이 없다(Deprez B et al: J Am Chem Soc 117: 5405-5406, 1995). 하우톤씨와 그의 공동 연구자들에 의해 창안된 위치 스캐닝 방법은 반복 재합성을 제거시켰다(Dooley CT et al: Life Sci 52:1509-1517, 1993; Pinilla C et al: Biotechniques 13:901-905, 1992; Pinilla C et al: Drug Dev Res 33:133-145, 1992). 또한 상기 분할 합성 방법과 이 방법을 결합시킨 방법이 제의되었다(Erb E et al: Proc Natl Acad Sci USA, 91:11422-11426, 1994). 가용성 라이브러리 접근법에 있서 주문제점은 고도의 친화성 시스템에 대한 성공적인 적용성을 포함한다. 용액내의 풍부한 각 화합물은 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는 라이브러리 내의 화합물의 전제수에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로 어느 풀내의 고활서의 화합물은 가장 강력한 분자일 수 있다. 라이브러리 내의 어떤 수의 용해도의 결핍은 이 현상에 더 영향을 줄 수 있다. 실재로 여러 라이브러리에 대하여 가장 황성인 펩티드는 가장 활성도가 큰 라이브러리 풀 내에서 확인되지 않았다(Dooley CT et al: Life Sci 52:1509-1517, 1993; Eichler J, in Proc. 23rd Eur. Peptide Symp., Berga, Sept. 1994, Poster 198; Wyatt JR: Proc Natl Acad Sci USA, 91:1360, 1994).
무작위 라이브러리에 정타(positive hit)를 위한 구조 결정에 사용되는 여러가지 방법이 개발 되었다. 고체상 라이브러리에 대한 직접 분석 양식은 펩티드 라이브러리를 위한 에드만 분해, 올리고뉴클레오타이드 라이브러리의 DNA 서열화와 매트릭스 결합 화합물에 대한 여러 질량 스펙트로메트 기술을 포함한다. 라이브러리 조립중 각 합성단계에서 일련의 부분적으로 엔 캡된 화합물을 창출하는 기술은 질량 스펙트로메트에 의해서 명확하게 확인하는데 도움이 된다(Youngquist RS et al: J Am Chem Soc 117:3900-3906, 1995; Youngquist RS et al: Rapid Commun Mass Spectr 8:77-81, 1994). 이 기술은 화학적으로 다양한 라이브러리의 여러가지 변화에 적용시킬 수 있는 것이 용구된다. 또한 입자들의 고체상 매트릭스에 공유 결합된 화합물들의 직접 질량 스펙트로메트 분석은 매트릭스 보조 레이저 방출/이온화(MALDI) 기술을 사용함으로써 가능하다(Siuzadak G et al: Bioorg Med Chem Lett 6:979, 1996: Brown BB et al: Molecular Diversity 1:4-12, 1995). 이들 분석 기술에 더하여 여러가지 코드화 방법이 비펩티드와 비뉴클레오티드 라이브러리를 포함한 유기 분자 기초 라이브러리 내의 구조 설명용으로 창안되었다. 여러가지 코드화 방법은 DNA 코드화, 펩티드 코드화, 할로방향족 택(tag) 코드화, 및 고주파 트랜스폰더에 기초한 코드화를 포함한다.
상기 대부분의 라이브러리는 그들의 구조 및 형상의 다양성 때문에 "무작위(random)" 라이브러리라 불리어진다. 비교적 한정되고 기울어진 구조의 라이브러리들이 또한 보고되었다. 구조적으로 통상적인 형판상에 쌓여진 형상적으로 고정된 화합물들의 라이브러리의 예로는 벤조디아제핀, β-락탐, β-턴 미테틱, 디케토피페라진, 아소퀴놀린, 디히드로- 및 테트라히드로이소퀴놀린, 1,4-디히드로피리딘, 히단토인, 피롤리딘, 티아졸리딘-4-카르볼실산, 4-티아졸리딘 및 관련 메타티아자논 및 이미다졸등이 있다.
소분자의 라이브러리의 여러가지 분류중 펩티드 라이브러리는 자연적으로 생성하는 아미노산을 사용함으로써 제공되는 구조적 다양성, 다양한 디자이너의 아미노산의 결합, 및 고효율성 때문에 가장 다양하게 잔존해 있으며 쉽게 펩티드 합성이 수행될 수 있다. 이에 더하여 펩티드 기초 라이브러리내의 다른 구조적 다양성 수준은 라이브러리의 후합성 개선에 의해서 증가될 수 있다. 이들 개선 방법은 퍼메틸화반응, 아실화반응, 측쇄 관능성의 작용기화, N-말단기의 환원 아미노화반응을 포함한다.
또한 하나의 특수한 생물학적 표적에 대해 특히 적합한 여러 라이브러리들이 보고되었다. 일반적으로 이들 라이브러리들은 표적 특이 반응을 유도하는데 필수적일 수 있는 한 세트의 구조적 성분만을 결합시켜서 조립한다. 이 부류의 보고된 몇몇 라이브러리들은 아스파르산 프로테아제, 아연 프로테아제, 카르본산 안히드라제 억제제, 티로신키나제 억제제, 에스트로겐 리셉터 리간드 및 산화방지제 등이 있다.
발명의 요약
(발명의 개시)
금속-구조체. 본 발명에 따라, 금속 이온과 착물을 형성하는 금속 이온 결합 골격과, 상기 금속 이온 결합 골격과 금속 이온의 착물화에 의해서 구조형태적으로 구속된 생물학적 작용 도메인, 및 임의적으로 금속 이온을 포함하는 금속-구조체를 제공한다. 상기 금속-구조체에서 그 구조체 중의 최소한 일부는 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물화시킴으로써 이차 구조로 구조형태적으로 구속될 수 있다. 임의로, 상기 구조체는 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물화시킴으로써 구조형태적으로 구속된 구형 구조를 가질 수 있다. 일반적으로 생물학적 작용 도메인은 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물화시킴으로써 실질적으로 더 유효하게 된다. 생물학적 작용 도메인은 사이크놀로지칼(sychnological) 또는 레그닐로지칼(rhegnylogical)일 수 있다.
금속 이온 결합 골격은 아미노산으로 구성될 수 있거나, 금속 이온을 착물화시키는 질소, 황 또는 산소 원자를 갖는 것으로 구성될 수 있으며, 금속 결합 킬레이트 구조에 기초할 수 있다. 이들 금속-구조체에서, 금속 이온 결합 골격은 금속 이온의 이용가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 아미노산 내의 질소, 황 또는 산소 원자에 금속 이온을 착화시킴으로써 만족되는 실질적으로 금속 이온의 모든 원자가를 갖는 복수의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서 상기 금속-구조체의 특징은, 금속 이온의 이용가능한 원자가와 착물을 형성하는데 필요한 적어도 하나 이상의 질소, 황 또는 산소 원자를 각각 함유하는 복수의 아미노산을 포함하는 금속 이온 결합 골격에 있다. 또한 금속 이온 결합 골격은 유도된 아미노산 또는 스페이서 서열을 포함할 수도 있는데, 상기 유도 아미노산 또는 스페이서 서열은 금속 이온의 이용가능한 원자가와 착화시킬 수 있는 적어도 하나 이상의 질소, 황 또는 산소 원자를 포함하고, 따라서 금속 이온의 모든 모든 원자가는 금속 이온의 착화에 의해서 충족될 수 있도록 한다.
금속 착물의 생물학적 작용 도메인은 리간드의 한 성분과 리셉터 (receptor)의 한쌍을 형성할 수 있는 리간드를 구성할 수 있다. 그 예로서 일반적으로 리셉터에 대한 리간드의 친화성은, 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성하지 않을 때보다 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성할 때 실질적으로 더 높다.
금속 이온은 이온 형태의 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 망간, 비소, 셀레늄, 테크네튬, 루테늄, 팔라듐, 은, 카드뮴, 인듐, 안티몬, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 수은, 탈륨, 납, 비스무트, 폴로늄 또는 아스타틴 원소일 수 있다.
금속펩티드. 또한 본 발명은, 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 두개 이상의 연속적인 아미노산을 가진 금속 이온 결합 골격과, 상기 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성함으로써 구조형태적으로 구속된 생물학적 작용 도메인을 포함하는, 제조 펩티드 및 약리학적으로 허용되는 염들을 포함한다. 또한 상기 펩티드는 금속 이온을 포함할 수 있으며, 그래서 금속펩티드일 수 있다. 일반적으로 최소한 일부분의 펩티드가 금속 이온과 금속 이온 결합 골격과의 착물을 형성함으로써 이차 구조로 구조적으로 한정시킨다. 펩티드는 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성함으로써 구조형태적으로 구속된 구형 구조를 가질 수 있다. 펩티드의 생물학적 작용 도메인은 대부분의 예에서 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성함으로써 실질적으로 더 유효하게 된다. 또한 상기 펩티드의 특징은, 여러 예에서, 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성함으로써 효소적 분해에 실질적으로 저항한다는 데 있다.
대부분의 응용에서, 금속 이온 결합 골격은 금속 이온의 모든 원자가가 금속 이온과 착물을 형성하여 충족되도록 설계된다. 그 예로서 금속 이온 결합 골격은 금속 이온의 이용가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 적어도 하나의 질소, 황 또는 산소 원자를 각각 포함하는 복수의 아미노산일 수 있다. 만약 금속 이온의 모든 원자가보다 적은 것이 금속 이온 결합 골격 내에 포함되는 아미노산과 금속 이온의 착물을 형성함으로써 충족된다면, 그 금속 이온 결합 골격 또한 금속 이온의 모든 원자가가 금속 이온의 착물화에 의해서 만족되도록 금속 이온의 이용가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 한개 이상의 질소, 황 또는 산소원자를 함유하는 유도된 아미노산 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
펩티드의 생물학적 작용 도메인은 리간드의 한 성분과 리셉터쌍을 형성할 수 있는 리간드일 수 있다. 이러한 경우에 일반적으로 그 리셉터에 대한 리간드의 친화성은 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성하지 않을때 그 리셉터에 대한 친화성 보다 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성할때 실질적으로 더 높다. 어떤 경우에도 생물학적 작용 도메인은 사이크놀로지칼 또는 레그닐로지칼일 수 있다.
펩티드에 착물을 형성하는 금속 이온은 원소들 즉, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 망간, 비소, 셀레늄, 테크네튬, 루테늄, 팔라듐, 은, 카드뮴, 인듐, 안티몬, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 수은, 탈륨, 납, 비스무트, 폴로늄, 아스타틴의 이온형태일 수 있다. 또 금속 이온은 의약적으로 유용한 금속 이온일 수 있다. 이 경우에 금속 이온은 방사선 또는 상자성일 수 있다.
또한 펩티드는 환상(고리) 펩티드 일 수 있으며, 아미드, 디설파이드, 티오에테르, 우레탄, 카르바메이트, 또는 에스테르결합을 통하여 고리화시킬 수 있다. 또한 이러한 고리화는 펩티드의 말단기를 통하여 공유결합, 펩티드내의 두개의 아미노산의 측쇄 관능성을 통한 공유결합, 또는 펩티드의 한개의 말단기와 펩티드내의 어떤 아미노산의 측쇄 관능성을 통한 공유결합일 수 있다.
금속펩티드의 구조. 펩티드와 그의 약리학적으로 허용되는 염들은 금속 이온과 착물을 형성함으로써 이차 구조를 구조적으로 한정시킨다. 이와같이 한정시킨 이차 구조는 리간드의 한 성분과 리셉터쌍을 구성할 수 있다. 이들 펩티드는 다음 일반식을 갖는다:
R1-X-R2
식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 연속 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
X는 금속 이온과의 금속이온과의 착물 형성시, 전체적으로 이차구조를 적어도 일부분 형성하는 특정의 국소적 이차구조를 가지며;
R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하고, 여기서 상기 아미노산은 금속 이온과 X의 착물 형성시 R1이나 R2 중 어느 하나 또는 두가지 모두의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 나머지 부분(balance)을 갖도록 선택되며;
X, R1, 또는 R2의 적어도 일부분을 포함하는 상기 구조형태적으로 구속된 이차 구조는 리간드와 리셉터 쌍의 멤버를 형성할 수 있는 리간드를 포함하고 있다.
또한 상기 구조는 상기 일반식에서와 같이 X와 착물을 형성하는 금속 이온을 포함한다. 금속 이온과의 착물을 형성함으로써 X는 역회전구조인 특정 구역의 이차 구조를 형성할 수 있다.
상기 일반식에서 X는 금속 이온의 가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 최소한 한개의 질소, 황 또는 산소원자를 각각 함유하는 아미노산일 수 있다. 만약 금속 이온의 모든 원자가 보다 적은 것이 X 내에 함유된 아미노산과 금속 이온의 착물 형성에 의해서 충족된다면 X는 유도된 아미노산 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 유도된 아미노산 또는 스페이서 서열은 금속 이온의 모든 원자가가 X와 금속 이온의 착물화에 의해서 충족되도록 금속 이온의 가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 한개 이상의 질소, 황 또는 산소원자를 포함할 수 있다.
또한 펩티드는 다음 일반식의 고리 펩티드일 수 있다:
여기서 R1과 R2는 다함께 공유결합된다. 이 경우에 R1과 R2는 아미드, 디설파이드, 티오에테르, 티오에스테르, 우레탄 또는 에스테르 결합을 통하여 다함께 공유결합시킬 수 있다. R1과 R2간의 공유결합은 R1과 R2의 말단기를 통한 결합, R1과 R2내의 어떤 아미노산의 측쇄 작용기를 통한 결합, R1의 말단기와 R2내의 어떤 아미노산의 측쇄 작용기를 통한 결합 또는 R2의 말단기와 R1내의 어떤 아미노산의 측쇄작용기를 통한 결합일 수 있다.
또한 펩티드는 다음 일반식의 고리 펩티드일 수도 있다.
여기서 R1과 R2는 위에서 정의 한것과 같으며, R3는 1 내지 약 20개의 아미노산으로 구성된다. 이 예로서 R3는 이차 구조를 구조적으로 한정시킨 일부분을 형성할 수 있다.
RGD-리셉터 모사물. 본 발명의 펩티드는 금속 이온과 착물을 형성 할 수 있는 두개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 금속 이온 결합 골격과 트리펩티드 서열 Agr-Gly-Asp에 리셉터에 대해 특이한 생물학적 관능 영역을 함유하는 펩티드와 그의 약리학적으로 허용되는 염을 제조할 수 있는데, 여기서 생물학적 관능 영역은 금속 이온과 금속 이온 결합 골격의 착물 형성에 의해서 구조적으로 한정시킨다. 이 경우에 펩티드는 다음 일반식으로 나타낼 수 있다:
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-R2,
R1-Bbb-Aaa-Ccc-Ddd-R2,
R1-Bbb-Ddd-Ccc-Aaa-R2, 또는
R1-Ddd-Bbb-Ccc-Aaa-R2,
여기서,
Aaa는 양전하의 측쇄를 가진 아미노산과, 금속 이온을 결합시킬 수 있는 질소를 함유하는 아미노산의 L-또는 D-이성질체이고,
Bbb는 한개 이상의 하전되지 않은 측쇄를 가진 아미노산의 L-또는 D-이성질체이며,
Ccc는 황과 질소를 함유하거나 금속 이온을 결합시킬 수 있는 두개의 질소를 함유하는 아미노산의 L-또는 D-이성질체이고,
Ddd는 α-카르복실기를 가진 중성 아미노산 또는 측쇄내에 음전하 작용기를 가진 아미노산의 L-또는 D-이성질체이다.
R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 또는 카르보닐기에 직접 또는 그를 통하여 부착된 폴리머이다.
R2는 Ddd가 유리 α-카르복실기를 가진 중성 아미노산이면 아미드, 치환아미드 또는 에스테르이다.
Ddd는 Gly, Ala, β-Ala, N-Me-β-Ala, 또는 β-Ala의 더큰 동족체일 수 있다.
상기 일반식의 펩티드의 대표적인 예는 다음과 같다:
Arg-Gly-Cys-β-Ala,
D-Arg-Gly-Cys-β-Ala,
Arg-Gly-D-Cys-β-Ala,
D-Agr-Gly-D-Cys-β-Ala,
D-Lys-Gly-Cys-β-Ala,
D-Lys-Gly-Cys-Gly,
Gly-Arg-Cys-β-Ala,
Gly-D-Arg-Cys-β-Ala,
Gly-Arg-D-Cys-β-Ala,
Gly-D-Arg-D-Cys-β-Ala,
D-Arg-D-Phe-D-Cys-β-Ala,
C6H5-CH2-CO-D-ARG-Gly-D-Cys-β-Ala, 및
Phe-Arg-D-Cys-β-Ala.
또한 트리펩티드 서열 Arg-Gly-Asp에 대한 리셉터에 특이한 구조적으로 제한시킨 생물학적 작용 도메인을 가진 다음과 같은 펩티드(그러나 상기 일반식의 것일 필요는 없다)를 구성하는 것이 가능하다:
D-Arg-Gly-D-Cys,
Arg-Gly-D-Cys,
HOOC-(CH2)2-CO-Phe-Gly-Cys-Arg,
HOOC-(CH2)4-CO-Gly-Lys-Cys, 및
HOOC-(CH2)5-CO-Gly-Lys-Cys.
이들 펩티드는 감마선 방출 금속 이온과 착물을 형성하는 금속 이온 결합 골격을 가질 수 있으며, 혈전증, 암, 염증부위, 또는 아테롬성 동맥 경화증 반점의 영상화용으로 사용될 수 있다. 또한 이들 펩티드는 비방사선 금속 이온과 착물을 형성하는 금속 이온 결합 골격을 가질수 있으며, 심근경색, 혈전증, 레스티노시스, 골흡수증 또는 전이암에 대한 치료제로서 사용될 수 있다.
터프트신(Tuftsin) 모사물. 본 발명의 펩티드는 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 두개 이상의 연속 아미노산을 포함한 금속 이온 결합 골격과 터프트신 리셉터에 특이한 생물학적 작용 도메인을 함유하는 펩티드와 그의 약리학적으로 허용되는 염들을 제조할 수 있다. 여기서 생물학적 작용 도메인은 금속 이온과 금속 이온 결합 골격과의 착물 형성 의하여 구조적으로 제한시킬 수 있다. 펩티드는 다음 일반식을 갖는 것일 수 있다.:
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-Eee-R2
여기서,
Aaa는 중성 또는 친수성 측쇄를 가진 아미노산의 L-또는 D-이성질체이며,
Bbb는 금속 이온을 결합시킬 수 있는 질소를 함유하는 양전하 측쇄를 가진 아미노산 L-또는 D-이성질체이고,
Ccc는 금속 이온을 결합시킬 수 있는 질소를 함유하고 하전되지 않은 측쇄를 가진 아미노산의 L-또는 D-이성질체이며,
Ddd는 금속 이온을 결합시킬 수 있는 황, 황과 질소, 또는 두개의 질소를 함유하는 아미노산의 L-또는 D-이성질체이고,
Eee는 양전하 측쇄를 가진 아미노산의 L-또는 D-이성질체이다.
R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 알킬옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 또는 카르보닐기에 직접 그를 통하여 부착된 폴리머이며, Aaa가 탈아미노 아미노산이 아니한 이 경우에 R1이 존재하지 않는다.
R2는 아미드 치환 아미드, 에스테르 또는 Eee가 탈카르복실 아미노산(이경우에 R2가 존재하지 않음)이 아니한 폴리머이다.
Aaa는 Thr, Cys, Pen, Pro, Ser 또는 해당 탈아미노 유도체일 수 있다. 대표적인 펩티드는 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg, Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg 및 Pro-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 포함한다.
금속 이온 결합 골격은 감마 방출 금속 이온과 착물을 형성할 수 있고 펩티드는 감염 또는 염증의 부위를 영상화하는 진단용으로 사용된다. 또한 펩티드는 면역 촉진제로 사용될 수 있으며 이예로는 방사선 물질이 아닌 금속 이온과 착물을 형성할 수 있다.
고리펩티드. 본 발명은 또한 디설파이드, 티오에테르, 락탐 또는 락톤 브리지의 등량 치환을 위한 금속 이온 결합 골격을 가진 고리펩티드와 그의 약리학적으로 허용되는 염들을 포함하며, 고리펩티드는 다음의 일반식을 갖는다:
여기서, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 X와 금속 이온의 착물화에 의하여 충족되도록 복수개의 아미노산으로 구성되는 금속 이온을 착물화시키기 위한 착물화 골격이다. 여기서 R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산으로 구성된다.여기서 R3는 1 내지 약 20개의 아미노산으로 구성된다.
Aaa와 Bbb는 각각 디설파이드, 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 우레탄 또는 에스테르 결합을 통하여 X에 연결된 아미노산으로 구성된다.
또한 펩티드는 X에 착물화된 금속 이온을 포함한다. X는 이들 고리 펩티드 내에 금속 이온의 가능한 원자가와 착물화 될 수 있는 한개 이상의 질소, 황 또는 산소를 함유하는 아미노산을 포함한다. 만약 금속 이온의 모든 원자가가 보다 적은 것이 X로 구성되는 아미노산과 금속 이온의 착물화에 의해서 총족된다면 그때 X는 유도된 아미노산 또는 스페이서 서열을 포함할 수도 있다. 여기서 유도된 아미노산 또는 스페이서 서열은 금속 이온의 모든 원자가가 X와 금속 이온의 착물화에 의하여 충족되도록 금속 이온의 가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 한개 이상의 질소, 황 또는 산소원자로 구성된다.
X는 다음의 아미노산 서열을 갖는다:
Ccc-Ddd-Eee 또는 Eee-Ddd-Ccc,
여기서 Ccc와 Ddd의 각각은 하전되지 않은 측쇄를 가진 아미노산 또는 디펩티드이다.
여기서 Eee는 Cys, HomoCys, Pen, 또는 His의 L-또는 D-이성질체이다.
Aaa는 측쇄에 카르복실기 또는 아민기를 갖는 아미노산의 L-또는 D-이성질체이다. Bbb는 카르복실기 또는 아미노기를 가진 측쇄를 가진 아미노산의 L-또는 D-이성질체이며, 이때 만약 Bbb가 카르복실기를 가진 측쇄라면 Aaa는 아미노기를 가진 측쇄를 갖고, 만약 Bbb가 아미노기를 가진 측쇄를 갖는다면 Aaa는 카르복실기를 갖는 측쇄를 갖는다.
상기 일반식의 고리펩티드는 다음 일반식의 소마토스타틴 동족체를 포함한다:
여기서 X는 Gly-Gly-Gly-Cys, Gly-Gly-Cys, Gly-Gly-Gly-His, 또는 Gly-Gly-His의 L-또는 D-이성질체를 함유한다.
또한 상기 일반식의 고리펩티드는 다음 일반식의 멜라노트로핀 동족체들을 포함한다:
또는
여기서 X는 Gly-Gly-Gly-Cys, Gly-Gly-Cys, Gly-Gly-Gly-His, 또는 Gly-Gly-His의 L-또는 D-이성질체를 함유한다.
제조방법. 본 발명은 금속 이온과 착물을 형성함으로써 얻어진 구조적으로 한정시킨 이차 구조를 가진 펩티드와 약리학적으로 허용되는 그의 염의 제조방법을 포함하며, 그 제조방법을 포함하며, 그 제조방법은
a) 다음의 일반식을 가진 펩티드를 제공하는 단계와,
R1-X-R2
식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 연속 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
X는 금속 이온과의 금속이온과의 착물 형성시, 전체적으로 이차구조를 적어도 일부분 형성하는 특정의 국소적 이차구조를 가지며;
R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하고, 여기서 상기 아미노산은 금속 이온과 X의 착물 형성시 R1이나 R2 중 어느 하나 또는 두가지 모두의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 나머지 부분(balance)을 갖도록 선택됨;
b) 금속 이온을 상기 펩티드에 착물화시키는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 리간드의 한 성분과 리셉터 쌍을 형성할 수 있는 리간드의 최소한 일부를 형성하도록 구조적으로 한정시킨 이차 구조를 포함하는 다음의 단계로 구성되는 펩티드 또는 약리학적으로 허용되는 그의 염들의 제조방법을 포함한다:
a) 다음 일반식의 펩티드를 제공하는 단계:
R1-X-R2
식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 연속 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
X는 금속 이온과의 금속이온과의 착물 형성시, 전체적으로 이차구조를 적어도 일부분 형성하는 특정의 국소적 이차구조를 가지며;
R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하고, 여기서 상기 아미노산은 금속 이온과 X의 착물 형성시 R1이나 R2 중 어느 하나 또는 두가지 모두의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 나머지 부분(balance)을 갖도록 선택됨;
X, R1, 또는 R2의 적어도 일부분을 포함하는 상기 구조형태적으로 구속된 이차 구조는 리간드와 리셉터 쌍의 멤버를 형성할 수 있는 리간드를 포함하고 있음;
b) 펩티드에 금속 이온을 착물화시키는 단계,
금속 이온이 X에 특정 영역의 이차 구조를 형성하도록 함으로써 펩티드가 리간드의 한 성분과 리셉터 쌍을 형성할 수 있는 리간드로 구성되는 구조적으로 한정시킨 이차 구조로서 배열되게 한다. 그 리셉터를 위한 리간드의 최소한 일부를 형성하는, 구조적으로 한정시킨 이차 구조의 친화성은 일반적으로 금속 이온을 가진 전체적인 이차 구조내에 구조적으로 한정시키지 않은 펩티드의 친화성 보다 실질적으로 더 높을 것이다.
또한 본 발명은 다음의 단계들로 구성되는 생물학적 작용 도메인을 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 약리학적으로 허용되는 그의 염들의 제조방법을 포함한다:
a) 복수개의 아미노산으로 구성되는 금속 이온을 착물화시키기 위하여 착물화 골격을 제공하는 단계, 여기서 아미노산은 착물화 골격과 금속 이온의 착물화에 의해서 실질적으로 금속 이온의 모든 원자가가 충족되도록 선택되며, 착물화 골격은 금속 이온과 착물화 골격의 착물화에 의해서 최소한 일부의 생물학적 작용 도메인과 같은 범위내이며,
b) 착물화 골격의 양단에 결합된 0 내지 약 20개의 아미노산을 제공하는 단계, 여기서 아미노산은 금속 이온과 착물화 골격을 착물화시킴으로써 잔존 생물학적 작용 도메인으로 구성되며,
c) 금속 이온으로 착물화 골격에 착물을 형성하게 하는 단계.
이 방법에서 아미노산의 착물화 골격을 형성하는 아미노산의 최소한 몇 개는 착물화 골겨을 금속 이온으로 착물화시킴으로써 생물학적 작용 도메인의 최소한 일부로써 착물화 골격의 동족성을 증가시키도록 개량된 측쇄를 포함할 수 있다.
착물화 골격을 금속 이온으로 착물화 시킴으로써, 착물화 골격은 특정 영역의 이차 구조를 형성할 수 있다. 이 경우에 특정 영역의 이차 구조가 펩티드에 구조적으로 한정시킨 이차 구조로 배열되도록 하게 할 수 있다.
약리학적 응용. 본 발명에 포함된 것은 금속 이온 결합 골격과 결정된 생물학적 작용 도메인을 함유한 펩티드와 금속 이온을 포함하는 펩티드 기초 약리학적 조성물이며, 여기서 생물학적 작용 도메인은 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물화 시킴으로써 구조적으로 한정된다. 이러한 약리학적 제제에서 최소한 일부의 펩티드는 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물화 시킴으로써 이차 구조에 있어 구조적으로 한정시킬 수 있다. 또한 생물학적 작용 도메인은 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물이 형성될때 까지 실질적으로 불활성이다.
금속 펩티드라이브러리. 또한 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 금속 펩티드의 라이브러리로 부터 필요한 표적 성질을 가진 금속 펩티드를 얻는 방법을 포함한다:
a) 후보 펩티드의 혼합물에 제공하는 단계,
여기서 각 펩티드는 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 두개 이상의 연속 아미노산을 가진 금속 이온 결합 골격을 포함하며, 금속 이온 결합 골격은 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물화 시킴으로써 구조적으로 한정시키고, 각 펩티드는 특별하고 유일하며 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 이 혼합물 내의 각 펩티드의 존재가 미리 결정되며,
b) 펩티드의 금속 이온 결합 골격을 금속 이온으로 착물을 형성하는 단계와,
c) 요구되는 표적 특성을 가진 금속 펩티드가 바람직하게 결합하는 물질에 후보 금속 펩티드의 혼합물을 노출시킴으로써 필요한 표적 특성을 가진 금속 펩티드를 후보 금속 펩티드의 혼합물 중에서 선택하는 단계.
금속 펩티드라이브러리에 관련된 기타 방법에서 요망되는 성질을 가진 금속 펩티드는 바이오어에시, 생화적 분석, 약리학적 분석, 물리화학적 분석 또는 유사한 분석을 이용하여 통상적으로 선택할 수 있다. 이러한 분석법은 금속 펩티드가 요망되는 성질을 갖는 것을 직접 또는 간접적으로 결정할 수 있거나, 또는 필요한 성질에 관련된 어떤 매개 변수를 결정할 수 있다.
이 방법에는 또한 요구되 표적 특성을 가진 선택된 후보 금속 펩티드를 분리시키는 것을 포함시킬 수 있다. 필요하다면 가용성 라이브러리에 대한 예로서 본 기술분유에 공지된 여러가지 방법을 이용하여 필요한 특성을 가진 금속 펩티드의 아미노산 조성 또는 구조를 결정할 수 있다. 후보 펩티드의 혼합물을 특정 펩티드의 한가지만이 각 수지의 특이성에 결합되는 고체상수지에 결합시킬 수 있거나 용액 중에서 수행할 수 있다.
요망되는 표적 특성을 가진 금속 펩티드를 얻는 기타 방법은 다음의 단계를 포한다:
a) 각 아미노산이 금속 이온과 착물을 형성할 수 있고 또한 금속 이온 결합 골격이 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성하여 구조적으로 한정시킨 금속 이온 결합 골격의 최소한 일부분을 구성하는 2, 3 또는 4개의 연속 아미노산의 공지의 결합물들을 제공하는 단계,
b) 특수하고, 유일하고 상이한 아미노산 서열을 (각 서열은 한개 이상의 아미노산으로 구성된다) 상기 혼합물 내에 각 펩티드의 존재를 결정하는, 금속 이온 결합 골격을 구성하는 아미노산에 첨가시키는 단계,
c) 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성하는 단계와
d) 필요한 표적 특성을 가진 금속 펩티드가 선택적으로 결합되는 물질에 후보 금속 펩티드의 혼합물을 노출시킴으로써 요구되는 표적 특성을 가진 금속 펩티드를 후보 금속 펩티드의 혼합물 중에서 선택하는 단계.
추가로 상기 방법은 필요한 표적 성질을 가진 선택된 후보 금속 펩티드를 분리시키는 방법을 포함한다. 후보 펩티드의 혼합물은 특정 펩티드 한가지 만이 각 수지의 특이성에 결합되는 고체상수지에 결합시킬 수 있거나 용액중에서 수행할 수 있다.
금속 이온 결합 골격을 구성하는 연속 아미노산은 각각 금속 이온의 가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 한개 이상의 질소, 황 또는 산소원자를 함유할 수 있다.
요구되는 생물학적 작용 도메인을 가진 금속 펩티드를 얻는 방법은 다음의 단계들로 이루어진다:
a) 각 아미노산이 금속 이온과 착물을 형성할 수 있고, 또한 금속 이온 결합 골격이 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성함으로써 구조적으로 한정시킨 금속 이온 결합 골격의 최소한 일부분을 구성하는 2, 3 또는 4개의 연속 아미노산의 공지의 결합물들을 제공하는 단계,
b) 특수하고, 유일하고, 상이한 아미노산 서열(가 서열은 한개 이상의 아미노산으로 구성됨)을 상기 혼합물 내에 각 펩티드의 존재를 결정하는, 금속 이온 결합 골격을 구성하는 아미노산에 첨가시키는 단계,
c) 금속 이온 결합 골격을 금속 이온과 착물을 형성하는 단계와
d) 요구되는 생물학적 작용 도메인을 가진 펩티드가 선택적으로 결합되어 있는 물질에 후보 금속 펩티드의 혼합물을 노출시켜 필요한 생물학적 작용 도메인을 가진 금속 펩티드를 후보 금속 펩티드의 혼합물 중에서 선택하는 단계.
상기 방법은 요구되는 생물학적 작용 도메인을 가진 선택된 후보 금속 펩티드를 분리시키는 방법을 추가로 포함한다. 후보 펩티드의 혼합물을 특정 펩티드의 한가지 만을 각 수지 특서에 결합시키는 고체상 수지에 결합시킬 수 있거나, 용액중에서 수행할 수 있다.
금속 이온 결합 골격을 구성하는 연속 아미노산은 각각 금속 이온의 가능한 원자가와 착물을 형성할 수 있는 한개 이상의 질소, 황 또는 산소원자를 함유할 수 있다.
본 발명의 목적. 본 발명의 목적은 얻어진 착물 내의 측쇄의 분포상태가 공지의 생물학적 리셉터에 결합하는 생물학적으로 활성인 삼차원 구조이므로 요구되는 금속 이온에 그의 서열을 착물화시켜 펩티드, 펩토이드, 관련 슈도펩티드, 펩티도미메틱 및 금속 구조체 중에서 매우 특수하게 구조적으로 제한을 가하여 사용하는 것을 창안, 설명 및 예시하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 금속 이온 착물 분자들 만이 생물학적으로 라디오이메징, 방사선 치료, 양전자 방출 분포상태(PET) 등에 유효하도록 운반체 없는 상태의 방사선 라벨을 부착한 분자를 얻기 위하여 이 접근을 이용하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 펩티드 내의 디설파이드, 락탐 또는 락톤 브리지로 치환시키는 특정 수단으로 금속 이온을 각각 착물화시킬 수 있는 일련의 분자 부분을 설계함으로써 금속 이온과의 착물화에 의해서 펩티드 관련 분절내에 구조적으로 제한을 가하는 방법을 제공하는 것이다. 금속 이온 착물 분자내에 있는 생물학적 작용 도메인의 측쇄의 분포 상태는 해당 디설파이드-, 락탐- 또는 락톤 함유 펩티드 동속물의 그것과 유사하다.
본 발명의 다른 목적은 고도의 안정을 갖고 금속 이온에 착물을 형성하지 않는 펩티드 또는 공지의 펩티드 보다 단백질 분해시키기가 쉽지 않는 펩티-금속 이온 착물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비착물 펩티드 동족체가 불활성이거나 낮은 효능을 나타내지만 방사선 금속 이온을 포함한 금속 이온과의 착물화에 의해서 고효능과 부수적인 구조적 제한을 가하도록, 만약 금속 이온과 착물을 형성하지 않는다면 구조적 제한이 부족한 펩티드 동족체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 자연 생성 펩티드 또는 단백질 내에서 일반적으로 발견되는 베타 회전 및 감마 회전과 같은 역회전구조에 대한 대용물로서 구조적으로 한정시킨 펩티드-금속 이온 착물을 제공하여 반데르발스 상호작용과 수소결합과 같은 더 약한 상호작용에서 만이 안정화되는 자연 생성 굴곡구조 보다 금속 이온 착물화 결과로서 형성된 굴곡구조가 더 안정성이 있게 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 금속 결합 위이에 펩티드 구조가 금속 착물화에 의해서 적당하게 고정되도록 펩티드 내에 특정 지역의 구조적 제한을 가하기 위하여 펩티드 내에 금속 착물 형성을 이용하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 순차적으로 아미노산 잔기를 포함하는 서열에 금속 이온을 착물화 시킴으로써 지역 구조적 제한이 펩티드의 말단부에 구조적 제한을 가하도록 펩티드 내의 특수한 전체 구조적 제한을 가하기 위하여 펩티드 내에 금속 이온의 착물화를 적용시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 디설파이드, 락탐 또는 유사한 기를 통하여 펩티드를 고리화시킴으로써 얻어질 수 있는 구조적 제한을 가하기 위하여 펩티드를 굴곡시키고 구조적으로 제한을 가하도록 직쇄 펩티드 내에 금속 이온 착물화를 적용시키는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 생체 내의 생물학적 배열 윤곽, 생체로부터 제거 속도 및 형태, 생물학적 이용성 및 포유류 내의 약리역학을 변경시키도록 펩티드를 금속 이온과 착물화시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 질병의 치료용과 같은 특수 생물학적 활성을 갖는 생물학적 작용 도메인을 가진 안정된 비방사선 금속 이온을 이용한 펩티드-금속 이온 착물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 금속 이온과의 착물화에 의해서 혈전증 영상화, 신장 손상의 영상화, 종양장해의 영상화 및 치료 및 심근경색의 영상화 및 치료를 포함한 진단 및 치료요법에 사용되는 리셉터의 한가지 이상의 RGD-결함 인테그린 패밀리인 생물학적 작용 도메인을 포함하는 분자를 설계 및 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 금속 이온과 착물화에 의하여 터프트신 리셉터에 특이적이고 다형핵 과립구, 단핵세포와 식작용을 향한 대식 세포를 자극시키고 농양과 감염의 영상화를 위한 진단 요법에 사용될 수 있는 생물학적 작용 도메인을 포함하는 분자를 설계 및 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 다핵 과립구와 대식세포에 터프트신 리셉터를 가진 펩티드-금속 이온 착물을 제공하는 것이며, 이 착물의 존재는 이러한 다핵과립구와 대식세포에 존재하는 항원의 항원 프로파일을 증대시켜 더 큰 역가의 항체를 생산하게 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특정 금속 이온-착물화 부분에 금속 이온을 착물화시킨 후 리셉터 결합 영역의 분포상태가 고정되고 본래 디설파이드 함유, 소마토스타틴 분자 내의 것과 유사하도록 상기 착물화 부분으로 소마토스타틴 내의 디설파이드 결합을 치환시키는 소마토스타틴 동족체를 설계 및 개발하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 금속 이온을 착물화시킨 후에 만이 상기 분자가 효력을 갖고 지정된 리셉터에 결합하도록 특정 금속 이온 결합 부분에 의해서 고리 락 탐 브리지를 함유하는 유효한 멜라노트로핀 동족체 내에 락탐 브리지를 치환시키는 것이다.
본 발명 다른 목적은 리간드가 금속 이온으로 착물화된 후에 만이 에스트로겐 리셉터를 결합시키도록 새로운 설계에 의해서 에스트로겐 리셉터를 위한 펩티드-금속 이온 리간드를 개발하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생성된 펩티드-금속 이온 착물은 착물화 되지 않은 펩티드 분자 보다 조직 표적에 대한 친화성과 특이성이 더 높도록 전신의 영상화 및 방사선 치료에 사용되는 방사선 금속 이온으로 펩티드를 착물화 시키는 것이다. 그러므로 이와 같이 얻은 방사선 표지 종류는 생물학적 표적 인식의 견지에서 운반체가 없는 것이 필수적이다.
본 발명의 다른 목적은 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있고 그때 뇌의 증상을 치료 또는 진단하는데 사용할 수 있는 펩티드 금속 이온 착물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 펩티드가 특정 구조적 제한물이 펩티드를 금속 이온으로 표지 함으로써 얻어지는 금속 이온 결합 영역을 포함하는 펩티드-금속 이온 착물의 결합 및 펩티드 라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 금속 펩티드가 특정 구조의 제한물 펩티드를 금속 이온으로 표지함으로써 얻어지는 금속 이온 결합 영역을 포함하고 이 금속 펩티드는 특수하고 유일하며 상이한 아미노산 서열을 추가로 포함하는 금속 펩티드라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 금속 펩티드가 필요한 표적 특성을 가진 금속 펩티드를 바람직하게 결합시켜 물질에 노출될 수 있고 금속 펩티드가 금속 이온 결합 영역을 포함하고 알려진 그러나 특수하고 유일하며 상이한 아미노산 서열을 포함하는 금속 펩티드라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 금속 펩티드가 금속 이온 결합 영역을 포함하고 알려저 있으며 그러나 특수하고 유일하며 상이한 아미노산 서열을 포함하며 그 금속 펩티드는 생물학적 작용 도메인을 가진 금속 펩티드가 선택적으로 결합되는 물질에 노출될 수 있는 금속 펩티드라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 금속 펩티드가 가용성이거나 고체상 라이브러리일 수 있는 금속 이온 결합 영역을 포함하는 금속 이온 결합 펩티드 라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 금속 이온과의 착물 형성에 의하여 고도의 구조적 제한을 받고 펩티드-금속 이온 착물에 대해 공개된 방법에 적용시킬 수 있는 비펩티드 금속-구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 기타 목적, 이점 및 신규성 및 추가적인 응용 범위는 다음의 상세한 설명에서 기술되며 후속시험에 의해서 본 기술분야의 숙련자들에 의해서 명백해 질 것이며 또는 본 발명을 실시함으로써 알 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 청구범위에 특히 명시된 수단과 결합에 의해서 실현 및 성취될 수 있을 것이다.
펩티드 금속 이온 복합체는 본 발명의 방법을 이용하여, 금속 이온과의 결합을 위하여 개별적으로 배위 결합 부위를 제공하는데 필요한 그 작용기들을 에워싸는 하나의 펩티드 고리를 선택함으로써 설계된다. 이 펩티드 금속 이온 결합물의 특정한 입체 화학적 특징은 결합 금속 이온의 배위 결합 영역의 입체 화학에 기인한다. 그러므로 결합되는 금속 이온의 배위 결합의 한정된 결합 구조는 펩티드 골격에 가해진 형태적 제한의 범위와 성질을 설명한다.
금속 이온의 착물화가 펩티드 사슬에서 특정한 구조형태적 선호도를 응집시키고 이러한 접근이 이미 존재하는 이차 구조 영역으로부터 삼차 구조를 형성시키는 것으로 알려져 있으며, 주어진 생물학적 수용기와 관련이 있는 우선적 이차 구조를 유도하도록 형태적 제한을 가하는 금속 합성을 이용은 지금까지 알려지지 않았다. 더 짧은 펩티드는 일반적으로 우선되는 용해 형태(solution conformation) 를 보이지 않고, 일반적으로 중요한 부분 유용성(flexibility)에 의하여 특징지어지므로 이러한 접근은 상당한 이점을 제공해준다. 생물 수용기와 결합하는 서열을 포함한 짧은 펩티드와 같은 이차 구조가 중요성을 지닌 펩티드의 경우, 화학적 변형의 몇몇 형태가 형태적 유용성을 감소시키는데 필요하다.
정의. 명세서와 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 용어들은 아래와 같이 정의된다.
명세서와 청구범위에 걸쳐 사용된 "결합하다", "결합", "표지", "표지하기", "착물화", "착물"이라는 용어는 일반적으로 모든 유형의 물리적 화학적 결합, 반응, 복합, 유착, 킬레이트와 같은 것을 포함한다.
본 발명의 펩티드는:
a) 자연 생성되는 것
b) 화학적 합성에 의하여 제조되는 것
c) DNA 재조합 기술에 의하여 제조되는 것
d) 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 무사분열에 의하여 생성되는 것
e) 상기 a 내지 d에 기재된 방법을 조합한 방법에 의하여 제조되는 것
f) 기타 펩티드 제조 방법에 의하여 제조된 것
선호되는 제조 방법인 화학적 합성을 이용하는 경우, 사슬을 따라서는 자연적으로 생성되지 않는 다양한 아미노산을 만들어 낼 수 있고, N- 또는 C-말단을 변형할 수 있으므로, 수명이 긴 펩티드를 제공하며, 안정성과 배합물, 프로테아제 분해에 대한 저항성과 같은 것을 향상시킬 수 있다.
명세서와 청구범위에서 사용된 "펩티드"라는 용어는 아미노산 유도체를 포함하여 둘 이상의 아미노산으로 구성된 구조를 포함한다. 대개, 본 발명의 펩티드는 100개 미만의 아미노산을 포함하고, 더 바람직하게는 세 개 미만의 아미노산을 , 가장 바람직하게는 2개에서 20개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 전체 또는 일부를 구성하는 아미노산은 자연 생성된 아미노산, 번역후 조절된 아미노산, 효소에 의해 변형된 아미노산, 아미노산을 모조하기 위하여 설계된 구성 또는 구조와 같은 것들이며, "펩티드"라는 용어는 슈도 펩티드와 펩티드미메틱을 포함한다. "펩티드"라는 용어는 펩티드 2분자체 또는 다중결합체를 포함한다. "제조된"펩티드는 일반적으로 화학 합성, DNA 재조합 기술, 큰 분자의 생화학적 또는 화학적 무사분열 또는 기타 다른 방법으로 제조된 펩티드를 포함한다.
본 발명에 사용된, 그리고 명세서와 청구범위에서 사용된 "아미노산"은 알려진 자연 생성되는 프로틴 아미노산을 포함하며, 흔히 세자로 된 약어나 한 자로 된 약어로 표시된다(Synthetic Peptides: A User's Guide, GA Grant, editor, W.H. Freeman & Co., New York, 1992 참조). 상기 참고문헌의 11쪽 내지 24쪽의 내용과 표를 본 발명에서 종래 기술로 인용하였다. "아미노산"이라는 용어는 이성질체와 자연 생성된 프로틴 아미노산의 변형, 비단백 (non-protein) 아미노산, 번역후 조절된 아미노산, 효소 합성된 아미노산, 유도된 아미노산, 아미노산을 모방하도록 설계된 구성과 구조와 같은 것들을 포함한다. 변형되거나 별종의 아미노산은 일반적으로 상기한 Synthetic Peptides: A User's Guide ; hruby VJ, Al-obeidi F, Kazmierski W : 수용자 선택적 펩티드 배위자의 분자 설계에 있어서의 새로운 접근 방법; 구조배열적, 형태상의 국소 해부적, 역동적 고찰. Biochem J 268;249-262, 1990; Tonio C: 짧은 범위의 주기화를 통하여 형태적으로 한정된 펩티드. Int J Peptide Protein Res 35:287-300, 1990; 상기 선행 기술들은 종래기술로서 본 발명에 인용되었다. 단일 아미노산은 본 발명에서는 때때로 "잔기"이라 나타내었다.
본 발명의 펩티드 복합물은 금속 이온도 포함하며, 금속 이온이 사용된 예로서는 진단 또는 치료에 있어서, 의료상 유용한 금속 이온을 들 수 있다. 금속 이온은 반드시 그러한 것은 아니나, 방사선이 있고, 상자성이거나, 초상자성일 수 있다. 금속 이온은 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 망간, 비소, 셀레늄, 테크네튬, 루테늄, 팔라듐, 은, 카드뮴, 인듐, 안티몬, 레듐, 오스듐, 이리듐, 백금, 금, 수은, 탈륨, 납, 비스머스, 폴로늄, 아스타틴 원자의 이온형도 가능하다. 금속 이온은 이듐, 금 , 은, 수은, 테크네튬, 레늄, 주석, 아스타틴, 구리의 이온 방사성 핵종이어도 된다.
방사선을 지닌 의학적으로 유용한 금속 이온은 감마선, 베타 미립자, 전자와 충돌하면 감마선으로 변하는 양전자를 발생시킨다. 의학적으로 유용한 이온은 감마 신티그램법, 특정한 광자 방사 컴퓨터 단층촬영이나 양전자 방사 단층 촬영을 포함한 진단 영상 촬영에도 사용될 수 있다. 의학적으로 유용한 금속 이온은 자기 공명 영상에도 진단을 위하여 사용될 수 있다. 의학적으로 유용한 금 속 이온은 치료 목적으로도 사용될 수 있다.
의학적으로 유용한 금속 이온의 유형은 의학적으로 어떻게 응용하느냐에 따라 달라진다. 특히 융용한 금속 이온에는 원소번호 25-30의 원소 (Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn), 33-34(As, Se), 42-50(Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn)과 75-85(Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Ti, Pb, Bi, Po, At) 등을 포함한다. 원소 Tc의 동위원소, Re, Cu는 특히 진단 영상 촬영법과 방사선 요법에 사용하는데 적절하다. 99mTc는 특히 진단용 영상촬영법에 적용할 수 있다. 진단용이나 치료 목적으로 응용하는데 사용되는 기타 방사성 핵종으로는 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 186Re, 188Re, 198Au, 199Au, 203Pb, 211Pb, 212Bi 등이 포함된다.
펩티드의 생물학적 작용 도메인은 세포, 조직, 기관과 다른 생물학적 물질에 근거한 생물학적 수용자에 결합되는 것을 보여주면서, 생물학적 활성 펩티드 배열을 구성하는 하나 이상의 아미드산 배열로서 명세서와 청구범위에 한정된다. 생물학적 작용 도메인은, 리셉터나 수용기와 특정한 상호작용을 일으킬 수 있는 ,하나의 배위자를 구성하는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 연속적인 아미노산(sychnological)이나 비연속적 아미노산(rhegnylogical)으로 된 임의의 배열도 포함한다. "리셉터"라는 용어는 억셉터(acceptor)와 리셉터(receptor)를 모두 포함한다. 리셉터는 생물학적 리셉터이어도 무방하다. 펩티드나 생물학적 작용 도메인은 세포, 조직이나 결합 후에 생물학적 리셉터와 관련이 있는 다른 물질들로 신호를 전달하지만, 그러한 것이 요구되는 것은 아니다. 실시예들은 특히 호르몬 리셉터, 신경전달물질 리셉터, 세포 표면 리셉터, 효소 리셉터, 항체-항원 체계를 위한 생물학적 작용 도메인을 포함하나 그것에 한정되지는 아니한다. 생물학적 작용 도메인은 작용 물질이거나 반작용 물질 또는 작용 물질과 반작용 물질이 혼합물을 포함할 수도 있다. 생물학적 작용 도메인은 유전정보의 전사나 다른 유전자 조절 단백질의 모방으로서 사용될 수 있는 배열과 같은 특히 RNA나 DNA 결합을 위한 임의의 배위자도 포함할 수 있다. 생물학적 작용 도메인은 하나 이상의 아미노산이나 다른 구속된 분자 영역의 임의의 배열을 포함하고, 그것은 다른 펩티드, 효소, 항체나 단백질성 합성물을 포함한 기타 합성물에 근거한 생물학적 리셉터에 결합되는 것을 보여주고, 스스로 또 다른 생물학적 리셉터에 결합하는 것을 보여준다. 생물학적 작용 도메인은 "특정 결합쌍"의 한 성분을 구성하고, 특정한 결합 쌍은 적어도 두 개의 다른 분자를 구성하며, 하나의 분자는 표면이나 강(cavity)에서특별히 다른 분자의 공간적 극성 조직에 결합되는 특정한 영역을 가진다. 특정한 결합 쌍의 성분들은 빈번하게 배위자나 리셉터 또는 항 배위자에 속하는 것으로 간주된다. 특정한 결합 쌍들의 예에는 항원-항체 쌍, 호르몬-리셉터 쌍, 펩티드-리셉터 쌍, 효소-리셉터 쌍, 탄수화물-단백질 쌍 (글리코프로틴), 탄수화물-지방 쌍(글리코리피드), 렉틴-탄수화물 쌍과 같은 것들이 포함된다.
생물학적 작용 도메인은 구성 부분을 포함하며, 그 구성은 펩티도미메틱(peptidomimetic), 펩티드 동류(同類) 또는 금속-구성 분자이며, 그것은 금속 이온을 포함한 구성으로 결합되어 세포, 조직, 기관 그리고 기타 생물학적 물질에 근거한 생물학적 리셉터에 결합되는 것을 보여주므로 생물학적 활성을 띤다. 이러한 생물학적 작용 도메인은 본 예에서 시크노로지칼 또는 레그닐로지칼이며, 일반적으로 펩티드의 생물학적 작용 도메인의 기능과 특성을 가진다. 생물학적 작용 도메인은 금속 이온 결합 영역 전체나 부분과 동일 공간에 있으며, 그러므로 메탈 이온 결합 영역을 구성하는 동일한 아미노산은 그 생물학적 작용 도메인의 전체 또는 부분을 구성한다. 여러 사례에서, 하나 또는 복수의 금속 이온 결합 영역 아미노산은 그 생물학적 작용 도메인의 부분이 되며, 금속 이온 결합 영역의 부분이 아닌 하나 이상의 부가된 아미노산은 생물학적 작용 도메인의 잔여물을 형성한다.
형태적 구속은 펩티드와 기타 구조체에 의해 가정되는 삼차원 형태의 안정성과 바람직한 형태에 대한 것이다. 형태적 구속은 펩티드에서의 하나의 잔기의 형태적 이동성을 구속하는 것과 관련된 지역적 구속과, 약간의 이차 구조 유니트를 형성하는 잔기 집단의 형태적 이동성을 제한하는 것과 관련된 영역적 구속, 전체 펩티드 구조와 관련된 구형 구속을 포함한다. 상기한 Synthetic Peptides: A User's Guide를 참조.
펩티드의 일차 구조는 그 아미노산 배열이다. 이차 구조는 펩티드 골격의 형태와 펩티드 분절을 접어 α-나선, β-시트, 반전(turn)과 같은 것으로 하는 것을 다룬다. 따라서, 펩티드에 의해 상정되는 3차원 형태는 그 이차 구조와 직접적으로 관련이 있다. 상기한 Synthetic Peptides: A User's Guide 의 24 내지 33, 39 내지 41, 58 내지 67쪽의 내용과 그림, 표를 참조. 전체 구조는 형태적으로 구속된 3차원 형태를 적용하는 데 바람직한 펩티드 구조에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로부터 나오는 생성물은 의학적으로도 수의학적으로도 응용하여 사용할 수 있다. 전형적으로는, 그 생성물은 인체에 이용되지만, 다른 포유 동물에게도 사용할 수 있다. "환자"라는 용어는 포유류에 속하는 개체를 의미하는 것이며, 명세서와 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 본 발명은 우선적으로 인체에 적용이 되나, 실험실, 농장, 동물원, 야생 동물, 애완용 동물, 사냥용 동물나 다른 동물들에게도 적용될 수 있다.
금속 이온의 배위 결합. 다양한 일반 금속 이온의 배위 결합 영역은 일반적으로 네 자리에서 여섯 자리이다. 본 발명의 일실시예에 의하면 하나의 펩티드가, 리셉터 인식을 위하여 필요한 요구된 화학작용기 이외에, 금속 이온과의 결합을 형성하도록 요망된 수의 작용기(대부분의 경우 네 개에서 여섯 개)을 포함하도록 설계된다. 그 분자는, 금속이온으로 표지되고, 리셉터를 위한 친화력을 갖도록 형태가 고정되도록 설계된다. 분자는 ALCHEMY-Ⅲ(Tripos Associates Inc., St. Louis, MO)로 불리는 프로그램과 같은 3차원 분자 모델링 컴퓨터 소프트웨어의 도움을 받아 드 노보(de novo)로 설계된다. 설계를 위한 한 가지 기본적인 접근법은 금속 이온과 결합된 펩티드 골격을 구성하여, 특정한 금속 이온에 의하여 한정된 배위 결합 결합구조를 유지하는 동안 모든 원자가가 충족되도록 하는 것이다. 이 방법은 금속-펩티드 골격의 분자 골격을 생성시키며, 그 분자 골격은 생물학적 표적을 위하여 특정한 작용기에 의해 조절된다. 특히, 리셉터 인식과 결합을 위해 필요한 아미노산 측쇄는 측쇄들 사이의 공간적 관계가 배위자의 그러한 클래스 를 위한 과학 논문에서 이미 보고되고 제기된 것이나, Brookhaven National Laboratory에서 보관하고 있는 단백질 데이터 베이스와 같은 데이터베이스에서 발견되고 있는 것과 일치하는 식으로, 그 골격 위의 적절한 아미노산 잔기에 붙여진다. 현재는 일반적으로, 배위자 자기 공명 분광기나 분자 모델링과 같은 기구를 이용하여 리셉터나 항원 결합의 특정 아미노산 잔기의 영향과 상대적인 중요성을 측정할 수 있으며, 공지의 항원, 항체, 리셉터를 결합시키거나 공지의 결합 배열이나 배위자를 모방하는 펩티드의 특정한 설계나 합성을 허용한다.
배위 결합 번호 4, 5, 6의 금속 이온과 네자리, 다섯 자리, 여섯 자리 배위자와 의 각각의 착물은 배위자를 접고 구속한다. 바꾸어 말하자면 펩티드와 같은 고도로 신축적인 분자는 금속 이온과의 착물할 때 접혀서 일종의 반전을 형성한다. 이렇게 하여 형성된 turn은 형태적으로 상당히 구속된 구조이다. 도1은 본 발명에 의한 직선형 펩티드를 개략적으로 도시한다. 도 1-A는 반전 이 두 개의 비평행 β-시트 사이에 위치하여 안정된 구조를 가지는 큰 펩티드나 단백질의 한 부분과 같은 자연 생성되는 역회전 구조를 도시한다. 그러므로 도 1-A 에서 추가된 아미노산 배열은 말단에 연결되지만, 도시하지 아니하였다. 도 1- B는 금속 이온과 착물되지 않은 본 발명의 펩티드를 개략적으로 도시한다. 그러한 펩티드는 구조적으로 구속되어있지 않으며, 따라서 펩티드의 각 아미노산은 다른 아미노산에 대하여 다중적이고 다양한 3차원의 형태를 가진다. 도 1- C는 금속 이온과 착물한 본 발명의 펩티드를 도시한다. 이와 같은 착물은 상당히 구속된 구조를 만들면서 반전 구조를 형성한다. 이 반전은 생물학적 결합에 있어서 중요한데, 대부분의 생물학적으로 활성화된 펩티드는 리셉터 결합부에서 접혀진 구조나 반전 을 보여왔기 때문이다. 대부분의 펩티드 호르몬 리셉터와 항체 결합 에피토프는 펩티드의 접혀진 형성기를 수용하는 것으로 나타났다. 그러므로 본 발명은 다양한 배위자 시스템에 적용될 수 있으며, 리셉터 접촉을 형성하는 측쇄가 금속 펩티드골격에 놓여질 수 있도록 제공되고, 금속 이온 착온 후에 생물학적 리셉터에서 요구되는 상당히 구속된 형태를 이룬다.
금속 펩티드골격. 다양한 금속 이온 착물 골격이 본 발명에 이용될 수 있다. 어떤 골격을 선택하는 지 여부는, 일반적으로, 이용되는 금속이온이 무엇인지, 생물학적 리셉터와 생물학적 리셉터에 요구되는 생물학적 작용 도메인의 크기와 특징에 따라 정한다. 대체로, 본 발명에 유용할 대부분의 금속 이온은 4 내지 6의 배위 결합 수를 가지며, 드물게는 8과 같이 높은 배위 결합수를 갖는데, 이는 추정되는 금속 이온 결합 펩티드 사슬이 있는 결합 구조의 금속 이온과 배위 결합계를 결합시킬 수 있도록, 입체적인 방식으로 펩티드 사슬에 위치한 충분한 작용기들을 가지고 있다는 것을 암시한다. 펩티드 사슬에서 배위 결합기는 아민, 아미드, 이미다졸이나 구아니디노 작용기의 질소 원자, 티올, 디설파이드의 황 원자, 수산기, 석탄산기, 카르보닐기, 카르복실기 작용기의 산소 원자를 포함한다. 또한, 펩티드 사슬이나 개개의 아미노산은 옥심, 히드라지노, 설피드기, 인산염, 시아노기, 피리딘, 피페리디노, 몰폴리노와 같은 배위 결합하는 기를 포함하도록 화학적으로 변경될 수 있다. 펩티드 구성은 직선 또는 고리형일 수 있으나 일반적으로 직선형이 바람직하다. 작은 직선형 펩티드의 한 예는 Gly-Gly-Gly-Gly이며, 그것은 골격에 배위 결합수 4로 금속과 착물될 수 있는 4개의 질소(하나의 N4 착물 시스템)를 가진다. 다른 유사하고 적절한 테트라펩티드 도 이용될 수 있다. 또한, 배위 결합하는 기와 함께 측쇄를 가진 적어도 하나의 아미노산을 가지는 트리펩티드도 배위 결합수 4를 지닌 금속 이온과 함께 사용될 수 있다. 그러므로, 테트라덴테이트(tetradentate) 펩티드 구조체는 질소, 황, 산소 원자를 이용하는 테트라덴테이트 배위 결합을 생성하는 N4, N3S, N2S2, N2S, N2SO이나 다른 유사한 결합일 수 있다. 순환 배열이 채용될 수도 있다. 예를 들면 cyclo[Gly-Gyl-Gly-Gly]는 금속 이온을 배위 결합수 4로 착물하는 데 적합한 N4 tetradendate 배위자를 생성하는 단순한 사이클 펩티드이다. 이러한 순환 테트라펩티드 템플레이트에 대한 다른 적절한 변형은 상기한 직선형 펩티드를 상기한 다른 테트라덴데이트 배위자로 변경하는 것과 비슷한 방식으로 구조적으로 처리될 수 있다.
직선형과 순환형 시스템은 둘 다 변경되어 추가적인 배위 결합 기를 편입시킬 수 있으며, 그 결과 생성된 펩티드는 금속 이온과 더 높은 배위 결합수를 배위 결합시키는 다섯 자리 - 또는 여섯 자리 또는 그 이상이다. 그러한 금속 이온 착물 펩티드 배열의 설계는 과학 문헌에서 기술되어 왔다. (Ozeki E, Kimura S, Imanishi Y: Int J Peptide Protein Research 34:111, 1989; Garcia-Escheverria C, Albercio F, Giralt E 와 Pons M: J Amer Chem Soc 115: 11663-11670, 1992; Fattoruso R, Morelli G, Lombardi A, Nastri F, Maglio O, D'Auria G, Pedone C, Pavone V: 금속 이온 결합 펩티드의 설계, Biopolymer(Peptide Sci) 37:401-410, 1995). 자연 발생하는 금속 결합 펩티드의 다른 실시예는 칼모듈닌(calmodulin)과 유사한 칼슘 결합 펩티드와 밸리노마이신, 칼륨과 반응하는 순환 팹티드 항생 물질을 포함한다.
다른 착물 골격은, 금속 이온 원자가와 착물할 수 있는 질소, 황 또는 산소 원소를 가지는 유도된 아미노산이나 스페이서 배열과 함께, 적어도 두 개의 아미노산 잔기와 유도된 아미노산 또는 스페이서(spacer) 배열을 포함한다. 유도된 아미노산의 예들은 아미드, 1차 알킬, 아릴 아미드, 1,2,3,4-테트라하아드로이소퀴놀린-2-카르복실산과 그에 대응하는 7- 하이드록시 유도체, N- 카르복시메틸화 아미노산, 2‘-메캅토-Trp, Nβ-(2 mercaptoethane)-α,β-다이아미노프로피온산과 다른 동족체 아미노산의 고차(higher) 동족체, Nβ-(2 aminoethane)- α,β-다이아민프로피온산과 다른 동족체 아미노산의 유사한 higher 동족체, Nβ-(picolinoyl)-α, β-다이아민프로피온 산과 동족체 아미노산의 유사한 고차 동족체, β-(피콜리아미드)-Asp와 다른 동족 아미드산의 유사한 동족체, Nβ-(2-아미노- 벤조닐)-α, β-다이아민프로피온산과 다른 동족체의 아미노산의 유사한 고차 동족체, β-(2- 아민도메틸피리딘)-Asp와 다른 동족체 아미노산의 유사한 동족체, N-벤졸옥시카보닐 아미드산, N- tert 부틸카르보닐 아미노산, N-플루오레닐메틸옥시카르보닐 아미드산과 다른 유사한 우레탄 보호기 차단된 아미노산 유도체, 상기한 것과 관련된 유도되거나 합성 아미노산.
본 발명에서 이용되는 스페이서 배열의 예들은 2- 메르캅토에틸아민, 호박산, 글루타루산, 2- 메르캅토 호박산, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜타아민, 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 티오글리콜산, 케르캅토프로피온산, 피리딘-2-카르복실산염, 피코릴아민, 2-메르캅토아닐린, 2-아미노 벤 조산, 2-아미노메틸 피리딘이다. 일반적으로, 연속된 배열을 형성하기 위하여 두 개의 아미노산에 직접, 간접적으로 결합되어 있고, 금속 이온의 원자가와 착물할 수 있는 질소, 황, 산소 원소를 가지는 임의의 배열을 사용할 수 있다.
대부분의 적용에 있어서, 각 펩티드 분자는 하나의 금속 이온과 착물되는 금속 이온 착물 골격을 가진다. 그러나, 특정한 적용에 있어서는, 펩티드 분자는 하나 이상의 금속 이온과 착물하는 금속이온 착물 골격을 가지도록 설계된다. 일실시예에서, 펩티드 배열은 하나 이상의 아미노산 잔기나 다른 스페이서에 의하여 분리된 두 개의 분리된 골격을 포함하고, 그 잔기나 스페이서는 작용기이나 생물학적 작용 도메인을 형성할 수 있으며 반드시 그러한 것은 아니다.
금속 이온 결합 골격은 키랄 중심에서 미리 한정된 입체 화학을 가지는 펩티드 배열이며, 그것은 번갈아 가며 추가적인 잔기나 생물학적 작용 도메인의 전체나 부분을 형성하는 구조적 원소와 연결될 수 있다. 예정된 입체화학으로 키랄 중심을 선택하는 것은 그것이 금속 이온의 착물에 있어서 새로운 키랄 중심을 생성하는데 상당한 장점이 있으며, 생물학적 작용 도메인의 생물학적 활동 프로필에 영향을 미친다. 생성된 입체 화학에 대하여 조정되지 않은 두 개의 새로운 키랄 중심의 생성은 Katzenellenbogen 과 그의 공동 연구자(Chi DY, O'Neil JP, Anderson CJ, Welch MJ, Katzenellenbogen JA: 레늄(V) 과 테크네튬(V)의 동종 이량체와 이종 이량체 비스 (아미노 티올) 옥소메탈 착물: 이종 이량체 착물 형성의 통제 와 스테로이드 호르몬을 모방한 금속 착명에 대한 접근법. J Med Chem 37:928-937, 1994)들에 의한 스테로이드 호르몬 배위자의 모사물으로서 합성된 이종 이량체 레듐과 테크네튬 착물의 중대한 결점이다.
TcO[V] 또는 ReO[V]와 같은 펩타이드의 메탈옥소 이온 종의 착물은 이론 적으로 syn-메탈 옥소기이나 anti- 메탈옥소기중 하나를 갖는다는 면에서 상이한 두 개의 이성질체로 안내된다. 본 발명에 따른 펩티드 메탈옥소 착물은 이와 같은 syn- , anti- 이성질체의 유형을 나타낸다. 이러한 이성질체들은 광학적으로 활성적인 아미노산이 분자의 메탈옥소 이온 착물 부분 일체로 된 부분(integral part)을 형성하는 경우에 있어서 HPLC나 유사한 수단에 의하여 분리할 수 있다. syn-배열에서나 anti-배열에서나 메탈 옥소기의 방향 위치는 메탈옥소기에 착물되는 펩티드는 본 발명의 두 개의 다른 99mTc 표지된 펩티드의 syn-배열과 anti-배열을 도시한 도 2와 도 3에서와 같이 골격의 형태적 특성에 어떤 영향도 주지 않는 것으로 나타났다. 도 2는 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala의 1차 표지되지 않은 구조를 지닌 금속이온 표지 펩티드의 확대 입체도이다. 도 2A와 2B는 메탈옥소기안에서 이성에 의하여 만들어진 두 개의 이성을 보여준다. 도 2C 는 도2A와 2B를 겹친 형상을 나타낸 것으로서 두개의 이성질체 사이에 생물학적으로 관련이 있는 아미노산 측쇄의 형태상에서 차이가 없음을 보여주는 도면이다. 도 3은 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg의 일차적 비표지된 구조와 함께 금속 이온 비표지된 펩티드를 도시한 확대 입체도이다. 도 3A와 3B는 메탈옥소기에서 이성에 의하여 생성된 두 개의 이성질체를 도시한다. 도 3C는 도3A와 3B를 포개어 도시하고, 두개의 이성질체 사이에 생물학적으로 관련이 있는 아미노산 측쇄의 형태에 차이가 없음을 보여준다. 결과적으로 두 이성질체중 하나의 메탈옥소기가 생물학적 표적과 착물 상호작용하는 동안 분자의 공간적 배치에 관한 방해를 일으키지 않는다면, 두 이성질체의 생물학적 활동은 유사하다. 이러한 예들에서, 두 이성질체중의 하나는 더 활발한 생물학적 활성 특성을 가질 수도 있다.
대부분의 금속이온 착물은 배위 결합수 6 또는 4이다. 배위 결합수 2, 3, 과 7의 착물은 드물다. 일정한 기수의 배위수를 가진 금속 착물은 그의 드문 입체화학과 배위 결합 특징으로 인하여 상대적으로 드물다. 배위 결합수 5를 지닌 많은 금속 이온 착물이 알려져 있고 대개 중심적인 금속 종으로서 모노 옥소 또는 디옥소 금속 양이온으로서 알려져있다. 이러한 종류의 착물에서는 몇몇 전이 금속 이온이 동일한 산화 상태에 관하여 다른 중심 물질로 존재하는 것으로 알려져있다. 그 한 예가 Mo(V), MoO3+, MoO2 +와 같은 모노 옥소 형태와 Mo2O2, Mo2O3 4+, Mo2O4 2+와 같은 에서 5+ 상태의 몰리브덴이다. 그와 유사하게, 테크네튬도 4에서 9의 배위 결합 수를 가지고 1-에서 7+의 다중 산화 상태에 중심종으로서 하나의 Tc 또는 Tc-옥소메탈 양이온 존재한다(Tisato F, Refosco F, Bandoli G: 테크네튬 착물의 구조적 survey. Coordination Chem Rev 135/ 136: 325-397, 1994; The Chemistry of Technetium in Medicine, Steigman J, Eckelman WC, National Academy Press, Washington, DC, 1992). 레늄 화학은 테크네튬 화학의 그것과 유사하고, 다양한 메탈옥소 상태, 산화 상태, 배위 결합수에 의하여 발생하는 레늄 착물과 유사한 세트들이 가능하다(Rouschias G: 레늄화학에서의 최신 접근법. Chemical Rev 74:531-566, 1974). 이러한 착물에 의하여 보이는 갖가지 결합구조는 삼각형의 바이피라밋(산화상태 1-, 배위 결합수 5), 팔면체(산화상태 1-6, 배위 결합수 6), 5각형 바이피라밋(산화상태 3, 배위 결합수 7), 사각형 피라미드(산화상태 5, 배위 결합수 5를 포함한다. 금속 이온 결합 골격은 금속 이온 원자가가 착물으로 충족되도록 지정된다.
생물학적 작용 도메인. 구조체의 생물학적 작용 도메인은 생물학적 표적과 결합하여 신호 변환을 일으키거나 생물학적 신호의 변환을 차단시키기도 하는, 분자 내의 구조적 부분이다. 리셉터가 생물학적 표적이 아닌, 배위자와 리셉터 쌍을 형성할 수 있는 펩티드에 있어서는, 생물학적 작용 도메인에 관한 논의를 특히 생물학적계로 제한하지 않고 적용한다. 펩티드의 생물학적 작용 도메인은 다양한 아미노산 측쇄를 가지며, 영역이 입체 특정적으로 리셉터에 결합하고, 임의대로 생물학적 반응을 일으키거나 막을 수 있도록 배열된다. 생물학적 작용 도메인은 사이크놀로지칼 (연속된 배열에 위치한 구조요소)일수도 있고 또는 레그닐로지칼 (불연속적 배열에 위치한 구조요소)일수도 있으며, 이러한 개념은 일반적으로, Schwyzer R: Peptide-membrane interactions and a new principle in quantitative structure-activity relationship. Biopolymer 31:875-792, 1991에 기재되어 있는 것으로, 이러한 기재내용은 본 명세서에 인용된 것에 의해 본 발명의 내용으로 한다.
금속이온을 착물형성시키기 위한 특정의 착물형성 골격에 기초한 생물학적 작용 도메인의 설계는 적어도 2가지 방법으로 수행할 수 있다. 한가지 접근법에서는 금속 이온 결합 골격과 생물학적 작용 도메인이 결합되어 생물학적으로 관련이 있는 작용기가 직접적으로 배열되고, 금속 결합 영역과 같은 공간에 걸쳐지며, 금속 결합 영역에 대한 금속 이온의 결합은 생물학적 작용 도메인의 지형을 결정한다. 그러므로, 생물학적 작용 도메인은, 금속 결합 영역의 형태가 금속 이온의 결합에 의하여 고정된 때, 소망되는 생물학적으로 활발한 삼차원 구조에 유사한 관련 작용기를 가진다. 이러한 접근법은 생물학적으로 활발한 형태에서 반전으로 접히는 펩티드 배위자에 적합하나, 그것에 한정되는 것은 아니다. 이러한 배위자의 예로는 다른 많은 배위자들 중에서 오피오이드 펩티드, 황체 호르몬 방출 호르몬, 소마토스타틴(somatostatin), 멜라노트로핀, 태키키닌스(tachykinins), 콜레시스토키닌스(cholecystokinins)를 포함한다.
또 다른 접근법에서는, 생물학적 작용 도메인이 금속 결합 골격과는 구분되고, 금속 이온 결합 골격에의 금속 이온의 착물은 펩티드가 전체적으로 구속된 이차 구조를 가지도록 하여 소망되는 생물학적으로 활발한 삼차원 구조안에서 생물학적 작용 도메인의 지형적 정렬이 된다. 이러한 유형의 접근법은 브릿지 디설파이드, 락탐, 락톤, 티오에테르나 유사 결합을 섞어 놓은 펩티드 배위자에 적합하나, 그것에 한정되지는 아니한다. 주어진 구성 속에서 두 가지 접근법을 통합시켜, 금속 이온 결합 골격 전체나 부분이 생물학적 작용 도메인의 균형을 이루는 분자의 하나 이상의 서로 다른 말단부와 함께 생물학적 작용 도메인의 부분을 형성하게 할 수도 있다. 그러한 경우에, 생물학적 작용 도메인은 시크놀로지칼이거나 레그닐로지칼일 수 있으나, 일반적으로는 레그닐로지칼이다.
본 발명은 두 개의 넓은 금속 이온 착물 분자 족을 포함하며, 그 분자는 펩티드, 펩티도미메틱 또는 다른 유기 분자이다. 모든 경우에 있어서, 금속 이온은 적절하게 설계된 금속에 착물되어 지역 또는 전체적인 형태 수축을 일으킨다. 지역적으로 제한된 금속 펩티드에서 금속 이온 결합 영역과 생물 기능 영역은 서로 같은 공간에 있으며 서로 구별할 수 없다. 전체적으로 구속된 금속 오페타이트에서 이 두 영역은 구조적으로 공간적으로 구별되며, 분자 속에서도 구별되나. 금속 이온 결합 영역에의 금속 이온 착물은 생물 기능 영역의 형태를 구속하도록 배열된다.
본 발명의 펩티드의 생물학적 효능이나 그 리셉터에 대한 배위자의 친화력은 금속 결합 골격에의 금속 이온의 착물이나 결합에 직접적으로 연관된다. 금속 이온과 결합되거나 착물되지 않은 본 발명의 펩티드의 생물학적 효능이나 친화력은 금속 이온 착물 펩티드로 얻을 수 있는 것보다 매우 낮거나 무시할 수 있는 정도이다. 상자성 금속 이온과 방사성 금속 이온과 착물된 구조체의 경우에 있어서, 분자와 착물된 금속 이온만이 생물학적으로 관련이 있다는 점에서 이러한 특징은 상당히 유효하다. 주어진 preperation에서 펩티드 분자의 5%만이 착물된 금속 이온이고, 그러므로 그 5%만이 생물학적으로 활성적이다. 착물된 금속 이온이 아닌 펩티드 분자의 나머지 95%는 생물학적 활성도를 거의 나타내지 않는다. 그러므로 금속 이온이 표지된 종은 금속 이온을 나르는 유일한 펩티드 분자가 대체로 생물학적으로 활성적이므로 반드시 무담체이다. 그러므로, 비착물 펩티드 분자를 포함하는 전체 혼합물은 비표지된 분자로부터 표지된 분자를 분리하기 위한 정제(purification)를 필요로 하지 않고 생체내로 투여되거나, 시험관에서 사용될 수 있다. 이것은 생물학적 활성 펩티드의 투여량이 대체로 선행 기술에서 얻어질 수 있는 양보다 대체로 적다는 점에서 중요한 이점을 제시한다. 예를 들면, 소망하는 리셉터에 결합되나 독성이 있으며 소망되는 생물 활성도를 가지는 생물 활성 펩티드의 경우, 독성과 생물학적 활성도는 최소화된다. 금속이온으로 표지된 그러한 펩티드 분자만이 대체로 생물학적으로 활성적이다. 방사치료의 경우, 일반적으로 전체의 대다수를 차지하는, 착물된 금속이 아닌 그러한 분자는, 생물학적 활성도를 거의 나타내지 않으며, 그러므로 거의 독성이나 리셉터를 위한 경쟁이나 소망하지 않은 생물학적 활성도는 거의 또는 전혀 일으키지 않는다. 마찬가지로 착물된 금속 이온 펩티드만이 생물학적으로 대개 활성적이므로, 착물되고 생물학적 활성도를 지닌 금속이온 펩티드의 백분율로 표시된 특성 활성도는 이론상 가능한 최대치이거나 최대치의 근사한 값이다.
금속이온과의 착물. 펩티드에 대하여, 특히 펩티드 금속 이온의 착물 골격에 적정량의 펩티드를 금속 이온과 혼합함으로서 착물이 이루어진다. 이는 바람직하게는 용액속에 적절한 완충제를 포함하는 용해작용에 의하여 이루어진다. 하나의 접근 방법에서, 금속 이온은 펩티드와 혼합될 경우, 이미 금속 이온 착물 골격에 착물되는데 필요한 산화 상태로 되어 있다. 어떤 금속 이온은 칼슘, 포타슘, 이디움, 망간, 구리, 아연, 코발트, 기타 금속들의 이온화 형태와 같은 가장 안정된 산화 상태에서 착물된다. 다른 접근 방법에서는 금속 이온은 금속 이온 착물 골격에 착물되도록 낮은 산화 상태로 낮추어져야 한다. 제1철, 제2철, 제1주석, 제2주석, 테크네튬옥소[V], Pertechnetate, 레늄옥소[V], 과레늄산염과 다른 유사 금속 이온들의 경우에 그러하다. 그러므로, 예를 들어 과레늄산염과 퍼테크네테이드는 둘 다 착물을 하기 이전에 더 낮은 산화 상태로 낮추어져야 한다. 산화 상태를 줄이는 것은 혼합을 하기 전에, 펩티드와 혼합하는 것과 동시에, 또는 펩티드와 혼합을 다음에 실시할 수 있다. 소망하는 산화 상태로 낮추는 방법으로서 알려진 것은 어떤 방법이든 사용될 수 있다. 예를 들어, 과레늄산염과 퍼테크네테이트는 제1철이나 이티온산염 또는 다른 수단을 사용함으로서 낮출 수 있다. 제1철 또는 이티온산염 금속 이온 환원제는 산화 상태를 낮출 금속 이온과 금속 이온을 펩티드에 첨가하기 전에 또는 동시에 혼합되거 나, 금속 이온이 환원될 때 펩티드와 함께 용액 속에 들어있고, 다음에 펩티드와 착화되고, 용액에 첨가된다.
표지 또는 착물 단계에서의 펩티드와 금속 이온의 화학비는 적용에 따라 변화될 수 있다. 예를 들어, 방사 금속 착물의 경우에, 펩티드 분자에 대한 방사 금속 이온의 비는 부수적인 불순물을 생성하지 않고, 방사화학적 불순물을 1:2 이하 내지 1:1000이상까지 변화할 수 있다. 다른 적용에서는, 펩티드 분자에 대한 금속 이온비는 최소 1000:1 내지 1:1000 이상의 범위를 가질 수 있다. 금속 이온의 농도가 펩티드 분자의 농도보다 높을 때는, 모든, 실질적으로 모든 펩티드 분자가 금속 이온에 착물된다. 펩티드에 대한 금속 이온의 비율은 생물학적 또는 다른 배위자 활성도를 갖기 위하여 형태적으로 구속되는 펩티드의 백분율에 직접적으로 영향을 미치지만, 리셉터 위치나 표적에는 전혀 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 금속 이온을 메탈 이온 과 펩티드의 비율을 1: 100으로 하여 단 1%의 펩티드 분자에 착물시킬 수 있으며, 그러한 경우에 단 1%의 펩티드 분자만이 생물학적 또는 다른 배위자 활성도를 갖는다.
방사성이나 비방사성 금속 이온이 사용될 수 있다. 방사성 동위원소를 사용함으로써 특정한 진단상, 또는 치료적 이점을 얻을 수 있는 곳에서는 방사성 금속 이온이 사용된다. 형태적으로 구속된 생물학적 작용 도메인으로부터 진단상 또는 치료상의 효용성을 얻을 수 있는 곳에서는 비방사성 금속 이온이 사용된다. 특정한 응용이 유익할 수 있도록 본 발명의 동일한 펩티드 생성물과 함께 따른 금속 이온을 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드와 N4, N3S1, N2S2 금속 결합 영역이 99mTC와 같은 감마선 방사 금속 이온과, 186Re나 188Re와 같은 베타선 방사 금속 이온과, 안정적인 ReO[V]와 같은 비방사 금속 이온과 각각 착물될 수 있다. 금속 이온을 적절한 산화 상태로 환원시키는 데 필요한 수단과 같은 착물 화학에는 차이점들이 있을 수 있으나, 다른 금속 이온들과 성공적으로 착물되기 위하여 펩티드의 구조에는 변화가 없어야 한다.
폴리머 구성. 본 발명의 펩티드 금속 이온 착물의 약물동력학적 측면을 변경시키기 위하여, 착물이 다양한 폴리머들에 결합되어, 분자 크기, 전하량, 소수성, 과 분자의 다른 특성들을 변경시킨다. 펩티드 구조체에 결합되는 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PGA) , 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리아미노산, 지방산, 지질 분자 등을 포함한다. 펩티드 금속이온 착물은 리포좀에 넣어져, 리포좀내에서 펩티드 금속 이온 착물의 약물 동력학과 생체이용률에 있어서 현저한 차이를 보인다.
다른 진단 영상 촬영에의 응용. 본 발명의 펩티드와 그것을 이용한 방법은 양전자 방사 단층 촬영법(PET)과 자기 공명 영상촬영법(MRI)을 위한 진단용 약품으로도 이용될 수 있다. PET 약품으로 사용되는 경우, 펩티드는 51Mn, 52Fe, 60Cu, 68Ga, 72As, 94mTc, 110In, AT 동이원소와 같은 다양한 양전자 방사 금속 이온 중 하나와 착물된다. MRI에 응용되는 경우에는, 착물 이온은 Mn, Gd, Fe, Dy와 같은 상자성체이다.
본 발명을 MRI와 PET에 적용하는 두 가지 경우에, 착물되지 않은 펩티드 분자가 생물학적 효능이 결여되거나 한정되는 반면, 관련 금속 이온과 결합하는 분자 부분만이 3차원 구조에 반응하는 리셉터의 모습을 취한다. 그러므로, 본 발명은 금속이 표지된 종이 비착물 펩티드 분자로 부터 금속이 표지된 부분을 분리할 필요 없이 투여될 수 있다는 점에서 이와 같은 진단적 양식에 있어 장점을 가진다.
치료제의 담체로서의 용도. 봄 발명의 생성물과 본 발명의 방법에 의하여 만들어진 생성물은 화학요법제, 유전자 조절제, 효소 기능 억제제, 표적 세포막 파괴제, 바이러스 차단제, 항체 차단제 등과 같은 치료에 적합한 다른 화학 종들을 특정한 표적에 운반하기 위한 백터나 담체로도 이용될 수 있다. 치료적 유상하중은 금속이온의 착물이나 생물학적 표적을 결합하는데 필수적인 것들 이외의 부위들에서 펩티드에 결합될 수 있다. 치료적 유상하중은 펩티드를 금속이온에 착물하기 전이나 후에 펩티드에 결합될 수 있으며, 생물학적 작용 도메인을 활성화 시킨다.
생체내 금속 이온 착물법. 본 발명의 펩티드 구조체는 금속 이온에의 착물없이 생체내로 투여될 수 있다. 펩티드와 금속 이온의 그 후의 착물은 펩티드가 형태적으로 구속되게 하고 생물학적 작용 도메인이 그 표적에 특정화되도록 한다. 그러므로, 순환속에서 금속 이온과 착합하는 본 발명의 방법으로 만들어지고 적절하게 설계된 펩티드의 투여는 펩티드를 내생의 또는 이어서 투여되는 금속 이온과 착물함에 있어, 생물학적으로 활성적인 형태로 변화시킨다.
방사 치료에의 응용. 본 발명의 생성물과 본 발명의 방법을 이용한 생성물은 방사 치료제로서도 이용될 수 있다. 예를 들면, 99mTC와 같은 감마 방사성 동이원소로 표지되었을 경우, 그 생성물은 진단 핵 약품으로 이용될 수 있다. 그러한 용도로, 본 발명의 펩티드는 특정한 질병 상태의 특징이거나, 질병 부위에서 높은 농도로 발견되는 세포에 존재하는 리셉터를 위하여 효과가 있는 생물학적 작용 도메인을 포함한다. 예를 들면, 혈소판, 섬유소, 다른 응혈 구성성분에 특히 유효한 생물학적 작용 도메인을 가진 펩티드는 트롬빈의 진단 영상으로도 사용될 수 있다. 마찬가지로, 다형핵 세포를 포함한 많은 백혈구 중 어느 것에나 유효한 생물학적 작용 도메인을 가진 펩티드는 감염증이나 염증 부위의 진단 영상에 사용될 수 있다. 리셉터는 특정 악성종양의 종양 표지물과 같은 질병이다.
본 발명의 생성물과 본 발명의 방법을 이용한 생성물은 알파- 또는 베타-방사 방사성 동이원소로 표지된 치료제로도 사용되어 질 수 있다. 예를 들면 레늄-186(186Re) 또는 레늄-188(188Re)과 같은 알파- 또는 베타-방사 방사성 동이원소로 표지된 펩티드는 여러 가지 악성 종양과 같은 특정 세포 표면 리셉터 관련 질병을 포함하는 질병에 대한 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 생성물과 본 발명의 방법을 이용한 생성물은 생물학적으로 활성적인 펩티드나 단백질 분자가 사용되는 방사 약학적 응용에도 사용될 수 있다. 이것에는 F(ab')2, Fab, Fv, Fc부분을 포함하는 항체 부분의 결합부위에 근거한 단백질 항체의 생성물이나 단일 사슬 결합 단백질을 포함하는 단백질 항체의 초가변 부위에 근거한 단백질 항체의 생성물을 포함한다. 이것은 또한 다른 항원 결합 영역 부분과 생물학적으로 활성적인 펩티드를 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 방법을 사용함으로써 펩티드에 기초한 조영 및 치료제의 합리적인 개발이 가능해지고, 금속 이온으로 표지시킬 경우 친분자 (parent molecule)의 기지의 결합특성을 모사하는 펩티드 의사체 (펩티도미메틱) 또는 슈도펩티드를 비롯한 펩티드를 설계 및 제조할 수 있다. 본 발명의 방법으로 제조될 수 있는 적당한 생성물의 예로는 금속 이온으로 표지시킬 경우 RGD, YIGSR, For-MLF, TGF-beta(종양 성장 인자), FGF(섬유아세포 성장 인자), PDGF(혈청 유도 성장 인자), EGF(포피 성장 인자), NGF(신경 성장 인자), 뉴로 펩티드 Y, 콜레키토키닌, 종양 관련 표지물, 에스트로젠, 터프트신(tuftsin), 멜라노트로핀, 소마토스테틴 등의 것과 기능적으로 유사한 생물학적 작용 도메인을 갖는 펩티드가 포함된다. 300종 이상의 리셉터 및 그의 작용물질들 (agonists)이 알려져 있으며, 그 각각은 본 발명의 생성물의 잠재적인 후보이다.
방사 약학의 응용, 다른 의학적 응용으로서 본 발명의 펩티드와 본 발명의 방법으로 만들어지는 생성물은 전체 직선 또는 단일 사슬 펩티드 구성에 대하여 상당한 이점을 제공한다. 예를 들어, 항체의 초가성 루프 배열로부터 유도된 형태적으로 구속된 이합체 펩티드는 항원을 친화력을 가지고 지선형 배열 펩티드로 얻어진 것보다 40 포드 높게(higher)까지 결합시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 펩티드는 금속 이온과 표지될 때 정의상 형태적으로 구속되어 있다는 점에서, 종래의 직선형 배열로 얻어지는 것보다 유사하게 높은 친화력을 가지고 있다.
방사 약학과 다른 의학적 응용으로서, 펩티드는 본 발명에 속하는 기술분야에서 알려진 어떤 방법으로도 실시할 수 있다. 정맥 주사, 피하 주사, 점막을 통한 투여, 경구 투여, 피부 투여, 조직, 강이나 국부에 대한 국부 투여 등과 같은 방법들이 이에 속한다.
고 친화성 구성. 본 발명의 생성물과 본 발명의 방법으로 만들어진 생성물은 금속 이온과 표지될 때, 극도로 높은 친화력을 나타낸다. 이것은 특히 세 개 내지 약 20개의 아미노산 서열에서 작은 펩티드 구성인 생성물과 관련이 있다. 형태적으로 구속되어 있지 않은 선행 기술의 펩티드 배열은 일반적으로, 형태적으로 구속된 항체 초가변 부분가 같은 모분자보다, 표적에 대하여 상당히 낮은 친화성을 나타낸다. 그러므로 본 발명의 생성물은 치료제로서 직접 사용될 수 있으며, 그 안에서 금속 이온이 형태적으로 생물학적 작용 도메인을 고정시키는 기능을 하나 금속 이온 그 자체는 반드시 치료 성분으로서 작용하는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 이용하여 펩티드 호르몬, 신경전달물질, 스테로이드 호르몬, 효소 억제제 등과 같은 생물학적 활동 측면을 나타내는 펩티드 금속 이온 착물을 설계할 수 있다. 본 발명의 펩티드 금속 이온 착물은 입체 특이적 방법으로 생물학적 리셉터를 높은 친화력으로 결합할 수 있고, 작용 물질, 반작용 물질, 작용물질과 반작용 물질의 혼합물로서 생물학적 반응을 나타낸다. 펩티드 금속 이온 결합은 펩티드 안에서 시안산염기, 시안산황기, α-haloketone, mustard moiety 등과 같은 반작용적인 화학 작용기를 혼합함으로서 특정 표적 자멸 기질로서도 사용될 수 있으며, 표적 리셉터나 효소와 결합한 후, 뱐응기는 표적 분자와 변경 불가능한 결합을 형성하여, 더 이상의 생물학적 신호를 변환할 수 없게 한다.
치료제로서의 용도. 본 발명의 생성물과 본 발명의 방법으로 만들어진 생성물은 일반적으로 펩티도미메틱이나 슈도 펩티드를 포함한 펩티드가 사용되는 어떠한 응용에도 사용될 수 있다. 그 생성물은 특히 전체적으로 구속된 구조나 생물학적 작용 도메인이 필요한 펩티드 약물에 유용하다. 이러한 응용에서 금속 이온은 펩티드나 한 부분을 형태적으로 구속하는데만 기능할 수 있으며, 그 자체가 약제의 치료적 성질에도 관련이 있을 수 있다. 다양한 펩티드 약품으로서의 응용은 본 발명의 다른 부분에서 설명한다. 일반적으로 본 발명의 생성물은 존재하는 펩티드- 또는 (a) 옥시토신, 바소프레신, 소마토스타틴, 멜라노트로핀, 황체형성 호르몬 방출 호르몬, 인슐린, 칼시토닌, 스테로이드 호르몬 등과 같은 호르몬, (b) 레닌, 앤지오텐신 전환 효소 억제자, HIV 프로테아제, 등과 같은 효소 억제자, (c) 밸리노마이신, 페니실린, 테트라사이클린, 블레오마이신 등과 같은 항생물질, (d) 이온 경로 차단제, (e) 진통제 (f) 성장 인자와 기타 등을 포함하는 펩티도미메틱-치료제의 용도과 유사한 치료적 용도를 발견할 수 있다. 펩티드계 약제의 발달은 인용 참증으로 인용한 펩티드 약제: 신규한 약품 설계에 대한 접근법, DJ Ward, 편집자, Open University Press, London, 1989에 일반적으로 기재되어 있다.
비 펩티드 생물학적 작용 도메인의 모사물들. 생물학적 작용 도메인은 비펩티드인 자연 생성 배위자의 모사물일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법과 구성을 이용하면, 스테로이드, 호르몬, 기타 배위자들의 모사물을 만들 수 있다. 그러므로 본 발명은 리셉터나 자연 생성 배위자나 배위자 또는 두 가지 모두 펩티드로 구성되지 않는 상황을 초래한다.
금속 펩티드구성 설계에 대한 일예는 비펩티드 천연 분자, 팩클리텍셀(paclitaxel: taxol)의 모사물의 설계이다. 팩클리텍셀의 결정 구조는 적절하게 유도된 측쇄를 대신하는 펩티드 분자를 설계하는 출발 지점으로 사용된다(Mastropaolo D et al: paclitaxel(taxol)의 결정 구조와 분자 구조. Proc Natl Acad Sci USA, 92:6920-6924, 1995). 바람직하게는 아래의 일반적인 구조의 분자 라이브러리는 구속되어 있다.
[N-benzoyl-(2R, 3S)-3-phenyl]isoserinyl-Aaa-Bbb-Cys-Ddd.
Aaa, Bbb, Ddd는 생물학적 활성도에 필수적인 팩클리텍셀 안에서 하나 이상의 작용기를 모방하는 무작위 아미노산 유도체이다. 이러한 분자들은 ReO[V]과 같은 금속 이온과 착물됨에 있어, 유도된 아미노산 측쇄 작용기들이 공간적으로, C-13 측쇄, C-1 OH기, C-2 안식향산염, C-4 아세테이트, C-10 아세테이트와 같은 팩클리텍셀 작용기들의 모방이 적어도 두 개 이상 그 안에서 일어나는 교환 활성이 없는 금속 펩티드를 생성한다. 팩클리텍셀의 이러한 측쇄들은 C-13 측쇄와 함께 그 광학이성으로 생물학적 활성도에 있어서 중요하며, 아마 모든 것 중에서 가장 중요한 알려져 있다 (Gueritte-Voegelein F et al: taxol 상사기관의 구조와 세포분열 저지활동의 관계. J Med Chem 34: 992-998, 1991; Kingston DGI: taxol Pharma Ther의 화학 작용: 52: 1-34, 1991; Grenard D et al: Taxol과 texotere: 발견물, 화학작용과 구조-활동 관계. Acc Chem Res 26: 160-167, 1993). C-13 측쇄, N-benzoyl-(2R, 3S)-3-phenylisoserine이 상업적으로 이용가능하다.(Cat. No. 44, 437-5, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI).
펩티드가 아니나 구조적으로 결정된 금속 이온 구조체. 본 발명의 방법을 이용하여, 아미노산으로 구성되지 않고, 본 발명에서와 같이 한정된 펩티드가 아니나, 메탈이온 결합 영역과 생물학적 작용 도메인을 통합하는 금속 구성 분자를 디자인하고, 만들고, 사용할 수 있다. 예를 들면, 비펩티드 분자는 금속 이온을 착물하기 위하여 설계될 수 있으며, 그것은 금속 착물에 있어서만 표적 생물학적 리셉터를 위하여 대개 생물학적 활성을 띠는 것으로 특징지어진다. 이러한 구조체 클래스 설계의 기본적인 특징은 본 발명의 펩티드 구성 설계에 관련된 특징과 유사하다. 지방성, 방향성, 결합 골격은 금속 이온의 모든 원자가가 충족되도록 금속 이온을 착물한다. 골격은 충분한 수의 N, S, O 금속 이온 결합 부분이나 N, S, O 금속 이온 결합 부분의 결합을 통합하여 금속 이온을 착물한다. 또한 골격은, 생물학적 표적에 결합되기 위하여 필요하고, 생물학적 작용 도메인을 함께 형성하는 작용기와 구조 원자와 함께 유도된다. 생물학적 작용 도메인은 전체적 또는 부분적으로 금속 이온 결합 골격과 같은 공간에 존재하며, 금속 이온의 착물은 분자의 전체적인 구조적 구성을 하여, 주어진 생물학적 리셉터를 결합하는 배위자를 위한 생물학적 활성 형태를 모방하는 지형학을 형성한다.
본 발명의 비펩티드의 간단한 예는 RGD 배열의 금속 구성 모사물이며, 그것은 99mTc, Re, In, Mn, Fe나 Cu등과 같은 금속이온을 에틸렌디아민과 함께 디에틸렌트리아민펜타아세트산의 동 몰의 코발트 부가물에 착물함으로써 만들어지는 리셉터의 인테그린 계통 작용기에 결합된다. 이 부가 생성물은 에틸렌디아민이 DTPA-디안하이드라이드와 에틸렌디아민을 반응시킴으로써 얻어진다. 이 부가물에 있는 에틸렌디아민 부분의 아미노기는 DTPA 부분의 유리 카르복실레이트와 함께 두 개의 1차 인테그린 리셉터 결합 작용기를 모방한다. 이러한 부가 생성물을 형성함에 있어 방향성 아민 유도체 뿐만이 아니라 에틸렌디아민의 고차 동족체나, 1,4-피페라진과 같은 다른 디아민이 리셉터의 하나 이상의 인테그린 계통 작용기에 효과가 있는 금속 구조체를 제공한다. 그러나 이러한 종류의 배위자를 구성하기 위한 다른 방법은 디에틸렌트리아민이나 그 동족체의 부가 생성물을 호박산이나 그 동족체와 함께 후자의 무수물을 사용하여 생성하는 방법에 의한 것이다. N기와 함께 생성된 착물은 금속이온을 착물하고, 생물학적 작용 도메인을 형성하는 양이온과 음이온 중심을 제공한다. 이러한 분자 클래스에서 부가된 기능은 오피오이드, 소마토스타틴, 콜레시토키닌(cholecystokinin), 멜라노트로핀, 뉴로키닌 등과 같은 여러 가지 펩티드 호르몬과 신경전달물의 생물학적 작용 도메인 부분을 형성하는 것으로 알려진 질석탄산기, 페닐기, 이미다졸기, 인돌기 을 포함하는 여러 대체물을 사용함으로서 기능화될 수 있다. 이러한 부가 생성물을 형성하는 합성 방법으로는 직각 방어나 하나 이상의 화학반응기를 필요로 한다.
펩티드와 금속 구성 분자 라이브러리와 결합 화학에서의 용도. 특히 특정한 생물학적 표적을 향할 뿐만이 아니라, 구조적 형태적 다양성이라는 점에서 상당히 편중되어 있는 펩티드, 펩티도미메틱, 슈도 펩티드, 비펩티드 유기 분자 라이브러리를 설계하는데 대한 중요성이 더욱 증가되고 있다. 많은 응용 분야에 있어서, 펩티도미메틱의 라이브러리와 작은 유기 분자는 신진대사의 안정성, 생체이용가능성, 약물 동력학에 대한 고려할 때 펩티드 라이브러리보다 선호된다. 라이브러리와 결합 화학에 관한 선행 기술은 금속 펩티드나 금속 구성 분자 영역에 대해서는 다루지 않았다. 금속 결합 영역을 충족시키기 위하여 적절하게 설계된 펩티드와 유기 분자에 착물되는 금속은 특이성, 친화성, 신진대사의 안정성, 생체 이용율, 약물동력학에 있어서 상당한 장점을 지니고, 상당히 구속된 구조가 된다.
본 발명의 한 응용은 라이브러리를 조립하기 위한 주형(template)으로서 지역적으로 또는 전체적으로 구속된 금속 펩티드구조를 사용하는 것이다. 금속펩티드의 라이브러리는 지역적 형태 제한이나 전체적 형태 제한을 가진 분자 또는 상기 두 가지가 결합된 분자를 포함한다. 본 발명의 이러한 측면은 스크리닝 시스템에 있어서의 긍정적인 hits에 대한 다양한 합성 방법, 스크리닝과 구조 설명 방법을 포함한다. 이러한 측면의 중요성은 본 발명의 기술 분야에 있어서 잘 알려져 있는 것이며, 다음 설명과 실시예들을 통하여 더욱 명백해질 것이다.
본 발명의 일실시예에서, 금속 배위 결합 분자는, 개별 아미노산이 생물학적 표적에 유효한 측쇄를 제공하는, 펩티드를 통하여 얻어진다. 금속 펩티드의 라이브러리에서의 다양한 결합은 금속 이온과 배위 결합할 때, 거의 유사한 위상기하학을 가진 착물을 형성하는데 최대로 활용되는 일련의 펩티드에서 아미노산의 배열을 다양화함으로써 얻어진다. 이러한 활용은 예를 들면, 금속이온을 착물하는데 있어서 높은 친화성을 가진 아미노산의 적정한 위치 배열을 통하여 얻어진다. 금속 착물에 대한 높은 친화성을 가진 자연 생성 아미노산의 예로는 Cys와 His가 있다. 그러므로 그러한 펩티드의 라이브러리는 배열 속에 적절하게 놓여진 이러한 아미노산중 하나를 가지며, 그 라이브러리에서 이러한 아미노산은 모든 분자에 공통되며, 이러한 아미노산은 무작위화 된 것이 아니다. 지역적인 형태적 제한을 사용하여 구성된 금속 펩티드의 고체상 라이브러리에 대한 개념적인 일반화된 도면은 다음과 같다.
M은 금속 이온이며, R1, R2는 잠재적인 생물학적 영역 부분을 형성하는 무작위로 선택된 아미노산 측쇄이다. 유사한 라이브러리도 구성될 수 있으며 그 구성성분들이 용해될 수 있고, 수지와 결합하지 않는다.
그 구성 성분들이 형태적으로 금속 이온 착물에 구속되고, 지역적으로 구속된 금속 펩티드라이브러리의 일례는 RGD 배열을 인식하는 다양한 인테그린 리셉터족의 맞은 편에 있는 라이브러리이다. 이러한 라이브러리에서 개개의 아미노산 위치는 하나의 위치에 일련의 양이온 아미노산을, 또 다른 위치에 두 번째 일련의 음이온 아미노산과 세 번째 일련의 선택된 아미노산을 강한 금속 착물 특성을 지니고 선택함에 따라 변화한다. 펩티드에서 다른 위치는 무작위화될 수 있다. 이러한 라이브러리에서의 금속 펩티드착물의 일반적인 단단한 구조는 인테그린 리셉터와의 상호작용을 위하여 양이온 중심과 음이온 중심의 다양한 표시 형태를 허용한다. 이러한 구조의 라이브러리는 개별 인테그린 리셉터를 위한 특정한 금속 펩티드를 확인하는데 도움이 될 수 있다. 용해성일 수도 고체상 라이브러리일 수도 있으며, 금속 이온 착물에 우선하는 이러한 라이브러리의 일반적인 구조는 다음과 같다.
R1-Aaa-Bbb-Ccc-R2 (용해성 라이브러리)
또는
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-R2-수지 (고체상 바운드 라이브러리)
Aaa = Arg, Lys, Orn, homoArg, 2,3-다이아민 프로피오닉산, 2,4-다이아민부틸산, S-아미노에틸시스테인, 3(O-aminotheyl)Ser, 또는 다른 합성 기초 아미노산과 같은, 금속이온 착물에 N을 제공하는 L- 또는 D- 배열 잔기.
Bbb = Gly, Ala, Aib, Val, Nle, Leu 또는 하전되지 않은 측쇄를 지닌 유사한 아미노산과 같은, 금속 이온에 N 을 제공하는 L- 또는 D- 배열 잔기.
Ccc = Cys, HomoCys, Pen, Hism 또는 N과 S를 모두 포함하는 자연생성 또는 인공 생성의 , 또는 두 개의 N 중에 하나를 선택하는, 금속이온 결합 할 수 있는 다른 아미노산들과 같은 금속 이온 착물 가능하고, N과S 둘 다 또는 두 개의 N 중 하나를 제공하는 L- 또는 D- 배열 잔기.
Ddd = Asp, Glu, 또는 음전하 측쇄 작용기를 가진 합성 아미노산과 같은 음전하 측쇄 작용기를 가진 L- 또는 D- 배열 잔기.
R1, R2 = H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐,알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬록시카르보닐, 아릴록시카르보닐 또는 직접 또는 카르보닐기를 통하여 결합되는 PEG, PVA, 폴리 아미노산과 같은 중합체.
이러한 라이브러리의 다른 형태는 아래에 설명하는 양이온 중심과 음이온 중심 의 공간적 거리가 상기 설명한 것과 차이가 나는 일반적인 공식을 가진 구조들을 포함한다.
R1-Bbb-Aaa-Ccc-Ddd-R2 (용해성 라이브러리)
R1-Bbb-Aaa-Ccc-Ddd-R2-수지 (고체상 라이브러리)
그리고
R1-Bbb-Aaa-Ccc- Aaa-R2 (용해성 라이브러리)
또는
R1-Bbb-Ddd-Ccc-Aaa-R2-수지 (고체상 라이브러리)
그리고
R1-Ddd-Bbb-Ccc-Aaa-R2 (용해성 라이브러리)
또는
R1-Ddd-Bbb-Ccc-Aaa-R2-수지 (고체상 라이브러리)
상기 공식 각각에 있어서, R1, R2, Aaa, Bbb, Ccc, Ddd의 정의는 상술한 것과 같다. 상기한 네 개의 라이브러리의 클래스 는 각각 합성되거나 하나의 라이브러리로 만들어질 수 있다.
본 발명에 의하여 구성된 생물학적 지역적으로 제한된 금속 펩티드의 표적에 특정적으로 유효한 라이브러리의 또 다른 예는 터프트신 모사물이다. 터프트신, 테트라펩티드 Thr-Lys-Pro-Arg는 천연 식균작용 촉진제이다. 이러한 분자 라이브러리의 기초적인 기준(criteria)은 금속 펩티드착물에 의하여 형성된 일반적인 딱딱한 구조적 주형과 유사하며, 적어도 적절하게 배치된 하나의 아미드산은 금속 이온과의 강한 초기 결합을 형성하는 경향을 강하게 띠며, 측쇄가 있는 아미노산은, 생물학적 표적 리셉터에의 결합을 가능하게 한다. 다양한 일반 구조의 일례로 다음과 같은 것을 들 수 있다.
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-Eee-R2 (용해성 라이브러리)
또는
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-Eee-R2-수지 (고체상 라이브러리)
상기 식에서,
Aaa = THr, Cys, Pen, Pro, Ser, 또는 유사한 중성 아미노산과 같은 L- 또는 D- 배열 중성 잔기와 그 부수적인 des-amino 유도체.
Bbb = Arg, Lys, Orn, homoArg, 2,3-디아민 프로피오닉산, 2,4-디아민 뷰티릭산, S-아미노에틸시스테인, S-아미노프로필 시스테인 또는 다른 기초 아미노산과 같은 금속 이온 착물을 위한 N 을 제공하는 L- 또는 D- 배열 기초 잔기.
Ccc = Gly, Ala, Aib, Val, Nle, Leu 또는 하전되지 않은 측쇄를 가진 유사한 아미노산과 같은 금속 이온 착물을 위한 N을 제공하는 하전되지 않은 측쇄를 가진 L- 또는 D- 배열 잔기.
Ddd = Cys, HomoCys, Pen, His 또는 N과 S를 둘 다 가진, 또는 두 개의 N중 하나를 가지고 금속 이온 결합이 가능한 다른 아미노산과 같은 금속 이온 착물을 할 수 있는 N과 S를 둘 다 가진, 또는 두 개의 N중 하나를 제공하는 L- 또는 D- 배열 잔기.
Eee = Arg, Lys, Orn, homoArg, 2,3-디아민 프로피온산, 2,4,- 디아민 낙산, S-아미노에틸 시스테인, S-아미노프로필 시스테인, 또는 다른 기초 아미노산과 같은 L- 또는 D- 배열 기초 잔기.
R1 = H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬록시카르보닐, 아릴록시카르보닐, 또는 직접 또는 카르보닐기를 통하여 결합되는 PEG, PVA, 또는 폴리아미노산과 같은 폴리머.
R2 = 아미드, 대체 아미드, 에스터, PEG, PVA 또는 폴리아미노산과 같은 폴리머.
본 발명의 다른 일실시예는 전체적인 형태적 제한을 가진 금속 펩티드라이브러리의 구성을 제공한다. 이러한 유형의 라이브러리는 금속 펩티드를 에워싸며, 그 안에서 금속 결합 영역은 순환기 펩티드에서 디설파이드, 락탐, 락톤, 티오에테르, 티오에스테르 부분에 대한 대체품이다. 이러한 구성에 있어서, 금속 결합 부위는 생물학적 작용 도메인을 포함하고 있는 직선형 펩티드의 두 개의 미리 선택된 말단기(end) 사이에 위치한다. 이러한 유형의 금속 펩티드라이브러리의 일반 구조는 다음과 같다.
상기 식에서 M은 금속 이온, R1 과 R2는 기관 청정성(organ of clearance)을 결정하거나, 약물동력학의 생체 배분 패턴을 변경하는 것과 같이 금속 착물에 안정성을 더해주거나, 생물학적 활성도를 조절하는 구조적 원소이다.
전체적으로 구속된 금속 펩티드라이브러리의 일례는 라이브러리의 모든 구성성분이 금속 이온 결합 영역을 포함하는 펩티드 라이브러리이며, 그 라이브러리는 소마토스태틴, 콜레시스티키닌(cholecystikinin), 오피오이드 펩티드, 멜라노트로핀, 황체형성 호르몬 방출 호르몬, 택티티닌(tachykinin) 그리고 유사한 펩티드 호르몬과 같은 펩티드 호르몬 클래스에 특별히 지정된다. 금속 이온에 착물되기 전의 이러한 펩티드 라이브러리의 일반식은 다음과 같다.
상기 식에서 X는 복수의 아미노산을 포함하는 금속 이온 킬레이팅 영역이며, 금속 이온의 모든 원자가는 X와의 금속 이온 착물에 있어서 충족된다.
상기 식에서 R1, R2는 각각 0 내지 약 20 아미노산을 포함한다.
상기 식에서 R3는 0 내지 약 20 아미노산을 포함한다.
상기 식에서 Aaa와 Bbb는 각각 하나의 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 에스터, 카르바메이트, 우레탄 결합을 통하여 X에 연결되는 아미노산을 포함한다.
상기 식에서 R3 은 단독으로 또는 R1 또는 R2 각각과 또는 R1 와 R2와 함께 결합하여 생물학적 작용 도메인을 형성하거나 한정한다.
펩티드 구성의 고체형 라이브러리는 수지에 부착되고, 용해성 라이브러리의 경우에는 수지가 제외된다. 이러한 전체적으로 구속된 금속 펩티드의 라이브러리는 가설상의 생물학적 활성 구조로서 반전 구조 속에 존재하는 것으로 알려진 다양한 펩티드도미메틱들인 합성물을 찾아내기 위하여 스크린될 수 있다. 이러한 예로는 소마소스태틴, 콜레시토키닌, 오피오이드 펩티드, 멜라노트로핀, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 태키키닌과 다양한 항체 에피토프와 같은 여러 가지 펩티드 호르몬이 포함된다.
이러한 각 펩티드 라이브러리의 기능적 등가물은 비아미노산 구축 차단의 발달을 통하여 얻어지고, 이러한 펩티드의 구조적 모사물을 형성한다. 펩티드 결합은 티오아미드, 티오에테르, 대체 아민, 카르바네이트, 우레탄, 지방성 부분, 기능적으로 유사한 구조체들과 같은 슈도펩티드 접합에 의하여 대체될 수 있다.
금속 펩티드라이브러리는 후(post)합성 펩티드, 슈도 펩티드, 비 펩티드, 펩티도미메틱 변형에 의하여 얻어진다. 펩티드 라이브러리는 상기한 바와 같이 펩티드 합성의 방법으로 잘 알려진 배열 가공과 변성에 따라 최초로 만들어진다. 이러한 라이브러리는 스플릿 합성 방법을 사용하여 또는 용해 가능한 라이브러리의 희석 기술을 사용하여 평행 합성에서 식별할 수 있고, 공간적으로 인지가 가능한 화합물로서 합성될 수 있다. 유사한 방법을 사용하여, 슈도펩티드, 펩티도미메틱이나 비 펩티드라이브러리를 얻을 수 있다. 또한, 비 펩티드 라이브러리는 본 발명의 기술 분야에 속하는 여러 가지 택(tagging) 방법중 하나를 포함할 수 있다. 고체상 라이브러리와 용해성 라이브러리 모두 이러한 방법으로 얻을 수 있다. 전체 라이브러리는 적절한 금속 착물제와 반응하여 미리 한정된 구조를 가진 유사한 클래스를 포함하여상응하는 금속 배위 결합된 라이브러리를 생성한다. 예를 들면 rheniumoxo 금속 이온을 가진 펩티드 라이브러리를 착물하기 위하여, 펩티드 라이브러리는 아세트산 나트륨의 존재 하에 옥서트리클로로비스(트리페닐로포스핀)레늄[V]로 처리한다. 이러한 처리는 펩티드와 함께 ReO[V]의 양적인 착물을 만들어낸다. Zn, Co, Mn, Fe, Cu 이온을 착물하기 위하여, 펩티드 라이브러리는 염화물이나 이러한 금속 이온의 다른 적절한 염으로 처리하여 상응하는 금속 이온의 라이브러리를 생성한다. 본래, 다양한 금속 이온이 여러 가지 금속 펩티드를 구성하는데 사용되어 질 수 있다. 적절한 금속 이온을 선택하는데 있어서 하나의 제한적 요인은 금속 펩티드결합 상수나 상수와 크게 관련이 있는 특정 금속 펩티드착물의 상대적 안정성이다. 몇몇 금속 펩티드구조체가 특정한 PH에서 또는 특정한 상황하에서 안정적이며 공기 중에서 쉽게 산화된다는 것은 인용 문헌에서도 잘 알려져 있다. ReO[V] 를 가지고 있는 펩티드 금속 이온 착물과 같은 몇몇 펩티드 금속 이온 착물은 순수한 형태에서 안정적이며, 정상적인 보관 상태에서 장시간동안 단리되어 보관될 수 있다.
본 발명에 의하여 구성된 금속 펩티드라이브러리는 하나 이상의 리셉터 결합 또는 약학적으로 활성적인 후보를 선행 기술에 기재된 다양한 기술을 이용하여 확인하기 위하여 스크린 될 수 있다. 용해성 라이브러리와 고체상 라이브러리는 이러한 시험에서 둘 다 사용될 수 있다. 이러한 기술에는 Lam 과 공동 연구자들(Lam KS et al: Nature 354:82-84, 1991; Lam KS et al: Nature 360:768, 1992)에 의하여 기술된 직접적인 표적 결합 방법, 희석 반복 재합성방법(Houghten RA et al: Proc Natl Acad Sci USA82:5131-5135, 1985; Berg et al : J Am Chem Soc 111: 8024-8026, 1989; Dooley CT et al: Science 266: 2019-2022, 1994; Blondelle SE: Antimicrob Agents Chemother 38: 2280-2286, 1994; Panilla C: Biopolymers 37:221-240, 1995), Tartar와 공동 연구자들 (Deprez B et al: J Am Chem Soc 117:5405-5406, 1995)에 의하면 두 개의 상호 합성 라이브러리의 직교 풀을 사용한 방법, Houghton 과 그의 공동 연구자들에 의하여 고안된 반복 재합성을 없애는 위치적 스캐닝 방법(Dooley CT et al: Life Sci 52:1509-1517, 1993; Pinilla C et al:Biotechnique 13:901-905, 1992; Pinilla C et al: Drug Dev Res 33:133-145, 1992), split 합성 방법과 위치적 스캐닝 방법의 합성(Erb E et al: Proc Natl Acad Sci USA, 91:11422-11426, 1994) 등이 포함된다.
이러한 기술 방법 중에는, 디콘볼루션과 반복적인 재합성법, 두 가지 상호 합성된 라이브러리의 직교하는 푸울과 관련된 방법, 위치적인 스캐닝 방법은 직접적으로 가용성 금속 펩티드 라이브러리에 직접 적용하여, 이 스크린 과정에서 리셉터 결합성 또는 의약학적 활성 후보물로서 동정된 펩티드 또는, “히트(hit)”의 구조를 밝힐 수도 있다. 고체상 라이브러리, 공간적으로 식별 가능한 평행 합성 라이브러리 이외의 경우, 히트의 구조는 이 분야의 숙련가에 기지된 현재의 다양한 방법으로 직접적으로 결정될 수 있다. 여기에는, 세포간질 지지된 레이저 분해/이온화(MALDI) 기법(Siuzadak G et al: Bioorg Med Chem Lett 6:979, 1996; Brown B B et al: Molecular Diversity 1:4-12, 1995)을 사용함으로써 입자들의 고체상 세포간질에 공유 결합되어 있는 화합물들의 직접적인 질량 분광 분석법이 포함된다. 라이브러리 어셈블리하는 동안에 각각의 합성 단계에서 일련의 부분적으로 말단-차단된 화합물들을 생성시키는 기술 방법은 또한 질량 분석기에 의한 불분명한 동정에 도움이 된다(Youngquist RS et al: J am Chem Soc, 117:2900-3906, 1995; Youngquist RS et al: Rapid Commun Mass Spectr 8:77-81, 1994). 이같은 분석 기법에 부가하여, 비펩티드 및 비뉴클레오티드 라이브러리를 포함하는 유기 분자-기초 라이브러리에서 구조상의 특징으로 분류되는 다양한 코드화 방법이 사용될 수도 있다. DNA 코드화, 펩티드 코드화, 할로겐방향족 택(tag) 코드화 및 무선주파수 트랜스폰더를 기초로한 코드화 등의 다양한 코드화 방법들이 이 기술 분야에 공지된 바이며, 금속 펩티드 라이브러리에 직접 배합하여 사용할 수 있다. 이같은 택을 하는 방법들은 라이브러리 합성 동안에 택을 첨부하는 반응이 필요한데, 금속 착물화 반응이 최종적인, 후-합성 단계이기 때문에, 금속 펩티드 라이브러리의 구성 동안에 완수될 수 있다.
산업적 및 비의약적 응용. 본 발명에 의해 제조된 펩티드들은 다양한 산업적, 농업적 및 그 외의 비의약적 분야에서 광범위하게 이용될 수도 있다. 본 발명의 펩티드와 그 방법들은 펩티드 작용제(peptidomimetics)와 그 외의 본문에 기재한 펩티드 변형믈을 포함하는 펩티드의 그 어떤 용도에 사용하는데, 펩티드는 잘 구분이 된 이차 구조를 갖는 것이 바람직하다. 여기에는 리간드와 그의 리셉터 사이의 특정 상호작용을 형성하는 펩티드와 같이, 특정 인식 영역이나, 생물학적 작용 범위의 그 외의 활성의 또는 작용기의 등가물과 결합된 펩티드가 필수적으로 포함된다. 이같은 방법들은 특히, 약 20 개 미만의 아미노산으로 이루어진, 적은 펩티드에 유용한데, 구조 형태적으로 한정되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 펩티드는 그 어떤 상업적 또는 산업적 공정이나, 구조적으로 한정된 펩티드가 필요하거나 사용이 가능한 분야에 사용되어도 좋다. 여기에는, 쇠약함 개선제, 촉매성 펩티드, 효소성 펩티드, 표지제와 진다 시스템, 살충제, 동물 의약, 백신 등과 같은 용도가 포함된다. 상업적이나 산업적 공정 또는 그 적용에 사용된 본 발명의 펩티드는 펩티드에 콘쥬게이트되거나, 아니면 결합될 수 있는 그 어떤 작용제나 시약에 대한 담체로서 공급되거나, 촉매적 또는 효소적 펩티드와 같은 본래의 생화학적 특성을 갖는 펩티드로서 디자인될 수도 있다. 이러한 펩티드류는 차단제로서 제공될 수도 있는데, 특정 리셉터와 결합하여 그 어떤 신호도 투과시키지 않거나, 그 어떤 생화학적 반응에도 참여시키지 않도록 디자인된다. 대개의 경우에는, 금속 이온이 제공되어 이 펩티드를 구조적으로 제한시키지 않는다면, 그 자체만으로는 펩티드의 효과가 발현되지 않을 것이다. 하지만, 가능한 응용법에는 이 금속 이온이 진단 시스템의 본래의 일부분인 것이나, 이 금속 이온이 부분적으로 추가 효과를 갖는 것이 포함된다. 여기에는, 금속 이온이 상업적이나 산업적 공정 및 그 적용을 위해 방사선 활성인 금속 이온 펩티드의 용도가 포함되는 데, 이에 한정되는 것은 아니다.
신진대사 안정성 및 생체 적합성. 일반적으로 펩티드류는 효소에 대해 불한정하다. 펩티드 특정 프로테아제를 포함하는, 세린 프로테아제, 카르복시펩티다제, 아미노펩티다제, 엔도 및 엑소-펩티다제 등과 같은 다양한 펩티다제류는 펩티드를 분해하여 생물학적으로 불활성화시킨다. 주요 분해 부위는 연속적인 아미노산 두 가지 사이의 펩티드(또는 아미드) 결합인데, 분해 반응은 효소의 활성 부위의 특정 친핵체에 의한 친핵성 공격에 의해 야기된다. 본 발명의 금속 구조체, 특히 본 발명의 금속 펩티드류는 펩티다제와 효소 분해 반응에 대한 높은 내성을 갖으며, 이같은 내성은 본 발명에 의한 구성의 특성이자 장점이다. 특정 이론적 근거 없이, 금속 이온 착물에서 펩티드 결합의 질소 배위 결합은, 효소의 친핵성 공격을 입체적으로 차단할 수 있는 방식으로 아미드 카르보닐기 쪽으로 위치를 정한다는 가설을 설정한다. 따라서, 이 입체 화학으로부터 본 발명의 금속 펩티드류가 단백질 가수분해 효소에 대해 매우 안정해진다. 추가로, 이같은 구조체의 형태상의 경직성 또한 다수의 효소의 활성 부위의 적절한 일치가 불가능하게 한다.
다수의 본 발명의 99mTc 표지된 구조체는 설치 동물로 테스하였다. 시험된 금속 펩티드류 전부가 이 동물들의 소변을 통해 손상되지 않은채 분비되었다. 경구 투여된 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg는 인위적으로 유도된 마우스의 염증 부위에 배치되고(도 14), 소변을 손상되지 않고 배설되는 것을 관찰하였다. 따라서, 이같은 구조체가 소화관 효소 및 흡수 이후의 혈청에서 발견되는 펩티다제와 효소의 존재 하에서 안정성을 갖는다고 추정되었다.
생체 적합성 및 약물 역학성을 증진시키기 위한 금속 구조체의 용도. 본 발명의 또다른 구체적인 예로서는, 금 속 이온들이 펩티드와 착물을 이루고 나머지 유기 분자들이 이 금속 구조체에서 구조적 변화를 일으켜서, 소화관-혈액 및 혈액-뇌 장벽들을 통해 이 금속 구조체의 전달을 변형시켜 세포 조직을 통한 전달을 증가시키며, 일반적으로 생체 적합성을 증가시킬 수도 있다. 이 금속 구조체는 금속 이온과 착물을 이루지 않은 구조체보다 좀더 용이하게 그의 표적 기관이나 세포기관에 도달하거나 침투된다. 따라서, 금속 이온 착물화는 분자 구조를 변형시켜, 그의 약물 역학적 특성이나 생체 적합성을 변화시킨다. 착물화되지 않은 모분자는 생물학적 활성을 갖고 그의 생물학적 활성은 금속 이온과의 착물의 결과로서 손상을 입을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
또한, 금속 구조체를 금속 이온이 표적 부위에서 분해되어 생물학적 활성을 갖는 착화되지 않은 구조체를 방출하도록 설계할 수도 있다. 이러한 경우에는, 금속 착물화는 조직 장벽을 통해 이 분자를 전달하는 데 유리하다. 이 금속 분해 과정은 특정 프로테아제의 방출, 생체내 산화 과정, 조직 배지의 pH 또는 금속 이온의 트랜스킬레이션(transchelation)을 포함하는, 표적 조직 특정 생물학적 현상을 야기시킬 수도 있다.
예를 들면, 오피오이드 펩티드-금속 착물은 혈액-뇌 장벽을 통과하도록 고안될 수도 있다. 디설파이드 함유 오피오이드 펩티드, [D-Pen2.5]엔케팔린, 및 두 개의 유리 수황기 [D-Pen(SH)2, D-Pen(SH)5]엔케팔린을 갖는 그 해당 환원 동류물은 모두 생물학적 활서을 갖는 것으로알려져 있지만, 이들이 혈액-외 장벽을 통과할 수 없기 때문에 전신 경로를 통해서 투여될 경우에는 진통 효과를 나타내지 않는다(Matsunaga TO, Collins N, Yamamura S, Ramawami V, O'Brien DF, Hruby VF: Comparision of the membrane bound stses of two structurally similar delta selective opiod peptides by transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy and molecular modeling. Biochem 32;13180-13190, 1993). 그의 수황기를 통한 [D-Pen(SH)2, D-Pen(SH)5] 엔케팔린과 Cu, Zn 또는 ReO(V) 등의 금속 이온과의 착물화 반응은 이 분자의 물 회합 및 수소 결합 특성을 변형시켜, 혈액-뇌 장벽을 통한 전달을 촉진시킨다.
펩티드 디자인의 예. 금속 결합 서열을 함유하는 환형으로 형성된 펩티드의 디자인, 및 두 가지 펩티드 구조체에 대한 일반적인 디자인의 주안점은 다음과 같다. 이같은 디자인의 주안점, 및 그의 변형이 생물학적 작용-영역, 또는 리간드 구조가 알려진 그 어떤 경우에라도 이용될 수도 있다.
RGD 유사체 구조체. 생물학적 작용 도메인과 금속 펩티드 골격이 조합된, 국부적으로 한정된 펩티드류는 트리펩티드 서열 Arg-Gly-Asp(RGD)의 유사체를 기초로 제조하였다. 다수의 세포외 세포간질 단백질에 연관된 RGD 펩티드는 소위 인테그린스(integrins: Craig WS et al: concepts and progress in the development of RGD-containing peptide pharmaceuticals. Biopolymers(Peptide Sci) 37:157-175, 1995)라는 다양한 이종이원열 리셉터(heterodimeric receptors)와 상호 작용하여, 세포-세포 유착, 혈관 응고 및 맥관형성을 포함하는 다양한 세포 및 혈관 작용을 매개한다. 혈소판 응집과 혈액 응고를 매개하는 인테그린 리셉터는 αIIb-β3 수사슬데, 또한 인테그린 이종이원열 당단백질 IIb/IIIa(GP IIb/IIa), 혈소판 표면에서 발견되는 경막성 단백질(transmembrane protein)이라고 일컫기도 한다. 맥관형성과 관련된 인테그린 리셉터는 αV-β3 리셉터이다. 다수의 RGD 기초 리간드는 심근 경색증 치료용인 혈소판 유착의 길항근(예컨대, Jackson S et al: Template-constrained cyclic peptides: Design of high-affinity ligands for GP IIb/IIIa. J am Chem Soc 116:3220-3220, 1994 참조), 종양 생장을 쇠퇴 및 종식 시키기 위한 항-맥관형성제(Brooks PC et al: Integrin αV-β3 antigonists promote tumor regression by including apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 79:1157-1164, 1994; Pfaff M et al: Selective recognition of cyclic RGD peptides of NMR defined conformation by αIIb-β3, αV-β3 and α5-β1 integrins. J. Biol. Chem. 269:20233-20238, 1994; Bach II AC et al: Type II' to type I β-turn swap changes specificity for integrins. J. Am. Chem. Soc. 118:293-294, 1996), 골질 재흡수 억제제(Duggan ME et al: Design and evaluation of potent non-peptide ligands of αV-β3 as inhibitors of bone resorption. 211th National Meeting of the American Chemical Society, New Orleans, LA, March 24-28, abstract No. 234, 1996) 및 세포 간질 합착을 촉진시키고, 이식된 조직과 기관의 거부 반응, 및 다수의 그외 증상들을 억제시키는 생체 적합성 코팅제(Craig WS et al: Concepts and progress in the development of RGD-containing peptide pharmaceuticals. Biopolymers(Peptide Sci) 37:157-175, 1995)로서 개발되어 왔다.
GP IIb/IIIa 이종이원열 복합체는 RGD 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 혈소판 자극제에 대한 형태를 변화시킨다. 뱀의 독액 등으로부터의 에키스테틴(echistatin)과 같은, 다양한 출원처를 갖는 다수의 천연 펩티드는 GP IIb/IIIa 리셉터와 결합하기 위한 통상적인 동인으로서 RGD 서열을 함유한다. RGD 동인을 통한 피브리노겐의 결합은 혈소판의 활성을 야기시킨다. GP IIb/IIIa 리셉터와 결합하는 피브리노겐을 차단시켜, 혈소판 응집을 억제시킬 수 있는 RGD 서열의 유사체는 심근 경색증 치료용 양상으로서 연구 진행중이다. 추가적으로, 이같은 작용제의 방사선 표지된 유형들은 다양한 유형의 혈전에 대한 생체내 형상화제로서 가능하다.
본 발명의 방법을 사용하여 입체 배열적으로 한정된 펩티드를 구성하기 위해서는, 테크네튬(또는 레늄) 금속 이온과 결합하는 펩티드 분자 구조체로서, 금속 이온과 결합한 후에 혈소판 피브리노넥틴(fibrinonectin) 리셉터와 결합할 수 있는 구조체는 환원된 테크네튬(또는 레늄)옥사이드[V] 핵중심의 가능한 4 가의 원자가가 이 금속과 착물을 이룰 수 있는 펩티드 서열과 배위 결합하도록 디자인되었다. 특히 테크네튬이나 레늄 금속 이온과 결합한 N3S1 금속 이온 복합 골격을 제공하는 트리펩티드 서열을 출발물질로서 이용하였다. RGD 서열의 생물학적 결합을 모사하기 위해서는, GP IIb/IIa 복합체와 접하는 리셉터를 제조하기 위해 필요한, 두 가지의 가장 중요하고 일차적인 구조적 요건이, 리셉터 활성 서열 Arg-Gly-Asp(RGD 서열)을 함유하는 전형적인 피브리노넥틴 펩티드에서의 Arg와 Asp 잔기의 측쇄와 유사하게 음으로 하전된 측쇄와 양으로 하전된 측쇄라고 결정되었다. 이같은 두 가지의 측쇄를 갖는 금속-펩티드 골격을 개량 변형시켜(decorating), 혈소판 피브리노넥틴 리셉터에 대한 후보 물질(candidate)이라고 예상되는, 테트라펩티드 Arg-Gly-Cys-β-Ala를 모사한 RGD을 생성시켰다. 광학 활성 아미노산의 측쇄에 대한 입체 화학, 생성된 펩티드이 생체내 안정성의 개선, 생체내 혈액 체류 시간 증진, 및 바람직한 배열 형태로 금속 이온과의 착물화의 용이성을 포함하는 그외의 요건에 대한 구조상에서의 추가 정제 과정을 수행하였다. 이같은 요건들을 기준으로 하여, 다음의 일반식을 갖는 펩티드를 디자인하였는데:
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-R2
식 중에서,
Aaa = Arg, Me-Arg, N-Me-Arg, Lys, Orn, homoArg, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, S-아미노에틸 시스테인, 3(O-아미노에틸)Ser 및, Lys, Orn, homoArg의 유사한 유도체 및 이성질체, 및 그 외의 유사한 염기성 아미노산과 같은, 금속 이온 착물화를 위한 N을 제공하고 양으로 하전된 측쇄를 갖고 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Bbb = Gly, Ala, Aib, Val, Nle, Leu 및 하전되지 않은 측쇄를 갖는 유사한 아미노산과 같은, 금속 이온 착물화를 위한 N을 제공하고 하전되지 않은 측쇄를 갖는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Ccc = Cys, HomoCys, Pen, His 및 그외의 합성 또는 유도 아미노산과 같은, 금속 이온 착물화를 위한, S, 바람직하게는 S와 N, 또는 N 두 개를 제공하는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Ddd = β-Ala, N-Me-β-Ala 및, β-Ala의 상급 상동물(higher homologues), Asp, N-Me-Asp, Glu, N-Me-Glu 및 그 외의 그 합성 또는 유도 아미노산 또는 유리 α-카르복실기 를 갖는 하전되지 않은 아미노산과 같은, 음으로 하전된 측쇄를 갖는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
R1 = H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬록시카르보닐, 아릴록시카르보닐 또는, PEG, PVA 또는 카르보닐기에 직접 또는 경유하여 결합된 폴리아미노산과 같은 폴리머.
R2 = Ddd가 β-Ala, N-Me-β-Ala 및, β-Ala의 상급 상동물 이외의 것이라면, R2는 아미드 또는 치환된 아미드.
이같은 계열로부터 대표적인 펩티드에는 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala와 PEG-CO-D-Arg -Gly-D-Cys-β-Ala가 포함된다. 이같은 펩티드들은 환원된 Tc=O[V]와의 이들의 결합 후의 응고물 결합 분석에서 GP IIb/IIIa 혈소판 리셉터에 대해 매우 높은 친화도(KD = 5～10 nM)를 나타낸다. 금속 이온과 착화되지 않은 펩티드는 비활성이든지 매우 약한 활성도를 갖는다(KD ≥ 1 mM).
테크네튬과 결합한 후의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드의 구조는 다음과 같다:
도 2는 테크네튬과 펩티드의 결합 후의 전체 펩티드의 3 차원 예측 골격을 확대 입체도로 나타낸 것이다. 도 2A와 도2B는 메탈옥소기의 이성질체에 의해 생성되는 두 가지 이성질사슬데, 도 2C는 도 2A와 도 2B의 겹친 도면으로, 이 두 가지 이성질체에서 생물학적 연관성을 갖는 아미노산 측쇄의 형태상 상동 관계를 보여준다. 이 구조체는 마찬가지로 ReO[V]나 그 외의 적절한 금속을 기초로 할 수 있는데, 방사선 활성이거나 불활성일 수도 있다.
다음 일반식의 펩티드도 또한, 금속이온으로 표지될 경우, RGD 서열의 유사체로서 이용할 수 있는데:
R1-Bbb-Aaa-Ccc-Ddd-R2
R1-Bbb-Ddd-Ccc-Aaa-R2, 또는
R1-Ddd-Bbb-Ccc-Aaa-R2
식 중에서, 각 성분들은 일반식 R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-R2를 갖는 펩티드에 대해 상기한 바와 같은 정의를 갖는다.
다수의 금속 펩티드 구조체는 αIIb-β3, αv-β3 및 α5-β1 리셉터와 같은 다양한 인테그린 리셉터에 대한 RGD 서열의 유사체로서 합성되었다. 이같은 구조체들은 99mTc 또는 ReO[V]와 결합하도록 합성되었다. 다음 구조체들을 Re 표지되는 것으로 합성하였다(금속 이온-결합 영역이라고 추정되는 꺽음 괄호로 나타내었음).
Reo[V]-[Arg-Gly-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[D-Arg-Gly-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[D-Lys-Gly-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[D-Lys-Gly-Cys]-Gly
Reo[V]-[Gly-Arg-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[Gly-D-Arg-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[Gly-Arg-D-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[Gly-D-Arg-D-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[D-Arg-D-Phe-D-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[D-Arg-Gly-D-Cys]
Reo[V]-[Arg-Gly-D-Cys]
Reo[V]-C6H5-CH2-CO-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala
Reo[V]-[Phe-Arg-D-Cys]-β-Ala
Reo[V]-HOOC-(CH2)2-CO-[Phe-Gly-Cys]-Arg
Reo[V]-HOOC-(CH2)4-CO-[Gly-Lys-Cys]
Reo[V]-HOOC-(CH2)5-CO-[Gly-Lys-Cys]
터프트신 리셉터 펩티드 구조체. 생물학적 작용 도메인과 금속-펩티드 골격이 배합된, 다형핵(PMN: polymorphonuclear) 과립성 백혈구, 단핵 세포 및 대식구에서 발견되는 터프트신(tuftsin) 리셉터에 특정적인, 국부적으로 한정된 펩티드는 마찬가지의 경로와 방법을 이용하여 디자인하였다. 천연 터프트신은 Thr-Lys-Pro-Arg의 서열을 갖는 테트라펩티드인데, 로이코키닌(leukokinin: 세포친화성γ-글로불린)의 거대 사슬(heavy chain)의 Fc 영역의 잔기 289-292로서 존재한다. 2 회 분할의 조합에 의해 유리된다. C-말단 펩티드 결합은 비장 효소에 의해 비장에서 분해되고, 식작용을 촉진시키는 작용을 하는 과립성 백혈구의 막조직에서 생성되는 로이코키니나제에 의해 N-말단 펩티드 결합이 후속으로 분해된다. 터프신 서열은 대식 세포들과 다형핵 과립성 백혈구를 자극하여 식작용을 촉진시킨다. 따라서, 이 서열은 면역 시스템 반응에서 감염증 및 박테리아와 그 외의 침해을 저지하는 역할을 한다. 과립성 백혈구와 대식 세포에 존재하는 특정 터프트신 리셉터가 있다. 이 리셉터 밀도는 결합 후에 흡수하는 것으로 보고된 리셉터-터프신 복합체로 대략 세포당 50,000-100,000이다. 따라서, 참고문헌으로 첨부된 VA Najjar의 미국 특허 제 4,390,528 호와 K Nishioka의 미국 특허 제 5,028,593 호에 일반적으로 개시된 바와 같이, 터프신 리셉터에 특정적인 펩티드를 그 어떤 질병 치료에 사용할 수도 있다. 이같은 펩티드는 또한 99mTc와 같은 특징적인 금속 이온으로 방사선 표지되어, 감염이나 염증과 같은 과립성 백혈구와 대식 세포가 농축된 부위를 검진하느 sep 사용하거나, 186Re 또는 188Re 등의 치료용 금속 이온으로 방사선 표지되어 질병을 치료하는 데 사용할 수도 있다.
다음 구조의 전구 펩티드를 금속 이온-결합 골격, 및 생물학적 작용 도메인을 결합시키도록 디자인하였는데, 생물학적 작용 도메인이 금속 이온-결합 골격과 금속 이온을 착물화시키거나 표지시킴으로써만 생물학적 활성을 갖는다:
R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-Eee-R2
식 중에서,
Aaa = Thr, Cys, Pen, Pro 또는 Ser 및 해당 데스(des)-아미노산 유도체로 이루어진 군 중에서 선택된 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Bbb = Arg, Lys, Orn, homoArg, S-(2-아미노에틸)Cys, O-(2-아미노에 틸)Ser 및 그 외의 유사한 염기성 아미노산 및 그의 유도체와 같은, 금속 이온 착물화를 위한 N을 함유하고 양으로 하전된 측쇄를 갖는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Ccc = Gly, Ala, Aib, Val, Nle, Leu 및 하전되지 않은 측쇄를 갖는 유사한 아미노산과 같은, 금속 이온 착물화를 위한 N을 함유하고 하전되지 않은 측쇄를 갖는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Ddd = Cys, HomoCys, Pen, His 및 그외의 합성 또는 유도 아미노산과 같은, 금속 이온 착물화를 위한, S, 바람직하게는 S와 N, 또는 N 두 개를 제공하는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기.
Eee = Arg의 L- 또는 D- 이성질체, Lys, Orn, homoArg, S-(2-아미노에 틸)Cys, O-(2-아미노에틸)Ser 및 그 외의 유사한 염기성 아미노산, 및 그의 해당 데스-카르복시 유도체오 같은 양으로 하전된 측쇄를 갖는 L- 또는 D- 배열 형태의 잔기(염기성 작용기를 갖는 유사한 지방족 또는 방향족 사슬도 또한 치환이 가능함).
R1 = H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬록시카르보닐, 아릴록시카르보닐 또는, PEG, PVA 또는 카르보닐기에 직접 또는 경유하여 결합된 폴리아미노산과 같은 폴리머(Aaa가 데스-아미노산이라면 R1은 삭제됨).
R2 = 아미드, 치환된 아미드, 에스테르 또는 PEG, PVA 또는 폴리아미노산과 같은 폴리머(Eee가 데스-아미노산이라면 R2는 삭제됨).
이같은 계열 중에서 대표적인 펩티드 한 가지는 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg이다. 이 펩티드는 환원된 TcO[V]와의 결합 이후에 인체 백혈구에 대한 친화도가 매우 높은 것으로 나타난다. 방사선 활성을 갖는 99mTcO[V]와 착물을 이룰 경우에, 이 펩티드는 정맥 투여로 염증이나 감염 부위에 위치하게 된다. 금속 이온과 착물을 이루지 않은 펩티드의 친화도는 KD = 10-4 M 정도이다.
테크테늄과 결합한 후의 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드의 구조는 다음과 같다:
이 펩티드도 마찬가지로 Re로 표지될 수 있다. 도 3은 테크네튬과 펩티드 결합 후의 전체 펩티드의 3 차원 예측 골격을 확대 입체도로 나타낸 것이다. 도 3A와 도 3B는 메탈옥소기의 이성질화에 의해 생성되는 두 가지 이성질사슬데, 도 3C는 도 3A와 도 3B의 겹친 도면으로, 이 두 가지 이성질체에서 생물학적 연관성을 갖는 아미노산 측쇄의 형태상 상동 관계를 보여준다. 또한, Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg와 같이, 유사한 펩티드를 N4 금속 이온-결합 영역을 이용하여 디자인 및 합성할 수도 있다.
금속-결합 서열을 함유하는 전체적으로 구속된 펩티드. 본 발명을 이용하여, 생물학적 작용 도메인과 금속-펩티드 골격이 구조적으로 별개이고 분자내에서 분화될 수 있지만, 금속-펩티드 골격과 금속 이온과의 착물 형성이 생물학적 작용 도메인의 구조형태를 한정시켜 금속 이온 착물화시에 표적의 특이성 및/또는 친화성이 실질적으로 증가할 수 있도록 구성된, 구형으로 구속된 펩티드를 설계하고 제조할 수 있다. 일례로서, 모펩티드의 디설파이드, 락탐 또는 락톤 결합을 대체하는 금속 결합 영역으로 이루어진 분자를 디자인하였다. 이소에스테르기를 펩티드에서 디설파이드를 형성시키는 두 개의 시스테인이나, 펩티드에서 락탐 또는 락톤 결합을 형성시키는 두 개의 아미노산에 위치하도록 디자인하였다. 이 금속 결합 영역에 금속 이온이 착물을 형성하지 않은 경우에, 분자는 구조 형태상으로 원래의 디설파이드 또는 락탐 또는 락톤 결합보다 훨씬 자유롭게 되어서, 이 생물학적 작용 도메인을 생물학적 불활성화하던지 효능을 저하시킨다. 하지만, 이 금속 결합 영역에 금속 이온이 착물을 형성할 경우에는, 이 분자의 구조 형태가 디설파이드, 또는 락탐, 또는 락톤 결합에 의해 생성되는 것과 마찬가지 방식으로 경직성을 갖게 된다. 이같은 결합이 생물학적 활성에 중요하게 영향을 미치는 것이라고 알려져 있는 생물학적 활성 분자에서 금속 착물화는 주요 관건이 되는 리셉터 인식 및 활성화 성분의 배열 구조 및 구조 형태와 바람직한 그에 관련된 작용기를 복구시킬 수도 있고 강화시킬 수도 있다. 이 전구 분자의 일반 구조 및 펩티드 사슬에서의 그 배열은 다음과 같다:
식 중에서,
X = 금속 이온의 전체 원자가가 이 금속 이온과 X가 착물화하는 것을 만족시킬 수 있도록 금속 이온과 착물을 형성하는 착물화 골격으로서, 이 골격은 두가지 이상의 아미노산을 함유함,
R1 및 R2 = 약 0～20 개의 아미노산을 각각 함유함,
R3 =약 1～20 개의 아미노산들,
Aaa 및 Bbb = 아미드, 티오에테르 또는 에스테르 결합을 통해 X와 결합되어 있는 아미노산으로 각각 이루어짐.
이 서열 X는 알맞은 원자가의 금속 이온과 착물을 형성하는 데 유용한 질소, 황 또는 산소 원자 한 가지 이상을 함유하는 아미노산으로 이루어질 수 있다. 이 금속 이온의 전체 원자가 보다 적은 것이 X에 포함된 아미노산과 금속이온의 착물 형성을 만족시키게 된다면, X는 또한 유도 아미노산이나 여분의 서열을 포함하여, 이 금속 이온의 이용가능한 원자가와 착물을 형성하는 데 유용한 질소, 황 또는 산소 원자 한 가지 이상을 포함함으로써 이 금속 이온의 상기 전체 원자가가 X와 금속 이온의 착물을 형성하는 데 만족시키도록 한다. 이 서열 X는 서열식 Ccc-Ddd-Eee 또는 Eee-Ddd-Ccc의 아미노산 서열이 될 수 있다. 이같은 경우, 각각의 Ccc와 Ddd는 하전되지 않은 측쇄를 갖는 아미노산이나 디펩티드가 될 수있으며, Eee는 Cys, HomoCys 또는, Pen, His의 L- 또는 D-이성질체, 또는 금속 이온과의 결합에 유용한 S, 바람직하게는 S와 N, 또는 N 두 개를 함유하는 그 외의 합성 또는 유도 아미노산이 될 수 있다. Aaa는 카르복실기나 아미노기로 종결되는 아미노산의 L- 또는 D-이성질체가 될 수 있다. Bbb는 카르복실기나 아미노기로 종결되는 아미노산의 L- 또는 D-이성질체가 될 수 있는데, Bbb가 말단 카르복실기의 측쇄를 갖는다면, Eee가 말단 아미노기의 측쇄를 갖고, Bbb가 말단 아미노기의 측쇄를 갖는다면, Eee가 말단 카르복실기의 측쇄를 갖도록 선택된다.
따라서, 디설파이드, 락탐 또는 락톤 결합의 동일한 구조 배열의 대체에 대한 전구 분자에는 다음 유형들의 구조체가 포함된다:
식 중에서, Aaa 및 Bbb = Asp, Glu 또는 유사한 합성 아미노산과 같은 말단 카르복실기의 측쇄를 갖는 아미노산, 또는 Orn, Lys 또는 유사한 합성 아미노산과 같은 말단 아미노기의 측쇄를 갖는 아미노산의 L- 또는 D-이성질체(Aaa가 카르복실기이면 Bbb가 아미노기이고, Aaa가 아미노기이면 Bbb가 카르복실기임).
Ccc 및 Ddd = GLy, Ala, Aib, Val, Nle, Leu 또는 하전되지 않은 측쇄를 갖는 유사한 아미노산의 L- 또는 D-이성질체, 또는 이같은 아미노산 중 어떠한 것으로 이루어진 디펩티드(Aaa도 또한 이같은 아미노산의 조합으로 이루어진 디펩티드임).
Eee = Cys, HomoCys, Pen, His 또는 유사한 합성 또는 유도 아미노산과 같은, 금속 이온과 착물을 형성하는 S, 바람직하게는 금속 이온과 착물을 형성하는 S와 N, 또는 금속 이온과 착물을 형성하는 두 개의 N을 함유하는 아미노산의 L- 또는 D-이성질체.
R1, R2 및 R3 = R1과 R2는 약 0～20 개의 아미노산 잔기이며, R3는 약 1～20 개의 아미노산 잔기인데, 이들의 전체 또는 그 어떤 일부분이 생물학적 작용 도메인의 전체 또는 일부를 구성함(생물학적 작용 도메인은 사이크노로지칼 또는 레그닐로지칼일 수도 있음).
방사선 의약 키트의 배합물. 본 발명의 한 가지 응용법으로서, 펩티드를 방사선 약물, 99mTc, 111In과 같은 방사성 동위 원소로 표지된 진단제나 188Re또는 186Re와 같은 방사선 동위 원소로 표지된 치료제로서 사용하는 데 제공한다. 99mTc는 일반적으로 나트륨 퍼테크네테이트로서, 레늄은 퍼레네이트로서 얻어진다. 이 두 가지 경우에 있어서, 이 금속 이온이 펩티드와 착물을 형성할 수 있도록 이 퍼테크네이트 또는 퍼레네이트를 환원시킬 필요가 있다. 주석(또한, “Sn(II)”으로도 기재함)은 이같은 목적에 효과적으로 사용될 수 있다. Sn(II)의 원료에는 주석 타르타르산염, 주석 글루코헵토네이트, 주석 글루코네이트, 주석 인산염, 염화주석, 황산주석, 아세트산주석 및 플루오르화주석이 포함된다. Sn(II)의 원료와 그의 최종 농도는 이 펩티드의 목적하는 의약적 적용, 펩티드의 특성 및 사용된 금속 이온에 따라 선택된다. 예를 들면, 퍼테크네테이트를 환원시키는 것보다 퍼레네이트를 환원시키는 데 훨씬 높은 주석 농도가 필요하다. 퍼레네이트 유형의 188Re는 모두 5～6 정도의 pH로, 약 2.5～15 mM 주석을 함유하고, 전체 주석이 약 1～5 mg 정도에 속하거나 좀더 큰 부피의 키트를 사용한다면 그 이상의 키트를 사용하여 표지될 수도 있다. 대체로, 주석 농도가 작은 키트는 전체 이용가능한 퍼레네이트를 효과적으로 환원시키는 데 30～60 분 정도의 물중탕(100 ℃ 전후로)과 같은 가열이 필요한 반면에, 전체 주석 농도가 큰 키트는 실온으로 약 1 시간 이내 정도로 배양시켜 이 퍼레네이트를 환원시키기에 충분한 환원 용량을 갖는다. 주석 농도가 15 mM 이상으로 증가한다고 해도 환원 용량에는 그리 큰 변화가 없고, 농도가 높아지면 주석을 용액으로 유지하기가 어렵게만 된다.
186Re 또는 188Re 표지의 경우, 전체 주석 농도가 대략 1.2 mg인, 주석 타르타르산염 약 5 mM을 펩티드 200 μg에 이용하였다. 동량의 펩티드를 99mTc로 표지하는 경우에는, 주석 타르타르산염 약 0.5 mM을 사용하였다. 조제물에서의 Sn(II)의 양은 금속 이온을 특정 반응 조건 하에서 바람직한 산화 환원 상태로 완전히 환원시키기에 충분할 정도가 되어야 하는데, 이같은 Sn(II)의 농도는 용액에서 주석 침전물을 생성시키지 않아야 한다. 대부분의 경우, 침전은 적절한 완충제와 착화제를 선택함으로써 조정할 수 있다. Sn(II)의 양은 또한 반응 조건들에 따라서도 변화되는데; 예를 들면, 80～100 ℃ 정도의 온도에서 배양되는 조제물에서는 실온으로 배양을 유효하게 실시할 수 있는 경우보다 적은 양의 Sn(II)이 필요하다. 배양 시간은 또한 배양 조건에 따라 달라지는데, 온도가 주요 변수가 되긴 하지만, pH 및 그 외의 조건들도 배양 시간에 영향을 미친다. 대체로, 80～100 ℃ 정도 온도에서의 배양이 실온에서의 배양보다 실질적으로 짧게 되는데, 길이면에서 1/2로부터 1/10 이하까지의 배양 시간이 필요하다.
퍼테크네테이트 표지의 경우, 전체 부피에 따라 달라지긴 하지만, 0.2～1 mM 정도의 주석, 바람직하게는 0.5～1 mM 정도의 주석을, 전체 주석이 40 μg 정도로 적게 하여 사용할 수 있다.
이용 방법에 무관하게, 사용되는 주석의 유형은 키트내에서 이용되는 완충제에 따라 부분적으로 변화된다. 예를 들면, 착화제로서 타르타르산염을 함유하는 완충제의 키트에서는, 주석 타르타르산염을 사용하는 것이 바람직하다. EDTA를 함유한 키트와 같이, 타르타르산염 이외의 착화제를 함유한 키트의 경우에는, 염화주석 이수화물을 사용할 수도 있다. 대체로, 모든 주석을 농축된 염산에 첨가한다. 이는 주석을 제 2 주석 이온으로서의 Sn(IV) 산화 상태보다, 제 1 주석 이온으로서의 Sn(II) 산화 상태로 유지하는 데 유리하다. Sn(II)은 퍼테크네테이트나 퍼레네이트와 같은 방사선 금속들을 효과적으로 환원시키지만, Sn(IV)는 그렇지 않다. 착화제는 일반적으로 전체 주석보다 2～20 몰 과량으로 사용하여 제 1 주석 이온과 제 2 주석 이온을 포함한 모든 주석을 착화시킬 수 있도록 한다. 중성 pH에서 착물을 형성하지 않은 주석은 대개 불용성 수산화물을 형성한다. 착화제가 없는 경우에는, pH 5.5 이상에서 콜로이드성 주석 계통의 물질이 수산화물 침전전에 형성될 수도 있다. 가교제는 주석의 가수분해 반응은 억제시키지만, 산화환원 반응에 참가하는 것을 방해하지는 않는다. 주석 용액의 pH 적정은 EDTA>>시트르산염>>글루코헵토네이트>>타르타르산염>>말산과의 착화력을 증진시키는 것을 나타내었다. 주석 타르타르산염이 건조염으로서 주석 : 타르타르산염이 1 : 1의 몰비로 존재할지라도, 경험상에 의하면 최소 2 배를 초과하는 타르타르산염이 중성 pH에서 주석을 안정화시키는 데 필요하다. 하지만, EDTA, 시트르산염 및 글루코헵토네이트는 중성 pH에서 대략 1 : 1 정도의 몰비로 주석을 전부 안정화시킬 수 있는데, 실재로는 학화제 : 주석이 1.2 : 1 정도의 몰비인 식을 만족스럽게 사용할 수 있다.
이용 방법에 무관하게, 고농도의 주석을 적절한 완충제를 사용함으로써 안정화시킬 수도 있다. 예를 들면, 50～100 mM의 디글리신과 트리글리신과 같은 금속 결합 완충제는 중성 pH에서 큰 밀리몰의 주석의 안정성을 증진시킬 수 있다. 예를 들면, EDTA, 시트르산염, 글루코헵토네이트 또는 타르타르산염과 같은 적절한 착화제를 갖는 50 mM 디글리신이나 트리글리신을 함유하는 완충제는, 전체 주석 농도가 5～10 mM일 경우에, 이 주석을 안정화시키고 침전을 방지하는 데 사용될 수 있다. 적절한 금속 이온 완충제에는 시트르산염과 타르타르산염, EDTA, DTPA 및 NTA(나이트릴로트리아세트산 )과 같은 폴리아미노카르복실산, ACES(N-2-아세트아미도-2-아미노에탄설폰산), ADA(N-2-아세트아미도이미노디아세트산), 바이신, 트리신, 글리실글리신, 트리글리신, 테트라글리신 및 MES(2-(N-2-모노포리노)에탄설폰산)가 포함된다. 예를 들면, pKa 8.2이고, 50～100 mM인 글리실글리신과 같은 이차 금속 결합 완충제를 첨가함으로써, 중성 pH 이상에서, 40 mM의 KH 프탈레이트와 10 mM의 NaK 타르타르산염으로의 5 mM 주석 타르타르산염으로 이루어진, 큰 밀리몰의 주석 용액을 안정화시킬 수 있다. 대체로, 주석의 용해도는 방사선 표지되는 조성물의 pH와 같거나 근사한 pKa를 갖는 이차 금속 결합 완충제를 첨가함으로써 증가된다. 예를 들어, pKa가 4.3인 방사선 표지 조성물이 타르타르산염을 함유하고, 이 조성물이 4.3과 매우 상이한 pH로 방사선 표지되어야 한다면, 이 방사선 표지된 조성물의 pH와 동일하거나 근사한 pKa를 갖는 이차 금속 결합 완충제를 첨가함으로써 주석의 결과적인 안정도와 침전 방지와 함께, 증진된 주석 착화 반응을 이룰 수 있다.
이용되는 펩티드에 따라, 배합물 및 반응 조건들이 달라져야 하며, 주어진 본 발명의 그 어떤 펩티드에 대해서도 경험상에 의한 결정이 가능하다. 일반적으로, 착화제 또는 완충제는 다양한 펩티드로 다양한 결과를 얻게 된다. 예를 들면, 나트륨 퍼테크네테이트로서 99mTc로 표지할 경우에 좋은 결과를 얻을 수 있도록, 펩티드 구조체 한 가지를 SnCl2-타르타르산염-프탈레이트와 함께 1-10-40 mM의 비율로 펩티드 5 μg을 함유한 바이알에서 전체 부피 40 μL로 pH 5.5에서 사용할 수도 있다. 다른 펩티드는 이같은 환원성 완충성 용액을 사용하여, 완전히 표지되지 않은 방사화학적 불순물을 함유하여도, SnCl2-숙신산염-EDTA, 1-20-1.2 mM의 비율로 펩티드 5 μg을 함유한 바이알에서 전체 부피 400 μL로 pH 6.2에서 좋은 결과를 얻을 수도 있다. 또다른 펩티드는 글루코헵토네이트-Sn, 0.2-1 mM의 비율로 펩티드 1～5 μg을 함유한 바이알에서 전체 부피 400 μL로 pH 7.5～8.0에서 좋은 결과를 얻을 수도 있다. 나머지 환원성 및 완충성 용액들도 마찬가지로 이용할 수 있으며, 각각의 특정 펩티드에 대해 결정이 가능하다.
제시된 경우에서, 타르타르산염의 농도는 10 mM 이하로부터 50 mM 이상까지의 범위가 될 수 있다. 칼륨 수소 프탈레이트와 같은 완충제는 40 mM 이상으로부터 10 mM 미만까지의 범위가 될 수 있다. 10 mM 농도의 칼륨 수소 프탈레이트 및, 일부 경우에서는 낮은 농도가 용이한 동결 건조(facile freez drying)를 위해 좀더 높은 유리 전이 온도를 제공하는 동시에 허용이 가능한 방사선 표지 결과를 얻는 데 충분하다.
다양한 부형제와 그외의 작용제들을 경우에 따라 사용할 수도 있다. 그 어떤 펩티드의 용해도를 증가시키는 작용제와 동결건조용 부형제 등이 이에 포함된다. 말토스, 이노시톨, 마니톨 및 그 외의 슈가가 동결 건조용 부형제로서 첨가될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드 1～5 μg 정도로 적은 양도 상기한 바와 같은 방법을 사용하여 99mTc와 레늄으로 표지할 수도 있다. 방사선 표지된 펩티드만이 생물학적 활성을 갖기 때문에, 필요량은 부분적으로, 첨가되는 금속 이온의 양에 따라 달라진다. 다수의 방사선 의약적 적용의 경우, 펩티드는 모든 금속 이온들이 펩티드 분장에 배합될 수 있도록 금속 이온의 양보다 2～20 배 정도 과량으로 첨가되어야만 한다. 하지만, 비-방사선 의약적 적용의 경우, 금속 이온은 펩티드의 양보다 현저히 많은 양으로 첨가되어 모든 펩티드 분자들이 금속 이온과 결합할 수 있도록 할 수 있다. 이러한 비-방사선 의약적 적용의 경우, 금속 이온으로 표지된 펩티드의 양은 가능한대로 많아질 수도 있다.
최근의 종래 기술의 방사선 의약적 방법들은 100 μg 이상의 펩티드 배합물에 관련된 것들이다. 본 발명에 의한 방법들은 1 μg 정도로 소량을 함유하는 조제물로 얻어지는 허용되는 방사선 표지된, 5 μg 이하를 함유하는 배합물에서의 방사선 의약적 조제물에 사용할 수 있는데, 여기서 생물학적 활성 부분은 금속 이온과 착물을 형성하고 있는 펩티드 전체 백분율을 기준으로 하여, 배합물에서의 전체 펩티드의 1% 미만에서 대략 20% 정도까지이다. 따라서, 배합물에 사용되는 전체 펩티드의 양이 매우 적고, 금속 이온 표지된 배합물에서의 생물학적 활성 펩티드의 양은 대략 5 배에서 100 배까지나 그 미만 정도로 훨씬더 적다. 매우 소량의 펩티드를 사용하는 것이 이 펩티드의 이량화와 응집을 최소화하고 이론적 극한치와 동일하거나 근사하게, 매우 높은 특정 활성도를 갖고, 배합물에서의 생물학적 활성 펩티드의 양을 최소화함으로써, 독성이나 바람직하지 못한 생물학적 활성도를 매우 낮게 제공한다.
본 발명의 방사선 의약적 생성물은 통상적으로 펩티드, Sn(II), 완충제 및 그외의 부형제를 함유한 바이알에 방사성 핵종을 첨가함으로써 방사선 표지된다. 이 방사성 핵종을 첨가한 후에, 이 용액을 실온에서부터 100 ℃까지 정도의 온도로 15 분에서 4 시간까지로 배양시킨다. 방사선 표지 후에, 이 생성물을 UV와 방사선 동위 원소 검측기가 연결되어 장착된 역상 HPLC를 포함한 HPLC에 의해서, 또는 얇은막 크로마토그래피에 의해서나 그 외의 이 분야의 기지 방법에 의해 테스트할 수도 있다. 본 발명의 생성물들은 방사화학적 불순물을 전형적으로 5% 미만으로, 대개는 2% 미만으로 포함하는데, 이 불순물들은 착물을 형성하지 않거나 환원되지 않은 방사성 핵종, 콜로이드 등으로 이루어진다.
본 발명은 한정성을 갖지 않는 다음의 실시예들에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1 - RGD 리셉터 특정 펩티드의 디자인 및 합성
Arg-Gly-Asp(RGD)의 리셉터 결합 특징을 기준으로 하는 분자를 디자인하였다. 펩티드 N3S1 금속 이온 결합 골격과 이 골격을 RGD의 리셉터 결합 영역과 유사한 구조체에 다다를 수 있도록 이 골격을 변형시키고 첨가 반응시키는 것을 기초로 하여, 펩티드 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 디자인하고, 통상적인 고체-상 펩티드 합성법에 의해 합성하였다. 간략하게는, Fmoc-β-Ala를 4-알콕시벤질 알콜 수지, 펩티드 합성 수지에 커플링시켰다. 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거한 후에, 연속적으로 Fmoc-D-Cys(Trt), Fomc-Gly 및 Fmoc-D-Arg(Pmc)를 사용하여 펩티드 사슬을 연장시켰다. 생성된 펩티드-수지, Fmoc-D-Arg(Pmc)-Gly-D-Cys(Trt)-β-Ala-수지로부터 Fmoc기를 제거하였다. TFA로 처리함으로써 이수지로부터 완전하게 탈보호기화된 펩티드를 방출시켰다. 이 펩티드를 역상 HPLC에 의해 정제하여 동결건조된 백색 분말로서 얻었다. 고속-원자 질량 분광 분석을 통해 합성된 이 펩티드의 정확한 질량을 얻었다.
실시예 2 - RGD 리셉터 특정 펩티드의 제 2의 합성법
펩티드 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 Boc 보호기로, 차단된 아미노산을 사용하는 또다른 고체-상법에 의해 합성하였다. 그 후에, 이 Boc 보호기를 TFA로 처리함으로써 제거하고, 이 펩티드 사슬을 연속적인 아미노산, Boc-D-Cys(MeBzl), Boc-Gly 및 Boc-D-Arg(Tos)을 사용하여 연장시켰다. 그 후에, 완전하게 합성된 보호기로 차단된 펩티드-수지, Boc-D-Arg(Tos)-Gly-D-Cys(MeBzl)-β-Ala-수지를 HF로 처리하여 완전하게 탈보호기화된 펩티드를 유리시켰다. 그 후에, 펩티드를 역상 HPLC로 정제하였다.
실시예 3 - RGD 리셉터 특정 펩티드의 제 3의 합성법
펩티드 D-Ala-Gly-D-Cys-β-Ala는 또한 용액-상 펩티드 합성법인 통상적인 방법에 의해서도 합성하였다. 간략하게는, Boc-D-Cys(MeBzl)을 DCC-HOBt와 같은 커플링제를 사용하여 β-Ala-OEt와 커플링시켰다. Boc 보호기는 TFA로 생성된 디펩티드 Boc-D-Cys(MeBzl)-β-Ala-OEt를 처리함으로써 제거된다. 그 후에, 이를 마찬가지 방법을 이용하여 Boc-Gly에 커플링시켰다. 생성된 트리펩티드 Boc-Gly-D -Cys(MeBzl)-β-Ala-OEt로부터의 Boc 보호기를 제거한 후에, 연이어 Boc-D-Arg(Tos)와 커플링시켜, 완전하게 보호기로 차단된 테트라펩티드를 얻었다. 이 C-말단 에스테르기를 가수분해하고 생성된 펩티드를 HF로 처리하여 완전하게 탈보호화된 펩티드를 생성시켜 역상 HPLC로 정제하였다.
실시예 4 - 분자량이 큰 분자에 콘쥬게이트된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala의 제조
상기 실시예 1의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드는 다양한 유형의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 콘쥬게이트시켜 생물학적 분산(biodistribution) 연구용의 고분자량 구조체를 얻었다. 다양한 분자량(100-8000)의 PEG 및 마찬가지 분자량의 모노-메톡시 PEG를 S. Zalipsky(Bioconjugate Chemistry 4:296-299, 1993)의 기술 방법에 따라 디숙신이미드 카보네이트로 활성화시켰다. 그 후에, 1 mM HOBt의 존재 하에서의 인산염 완충 용액(125 mM, pH 6.5)에서 취해진 펩티드 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala로 활성화된 PEG를 처리하였다. 실온에서 1 시간 후에, 반응 혼합물을 수 차례에 걸쳐 디클로로메탄으로 추출하였다. 모아 합쳐놓은 유기 추출액을 물로 씻어내고 증발시켜 건조시켰다. 그 후에 이 생성물을 무수 에테르를 첨가하여 침전시켰다. 이 생성물을 에탄올-에테르 시스템으로부터 침전시켜 1 회 정제하였다. 다음 구조체도 이와 같은 방식으로 합성하였다: [PEG8000(M/W)]-(D-Arg-Gly-D-Cys-β)2, [Me-PEG5000(M/W)] -D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 및 [Me-PEG2000(M/W)]-D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala.
실시예 5 - D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala와 주석-타르타르산염-프탈레이트를 이용한 방사선 의약 키트의 배합물 및 방사선 표지
직접적인 표지. 실시예 1에 상기한 바와 같이 얻은 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드를 타르타르산염-프탈레이트 완충 용액에서 환원제로서의 주석 존재 하에서 99mTc로 표지시켰다. 펩티드 100 μg을 발생제(generator) 용리된 99mTc 나트륨 퍼테크테테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하였다. 주석-타르타르산염-프탈레이트(1 mM-10 mM-40 mM, pH 6.1)의 질소 퍼지된 용액(400 μL)을 이에 첨가하였다. 이 바이알의 상부층 공간을 질소로 퍼지하고, 이 용액을 실온으로 30 분 동안 방치시켰다. 이같이 99mTc 표지된 펩티드의 소량을 C-18 컬럼이 장착된 역상 HPLC(VYDAC, Cat. No. 218TP104)로 분석하였다. 1.5 mL/min.의 유속으로 30 분 동안에 완결되는 0-20% 아세토나이트릴 경사 분리법(gradient)를 이용하였다. 방사선 검측 플로우 세포 시스템을 HPLC에 장착하여 방사용리 프로필(radioelution profile)을 생성시켰다. 이 프로필을 통해 99mTc 표지된 펩티드가 11.1 min.에서 용리하는 것으로 나타났다. 소량의 방사선 표지된 단편이 또한 13.8 min.에서 용리하도록 존재하여, 펩티드-99mTc 2 : 1의 착물로 이루어진 이량체가 될 수도 있다. 이 프로필을 통해서는이 용매 피크로 용리되는 환원된 99mTc의 검측 가능한 양은 설사 있다 해도 4% 이하라는 것으로 나타났다. 이 표지된 조제물의 10 μCi 샘플을 인스턴트 얇은막 크로마토그래피(ITLC) 스트립(1.5 ×10 cm, 실리카겔 침착된 스트립, Gelman Science, Ann Arbor, MI) 상에다 스팟팅하고 150 mM NaCl 용액으로 전개시켰다. 이같은 스트립상에서의 방사 활성도 측정은 측정원이 단지 2～4.5%의 방사 활성도를 갖는데, 이 조제물에 함유된 99mTc 콜로이드에 해당되는 것이라는 것을 밝혔다. 표지된 조제물은 실온으로 36 시간까지 방치하였을 경우라도 HPLC 및 ITLC 프로필에서의 그 어떤 변화도 나타나지 않았다. 이 HPLC와 ITLC 결과들은 다같이 이같은 펩티드에 대해 매우 좋은 99mTc 표지 프로필을 제공한다.
키트 배합물. 방사선 의약 키트를 동일한 완충 시스템을 사용하여 배합하였다. 각각의 바이알에는 상기 실시예 1의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 100 μg과 주석-타르타르산염-프탈레이트(1 mM-10 mM-40 mM, pH 6.1)의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)을 담았다. 이 키트들을 냉장 하에서 보관하고, 일부 키트들은 동결건조시켰다. 동결건조된 바이알은 질소로 재충전시키고 봉합하였다. 이 냉장 보관된 바이알이나 동결건조된 바이알을 표지하기 위해서, 바이알의 함유 성분들을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하고, 용액을 실온으로 30 분 동안 방치하였다. 실질적으로 동일한 방사 화학적 수율과 프로필을 이같은 키트로 얻었다.
키트들을 상기 실시예 1의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 5 μg 정도의 소량과 주석-타르타르산염-프탈레이트(1 mM-10 mM-40 mM, pH 6.1)의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)으로 배합하였다. D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 5 μg을 갖는 키트들을뚜렷한 방사 화학적 불순물이 없이, 99mTc 52 mCi와 동량의 금속 이온 농도에 대해 99Tc로서 99mTc 50 mCi의 동량과 99mTc 2 mCi로 표지하였다. 99mTc 52 mCi 동량으로 금속 이온 대 펩티드의 비는 1 : 22이였다. 99Tc의 양을 증가시킴으로써, 5 μg 키트를 사용하여 금속 대 펩티드 1 : 8의 비율 정도로 낮게, 2 μg 키트를 사용하여 1 : 2의 비율로 낮게 성공적인 표지를 달성하였다.
PEG 콘쥬게이트된 생성물 표지. 상기 실시예 4의 생성물을 상기한 바와 같은 방법으로 직접 표지하여, 마찬가지의 방사 화학적 수율과 프로필을 얻었다. 콘쥬게이트로서 이용된 PEG의 유형에 따라 용리 시간이 달라질 필요가 있다.
그 외의 합성 펩티드. 방사선 표지 방법은 펩티드원과 무관하여, 상기 실시예 2 또는 3 중 어느 한 가지 방법을 사용하여 제조된 펩티드로 상기한 바와 같이 이용할 수도 있다.
실시예 6 - D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala과 주석-타르타르산염-글리실글리신을 이용한 방사선 의약 키트의 배합물 및 방사선 표지
직접적인 표지. 실시예 1에 상기한 바와 같이 얻은 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드를 타르타르산염-프탈레이트-글리실글리신 완충 용액에서 안정화된 주석으로, 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트에 대한 환원제로서 주석을 사용하여 표지시켰다. 일반적인 방법은 주석-타르타르산염-프탈레이트-글리실글리신(1 mM-10 mM-40 mM-50 mM, pH 6.6)의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)이 사용된 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하였다. HPLC와 ITLC 기법을 사용하여 실시예 5에서와 마찬가지의 표지 효용성 결과를 얻었다.
키트 배합물. 방사선 의약 키트를 동일한 완충 시스템을 사용하여 배합하였다. 각각의 바이알에는 상기 실시예 1의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 1～100 μg과 상기한 바와 같은 주석-타르타르산염-프탈레이트-글리실글리신의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)을 담았다. 이 키트들을 냉장 하에서 보관하거나, 임의로 동결건조시켰다. 동결건조된 바이알은 질소로 재충전시키고 봉합하였다. 이 냉장 보관된 바이알이나 동결건조된 바이알을 표지하기 위해서, 바이알의 함유 성분들을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하였다.
PEG 콘쥬게이트된 생성물 표지. 상기 실시예 4의 생성물을 본 실시예에 기재된 방법으로 직접 표지하였다.
그 외의 합성 펩티드. 본 실시예의 방사선 표지 방법은 펩티드원과 무관하여, 상기 실시예 2 또는 3 중 어느 한 가지 방법을 사용하여 제조된 펩티드에 상기한 바와 같이 이용할 수도 있다.
실시예 7 - D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala과 주석-타르타르산염-숙신네이트를 이용한 방사선 의약 키트의 배합물 및 방사선 표지
직접적인 표지. 실시예 1에 상기한 바와 같이 얻은 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드를 타르타르산염-숙신네이트 완충 용액에서 안정화된 주석으로, 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트에 대한 환원제로서 주석을 사용하여 표지시켰다. 일반적인 방법은 주석-타르타르산염-숙신네이트(1 mM-10 mM-20 mM, pH 6.2)의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)이 사용된 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하였다. HPLC와 ITLC 기법을 사용하여 실시예 5에서와 마찬가지의 표지 효용성 결과를 얻었다.
키트 배합물. 방사선 의약 키트를 동일한 완충 시스템을 사용하여 배합하였다. 각각의 바이알에는 상기 실시예 1의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 1～100 μg과 상기한 바와 같은 주석-타르타르산염-숙신네이트의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)을 담았다. 이 키트들을 동결건조시켜, 질소로 재충전시키고 봉합할 수도 있다. 표지하기 위해서, 바이알의 함유 성분들을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하였다.
PEG 콘쥬게이트된 생성물 표지. 상기 실시예 4의 생성물을 본 실시예에 기재된 방법으로 직접 표지하였다.
그 외의 합성 펩티드. 본 실시예의 방사선 표지 방법은 펩티드원과 무관하여, 상기 실시예 2 또는 3 중 어느 한 가지 방법을 사용하여 제조된 펩티드에 상기한 바와 같이 이용할 수도 있다.
실시예 8 - D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala과 주석-EDTA-숙신네이트를 이용한 방사선 의약 키트의 배합물 및 방사선 표지
직접적인 표지. 실시예 1에 상기한 바와 같이 얻은 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드를 EDTA-숙신네이트 완충 용액에서 안정화된 주석으로, 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트에 대한 환원제로서 주석을 사용하여 표지시켰다. 일반적인 방법은 주석-EDTA-숙신네이트(1 mM-1.1 mM-20 mM, pH 6.2)의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)이 사용된 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하였다. HPLC와 ITLC 기법을 사용하여 실시예 5에서와 유사한 표지 효용성 결과를 얻었다.
키트 배합물. 방사선 의약 키트를 동일한 완충 시스템을 사용하여 배합하였다. 각각의 바이알에는 상기 실시예 1의 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 1～100 μg과 상기한 바와 같은 주석-EDTA-숙신네이트의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)을 담았다. 부형제들을 첨가할 수도 있으며, 이 키트들을 동결건조시켜, 질소로 재충전시키고 봉합하였다. 표지하기 위해서, 바이알의 함유 성분들을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하였다.
PEG 콘쥬게이트된 생성물 표지. 상기 실시예 4의 생성물을 본 실시예에 기재된 방법으로 직접 표지하였다.
그 외의 합성 펩티드. 본 실시예의 방사선 표지 방법은 펩티드원과 무관하여, 상기 실시예 2 또는 3 중 어느 한 가지 방법을 사용하여 제조된 펩티드에 상기한 바와 같이 이용할 수도 있다.
실시예 9 - D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala과 글루코헵토네이트를 이용한 방사선 의약 키트의 배합물 및 방사선 표지
실시예 1에 상기한 바와 같이 얻은 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드를, 트랜스킬레이션제로서도 제공되는, 글루코헵토네이트 완충 용액에서 안정화된 주석으로, 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트에 대한 환원제로서 주석을 사용하여 표지시켰다. 표지시키기 위해서, 펩티드 용액(100 μL 식염수에 100 μg)을 실온에서 10 분 동안 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트 1～35 mCi(200～500 μL)로 새로 재구성된 GlucoScan(DuPont, Wilmington, DE) 키트에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 방치시킨 후에, 상기한 바와 같은 HPLC와 ITLC 기법에 의해 분석하였다. 상기 실시예 5에서와 유사한 표지 효용성 결과를 동일한 HPLC와 ITLC 기법을 사용하여 얻었다.
실시예 10 - D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala과 주석-보레이트-타르타르산염을 이용한 방사선 의약 키트의 배합물 및 방사선 표지
실시예 1에 상기한 바와 같이 얻은 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드를, 트랜스킬레이션제로서도 제공되는, 보레이트-타르타르산염 완충 용액에서 안정화된 주석으로, 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트에 대한 환원제로서 주석을 사용하여 표지시켰다. 일반적인 방법은 주석-EDTA-숙신네이트(1 mM-50 mM-20 mM, pH 9.3)의 질소 퍼지된 용액(200～400 μL)이 사용된 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하였다. HPLC와 ITLC 기법을 사용하여 실시예 5에서와 유사한 표지 효용성 결과를 얻었다.
실시예 11 - 혈소판과 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala의 포화 결합
인체 혈소판에 대한 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala 펩티드의 포화 결합은, 혈소판 다량의 혈장(PRP: platelet rich plasma)의 새로 제조된 조제물을 이용하여 증명하였다. PRP에서의 혈소판의 농도는 PPP를 이용하여 각각의 분석 튜브당 3 × 108 혈소판/mL의 최종치로 조정하였다. 99mTc-표지된 펩티드의 증가량을 다양한 분석 튜브에 있는 일정량의 PRP에 첨가하였다. 그 후에, 혈소판을 활성화시킬 수 있도록 10 μM의 최종 농도로 ADP를 첨가하였다. 동일한 부피의 PPP를 실험 조건 하에서 비특정 결합 성분의 측정 도구로서 99mTc-표지된 펩티드의 각 농도로 사용하였다. 튜브를 얼음조로 옮긴 후 30 분 동안 결합을 진행시킨다. 0.6 × 108 혈소판들에 상당하는 200 μL 부분을 PPP에 30 분 동안 미리 담가놓은 유리 섬유 필터를 통과시켜 여과하였다. 그 후에 이 여과물을 PBS 1 mL로 3 회 씻어주고, 결합된 방사선 활성도에 대해 감마선 카운터로 검측하였다. 결과치는 99mTc의 쇠퇴를 밝힐 수 있도록 표준화되고 도식화되었다. 이 결과의 분석을 통해 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala 펩티드에 대해 5～10 nM 정도의 KD 값이 나타났다.
실시예 12 - 정착된 혈소판과 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala의 포화 결합
ADP-활성화되고 포르말린-정착된 인체 혈소판에 대한 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala 펩티드의 포화 결합은, 혈소판을 활성화시키는 데 트롬빈 대신에 ADP(최종 농도 10 μM)를 사용한 것을 제외하고는 참고문헌으로 첨부된 미국 특허 제 5,332,726 호의 기재 방법에 따라 제조한 혈소판 다량 함유 혈장(PRP)의 조제물을 이용하여 증명하였다. 이같은 방법으로 얻어진 정착된 혈소판의 농도는 PPP를 이용하여 각각의 분석 튜브당 3 × 108 혈소판/mL의 최종치로 조절하였다. 99mTc-표지된 펩티드의 증가량을 다양한 분석 튜브에 있는 일정량의 정착된 혈소판에 첨가하였다. 동일한 부피의 PPP를 실험 조건 하에서 비특정 결합 성분의 측정 도구로서 99mTc-표지된 펩티드의 각 농도에 대해 사용하였다. 30 분 동안 결합을 진행시키고, 실시예 11에 상기한 바와 같은 방법으로 분석하였다. 이 경우에서 얻어진 실험 결과도 99mTc의 쇠퇴를 밝힐 수 있도록 표준화되고 도식화되었다. 이 결과의 분석을 통해 도 4에 나타낸 바와 같이, 그의 활성화된 혈소판 리셉터에 대한 펩티드의 포화 결합 동력학을 증명한다. X 축은 생물학적 활성을 갖는다고 추정되는 99mTc-표지된 분자 만인 전체 펩티드 분자 중의 99mTc-표지된 분자의 실제 분수를 나타낸 것이다. 실험 결과 분석을 통해, 상기 실시예 11에서 얻어진 결과와 유사한, 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala 펩티드에 대한 5～10 nM 범위의 KD 값을 얻었다.
실시예 13 - 혈병과 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala의 포화 결합
상기 실시예 5의 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala 펩티드의 혈병과의 포화 결합은, 새로 제조된 인체 혈액 혈병을 이용하여 증명하였다. 이 새로 채혈된 인체 혈액 100 μL 부를 유리 튜브에 담고 실온에서 1.5 시간 동안 배양시켰다. 4 ℃에서 30 분 동안 추가 배양시킨 후에, 형성된 혈병을 PBS에서의 1 mM EDTA 1 mL로 3 회 씻어 주었다. 99mTc-표지된 펩티드의 증가량을 이같은 혈병에 3 배로 첨가하였다. 실험 조건 하에서, 빈 유리 튜브를 비-특정 결합 성분의 측정법으로서 이 분석에 포함시켰다. 실온에서 60 분 동안 결합을 진행시켰다. 그 후에, 모든 튜브들을 얼음조로 옮겼다. 얼음 냉각된 PBS 1 mL를 각각의 튜브에 첨가하고 PBS를 흡출해냄으로써 씻어주었다. 이 혈병은 마찬가지 방식으로 PBS 1 mL로 3 회 이상을 추가로 씻어 주고, 이 혈병이 담긴 튜브들을 감마 카운터로 결합된 방사 활성도에 대해 측정하였다. 이같은 방법으로 얻어진 결과는 99mTc의 쇠퇴를 밝힐 수 있도록 표준화되고 도식화되었다. 이 결과로 혈병내에 갇혀 있는 혈소판상에서의 그의 활성화된 혈소판 리셉터에 대한 펩티드의 포화 결합 동력학을 증명할 수 있다. 이 실험 결과의 분석을 통해, 상기 실시예 11과 12에서 얻어진 결과와 유사한, 99mTc-[D-Arg-Gly-D -Cys]-β-Ala 펩티드에 대한 5～10 nM 범위의 KD 값을 얻었다.
실시예 14 - 담체가 없는 조제물을 사용한 혈병과 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala의 포화 결합
99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala 펩티드와 혈병과의 포화 결합은, 상기 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 증명하였다. 담체가 없는 99mTc-표지된 펩티드의 조제물은 새로 표지된 상기 실시예 5의 99mTc-표지된 펩티드 조제물은 티올 반응기가 흡착되는 고체상(아가로오스나 폴리스티렌 비즈)으로 이루어진 친화성 컬럼을 통과시킴으로써 제조하였다. 이러한 목적으로 사용된 폴리스티렌과 브로모아세틸레이티드 데스트로오스에 결합된 말레이미드를 구입하였다. 이 수지의 이같은 작용기들은 펩티드이 Cys 잔기의 티올기에 대한 반응성이 있다. 결과적으로, 99mTc 원자에 결합되지 않은 펩티드 분자는 어김없이 이 칼럼에 남게 된다. 따라서, 이 칼럼으로부터의 용리액은 펩티드의 99mTc-표지된 분자만을 함유하였다. 이같은 조제물을 실시예 13에서 상기한 바와 같이 혈병 결합 실험에 사용하였다. 실험 결과의 분석을 통해, 5～10 nM 범위의 KD 값을 얻었다. 이같은 결과들은 상기 실시예 11～13에서 얻어진 결과와 매우 유사한 것으로, 펩티드의 99mTc-표지된 분획이 생물학적 활성을 갖는다는 것과 리셉터 결합이 나타났음을 확증시켜주는 것이었다.
실시예 15 - 혈병과 PEG-99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala의 포화 결합
상기 실시예 4의 99mTc-표지된 PEG8000-D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드와 혈병과의 포화 결합은, 실시예 13에 상기한 바와 같은 방식으로 새로 제조된 인체 혈병을 사용하여 증명하였다. PEG-콘쥬게이트된 펩티드를 실시예 5에 상기한 바와 같은 방법으로 99mTc 표지하였다. 실험 결과를 통해, 상기 실시예 11～14에서 얻어진 결과와 유사한 99mTc-표지된 PEG8000-D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드에 대해 5～10 nM 범위의 KD 값을 얻었다.
실시예 16 - 결합 분석에서 냉각된 99Tc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala와 99mTc-[D- Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala와의 비교
실시예 12에 상기한 바와 같은, 활성화되고 포르말린-정착된 혈소판(분석 튜브당 3 × 108 혈소판/mL)을 99mTc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드와 99Tc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드의 혼합물로 배양시켰다. 일정량이지만 소량의 99mTc-표지된 펩티드를 이 분석에 사용하였다. 하지만, 99Tc-표지된 펩티드의 양은 전체 펩티드 분자 중의 99Tc-표지된 분율에 의해 10-9～10-7 M 사이로 변화시켰다. 99mTc-표지된 펩티드와 99Tc-표지된 펩티드 모두를 상기 실시예 5의 방법에 따라 제조하였다. 이같은 실험 결과는 99Tc-표지된 펩티드의 결합 저해를 증명하였고, 99mTc-표지된 펩티드에 대해 5～10 nM 범위의 IC50 값을 얻었다. 도 5에는 99Tc-표지된 펩티드에 대한 이같은 실험에서 얻어진 결합 곡선을 도시하였다.
실시예 17 - 결합 분석에서 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala와 99mTc-[D-Arg-Gly-D- Cys]-β-Ala와의 비교
D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 99Tc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 대신에 사용한 것을 제외하고, 실시예 16에 상기한 바와 같이 이 연구를 수행하였다. 비표지화된 펩티드의 양은 10-6～10-4 M 사이로 변화시켰다. 이같은 실험 결과는 99Tc-표지된 펩티드의 결합 저해를 증명하였고, 99mTc-표지된 펩티드에 대해 5～10 nM 범위의 IC50 값을 얻었다. 도 5에는 비표지화된 펩티드에 대한 이같은 실험에서 얻어지는 결합 곡선을, 99Tc-표지된 펩티드의 결합 곡선과 함께 도시하였다.
실시예 18 - 결합 분석에서 Sn-D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala와 99mTc-[D-Arg-Gly-D- Cys]-β-Ala와의 비교
주석 이온을 함유한 완충 용액(펩티드의 99mTc 표지에 사용된 완충 용액과 동일함)으로 배양된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala로, 실시예 16에 상기한 바와 같이 이 연구를 수행하였다. Sn-표지된 것으로 예측되는 펩티드의 양은 10-6～10-4 M 사이로 변화시켰다. 실험 결과는 Sn-표지된 펩티드가 실질적으로 리셉터 부위에 대한 99mTc-표지된 펩티드와 경쟁하는 데에서 좀더 낮은 친화도를 갖는다는 것을 나타냈다. 주석을 함유하는 것은 그의 혈소판 리셉터에 대한 펩티드의 친화도를 감퇴시키지 않는다.
실시예 19 - 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala를 이용한 다리의 혈병의 형상화
트롬빈(10～20 units)의 식염수 용액 100～200 μL를 마우스의 상단 넓적다리에 근육주사하였다. 이로부터 이 주사 부위에 혈병 형성이 유도되었다. 트롬빈 주사후에 5～30 분 경과하여, 상기 실시예 5의 방법에 의해 제조된 99mTc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 펩티드 50～200 μCi를 꼬리 정맥을 통해 이 동물에게 주사하였다. 그 이후에, 카메라가 장착된 평행 시준기상에 이 동물을 올려놓음으로써 바로 감마 카메라 영상을 얻었다. 형상화(imaging) 과정 중에, 케타민을 복강 주사하여 이 동물을 약화시켰다. 다리에서의 혈병 유도 부위는 99mTc-표지된 펩티드의 국부화와 집적의 결화로서 가시화될 수 있었다. 헵티드 주사 후 45～60 까지 또는, 혈병이 동물체의 방어 메카니즘에 의해 사라질 때까지 연속적인 형상화가 가능하다. 도 6은 99mTc-표지된 펩티드의 주사 후 25 분 경과한 후에 얻은 감마 카메라 영상을 나타낸 것인데, 동물의 다리에 주사된 트롬빈 100 μL의 주사 후에 38 분이였다.
실시예 20 - 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala를 이용한 폐 혈병의 형상화
트롬빈(30 units)을 재구성한 식염수 300 μL를 약 100 백만 개의 폴리비닐 플루오리딘 비즈(polyvinyl fluoridine beads: 평균 크기 5 미크론)로 1 시간 동안 배양시켰다. 그 후에 이 비즈들은 원심 분리법에 의해 회수하고 새 식염수 300 μL로 재현탁화시켰다. 이같은 현탁액 100～200 μL, 또는 원래의 트롬빈 식염수 용액 100～200 μL 를 꼬리 정맥을 통해 래트에게 주사하였다. 이같은 과정으로 혈액 응결이 야기되고, 이 혈병들은 폐에 모이게 된다. 그 후에, 이같은 폐 엠볼리(emboli)가, 상기 실시예 5의 방법에 의해 제조되어 트롬빈 주사 후에 5～30 분 이내에 주사된 99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala를 꼬리 정맥으로 주사함으로써 형상화되었다. 이후에, 카메라가 장착된 평행 시준기상에 이 동물을 올려놓음으로써 바로 감마 카메라 영상을 얻었다. 형상화 과정 중에, 케타민을 복강 주사하여 이 동물을 약화시켰다. 다리에서의 혈병 유도 부위는 99mTc-표지된 펩티드의 국부화와 집적의 결화로서 가시화될 수 있었다. 헵티드 주사 후 45～60 까지 또는, 혈병이 동물체의 방어 메카니즘에 의해 사라질 때까지 연속적인 형상화가 가능하다. 도 7은 99mTc-표지된 펩티드의 주사 후 7 분 경과한 후에 얻은 감마 카메라 영상을 나타낸 것인데, 동물의 다리에 주사된 트롬빈 200 μL의 주사 후에 34 분이였다.
실시예 21 - 터프트신 동족체의 디자인 및 합성
터프트신의 리셉터 결합 특성을 기초로 하는 분자를 디자인하였다. 아미노산 N3S1 금속 이온-결합 골격을 이용하고, 이 골격을 터프트신의 리셉터 결합 부위와 유사한 구조체가 될 수 있도록 수정하고 부가시켜, 이 펩티드가 99mTc 또는 그 외의 적절한 금속 이온으로 표지된 후에 과립성 백혈구상에서 터프트신 리셉터와 결합할 수 있도록, 서열 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Ala을 디자인하였다. 이 펩티드는 상기 실시예 1의 방법과 같은 방법들을 사용하여, 고체-상 펩티드 합성법으로 제조하였다. 간략하게는, Fmoc-Arg(Pmc)를 4-알콕시벤질 알콜 수지, 펩티드 합성 수지와 커플링시켰다. 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거한 후에, 연속적으로 Fmoc-D-Cys(Trt), Fomc-Gly, Fmoc-D-Lys(Boc) 및 Fmoc-Thr(But)을 사용하여 펩티드 사슬을 연장시켰다. 생성된 펩티드-수지, Fmoc-Thr(But)-D-Lys(Boc)-Gly-D-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-수지로부터 Fmoc기를 제거하였다. TFA로 처리함으로써 이수지로부터 완전하게 탈보호기화된 펩티드를 방출시켰다. 이 펩티드를 역상 HPLC에 의해 정제하여 동결건조된 백색 분말로서 얻었다. 고속-원자 질량 분광 분석을 통해 합성된 이 펩티드의 정확한 질량을 얻었다.
이 펩티드는 Boc-화학을 이용한 고체-상 펩티드 합성법 및 실시예 2와 3에 상기한 바와 같은 용액-상 펩티드 합성법의 일반적인 방법에 의해서도 합성할 수도 있다.
실시예 22 - 고분자량의 분자에 콘쥬게이트된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg의 제조
PEG, PVA, 지방산 등과 같은 고분자량의 담체 분자와 펩티드 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg와의 콘쥬게이션 반응은 펩티드의 합성 중이나 그 이후에 이루어질 수 있다. 이 펩티드와 이같은 분자들의 결합은 상기 실시예 4의 방법에 의해서 되거나, 펩티드 합성의 고체-상 또는 용액-상 방법에 의해 합성되는 동안에 이 펩티드에 담체 분자가 결합된다. 이 담체 분자들은 N-말단 또는 C-말단, 또는 양쪽 말단에 결합된다.
실시예 23 - Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg을 이용한 방사선 의약 배합물과 방사선 표지
펩티드의 직접 표지 방법 A: 상기 실시예 21의 방법에 의해 합성된 펩티드 Thr-D -Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드를 숙신네이트-EDTA 완충 용액에서 미리 안정화된 환원제로서의 주석 존재 하에서 99mTc로 표지시켰다. 펩티드 100 μg을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크테테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하였다. 주석-숙신네이트-EDTA(1 mM-20 mM-1.1 mM, pH 6.2)의 질소 퍼지된 완충 용액(200～400 μL)을 이에 첨가하였다. 이 바이알의 상부층 공간을 질소로 퍼지시키고, 이 용액을 20 분 동안 100 ℃ 정도로 물중탕시켰다. 냉각시킨 후에 이 용액은 식염수에 추가로 희석시켰다. 이같이 99mTc 표지된 펩티드 소량을 C-18 컬럼이 장착된 역상 HPLC(VYDAC, Cat. No. 218TP104)로 분석하였다. 1.5 mL/min.의 유속으로 30 분 동안에 완결되는 0-20% 아세토나이트릴 경사 분리법을 이용하였다. 방사선 검측 플로우 세포 시스템을 HPLC에 장착하여 방사용리 프로필을 생성시켰다. 이 프로필을 통해 99mTc 표지된 펩티드가 절정부에서 이중선 피크(머무름 시간 12.9 mim.과 13.1 min.)로 갈라지는 주요 피크로서 용리하는 것으로 나타났다. 이같은 이중선은 99mTcO[V] 중심부에서의 이성질화에 기인한 표지된 물질 중의 두 가지 이성질체를 나타내는 것으로 보인다. 끓는 물에서의 물중탕을 하지는 않았지만, 마찬가지의 방식으로 표지된 펩티드의 샘플은 14.8 min.과 16.2 min.에 집중된 추가 피크를 나타내었는데, 1 : 1 펩티드-99mTc 착물을 나타내는 주요 피크의 열분해에 의한, 펩티드-99mTc 착물의 다중결합 물질에 기인한 것이었다. 용리 프로필은 또한 용매 피크(머무름 시간 2.2 min.)로 용리되는 환원된 99mTc(펩티드와 착물을 형성하지 않은)의 검측 가능한 양은 설사 있다하더라도 4% 이하라는 것을 나타내었다. 이 표지된 조제물의 10 μCi 샘플을 인스턴트 얇은막 크로마토그래피(ITLC) 스트립(1.5 ×10 cm, 실리카겔 침착된 스트립, Gelman Science, Ann Arbor, MI) 상에다 스팟팅하고 150 mM NaCl 용액으로 전개시켰다. 이같은 스트립상에서의 방사 활성도 측정은 측정원이 단지 2～4.5%의 방사 활성도를 갖는데, 이 조제물에 함유된 99mTc 콜로이드에 해당되는 것이라는 것을 밝혔다. 표지된 조제물은 실온으로 36 시간까지 방치하였을 경우라도 HPLC 및 ITLC 프로필에서의 그 어떤 변화도 나타나지 않았다. 이 HPLC와 ITLC 결과들 모두는 이같은 펩티드에 대해 매우 좋은 99mTc 표지 프로필을 제공한다.
방법 A의 방사선 의약 키트 배합물: 펩티드 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 키트 유형으로 배합하여 99mTc 표지하는 데 편리하게 이용하였다. 이를 이루기 위해서는, 5 mL혈청 바이알에 담긴 펩티드 100 μg을 질소 퍼지된 주석-숙신네이트-EDTA(1 mM-20 mM-1.1 mM EDTA, pH 6.2)의 질소 퍼지된 완충 용액 400 μL와 혼합하였다. 이 바이알의 상층부 공간을 즉시 질소 퍼지시켰다. 그 후에 그 함유 성분들을 동결건조시키고, 아르곤이나 질소를 채워 봉합하였다. 이 동결건조된 키트들은 약 4 ℃에서 장기간 동안 보관할 수 있다. 테크테늄 표지를 위해, 발생제-용리된 99mTc-나트륨 퍼테크네테이트(500 μL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)를 바이알에 주입하였다. 이 바이알의 함유 성분을 전체적으로 혼합하고, 이 바이알에 주사 바늘을 꽂아 틈을 만들고, 25 분 동안 100 ℃ 정도로 물중탕하였다. 그 함유 성분들을 냉각한 후에, 식염수나 PBS로 희석시켰다. 상기한 바와 같이 HPLC와 ITLC 기법에 의한 일부분 검측을 통해 직접 표지된 펩티드 하에서 얻어진 것과 동일한 결과를 얻었다.
다른 방법 A의 방사선 의약 키트 배합물: 펩티드 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 펩티드 5 μg과 질소 퍼지된 주석-숙신네이트-EDTA(1 mM-20 mM-1.1 mM EDTA, pH 6.2)의 질소 퍼지된 완충 용액 400 μL를 함유한 각각의 바이알로 키트 유형으로 배합하였다. 펩티드 5 μg의 키트들은, 99mTc의 2 mCi와 99mTc의 50 mCi와 등가의 99Tc를 99mTc의 52 mCi와 등가의 금속 이온 농도에 대해 방사 화학적 불순물이 명확히 없이 표지되었다. 금속 이온 대 펩티드의 비율은 99mTc의 52 mCi 동량으로 1 : 15.4이였다. 99Tc의 양을 증가시킴으로써, 5 μg 키트를 사용하여 금속 이온 대 펩티드 비율이 1 : 8 정도로 낮게 표지시키는 것을 성공하였다.
펩티드의 직접 표지 방법 B: 상기 실시예 21의 방법에 의해 합성된 펩티드 Thr-D -Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드를 나트륨 글루코헵토네이트 완충 용액에서 미리 안정화된 환원제로서의 주석 존재 하에서 99mTc로 표지시켰다. 펩티드 1～100 μg을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크테테이트(0.5～3.5 mL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하였다. 주석-글루코헵토네이트(1 mM-200 mM, pH 7.5～8.5)의 질소 퍼지된 완충 용액(200～400 μL)을 이에 첨가하였다. 이 바이알의 상부층 공간을 질소로 퍼지시키고, 이 용액을 15 분 동안 100 ℃ 정도로 물중탕시켰다. 냉각시킨 후에 이 용액은 임의로 식염수에 추가로 희석시켰다. 이같이 99mTc 표지된 펩티드 소량을 실시예 23에 상기한 바와 같은 C-18 컬럼이 장착된 역상 HPLC로 분석하여, 마찬가지의 결과를 상기 방법 A에 기재한 바와 같이 얻었다. 일반적으로, ITLC와 SepPak 기법에 의해 92～95%의 방사선 활성도가, 비착물 형성된 99mTc로서 용리도는 방사선 활성도 2～5%와 99mTc-콜로이드로서 1～3%와 함께, 펩티드-결합된 것으로 나타났다. SepPak 분석법의 경우, 표지된 조제물 샘플 10～100 μCi를 EtOH(10 mL)로 씻어주고, 0.0001 N HCl(용리액 A: Eluent-A) 10 mL로 평형을 이룬, SepPak Plus C-18 Cartridge에 적용하였다. 이 카트리지는 용리액 A와 용리액 B (EtOH -식염수 1 : 1) 10 mL로 용리시키는 데 성공하였다. 이 실례 모두에서, 카트리지 용리액은 용리된 방사선 활성도에 대해 측정되어 (a)유리 99mTc와 같은 친수성 불순물과 (b) 표지된 펩티드의 측정치를 제공하였다. 용리돈 카트리에 결합되어 있는 방사선 활성도로부터 99mTc 콜로이드와 같은 비용리성 불순물의 측정치를 얻었다. 표지된 조제물은 식염수로 희석되거나 36 시간 정도까지 실온으로 보관될 경우라도 HPLC, ITLC 또는 SepPak 용리 프로필에서의 그 어떤 변화도 나타나지 않았다. 이 HPLC, ITLC 및 SepPak 결과들 모두는 이같은 펩티드에 대해 매우 좋은 99mTc 표지 프로필을 제공한다.
방법 B의 방사선 의약 키트 배합물: 펩티드 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 키트 유형으로 배합하여 99mTc 표지하는 데 편리하게 이용하였다. 이를 이루기 위해서는, 5 mL혈청 바이알에 담긴 펩티드 1～100 μg을 질소 퍼지된 주석-글루코헵토네이트(1 mM-200 mM, pH 7.5～8.5)의 질소 퍼지된 완충 용액 400 μL와 혼합하고 실시예 23에 상기한 바와 같이 동결건조시켰다. 이같은 방식으로 얻어진 한 단계 동결건조된 표지 키트를 실시예 23에 상기한 바와 같이 나트륨 퍼테크테이트 99mTc를 첨가함으로써 표지하고, HPLC, ITLC 및 SepPak 질적 조정 방법에 의해 테스트되었다. 얻어진 결과는 실질적으로 상기한 바와 같은 방법 B와 동일한 것이었다.
펩티드의 직접 표지 방법 C: 상기 실시예 21의 방법에 의해 합성된 펩티드 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 실시예 5에 상기한 바와 같이, 타르타르산염-프탈레이트 완충 용액에서 안정화된 환원제로서 주석의 존재 하에서 99mTc로 표지되었다.
실시예 24 - Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg의 또다른 표지법
상기 실시예 21의 펩티드는 또한 주석이온을 안정화시킬 수 있는 다른 완충 용액을 사용하여, 실시예 23에 상기한 바와 같은 방법으로 직접 표지함으로써 방사선 표지 되었다. 다음의 선택적인 완충 용액들을 사용하였다: (a) 주석-타르타르산염-프탈레이트(1 mM-10 mM-40 mM, pH 6.2), (b) 주석-타르타르산염-프탈레이트-글리실글리신 (1 mM-10 mM-40 mM-50 mM, pH 6.6), (c) 주석-타르타르산염-숙신네이트(1 mM-10 mM-20 mM, pH 6.2). 고온(100 ℃ 정도로 물중탕)으로나 실온으로 모두 표지화시켰다. 이같은 조제물들의 HPLC 프로필은 어느 정도는 실시예 23에 상기된 바와 같다. 하지만, 비교적 보다 많은 양의 다중 생성물 종이 HPLC 프로필에서 산측되었다.
실시예 25 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 시어진 우유 유도 농양의 형상화
시어진 우유(14 시간 동안 실온에서 방시시킨 우유 샘플) 100～200 μLfmf 래트 또는 마우스의 상부 넓적 다리 부분에 주사하여 농양을 야기시켰다. 시어진 우유를 주사하고 30～60 분 경과 후에, 상기 실시예 23의 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 조제물(50～200 μCi)을 동물의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 그 후에, 바로 카메라에 장착된 평행 시준기상에 동물을 놓음으로써 감마 카메라 영상을 얻었다. 형상화 과정 중에, 케타민을 복강 주사하여 동물을 약화시켰다. 농양 부위는 99mTc-표지된 펩티드의 국부화와 집적화의 결과로서 가시화되었다. 이 펩티드 주사 후에 7 시간 이상 동안 연속 형상화가 가능하다. 도 8과 9는 다리의 시어진 우유 유도 농양을 갖는 마우스의 감마 카메라 영상을 나타낸 것이다. 99mTc-표지된 펩티드를 시어진 우유 주사 후에 55 분에 주사하였다. 도 8의 영상은 99mTc-표지된 펩티드를 주사후 20 분 경과하고 얻었고, 도 9는 99mTc-표지된 펩티드 주사후 4 시간 경과하여 얻었다.
실시예 26 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 케타민 유도 농양의 형상화
케타민(100 mg/mL)의 식염수 용액 100 μL를 래트 또는 마우스의 상부 넓적 다리 부분에 주사하여 농양을 야기시켰다. 30～60 분 경과 후에, 상기 실시예 23의 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 조제물(50～200 μCi)을 동물의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 그 후에, 실시예 25에 상기한 바와 같이, 바로 감마 카메라 영상을 얻었다. 염증 부위는 99mTc-표지된 펩티드의 국부화와 집적화의 결과로서 가시화되었다. 이 펩티드 주사 후에 7 시간 이상 동안 연속 형상화가 가능하다.
실시예 27 - 99mTc-표지된 구조체의 혈장 안정성
99mTc 2 mCi까지로 표지되고 실시예 5와 23에 상기한 바와 같이 일반적으로 제조된, 다양한 99mTc-표지된 펩티드 구조체 10～100 μL을 인체 혈장 결핍 혈장(PPP) 동부피와 혼합하였다. 그 후에, 생성된 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 그리고나서, 이같은 혼합물과 PPP로 배양하지 않은 99mTc-표지된 펩티드 모두의 일부분을 실시예 5와 23에 상기한 바와 같은 일반적인 조건 하에서 역상 HPLC로 분석하였다. PPP와 99mTc-표지된 펩티드 구조체의 혼합물과 PPP로 배양하지 않은 샘플의 생성된 방사선 용리 프로필들을 비교하여, 두 가지 HPLC 프로필에서의 실질적인 차이가 없음을 밝혀졌다. 그 어떤 프로필에서도 PPP로 배양되지 않은 99mTc-표지된 펩티드 구조체의 것과 다른 피크가 검측되지 않았기에, PPP에 함유된 혈청 프로테아제의 존재 하에서 99mTc-표지된 펩티드 구조체의 완전하거나 완전에 가까운 안정성이 제시될 수 있었다. 다음의 99mTc-표지된 펩티드 구조체가 인체 혈청에서의 안정성에 대해 분석되었다:
99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala,
99mTc-[Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala,
99mTc-[Gly-D-Arg-D-Cys]-β-Ala,
Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg.
실시예 28 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 인체 다형다핵 세포의 포화 결합
상기 실시예 23의 방법에 의해 제조된, 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드의 인체 PMN 백혈구와의 포화 결합은 인체 혈액으로부터 새로 모은 PMN 백혈구와 포르말린 정착된 PMN 백혈구 모두를 사용하여 증명하였다. 배양 배지로서 PBS에서의 PMN 세포의 농도는 분석 튜브 한 개당 2.5 × 106 cells/mL이였다. 다양한 분 석 튜브에 담긴 일정량의 세포들에 증가되는 양의 99mTc 표지된 펩티드를 첨가하였다. 동부피의 PBS를 실험 조건 하에서 비특정 결합 성분의 수단으로서 99mTc-표지된 펩티드의 각 농도로 사용하였다. 튜브를 얼음조로 옮기고 30 분 경과한 후에, 결합이 발생되었다. 0.5 × 106 개의 세포에 해당하는 200 μL 정도를 PBS에서의 50% 소혈청에 30 분 동안 미리 담궈둔 유리 섬유 필터를 통과시켜 여과하였다. 그 후에, 이 여과물을 PBS 1 mL로 3 회 씻어주고, 감마 카운터로 결합된 방사선 활성도에 대해 검측하였다. 실험 결과는 99mTc의 쇠퇴를 밝힐 수 있도록 표준화되고 도식화되었다. 이 결과로 PMN 세포상에서의 그의 리셉터에 대한 펩티드의 포화 결합 동력학이 밝혀졌다. 이 실험 결과의 분석을 통해, 1～5 nM 범위의 KD 값을 얻었다. 도 10은 이같은 실험으로 얻어진 결합 곡선을 나타낸 것이다.
실시예 29 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 HL-60 세포의 포화 결합
상기 실시예 23의 방법에 의해 제조된, 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드의 HL-60 세포(인체 백혈병 세포 라인: human leuken\mic cell line)와의 포화 결합은 새로 배양된 HL-60 세포 및 포르말린 정착된 HL-60 세포 모두를 사용하여 증명하였다. 분석은 상기 실시예 28에서의 PMN 세포에 개시된 바와 같이 수행하였다. 실험 결과의 분석을 통해, 1～5 nM 범위의 KD 값을 얻었다.
실시예 30 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg과 99Tc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]- Arg를 이용한 인체 다형다핵 세포와의 비교 결합
실시예 28에서 일반적으로 상기한 바와 같이, 포르말린 정착된 PMN 백혈구(분석 튜브당 1 mL의 최종 부피에서의 2.5 × 106 세포)를 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys -Arg 펩티드와 99Tc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드의 혼합물로 배양시켰다. 99mTc-표지된 펩티드 일정량이지만 소량을 이 분석에 사용하였다. 하지만, 99Tc-표지된 펩티드의 양은 펩티드 분자의 99Tc-표지된 단편을 단위로 10-9～10-7 M 사이에서 변화되었다. 이 실험을 위해, 99mTc-표지된 펩티드 및 99Tc-표지된 펩티드는 상기 실시예 24의 방법에 의해 제조되었고 실시예 28에 상기한 바와 같이 분석을 수행하였다. 이같은 분석의 결과로부터, 99mTc-표지된 펩티드에 대한 IC50 지수는 1～5 nM인 반면에, 금속 이온이 없는 천연 펩티드는 2～5 nM 범위의 IC50 지수를 갖았다. 이같은 지수는 실시예 28고 29에 상기한 바와 같은 다양한 포화 결합 실험에서 얻어진 것과 유사한 것이다. 도 11은 99Tc-표지된 펩티드에 대한 이 실험에서 얻어진 결합 곡선을 나타낸 것이다.
실시예 31 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg과 비표지화된 Thr-D-Lys-Gly-D- Cys-Arg를 이용한 인체 다형다핵 세포와의 비교 결합
비표지화된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드를 10-10～10-4 M로 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 30의 방법을 사용하여 이 실험을 수행하였다. 이 비표지화된 펩티드는 99mTc-표지된 펩티드와 실제로 비교가 되지 않았다. 비표지화된 펩티드에 대한 검측된 IC50 지수는 10-5 M을 초과하였는데, 실질적으로 99mTc-표지된 펩티드에 대한 IC50 지수보다 높았다. 이 결과를 통해 99mTc-와 99Tc-표지된 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 반면에, 비표지된 펩티드는 최저의 생물학적 활성을 갖는다. 도 11은 99Tc-표지된 펩티드에 대한 결합 곡선과 함께, 이 실험에서 얻어진 결합 곡선을 나타낸 것이다.
실시예 32 - 천연 터프트신을 사용한 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 인체 다형다핵 세포와의 비교 결합
실시예 28에서 상기한 바와 같이, 포르말린 정착된 PMN 백혈구(분석 튜브당 1 mL의 최종 부피에서의 2.5 × 106 cells)를 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드와 천연 터프트신 Thr-Lys-Pro-Arg 펩티드의 혼합물로 배양시켰다. 99mTc-표지된 펩티드 일정량이지만 소량을 실시예 28에 상기한 바와 같이 제조하였다. 하지만, 99Tc-표지된 펩티드의 양은 펩티드 분자의 99Tc-표지된 단편을 단위로 10-10～10-5 M 사이에서 변화되었다. 분석은 실시예 28에 상기한 바와 같이 실시하였다. 천연 터프트신에 대한 IC50 지수는 100 nM 정도의 결과를 얻었는데, 종래 기술로부터 얻어진 결과와 일치하는 바이다. 이 결과를 통해, 또한 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg가 천연 터프트신 분자와 같은 리셉터와 결합한다는 것이 증명되었다.
실시예 33 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg과 99Tc-표지된 Thr-[D-Lys-Gly- D-Cys]-Arg를 이용한 HL-60 세포와의 비교 결합
HL-60 세포상의 터프트신 리셉터에 대한, 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드와 99Tc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드의 비교 결합도 또한, 상기 실시예 28의 방법에 의해, 실시예 29에 상기한 바와 같은 HL-60 세포를 사용하여 수행하였다. 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드에 대한 IC50 지수 1～5 nM는 상기 실시예 29의 포화 결합 실험에서의 해당 99mTc-표지된 펩티드에 대해 얻은 것과 동일한 것이다.
실시예 34 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg과 비표지화된 Thr-D-Lys-Gly-D- Cys-Arg를 이용한 HL-60 세포와의 비교 결합
HL-60 세포상의 터프트신 리셉터에 대한 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg와 비표지화된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드의 비교 결합을 상기 실시예 31의 방법에 의해 수행하였다. Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드에 대한 IC50 지수가 10-5 M을 초과하게 얻었는데, 99mTc-와 99Tc-표지된 펩티드는 생물학적 활성이 있는 것과 비교되는 것이다.
실시예 35 - 천연 터프트신을 사용한 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 HL-60 세포와의 비교 결합
HL-60 세포상의 터프트신 리셉터에 대한 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg 펩티드와 천연 터프트신 Thr-Lys-Pro-Arg 펩티드의 비교 결합도 또한, 상기 실시예 32의 방법에 의해 수행하였다. 이 실험으로부터 천연 Thr-Lys-Pro-Arg 펩티드에 대한 유사한 IC50 지수 100 nM 정도의 결과를 얻었는데, 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys -Arg가 천연 터프트신 분자과 동일한 리셉터와 결합한다는 관찰과 같은 것이지만, 99mTc-표지된 펩티드가 천연 펩티드에 비해 리셉터에 대한 친화도가 높다.
실시예 36 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 터펜틴 유도 멸균 농양을 갖는 래빗의 형상화
공지된 바와 같은 동물 모델(Tsan MF: Studies of galluim accumulation in inflammatory lesions: III. Role of polymorphonuclear leukocytes and bacteria. J Nucl Med 19:492-495, 1978)에 따라, 터펜틴을 래빗의 왼쪽 뒷다리 허벅지에 주사하였다. 4 일 경과 후에, 상기 실시예 23의 방법에 의해 제조된 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 0.5 mCi 주사를 래빗에게 그의 귀 정맥을 통해 투여하였다. 신티그램촬영법적 영상을 얻었으며, 이 펩티드 주사후 10 분 이내에 농양 부위가 가시화되었다. 도 12는 주사하고 15 분 경과후에 얻은 결과를 나타낸 것이다. 농양은 주사하고 4 시간 경과후에, 연구 기간 과정 중에 가시화되기도 하였다.
실시예 37 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 휘플볼 유도 염증의 래빗 형상화
보고된 모델(Tsan MF, 상기 참조)을 이용하여, 휘플볼(whiffle ball)을 래빗의 왼쪽 뒷다리 허벅지에 피하로 이식하였다. 7 일 경과 후에, 이 휘플볼에 카세인을 주사하여 국부 염증을 야기시켜키고, 상기 실시예 23의 방법에 의해 제조된 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 0.5 mCi 주사를 래빗에게 그의 귀 정맥을 통해 투여하였다. 신티그램촬영법적 영상을 얻었으며, 이 펩티드 주사후 10 분 이내에 휘플볼내에서 염증 부위가 가시화되었고, 영상은 주사하고 4 시간 경과후에, 연구 기간 과정 중에 지속되었다.
실시예 38 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 마우스 모델에서의 HL-60 종양의 형상화
500,000 HL-60 세포를 식염수에서의 Matrigel, Becton Dickinson Labware(Bedford, MA)에 의해 배급되는 기저막 세포간질 생성물의 용액(0.1% 식염수) 100 μL와 혼합하였다. 이것을 제모한 마우스의 왼쪽 뒷다리 허벅지에 피하 주사하였으며, 10～20 일 이내에 가시화되고 촉각 진단이 가능한 종양 이종 이식편을 형성하였다. 상기 실시예 23의 방법에 의해 제조된 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 20～40 μCi 주사를 마우스의 귀 정맥으로 주사하였다. 주사하고 10 분 경과후에 시작하여, 이 마우스의 전신 신티그램촬영법적 영상을 얻었다. 이종 이식편에 이 펩티드가 국부화하는 것이 10 분 이내에 가시화되었고, 6 시간의 실험 전반에 걸쳐 관찰되었다.
실시예 39 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 종양의 형상화
소세포 폐암, 유방암, 전립선암 및 흑색종을 포함하는 다양한 유형의 종양을 앓는 환자들에게 상기 실시예 23이나 24에 의해 제조된 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 5～20 mCi를, 펩티드의 총량이 약 1～10 μg이 되도록 주사하였다. 주사하고 10 분 경과후에 시작하여, 주기적인 전신 신티그램촬영법적 영상을 얻어서 종양 부위에 방사선 표지된 펩티드의 국부화를 관찰하였다. 이같은 종양을 형상화하는 데 표지된 펩티드의 유효성이 주목된다.
실시예 40 - 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 이용한 농양 및 염증의 형상화
염증이나 농양 추정 부위를 갖는 환자에게 상기 실시예 23이나 24에 의해 제조된 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 5～20 mCi를, 펩티드의 총량이 약 1～10 μg이 되도록 주사하였다. 주사하고 10 분 경과후에 시작하여, 주기적인 전신 신티그램촬영법적 영상을 얻어서 염증이나 농양 부위에 방사선 표지된 펩티드의 국부화를 관찰하였다. 이같은 부위를 형상화하는 데 표지된 펩티드의 유효성이 주목된다.
실시예 41 - 안정한 레늄 착물 펩티드: 유효한 식세포 자극 화합물로서 Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 합성 및 그 안정성
펩티드 Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg ReO[V]와 착물을 형성한 후에 터프트신 리셉터와 결합하는 펩티드로서 디자인되었으며, 실시예 21에 상기한 바와 같이 합성하였다. 트리플루오르아세테이트 염으로서 이같은 펩티드 91 mg을 메탄올(15 mL)에 담고, 옥소트리클로로비스(트리페닐포스핀)레늄[V] 85 mg을 첨가하였다(Johnson NP et al: Inorganic Chemistry, 9:145～148, 1967). 메탄올성 나트륨 아세테이트(1 mL)를 첨가한 후에, 반응 혼합물을 반응색이 그린빛 노란색에서 어두운 자주색이나 탁한 브라운색을 변할 때까지 환류시켰다. 환류시간은 약 15～20 분이면 충분하였다. 그 후에, 메탄올을 증발시켜 제거하고, 잔류 고체를 물에 녹여 여과시키고, 여과물을 동결건조시켜 이 펩티드의 불순한 레늄 착물을 얻었다. 이 불순한 레늄 착물 펩티드는, 실시예 23에 일반적으로 상기된 바와 같은 세미-예비성의 RP-HPLC로 정제하였다. 이 생성물의 HPLC 프로필은 Re-표지된 펩티드 또한 ReO[V] 핵중심에서의 이성질화에 기인한 두 가지 이성질체(syn과 anti)를 나타내는, 머무름 시간 13.8 min.과 14.3 min.의 유사한 두 가지 피크를 나타낸다는 점에서 해당 99mTc-표지된 펩티드에 대해 상기한 바와 유사하다. 이 Re-표지된 펩티드는 또한 ReO[V] 배위 결합 물질의 특징인 λ 320～360 nm에서의 UV 흡수를 나타내었다. 수용액으로부터 동결건조시킨 후, 정제된 생성물을 밝은 핑크색 고체로서 얻었다. 전자 분사 질량 분석기(ES-MS)를 통해, 레늄 착물 펩티드의 질량에 대한 정확한 결과를 얻었다. 질량의 계산치는 761과 763이었고(Re의 두 가지 천연 이성질체에 기인), 측정치(M+1)는 762.3과 764.3이였다. 금속 이온과 펩티드의 착물은 순환성 2 색성 연구에 의해 용이하게 확정될 수도 있다. 이 정제된 생성물은 RP-HPLC에 의해 점측된 바와 같이, 5 개월의 연구 기간 동안 -20 ℃로 보관하였을 경우 안정한 것으로 나타났다. 2～5 ℃에서 보관된 정제된 생성물의 수용액도 또한 동일 기간 동안에 걸쳐 안정한 것으로 밝혀졌다.
실시예 42 - 천연 터프트신의 유효한 유사체, Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-Cys]- Arg에 의한 식세포 자극
새로 배양된 다형다핵(PMN) 과립성 백혈구를 이용하여 분석을 실시하였다. 수여자의 인체 혈액(50～100 mL)을 항응고제 ACD와 혼합하였다. 이 혈액을 처리하여 임파구 분리 배지(histopaque, from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 통해 원심분리된 담황갈색의 코팅을 얻었다. 오염 적혈구를 저장성 처리법으로 용해시켰다. 배지로 이 세포들을 씻어 주고, 차별적으로 산측하여 >95% 생체 적합성의 약 96% PMN 을 알 수 있었다. 세포 현탁액 400 μL(1 × 106 cells)를 3 mL 폴리스티렌 튜브에서 실시예 41에 상기한 바와 같이, Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 농축액 5 μL로 37 ℃에서 15 분 동안 배양시켰다. 그 후에, 가열 불활성화된 이스트 세포의 100 μL(5 × 106 cells)를 첨가하였다. 그 후에, 가열 불활성화된 이스트 세포들의 세포 현탁액 최종 부피 0.5 mL를 37 ℃에서 15 분 동안 배양시켰다. PMN 자극의 기본 단계를 측정하기 위한 대조군으로서 PBS 블랭크와 함께, 다양한 농도의 Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg로 분석을 3 회 실시하였다. 그 후에, 분석 튜브를 옮겨 4 ℃에서 보관하고 반응을 종결시키고, 도말표본을 제조하여 염색하고, 카운트로 400 PMN에 의해 흡수된 이스트 세포의 수를 산측하였다. 식작용 자극도 백분율은 다음 식에 따라 산측하였다:[(금속 펩티드 자극 세포에 의해 흡수된 이스트 세포의 수 - 대조군 세포에 의해 흡수된 이스트 세포의 수)/(금속 펩티드 자극 세포에 의해 흡수된 이스트 세포의 수)] × 100. 도 13에 실험 결과를 나타내었으며, 최대 자극도가 약 1 nM 농도에서 나타나는 금속 펩티드에 대한 종 모양의 투여 반응 곡선을 나타낸다.
실시예 43 - 천연 터프트신의 유효한 유사체, Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-Cys]- Arg에 의한 헥소오스 모노포스페이트 문합 활성도 자극의 측정에 대한 니트로블루 테트라졸륨 염료 환원 분석
실시예 42에 상기된 바와 같이, 새로 배양된 다형다핵(PMN) 과립성 백혈구를 이용하여 분석을 실시하였다. 분석을 시작하기 전에 이 세포와 모든 반응 용액들을 37 ℃로 유지하였다. 세포 현탁액 595 μL(10 × 106 crlls)를 10 mL 보로실리케이트 글래스 튜브에서 배양시키고, 니트로블루 테트라졸륨 용액(nitroblue tetrazolium solution: 0.1% PBS) 400 μL와 상기 실시예 41에서과 같이 제조된 Thr-ReO[V]- [D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 농축액 5 μL(최종 배양 농도를 1 × 10-12 M와 1 × 10-7 M 사이로 얻을 수 있도록)을 혼합하고, 37 ℃에서 30 분 동안 배양시켰다. 용액을 원심분리하고, PBS로 1 회 씻어 주었다. 이 세포 팰렛을 온화하게 초음파 분해 처리하여 디옥산(1 mL)으로 추출하여 세포 내부에서 생성된 포르마잔을 용해시켰다. 원심분리 후에 얻어진 투명한 용액은 λ 540 nm에서 분광학적으로 판독되었다. PMN 활성도의 기본 단계를 측정하기 위해 PBS 블랭크를 이용하여, Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 몇몇 농도로 분석을 3 회 실시하였다. 최대 자극도가 금속 펩티드 1～5 nM 농도로 얻어진 것으로 이 결과는 나타났다. 천연 터프트신은 100 nM 농도에서 최대 자극도를 나타내었다. 모든 경우에서의 투여 반응 곡선은 최대 자극을 생성시키는 것 이상의 증가된 농도는 생물학적 반응을 감소시키는 종 모양의 곡선이었다.
실시예 44 - 99mTc-표지된 구조체의 생체내 안정성
마우스 6 마리의 군에게 본 발명의 99mTc-착물 펩티드 50～100 μCi 정도를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하거나 피하 주사하였다. 이 동물들의 오줌 샘플을 30～120 분의 다양한 시간 간격으로 채집하였다. 이 오줌 샘플은 원심 분리시켜 침전물 불용성 미립자들과 온라인 방사선 트레이서 검측기를 이용한 역상 고성눙 액체 크로마토그래피에 의해 분석되는 상등액으로 분리하였다. 테스트된 99mTc-펩티드 모두의 오줌 샘플 전체의 방사선 용리 프로필은 모사슬 99mTc-펩티드의 것과 동일하였다. 99mTc-펩티드 구조체에 해당되는 것 이외의 피크는 그 어떤 프로필에서 검측되지 않았기에, 99mTc-펩티드 구조체가 신장을 거쳐 온전하게 분비되며, 그 어떤 신진대사의 손상이 진행되지 않는다는 것이 제시된다. 따라서, 이것은 테스트된 99mTc-펩티드 구조체와 본 발명의 금속 펩티드가 일반적으로 신진대사적으로 안정하다는 증거를 제공하는 것이다. 다음 표 1에 분석된 99mTc-펩티드 구조체를 나타내었다.
99mTc-표지된 구조체의 정맥 주사 또는 피하 주사 이후의 오줌의 RP-HLPC 결과
99mTc-표지된 구조체 투여 경로 시간 포인트(Min.) 표지된 구조체의 바운드 피크% 오줌의 바운드 피크%
99mTc-[Arg-Gly-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
99mTc-[D-Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala iv, sc 300-120 100% 100%
99mTc-[Arg-Gly-D-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
99mTc-[D-Arg-Gly-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
99mTc-[Gly-Arg-D-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
99mTc-[Gly-D-Arg-D-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
99mTc-[Gly-D-Arg-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
99mTc-[Gly-Arg-Cys]-β-Ala iv 300-120 100% 100%
Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg iv 300-120 100% 100%
Tyr-99mTc-[Gly-Phe-NH-(CH2)2SH] iv 300-120 100% 100%
실시예 45 - Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 경구 생체 적합성
상기 실시예 23에 의해 10 μg 키트를 제조하고, 최종 부피 1.5 mL인 99mTc 5 mCi로 표지하였다. 또한, 상기한 바와 같은 다른 키트 배합물이나 직접적인 표지 방법을 사용할 수도 있다. 이 조제물을 HPLC로 분석하여 펩티드와 99mTc와의 착물이 형성되었는지 확인하였고, SepPak-C18 카트리지에 의한 분석을 통해 이 표지된 키트에 존재하는 콜로이드의 양을 확인하였다. 170～250 μCi 정도의 Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg 측정량(총부피 50～75 μL)를, 오른쪽 넓적다리 근육에 한 시간 이내로 국부 염증을 유발시킬 수 있도록, 케타민 주사(10μL에 10 μg)를 맞은 6 마리의 마우스 각각에게 경구 투여하였다. i.p. 주사된 케타민 마취 하에서 Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 투여하였다. 그 후에, 주사된 동물을 우리에 도로 옮기고 움직임에 구속을 받지 않도록 하였다. 120 분 후에, 이 동물을 제물로 삼았고, 전신 방사선 활성도 분포에 대한 사후 신티그램촬영법적 영상을 개방 시준기가 장착된 신티그램촬영 카메라로 얻었다. 이 동물을 개복하여 그 내장 대부분을 절제해서, 중량을 측정하고, 감마 카운터로 방사선 활성도를 측정하였다. 케타민 염증을 일으킨 근육 또한 이 부위에서의 방사선 활성도 측정하기 위해 절제하였으며, 대조의 목적을 위해 반대쪽 다리로부터 동일한 부위 조각의 근육을 절제하였다. 이렇게 절제된 동물의 신티그램촬영 영상은 케타민-유도 염증의 분명한 가시화를 나타내었다. 방사선 활성 펩티드 또한 신체 전반에 분산된 것으로 관찰되었는데, 이는 이 펩티드의 효과적인 경구 흡수와 순화계의 투과성을 나타낸 것이었다. 하지만, 다량의 활성도가 소화관에 존재하였다. 펩티드의 경구 흡수된 부분은 신장에 다량의 축적량이 명백하게 나타난 바와 같이, 분명하게 전부 신장 경로를 통해 분비되었다. 선택적인 기관 생체 적합성을 도 14에 도시하였다. 그외의 뚜렷한 기관 축적은 관찰되지 않았다. 케타민 염증을 일으킨 근육은 반대쪽의 근육의 축적의 7.7 배를 나타내었다. 염증이 발생한 근육과 혈액의 비는 1 : 1.6이였다. 실시예 44에 상기한 바와 같은 역상 HPLC 기법에 의한 이 동물들의 독립적인 소변 분석은, 소변에서 손상되지 않은 Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 존재를 확인하였는데, 이는 온전한 펩티드의 경구 흡수의 증거를 제공하는 것이었다. 따라서, 이같은 연구들은 Thr-99mTc-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg이 의약학적으로 유효한 양으로 경구 흡수되는 염증 형상화제이고, 생체내에서 신진대사적으로 안정하며, 오줌으로 온전하게 분비된다라는 것을 보여주는 증거를 제공하는 것이다.
실시예 46 - 사이클 소마토스타틴 펩티드에서의 디설파이드 브릿지의 등전자 배열성 교체
디설파이드 브릿지 등전자체의 소마토스타틴 동족체. 소마토스타틴과 그의 동족체의 생물학적 활성은 디설파이드 결합의 존재 유무에 좌우된다. 이 고리 구조가 열리는 이 결합의 환원은 생물학적 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 전형적인 기지 소마토스타틴 분자는 다음과 같다.
상기한 바와 같은 모체 소마토스타틴에서의 디설파이드 브릿지를 대체하는 99mTc, 99Tc, 188Re 또는 186Re 결합 부위를 갖는, 본 발명의 방법에 의해 디자인된 소마토스타틴 분자는 다음과 같다.
필요한 금속 이온과 결합한 후에 이 분자들은 소마토스타틴 리셉터와 결합한다.
이 금속 이온-결합 부위, 여기서는 Gly-Gly-Gly-Cys는 L- 및 D- 배열 모두의Gly-Gly-Cys와 Gly-Gly-His, 및 각각의 아미노산이나 유사체가 금속이온과 배위 결합 구체의 원자가를 만족시키기에 유용한 N, S, 두 개 N 또는 N과 S를 함유하는, 다른 아미노산과 그의 유사체로 이루어진 구조체를 포함하는데 이에 한정되는 것은 아닌, 그 외의 금속 이온 결합 영역으로 치환될 수 있다.
이 분자는 고체-상 펩티드 합성의 공지 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 금속 이온으로 이같은 분자를 표지하는 것은 실시예 5～10에 상기한 바와 같은 방법이나 그의 변형법으로 용이하게 달성할 수 있다.
실시예 47 - 사이클 멜라노트로핀 펩티드에서의 락탐 브릿지의 등전자 배열성 교체
락탐 브릿지 등전자체의 멜라노트로핀 동족체. 하기한 바와 같은 멜라노트로핀(melanotripine) 동족체의 높은 효능은 락탐 결합의 존재 유무에 좌우된다. 이같은 결합이 없어, 결과적인 형태적 강제성의 결여가 생물학적 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 다음과 같은 구조의 멜라노트로핀 사이클 펩티드를 출발물질로서 사용하였다.
다음 분자는 본 발명의 방법에 의해 디자인된 것으로서, 모체 멜라노트로핀 동족체에서의 락탐 브릿지를 대체하는 99mTc, 99Tc, 188Re 또는 186Re 결합 영역을 갖는다.
이같은 전구 분자는 필요한 금속 이온과 결합한 후에, 멜라노트로핀 리셉터에서 생물학적 활성을 갖는다.
이 금속 이온-결합 부위, 여기서는 Gly-Gly-Gly-Cys는 L- 및 D- 배열 모두의Gly-Gly-Cys와 Gly-Gly-His, 및 각각의 아미노산이나 유사체가 금속이온과 배위 결합 구체의 원자가를 만족시키기에 유용한 N, S, 두 개 N 또는 N과 S를 함유하는, 다른 아미노산과 그의 유사체로 이루어진 구조체를 포함하는데 이에 한정되는 것은 아닌, 그 외의 금속 이온 결합 영역으로 치환될 수 있다.
이 분자는 고체-상 펩티드 합성의 공지 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 금속 이온으로 이같은 분자를 표지하는 것은 실시예 5～10에 상기한 바와 같은 방법이나 그의 변형법으로 용이하게 달성할 수 있다.
실시예 48 - 111In 표지용 소마토스타틴 동족체 펩티드
선형 펩티드 D-Phe-Lys(Nε비스카르복시메틸)-Thr-D-Trp-Lys-Val-Lys(Nε비스카르복시메틸)-Trp-NH2는 용액-상이나 고체-상 펩티드 합성의 공지 방법에 의해 합성하였다. 이같은 서열은 111In과 착물을 형성한 후에, 소마토스타틴 리셉터와 결합한다. 이 펩티드의 용액은 적절한 완충 용액으로 제조하고 111InCl3와 혼합하여, 111In 금속 이온이 이 펩티드 서열에서의 두 가지 리진 잔기의 ε-아미노기상에 있는 카르복시메틸기와 착물을 형성함으로써 펩티드의 구조 형태가 겹쳐지고 고정된 111In 표지된 펩티드 물질을 얻었다. 111In과 착물을 이루지 않은 펩티드 분자들은 소마토스타틴 리셉터와 결합하지 않았다.
실시예 49 - 111In 표지용 멜라노트로핀 동족체 펩티드
펩티드 Ac-Nle-Lys(Nε비스카르복시메틸)-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Nε비스카르복시메틸)-NH2는 용액-상이나 고체-상 펩티드 합성의 공지 방법에 의해 합성하였다. 이같은 펩티드는 111In과 착물을 형성한 후에, 소마토스타틴 리셉터와 결합한다. 이 펩티드의 용액은 적절한 완충 용액으로 제조하고 111InCl3와 혼합하여, 111In 금속 이온이 이 펩티드 서열에서의 두 가지 리진 잔기의 ε-아미노기상에 있는 카르복시메틸기와 착물을 형성함으로써 펩티드의 구조 형태가 고정된 111In 표지된 펩티드 물질을 얻었다. 111In과 착물을 이루지 않은 펩티드 분자들은 멜라노트로핀 리셉터와 결합하지 않았다.
실시예 50 - Tc 또는 Re 표지용 에스트로겐 동족체 펩티드
펩티드 유도체, Tic(7-OH)-Thr-NH(CH2)2SH 또는 D-Tic(7-OH)-D-Thr-NH(CH2)2SH는, 99mTcO[V] 또는 ReO[V]와 착물을 형성하는 면에서 에스트로겐을 모사하도록 리간드를 디자인한 바와 같이 펩티드 합성의 기지 방법에 따라 합성하였다. 펩티드 유도체, Tic(7-OH)-Thr-NH(CH2)2SH는 금속 이온과 결합한 후에, 에스트로겐 동족체와 같이 생물학적 활성도를 갖으며, 다음과 같은 구조를 갖는다.
이 펩티드는 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 기재한 바와 같은 방법이나 그의 변형법에 의해 표지되었다. 이 표지된 분자는 에스트로겐 리셉터와 결합한 반면에, 비표지된 분자는 이같은 리셉터에 대한 친화도가 거의 또는 전혀 없다.
실시예 51 - Tc 또는 Re 표지용 다른 에스트로겐 동족체 펩티드
Tic(7-OH)-Ser-Cys 또는 D-Tic(7-OH)-D-Ser-Cys의 구조를 갖는 펩티드 유도체를, 99mTcO[V] 또는 ReO[V]와 착물을 형성한 후에 에스트로겐 리셉터와 결합하도록 다른 리간드를 디자인한 바대로 펩티드 합성의 기지 방법에 따라 합성하였다. 펩티드 유도체, Tic(7-OH)-Ser-Cys는 금속 이온과 결합한 후에, 에스트로겐 동족체와 같이 생물학적 활성도를 갖으며, 다음과 같은 구조를 갖는다.
이 펩티드는 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 기재한 바와 같은 방법이나 그의 변형법에 의해 표지되었다. 이 표지된 분자는 에스트로겐 리셉터와 결합한 반면에, 비표지된 분자는 이같은 리셉터에 대한 친화도가 거의 또는 전혀 없다.
실시예 52 - Tc 또는 Re 표지용 라민-유도 YIGSR 펩티드 동족체
혈소판은 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)로 이루어진 라민(laminin)-유도 펩티드 서열과 결합하는 67kDa 리셉터를 함유한다(Tandon NN, Holland EA, Kralisz U, Kleinman HK, Robey FA, and Jamieson GA: Interaction of human platelets with laminin and identification of the 67 kDa laminin receptor on platelets. Biochem J 274:535-542, 1991). 이같은 펩티트 리셉터는 혈소판과 온전한 라민 분자의 상호 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이같은 리셉터를 통한 혈소판의 라민에 대한 유착성 그 자체가 혈소판 활성화를 초래하는 것은 아니다(Ill CR, Engvall E, and Rouslahti E: Adhesion of platelets to laminin in the absence of activation. J Cell Biol 99:2140-2145, 1984).
YIGSR 펩티드 서열을 함유한 펩티드류는 anti-metastatic agent로서 제공되어 왔다(U.S. Patent No.5,039,662, Peptide with Anti-Matastatic Activity, to Schasteen CS; U.S. Patent No. 5,092,885, Peptides with Laminin Activity, to Yamada Y, Graft JO, IWamoto Y, Rober F, kleinman HK, Sasaki M and Martin GR; and U.S. Patent 5,236,903, Polypeptide Comprising Repeated Cell-Adhesive Core Sequences, to Saki I, Nishi N, Azuma I, Tokura S.). 이같은 특허들은 YIGSR 펩티드 서열, 아실레이트된 YIGSR 펩티드 서열, 사이클 YIGSR 서열 및 반복 YIGSR 선형 서열을 함유하는 좀더 긴 서열들을 포함한다.
펩티드 유도체, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg는 99mTcO[V] 또는 ReO[V]와 착물을 형성하는 점에서 라민의 유착성 펜타펩티드 서열, YIGSR을 모사하도록 리간드를 디자인한 바대로 펩티드 합성의 공지 방법에 따라 합성하였다. 이 펩티드는 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 기재한 바와 같은 방법이나 그의 변형법에 의해 표지되었다. 이 표지된 분자는 라민 리셉터와 결합한 반면에, 비표지된 분자는 이같은 리셉터에 대한 친화도가 거의 또는 전혀 없다.
실시예 53 - 암의 형상화를 위한 소마토스타틴 동족체의 용도
상기 실시예 46이나 48 중 그 어떤 것의 소마토스타틴 동족체를상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여, 99mTc 5～20 mCi 사이로, 또는 실시예 48의 경우에서는 111In 2～10 mCi 사이로 표지시켰다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 펩티드의 총량은 약 1～10 μg이 될 것이다. 이 표지된 소마토스타틴 동족체는 소마토스타틴-리셉터 양성 암을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 주사후 10 분 경과하여 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 방사선표지된 펩티드의 종양 부위 또는 부위들에서의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양을 형상화하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 54 - 암의 형상화를 위한 멜라노트로핀 동족체의 용도
상기 실시예 47이나 49 중 그 어떤 것의 멜라노트로핀 동족체를 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여, 99mTc 5～20 mCi 사이로, 또는 실시예 49의 경우에서는 111In 2～10 mCi 사이로 표지시켰다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 펩티드의 총량은 약 1～10 μg이 될 것이다. 이 표지된 멜라노트로핀 동족체는 흑색종과 같은 멜라노트로핀-리셉터 양성 암을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 주사후 10 분 경과하여 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 방사선표지된 펩티드의 종양 부위 또는 부위들에서의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양을 형상화하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 55 - 암의 형상화를 위한 에스트로겐 동족체의 용도
상기 실시예 50이나 51 중 그 어떤 것의 에스트로겐 동족체를 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여 99mTc 5～20 mCi 사이로 표지시켰다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 펩티드의 총량은 약 1～10 μg이 될 것이다. 이 표지된 에스트로겐 동족체는 유방암과 같은 에스트로겐-리셉터 양성 암을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 주사후 10 분 경과하여 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 방사선표지된 펩티드의 종양 부위 또는 부위들에서의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양을 형상화하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 56 - 암치료를 위한 소마토스타틴 동족체의 용도
상기 실시예 46의 소마토스타틴 동족체를 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여, 과레늄산염을 환원시키는 데 필요한 바와 같이 증가된 Sn(II) 농축물과 함께, 186Re 또는 188Re 1～100 mCi 사이로 표지시켰다. 환자는 소마토스타틴-리셉터 양성 암을 진단받은 사람을 최적으로 선택하였는데, 상기 실시예 53의 진단 형상화에 의해 편리하게 진단될 수도 있다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 치료용 방사선 동위원소 조제물에서의 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 치료용 펩티드의 총량은 약 5～25 μg이 될 것이다. 이 표지된 소마토스타틴 동족체는 소마토스타틴-리셉터 양성 암을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 바람직한 치료 효과를 얻는 데 필요한 정도로 투여를 반복한다. 186Re와 188Re는 모두 감마와 베타 방사능을 방사하기 때문에, 주사후 10 분이 되자마자 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 방사선 표지된 펩티드의 종양 부위 또는 부위들에서의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양을 치료하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 57 - 암치료를 위한 멜라노트로핀 동족체의 용도
상기 실시예 47의 멜라노트로핀 동족체를 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여, 과레늄산염을 환원시키는 데 필요한 바와 같이 증가된 Sn(II) 농축물과 함께, 186Re 또는 188Re 1～100 mCi 사이로 표지시켰다. 흑색종 환자는 멜라노트로핀-리셉터 양성 암을 진단받은 사람을 최적으로 선택하였는데, 상기 실시예 54의 진단 형상화에 의해 편리하게 진단될 수도 있다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 치료용 방사선 동위원소 조제물에서의 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 치료용 펩티드의 총량은 약 5～25 μg이 될 것이다. 이 표지된 멜라노트로핀 동족체는 멜라노트로핀-리셉터 양성 암을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 바람직한 치료 효과를 얻는 데 필요한 정도로 투여를 반복한다. 186Re와 188Re는 모두 감마와 베타 방사능을 방사하기 때문에, 주사후 10 분이 되자마자 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 방사선 표지된 펩티드의 종양 부위 또는 부위들에서의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양을 치료하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 58 - 암치료를 위한 에스트로겐 동족체의 용도
상기 실시예 50과 51의 에스트로겐 동족체를 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여, 과레늄산염을 환원시키는 데 필요한 바와 같이 증가된 Sn(II) 농축물과 함께, 186Re 또는 188Re 1～100 mCi 사이로 표지시켰다. 환자는 유방암이나 그 외의 에스트로겐-리셉터 양성 암을 진단받은 사람을 최적으로 선택하였는데, 상기 실시예 55의 진단 형상화에 의해 편리하게 진단될 수도 있다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 치료용 방사선 동위원소 조제물에서의 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 치료용 펩티드의 총량은 약 5～25 μg이 될 것이다. 이 표지된 에스트로겐 동족체는 에스트로겐-리셉터 양성 암을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 바람직한 치료 효과를 얻는 데 필요한 정도로 투여를 반복한다. 186Re와 188Re는 모두 감마와 베타 방사능을 방사하기 때문에, 주사후 10 분이 되자마자 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 방사선 표지된 펩티드의 종양 부위 또는 부위들에서의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양을 치료하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 59 - 99mTc-D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 이용한 혈전증의 형상화
상기 실시예 1～4 중 그 어떤 것의 RGD 동족체 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala는, 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 방법이나 이의 변형 방법을 이용하여 99mTc 5～20 mCi 사이로 표지시켰다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 치료용 방사선 동위원소 조제물에서의 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 진단용 형상화용법의 펩티드 총량은 약 1～10 μg이 될 것이다. 이 표지된 RGD 동족체를 혈전증이나 혈병을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 주사후 10 분이 경과하고 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 혈전증에 걸린 부위나 혈병을 포함한 혈소판 누적에 대한 방사선 표지된 펩티드의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 혈전증을 형상화하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 60 - 99mTc-D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 이용한 종양들의 형상화
상기 실시예 1～4 중 그 어떤 것의 RGD 동족체 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala는, 상기 실시예 5～10, 또는 23～24에 개시된 바와 같은 어떤 방법이나 그 변형법을 이용하여 99mTc 5～20 mCi 사이로 표지시켰다. 본 발명의 동족체는 펩티드와 금속 이온의 비율이 2 : 1 정도로 적게, 경우에 따라서는 더욱 적게 이용할 수도 있다. 따라서, 펩티드의 최소량은 일반적으로 치료용 방사선 동위원소 조제물에서의 금속 이온의 양에 따라 결정되었다. 통상적으로, 진단용 형상화용법의 펩티드 총량은 약 1～10 μg이 될 것이다. 이 표지된 RGD 동족체를 전이성 또는 그 외의 종양들을 갖는다고 추정되는 환자에게 정맥 주사 또는 국부 전달에 의해 투여하고, 주사후 10 분이 경과하고 시작하여 주기적인 전신 신티그램촬영 영상을 얻어 종양 부위나 부위들에 대한 방사선 표지된 펩티드의 집중화를 측정하였다. 이 표지된 펩티드가 이같은 종양들을 형상화하는 데 유효함이 주목된다.
실시예 61 - 테트라덴데이트 금속 이온 RGD 동족체의 디자인 및 합성
펩티드 유도체 D-Arg-Gly-His-β-Ala는, 상기 실시예 1～3의 방법과 같은 공지된 펩티드 합성법이나 그의 변형법에 의해 합성하였다. 이 펩티드 유도체 D-Arg-Gly-His-β-Ala는 Cu, Co, Zn, Ni 또는 Mn과 같은 테트라덴테이트(tetradendate) 금속 이온과 착물을 형성시켰다. 이 금속 이온과 결합하면, 이 펩티드는 활성화된 혈소판상의 헤테로다이머 리셉터 GP IIb/IIIa와 특정적으로 결합한다. 따라서, 이같은 펩티드-금속 이온 착물은 생체내 혈전과 결합할 수 있으며, 항-혈전제로서 및 심근 경색증의 치료제로서의 용도가 발견될 수도 있다. 이같은 펩티드의 Mn 착물은 또한, 자기 공명 영상화 기법에 의해 포유 동물의 감춰진 정맥 트롬빈이나 폐 색전을 찾는 데 이용할 수도 있다. 금속 이온이 없는 펩티드 분자는 혈소판 리셉터에 대해 불활성이든지 매우 약한 리간드들이다.
실시예 62 - 테트라덴데이트 금속 이온 터프트신 동족체의 디자인 및 합성
펩티드 유도체 Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg는, 상기 실시예 1～3의 방법과 같은 공지된 펩티드 합성법이나 그의 변형법에 의해 합성하였다. 이 펩티드 유도체 Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg는 Cu, Co, Zn, Ni 또는 Mn과 같은 테트라덴테이트 금속 이온과 착물을 형성시켰다. 이 금속 이온과 결합하면, 이 펩티드는 활성화된 다형다핵 백혈구와 대식세포상의 터프트신 리셉터에 특정적으로 결합하여 이같은 세포들에서의 식작용을 촉진시킨다. 이같은 펩티드-금속 이온 착물은 염증 치유하는 데 PMN 백혈구와 대식세포를 통해 매개되는 생물학적 작용을 증진시키는 데와, 항원의 진행 및 이를 나타내는 데 사용할 수도 있다. 이같은 펩티와 Mn의 착물은 또한, 자기 공명 영상화 기법에 의해 포유 동물의 감염 및 염증 병소들을 찾는 데 이용할 수도 있다. 금속 이온이 없는 펩티드 분자는 혈소판 리셉터에 대해 불활성이든지 매우 약한 리간드들이다.
실시예 63 - 식세포 자극 화합물로서의 Thr-ReO[V]-[D-Lys-Gly-D-His]-Arg의 합성 및 안정성
펩티드 유도체 Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg는, 상기 실시예 41에 기재한 바와 같이, ReO[V]와 착물을 형성한 후에 과립성 백혈구상의 터프트신 리셉터와 결합하는 또다른 펩티드로서 디자인되고 합성되었다. 이같은 펩티드는 금속 착물화를 목적으로 N4 리간드를 함유하도록 디자인되었다. 이 Re 금속이온과 배위 결합하는 4 개의 질소 중 3 개는 펩티드 골격의 일부이지만, 네 번째 질소는 His 잔기의 측쇄로부터의 이미다졸 질소이다. 트리플루오르아세테이트 염으로서의 이같은 펩티드 32 mg을 옥소트리클로로비스(트리페닐포스핀)레늄[V] 40 mg과 반응시키고, 상기 실시예 41에 기재한 바와 같은 HPLC 방법에 의해 정제하였다. Re-표지된 펩티드 배합물은 λ 320～360 nm에서의 UV 흡광, 환상 디크로이즘 연구, 원소 분석 및 전자 분사 질량 분석(ES-MS)에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
실시예 64 - 방사선 표지된 식세포 자극 화합물로서의 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly- D-His-Arg
펩티드의 직접 표지. 펩티드 Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg는 N4 금속 이온-결합 영역, 및 터프트신 리셉터를 모사한 생물학적 작용 도메인으로 디자인되었다. 이 펩티드는 상기 실시예 21에 기재한 바와 같이 합성되고 실시예 23의 방법 B에 상기한 바와 나트륨 글루코헵토네이트를 함유하는 주석 환원제에서의 99mTc로 표지되었다. 간략하게는, 이 펩티드 1～10 μg을 발생제 용리된 99mTc-나트륨 퍼테크테테이트(0.5～3.5 mL까지의 부피에서 방사선 활성도 1-35 mCi)와 혼합하고, 주석-글루코헵토네이트(1 mM-200 mM, pH 7.5～8.5)의 질소 퍼지된 완충 용액(200～400 μL)을 첨가하였다. 이 바이알의 상부층 공간을 질소로 퍼지하고, 이 용액을 실온으로 60 분 동안 배양시키거나 100 ℃ 정도에서 15 분 물중탕시켜 배양시켰다. 용액을 냉각시킨 후에 추가로 식염수로 적절하게 희석시켰다. 이같이 99mTc 표지된 펩티드 소량을 C-18 컬럼이 장착된 RP-HPLC로 분석하였는데, 방사선 용리 프로필은 두 가지 피크(머무름 시간 11.2와 13 min.)를 나타내었다. 첫 번째 피크가 일반적으로 두 번째보다 많은 양이었는데, 이 두 피크의 비유은 3 : 1에서 5 : 1 정도이였다. 표지된 펩티드의 샘플들은 또한 상기 실시예 23에서와 같이 ITLC 스트립과 SekPak 카트리지를 이용하여 분석하였다. 일반적으로 방사활성도 75～85%가 펩티드 결합된 것으로, 방사활성도 10～20%가 착물을 형성하지 않은 99mTc로서 용리되고, 방사활성도 1～3%가 99mT-콜로이드가 되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 65 - Cu 금속 이온과 결합한 D-Arg-Gly-D-His-β-Ala 펩티드 구조체
펩티드 유도체 D-Arg-Gly-D-His-β-Ala는, 리간드가 Cu, Co, Zn, Ni 또는 Mn과 같은 테트라덴테이트 금속 이온과 착물을 형성한 후에 활성화된 혈소판 상의 헤테로다이머 리셉터 GP IIb-IIIa에 특정적으로 결합하는 바대로, 상기 실시예 1～3에 일반적으로 기재된 바와 같은 공지된 펩티드 합성법에 따라 합성되었다. 따라서, 이같은 펩티드-금속 이온 착물은 생체내 혈전과 결합할 것이며, 항-혈전제로서 및 심근 경색증의 치료제로서의 용도를 발견할 수도 있다. 이같은 펩티드와 Mn과의 착물은 또한, 자기 공명 영상화 기법에 의해 포유 동물의 감춰진 정맥 트롬빈이나 폐 색전을 찾는 데 이용할 수도 있다. 금속 이온이 없는 펩티드 분자는 혈소판 리셉터에 대해 불활성이든지 매우 약한 리간드들이다.
실시예 66 - Cu 금속 이온과 결합한 Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg 펩티드 구조체
펩티드 유도체 Thr-D-Lys-Gly-D-His-Arg는, 리간드가 Cu, Co, Zn, Ni 또는 Mn과 같은 테트라덴테이트 금속 이온과 착물을 형성한 후에 다형다핵 백혈구와 대식세포사의 터프트신 리셉터에 특정적으로 결합하여 이같은 세포들에서의 식작용을 촉진시킬 수 있도록, 상기 실시예 1～3에 일반적으로 기재된 바와 같은 공지된 펩티드 합성법에 따라 합성되었다. 이같은 펩티드-금속 이온 착물은 또한, 감염을 치유하는 데 대식세포 및 PMN 백혈구를 통해 매개되는 생물학적 작용을 증진시기는 데와 항원 진행 및 그 표시에 이용될 수도 있다. 이같은 펩티드와 Mn과의 착물은 또한, 자기 공명 영상화 기법에 의해 포유 동물의 감염 및 염증 병소들을 찾는 데 이용할 수도 있다. 금속 이온이 없는 펩티드 분자는 혈소판 리셉터에 대해 불활성이든지 매우 약한 리간드들이다.
실시예 67 - 다양한 인테그린 리셉터로 지시된 금속 펩티드의 고체상 라이브러리의 구조체
펩티드 합성의 공지 방법을 이용하여, 선형 펩티드의 라이브러리를 얻었다. p-메틸벤질디아민 결합된 폴리스티렌 수지(치환 레벨 0.2～0.35 mM/gm)는 이 수지와 펩티드 사슬 사이의 스페이서로서 작용하는 6-N-Fmoc-아미노헥사논산으로부터 유도되었다. 이 Fmoc 보호기는 20% 피페리딘으로 제거되었고, 이 수지는 8 개의 동등한 부분으로 나뉘었으며, 각각의 개별적인 부분은 다음의 Fmoc-보호기 치환된 아미노산 유도체 중의 그 어떤 한 가지와만 커플링하였다: Asp, Glu, N-Me-Asp, N-Me-Glu, D-Asp, D-Glu, D-N-Me-Asp 및 D-N-Me-Glu. 이같은 커플링 종결 후에, 8 개의 수지 부분 모두를 함께 혼합하고, Fmoc 보호기를 제거하여, 이 수지를 다시 4 개의 동등한 부분으로 나누었다. 각각의 개별 부분들은 다음의 Fmoc-보호기 치환된 아미노산 유도체 중의 그 어떤 한 가지와만 커플링하였다: Cys(Trt), His(Trt), D0Cys(Trt), D-His(Trt). 이 커플링 반응을 종결한 후에, 이 수지을 다시 재조합하고, Fmoc 보호기를 제거하고, Fmoc-Gly를 이같은 수지에 커플링시켰다. 이 글리신으로 Fmoc를 제거한 후에, 이 수지는 16 개의 동등한 부분으로 나뉘었다. 각각의 부분을 다음의 16 개의 아미노산 유도체 중의 단 한 가지와 반응시켰다: Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Orm(Boc), Fmoc-Apr(Boc), Fmoc-Abu(Boc), Fmoc-Aec(Boc), Fmoc-Apc(Boc), Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-D-Lys(Boc), Fmoc-D-Orm(Boc), Fmoc-D- Apr(Boc), Fmoc-D-Abu(Boc), Fmoc-D-Aec(Boc), Fmoc-D-Apc(Boc). 이 커플링을 종결한 후에, 모든 펩티드 수지들은 다시 합쳐졌다. 질소 기체 하에서, Fmoc 보호기를 우선 제거하고, 다양한 아미노산으로부터의 그 외의 산성 불안정한 측쇄 보호기 및 Boc기를 제거하였다. 그 후에, 이같은 방식으로 얻어진 펩티드 수지는 아세트산나트륨의 존재 하에서 옥소트리클로로비스-(트리페닐포스핀)레늄[V]과 반응시켜 이 펩티드에 레늄옥소 이온을 착물화시켰다. 이같은 방식으로 얻어진 512(8×4×1×18) 레늄 펩티드 착물의 생성된 라이브러리는 생물학적 분석용으로 보관되었다.
실시예 68 - 직교 다중 방출 링커 시스템의 다양한 인테그린 리셉터로 지시된 금속 펩티드의 고체상 라이브러리의 구조체
상기 실시예 67에 기재한 바와 같은 512 금속 펩티드의 라이브러리는 또한, 참고문헌으로서 첨부된 것으로 M.Lebel과 그 동료들에 의해 개시된, 직교 다중 방출 링커 시스템(orthogonal multiple release linker system - Lebel M, Krchnak V, Sepetor NF, Seligmann B, Strop P, Felder S, Larn KS: one-bead-one- structure combinational libraries, Biopolymers(Peptide Sci) 37:177-198, 1995)을 이용하여 합성하여서, 펩티드의 일부량이 용액에서 생물학적 분석용으로 비즈로부터 방출될 수 있도록 할 수도 있다. 이같은 목적을 위하여, M.Lebel과 그 동료들에 의해 개시된 바와 같이 이 링커가 먼저 수지에 유착되고, 상기 실시예 67에 의한 아미노산 커플링을 한다. 실시예 67에 상기한 바와 같은 방법에 따라 의해 금속 이온의 착화물도 또한 형성된다.
실시예 69 - 포토링커 시스템의 다양한 인테그린 리셉터로 지시된 금속 펩티드의 고체상 라이브러리의 구조체
상기 실시예 67에 기재한 바와 같은 512 금속 펩티드의 라이브러리는 또한, J.C. Chabala에 의해 Synthetic Chemical Libraries in Drug Development, London, 1995에 개시된 광-불안정성 펩티드 방출 링커 시스템을 이용하여 합성하여서, 펩티드가 용액에서 생물학적 분석용으로 비즈로부터 방출될 수 있도록 할 수도 있다. 이같은 목적을 위하여는, J.C. Chabala에 의해 개시된 바와 같이 이 링커가 먼저 수지에 유착되고, 상기 실시예 67에 의한 아미노산 커플링을 한다. 실시예 67에 상기한 바와 같은 방법에 따라 의해 금속 이온의 착화물도 또한 형성된다.
실시예 70 - 다양한 인테그린 리셉터로 지시된 금속 펩티드의 고체상 라이브러리의 구조체
상기 실시예 67에 기재한 바와 같은 512 금속 펩티드의 라이브러리는 또한, 펩티드 합성을 위해 Boc 화학 반응을 이용할 수도 있다. 라이브러리를 구성하는 일반적인 합성 전략은 Boc-보호기 치환된 아미노산을 사용한다는 것을 제외하고는 동일한 것이다. 이같은 아미노산의 측쇄 작용기들은 Fmoc와 같은 염기성 불안정 보호기에 의해 치환되어 차단되어 있다. 일바적인 방법은 상기 실시예 67에 일반적으로 개시되어 있으며, 이 분야의 숙련가에게 기지된 것이다.
실시예 71 - 제 2의 고체상 라이브러리 합성
상기 실시예 67에 기재한 바와 같은 512 금속 펩티드의 라이브러리는 또한, M. Gysin(Proc Natl Acad Sci USA 81:3998, 1984)에 개시된 바와 같이 핀에 합성될 수 있다. Fmoc(실시예 67)와 Boc(실시예 70)의 두 방법이 이같은 목적을 위해 이용된다 이같은 방식으로 제조된 금속 펩티드는 M. Gysin에 의해 개시된 바와 같이, 다중적정(multititer) 플레이트에서 바로 분석된다 .
실시예 72 - 제 3의 고체상 라이브러리 합성
상기 실시예 67에 기재한 바와 같은 512 금속 펩티드의 라이브러리는 또한, Tengtangel 수지, Merrifield 수지, PAM 수지, Wang 수지, 폴리아미드 수지, 옥심 수지 및 이 분야에 기지된 그 외의 수지과 같은 다양한 그 외의 수지상에 합성될 수도 있다. 이같은 수지는 상기 실시예 67에 참고로 기재되어 있다. 수지들의 그 외 기재 내용은 상기한 바 있는 Fields GB 등의 Principles and practice of solid-phase peptide synthesis, Synthetic Peptides, A User Gide, pp.77-183에 포함되어 있다. 상기 실시예 68과 69에 개시된 다양한 링커들이 이같은 수지와 함께 사용될 수도 있다.
실시예 73 - 가용성 펩티드 라이브러리의 합성
상기 실시예 67, 70 및 72에 기재한 바와 같은 고체상에서의 512 금속 펩티드의 라이브러리는 또한, 가용성 라이브러리로서 얻어질 수도 있다. 이같은 목적을 위하여, 상기한 바와 같은 고체상에서 제조된 512 펩티드 혼합물은 적절한 절단분해 시약을 사용하여 이 수지로부터 분해된다. 수지와 합성에 이용된 분해제의 특성(참조, Fields GB 등의 상기 문헌)에 따라, 생성되는 펩티드는 유리산, 아미드, 히드라지드 또는 에스테르로서 얻어진다. 그 후에, 생성된 펩티드 혼합물은 메탄올에서의 아세트산나트륨 존재 하에서 옥소트리클로로비스(트리페닐포스핀)레늄[V]과 반응시켜 이 펩티드와 레늄옥소 이온의 착물을 형성시켰다. 이같은 방법으로 이 펩티드는 금속 펩티드 착물로 정량적으로 전환된다.
실시예 74 - 그 외의 금속 이온을 이용한 펩티드 라이브러리
상기 실시예 67과 70(고체상 라이브러리) 또는 73(가용성 라이브러리)에 따라 합성된 512 금속 펩티드의 라이브러리는 Zn, Co, Mn, Fe 또는 Cu 이온들(이같은 금속 이온의 염화물 또는 그 외의 적절한 염의 형태로서)로 처리되어 해당 금속 이온 착물 펩티드의 라이브러리를 얻었다. 본질적으로는, 다양한 금속 이온들이 다양한 금속 펩티드 라이브러리를 구성하는 데 사용될 수 있다. 가용성 라이브러리의 경우, 착물화는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 기법 및 질량 분석, 적외선 분광법, 자외선 분광법과 같은 분광법적 방법과, 바람직하게는 환상 디크로이즘에 의해 달라질 수 있다. 금속 펩티드 라이브러리에 결합된 수지의 경우에 있어서, 가장 적합한 분석 방법은 세포간질 지지된 레이저 분해/이온화(MALDI) 기법이다(Siuzadak G et al: Bioorg Med Chem Lett 6:979, 1996; Brown B B et al: Molecular Diversity 1:4-12, 1995).
전술한 모든 내용은 다지 예시적인 것일 뿐이지, 그 외의 예들이 가능하고 포함된 것이다.
본 발명이 이같은 바람직한 예에 관련하여 기재되어 있긴 하지만, 그 외의 예들이 동일한 결과를 얻을 수 있다. 본 발명의 수정 및 변형이 이 분야의 숙련가에게는 명확해질 것이며 다음의 청구 범위에서 이 같은 변형 등의 모두를 포함할 수 있도록 하였다. 앞서 인용된 모든 출원, 특허 및 공개문헌의 기재내용, 그리고 대응 출원의 기재내용은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
도 1은 먼저 형태적으로 구속되지 않은 금속 이온과 결합하고, 그 후 형태적으로 구속되는 금속 이온과 결합하는 본 발명에 의한 직선형 펩티드를 개략적으로 도시한 것이다. 도 1A는 두 개의 비평행 B-시트 사이에 반전이 위치하는 큰 펩티드나 프로틴 부분과 같은 자연 발생하는 역회전 구조를 도시한 것이다. 도 1B는 금속 이온과 결합하지 않고 무작위적인 구조를 지닌 본 발명에 의한 펩티드를 개략적으로 도시한 것이다. 도 1C는 금속 이온과 착물화하는 본 발명에 의한 펩티드를 도시한 것이다. 이 착물화는 역회전 구조를 형성하여, 그 한정성이 매우 큰 구조를 얻었다.
도 2는 본 발명에 의한 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala의 일차 비표지된 구조와 본 발명의 금속 이온 표지된 펩티드의 확대 입체 도면(relaxed stereo view)을 나타낸 것이다.
도 2A와 2B는 메탈옥소기의 이성질화에 의해 생성되는 두 가지 이성질체를 나타낸 것이다. 도 2C는 겹쳐진 도 2A와 도 2B의 그림을 나타내는 것으로서, 이 두 이성질체 사이에 생물학적 연관 아미노산 측쇄의 형태에서 별다른 차이가 없음을 알 수 있다.
도 3은 본 발명에 의한 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg의 일차 비표지된 구조와 본 발명에 의한 금속 이온 표지된 펩티드의 확대 입체도이다. 도 3A와 3B는 메탈옥소기의 이성질화에 의하여 생성된 두 가지의 이성질체를 나타낸 것이다. 도 3C는 도 3A와 도 3B를 겹친 도면을 나타낸 것이며, 이 두 가지 이성질체 사이의 생물학적 연관 아미노산 측쇄의 형태학적으로 차이가 없음을 알 수 있다.
도 4는 인체의 활성화된 혈소판과 99mTc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala와의 결합의 포화 결합 등온선을 나타낸 것이다.
도 5는 인체의 혈소판과의 결합에 대한 99Tc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala 및 비표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 99mTc-표지 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala의 경쟁 결합 반응의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 99mTc-표지된 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 사용하는 동물 모델에서 다리에 유도된 혈병의 감마 카메라 영상을 나타낸 것이다.
도 7은 99mTc-표지 D-Arg-Gly-D-Cys-β-Ala를 사용하는 동물 모델에서 유도된 폐 혈병의 감마 카메라 영상을 나타낸 것이다.
도 8은 다리에 시어진 우유로 유도된 농양을 가진 마우스들을 99mTc-Thr-D-Lys-Gly- D-Cys-Arg를 주사한 다음 20분 후의 감마 카메라 영상을 나타낸 것이다.
도 9는 다리에 시어진 우유로 유도된 농양을 가진 마우스들을 99mTc-Thr-D-Lys-Gly- D-Cys-Arg를 주사한 다음 4시간 후의 감마 카메라 영상을 나타낸 것이다.
도 10은 인체의 다형다핵 백혈구와 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg와의 결합의 포화 결합 등온선을 도시한 것이다.
도 11은 인체의 다형다핵 백혈구와의 결합에 대한, 99Tc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D- Cys-Arg 및 비표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 99mTc-표지된 Thr-D-Lys-Gly-D-Cys -Arg와의 경쟁 결합 반응의 결과를 도시한 것이다.
도 12는 Tc-Thr-D-Lys-Gly-D-Cys-Arg를 주사한 후 15분 후의, 토끼에서 테레빈으로 유도된 농양의 감마 카메라 영상을 나타낸 것이다.
도 13은 ReO[V]-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg에 노출된 인체의 다형다핵 과립성 백혈구에 의한 열-불활성화된 이스트 세포 식작용의 자극 백분율의 투여량-반응의 상관 관계의 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 14는 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg를 경구 투여하고 2 시간 경과하여 마우스에서의 99mTc-Thr-[D-Lys-Gly-D-Cys]-Arg의 생체 분포 프로필을 나타낸 것이다. 다양한 기관의 그램당 주사된 투여량%(% ID/gm)를 나타낸 것이다. Bl은 혈액, Ki는 신장, Li는 간, Lu는 폐, St는 위, Sp는 비장, Ll은 대장, Sl은 소장, He는 심장, Mu는 정상적인 대퇴근, Fe는 대퇴골, Ab는 대퇴근의 염증부위이다.

Claims (40)

  1. 금속 이온과 착물을 형성하기 위한 금속 이온 결합 골격 및, 그 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 생물학적 작용 도메인을 포함하는 금속 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구조체의 적어도 일부분이 금속 이온 결합 골격과 금속 이온이 착물을 형성하여 구조형태적으로 구속된 이차 구조를 갖는 구조체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 구조체가 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 전체적인 구조를 갖는 것인 구조체.
  4. 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 두 개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 금속 이온 결합 골격 및, 상기 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 생물학적 작용 도메인을 포함하는, 제조된 펩티드 및 의약적으로 허용가능한 그의 염.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩티드의 적어도 일부분이 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 이차 구조가 구조형태적으로 구속된 것인 펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 전체적인 구조를 갖는 것인 펩티드.
  7. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 작용 도메인이 금속 이온 결합 골격과 금속 이온이 착물을 형성하여 실질적으로 보다 유효하게 되는 펩티드.
  8. 제4항에 있어서, 상기 금속 이온의 모든 원자가가 금속 이온의 착물화에 의해 충족되는 펩티드.
  9. 제4항에 있어서, 상기 금속 이온 결합 골격이 금속 이온의 복수의 아미노산을 함유하고, 이들 각각의 아미노산이 상기 금속 이온의 이용가능한 원자가와의 착물형성에 이용될 수 있는 적어도 1개의 질소, 황 또는 산소 원자를 함유하는 것인 펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 금속 이온 결합 골격을 구성하고 있는 아미노산과 상기 금속 이온과의 착물 형성에 의해 금속 이온의 원자가의 전부가 만족되지 않는 경우에는, 금속 이온의 결합 골격은, 금속 이온의 착물화에 의해 금속 이온의 모든 원자가가 만족되도록, 금속 이온의 이용가능한 원자가와의 착물 형성에 이용될 수 있는 적어도 1개의 질소, 황 또는 산소 원자를 함유하는 유도 아미노산이나 스페이서 서열도 포함하는 것인 펩티드.
  11. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 작용 도메인이 리간드와 리셉터 쌍(pair)을 형성할 수 있는 리간드를 포함하는 펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성한 경우의 상기 리간드의 그 리셉터에 대한 친화도가, 상기 금속 이온 결합 골격이 금속 이온과 착물을 형성하지 않은 경우의 친화도보다 높은 펩티드.
  13. 제4항에 있어서, 상기 금속 이온 결합 골격이 금속 이온으로 착물화된 펩티드.
  14. 제4항에 있어서, 상기 펩티드가 환형(cyclic) 펩티드인 펩티드.
  15. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 작용 도메인이 금속 이온 결합 골격과 금속 이온의 착물 형성시, 사이크놀로지칼(sychnological)인 펩티드.
  16. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 작용 도메인이 금속 이온 결합 골격과 금속 이온의 착물 형성시, 레그닐로지칼(rhegnylogical)인 펩티드.
  17. 금속이온과의 착물형성에 의해 구조형태적으로 구속된 이차구조를 갖도록 제조된 펩티드 및 그의 의약적으로 허용가능한 염으로서, 상기 구조형태적으로 구속된 이차구조는 리간드-리셉터쌍 멤버를 함유하고, 상기 펩티드는 다음 일반식으로 표시되는 것인 제조 펩티드 및 그의 의약적으로 허용가능한 염:
    R1-X-R2
    식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 연속 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
    X는 금속 이온과의 금속이온과의 착물 형성시, 전체적으로 이차구조를 적어도 일부분 형성하는 특정의 국소적 이차구조를 가지며;
    R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하고, 여기서 상기 아미노산은 금속 이온과 X와의 착물 형성시 R1이나 R2 중 어느 하나 또는 두가지 모두의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 나머지 부분(balance)을 갖도록 선택되며;
    X, R1, 또는 R2의 적어도 일부분을 포함하는 상기 구조형태적으로 구속된 이차 구조는 리간드와 리셉터 쌍의 멤버를 형성할 수 있는 리간드를 포함하고 있음.
  18. 제17항에 있어서, 상기 금속 이온과 X를 구성하는 아미노산과의 착물 형성에 의해 금속 이온의 원자가의 전부가 만족되지 않는 경우에는, X는 또한 금속 이온과 X와의 착물 형성에 의해 금속 이온의 모든 원자가가 만족되도록, 금속 이온의 이용가능한 원자가와의 착물 형성에 이용가능한 적어도 1개의 질소, 황 또는 산소 원자를 함유하는 유도 아미노산 또는 스페이서 배열도 함유하는 것인 펩티드.
  19. 제17항에 있어서, 다음 일반식의 환형 펩티드인 펩티드:
    식 중에서, R1과 R2는 서로 공유 결합적으로 연결됨.
  20. 제19항에 있어서, 상기 R1과 R2가 아미드, 디설파이드, 티오에테르, 티오에스테르, 우레탄 또는 에스테르 결합을 통해 서로 공유 결합적으로 연결된 환형 펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 R1과 R2 사이의 공유 결합이 R1과 R2의 말단기를 통한 결합, R1과 R2내의 그 어떤 아미노산의 측쇄 작용기들을 통한 결합, R1의 말단기와 R2내의 그 어떤 아미노산기의 측쇄 작용기를 통한 결합, 또는 R2의 말단기와 R1내의 그 어떤 아미노산기의 측쇄 작용기를 통한 결합인 환형 펩티드.
  22. 제 19 항에 있어서, 다음 일반식을 갖는 환형 펩티드:
    식 중에서, R3는 1 내지 약 20 개의 아미노산임.
  23. 제22항에 있어서, 상기 R3가 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 일부를 형성하는 환형 펩티드.
  24. 제17항에 있어서, 상기 X가 금속 이온과 착물을 형성함으로써 역회전 구조인 특정의 국소적 이차 구조를 형성하는 펩티드.
  25. 금속 이온과의 착물 형성에 이용가능한 2개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 금속 이온 결합 골격 및, 트리펩티드 서열 Arg-Gly-Asp에 대한 리셉터에 특이적인, 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 생물학적 작용 도메인을 포함하는 제조된 펩티드 및 의약적으로 허용가능한 그의 염.
  26. 제25항에 있어서, 다음 일반식의 펩티드:
    R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-R2
    R1-Bbb-Aaa-Ccc-Ddd-R2
    R1-Bbb-Ddd-Ccc-Aaa-R2, 또는
    R1-Ddd-Bbb-Ccc-Aaa-R2
    식 중에서,
    Aaa는 금속 이온과 결합하는 데 이용가능한 질소를 함유하고, 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Bbb는 하전되지 않은 측쇄 한 가지 이상을 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Ccc는 금속 이온과 결합하는 데 이용가능한 황과 질소 또는 질소 두 개를 함유하는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Ddd는 그의 측쇄에 음으로 하전된 작용기를 갖는 아미노산 또는 유리 α-카르복실기를 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬록시카르보닐, 아릴록시카르보닐, 또는 카르보닐기를 통해서 또는 직접적으로 부착된 폴리머이고;
    R2는 Ddd가 유리 α-카르복실기를 갖는 중성 아미노산 이외의 것이라면, 아미드, 치환된 아미드 또는 에스테르임.
  27. 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 두 개 이상의 인접하는 아미노산을 포함하는 금속 이온 결합 골격과, 상기 금속 이온 결합 골격과 금속 이온이 착물을 형성하여 구조형태적으로 구속된, 터프트신 리셉터에 특이적인 생물학적 작용 도메인으로 이루어진, 제조 펩티드와 의약적으로 허용가능한 그의 염.
  28. 제27항에 있어서, 다음 일반식의 펩티드:
    R1-Aaa-Bbb-Ccc-Ddd-Eee-R2
    식 중에서,
    Aaa는 중성 또는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Bbb는 금속 이온과 결합하는 데 이용가능한 질소를 함유하고, 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Ccc는 금속 이온과 결합하는 데 이용가능한 질소를 함유하고, 하전되지 않은 측쇄 한 가지 이상을 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Ddd는 금속 이온과 결합하는 데 이용가능한 황, 황과 질소, 또는 질소 두 개를 함유하는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    Eee는 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 L-이나 D-이성질체이고;
    R1은 H, 알킬, 아릴, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알킬록시카르보닐, 아릴록시카르보닐, 또는 카르보닐기를 통해서나 직접적으로 부착된 폴리머인데, Aaa가 데스-아미노산이 아니라면 이 경우에 R1은 소거되며;
    R2는 아미드, 치환된 아미드, 에스테르 또는 폴리머인데, Eee가 데스-카르복실 아미노산이 아니라면 이 경우에 R2는 소거됨.
  29. 디설파이드, 티오에테르, 락탐 또는 락톤 브릿지의 등전자 배열 교체를 위한 금속 이온 결합 골격을 갖는, 다음 일반식의 환형 펩티드 및 의약적으로 허용가능한 그의 염:
    식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
    R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 포함하고,
    R3는 1 내지 약 20 개의 아미노산으로 포함하고;
    Aaa와 Bbb는 각각 디설파이드, 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 우레탄 또는 에스테르 결합을 통해 X와 결합하는 아미노산을 포함하는, 환형 펩티드 및 그의약적으로 허용가능한 그의 염.
  30. 제29항에 있어서, 상기 X가 다음 일반식의 아미노산 서열을 갖는 환형 펩티드:
    Ccc-Ddd-Eee 또는 Eee-Ddd-Ccc
    식 중에서, Ccc와 Ddd 각각은 하전되지 않은 측쇄를 갖는 아미노산이나 디펩티드이고,
    Eee는 Cys, HomoCys, Pen 또는 His의 L-이나 D-이성질체임.
  31. a) 다음 일반식의 펩티드를 제공하고,
    R1-X-R2
    식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 연속 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
    X는 금속 이온과의 착물 형성시, 전체적으로 이차구조를 적어도 일부분 형성하는 특정의 국소적 이차구조를 가지며;
    R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하고, 여기서 상기 아미노산은 금속 이온과 X의 착물 형성시 R1이나 R2 중 어느 하나 또는 두가지 모두의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 나머지 부분(balance)을 갖도록 선택됨; 및
    b) 상기 펩티드에 금속 이온을 착물화시키는 단계를 포함하여 이루어지는, 금속 이온과 착물을 형성하여 얻어진 구조형태적으로 구속된 이차 구조를 갖는 펩티드와 의약적으로 허용가능한 그의 염의 제조 방법.
  32. 리간드와 리셉터 쌍을 형성할 수 있는 리간드를 함유하는 구조형태적으로 한정된 이차 구조를 갖는 펩티드와 의약적으로 허용가능한 그의 염의 제조 방법으로,
    a) 다음 일반식의 펩티드를 제공하고,
    R1-X-R2
    식 중, X는 금속 이온의 실질적으로 모든 원자가가 금속 이온과 X와의 착물형성에 의해 만족되도록 복수의 아미노산을 함유하는, 금속 이온을 착물화하는 착물형성 골격이고;
    X는 금속 이온과의 금속이온과의 착물 형성시, 전체적으로 이차구조를 적어도 일부분 형성하는 특정의 국소적 이차구조를 가지며;
    R1과 R2는 각각 0 내지 약 20개의 아미노산을 함유하고, 여기서 상기 아미노산은 금속 이온과 X의 착물 형성시 R1이나 R2 중 어느 하나 또는 두가지 모두의 적어도 일부분이 구조형태적으로 구속된 이차 구조의 나머지 부분(balance)을 갖도록 선택되며;
    X, R1, 또는 R2의 적어도 일부분을 포함하는 상기 구조형태적으로 구속된 이차 구조는 리간드와 리셉터 쌍의 멤버를 형성할 수 있는 리간드를 포함하고 있음;
    b) 상기 펩티드에 금속 이온을 착물화시키는데, 상기 금속 이온이 X가 특정 국부적 이차 구조를 형성시키도록 하고, 이에 의해 상기 펩티드가 리간드와 리셉터 쌍의 성분을 형성할 수 있는 리간드로 이루어진 구조형태적으로 한정된 이차 구조로서 배열되도록 하는 단계로 이루어진 방법.
  33. 생물학적 작용 도메인을 모사한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 의약적으로 허용가능한 그의 염의 제조 방법으로서,
    a) 다수의 아미노산을 포함하는 금속 이온을 착물화시키기 위한 착물화용 골격을 제공하고, 여기서, 상기 아미노산은 실질적으로 이 금속 이온의 원자가 모두가 착물화용 골격과 금속 이온과의 착물화를 충족시키는 것이 되도록 선택되는 것으로서, 상기 착물화용 골격은 착물화용 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해, 생물학적 작용 도메인의 적어도 일부분과 동일한 범위를 점하는 것이고;
    b) 착물화용 골격의 어느 한쪽 말단에 결합하고, 착물화용 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해, 생물학적 작용 도메인의 잔부를 구성하는 0 내지 약 20개의 아미노산을 제공하고;
    c) 착물화용 골격과 금속 이온을 착물화시키는 단계를 포함하여 이루어진 방법.
  34. 금속 이온 결합 골격 및, 상기 금속 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속되는, 결정된 생물학적 작용 도메인을 함유하는 펩티드; 및
    금속 이온
    을 포함하여 이루어지는, 펩티드에 기초한 약학적 조성물.
  35. 요망되는 표적 특성을 갖는 금속 펩티드를 얻는 방법으로서,
    a) 각각의 펩티드가 금속 이온과의 착물화에 유용한 두 가지 이상의 아미노산을 갖는 금속 이온 결합 골격을 함유하는 것인 후보 펩티드 혼합물을 제공하고, 여기서, 상기 금속 이온 결합 골격은 금속 이온과 금속 이온 결합 골격과의 착물화에 의해 구조형태적으로 구속되고, 각각의 펩티드는 다시, 별도의 특유하고 다른 아미노산 서열을 함유하는 것으로, 상기 혼합물 중의 각각의 펩티드의 존재는 미리 결정되어 있는 것이며；
    b) 상기 펩티드의 금속 이온 결합 골격과 금속 이온을 착물화시키고;
    c) 요망되는 표적 특성을 갖는 금속 펩티드가 우선적으로 결합하는 물질에 후보 금속 펩티드의 혼합물을 노출시킴으로써, 후보 금속 펩티드의 혼합물 중에서, 바람직한 표적 특성을 갖는 금속 펩티드를 선택하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 바람직한 표적 특성을 갖는, 선택된 후보 금속 펩티드를 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 요망되는 표적 특성을 갖는 금속 펩티드를 얻는 방법으로서,
    a) 금속 이온 결합 골격을 함유하는 2개, 3개 또는 4개의 연속적인 아미노산의 공지 조합물을 제공하고, 여기서, 각각의 아미노산은 금속 이온의 착물화에 이용될 수 있는 것으로서, 금속 이온 결합 골격은 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 것이며,
    b) 1개 이상의 아미노산을 함유하는 별개의 특유한 다른 아미노산 서열을, 금속 이온 결합 골격을 포함하는 아미노산에 가하며, 여기서 이 혼합물 중의 각각의 펩티드의 존재는 예정된 것이고;
    c) 상기 펩티드의 금속 이온 결합 골격과 금속 이온을 착물화시키고,
    d) 요망되는 표적 특성을 갖는 금속 펩티드가 우선적으로 결합하는 물질에 후보 금속 펩티드의 혼합물을 노출시킴으로써, 후보 금속 펩티드의 혼합물 중에서, 요망되는 표적 특성을 갖는 금속 펩티드를 선택하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 요망되는 표적 특성을 갖는, 선택된 후보 금속 펩티드를 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 요망되는 생물학적 작용 도메인을 갖는 금속 펩티드를 얻는 방법으로서,
    a) 금속 이온 결합 골격을 함유하는 2개, 3개 또는 4개의 연속적인 아미노산의 공지 조합물을 제공하고, 여기서, 각각의 아미노산은 금속 이온의 착물화에 이용될 수 있는 것으로서, 금속 이온 결합 골격은 이온 결합 골격과 금속 이온과의 착물 형성에 의해 구조형태적으로 구속된 것이며,
    b) 1개 이상의 아미노산을 함유하는 별개의 특유한 다른 아미노산 서열을, 금속 이온 결합 골격을 구성하는 연속적인 아미노산에 가하며, 여기서 이 혼합물 중의 각각의 펩티드의 존재는 예정된 것이고;
    c) 상기 펩티드의 금속 이온 결합 골격과 금속 이온을 착물화시키고,
    d) 요망되는 생물학적 작용 도메인이 우선적으로 결합하는 물질에 후보 금속 펩티드의 혼합물을 노출시킴으로써, 후보 금속 펩티드의 혼합물 중에서, 요망되는 생물학적 작용 도메인을 선택하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 요망되는 생물학적 작용 도메인을 갖는, 선택된 후보 금속 펩티드를 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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