KR20170119225A - 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 시스플라틴에 의한 신장 독성 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항암제 시스플라틴(cisplatin)으로 유발되는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

Description

잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating acute renal failure comprising Carthamus tinctorius L. seed extract}

본 발명은 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항암제 시스플라틴(cisplatin)으로 유발되는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

급성신부전(acute renal failure)이란 질소성 노폐물 (nitrogenous wastes)과 수분 등의 대사 노폐물(metabolic waste products)의 배설과 산-염기 평형 유지를 위한 신장 기능의 급격한 저하로 초래되는 임상증후군으로, 사구체여과율(GFR)의 저하, 소변량의 감소, 과칼륨혈증, 대사성 산증, 체내 수분 과다 등의 증상을 수반함으로써 생명을 위협할 수 있으며, 주로, 신 혈류량의 감소(low blood volume), 급성사구체신염(glomerulinephritis), 혈관염(vasculitis), 신독성 (nephrotoxin) 항생제 및 항암제 사용 등에 의해 발병된다.

현재 임상에서 고환암, 난소암, 두경부암, 방광암, 비소세포성 폐암 등의 항암제로 널리 사용되고 있는 시스플라틴 (cis-diammine dichloroplatinum Ⅱ, Cisplatin)은, 골수억제, 위장관계독성, 신경독성, 신독성 등의 부작용을 일으키며 그 중, 신독성은 시스플라틴이 신장에 집중적으로 축적되어 용량 의존적으로 발생함으로써 심각한 문제가 되고 있다. 시스플라틴은 암세포를 사멸하기 위해 활성산소종(reactive oxygen species)을 생성시킴으로써 p53을 자극하게 되는데, 이러한 과정 중에 생성된 활성산소종은 신장의 DNA, 세포막, 미토콘드리아에 손상을 주어 신장독성을 일으키는 심각한 부작용을 초래하여 사용이 제한되고 있다.

따라서, 항암치료에 널리 사용되고 있는 시스플라틴의 지속적인 사용을 통한 효과적인 항암치료를 위해서는 신장기능의 강화 또는 시스플라틴의 투여로 인한 신장의 독성을 감소시키면서 항암치료효과를 상승시킬 수 있는 항암보조제의 개발이 필요하다.

천연물로부터 급성신부전에 미치는 효과를 측정하기 위한 방법으로 체중변화, 신장조직 무게, BUN, Creatinine을 측정하는 것으로 보고되어 있다(Chan Hum Park et al. 2008, Takako Yokozawa, et al 2000). 급성신부전 질병의 진행 평가에서 신장의 손상에 의해 상승하는 혈중 BUN과 creatinine의 수치를 측정하여 신장기능의 상태를 평가하는 것이 일반적이다. 생화학적 대사경로에 있어서 단백질의 분해 대사산물인 요소질소의 혈중 함량을 나타내는 혈중 BUN 수치와 비단백질 유래의 근육대사에 의해 형성되는 질소산물인 혈중 creatinine의 수치는 사구체 여과율(GFR)의 감소를 나타냄으로써 신장기능이 저하되었음을 의미한다. 시스플라틴에 의해 유발된 급성신부전에서도 혈중 BUN과 creatinine 수치가 상승함으로써 신장기능 저하로 인한 급성신부전 유발 유무의 마커로 사용되어 왔으며, 체중의 감소 및 신장조직 무게(g/100g 체중)의 증가는 시스플라틴 투여농도 의존적으로 유발됨으로써 시스플라틴의 직접적인 약물 독성 또는 급성신부전의 진행 정도 따른 이차적인 변화로 판단되어, 시스플라틴의 독성 감소 또는 급성신부전의 진행 억제를 통한 신장 보호 효과가 있는 활성 천연물질의 탐색에 있어서 기본적인 평가지표로 사용되어 왔다.

이에 본 발명자들은, 이상과 같은 항암치료의 부작용인 급성신부전을 예방 또는 치료하는 천연 항암치료 보조제를 약용작물로부터 탐색하던 중, 잇꽃씨 추출물이 시스플라틴 유발 급성신부전동물 모델에서 DNA 손상 억제를 통해 급성신부전의 진행을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 잇꽃씨 추출물은 잇꽃씨를 C₁ ~ C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출은 초음파추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군에서 선택한 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 급성신부전은 항암제에 의해 유발되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 잇꽃씨 추출물은 신장조직의 DNA 손상을 억제할 수 있다.

본 발명은 또한, 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 잇꽃씨 추출물은 잇꽃씨를 C₁ ~ C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 용매로 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출은 초음파추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군에서 선택한 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 급성신부전은 항암제에 의해 유발되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 잇꽃씨 추출물은 신장조직의 DNA 손상을 억제할 수 있다.

본 발명의 잇꽃씨 추출물은 급성신부전의 예방 또는 치료 효과를 갖는 천연 추출물로서, 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물의 형태로 제공하여 급성신부전을 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 항암제 시스플라틴의 부작용을 억제하는 효과가 있어 항암제 부작용 억제를 위한 항암치료 보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시스플라틴 투여에 의해 유발된 급성신증 마우스에 있어서 잇꽃씨 추출물 투여에 따른 체중변화 및 신장무게의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 시스플라틴 투여에 의해 유발된 급성신증 마우스에 있어서 잇꽃씨 추출물 투여에 따른 신장 기능의 변화를 관찰하기 위해 혈중 신장 기능 파라메터 (BUN, creatinine)의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 시스플라틴 투여에 의해 유발된 급성신증 마우스에 있어서 잇꽃씨 추출물 투여에 따른 신장조직의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 Hematoxylin-Eosin(H&E)염색을 하여 조직을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 시스플라틴 투여에 의해 유발된 급성신증 마우스에 있어서 잇꽃씨 추출물 투여에 따른 신장조직의 DNA 손상 관련 단백질의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 시스플라틴 투여에 의해 유발된 급성신증 마우스에 있어서 잇꽃씨 추출물 투여에 따른 신장조직의 mitogen-activated protein kinases (MAPK) 관련 단백질의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 시스플라틴 투여에 의해 유발된 급성신증 마우스에 있어서 잇꽃씨 추출물 투여에 따른 신장조직의 세포사 관련 단백질의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 항암제로 널리 사용되고 있는 시스플라틴은 골수억제, 위장관계독성, 신경독성, 신독성 등의 부작용을 일으키며 그 중, 신독성은 시스플라틴이 신장에 집중적으로 축적되어 용량 의존적으로 발생함으로써 심각한 문제가 되고 있어 시스플라틴의 지속적인 사용을 통한 효과적인 항암 치료를 위해서는 신장기능의 강화 또는 시스플라틴 투여로 인한 신장의 독성을 감소시킴으로써 항암 치료효과를 상승시킬 수 있는 항암 보조제의 개발이 필요하다.

이에 본 발명은 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 본 발명의 잇꽃씨 추출물은 급성신부전동물 모델에서 신장조직의 DNA 손상 억제를 효과를 나타내므로 급성신부전을 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 항암제 시스플라틴의 부작용을 억제하는 효과가 있어 항암제 부작용 억제를 위한 항암치료 보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다.

본 발명에서 사용되는 용어 “급성신부전”은 급성이고 신 혈류량의 감소, 사구체신염, 신독성 항생제 및 항암제의 사용 등 여러 원인에 의해 발생하는 급속한 신기능의 저하를 초래하는 임상증후군을 말한다. 본 발명에 따른 잇꽃씨 추출물은 이러한 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

용어 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명의

잇꽃씨 추출물에 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

용어 “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화(alleviating)”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명은 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “잇꽃씨”는 국화과에 속한 잇꽃 (Carthamus tinctorius L.)의 종자를 건조한 것을 의미한다. 잇꽃씨는 한방에서는 혈액순환을 촉진시키고 어혈을 풀어주며 독을 해독하는 효능뿐만 아니라 퇴행성 관절염과 골다공증을 포함한 뼈관절 계통의 질환 치료 효과가 있다.

본 발명의 잇꽃씨 추출물은 잇꽃씨를 C₁ ~ C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 용매로 추출하여 제조될 수 있다. 바람직하게 C₁ ~ C₄의 알코올은 에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 식물체에서 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 용매라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 70% 에탄올을 용매로 하여 잇꽃씨 추출물을 제조하였다.

상기 추출은 당해 기술 분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물체 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예를 들어, 초음파추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군에서 선택할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 열수 추출을 수행하여 잇꽃씨 추출물을 제조하였다.

본 발명에서 급성신부전은 항암제에 의해 유발된 것일 수 있고, 상기 항암제는 시스플라틴일 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 제조된 잇꽃씨 추출물이 시스플라틴으로 유발되는 급성신부전에 미치는 효과를 확인하기 위해 체중 변화, 신장조직 무게 변화, BUN 및 Creatinine의 수치를 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 급성신증 대조군(Vehicle)의 체중변화는 5.62g으로 정상군의 체중변화 0.44g과 비교하여 현저한 감소를 보였으나, 잇꽃씨 추출물 투여군(100 mg/kg 및 200 mg/kg)에서는 각각 -4.73g 및 -3.07g의 체중변화를 나타내어 급성신증 대조군 체중의 84.2% 및 54.6% 수준인 것을 확인할 수 있었다. 또한 급성신증 대조군의 신장무게는 2.18g으로 정상군의 신장무게 1.56g과 비교하여 39.7%의 증가를 보였으나, 잇꽃씨 추출물을 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 투여한 투여군에서는 각각 2.04g 및 1.91g으로 급성신증 대조군 신장무게의 약 93.6% 및 87.6% 수준인 것을 확인할 수 있었다.

도 2에 나타난 바와 같이 정상군과 비교하여 급성신증 대조군에서는 혈중 BUN 농도가 31.9mg/dl로 약 4.3배 증가되었으나 잇꽃씨 추출물을 각각 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 투여 시 BUN의 수치는 시스플라틴platin으로 유도된 BUN의 수치와 비교하여 79.4% 및 60.2% 정도로 유의 있게 억제됨을 확인할 수 있었다. 혈중 creatinine 수치는 급성신증 대조군에서 22.1mg/dl로 정상군과 비교하여 약 4.6배 증가하였으나, 잇꽃씨 200 mg/kg 투여군에서는 15.5mg/dl로 유의 있는 감소 효과가 관찰되었다.

나아가, 본 발명에서는 잇꽃씨 추출물 투여에 의한 신장조직의 형태학적 변화 관찰, DNA 손상 관련 단백질, MAPK 관련 단백질 및 신장의 세포사 관련 단백질 발현의 측정을 통해 급성신부전에 대한 잇꽃씨 추출물의 효능을 추가적으로 평가하였다.

먼저, 신장조직의 형태학적 변화를 평가하기 위해 신장조직의 Hematoxylin-Eosin(H&E)염색을 실시한 후 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 급성신부전 동물모델의 신장에서는 정상군과 비교하여 신장조직에서 괴사가 관찰되었고 신세뇨관 상피세포의 변성(renal tubular epithelial cells degeneration) 등의 신장독성이 관찰되었으나, 잇꽃씨 추출물 투여군에서는 이러한 변화가 개선되는 것이 관찰되었다.

다음으로, DNA 손상 관련 단백질인 Ataxia telangiectasia and Rad3 related protein (ATR)과 p-p53 단백질의 발현을 Western blot을 통해 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 급성신부전 동물모델의 신장에서 증가된 ATR 및 p-p53 단백질의 발현은 잇꽃씨 200 mg/kg 투여에 의해 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다.

다음으로, MAPK 관련 단백질인 p-p38 단백질의 발현을 Western blot을 통해 측정한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 급성신부전 동물모델의 신장에서 증가된 p-p38 단백질의 발현은 잇꽃씨 추출물의 투여농도에 의존적으로 유의한 억제효과가 관찰되었다.

마지막으로, 신장의 세포사 관련 단백질인 Bax와 caspase 3 단백질의 발현을 Western blot을 통해 측정한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 급성신부전 동물모델의 신장에서 증가된 Bax와 caspase 3 단백질의 발현은 저농도 투여군인 잇꽃씨 100 mg/kg 투여군부터 유의 있는 발현 감소 효과가 관찰되었다.

상기한 바와 같이, 도 1 내지 도 6의 결과들을 통해 본 발명의 잇꽃씨 추출물은 급성신부전의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 충분히 확인할 수 있었다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제,감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성, 및 상기 특정한 치료제에 대한 종양의 감수성에 의존적일 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

특히, 임의의 의학적으로 적합한 방법, 예를 들면, 정상적인 정맥내 투여 또는 동맥내 투여, 뇌척수액으로의 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 피내(intradermal) 투여, 강내(intracavity) 투여, 경막내(intrathecal) 투여, 종양 또는 상기 종양에 공급하는 동맥으로의 직접 투여가 유리하다. 종양 또는 그의 일부가 이전에 외과수술에 의해 제거된 경우, 치료제는 직접 주사 또는 미리 이식된 저장부(reservoir)를 통해 종양 부위(및 특히, 종양 부위에 있는 포위된 강(enclosed cavity) 또는 "절제 강(resection cavity)")로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 1∼500mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

본 발명은 또한, 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 잇꽃씨 추출물은 본 발명의 약학적 조성물에 함유된 잇꽃씨 추출물과 동일한 방법으로 제조될 수 있으며, 제조된 추출물의 효과 또한 동일하므로 이에 대한 설명은 생략한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 잇꽃씨 추출물을 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, “식품첨가물”로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품첨가물공전”에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물,

결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 잇꽃씨 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 상기 건강기능식품에 포함된 잇꽃씨 추출물의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있고, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기의 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

잇꽃씨 추출물 제조

시판되는 잇꽃씨를 구입하여 분쇄한 분쇄물 400 g을 70% 에탄올 600ml에 넣어 3시간 2회 열수 추출을 실시한 후 와트만(Whatman 46cm) 여과지를 이용하여 불용성물질을 제거하여 냉각 콘덴서가 장착된 농축 장치로 60℃에서 감압 농축하였다. 감압 농축된 추출물의 용매를 완전히 제거하기 위하여 정제수 50 ㎖를 넣어 현탁시킨 후 동결건조기를 이용하여 18.6 g의 추출물을 얻었다(수율: 4.65%).

실험동물 및 시료투여

가) 실험동물

18 마리의 수컷 BALB/c 마우스(6-week old upon receipt, 대한바이오링크, Korea)를 1주일간 예비사육 기간을 적용한 후 실험에 사용하였으며, 예비사육 기간 및 실험 전 기간 동안 온도 (20-25℃)와 습도 (30-35%)가 조절된 사육실에서 마우스용 폴리카보네이트(polycarbonate) 사육 상자에 1 마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기(light:dark cycle)는 12 시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용된 모든 실험동물은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [Department of Health, Education, and Welfare Publication (National Institute of Health)85-23]에 준하여 취급하였다.

나) 시료투여

상기 실시예 1에서 제조한 잇꽃씨 추출물을 시료로 사용하였다. 시료투여는 정상군(Normal), 급성신증 대조군(Vehicle), 약물투여군(잇꽃씨 추출물 100 mg/kg/체중 또는 200 mg/kg/체중) 등 총 4개의 군으로 나누어 실험을 하였다. 시료투여는 경구투여를 하였고, 투여기간은 총 3 일간 매일 1회 투여하였다. 투여 최종일에 급성신부전을 유발하기 위해 시스플라틴(20mg/kg)을 단회 복강주사 한 후 24시간 방치하였다. 구체적인 시료투여 조건은 하기의 표 1과 같다.

실험군	그룹명	투여 물질 및 용량
정상군	Normal	Nothing
급성신증군	Vehicle	D.W. + Cisplatin (20 mg/kg I.P.)
	Safflower seed (100 mg/kg)	Safflower seed (100 mg/kg P.O. + Cisplatin (20 mg/kg I.P.)
	Safflower seed (200 mg/kg)	Safflower seed (200 mg/kg P.O. + Cisplatin (20 mg/kg I.P.)

잇꽃씨 추출물 투여에 의한 체중 변화 및 신장무게의 이상 소견 여부 검증

급성신부전증 동물모델에서의 시스플라틴 처리 후 체중변화 측정 결과를 Mean±error of mean)으로 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 급성신증 대조군 cisplatin/vehicle의 체중변화는 5.62g으로 정상군의 체중변화 0.44g과 비교하여 현저한 감소를 보였다. 한편, 잇꽃씨 추출물을 농도별로 처리한 경우에는 시스플라틴에 의해 감소된 체중이 증가하는 효과를 나타내었다. 잇꽃씨 추출물을 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 각각 처리하면 -4.73g 및 -3.07g으로 급성신증 대조군 cisplatin/vehicle (-5.62g)의 약 84.2% 및 54.6% 수준인 것을 확인할 수 있었다.

그리고, 급성신증 대조군 cisplatin/vehicle의 신장무게는 2.18g으로 정상군의 신장무게 1.56g과 비교하여 39.7%의 증가를 보였으나, 잇꽃씨 추출물을 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 투여한 투여군에서는 각각 2.04g 및 1.91g으로 급성신증 대조군의 약 93.6% 및 87.6% 수준인 것을 확인할 수 있었다.

잇꽃씨 추출물 투여에 의한 신장기능의 이상 소견 여부 검증

신장 독성을 평가하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 잇꽃씨 추출물의 급성신부전증에 대한 개선효과를 하기와 같이 혈중 BUN(Blood Urea Nitrogen)과 creatinine의 수치를 측정하여 확인하였다.

가) 실험방법

최종 희생일에 모든 실험동물을 18 시간 이상 절식 후 심장으로부터 약 0.7 ㎖의 혈액을 채취하며, 상온에서 1시간 정도 방치한 다음 3,000 rpm으로 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 이후 혈중 BUN과 creatinine 함량은 commercial kit(BUN-E, Asan Pharmaceutical Co., Seoul, Korea; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, )를 이용하여 각각 측정하였다.

나) 실험결과

급성신부전 동물모델에서는 시스플라틴 처리 후 혈중 BUN과 creatinine 측정 결과를 Mean±error of mean)으로 도 2에 나타내었다. 실험결과 자료의 통계처리는 Microsoft Excel 프로그램을 이용하여 데이터 분석(Data Analysis)을 실시하고 각 군 간의 차이를 검증하기 위하여 Bonferroni multiple comparison test를 이용하여 사후 분석을 실시하였다. 통계학적인 유의수준은 p<0.05로 하였으며, 시스플라틴과 비교하여 잇꽃씨 추출물 처리군은 *로 표시하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 시스플라틴을 투여하면 혈중 BUN 농도가 31.9mg/dl로 약 4.3배 증가되는 것을 확인하였고, 잇꽃씨 추출물 투여시 BUN의 수치는 100 mg/kg, 200 mg/kg 투여군에서 시스플라틴으로 유도된 BUN의 수치와 비교하여 79.4% 및 60.2% 정도로 유의 있게 억제됨을 확인할 수 있었다.

정상군과 비교하여 급성신증 대조군 cisplatin/vehicle에서는 혈중 creatinine 수치는 22.1mg/dl로 약 4.6배의 증가가 관찰되었으나 잇꽃씨 200 mg/kg 투여군에서는 15.5mg/dl로 유의있는 감소 효과가 관찰되었다.

잇꽃씨 추출물 투여에 의한 신장조직의 형태학적 이상 소견 여부 검증

신장조직의 형태학적 변화를 평가하기 위해, 신장조직의 Hematoxylin-Eosin(H&E)염색을 실시한 후 관찰하였다.

가) 실험방법

최종 희생일에 시험동물에서 적출한 신장은 10% 중성 포르말린으로 고정시켜 Hematoxylin-Eosin(H&E)염색을 하여 조직을 관찰 후 광학현미경으로 400 배에서 관찰하였다.

나) 실험결과

도 3에 나타난 바와 같이, 급성신부전 동물모델의 신장에서는 정상군과 비교하여 신장조직에서 괴사가 관찰되었고 신세뇨관 상피세포의 변성(renal tubular epithelial cells degeneration) 등의 신장독성이 관찰되었으나, 잇꽃씨 추출물 투여군에서는 이러한 변화가 개선되는 것이 관찰되었다.

잇꽃씨 추출물 투여에 의한 신장의 DNA 손상 관련 단백질 발현 측정

잇꽃씨 추출물의 투여가 신장의 DNA 손상 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 Western blot 실험 방법으로 측정하여 확인하였다.

가) 실험방법

Ataxia telangiectasia and Rad3 related protein (ATR), p-p53 단백질의 발현을 측정하기 위하여 10 ㎍의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동(transfer)시킨다. 5% skim milk를 함유한 TBS-T (0.5% Tween 20 in TBS)에 담궈 1시간 처리한 후 TBS-T로 5분마다 5회 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 항체를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체(TBS-T로 1:5000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. ECL 용액으로 반응시킨 후 Davinch-ChemiTM Chemiluminescence Imaging system (Davinch-K Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 밴드를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.

나) 실험결과

급성신부전 동물모델의 신장에서 증가된 DNA 손상 관련 ATR 및 p-p53 단백질의 발현은 잇꽃씨 200 mg/kg 투여에 의해 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다.

잇꽃씨 추출물 투여에 의한 신장의 MAPK 관련 단백질 발현 측정

잇꽃씨 추출물의 투여가 신장의 MAPK 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 Western blot 실험 방법으로 측정하여 확인하였다.

가) 실험방법

p-p38 단백질의 발현을 측정하기 위하여 10 ㎍의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동(transfer)시킨다. 5% skim milk를 함유한 TBS-T (0.5% Tween 20 in TBS)에 담궈 1시간 처리한 후 TBS-T로 5분마다 5회 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 항체를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체(TBS-T로 1:5000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. ECL 용액으로 반응시킨 후 Davinch-ChemiTM Chemiluminescence Imaging system (Davinch-K Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 밴드를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.

나) 실험결과

급성신부전 동물모델의 신장에서 증가된 MAPK 관련 p-p38 단백질의 발현은 잇꽃씨 추출물의 투여농도에 의존적으로 유의 있는 억제효과가 관찰되었다.

잇꽃씨 추출물 투여에 의한 신장의 세포사 관련 단백질 발현 측정

잇꽃씨 추출물의 투여가 신장의 세포사 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 Western blot 실험 방법으로 측정하여 확인하였다.

가) 실험방법

Bax와 caspase 3 단백질의 발현을 측정하기 위하여 10 ㎍의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시킨다. 5% skim milk를 함유한 TBS-T (0.5% Tween 20 in TBS)에 담궈 1시간 처리한 후 TBS-T로 5분마다 5회 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 항체를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체(TBS-T로 1:5000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. ECL 용액으로 반응시킨 후 Davinch-ChemiTM Chemiluminescence Imaging system (Davinch-K Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 밴드를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.

나) 실험결과

급성신부전 동물모델의 신장에서 증가된 세포사 관련 Bax와 caspase 3 단백질의 발현은 저농도 투여군인 잇꽃씨 100 mg/kg 투여군부터 유의 있는 개선효과가 관찰되었다.

상기와 같은 결과들을 통해, 본 발명의 잇꽃씨 추출물은 급성신부전의 예방, 개선 또는 치료효과를 나타냄을 명확하게 확인할 수 있었다.

본 발명은 항암제 시스플라틴의 부작용인 급성신부전의 예방 또는 치료 효과를 갖는 천연 추출물로서, 항암치료 보조제로서 유용하게 이용될 수 있으므로 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (12)

1. 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 잇꽃씨 추출물은 잇꽃씨를 C₁ ~ C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 추출은 초음파추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군에서 선택한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 급성신부전은 항암제에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 잇꽃씨 추출물은 신장조직의 DNA 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 잇꽃씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성신부전의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 잇꽃씨 추출물은 잇꽃씨를 C₁ ~ C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 추출은 초음파추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군에서 선택한 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
10. 제7항에 있어서, 상기 급성신부전은 항암제에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
12. 제7항에 있어서, 상기 잇꽃씨 추출물은 신장조직의 DNA 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.

Images