TW201512405A - 利用微流道晶片進行核酸雜交之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種利用微流道晶片進行核酸雜交之方法，以達快速進行核酸雜交之目的。該微流道晶片內設有雜合區，包括步驟：注入緩衝液至該含基質之微流道晶片，使該基質活化帶正電；把待測之核酸與探針核酸混合形成之混合液注入該微流道晶片，使有雜合配對的待測核酸與探針吸附於基質的邊緣；連續注入陰離子界面活性劑沖洗至該微流道晶片；以及待陰離子界面活性劑沖洗預定時間後，檢測該基質上的雜合訊息；其中，該基質活化帶正電可使陰離子界面活性劑的沖洗與有雜合配對的待測核酸與探針形成微胞，而往基質中心加速擴散移動，故若應用於DNA專一性之雜合配對檢測，可在極短時間內檢測。

Description

利用微流道晶片進行核酸雜交之方法

本發明係關於一種核酸雜交之方法，尤其是利用微流道晶片進行核酸雜交之方法。

對於臨床診斷和治療而言，快速識別致病性病原菌能有效提升臨床療效。習知的細菌鑑定需依賴以培養基上培養生長的菌落，並檢測該些菌落之形態及所表達之生化特徵，整個鑑定流程需歷時4-5天。

利用探針(probe)核酸與待分析核酸進行雜交配對，係一般用以確認樣本DNA是否具有所欲基因或核酸片段最常使用之方法之一。習知雜交反應分析主要利用印漬法與轉漬法將待分析核酸移轉至一例如薄膜之基質上，而後以具專一性(specificity)的探針核酸進行雜交配對反應，再進一步藉由探針核酸所標記之顯示分子，以呈色、冷光或放射顯影等顯示方式呈現出雜交反應結果。

習知印漬分析方法，係在一薄膜表面滴放以待分析核酸後，利用加熱或是紫外光照射，使待分析核酸穩固交聯(crosslink)於薄膜表面，藉以於後續與探針核酸反應後之清洗反應時，不會被沖刷下來。若是該薄膜置於一微流道晶片內，則會因前述的加熱步驟，易使微流管道因熱產生些微扭曲，造成微流體易漏出，且有降熱慢之缺點，待分析核酸需花費較多的時間進行吸附。此外，探針核酸亦如同待分析核酸，僅能於薄膜表面 進行擴散作用，而以布朗運動方式移動尋找可相配對之待分析核酸。因此，習知核酸雜交反應需經歷較多之操作流程，並需耗費長達十數小時以上之反應時間，對於許多急於知曉檢測結果的試驗，即無法於短時間內完成。此外，對於一些較簡單的核酸定性檢測，若仍須花費相當多時間與試劑去試驗，亦是相當不經濟。

有鑑於此，預防及準確診斷是公共衛生感染防治之一極為重要的環節，而準確的診斷更是有效治療的基礎。能夠簡化核酸配對反應所需步驟與時間，並同時兼顧低背景雜訊之核酸雜交裝置或方法，對於一般簡易檢測或是大批次檢測，都可有效縮短試驗所需時間，並同時大幅降低所需耗費之材料成本，然而目前市面上尚缺乏一種準確、低成本、易保存且高效率的進行核酸雜交之檢測技術。

有鑑於此，本發明提供利用微流道晶片進行核酸雜交之方法，用以達到快速進行核酸雜交之目的，該微流道晶片內設有一雜合區，該雜合區係呈空腔狀，該雜合區內設置有一具孔洞之基質，該基質與該雜合區之側壁間係留有一預定寬度之空隙，該雜合區並分別連通設置有至少一第一流通口與至少一第二流通口，包括以下步驟：(a)把一待測之核酸與一探針核酸混合形成之一混合液經由至少一流通口注入該微流道晶片，充滿該基質與該雜交區側壁間之空隙，使有雜合配對的待測之核酸與探針核酸吸附於基質的邊緣，該專一性探針係帶有一螢光標記；(b)連續注入一陰離子界面活性劑，該陰離子界面活性劑經由至少一流通口注入該微流道晶片後，由基質邊緣流經基質中心而由其餘至少一流通口流出；以及(c)待陰 離子界面活性劑沖洗一預定時間後，檢測該基質上的雜合訊息；其中，在步驟(a)之前注入一緩衝液至該含基質之微流道晶片，使該基質活化帶正電，俾使步驟(c)陰離子界面活性劑的沖洗可與有雜合配對的待測之核酸與探針核酸形成微胞(micelle)，而把步驟(b)中已雜合配對的待測之核酸與探針核酸，由基質邊緣往基質中心加速擴散移動，本發明之步驟只需室溫中進行，不需有任何加熱程序。

本發明係以該陰離子界面活性劑的疏水性端結構片段將待測之核酸與探針核酸包覆，並以親水性端結構片段所帶的負電荷，與基質上的正電荷耦合，其中該陰離子界面活性劑的濃度會決定步驟(c)之該預定時間。

陰離子界面活性劑係為硫酸十二酯鈉溶液(sodium dodecyl sulfate)或肌胺酸溶液(sarcosine)，其中該硫酸十二酯鈉溶液的濃度範圍為0.1-0.3%(w/v)，該步驟(c)的預定時間為400秒以內；該肌胺酸溶液(sarcosine)的濃度範圍為0.3-0.4%(w/v)，該步驟(c)的預定時間為400秒以內。在另一實施例中，步驟(c)注入陰離子界面活性劑的同時，可選擇性地一併加入低濃度溶液，例如標準檸檬酸鈉溶液(standard sodium citrate)，其中該標準檸檬酸鈉溶液的濃度範圍為0.001-5倍稀釋濃度，且該緩衝液係一TE緩衝液。

藉由步驟(a)之前先注入一緩衝液，可使基質整體活化帶有正電荷，而在注入待測之核酸與帶有標記之探針核酸之混合液後，便步驟(b)連續注入一陰離子界面活性劑，使得雜合配對成功的待測之核酸與有標記之探針核酸形成微胞，於基質上顯示出由基質邊緣往基質中心的加速擴散移動；而未配對的大分子待測核酸則因未與有標記探針結合，便不會顯示 於基質上；而未配對之有標記探針核酸則被陰離子界面活性劑或其與選擇性地加入低濃度溶液，例如標準檸檬酸鈉溶液由基質孔洞所沖除，少部分有標記探針核酸則停留於基質邊緣。因此，藉此迥異於習知技術的移動方式，本發明能於室溫中在極短的時間內經由探針核酸檢驗出待測病原菌。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

10‧‧‧上基板

11‧‧‧雜合區

12‧‧‧第一流通口

13‧‧‧第二流通口

14‧‧‧第一微流道

15‧‧‧空隙

30‧‧‧基質

第1圖係本發明實施例之方法流程示意圖。

第2圖係本發明微流道晶片之俯視圖。

第3圖係以硫酸十二酯鈉(SDS)溶液沖洗待測雙股DNA/Sybr及探針/HEX之結果圖。

第4圖係以肌胺酸(sarcosine)溶液沖洗待測雙股DNA/Sybr及探針/HEX之結果圖。

第5圖係以硫酸十二酯鈉(SDS)與標準檸檬酸鈉溶液(SSC)混合液沖洗探針/HEX之結果圖。

第6圖係以肌胺酸(sarcosine)與標準檸檬酸鈉溶液(SSC)混合液沖洗天然/變性DNA及天然/變性探針結果圖。

第7圖係以肌胺酸(sarcosine)、硫酸十二酯鈉(SDS)分別搭配標準檸檬酸鈉溶液(SSC)沖洗待測DNA與探針之雜合結果圖。

第8圖以標準檸檬酸鈉溶液(SSC)沖洗待測雙股DNA/Sybr之結果圖。

第9圖以標準檸檬酸鈉溶液(SSC)沖洗探針/HEX之結果圖。

第10圖為陰離子界面活性劑所形成之微胞示意圖。

定義

「核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」及「核苷酸序列」一詞在本文中可互換使用，以表示任何長度之核苷酸的聚合物形式。聚核苷酸可包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。本文所示之核苷酸序列係以5’至3’方向排列。

「具專一性」係為當該探針可與特定之待測大分子核酸結合或產生交互作用，但未顯著地與其他大分子核酸結合或產生交互作用。

材料及方法：

請參閱第1圖，係為本發明實施例之方法流程示意圖。本發明之利用微流道晶片進行核酸雜交之方法，包括步驟100提供一微流道晶片，其內設有一具孔洞之基質，接著於步驟101注入一緩衝液活化該微流道晶片的基質，使其帶正電荷。步驟102則注入一待測之核酸與一探針核酸的混合液至該微流道晶片，使有雜合配對的待測之核酸與探針核酸吸附於基質的邊緣。之後於步驟103，連續注入一陰離子界面活性劑至該微流道晶片，把已雜合待測之核酸與探針核酸，由基質邊緣往基質中心加速擴散移動。最後進行步驟104，待陰離子界面活性劑沖洗一預定時間後，檢測該基質上的雜合訊息。

進行雜交反應訊息偵測時，可配合探針所具有之標記，而使 用適當的檢測方式。關於檢測方式，目前市面上有相當多的反應組套，除可利用該組套進行呈色或其他顯示反應。熟習本發明之技術領域者根據本說明書之敘述亦可了解，探針核酸製備時可以HEX、Cy3及Cy5等冷光反應檢測方式。所述檢測方式僅係例示，其他例如：阻抗檢測、電容值檢測、電阻值檢測、電化學檢測等光電反應檢測方式，以及質量檢測或重量檢測方式亦皆可利用，但並不僅限於此。

在本發明之實施例中，準備如第2圖結構之微流道生物晶片，其係由一聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)上基板10以及一聚甲基丙烯酸甲酯下基板20上下相疊合連接所構成。上基板10與下基板20間設有一呈原盤空腔狀之雜合區11，雜合區11中夾設有一直徑為6 mm，孔洞為0.2 mm之圓形尼龍膜(基質30)，尼龍膜邊緣與雜合區11側壁間則留有0.1 mm之空隙15，使得微流體能流經尼龍膜的纖維。第一流通口12與第二流通口13分別依習知微流道晶片裝置之設置方式，而分別連接有連通管與幫浦，第一微流道14則連通第二流通口13與雜合區11，以進行溶液之輸送。

製備欲進行雜合配對之待測DNA溶液與探針核酸溶液，取50 μL的實驗組Edwardsiella tarda(BCRC16702、BCRC16711)與對照組Escherichia coli(DH5α)，以PCR經過35個擴增循環表達16S rDNA。另外，則準備一僅能夠與E.tarda 16S rDNA相配對而不會與E.coli 16S rDNA相配對之有螢光標記(HEX)的探針核酸(長度為20 bp)；並各取5 μL分別加入前述待測已表達之16S rDNA溶液中加以混合，進行鹼基配對，並將之加熱至94℃5分鐘使於室溫下自然冷卻。Edwardsiella tarda PCR表達的16S rDNA 結合在基質的邊緣，此已用SYBR® Green I(購自Life Technologies Corporation)染色證實，SYBR® Green I在游離狀態下僅有微弱背景螢光，但一旦鑲嵌結合至DNA雙股螺旋的小溝區(minor groove)，經激發後可產生非常強的螢光，因此，SYBR® Green I的螢光強度與待測DNA的數量相關，適合用來監測PCR過程中待測DNA量的變化；本發明中該待測DNA與SYBR® Green I染色劑之混合液簡稱為DNA/Sybr。

於室溫中把50 μL的TE緩衝液以一預定流速，較佳為15 μL/min注入微流道晶片內，以活化雜合區內基質上(如：尼龍膜)的電荷，使基質帶有正電荷，其中該TE緩衝液係為Tris鹽酸緩衝液中加入EDTA所製成。接著，把前述經由PCR擴增放大的各種組合之混合液，例如待測DNA/Sybr、探針/HEX、天然DNA、變性DNA、E.tarda BCRC16702 DNA/探針、E.tarda BCRC 16711 DNA/探針及E.coli DH5α/探針。

於室溫中取20 μL的前述混合液直接由第二流通口13注入微流道晶片，經由第一微流道14到達帶有正電荷的基質上，流速較佳為50 μL/min。接著沖洗條件係使用陰離子界面活性劑：硫酸十二酯鈉溶液(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)或肌胺酸(sarcosine)，結構式如第10圖所示，以流速較佳為50 μL/min沖洗未雜合之探針，由基質30邊緣往基質中心流動擴散，最後由基質30與第二流通口於同一平面所設之第一流通口12排出，由於與探針配對結合之待測DNA形成雙股便藉由使用陰離子界面活性劑會迅速往基質中心移動，此時進行螢光標記探針之移動偵測，螢光顯微鏡以每10秒拍攝1張，取70張影像紀錄，藉由有螢光標記之探針移動之狀態；而未配對之探針核酸則直接被沖洗掉，未配對之其餘待測DNA也因未有螢光標 記之探針結合，也不會於螢光影像中顯現。在本發明另一實施例中，沖洗條件也可使用該陰離子界面活性劑與低濃度鹽液，例如標準檸檬酸鈉溶液(standard sodium citrate，SSC)的混合液，準備20倍SSC包括3 M氯化鈉(sodium chloride)與0.3 M，pH 7.0檸檬酸鈉(sodium citrate)]中備用。本發明可快速於10分鐘以內，較佳為10秒-400秒內明確地判定檢測結果。

實施例1 以硫酸十二酯鈉(SDS)溶液沖洗待測雙股DNA/Sybr及探針/HEX分析

由第3圖可明顯看出當注入的混合液為待測雙股DNA與SYBR® Green I染色劑之結合(簡稱為DNA/Sybr)及探針/HEX，於不同濃度的SDS沖洗條件下之結果，SDS濃度分別為0.04%(w/v)、0.1%(w/v)、0.2%(w/v)及0.3%(w/v)。第3圖顯示大分子待測16S rDNA(其長度約為1540 bp)於0.1%(w/v)的SDS沖洗條件下，沖洗200秒後才會開始向基質中心緩慢移動，而於0.2%(w/v)的SDS，該大分子待測DNA在沖洗400秒後明顯開始向基質中心移動，而於0.3%(w/v)的SDS，該大分子待測DNA在沖洗400秒幾乎全部移動到基質中心；而小分子探針/HEX於0.04%(w/v)的SDS沖洗條件，則因未有配對結合都立刻被沖走，沖不走的小分子探針/HEX則陷在基質邊緣，只有微弱的一圈螢光。在本發明之另一實施例中，同樣發現小分子探針/HEX於濃度0.01%-0.3%(w/v)的SDS有如第3圖相同的情況。

實施例2 以肌胺酸(sarcosine)溶液沖洗待測雙股DNA/Sybr及探針/HEX分析

由第4圖可明顯看出當注入的混合液為待測雙股DNA與 SYBR® Green I染色劑之結合(簡稱為DNA/Sybr)及探針/HEX，於不同濃度的肌胺酸(sarcosine)沖洗條件下之結果，肌胺酸濃度分別為0.2%(w/v)、0.3%(w/v)及0.4%(w/v)。第4圖顯示大分子待測DNA於0.3%(w/v)的肌胺酸(sarcosine)沖洗條件下，沖洗600秒後才會開始向基質中心移動，而於0.4%(w/v)的肌胺酸(sarcosine)，該大分子待測DNA在沖洗400秒後明顯開始向基質中心移動，沖洗600秒後，幾乎以全部沖洗出晶片基質外由第一流通口12排出；而小分子探針/HEX於0.2%(w/v)、0.3%(w/v)的肌胺酸(sarcosine)沖洗條件，則因未有配對結合都立刻被沖走，沖不走的小分子探針/HEX則陷在基質邊緣，只有微弱的一圈螢光。在本發明之又一實施例中，同樣發現小分子探針/HEX於濃度0.05%-0.4%(w/v)的肌胺酸(sarcosine)有如第4圖相同的情況。

實施例3 以硫酸十二酯鈉(SDS)與標準檸檬酸鈉溶液(SSC)混合液沖洗探針/HEX分析

由第5圖可明顯看出當注入的混合液為探針/HEX，於單獨使用0.1%(w/v)SDS沖洗條件及0.1%(w/v)SDS與0.1倍SSC混合液之沖洗結果。第5圖顯示單純陰離子界面活性劑SDS在沖洗過程中，小分子探針除陷在基質不能移動者外，游離的探針被SDS以微胞包覆並迅速向基質中心移動，移動過程中與基質上的正電荷耦合，則不再移動，在第300秒起很明顯的螢光由外向內漸淡。當陰離子界面活性劑SDS搭配0.1倍的SSC之混合液，比較探針在沖洗過程中在基質上移動狀態，在第200秒起可發現SSC溶液提供Cl^-與citrate^-的陰離子與探針/DNA競爭基質上的正電荷耦合，有效降低螢光背景值。

實施例4 以肌胺酸(sarcosine)與標準檸檬酸鈉溶液(SSC)混合液沖洗天然/變性DNA及天然/變性探針分析

由第6圖可明顯看出當注入的混合液為天然DNA/Sybr、變性DNA/Sybr、天然探針/HEX及變性探針/HEX，使用0.4%(w/v)肌胺酸(sarcosine)溶液與0.1倍SSC混合液之沖洗結果。比較天然DNA與變性DNA在微流道晶片的基質上沖洗的效果，發現以適度濃度的陰離子濃度界面活性劑搭配0.1倍SSC沖洗條件時，在天然(不加熱處理)與變性(加熱處理急速冷卻)狀態下，0.1倍SSC混合液沖洗大分子DNA時，天然DNA會從基質邊緣被沖洗下，並向基質中心移動，其中約300秒後明顯移動，而變性DNA則不會，仍停留並連結在基質邊緣。同樣條件下，以適度濃度陰離子界面活性劑搭配0.1倍SSC沖洗小分子探針不論加熱處理與否，不是很快被沖走，就是皆停留且連結在基質邊緣沖洗不掉。

實施例5 以肌胺酸(sarcosine)、硫酸十二酯鈉(SDS)分別搭配標準檸檬酸鈉溶液(SSC)沖洗待測DNA與探針之雜合分析

由第7圖可明顯看出當注入的混合液為探針、雜合的E.tarda BCRC16702 DNA/探針、雜合的E.tarda BCRC16711 DNA/探針及未雜合的E.coli DH5α/探針；使用0.1倍SSC依序分別與：0.4%(w/v)肌胺酸(sarcosine)溶液、0.1%(w/v)的SDS、0.4%(w/v)肌胺酸(sarcosine)溶液及0.3%(w/v)肌胺酸(sarcosine)溶液混合。由實施例4的天然DNA與變性DNA比較得知，在室溫下自然冷卻雜合(hybridization)時，DNA及探針雜合分子應介於天然與變性狀態之間；當類似天然狀態，則DNA會向基質中心移動，但因本實施例的DNA未以SYBR® Green I染色而看不見；若室溫下自然冷卻雜合時為類 似變性狀態，仍因為停留連結於基質邊緣，且由於該變性DNA未染色時看不見，再者，探針本身是停留連結在基質邊緣不會動。因此，在本實施例中只有與具有螢光標記之探針雜合的待測DNA才能被看到，所以沖向基質中心移動中的螢光影像為待測核酸/探針雜合分子。

結果顯示陰離子界面活性劑可與待測核酸/探針形成微胞(micelle)，微胞結構如第10圖所示。當陰離子界面活性劑為SDS時，其以疏水性端(hydrophobic)C12的結構片段將待測核酸/探針包覆，並以親水性端(hydrophilic)結構片段所帶的負電荷，與基質上的正電荷耦合。當陰離子界面活性劑為肌胺酸(sarcosine)時，其以疏水性端C14的結構片段將待測核酸/探針包覆，並以親水性端結構片段所帶的負電荷，與基質上的正電荷耦合。其中，本實驗結果顯示雜合的探針ET996/16702的DNA、ET996/16711的DNA皆可觀察到向基質中心移動的影像，而未雜合的ET996/DH5α則看不到向基質中心移動的螢光影像。

比較例1 以標準檸檬酸鈉溶液(SSC)沖洗待測雙股DNA/Sybr分析

由第8圖可明顯看出當注入的混合液為待測DNA與SYBR® Green I染色劑之結合(簡稱為DNA/Sybr)，於不同稀釋倍數的SSC沖洗條件下之結果，且未使用任何陰離子界面活性劑，其中SSC溶液分別稀釋為0.001倍、0.01倍、0.1倍及1倍。結果顯示以0.1倍或以上SSC溶液沖洗時，大分子待測DNA不會被沖洗至基質中心。然而，以0.01倍或更低0.001倍SSC溶液沖洗時，大分子待測DNA則顯示會被沖洗至基質中心。

比較例2 以標準檸檬酸鈉溶液(SSC)沖洗探針/HEX分析

由第9圖可明顯看出當注入的混合液為探針/HEX，於不同稀釋倍數的SSC沖洗條件下之結果，且亦未使用任何陰離子界面活性劑，其中SSC溶液分別稀釋為0.001倍、0.01倍、0.1倍及1倍。結果顯示無論是以低濃度0.001倍及高濃度至5倍(參見表1)SSC溶液沖洗時，皆無法把陷在基質邊緣的小分子探針沖洗下來。

由表1及第8、9圖顯示SSC溶液的沖洗為可選擇性地步驟，尤其是0.1倍的SSC溶液，因為其並未影響牢牢陷住連結至基質的雙股大分子DNA和小分子探針之移動情形，SSC溶液的作用不在移動核酸分子，而是提供陰離子與基質上的正電荷耦合。因此，在0.1倍的SSC溶液環境下，大分子待測DNA/SYBR及探針/HEX是否從基質上沖洗而脫落，本發明已證實係由陰離子界面活性劑的濃度決定。

由圖中實驗之結果可知，由於探針核酸能夠與E.tarda DNA相配對，因此當雜合混和溶液注入雜合反應本體後，E.tarda DNA與相配對之探針核酸(標記有螢光分子)即被阻擋吸附在基質邊緣，且其他未相配對之探針核酸亦有充塞於基質的孔洞之中，因此於未沖洗前，基質邊緣顯示螢光訊號。然而，只需經過一次之特定濃度範圍的陰離子界面活性劑沖洗，除沖洗未完成配對的多餘探針核酸被沖洗掉，本發明更發現E.tarda DNA與 相配對之探針核酸(標記有螢光分子)之配對組合會快速地被沖洗掉，亦即往基質中心移動。因此，藉由本發明方法的確能夠鑑別配對有探針核酸之待測DNA，進而確認待測DNA是否具有所欲標的的序列。

另一方面，於對照組中，由於E.coli DNA序列無法與探針核酸相配對，在本發明中只有與具有螢光標記之探針雜合的DNA才能被看到，所以移動中的螢光影像為DNA/探針雜合分子，因此未雜合的ET996/DH5α則看不到向基質中心移動的螢光影像，藉此結果可進一步確認本發明方法檢測之可行性，而不會有偽陽性之情形發生。

Claims (14)

1. 一種利用微流道晶片進行核酸雜交之方法，該微流道晶片內設有一雜合區，該雜合區係呈空腔狀，該雜合區內設置有一具孔洞之基質，該基質與該雜合區之側壁間係留有一預定寬度之空隙，該雜合區並分別連通設置有至少一第一流通口與至少一第二流通口，包括以下步驟：(a)把一待測之核酸與一探針核酸混合形成之一混合液經由至少一流通口注入該微流道晶片，充滿該基質與該雜交區側壁間之空隙，使有雜合配對的待測之核酸與探針核酸吸附於基質的邊緣；(b)連續注入一陰離子界面活性劑沖洗，該陰離子界面活性劑經由至少一流通口注入該微流道晶片後，由基質邊緣流經基質中心而由其餘至少一流通口流出；以及(c)待陰離子界面活性劑沖洗一預定時間後，檢測該基質上的雜合訊息；其中，在步驟(a)之前注入一緩衝液至該含基質之微流道晶片，使該基質活化帶正電，俾使步驟(c)陰離子界面活性劑的沖洗可與有雜合配對的待測之核酸與探針核酸形成微胞(micelle)，而把步驟(b)中已雜合配對的待測之核酸與探針核酸，由基質邊緣往基質中心加速擴散移動。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中以該陰離子界面活性劑的疏水性端結構片段將待測之核酸與探針核酸包覆，並以親水性端結構片段所帶的負電荷，與基質上的正電荷耦合。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該陰離子界面活性劑的濃度會決定步驟(c)之該預定時間。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該陰離子界面活性劑係為硫酸 十二酯鈉溶液(sodium dodecyl sulfate)。
5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該硫酸十二酯鈉溶液的濃度範圍為0.1-0.3%(w/v)。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該預定時間為400秒以內。
7. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該陰離子界面活性劑係為肌胺酸溶液(sarcosine)。
8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該肌胺酸溶液(sarcosine)的濃度範圍為0.3-0.4%(w/v)。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該預定時間為400秒以內。
10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(c)注入陰離子界面活性劑的同時，可選擇性地一併加入一低濃度鹽液。
11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該低濃度鹽液係為標準檸檬酸鈉溶液(standard sodium citrate)。
12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該標準檸檬酸鈉溶液的濃度範圍為0.001-5倍稀釋濃度。
13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該專一性探針係帶有一螢光標記。
14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該緩衝液係一TE緩衝液。