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WO1990011069A1 - Procede de preparation de compose ligand-recepteur - Google Patents

Procede de preparation de compose ligand-recepteur Download PDF

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Publication number
WO1990011069A1
WO1990011069A1 PCT/FR1990/000176 FR9000176W WO9011069A1 WO 1990011069 A1 WO1990011069 A1 WO 1990011069A1 FR 9000176 W FR9000176 W FR 9000176W WO 9011069 A1 WO9011069 A1 WO 9011069A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
product
galactose
ligand
rhamnose
phosphate
Prior art date
Application number
PCT/FR1990/000176
Other languages
English (en)
Inventor
Alain Denis
Claudine Kieda
Michel Monsigny
Pierre Perrier
Gérard Redziniak
Original Assignee
Parfums Christian Dior
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Parfums Christian Dior filed Critical Parfums Christian Dior
Priority to DE69006496T priority Critical patent/DE69006496T2/de
Priority to CA002056357A priority patent/CA2056357C/fr
Publication of WO1990011069A1 publication Critical patent/WO1990011069A1/fr

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Definitions

  • the present invention essentially relates to a process for fixing a product on the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond, process for the preparation of such a product, product obtained, cosmetic composition. or pharmaceutical container and its preparation process.
  • liposomes have been used as vectors drug or other active ingredient (see for example FR-A-2 221 122 or FR-A-2 415 460 or FR-A-2 540 381).
  • Document FR-A-2 609 397 relates to the use of a substance or composition of a carbohydrate nature as the active principle of a dermatological, or cosmetological, or pharmaceutical, or cellular stimulant composition, with the aim of strengthening the cellular bioenergetic potential or tissue (see claim 1) or to improve skin comfort, thanks to their moisturizing, softening, softening effect (page 3, line 33 to page 4, line 10; where an anti-inflammatory action is even indicated).
  • This document therefore relates to general education which is not related to the particular problem of keratinocytes.
  • Document PCT / W0 87/05300 BIOCOMPATIBLES LTD relates to a process for preserving a material having a structure dependent on water, comprising bringing the material into contact with an aqueous solution of a polyhydroxy compound and then removing the water of this material, this in order to allow a long term conservation of biological materials such as hemoglobin, erythrocytes, liposomes and cells (see page 1, lines 1 to 4).
  • WO 88/00474 describes a lipid membrane structure comprising a lipid vesicle encapsulating a medicament, and a ligand comprising a specific residue. hepatobiliary receptors, in order to achieve a control of the structure towards the hepatocytes with exceptional efficiency.
  • EP-A-0 285 178 relates to mannobiose derivatives useful as a modification component of pharmaceutical preparations, such as liposomes, having a specific affinity for Kupffer cells of the liver.
  • this document recommends a specific culture of keratinocytes to activate them in order to activate their capacity to multiply on all substrates coated with ligands.
  • patent application PCT / W0 86/05789 BIOCARB also relates to hydrocarbon derivatives within the framework of specific targeting for a therapeutic or diagnostic purpose, this targeting being carried out on molecules of organs different from mammals including humans (see page 1, lines 4 to 8).
  • rhamnose, galactose and galactose-6-phosphate are ligands specific for receptor sites of the keratinocyte membrane. It was further observed that the ⁇ - rhamnose and ⁇ - -galactose-6-phosphate have a specificity
  • the product carrying this sugar forming a ligand specific for receptors of the keratinocyte membrane could be in various forms. It can be, for example, a submicroscopic particle, such as a liposome or a polymer nanoparticle, or even a molecule or a macromolecule of natural or synthetic origin, such as a protein.
  • the ligand-forming sugar can be coupled in various ways to the surface of this product. It can be advantageously coupled by a covalent chemical bond, preferably by means of a spacer arm.
  • the object of the present invention is to solve the new technical problem consisting in providing a solution making it possible to specifically fix a product on the membrane of keratinocytes by means of a ligand-receptor bond, if necessary to the detriment of other categories of cells surrounding keratinocytes.
  • the object of the present invention is to solve the above new technical problem according to an extremely simple, rapid, practical and reliable method.
  • the present invention also aims to solve this new technical problem by providing a method of selecting a product capable of specifically binding to the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond which is particularly simple, rapid, practical. and reliable.
  • Another object of the present invention is to solve the aforementioned new technical problem by providing a process for the preparation of such a product capable of being specifically fixed on the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond which is as simple, rapid. , practical and reliable.
  • the present invention also aims to solve the aforementioned new technical problem by providing a product capable of being specifically fixed on the memoran of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond which is in a form which is particularly easy to handle, which is reliable and can be used quickly without requiring special steps.
  • the Another object of the present invention is to solve the aforementioned new technical problem by providing a cosmetic or pharmaceutical, in particular dermatological, composition and its preparation process, incorporating such a specific product which has all of the aforementioned determining technical advantages relating to the reliability of the specific fixation. on the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond according to a rapid, practical method.
  • the present invention solves the aforementioned technical problem by providing the aforementioned solutions in an extremely simple manner, usable on an industrial scale.
  • the present invention provides a method for fixing a product on the memoran of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond, characterized in that a product consisting of a structure is used.
  • base coupled to at least one ligand consisting of an osidic residue accessible to membrane receptors, said osidic residue being chosen from rhamnose, galactose and galactose-6-phosphate, and preferably from ⁇ --rhamnose and ⁇ - -galac tose-6-pnosphate.
  • the invention includes all the isomeric forms of rhamnose and galactose.
  • the ligand is coupled to the surface of said basic structure by a covalent chemical bond.
  • the ligand is coupled to the surface of the above-mentioned basic structure by means of a spacer arm such as the residue of a heterobifunctional reagent or a group of several sugars, such that the group (1-4) -o- ⁇ - D-glucopyranosyl- (1- 6) -o- ⁇ -D-glucopyranosyl.
  • a spacer arm such as the residue of a heterobifunctional reagent or a group of several sugars, such that the group (1-4) -o- ⁇ - D-glucopyranosyl- (1- 6) -o- ⁇ -D-glucopyranosyl.
  • the above-mentioned product is a submicroscopic particle such as a liposome or a polymeric nanoparticle.
  • the above-mentioned product is a molecule or a macromolecule of natural or synthetic origin, such as
  • an asiaticoside containing the ⁇ - -rhamnose extracted in particular from the plant Centella asiatica, available for example from Inverni Délia Beffa,
  • a digalactosyldiglyceride obtained in particular from an extract of wheat flour, available for example from Sigma, - a neoglycoprotein obtained for example by combining a serum albumin (SA) for example bovine or human with aforementioned sugar.
  • SA serum albumin
  • the aforementioned product is or contains a substance of cosmetic or pharmaceutical interest, in particular dermatological, such as an agent modulating the metabolism of skin cells.
  • the present invention also provides a method for selecting a product intended to be fixed on the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond, characterized in that one chooses, from among a set of products, those consisting of a basic structure coupled to at least one ligand constituted by an osidic residue accessible to receptors, said osidic residue being chosen from rhamnose, galactose or ga lactose-6-phosphate, preferably ⁇ - rhamnose and ⁇ -galactose-6-phosphate.
  • the present invention also provides a process for the preparation of a product intended to be fixed to the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond, characterized in that a structure is coupled corresponding base one at least one ligand consisting of an osidic residue accessible to membrane receptors, said osidic residue being chosen from rhamnose, galactose and galactose-6-phosphate, preferably ⁇ -L-rhamnose and ⁇ -D-galac tose-6-phosphate.
  • the above-mentioned ligand is coupled to the basic structure by a covalent chemical bond.
  • the coupling can be carried out in accordance with the general method described by Mac Broom in Methods in Enzymology (1972) 28, 212-222 or also that described by FJ Martin and D. Papahadjoloupos in The Journal of Biological Chemistry (1982), vol 257, n ° 1, pages 286-288.
  • the aforementioned ligand is coupled to the basic structure by means of a spacer arm as defined above.
  • the basic structure is a submicroscopic particle such as a liposome or a polymeric nanoparticle.
  • the abovementioned basic structure is a molecule or a macromolecule of natural or synthetic origin, such as a protein, for example a serum albumin.
  • the aforementioned product is or contains a substance of cosmetic or pharmaceutical interest, in particular dermatological, such as an agent modulating the metabolism of the cells of the water.
  • the invention also covers a product intended to be fixed on the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond, characterized in that it is obtained according to one of the previously defined methods .
  • the invention also covers new products capable of binding to the membrane of a keratinocyte by means of a ligand-receptor bond, characterized in that they comprise at least one ligand consisting of an osidic residue accessible to membrane receptors , said osidic residue being chosen from rhamnose, galactose and galactose-6-phosphate and preferably ⁇ - -rhamnose and ⁇ -
  • this coupling takes place via a spacer arm such as the residue of a heterobifunctional reagent or a group of several sugars, such as the group (1-4) -o- ⁇ - -glucopyranosyl - (1-
  • the present invention also provides a cosmetic or pharmaceutical composition, in particular a dermatological composition, characterized in that it contains at least one product as obtained by the process previously described or as previously defined.
  • the aforementioned composition is intended for any care or any treatment of interest to keratinocytes, for example the improvement of skin regeneration, the treatment of psoriasis or hair regrowth.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a cosmetic or pharmaceutical composition, in particular a dermatological composition, characterized in that at least one product such as a cosmetically or pharmaceutically acceptable excipient, vehicle or support is associated that obtained by one of the methods previously described, or as previously defined.
  • the invention also covers a process for the care or treatment of keratinocytes, for example with a view to skin regeneration, the treatment of psoriasis or hair regrowth, characterized in that the product is applied as previously obtained by one of the methods previously described, or as previously defined, in a cosmetically or therapeutically effective amount, advantageously while the latter is associated with a cosmetically or pharmaceutically acceptable vehicle, supoort or excipient.
  • cell targeting of a product is obtained which can thus be specifically concentrated at the level of keratinocytes thanks to the presence at least one specific ligand consisting of the osidic residue chosen from rhamnose, galactose and galactose-6-pnosphate, preferably ⁇ - -rhamnose and ⁇ - -galactose-6-phosphate.
  • the product to which the product is coupled the specific ligand constituted by the osidic residue may be any.
  • the number of osidic residues as defined above carried by the protein is at least about twenty.
  • lipid vesicle which can be in the form of a liposome.
  • lipid covers all substances comprising a so-called fatty carbon chain, generally greater than 5 carbon atoms, this substance usually being called "lipid".
  • ampnionile lipids are used as lipid to form the abovementioned liposome, that is to say made up of molecules having a hydrophilic group either ionic or nonionic and a lipophilic group, these amphiphilic lipids being susceptible to form lipid lamellar phases or liposomes in the presence of an aqueous phase.
  • lipids phospholipids, phosphoaminolipids, glycolipids. polyoxyethylenated fatty alcohols, esters of polyols optionally polyoxyethylenated.
  • Such substances are, for example, constituted by an egg or soy lecithin, a phosphatidylserine, a sphyngomyelin, a cerebroside or an oxyethylenated polyglycerol stearate.
  • the liposomes are formulated so as to have a high microviscosite.
  • This can for example be obtained by using amphiphilic lipids whose transition temperature is higher than approximately 37oC and preferably 41oC, in particular phospholipids or saturated fatty acids, for example dipalmitoyl phosphatidylcholine.
  • a polymeric nanoparticle generally of di mens i on i nfé ri eu re mi mi mi rom rom er, preferably polymer nanoparticles comprising NH 2 groups, alcohol functions or or thiol functions allowing easy coupling with the osidic residue according to the invention.
  • biodegradable nanoparticles such as polylactates
  • Such particular particles comprising NH 2 groups are commercially available, for example from Interfacial Dynamics Corporation (Portland, Oregon-USA).
  • the osidic residues coupled to the surface of said polymeric nanoparticles are chosen from the residues of ⁇ -D- galactose, ⁇ - L-rhamnose and ⁇ -D-galactose-6-phosphate.
  • porous nanoparticles can be used to encapsulate the active substances.
  • the basic products such as the aforementioned liposomes or nanoparticles, contain one or more substances of cosmetic or pharmaceutical interest, especially dermatological, such as an agent for modulating cell metabolism of the skin, for example peptides obtained by hydrolysis of proteins, modulators of enzymatic activity, for example a xanthine such as theophylline.
  • dermatological such as an agent for modulating cell metabolism of the skin, for example peptides obtained by hydrolysis of proteins, modulators of enzymatic activity, for example a xanthine such as theophylline.
  • the basic product which can be used according to the invention can also be the active substance itself of cosmetic or pharmaceutical interest, in particular dermatological interest.
  • PPITC- ⁇ - -rhamnopyranoside is prepared from p-
  • DPPE is dissolved mole to mole with PPITC- ⁇ - -rhamnopyranoside at 50oC in a mixture consisting of bicarbonate buffer (0.1 M, pH 9.5) and ethanol. The temperature is maintained at 50oC for 3 h, with stirring. The reaction medium is then cooled to approximately 4oC, and centrifuged.
  • DPPE-Rha rhamnosylated DPPE
  • This aqueous solution can, for example, contain a fluorescent marker consisting, for example, of the potassium salt of 5- (6) -carboxyfluorescein in an amount of 8 g per 40 ml of distilled water.
  • blue calcein can also be used in an equivalent manner.
  • the mixture After adding 10 ml of the aqueous solution to be encapsulated above, the mixture is placed under magnetic stirring for 15 to 24 hours, protected from light.
  • the contents of the flask are collected in a 30 ml container cooled in melting ice.
  • the suspension is subjected to sonication three times at 2 min at 4oC at a power of 200 W, which allows form liposomes of substantially homogeneous size, of submicroscopic dimension.
  • the liposomal suspension thus obtained can be stored at 4 ° C.
  • purification of the liposomes is carried out by separating them from the non-encapsulated aqueous phase by gel filtration, as is well known according to the conventional liposome purification protocol.
  • an “activated sugar” of formula (I) is prepared, as indicated below, consisting of a residue ⁇ - -rhamnopyranosyle, in which the OH group located on the first carbon is substituted by a straight chain terminated by an SH group.
  • the derivative (2) is obtained according to KEMPEN H.J.M. et al.,
  • the derivative (3) is obtained according to CHIPOWSKY S. et al.,
  • the product (4) is obtained by equimolecular reaction between the derivative (3) and 3-iodopropionic acid in solution in a water / acetone mixture 1: 1 in the presence of 1.15 eq. of Na 2 CO 3 and 2 eq. of Na 2 S 2 O 5 .
  • the reaction is followed by TLC (solvent AcOEt / AcOH / H 2 O 8: 2: 1).
  • the derivative (5) is obtained by deacylation of (4) in the presence of 4 eq. of triethylamine and 3 eq. of water in methane.
  • the reaction is followed by TLC (solvent AcOEt / AcOH / H 2 O 8: 2: 1); it is complete after 6 days.
  • the deacetylation product is isolated from the reaction medium by passage through a Dowex 1x2 column (HCOO-).
  • the product (7) is obtained by equimolecular reaction between the derivative (6) and succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA, synthesis according to Ducan et al. Anal. Biochem. (1983) 132 68-73) in presence of triethylamine (1 eq) in anhydrous dimethylformamide.
  • SATA succinimidyl-S-acetylthioacetate
  • the product (7) obtained is used in the rest of the operations without any particular purification.
  • liposomes are prepared according to a conventional method, for example as in Example 1.
  • the composition of the lipid phase is a mixture in 10: 2: 7 molar proportion of the following compounds:
  • MPB-DPPE is a phosoholipid carrying a maleimide group, prepared according to the method described by Martin F.J. and
  • the mixture is placed under an argon atmosphere, with gentle stirring for 12 h at ordinary temperature.
  • the thiol function of the compound of formula (I) is then fixed by addition reaction on the double bond of the maleimide group.
  • Liposomes are thus obtained comprising on the surface rhamnosylated residues located at the end of a chain of atoms (spacer arm) corresponding to the chain of the compound of formula (I).
  • composition of the lipid phase is a mixture in 4: 4: 1: 1 molar proportion of the following compounds:
  • the asiati coside is extracted from the plant Centella asiatica, available for example from Inverni Délia Beffa, of formula L-asiatate of [(0- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1-4) -o- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1-6)] -
  • the constituents of the above lipid phase are dissolved at a concentration of approximately 10% in an 80:20 by volume mixture of di chloromethane and methanol.
  • the organic solution is atomized at around 60oC according to the process described in document EP-B1-0087993 to obtain a powder.
  • This powder is then dispersed by stirring in the aqueous solution to be encapsulated, in a proportion of 1 part of powder for
  • aqueous solution 100 parts of aqueous solution.
  • This solution can for example contain a fluorescent label such as 5- (6) carboxyfluorescein, as in Example 1.
  • a liposome suspension is thus formed which is preferably homogenized, for example by means of a pressurized homogenizer as described in document EP-B1-0107559.
  • a suspension of liposomes comprising on the surface rhamnosylated residues, connected to the bilayer by spacer arms constituted by the residue (1-4) -o- ⁇ - -glucopyranosyl- (1-
  • Example 5 The procedure is as in Example 1, except that the digalactosyldiglyceride, wheat flour extract, available for example from Sigma and comprising at the end of the molecule two galactosy les residues, is used, instead of the product according to the invention used in Example 1.
  • Example 5 according to the invention
  • Nanoparticles can be obtained commercially in the form of beads with an average diameter of approximately 0.5 ⁇ m consisting mainly of polystyrene, and having NH 3 + groups on the surface. Such nanoparticles are available for example from Interfacial Dynamics Corporation (IDC, Portland, Oregcn, USA).
  • Nanoparticles are thus obtained comprising rhamnosylated residues on the surface.
  • a protein for example bovine serum albumin, BSA, to which around twenty units of rhamnose are coupled, thereby obtaining a neoglycoprotein.
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA-rhamnosy lée This neoglycoprotein called BSA-rhamnosy lée is obtained as follows by taking inspiration from the method described by MacBroon et al. in Methods in Enzymology, (1972) 28 212-222.
  • Example 1 in 2 ml of a 0.15 M aqueous NaCl solution and 300 g of BSA are added. The pH is adjusted to 9.0 with NaOH (1 N). After 6 h with stirring at room temperature, the reaction mixture is dialyzed for 16 h at 4 ° C. against 2 l of 0.15 M NaCl pH 7.0. The BSA-rhamnosy is further purified by passage through a Sephadex G25 column (10 ml of presaturated BSA gel, on a 0.5 x 20 cm column).
  • p-aminophenyl-6-phospho- ⁇ -D-galactopyranoside is prepared, from commercial p-nitrophenyl- ⁇ - -galactoside, according to the process described by GN SAIMDO and EM KARSON in Biochemistry (1980) vol. 19 No. 16 pages 3850-3855, by phosphorylation using phosphoryl chloride, followed by hydrogenation.
  • PPITC-6-phospho ⁇ - -galactopyranoside (PPITC-G) is prepared according to the method of the example
  • bovine serum albumin (BSA) are incubated in the presence of 62 mg of PPITC-G, prepared in the preceding step, operating as in Example 6.
  • BSA is thus coupled coupled with about twenty 6-phospho- ⁇ - -galactoside residues.
  • Example 1 we proceed to Example 1, except that we use instead of DPPE-Rha, a molecule of natural origin already carrying a glucosyl residue, consisting of the sericoside extracted from the roots of Terminalia sericea available for example from Inverni Délia Beffa.
  • DPPE-Rha a molecule of natural origin already carrying a glucosyl residue, consisting of the sericoside extracted from the roots of Terminalia sericea available for example from Inverni Délia Beffa.
  • the specificity of the products according to the invention carrying osidic ligands with respect to the keratinocyte membrane could be determined thanks to the use fluorescent neoglycoproteins synthesized by the inventors whose endocytosis can be observed by various techniques. It should be observed that endocytosis is all the more important as the binding is specific at the level of the cell membrane, so that the observation of endocytosis indirectly measures the specificity of the binding of the products according to the invention. These various techniques include:
  • F26 normal human fibroblasts
  • HSC human tumor keratinocytes
  • the culture media come from EUROBIO and are as follows:
  • MEM basic Eagle medium
  • DMEM Dulbécco
  • the culture conditions are as follows:
  • the keratinocytes are cultured on glass slides which serve as a support.
  • the culture is carried out in Petri dishes diameter 60 mm
  • Fluorescence microscopy allows the study of cells in situ. It is possible to locate the parts of the cell where the fluorescent compounds preferentially attach.
  • the substances tested are neoglycoproteins synthesized from BSA by reaction with a glycosido-p-phenylisothiocyanate, according to Example 6 or, where appropriate, Example 7 when a phosphate sugar is desired. Then, these neoglyco-proteins are made fluorescent by reacting them with fluorescein p-phenylisothiocyanate.
  • a Zeiss ® microscope equipped with "epifluorescence".
  • the excitation is done by a light of wavelength selected by a filter.
  • a second filter lets in the light emitted only for wavelengths between 520 and 560 mm.
  • Cells grown on coverslips are labeled with a neoglycoprotein as follows.
  • the medium is replaced in the keratinocyte culture dishes by a solution of neoglycoprotein in a PBS buffer at a concentration of 1 mg / ml. It is left to incubate for 2 hours at 32oC.
  • PBS buffer at 4oC
  • paraformaldehyde The same is done with fluorescent BSA as a control substance.
  • the plasma membrane is permeabilized using a detergent, such as Nonidet P40 ® available from SIGMA. This permeabilization makes it easier to access internal membranes to fluorescent products, which makes it possible to highlight sugar receptors inside the cell.
  • a detergent such as Nonidet P40 ® available from SIGMA.
  • V mb vesicles at the level of the membranes
  • V c vesicles in the cytoplasm
  • the cells cultured in 60 mm diameter petri dishes having reached confluence are brought into contact with the products according to the invention comprising at least one osidic ligand.
  • these products according to the invention carrying osidic ligands are incorporated into the lipid phase of the liposomes and are found on the surface of the liposomes with the ligandsosides freely accessible from the outside.
  • the potassium salt of 5- (6) -carboxyfluorescein [5- (6) -CF] is used.
  • the endocytosis of the different types of liposomes is compared by measuring the 5- (6) -CF incorporated in each cell.
  • composition DPPC / DCP / chol
  • Composition SER. / DPPC / DCP / choL
  • Each liposomal suspension purified on a column is diluted 1/2 in culture medium.
  • the blank is produced with culture medium. .
  • the Petri dishes are placed in an oven (37 ° C) for 1 h 30 min.
  • the dishes are rinsed twice with 5 ml of buffer
  • the cells are detached from the plastic support for fibroblasts: 0.25% trypsin
  • keratinocytes 0.25% trypsin + 0.02% EDTA. The cells are recovered and centrifuged at 1,500 rpm
  • the suspension is filtered on a blanket cloth (pore diameter: 60 ⁇ m) to remove the aggregates.
  • the measurements are carried out using a flow cytofluorimeter (EPICS Profile Coultronics) using an excitation wavelength ⁇ ex of 488 nm. Emission wavelengths
  • cell size f (cell density makes it possible to define the cell population (A)).
  • the liposomes exhibiting rhamnose referenced PE-Rha are endocyted more quickly than the liposomes having glucose of the sericoside molecule referenced SER.
  • the endocytosis of the liposomes containing the asiaticoside referenced C.A. is more important than that of PE-Rha.
  • the fibroblasts are cultured as previously described.
  • keratinocytes better endocytize liposomes having in their membrane composition molecules comprising a rhamnose, galactose or galactose-6-phosphate ligand. Furthermore, we observe that the ⁇ - -rhamnose and ⁇ - -galactose-6-phosphate have a
  • fibroblasts are indifferent to these molecules as well as to the structure of the glucose carried by the sericoside. It must therefore be concluded that products according to the invention comprising at least one osidic residue consisting of rhamnose, galactose or galactose-6-phosphate and more particularly ⁇ -L-rhamnose and ⁇ -D-galactose -6-phosphate can be attached
  • the cream is obtained by mixing an emulsion and a gelled suspension of liposomes of the following compositions: emulsion:
  • a gelled suspension of liposomes is prepared as follows.
  • the liposomes are prepared as indicated in Example 1.
  • the constituents of the lipid phase (DPPC, chol, DPC, DPPE-rhamnose) are dissolved in a chloroform-methanol 7: 1 mixture.
  • the organic solution thus obtained is evaporated under reduced pressure, then the lipid residue is taken up in 49 g of an aqueous solution containing the substances to be encapsulated (elastin polypeptides, and calf thymus hydrolyzate prepared, for example according to the process described in document FR-A1-2 594 847).
  • an aqueous solution containing the substances to be encapsulated elastin polypeptides, and calf thymus hydrolyzate prepared, for example according to the process described in document FR-A1-2 594 847.
  • This cream is applied daily to the skin of the face and neck.
  • a lipid powder is prepared according to Example 3 by spraying a solution into an 8: 2 dichloromethane-methanol mixture containing the lipid or hydrophobic constituents (DPPC, chol, DCP, C.A.) and 0.5 g of theophylline.
  • This powder is then dispersed in 50 ml of a solution containing 0.5 g of theophylline, by stirring, followed by homogenization with ultrasound, according to the method known to those skilled in the art.
  • the lotion thus obtained can be used in local applications for the treatment of psoriasis, twice a day, until the lesions disappear.
  • Example 11 The procedure is as in Example 11, except that the lipid powder does not contain theophylline.
  • This powder is dispersed in 50 ml of an aqueous solution containing 5 g of placental extract and 0.1 g of sodium pantothenate, then gelled with the sufficient amount of stabilized carbomer gel to obtain a final weight of 100 g of lotion .
  • this lotion improves the health of the hair bulb and stimulates hair growth.

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Abstract

L'invention concerne des produits destinés à se fixer spécifiquement sur la membrane d'un kératinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur. Ces produits sont porteurs d'au moins un ligand constitué par un résidu osidique choisi parmi l'alpha-L-rhamnose, l'alpha-D-galactose et l'alpha-D-galactose-6-phosphate. Grâce à cette spécificité, il est possible de préparer des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques présentant notamment une efficacité améliorée, par exemple pour régénérer l'épiderme, pour traiter le psoriasis, pour la repousse de cheveux.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE COMPOSE LIGAND-RECEPTEUR La présente invention concerne essentiellement un procédé pour fixer un produit sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, procédé de préparation d'un tel produit, produit obtenu, composition cosmétique ou pharmaceutique le contenant et son procédé de préparation.
On sait depuis longtemps qu'il existe des processus de reconnaissance des cellules, par exemple vis-à-vis d'autres cellules ou de substances telles que des protéines. Ces processus agissent par le biais d'une réaction entre un ligand et un récepteur présent à la surface des cellules.
On connaît par exemple la reconnaissance d'antigènes de surface par des anticorps monoclonaux, ce phénomène étant mis à profit dans des applications thérapeutiques ou diagnostiques. On peut citer par exemple le document FR-A1-2 606 034 qui décrit des anticorps capables de reconnaître une nouvelle protéine de surface, et qui peuvent être utilisés notamment comme réactifs dans les techniques basées sur la réaction antigène-anticorps.
On connaît également des processus de reconnaissance impliquant des sucres. Ceux-ci sont reconnus de manière spécifique par des récepteurs membranai res. Toutefois, les sucres reconnus ne sont pas les mêmes d'un type de cellule à un autre. On sait par exemple que les hépatocytes de rat reconnaissent spécifiquement le galactose (Ashwell G. et Morell A.G., Advan. Enzymol. (1974) 41, 99-128) alors que les fibroblastes humains reconnaissent le mannose-6-phosphate.
A partir de ces connaissances acquises, on a cherché à mettre au point des systèmes de délivrance ciblée de médicaments permettant d'atteindre dans l'organisme les sites sur lesquels on souhaite agir. On a utilisé en particulier pour cela des liposomes.
Depuis leur découverte par BANGHAM (J. Mol. Biol., 13, 238- 252, (1965), les liposomes ont été utilisés comme vecteurs de principe actif médicamenteux ou autres (voir par exemple FR-A-2 221 122 ou FR-A-2 415 460 ou FR-A-2 540 381).
Le document FR-A-2 609 397 concerne l'utilisation d'une substance ou composition de nature glucidique comme principe actif d'une composition dermatologique, ou cosmétologique, ou pharmaceutique, ou stimulante cellulaire, dans le but de renforcer le potentiel bioénergétique cellulaire ou tissulaire (voir revendication 1) ou pour améliorer le confort cutané, grâce à leur effet hydratant, adoucissant, assouplissant (page 3, ligne 33 à page 4, ligne 10 ; où il est même indiqué une action anti-inflammatoire).
Ce document concerne donc un enseignement général qui n'est pas relatif au problème particulier des kératinocytes.
Le document PCT/W0 87/05300 BIOCOMPATIBLES LTD est relatif à un procédé pour préserver un matériau ayant une structure dépendante de l'eau, comprenant la mise en contact du matériau avec une solution aqueuse d'un composé polyhydroxy et ensuite l'enlèvement de l'eau de ce matériau, ceci dans le but de permettre une conservation à long terme de matériaux biologiques comme l'hémoglobine, des erythrocytes, des liposomes et des cellules (voir page 1, lignes 1 à 4).
Ce document concerne l e prob lème du sé chage de protéines à partir de solutions aqueuses contenant des saccharides pour éviter des dégradations chimiques et physiques (voir page 3, 2ème paragraphe complet).
Il a été proposé plus récemment de donner une spécificité aux liposomes (voir BARBET J. et al. dans "Monoclonal Antibody covalently coupled to liposomes : Spécifie Targeting to Cells" dans J. SupramoL. Struct. Cell. Biochem. ; 16, 243-258, (1981) ainsi que LESERMAN L.D. et al "Targeting to Cells of fluorescent Liposomes covalently coupled with Monoclonal Antibodies or protein A" dans Nature, 228, 602-604 (1980).
Par ailleurs, le document W0 88/00474 décrit une structure de membrane lipidique comprenant une vésicule lipidique encapsulant un médicament, et un ligand comportant un résidu spéci fique des récepteurs hépatobiliaires, afin d'aboutir à un pilotage de la structure vers les hépatocytes avec une efficacité exceptionnelle.
Le document EP-A-0 028 917 est relatif à des vésicules lipidiques portant des surfaces hydrocarbonées comme véhicules lymphatiquement ciblés dans des buts thérapeutiques et de diagnostic. Ce document ne concerne pas le ciblage des kératinocytes.
Le document EP-A-0 285 178 est relatif à des dérivés de mannobiose utiles comme un composant de modification des préparations pharmaceutiques, comme des liposomes, ayant une affinité spécifique pour les cellules de Kupffer du foie.
L'abrégé de la bande de données STN de KARLSRUHE, voL. 106, du 8 juin 1987, résumé 193579j, cite un article de TODA dans Journal of Investment Dermatology, 88(4), 412-417, qui traite de la culture de kératinocytes humains, fraîchement isolés, sur des substrats liés à un ligand différent, incluant de la fibronectine, du collagène ou une membrane de structure.
Ce document va dans une direction totalement différente de celle qui est l'objet de l'invention.
En effet, ce document préconise une culture spécifique des kératinocytes pour les activer en vue d'activer leur capacité à se multiplier sur tous les substrats revêtus de ligands.
Cet article démontre que l'invention décrite ci-après n'était nullement évidente à l'homme de l'art.
Enfin, la demande de brevet PCT/W0 86/05789 BIOCARB concerne également des dérivés hydrocarbonés dans le cadre d'un ciblage spécifique dans un but thérapeutique ou de diagnostic, ce ciblage étant réalisé sur des molécules d'organes différents de mammifères incluant l'homme (voir page 1, lignes 4 à 8).
Il apparaît des buts indiqués à la page 2 que l'invention décrite dans ce document concerne ia détection de bactéries pathogènes par des récepteurs particuliers.
Ceci ne concerne donc pas du tout le problème du ciblage des kératinocytes, objet de i'invention décrite ci-après.
En ce qui concerne la peau, on constate qu'il y a un intérêt évident à ce que les produits dermatologiques et surtout cosmétiques, appliqués localement, se fixent préférentiellement et spécifiquement dans l'épiderme. La fixation sur les récepteurs membranaires des kératinocytes, qui sont les cellules essentielles de l'épiderme, constitue une solution à ce problème.
Or Jusqu'à présent, on ne connaissait pas de récepteur de sucre à la surface des kératinocytes.
Selon la présente invention, on a découvert de manière totalement inattendue que l'on pouvait fixer un produit sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur lorsque l'on utilise un produit porteur d'au moins un ligand constitué par le résidu osidique choisi parmi le rhamnose, le galactose et le galactose-6-phosphate. On a en effet découvert, de manière inattendue, que le rhamnose, le galactose et le galactose- 6-phosphate sont des ligands spécifiques des sites récepteurs de la membrane des kératinocytes. On a en outre observé que l'α-
Figure imgf000006_0003
rhamnose et l'α- -galactose-6-phosphate présentent une spécificité
Figure imgf000006_0002
nettement plus importante que l'α- -galactose, et sont de ce fait
Figure imgf000006_0001
préférés par rapport à ce dernier. En outre, il a été également mis en évidence que le produit porteur de ce sucre formant ligand spécifique des récepteurs de la membrane des kératinocytes pouvait se présenter sous diverses formes. Il peut s'agir par exemple d'une particule submicroscopique, telle qu'un liposome ou une nanoparti cule polymérique ou encore une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthétique, telle qu'une protéine. En outre, le sucre formant ligand peut être couplé de diverses manières à la surface de ce produit. Il peut être couplé avantageusement par une liaison chimique covalente, de préférence par l'intermédiaire d'un bras espaceur.
Ainsi, la présente invention a pour objet de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de fixer spécifiquement un produit sur la membrane des kératinocytes au moyen d'un liaison ligand-récepteur, le cas échéant au détriment d'autres catégories de cellules environnant les kératinocytes.
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique ci-dessus selon un procédé extrêmement simple, rapide, pratique et fiable. La présente invention a encore pour but de résoudre ce nouveau problème technique en fournissant un procédé de sélection d'un produit susceptible de se fixer spécifiquement sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligandrécepteur qui soit particulièrement simple, rapide, pratique et fiable.
La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique précité en fournissant un procédé de préparation d'un tel produit susceptible de se fixer spécifiquement sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligandrécepteur qui soit aussi simple, rapide, pratique et fiable. La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique précité en fournissant un produit susceptible de se fixer spécifiquement sur la memorane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur qui se présente sous une forme particulièrement aisée à manipuler, qui soit fiable et puisse être utilisé rapidement sans nécessiter d'étapes particulières. La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique précité en fournissant une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique et son procédé de préparation, incorporant un tel produit spécifique qui présente tous les avantages techniques déterminants précités relatifs à la fiabilité de la fixation spécifique sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur selon une méthode rapide, pratique.
La présente invention résout le problème techniαue précité en fournissant les solutions précitées d'une manière extrêmement simple, utilisable à l'échelle industrielle.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un procédé pour fixer un produit sur la memorane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce que l'on utilise un produit constitué d'une structure de base couplée à au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranai res, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose et le galactose-6- phosphate, et de préférence parmi l'α- -rhamnose et l'α- -galac
Figure imgf000008_0004
Figure imgf000008_0003
tose-6-pnosphate. Il est à noter αue l'invention inclut toutes les formes isomères du rhamnose et du galactose.
Selon une caractéristique avantageuse, le ligand est couplé à la surface de ladite structure de base par une liaison chimique covalente.
Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, le ligand est couplé à la surface de la structure de base précitée par l'intermédiaire d'un bras espaceur tel que le résidu d'un réactif hétérobifonctionnel ou un groupe de plusieurs sucres, tel que le groupe (1-4)-o-β-
Figure imgf000008_0001
D-glucopyranosyl-(1- 6)-o-β-D-glucopyranosyle. De tels bras espaceurs sont bien connus
Figure imgf000008_0002
à l'homme de l'art qui pourra se reporter par exemple à l'article de J.S. Slama et R.R. Rando dans Biochemistry, 1980, 19, 4595-4600.
Selon une autre caractéristique particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, le produit précité est une particule submicroscopique telle qu'un liposome ou une nano- particule polymérique. Selon encore une autre caractéristique particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, le produit précité est une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthétique, telle que
- un asiaticoside, contenant l'α-
Figure imgf000009_0005
-rhamnose extraite en particulier de la plante Centella asiatica, disponible par exemple chez Inverni Délia Beffa,
- un digalactosyldiglycéride, obtenu notamment à partir d'un extrait de farine de blé, disponible par exemple chez Sigma, - une néoglycoprotéine obtenue par exemple en combinant une albumine de sérum (SA) par exemple bovin ou humain à un sucre précité.
Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, le produit précité est ou contient une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau.
Selon un deuxième aspect, la présente invention fournit aussi un procédé pour sélectionner un produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand- récepteur, caractérisé en ce que l'on choisit, parmi un ensemble de produits, ceux constitués d'une structure de base couplée à au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose ou le ga lactose-6-phosphate, de préférence l'α- rhamnose et l'α -galactose-6-phosphate.
Figure imgf000009_0003
Figure imgf000009_0004
Selon un troisième aspect, la présente invention fournit encore un procédé de préparation d'un produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand- réceoteur, caractérisé en ce que l'on couple à une structure de base correspondante un au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranai res, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose et le galactose-6-phosphate, de préférence l' α-L-rhamnose et l'α-D-galac
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000009_0001
tose-6-phosphate.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, le ligand précité est couplé à la structure de base par une liaison chimique covalente. le couplage peut être réalisé conformément à la méthode générale décrite par Mac Broom dans Methods in Enzymology (1972) 28, 212-222 ou encore celle décrite par F.J. Martin et D. Papahadjoloupos dans The Journal of Biological Chemistry (1982), vol 257, n° 1, pages 286-288.
Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, le ligand précité est couplé à la structure de base par l'intermédiaire d'un bras espaceur tel que précédemment défini.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, la structure de base est une particule submicroscopique telle qu'un liposome ou une nanoparticule polymérique.
Selon encore une autre caractéristique du procédé selon l'invention, la structure de base précitée est une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthétique, telle qu'une protéine, par exemple une albumine de sérum.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, le produit précité est ou contient une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la oeau.
L'invention, selon un quatrième aspect, couvre aussi un produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce qu'il est obtenu selon l'un des procédés précédemment définis. l'invention couvre aussi les nouveaux produits susceptibles de se fixer sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce qu'ils comprennent au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranai res, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose et le galactose-6-phosphate et de préférence l'α- -rhamnose et l'α-
Figure imgf000010_0001
-galactose-6-phosphate, couplé à une structure de base, par exemple choisie parmi le groupe constitué par une particule submicroscopique telle qu'un liposome ou une nanoparticule polymérique ; une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthé tique, telle qu'une protéine, en particulier une albumine de sérum ; une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau. Selon une caractéristique avantageuse, ce couplage a lieu par l'intermédiaire d'un bras espaceur tel que le résidu d'un réactif hétérobifonctionnel ou un groupe de plusieurs sucres, tel que le groupe (1-4)-o-β- -glucopyranosyl-(1-
Figure imgf000011_0001
6)-o-β- -glucopyranosyle.
Figure imgf000011_0002
Selon un cinquième aspect, la présente invention fournit encore une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un produit tel qu'obtenu par le procédé précédemment décrit ou tel que précédemment défini.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la composition précitée est destinée à tout soin ou tout traitement intéressant les kératinocytes, par exemple l'amélioration de la régénération cutanée, le traitement du psoriasis ou la repousse des cheveux.
Enfin, l ' i nvent i on concerne encore un procédé de préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, caractérisée en ce que l'on associe à un excipient, véhicule ou support cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, au moins un produit tel qu'obtenu par l'un des procédés précédemment décrits, ou tel que précédemment définis. De même, l'invention couvre encore un procédé de soin ou de traitement intéressant les kératinocytes, en vue par exemple de la régénération cutanée, du traitement du psoriasis ou de la repousse des cheveux, caractérisé en ce qu'on applique le produit tel que précédemment obtenu par l'un des procédés précédemment décrits, ou tel que précédemment définis, en une quantité cosmétiquement ou thérapeutiquement efficace, avantageusement alors que celui-ci est associé à un véhicule, supoort ou excipient cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable.
On conçoit que, grâce à l'invention, on obtienne un ciblage cellulaire d'un produit que l'on peut ainsi concentrer spécifiquement au niveau des kératinocytes grâce à la présence d'au moins un ligand spécifique constitué par le résidu osidique choisi parmi le rhamnose, le galactose et le galactose-6-pnosphate, de préférence l'α-
Figure imgf000012_0002
-rhamnose et l'α- -galactose-6-phosphate.
Figure imgf000012_0001
Dans le cadre de la présente invention, le produit auouel est couplé le ligand spécifique constitué par le résidu osidique peut être quelconque.
On peut, par exemple, utiliser une protéine à laquelle on couple par voie de synthèse l'un des sucres précités.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le nombre de résidus osidiques tels que précédemment définis portés par la protéine est d'au moins vingt environ.
On peut également utiliser comme produit de base une particule submicroscopique telle qu'une vésicule lipidique pouvant se présenter sous forme de liposome.
Dans le cadre de la présente invention, le terme "lipidique" couvre toutes les substances comprenant une chaîne carbonée dite grasse, généralement supérieure à 5 atomes de carbone, cette substance étant habituellement dénommée "lipide".
Selon l'invention, on utilise à titre de lipide pour former le liposome précité, des lipides ampnioniles, c'est-à-dire constitués de molécules possédant un groupe hydrophile indifféremment ionique ou non ionique et un groupe lipophilε, ces lipides amphiphiles étant susceptibles de former des phases lamellaires lipidiques ou des liposomes en présence d'une phase aqueuse.
En particulier, on peut citer parmi ces lipides : les phospholipides, les phosphoaminolipides, les glycolipides. les alcools gras polyoxyéthylénés, les esters de polyols éventuellement polyoxyéthylénés. De telles substances sont par exemple constituées par une lécithine d'oeuf ou de soja, une phosphatidylsérine, une sphyngomyéline, un cérébroside ou un stéarate de polyglycérol oxyéthyléné.
Selon une caractéristique avantageuse de la présente invention, en ce qui concerne les liposomes, la proportion, en pourcent age mo la i re des dé r i vé s g lyc os i di ques se l on l ' i nvention par rapport à l'ensemble des molécules lipidiques formant la bi couche du l i posome e st d ' a u moi ns 1 0%, et de p réfé rence d'au moins 15 % par rapport à l'ensemble dés lipides amphiphiles du liposome.
Il est également préféré selon l'invention que les liposomes soient formulés de manière à présenter une forte microviscosite. Ceci peut par exemple ête obtenu en utilisant des lipides amphiphiles dont la température de transition est supérieure à environ 37ºC et de préférence 41ºC, notamment les phospholipides ou acides gras saturés, par exemple la dipalmitoyle phosphatidylcholine.
On remarquera également qu'en raison de l'hydrophilie des résidus osidiques, ceux-ci se répartissent à l'extérieur de la bicouche lipidique des liposomes et sont orientés les uns vers l'intérieur, les autres vers l'extérieur du liposome. Il a d'ailleurs été observé que plus les liposomes sont de petite taille, plus le nombre de résidus osidiques orientés vers l'extérieur est important. Ainsi, il s'en trouve un nombre suffisant pour être facilement accessibles aux récepteurs des kératinocytes. On comprendra que cette accessibilité est encore meilleure lorsque les résidus osidiques sont placés à l'extrémité d'un bras espaceur.
On peut également utiliser selon l'invention comme produit de base une nanoparticule polymérique, géné ra lement de di mens i on i nfé ri eu re au mi c romèt re , de préfé rence des nanoparticules polymériques comportant des groupes NH2, des fonctions alcools ou ou des fonctions thiols permettant un couplage aisé avec le résidu osidique selon l'invention. On choisit de préférence des nanoparti cules biodégradables, telles que polylactates, bien connues à l'homme de l'art. De telles particules particulières comportant des groupes NH2 sont disponibles dans le commerce, par exemple chez Interfacial Dynamics Corporation (Portland, Oregon-USA).
Selon une caractéristique avantageuse de la présente invention, les résidus osidiques couplés à la surface desdites nanoparti cules polymériques sont choisis parmi les résidus de α-D-
Figure imgf000013_0001
galactose, α-
Figure imgf000013_0002
L-rhamnose et α-D-galactose-6-phosphate. On peut utiliser avantageusement pour encapsuler les substances actives, des nanoparticules poreuses.
Suivant un mode avantageux de réalisation de l'invention, les produits de base, tels que les liposomes ou les nanoparticules précités, contiennent une ou plusieurs substances d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau, par exemple des peptides obtenues par hydrolyse de protéines, des modulateurs d'activité enzymatique, par exemple une xanthine telle que la théophylline.
Le produit de base utilisable selon l'invention peut également être la substance active elle-même d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre à l'aide de plusieurs exemples de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples tous les pourcentages sont donnés en poids sauf indication contraire.
Exemple 1 selon l'invention
Préparation de liposomes porteurs de résidus rhamnosylés A. Couplage de l'α-L-rhamnose sur un phospholipide
Le couplage entre une molécule de dipalmitoylphosphatidyle éthanolamine (DPPE) et une molécule d'α- -rhamnose (Rha) est
Figure imgf000014_0006
réalisé par réaction du p-phénylisothiocyanate-α-
Figure imgf000014_0005
-rhamnopyranoside (PPITC-α- -rhamnopyranoside) sur la fonction aminé de la DPPE.
Figure imgf000014_0003
Le PPITC-α- -rhamnopyranoside est préparé à partir du p-
Figure imgf000014_0004
aminophényl-α- -rhamnoside, par réaction avec le thiophosgène,
Figure imgf000014_0002
selon le procédé décrit par C.R. McBroom et al. dans Methods in Enzymology (1972) 28 212-222.
La DPPE du commerce est dissoute mole à mole avec le PPITC-α- -rhamnopyranoside à 50ºC dans un mélange constitué d'un
Figure imgf000014_0001
tampon bicarbonate (0,1 M, pH 9,5) et d'éthanol. La température est maintenue à 50ºC pendant 3 h, sous agitation. Le milieu réactionnel est ensuite refroidi à 4ºC environ, et on centrifuge.
Le solide obtenu, après lavage à l'eau distillée, est lyophilisé. On obtient ainsi une DPPE rhamnosylée (DPPE-Rha).
B. Préparation des liposomes
On pèse :
- Dipalmitoylphosphadityl Choline (DPPC)............................ 48,6 mg - Cholestérol (chol)...............................................................25,6 mg
- Dicétylphosphate (DCP)...........................................................9,1 mg
- Produit selon l'invention = DPPE-Rha................................16,7 mg
Après avoir mélangé les composés précités dans un ballon à fond plat, par exemple de 100 ml, on les solubilise avec un mélange chloroforme-méthanol 7/1, conformément à la méthode du ballon rotatif décrite par Bangham dans J. Mol. Biol., 13, 238-252, (1965). On évapore ensuite les solvants à 55ºC sous pression réduite. On peut éliminer les traces des solvants par un courant d'azote sur le film "gras" formé sur la paroi du ballon.
On ajoute ensuite 10 ml de la solution aqueuse à encapsuler dans les liposomes formés à partir de la phase lipidique précitée. Cette solution aqueuse peut par exemple contenir un marqueur fluorescent constitué par exemple le sel potassique de 5- (6)-carboxyfluoresceine à raison de 8 g pour 40 ml d'eau distillée.
Comme marqueur fluorescent, on peut également utiliser de manière équivalente la calcéine bleue.
Après avoir ajouté 10 ml de la solution aqueuse à encapsuler ci-dessus, on place sous agitation magnétique de 15 à 24 h à l'abri de la lumière.
On observe au microscope optique la formation de grosses vésicules lipidiques.
On récupère le contenu du ballon dans un récipient de 30 ml refroidi dans la glace fondante.
De préférence, on soumet la suspension à sonication trois fois à 2 min à 4ºC à une puissance de 200 W, ce qui permet de former des liposomes de taille sensiblement homogène, de dimension submicroscopique.
On peut conserver la suspension liposomale ainsi obtenue à 4°C.
Selon un mode de réalisation préféré, on réalise une purification des liposomes en les séparant de la phase aqueuse non encapsulée par une filtratîon sur gel, comme cela est bien connu selon le protocole classique de purification des liposomes.
Exemple 2 selon l'invention
Préparation de liposomes porteurs de résidus rhamnosylés par l'intermédiaire de bras espaceurs
A. Préparation du rhamnose porteur d'un bras espaceur
On prépare, comme indiqué ci-dessous, un "sucre activé" de de formule (I) constitué d'un résidu α-
Figure imgf000016_0002
-rhamnopyranosyle, dont le groupe OH situé sur le premier carbone est substitué par une chaîne linéaire terminée par un groupe SH.
Figure imgf000016_0001
Pour ce faire, on procède aux étapes successives suivantes :
* Synthèse du 2,3,4-tri-o-acétyl-α-
Figure imgf000016_0004
-bromorhamnopyranoside (2)
Le dérivé (2) est obtenu selon KEMPEN H.J.M. et al.,
J.Med.Chem. (1984) 27 1306-1312, par action du bromure de phosphore PBr3 (7 eq.) et de l'eau (50 eq) sur l'α-L-rhamnose-1,2,
Figure imgf000016_0003
3,4-tétra-o-acétylé (1), dans l'anhydride acétique sous agitation à 0ºC. Le produit (2) est recristal lise dans un mélange diisopropyléther/hexane. * Synthèse du bromhydrate de 2-S-(2,3,4-tri-o-acétyl-α- -rhamnopy-
Figure imgf000017_0001
ranosyl)-2-thiopseudourée (3).
Le dérivé (3) est obtenu selon CHIPOWSKY S. et al.,
Carbohyd. Res. (1973) 31 339-346 en chauffant sous reflux et sous argon pendant 3 h, un mélange du dérivé (2) et de thiourée en proportion équimoléculaire dans l'acétone anhydre. Le produit (3) est recristallisé dans l'isopropanol.
* Synthèse du 1-(2-carboxyéthyl)thio-2,3,4-tri-o-acétyl-α- -rhamno
Figure imgf000017_0002
pyranoside (4).
Le produit (4) est obtenu par réaction équimoléculai re entre le dérivé (3) et l'acide 3-iodopropionique en solution dans un mélange eau/acétone 1:1 en présence de 1,15 eq. de Na2CO3 et de 2 eq. de Na2S2O5. La réaction est suivie par CCM (solvant AcOEt/ AcOH/H2O 8:2:1).
* Synthèse du 1-(2-carboxyéthyl)thio-α-y-rhamnopyranoside de (5).
Le dérivé (5) est obtenu par désacylation de (4) en présence de 4 eq. de triéthylamine et de 3 eq. d'eau dans du méthanoL. La réaction est suivie par CCM (solvant AcOEt/AcOH/H2O 8:2:1) ; elle est complète au bout de 6 jours. Le produit de désacétylation est isolé du milieu réactionnel par passage sur colonne Dowex 1x2 (HCOO-).
* Synthèse du chlorhydrate du 1-(2-(3-amino-2-hydroxy-propylamino- carbonyl)-éthyl)thio-α-
Figure imgf000017_0003
-rhamnopyranoside (6).
0,5 g de (5) (1,8 mmole) et 0,8 g de 1 ,3-diaminopropanol- 2 (9 mmoles) sont dissous dans 20 ml d'eau. Le pH de la solution est ajusté à 5,5 (HCl) et on ajoute alors 1,1 g de 1-éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (5,4 mmoles). On laisse réagir 24 h sous ag i t at i on à température ambiante. Le produit (6) est isolé du milieu réactionnel par passage sur Dowex 50x2 (Na+) (éluants : HCl 0,33 N pour décrocher les monoamines et HCl 2 N pour décrocher les diamines). Finalement, on obtient le produit (6).
* Synthèse de l'amide entre le composé (6) et l'acide acétyl-S- thioglycolique (7).
Le produit (7) est obtenu par réaction équimoléculaire entre le dérivé (6) et le succinimidyl-S-acétylthioacétate (SATA, synthèse selon Ducan et al. Anal. Biochem. (1983) 132 68-73) en présence de triéthylamine (1 eq) dans le diméthyIformamide anhydre.
Le produit (7), obtenu est utilisé dans la suite des opérations sans purification particulière.
* Déprotection de la fonction thiol du composé (7) : synthèse du dérivé de formule (I)
Sur le produit (7) (1 eq.) on génère sous argon une fonction thiol à l'aide d'un fort excès d'hydroxylamine (50 eq.), dans une solution aqueuse 0,15 M en EDTA, pH = 7,5. La réaction est suivie par dosage spectrophotométrique des thiols en utilisant le réactif d'Ellman selon la méthode de P.W. RIDDLES et al., Anal.
Biochem. (1978) 94 75-81. Elle est complète au bout de 1 h. Le produit de formule (I) obtenu est utilisé rapidement pour le greffage sur les liposomes. B. Préparation de liposomes porteurs de groupes rnaléimide-
Ces liposomes sont préparés selon une méthode classique, par exemple comme dans l'exemple 1. La composition de la phase lipidique est un mélange en proportion molaire 10:2:7 des composés suivants :
- di pa lmi toy Iphospnat i dy Icho l i ne (DPPC)
- N -[4-(p-ma léi mi dophény l) buty ry l]-di pa lmi toy Iphosphadi dy lét hano l- ami ne (MPB-DPPE )
- cho lestéro l (cho l) .
Le MPB-DPPE est un phosoholipide porteur d'un groupe maléimide, préparé selon le procédé décrit par Martin F.J. et
Papahadjopoulos D., J. Biol. Chem. (1982) 257 286-288, par réaction de la dipalmitoylphosphadidyléthanolamine sur le succinimidyl-4-(p- maléimidophényl)butyrate (SMPB).
C. Préparation de liposomes rhamnosylés.
On procède selon la méthode décrite par Martin F.J. et Papahadjopoulos D. (référence citée ci-dessus). Ainsi, 6 μmoles du composé de formule (I) préparé à l'étape A sont introduites dans 0,67 ml de suspension aqueuse de liposomes préparés à l'étape B, tamponnée à pH 6,5.
Le mélange est placé sous atmosphère d'argon, sous agitation douce pendant 12 h à température ordinaire.
La fonction thiol du composé de formule (I) se fixe alors par réaction d'addition sur la double liaison du groupe maléimide.
On obtient ainsi des liposomes comportant en surface des résidus rhamnosylés situés à l'extrémité d'une chaîne d'atomes (bras espaceur) correspondant à la chaîne du composé de formule (I).
Exemple 3 selon l'invention
Préparation de liposomes porteurs de résidus rhamnosylés par l'intermédiaire de bras espaceurs
La composition de la phase lipidique est un mélange en proportion molaire 4:4:1:1 des composés suivants :
- Dipalmitoylphosphadidylcholine (DPPC)
- Cholestérol (chol)
- Dicétylphosphate (DCP)
- Asiaticoside (C.A.)
L'asiati coside est extrait de la plante Centella asiatica, disponible par exemple chez Inverni délia Beffa, de formule L-asiatate de [(0-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-o-β-D-glucopyranosyl-(1-6)]-
Figure imgf000019_0001
o-β-D-glucopyranose (PM = 959 g).
Figure imgf000019_0002
Les constituants de la phase lipidique ci-dessus sont dissous à la concentration de 10 % environ dans un mélange 80:20 en volume de di chlorométhane et de méthanol.
La solution organique est atomisée à 60ºC environ selon le procédé décrit dans le document EP-B1-0087993 pour obtenir une poudre.
Cette poudre est ensuite dispersée par agitation dans la solution aqueuse à encapsuler, à raison de 1 partie de poudre pour
100 parties de solution aqueuse. Cette solution peut par exemple contenir un marqueur fluorescent tel que la 5-(6) carboxyfluorescéine, comme dans l'exemple 1.
Il se forme ainsi une suspension de liposomes qui est de préférence homogénéisée, par exemple au moyen d'un homogénéiseur sous pression comme décrit dans le document EP-B1-0107559.
On obtient ainsi une suspension de liposomes comportant en surface des résidus rhamnosylés, reliés à la bicouche par des bras espaceurs constitués du résidu (1-4)-o-β- -glucopyranosyl-(1-
Figure imgf000020_0001
6)-o-β- -glucopyranosyle.
Figure imgf000020_0002
Exemple 4 selon l'invention
Préparation de liposomes porteurs en surface de
résidus qalactosylés
On procède comme à l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise le digalactosyldiglycéride, extrait de farine de blé, disponible par exemple chez Sigma et comportant à l'extrémité de la molécule deux résidus galactosy lés, à la place du produit selon l'invention utilisé à l'exemple 1. Exemple 5 selon l'invention
Préparation de nanoparticules fluorescentes comportant en surface des résidus rhamnosylés
On peut se procurer dans le commerce des nanoparticules sous forme de billes de diamètre moyen de 0,5 μm environ constituées principalement de polystyrène, et possédant en surface des groupes NH3 +. De telles nanoparticules sont disponibles par exemple chez Interfacial Dynamics Corporation (I.D.C., Portland, Oregcn, USA).
Il est donc possible, en opérant selon l'étape A de l'exemple 1, de couoler des résidus rhamnosylés sur ces nanoparticules.
Pour cela, on fait réagir, dans 5 ml de tampon bicarbonate à pH 9,5, 0,6 g de ces billes avec 9 μmoles de α-L-rhamnopy-
Figure imgf000020_0003
ranosioe phénylisothiocyanate sous agitation douce, pendant 5 h à 4°C. Les billes sont ensuite recueillies, puis rincées deux fois avec du tampon PBS.
On obtient ainsi des nanoparticules comportant en surface des résidus rhamnosylés.
Exemple 6 selon l'invention
Préparation d'une néoglycoprotéine portant des résidus rhamnosylés
On utilise dans le cas présent une protéine, par exemple de l'albumine de sérum bovin, BSA, à laquelle on couple une vingtaine d'unités de rhamnose en obtenant ainsi une néoglycoprotéine.
Cette néoglycoprotéine appelée BSA-rhamnosy lée est obtenue comme suit en s'inspirant de la méthode décrite par MacBroon et al. dans Methods in Enzymology, (1972) 28 212-222.
Pour ce faire, on dissout 250 mg (environ 1 mmole) de
PPITC-α -rhamnopyranoside préparé selon les indications figurant à
Figure imgf000021_0001
l'exemple 1, dans 2 ml d'une solution aqueuse de NaCl 0,15 M et on ajoute 300 g de BSA. Le pH est ajusté à 9,0 par NaOH (1 N) . Après 6 h sous agitation à température ambiante, Le mélange réactionnel est dialyse pendant 16 h à 4°C contre 2 l de NaCl 0,15 M pH 7,0. La BSA-rhamnosy lée est encore purifiée par passage sur colonne Séphadex G25 (10 ml de gel présaturé en BSA, sur colonne de 0,5 x 20 cm). L'absence de toute contamination par des résidus de rhamnose libre est vérifiée en chromatographie sur couche mince où la BSA-rhamnosy lée ne migre pas alors que le réactif rhamnosylé présenterait un Rf de 0,32 (chloroforme-MeOH : 1/1). Le dosage des protéines associé au dosage des sucres permet de déterminer un taux de greffage de 10 à 30 résidus de rhamnose par molécule de BSA suivant la préparation considérée.
Exemple 7 selon l'invention
Préparation d'une néoglycoprotéine portant des résidus du galactose-6-phosphate
On prépare dans une première étape le p-aminophényl-6- phospho-α-D-galactopyranoside, à partir du p-nitrophényl-α- -galactoside du commerce, selon le procédé décrit par G.N. SAIMDO et E.M. KARSON dans Biochemistry (1980) vol. 19 n° 16 pages 3850-3855, par phosphorylation au moyen du chlorure de phosphoryle, suivie d'une hydrogénation.
Dans une deuxième étape, on prépare le PPITC-6-phosphoα- -galactopyranoside (PPITC-G) selon la méthode de l'exemple
Figure imgf000022_0002
1, par réaction du thiophosgène sur le composé préparé à la première étape.
Enfin, dans une troisième étape, on laisse incuber 10 mg d'albumine de sérum de boeuf (BSA) en présence de 62 mg de PPITC-G, préparés à l'étape précédente, en opérant comme à l'exemple 6.
On obtient ainsi de la BSA couplée à environ une vingtaine de résidus 6-phospho-α- -galactoside.
Figure imgf000022_0001
Exemple 8 comparatif
Préparation de liposomes porteurs en surface de résidus glucosylés
Dans cet exemple, on procède à l'exemple 1, si ce n'est que l'on utilise à la place du DPPE-Rha, une molécule d'origine naturelle portant déjà un résidu glucosyle, constitué par le séricoside extrait des racines de Terminalia sericea disponible par exemple chez Inverni Délia Beffa.
Exemple 9
Détermination de la spécificité des produits selon l'invention vis-à-vis des membranes des kératinocytes La spécificité des produits selon l'invention porteurs de ligands osidiques vis-à-vis de la membrane des kératinocytes a pu être déterminée grâce à l'emploi de néoglycoprotéines fluorescentes synthétisées par les inventeurs dont on peut observer l'endocytose par diverses techniques. Il faut observer que l'endocytose est d'autant plus importante que la fixation est spécifique au niveau de la membrane cellulaire, de sorte que l'observation de l'endocytose mesure indirectement la spécificité de la fixation des produits selon l'invention. Ces diverses techniques comprennent :
a) microscopie de fluorescence, qui permet la visualisation cytochimique qualitative des dérivés fluorescents ; b) cytof luorimétrie des cellules mises en suspension qui permet, grâce à une analyse cellule par cellule, de préciser la répartition des molécules fluorescentes au sein de l'ensemble de la population cellulaire. En outre, cette technique ouvre la possibilité d'une analyse simultanée de divers paramètres (taille, forme cellulaire, double marquage à l'aide d'anticorps monoclonaux ou étude du cycle cellulaire à l'aide de marqueurs spécifiques de l'ADN ou de l'ARN).
Chacune de ces méthodes est détaillée ci-après après avoir exposé les cultures cellulaires utilisées.
On utilise comme cellules des fibroblastes humains normaux (F26), des kératinocytes humains tumoraux (HSC).
Les milieux de culture proviennent de chez EUROBIO et sont les suivants :
pour les fibroblastes :
le milieu de base de Eagle (MEM), bien connu à l'homme de l'art, pour les kératinocytes :
un milieu de Ham F12 additionné d'un milieu essentiel minimum de Eagle modifié par Dulbécco (DMEM), également bien connus à l'homme de l'art.
Ces milieux sont complémentés en sérum de veau foetal (10%) et en pénicilline-streptomycine (100 000 UI/l et 0,1 g/l), et en mycostatine (100 000 UI/l).
Les conditions de culture sont les suivantes :
* Pour l'étude par microscopie de fluorescence
Les kératinocytes sont cultivés sur des lamelles de ve rre qui servent de support.
Pour cela, on place une lamelle au fond de chaque puits d'une plaque de culture de 24 puits type Linbro (diamètre 14 mm).
Culture :
. 20 000 cellules/puits
. volume 200 ul/puits
. incubation : température 32ºC
humidité 96 %
taux de CO2 5 % . temps de culture : 5 jours pour aboutir à la confluence des cellules.
* Pour l ' étude en cytométrie en flux
La culture est réalisée en boîtes de Pétri diamètre 60 mm
(CORNING).
Culture :
. 200 000 cellules/boîte
. volume 2 ml/boîte
. incubation : température 37ºC
humidité 96 %
taux de CO2 5 %
. temps de cu l t ure : 7 à 1 2 jou rs pour about i r à l a confluence des cellules.
A. Microscopie de fluorescence
La microscopie de fluorescence permet l'étude des cellules in situ. Il est possible de localiser les parties de la cellule où se fixent préfèrentiellement les composés fluorescents.
Les substances testées sont des néoglycoprotéines synthétisées à partir de BSA par réaction avec un glycosido-p-phényliso- thiocyanate, selon l'exemple 6 ou, le cas échéant, l'exemple 7 lorsque l'on désire un sucre phosphaté. Ensuite, ces néoglyco- protéines sont rendues fluorescentes en les faisant réagir avec du p-phénylisothiocyanate de fluorescéine.
La détection de ces molécules se fera par analyse de fluorescence de la fluorescéine, sachant que celle-ci a une longueur d'onde maximale d'excitation λex = 490 mm et une longueur d'onde d'émission maximale à 517 mm.
Dans le cas présent, nous utilisons un microscope Zeiss® équipé en "épifluorescence". L'excitation se fait par une lumière de longueur d'onde sélectionnée par un filtre. De même, un second filtre ne laisse passer la lumière émise que pour des longueurs d'ondes comprises entre 520 et 560 mm. Les cellules cultivées sur lamelles sont marquées par une néoglycoprotéine de la manière suivante. On remplace dans les boîtes de culture de kératinocytes le milieu par une solution de néoglycoprotéine dans un tampon PBS à la concentration de 1 mg/ml. On laisse incuber pendant 2 h à 32ºC. On rince ensuite en culture par du tampon PBS à 4ºC, puis on fixe à l'aide de paraformaldéhyde. On procède de même avec de la BSA fluorescente comme substance témoin.
Sur un deuxième lot de boîtes, on réalise une incubation pendant 1 h 1/2 à 32ºC puis on ajouté de la Monensine à raison de 1 μg/ml dans le milieu et on poursuit l'incubation pendant 30 min, à 4ºC, le but de cette opération étant de réhausser le pH intracellulaire afin d'augmenter la sensibilité de la mesure fluorimétrique.
Sur un troisième lot de boîtes, après avoir réalisé l'incubation à 32ºC pendant 2 h, et la fixation au paraformaldéhyde, on perméabilise la membrane plasmique à l'aide d'un détergent, tel que le Nonidet P40 ® disponible chez SIGMA. Cette perméabilisation permet de faciliter l'accès des membranes internes aux produits fluorescents, ce qui permet de mettre en évidence des récepteurs de sucre à l'intérieur de la cellule.
L'observation permet de situer la fluorescence émise dans les différentes parties de la cellule : Vmb : vésicules au niveau des membranes
Vc : vésicules dans le cytoplasme
Mb : membrane externe
R : réseau dans le cytoplasme
N : noyau
PN : points autour du noyau
Les résultats de ces observations sont rassemblés au tableau 1 ci-après, pour des neoglycoproteines se différenciant les unes des autres par la nature des résidus osidiques qu'elles portent. Il apparaît très clairement que la fluorescence est intense, voire très intense, au niveau de la membrane cellulaire dans le cas du rhamnose, du galactose-6-phosphate, et, dans une nettement moindre mesure, du galactose.
Cette étude montre bien l'existence d'une affinité spécifique des récepteurs membranaires des kératinocytes pour les résidus rhamnose, galactose, galactose-6-phosphate, et plus particulièrement pour l'α-L-rhamnose et l'α- -galactose-6-phosphate.
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0001
B. Technique utilisant la cytofluorîmétrie en flux (CMF)
1. Principe
Les cellules cultivées en boîtes de Pétri de diamètre 60 mm ayant atteint la confluence sont mises en présence des produits selon l'invention comportant au moins un ligand osidique. Par exemple, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ces produits selon l'invention porteurs de ligands osidiques sont incorporés à la phase lipidique des liposomes et se retrouvent à la surface des liposomes avec lesligandsosidiques librement accessibles de l'extérieur.
Pour la mise en oeuvre de cette étude, il est nécessaire d'encapsuler dans les liposomes une substance fluorescente. De préférence, on utilise le sel potassique de la 5-(6)-carboxyfluorescéine [5-(6)-CF].
Selon cette technique, on compare l'endocytose des différents types de liposomes par mesure de la 5-(6)-CF incorporée dans chaque cellule.
Pour cette technique, il faut éviter d'utiliser une trop forte concentration en 5-(6)-CF qui pourrait induire une extinction de fluorescence.
2. Composition des liposomes préparés comme décrit à l'exemple 1 Liposome "nu" (sans sucre) T
Composition : DPPC / DCP / chol
: 5 / 1 / 4 en moles
Concentrations : 100 mg / 10 ml → 1 % Liposome PE-Rha (modèle rhamnose) (= exemple 1 de l'invention) Composition : PE-Rha / DPPC / DCP / choL
: 1 / 4 / 1 / 4 en moles Concentrations : 100 mg / 10 ml → 1 % Liposome asiaticoside (glucose-glucose-rhamnose) (= exemple 3 de l'invention) Composition : C.A. / DPPC / DCP / chol
1 / 4 / 1 / 4 en moles
Concentrations : 100 mg / 10 ml → 1 % Liposome séricoside (glucose) (= exemple 8 comparatif)
Composition : SER. / DPPC / DCP / choL
1 / 4 / 1 / 4 en moles
Concentrations : 100 mg / 10 ml → 1 % Le composé fluorescent encapsulé
5-(6) CF : 50 mM dans du PBS
3. Méthode
. Chaque suspension liposomale purifiée sur colonne est diluée au 1/2 dans du milieu de culture.
. On répartit dans chaque boîte (60 mm) 2 ml de suspension liposomale.
. Le blanc est réalisé avec du milieu de culture. . Les boîtes de Pétri sont placées à l'étuve (37°C) pendant 1 h 30 min.
. Les boîtes sont rincées deux fois avec 5 ml de tampon
PBS.
. Les cellules sont décrochées du support plastique pour les fibroblastes : trypsine 0,25 %
pour les kératinocytes : trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 % . Les cellules sont récupérées et centrifugées à 1 500 rpm
(centrifugeuse JOUAN E 96) à 4°C.
. Le surnageant est jeté, le culot cellulaire remis en suspension dans 50 μl d'iodure de propidium (I.P.) à
50 μg/ml final dans PBS (test viabilité).
. La suspension est filtrée sur toile à bluter (diamètre pores : 60 μm) pour éliminer les aggrégats.
. Les cellules sont ensuite gardées dans la glace jusqu'à l'analyse. 4. Mesures :
Les mesures sont réalisées à l'aide d'un cytofluorimètre en flux (EPICS Profile Coultronics) en utilisant une longueur d'onde d'excitation λex de 488 nm. Les longueurs d'onde d'émission
(λem) sont :
λ em (5-(6)CF) = 520 nm (vert)
λ em (I.P.) = 620 nm (rouge)
. Un premier histogramme biparamétrique, taille cellulaire = f (densité cellulaire permet de cerner la population cellulaire (A)).
. Cette population sera analysée en fluorescence rouge
(B). Seules les cellules non fluorescentes (vivantes) seront considérées pour l'analyse en fluorescence verte (C).
. L'analyse des cellules en fluorescence verte permettra d'apprécier l'incorporation des différents liposomes marqués à la 5-(6)CF (C).
(cf. figure 1).
(cf. figure 1 : LES DIFFERENTS HISTOGRAMMES permettant l'analyse de la population cellulaire par CM. F. selon le protocole proposé. A : granulosité = t (taille) → isolement de la population à analyser (fenêtre 1).
B : nombre de cellules = f (fluorescence rouge) → test de viabilité. L'analyse ne sera poursuivie que pour les cellules vivantes (fenêtre 2).
C : nombre de cellules = f (fluorescence verte) → analyse de la
5-(6) CF incorporée dans les cellules).
. La fluorescence intrinsèque des cellules (blanc) sera soustraite de chaque échantillon.
A la figure 2, on a représenté les histogrammes mono- paramétriques obtenus par cette technique de cytométrie en flux
(CM. F.) mettant en évidence l'internalisation du contenu des liposomes dans les kératinocytes (nombre de cellules = f (5-(6)CF) incorporée ; type cellulaire ; kératinocytes, nombre analysé 7000 cellules, après interaction avec différents liposomes encapsulant de la 5-(6)CF. incubation : 1 h 30).
On obtient le tableau 2 suivant :
Figure imgf000031_0001
On observe à partir du tableau 2 et de la figure 2 que les liposomes exposant du rhamnose référencés PE-Rha sont endocytés plus rapidement que les liposomes possédant du glucose de la molécule de séricoside référencés SER. D'autre part, l'endocytose des liposomes contenant l'asiaticoside référencés C.A., est plus importante que celle du PE-Rha.
On observe que la structure des molécules d'asiaticoside et de DPPE-Rha étant très différente, le seul point commun qui les rattache est la présence de rhamnose en bout de chaîne.
Ceci démontre que c'est ce sucre (ligand) qui est responsable de l'augmentation de l'incorporation par endocytose des lipo- somes dans les kératinocytes. On observera en outre que le liposome comportant à sa surface l'asiaticoside (C.A.) est endocyté plus rapidement sans doute grâce à la présence du bras espaceur glucosylglucose qui le rend plus accessible à son récepteur de la membrane des kératinocytes que le PE-Rha.
Relativement à l'incorporation de ces liposomes dans les fibroblastes : les fibroblastes sont cultivés comme précédemment décrit. On obtient les histogrammes monoparamétriques de la figure 3, (nombre de cellules = f (5-(6) CF ) incorporée ; type cellulaire: fibroplastes, nombre analysé : 5000 cellules , après interaction avec différents liposomes encapsulant de la 5-(6) CF. Incubation 1h 30) ainsi que le tableau 3 suivant :
Figure imgf000032_0006
On peut observer que vis-à-vis des fibroblastes, aucun liposome ne semble être endocyté plus facilement que le liposome témoin.
On peut conclure des analyses de fluorescence précédentes que les kératinocytes endocytent mieux les liposomes ayant dans leur composition membranaire des molécules comportant un ligand rhamnose, galactose ou galactose-6-phosphate. En outre, on observe que l'α-
Figure imgf000032_0001
-rhamnose et l'α- -galactose-6-phosphate présentent une
Figure imgf000032_0003
spécificité pour les récepteurs membranaires des kératinocytes nettement plus importante que l'α- -galactose.
Figure imgf000032_0002
Par contre, les fibroblastes sont indifférents à ces molécules ainsi qu'à la structure du glucose porté par le séricoside. On doit donc en conclure que des produits selon l'invention comportant au moins un résidu osidique constitué par le rhamnose, le galactose ou le galactose-6-phosphate et plus particulièrement l'α-L-rhamnose et l'α-D-galactose-6-phosphate peuvent être fixés
Figure imgf000032_0005
Figure imgf000032_0004
spécifiquement à la surface des membranes des kératinocytes.
On donnera maintenant divers exemples de composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, incorporant des produits selon l'invention. Exemple 10
Crème cosmétique antirides
La crème est obtenue par mélange d'une émulsion et d'une suspension gélifiée de liposomes de compositions suivantes : émulsion :
perhydrosqualène-------------------------------------------- 39,2 g lécithine de soja-------------------------------------------- 0,8 g eau distillée qsp------------------------------------------- 220,0 g suspension gélifiée de Liposomes :
dipamitoy lohosphatidyIcholine (DPPC)--------------------------- 0,49 g cholestérol (chol)-------------------------------------------- 0,26 g dicétylphosphate (DPC)-------------------------------------- 0,09 g DPPE - rhamnosylée (exemple 1)-------------------------------- 0,16 g polypeptides d'élastine-------------------------------------- 0,5 g hydrolysat de thymus de veau--------------------------------------- 0,1 g
Carbopol 940®---------------------------------------------------- 1,0 g triéthanolamine 1,0 g eau distillée, parfums et conservateurs qsp---------- 100,0 g
On chauffe au bain-marie à 70ºC pendant 15 min le mélange de perhydrosqualène (39,2 g) et de lécithine de soja (0,8 g). La phase grasse obtenue est reprise par 180 ml d'eau distillée, puis on émulsionne au moyen d'un agitateur Raynerie.
Par ailleurs, on prépare une suspension gélifiée de liposomes comme suit. Les liposomes sont préparés comme indiqué à l'exemple 1. Les constituants de la phase lipidique (DPPC, chol, DPC, DPPE-rhamnose) sont dissous dans un mélange chloroformeméthanol 7:1. La solution organique ainsi obtenue est évaporée sous pression réduite, puis le résidu lipidique est repris par 49 g d'une solution aqueuse contenant les substances à encapsuler (polypeptides d'élastine, et hydrolysat de thymus de veau préparé, par exemple selon le procédé décrit dans le document FR-A1-2 594 847). On obtient ainsi, après sonication, une suspension de liposomes homogénéisée. Cette suspension est enfin gélifiée par addition de 50 g de gel de Carbopol 940® à 2 %, neutralisé à la triéthanolamine, préparé de manière classique.
Cette crème est appliquée quotidiennement sur la peau du visage et du cou.
Exemple 11
Lotion pour traiter le pspriasis
Composition :
dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)---------------- 2,2 g cholestérol (chol)----------------------------------------------- 1,16 g dicétylphosohate (DCP)-------------------------------------- 0,41 g asiaticoside (C.A.)----------------------------------------------- 0,73 g théophylline--------------------------------------------------------- 1,00 g conservateur------------------------------------------------------- 0,10 g excipient aqueux gélifié au Carbppol 940®
(à 0,1 %)-------------------------------------------------------------- 100,00 g
On prépare une poudre lipidique selon l'exemple 3 par atomisation d'une solution dans un mélange dichlorométhane-méthanol 8:2 contenant les constituants lipidiques ou hydrophobes (DPPC, chol, DCP, C.A.) et 0,5 g de théophylline.
Cette poudre est ensuite dispersée dans 50 ml d'une solution aoueuse contenant 0,5 g de théophylline, par agitation, suivie d'une Homogénéisation aux ultrasons, selon la méthode connue de l'homme ce l'art.
On obtient ainsi une suspension de liposomes encapsulant de la théophi lline et comportant en surface des résidus rhamnosylés. On mélange enfin cette suspension à environ 45 g de gel de carbomère stabilisé, préparé de manière classique.
La lotion ainsi obtenue peut être utilisée en applications locales pour le traitement du psoriasis, deux fois par jour, jusqu'à disparition des lésions. Exemple 12
Lotion capillaire Composition :
phospholipides de soja (PS)-------------------------------------- 2,5 g cholestérol (chol)---------------------------------------------------- 1,2 g dicétylphosphate (DCP)-------------------------------------- 0,5 g asiaticoside (C.A.)----------------------------------------------------- 0,8 g extrait placentaire---------------------------------------------------- 5,0 g pentothénate de sodium-------------------------------------- 0,1 g conservateur--------------------------------------------------------------------- 0,1 g excipient aqueux gélifié
au Carbopol 940® (à 0,1 %) qsp-------------------------------------- 100,0 g
On opère comme à l'exemple 11, si ce n'est que la poudre lipidique ne contient pas de théophylline.
Cette poudre est dispersée dans 50 ml d'une solution aqueuse contenant 5 g d'extrait placentaire et 0,1 g de pantothénate de sodium, puis gélifiée par la quantité suffisante de gel de carbomere stabilisée pour obtenir un poids final de 100 g de lotion.
Appliquée quotidiennement sur le cuir chevelu, cette lotion améliore l'état de santé du bulbe capillaire et stimule la croissance des cheveux.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour fixer un produit sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce que l'on utilise un produit constitué d'une structure de base couplée à au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranaires, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose, et le galactose-6-phos- phate, de préférence l'α- -rhamnose et l'α-D-galactose-6-phosphate.
Figure imgf000036_0004
Figure imgf000036_0001
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est couplé à la surface de ladite structure de base par une liaison chimique ou covalente.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le ligand est couplé à la surface de la structure de base précitée par l'intermédiaire d'un bras espaceur tel que le résidu d'un réactif hétérobi fonctionnel ou un groupe de plusieurs sucres.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le bras espaceur est constitué par un groupe de plusieurs sucres, tel que le groupe (1-4)-o-β- -glucopyranosyl-(1-6)-o-β- -
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000036_0003
glucopyranosyle.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le produit précité est une particule submicroscooique telle qu'un liposome ou une nanoparticule polymérique.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le produit précité est une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthétique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la molécule ou la macromolécule est un asiaticoside, un digal a ctosy ldi g ly c é ri de ou une néoglycoprotéine obtenue par exemple en combinant une albumine de sérum avec un sucre précité.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le produit est ou contient une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau.
9. Procédé pour sélectionner un produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce que l'on choisit parmi un ensemble de produits ceux constitués d'une structure de base couplée à au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranai res, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose, ou le galactose-6- phosphate, de préférence parmi l'α- -rhamnose et l'α- -galactose-6-
Figure imgf000037_0004
Figure imgf000037_0003
phosphate.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le produit précité est une particule submicroscopique, tel qu'un liposome ou une nanoparticule polymérique.
11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que le produit précité est une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthétique.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la molécule naturelle ou synthétique est un asiaticoside, un digalactosy Idiglycéride ou une néoglycoprotéine obtenue par exemple en combinant une albumine de sérum avec un sucre précité.
13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que le produit est ou contient une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau.
14. Procédé de préparation d'un produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce que l'on couple une structure de base correspondante à au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranai res, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose. Le galactose et le galactose- 6-phosphate, de préférence l'α-L-rhamnose et l'α-D-galactose-6-
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000037_0001
phosphate.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le ligand est couplé à la surface de la structure de base précitée par une liaison chimique covalente.
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que le ligand précité est couplé à la structure de base par l'intermédiaire d'un bras espaceur tel que le résidu d'un réactif hétérobifonctionnel ou un groupe de plusieurs sucres.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le bras espaceur est constitué par un groupe de plusieurs sucres, tel que le groupe (1-4)-o-β- -glucopyranosyl-(1-6)-o-β- -
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000038_0001
glucopyranosyle.
18. Procédé selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce qu'on utilise comme structure de base une particule submicroscopique telle qu'un liposome ou une nanoparticule polymérique.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la proportion en pourcentage molaire des résidus osidiques par rapport à l'ensemole des molécules lipidiques formant la bicouche du liposome est d'au moins 10 %, et de préférence d'au moins 15 % par rapport à l'ensemble des lipides amphiphiles.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que les liposomes sont formulés de manière à présenter une forte microviscosité.
21. Procédé selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce qu'on utilise comme structure de base une molécule ou une macromolécule d'origine naturelle ou synthétique, telle αu'une protéine, en particulier une albumine de sérum.
22. Procédé selon l'une des revendications 14 à 21, caractérisé en ce que le produit précité est une substance d'inté- rêt cosmétique ou paarmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau.
23. Procédé selon l'une des revendications 14 à 21, caractérisé en ce que le produit précité contient une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau.
24. Produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'une liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce qu'il est obtenu selon un procédé défini à l'une quelconque des revendications 9 à 23.
25. Produit destiné à être fixé sur la membrane d'un keratinocyte au moyen d'un liaison ligand-récepteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand constitué par un résidu osidique accessible aux récepteurs membranaires, ledit résidu osidique étant choisi parmi le rhamnose, le galactose, et le galactose-6- phosphate, de préférence l'α-
Figure imgf000039_0001
-rhamnose et l'α- -galactose-6-phos-
Figure imgf000039_0002
phate, couplé à une structure de base choisie notamment parmi le groupe constitué par une particule submicroscopique telle qu'un liposome ou une nanoparticule polymérique ; une molécule ou macromolécule d'origine naturelle ou synthétique, telle qu'une protéine, en particulier de l'albumine de sérum ; une substance d'intérêt cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, telle qu'un agent modulateur du métabolisme des cellules de la peau.
26. Produit selon la revendication 25, caractérisé en ce que le couplage précité est réalisé par l'intermédiaire d'un bras espaceur, tel que le résidu d'un réactif hétérobifonctionnel ou un groupe de plusieurs sucres, tel le groupe (1-4)-o-β-D-glucopyrano-
Figure imgf000039_0003
syl-(1-6)-o-β- -glucopyranosy le.
Figure imgf000039_0004
27. Produit selon la revendication 26, caractérisé en ce que le nombre de résidus osidiques précités portés par une protéine est d'au moins 20 environ.
28. Produit selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que la nanoparticule polymérique précitée porte en surface des résidus α-
Figure imgf000039_0005
-galactosy le, α-
Figure imgf000039_0006
-rhamnosy le ou α-
Figure imgf000039_0007
- galactopyranosyle-6-phosphate.
29. Produit selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que le liposome précité porte en surface des résidus α-L-rhamnosy le ou α-D-galactosyle-6-phosphate.
Figure imgf000039_0009
Figure imgf000039_0008
30. Produit selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par un asiaticoside en particulier extrait de la plante Centella asiatica ; un digalactosy Idiglycéride ; une néoglycoprotéine, en particulier obtenue par la combinaison d'albumine de sérum avec l'α-L-rhamnose ou l'α-D-galactose-6-ohosphate.
31. Composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un produit tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 23 ou tel que défini par l'une quelconque des revendications 24 à 30.
32. Composition selon la revendication 31, destinée à tout soin ou tout traitement intéressant les kératinocytes, en particulier à l'amélioration de la régénération cutanée, au traitement du psoriasis, à la repousse des cheveux.
33. Procédé de préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, caractérisé en ce qu'on associe à un excipient, véhicule ou support cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, au moins un produit tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 23 ou tel que défini selon l'une quelconque des revendications 24 à 30.
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