WO1992006107A1

WO1992006107A1 - Process for purifying synthetic peptide, and linker and linker-combining solid-phase carrier used in said process

Info

Publication number: WO1992006107A1
Application number: PCT/JP1991/001379
Authority: WO
Inventors: Susumu Funakoshi; Hiroyuki Fukuda
Original assignee: Nihon Millipore Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1991-10-09
Publication date: 1992-04-16
Also published as: EP0552368A1; EP0552368A4

Description

明細書

合成べプチド精製方法およびこれに用いるリン力一、リンカー結合用固相担体

発明の背景

( 産業上の利用分野）

本発明は合成ぺブチド精製方法およびこれに用いるリンカー、リンカ一結合用固相担体に関するものである。詳しく述べると、本発明は、固相法により合成された合成ぺプチドを高精度、髙収率にて 1 段階分離を行うことのできる合成ペプチド精製方法およびこれに用いるリンカー、リン力一結合用固相担体に関するものである。

( 従来の技術）

ペプチドないし蛋白質は、生体に普遍的に存在する生物学的分子であり、その生理作用の解明、作用機序の解明等は、生化学、生理学、医学などの分野において大きな関心事となっている。

近年、例えば、ペプチドシンセサイザーなどを用いて、所定のアミノ酸配列を有するペプチドないし蛋白質を合成することが盛んに行われるようになってきている。このようにして合成された所定のアミノ酸配列を有するペプチドないし蛋白質を髙純度で供給することができれば、前記したような各分野における研究に飛躍的な進歩をもたらすこ. と力；できると考えられる。しかしな力；ら、上記したようなペプチド合成においては、目的のペプチドと共に多くの不純物が生起する。このため、このような多くの不純物の中から目的のペプチドのみをいかに迅速かつ高い収率で取り出すかということが、固相ペプチド合成において残された最大の課題である。

現在、固相法 [R. B. Merrif ield, J. Am. Chem. Soc, , 8 5, 2149 ( 1963 ) 3 により合成された合成ペプチドないし蛋白質の精製は、ゲル濾過法、高速液体クロマトグラフィー法、あるいはそれらの組み合わせによる方法により行われている。また、ある特殊なベプチ卜ないし蛋白質に限っては、親和性クロマトグラフィー法が有力な手段となり得るが、この方法でさえ完全とは言えないのが現状である。その理由は、固相法によるペプチドの合成では、多数のアミノ酸欠落べプチドが多種類同時に合成され、その中には親和性クロマトグラフィー法における担体と弱いながらも親和性を示すものが混在するためである。

ぺプチドの固相合成では段階的伸長法を採 ffl しており、例えば縮合反応収率が 9 9 % あれば、 5 0 残基のぺプチドで理論上 6 0 % の合成収率が得られる。しかしな力 ί ら、縮合反応はべプチドのシーケンス依存性であるゆえ常に 9 9 % 以上の収率が得られるとは限らない。そのためぺプチド鎖を構築して行くと不完全縮合による不純物は部分的にァミノ酸が欠落したペプチドとして蓄積してゆく。

このアミノ酸欠落べプチドを除くため各縮合反応の後に、無水酢酸によるキヤッビングを施し、不純物のそれ以上のペプチド鎖の延長を止めることが行われている。この操作を行うことにより、最終アミノ酸導入後、目的の配列を宵するペプチドのみが N 末端のアミノ基を有することとなる。

また、このアミノ基を利用した分離法も幾つか報告されてレ、る [ 例えば、 R . Cambl e, R. Garner, and G . T. Young,

Nature (London), 217, 247 ( 1968 ) ； K. Suzuki , Y. S a s a k i , and N. Endo, C h e m . P h a r m . Bul l. , 24, 1 ( 1976 ) ； I). S . em and D, G . Roberts, Tetrahedoron Lett. , 4269 ( 1975 ) ； T. Wei land, C. Birr, and H . Wissenbach , A n g e .

Chem. , Int. Ed. , Engl . , 8 , 764 ( 1969 ) ； H. Wi ssman a n d R . Geiger, Angew. Chem. , Int. Ed. , Engl. , 9 , 908 (1970) ； R. B. Merrif ield and A. E. Bach, J. Org. Che m. 43 , 4808 ( 1975 ) ； T. J . Lob 1 , R. M. Deibel, and A.

. Yen, Anal . Bi ochem. , 170, 502 ( 1988 ) ； H . Bal l, Grecian, S. B . H . Kent, and P. Mascagni, in " Pepti d es ' , J . E. Rivier and G. I! . ars al l , Eds. , ESCOM, L eiden, 1990, pp435など ] 。し力、しながら、これらのいずれの方法も、煩雑な操作を要し 1 段階分離法とは程遠いものである。

また、システィン一メチォニンを N 末端に導入し、システィンの S H 基を利用し、フヱニル水銀カラムに目的ぺブチドのみを吸着させ分離し、後に B r C N でメチォニン一ぺプチド間の結合を切断し目的べプチドを得る方法も知られているが [D. E. Kri eger, B. W. Erikson, and H. li . M - errif ield, Proc. Natl. Acad. S c i . U. S. A. , 73， 3160 ( 1976 ) ]、この方法はメチォニンを含有するべプチドには利用できないと言う制約があるものであつた。

発明の概要

従って、本発明は、固相法により合成された合成べプチドを髙精度、高収率にて 1 段階分離を行うことのできる合成ぺプチド精製方法並びにこれに用いるリンカーおよびリンカ一結合用固相担体を提供することを目的とするものである。

上記諸目的は、固相法によるべプチド合成において得られる末端基にアミノ基を有する目的とする成熟ペプチドおよびェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟べプチドが混在する系から、末端に官能基を有するリンカーを用いて前記成熟べプチドを化学選択的に固相担体に固定化 · 分離する合成べプチドの精製法によって達成される。

また、上記諸目的は、

a ) 固相法によるペプチド合成における最後のアミノ酸を導入した後、末端にアミノ基を有する目的とする成熟べプチド、および例えば、無水酢酸、無水プロビオン酸などのァシル化剤によってェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟ペプチドの双方が結合している固相に対し、一端部に、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プ p セスの後処理工程において酸性条件下で行われる脱保護蓰反応に安定でかつある他の条件で特異的に切断可能な結合をなす官能基を有し、また他端部に前記脱保護反応により活性な官能基を生成し得るリンカーを添加して ίί 記成熟べプチドを選択的に修飾し、

b ) 次いでペプチド合成プロセスにおける最終的な前記脱保護基反応を行い、これにより成熟べプチドおよび未成熟べプチドを固相より解離し、

c ) 前記最終的な脱保護基反応によって生成したリンカ — の前記他端部の官能基と反応して安定な結合を形成する官能基を有する化合物を固定化保持する別の固相を、前記 b ) 段階において得られたぺブチド混合物と接触させて、該固相に成熟べプチドをリンカーを介して選択的に固定し、 d ) さらに、前記 c ) 段階において得られた成熟ぺプチドを固定した固相を、リンカ一と成熟ペプチドとの結合を特異的に切断する前記他の条件に曝し、成熟ペプチドをリンカ一結合固相より切断する

操作を含んでいることを特徴とする合成ペプチド精製方法によって達成される。

また、本発明の合成ペプチド精製方法は、

e ) 固相法によるぺブチド合成における最後のアミノ酸を導入した後、末端にアミノ基を有する目的とする成熟べプチドおよびェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟ペプチドの双方が結合している固相に対し、

一端部に、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プロセスにおいて酸性条件下で行われる脱保護基反応に安定でかつあるアルカリ性条件下で特異的に切断可能な結合をなす官能基を有し、また他端部に前記脱保護反応により S H 基を生成し得るリンカーを添加して前記成熟ぺブチドを選択的に修飾し、

f ) 次いでべプチド合成プロセスにおける最終的な前記脱保護基反応を行い、これにより成熟ペプチドおよび未成熟べプチド耷固相より解離し、

S ) 前記最終的な脱保護基反応によって生成したリンカ一の前記他端部の S H 基と反応して安定な結合を形成する化合物を固定化してなる固相に、前記 f ) 段階において得られたぺブチド混合物を接触させて、該固相に成熟べプチドをリンカーを介して選択的に固定し、

h ) さらに、前記 g ) 段階において得られた成熟べプチドを固定した固相を、リンカ一と成熟ペプチドとの結合を特異的に切断するアルカリ性の条件下に曝し、成熟べプチドをリンカー結合固相より切断する

ことにより目的とする成熟べプチドを単離することができる。

本発明の合成ペプチドの精製方法は、さらにまた、 i ) 固相法によるペプチド合成における最後のアミノ酸を導入した後、末端にアミノ基を有する目的とする成熟べプチドおよびェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟ぺブチドの双方が結合している固相に対し、

一端部に、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プロセスにおいて酸性条件下で行われる脱保護基反応に安定でかつあるアル力リ性条件下で特異的に切断可能なゥレタン結合をなすアルコキシカーボネート結合を有し、また他端部に前記脱保護反応によりチオール基を生成し得るリンカーを添加して前記成熟ペプチドを選択的に修飾し、

j ) 次いでぺブチド合成プロセスにおける最終的な前記脱保護基反応を行い、これにより成熟ペプチドおよび未成熟ペプチドを固相より切断すると共に、成熟ペプチドに結合したリンカ一の前記他端部側のチオール基の保護基をはずして、該リンカーの前記他端部にチオール基を生成させ、 k ) 次に、ョード脂肪族カルボン酸およびブロム脂肪族カルボン酸からなる群から選ばれたいずれかのものの誘導体が結合されている固相担体に、前記 j ) 段階において得られたべプチド混合物を中性条件下で接触させ、脱ョードおよび脱ブロムのいずれかの反応を行って、安定な共有結合を形成して、該固相担体に成熟ペプチドをリンカ一を介して選択的に固定し、

1 ) さらに、前記 k ) 段階において得られた成熟べプチドを固定した固相担体を、アルカリ性の条件下に曝し、成熟ペプチドとリンカーとの結合部に（3 脱離反応を行わせ、成熟ペプチドをリンカー結合固相担体より切断する

ことにより目的とする成熟ペプチドを単離することができ. る。

また、本発明の合成ペプチドの精製方法においては、次の構造式（ ID )

0

II

X-NH- (CH₂ ) _n — S— CH₂— CH₂ -O-C-Y (Π)

II II

0 0

(ただし、式中、 nは 1〜4の整数、 Xは

CH₃— OHQ - CH₂ - S - （CH₂ ) « - C一（mは 1〜2)

CH₂ -S-CII₂一 ([ VOCH:

CH,一 C一 0— C一 NH— CH— CO— ；および I II CH₃ 0

CH₃一 0~ 一 CH₂ -O-C-NH-

W II

o

のいずれかであり、また Yは

一 0 、〉一 Ν0₂ ；

一

；および

F のいずれかである。）

F F で表されるリンカーが好ましく用いられる < またこのリンカ一は、次の構造式（ I ) O

II

X-NH- (CH₂ ) _n -S-CH₂ ~CH₂ -OH (I)

II

0

(ただし、式中 nは 1〜4の整数、 Xが Hのもの、およびその塩酸塩、

ならびに

cm

CH₃ -C-0-C- ；および

I II CH₃ 0

CH, 0—く z \〉一CH₂ -0-C- のいずれかである。）

II

0 で表されることを特徴とするリンカー合成中間体ないしは、次の構造式（ π )

0

II

X-NH- (CH₂ ) _n -S-CII₂ -CII2 -OH (II)

II

o

(ただし、式中、 n = 1〜 4の整数、 Xは

CH₃ -0-O-CEi₂ -S- (CH₂ ) _m -C- (mは 1〜2) ；

II O

CH, CH₂ - S - CI" -Q>-OCH, ；

CH, -C-O-C-NH-CH-CO- CH, O

および

CH,一 0 - O - CI -O-C-NH-

II

0

のいずれかである o ) で表されることを特徴とするリンカ一合成中間体より、易に合成され得るものである。さらに、本発明の合成ペプチド精製方法においては、表面に次の構造式を有する分子鎖

( ただし、式中 n = 1 〜 2、 m = 2 〜 6、 R は H または炭素数 1 ~ 6 のアルキル基である。）を結合させたことを特徴とするリンカー結合用固相担体が好ましく用いられ得る。

本発明者らは、固相法によるペプチド合成において、多数の未成熟ぺブチド混合物中から目的とする成熟べプチドのみを効率良く分離する方法を得るために、鋭意検討を行つた結果、一端部において、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プロセスの後処理工程において酸性条件下で行われる脱保護基反応に安定でかつある他の条件で特異的に切断可能な結合をなす官能基を有し、また他端部に前記脱保護反応により活性な官能基を生成し得るリンカーを ffl い、このリンカーによって前記成熟ぺブチドを選択的に修飾しればよいとの見解に到達した。すなわち、このリンカ一をペプチドの合成の最終アミノ酸導入後に成熟ペプチドの N 末端に結合させれば、最終脱保護反応後において、成熟ぺブチドおよび未成熟ぺプチドのべプチド混合物の内，成熟ぺブチドのみが結合したリンカ一により末端に活性な官能基を有することとなるため、この官能基と反応して安定な結合を形成する官能基を有する化合物を固定化してなる別の固相を、前記ペプチド混合物と接触させれば、該固相に成熟べプチドのみ選択的に固定でき、これによつて成熟ペプチドと未成熟ペプチドを分離し、そして、さらに成熟べプチドを固定した固相を、リンカ一と成熟べプチドとの結合を特.異的に切断する前記他の条件に曝せば、成熟べプチドがリンカ一結合固相より切り離され、成熟ペプチドのみが取り出されるものである。

本発明によれば、固相法によって得られた所望の配列を有する合成ペプチドを、迅速かつ高収率で精製できるものであり、ぺプチドないし蛋白質合成に飛躍的な進歩をもたらし、ペプチドないし蛋白質の生理作用の解明、作用機序の解明等に大きく貢献することができるものである。

図面の簡単な説明

第 1 図は F m o c 固相ペプチド合成サイクル及びその後の成熟べプチドの精製過程を示すフローチヤ一卜、

第 2 図はペプチド合成工程、リンカ一結合工程、およびリンカ一結合固相担体を用いる精製工程を示すフローチヤ一ト、

第 3 図はリンカー合成の反応系フローチヤ一卜、

第 4 図はリンカ一合成の別の反応系フローチヤ一ト、第 5 図はリンカー合成のさらに別の反応系フローチヤ一卜である。発明の詳細な説明

以下本発明を、実施態様に基づきより詳細に説明する。第 1 図は、 F m o c ( 9 -フロォレニルメチルォキシカルボニル）法による固相ペプチド合成において、本発明の精製方法の一例を適用した場合の概略を示すものである。

第 1 図に示すようにペプチド合成は、常法に従い、ステップ 1 〜ステップ 3 を繰り返すことによって行われる。すなわち、まずステップ 1 において、 N 末端が F m o c 基により保護された第 1 アミノ酸残基

( - N HH —- CC HH —- CC 00 - ) が多数結合してなる固相としての固相担体ビーズ P を、ペプチドシンセサイザ一の反応 ffl 容器にセットし、これに 2 0 % ピぺリジン / ジメチルホルムアミド（ D M F ) 混液を添加することにより末端の F m o c 基をはずし、次にステップ 2 においてこれに N 末端が F m o c 基により保護された第 2 アミノ酸

( F m o c - N HH -- CC HH -- CC 0O 0O HH )

を縮合剤（例えば、 N , N ' — ジイソプロピルカルボジィミド（DIPCD) + N — ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（ΗϋΒΤ)、ベンゾトリアゾールー 1 ーィルーォキシ一卜リス（ジメチルァミノ）一ホスフ才ニゥムへキサフルォロホスフェイト (Β0Ρ ) + Η 0 Β Τ、 [ と共にあるいは前記アミノ酸のぺシ夕フルオロフェニルエステル（ pFp エステル） + Π 0 Β Τ ] と共に添加し、第 2 アミノ酸残基を固相担体ビーズ P 上の第 1 アミノ酸残基側方に結合させる。ここで、第 2 ァミノ酸が結合しなかった未反応の鎖が、その後のアミノ酸結合反応において成長していくのを防止するために、ステップ 3 において無水酢酸 / ビリジン混液を反応用容器に添加し、未反応の鎖末端にァセチル基を結合させてェンンドキヤッビングを行.う。このキヤッビング処理により、固相担体ビーズ上には、第 1 アミノ酸残基および第 2 アミノ酸残基が結合した N 末端が F m o c 基により保護された鎖と、第 1 アミノ酸残基の N 末端にァセチル基が結合した鎖が存在することとなる。

次いで、ステップ 1 に戻り、第 1 アミノ酸残基および第 2 アミノ酸残基が結合した鎖の N 末端の F m o c 基をはずし、ステップ 2 において第 3 アミノ酸を縮合剤と共に添加して、該鎖の第 2 アミノ酸残基側方に第 3 アミノ鎖残基を結台させ、その後ステップ 3 において第 2 アミノ酸が結合しなかった未反応の鎖をエンドキヤッビングする。このようにして目的の n 個のアミノ酸が結合するまでステップ 1 〜 3 を繰り返すものである。

最終アミノ酸導入後において、固相担体（固相担体ビーズ）には、 N 末端のアミノ基を有する目的とする成熟ぺプチドと、無水酢酸でのキヤッビングによってァセチル基修飾末端を有する未成熟ペプチド（不純物）との双：// が結しており、目的とする成熟ペプチドは多数の不純物中に混在した状態にある。

なお、第 1 図においては、未成熟ペプチドの末端をァセチル基によってエンドキヤッビングする例を示した力;、未成熟ペプチドの末端を有効にキヤッビングできる限りにおいて、このようなキヤ、ジビングはいかなるキヤッビング試薬を用いて行うこともでき、これ以外にも例えば、プロビォニル基、 ^ るいは 4 一二トロフエニル基、 2, 4— ジニトロフヱニル基、 2, 6— ジニトロフエニル基などによるキヤッビングが可能である。

しかして、本発明の合成べプチド精製方法においては、この最終アミノ酸導入直後に、固相に対し、前記成熟ぺプチドの N 末端と、酸性条件下で行われる固相法における最終脱保護基反応に安定でかつある他の条件、例えばアル力リ性条件下で特異的に切断可能な結合（例えばウレ夕ン結合）をなす官能基を有し、かつ他端部に前記脱保護基反応により活性な官能基を生成し得るリンカーを添加する。

酸性条件下で行われる最終脱保護基反応に安定でかつァルカリ性条件下で除去可能なァミノ保護基として、カルピノらの F m o c 基（ 9 -フルォレニルメチルォキシカルボ二メレ _) L L . A . Ca r 1 n 0 and G . Y , Han, J . Am. Chem. S o c . , 92, 5478 (1970) ； J. Org. Chem. , 37, 3404 (1972)] 、テッサァらの M s c 基（メチノレスルホニルェチルォキシカルボニル） [G. I. Tesser and I . C. alvert-Geers, Inし J. Peptide Protein Res. , 7, 295 (1975) ]力 ί ある ₀ F m o c 基

M s c 基：

O °

II II

CH, S-CH₂ CH₂一 O - C一

II

o

いずれの保護基もアルカリ処理により 13 脱離反応を起こし短時間に除去可能なァミノ保護基である。従って、本発明において用いられるリンカ — は、このようなァミノ保護基をベースとして好適に構成され得る力特に、リンカ一合成の容易さ、さらに分子鎖の長さから考えて、テッサァらの M s c 基を用いたほうが有利である。本発明において用いられるリンカ — として、具体的には、例えば、次の構造式（ ΠΙ )

0

II

X-NH- (CH₂ ) -S-CH₂ -CH₂ -O-C-Y (III)

II II

0 o

(ただし、式中、 nは 1〜4の整数、 Xは

CII₃— 0— <T CH₂— S—（CH₂ ) — C— （mは 1〜2) ；

W II

0

CH, ；および

CH₂ -S-CH₂ - <Q> - OCH:

CH, -0→Q-CH₂ -O-C-NH-CH-CO

のいずれかであり、また Yは

o

II

c、

；および

■o—_ -F のいずれかである。）

で表されるものなどが好適に例示される。このリンカ一は、 M s c 基を基本骨格として有し、かつ一端にペプチドの N 末端のアミノ基に導入可能な活性ァルコキシカルボネー卜ないしはァリールォキシカノレポネー卜を有し、さらに他端に活性な官能基としてチオール基（ S H 基）を有している ( 但し、この S H 基は保護基により保護された形態にある。）ものである。このリンカ一の上記一端部は、固相法べプチド合成の最終脱保護基工程における反応条件下、ぺブチド合成の最終脱保護基用試薬として用いられるあらゆる酸には安定であるが、アルカリ（例えば、 0. 2 N N a 0 H ( 5 0 w/w % メタノーノレ中） 5 秒、 5 w/w % N H₄0 H ( 5 0 w/w % メタノール中） 5 分）によって 3 脱離反応を起こし容易に解離する結合をべプチドの N 末端となすものである。またこのリンカ一の上記他端部の S H 基は、ョ一ド酢酸誘 ¾ 体と反応し、中性およびアル力リ性下において安定なチォエステル型の共有結合を形成するものである。この構造式（ m ) で表されるリンカ一の合成経路としては特に限定されるものではない力例えば、構造式（ I ) で表される M s c 基を骨格として有する中間体より好適に導き出される。

0

II

X-NH- (CH₂ ) n -S-CH₂ -CH₂ -OH CI)

II

0

(ただし、式中 nは 1~4の整数、 Xが Hのもの、およびその塩酸塩、

ならびに

CH,

i

CH, -C-O-C- ；および

I II CH, 0

CH, O—〈Z》一 CH₂ -O-C- のいずれかである。）

II

0

すなわち、構造式（ I ) で表される中間体の一方の末端である水酸基は、ペプチドないしは蛋白質のァミノ基に導入可能な活性アルコキシカルボネー卜に容易にみちびくことができ、一方、他方の末端であるアミノ基ないし適当な保護基によって保護されたァミノ基は、活性な官能基を有する化合物、例えば S H 基を有する化合物を容易に導入することができるものである。

また、構造式（ Π ) で表される中間体は、この構造式 ( I ) で表される中間体の前記他方の末端であるアミノ基末端に保護基により保護されたチオール基を有する化合物を導入したものである。

0

II

X-NII- (CH₂ ) -S-CH₂ -CH₂ -OH (Π)

II

o

(ただし、式中、 n=l〜4の整数、 Xは

CH₃ -O- \〉— CH₂一 S— (CH₂ ) 雕一 C— (mは 1〜2) ；

II

0

CH₃ CH₂一 S— CH₂ - — 0CH₃ ；

CH₃一 C一 O— C一 NH— CH— CO—

I II CH, 0

および

CH₂ -S-CH₂ - <Q> - OCH₃

CH₃ -0- -CH₂ -0-C-NH-CH-CO- W II

o

のいずれかである。）このようなリンカ一が添加されると、リンカ一は、第 1 図に示すように目的とする成熟べプチドのみが N 末端のァミノ基を有するゆえに、この成熟ペプチドのみに結合する。従って、リンカ一に含まれる例えば S H 基などのような活性基は成熟ぺブチド鎖末端のみに導入される。

次いで、常法に基づき酸性条件下で最終脱保護基反応をおこない、固相より、リンカ一の結合した成熟ペプチド鎖およびァセチル基などによりェンドキヤッビングされた未成熟ペプチド鎖を切断する。上記したようにこの最終脱保護基反応においては、上記リンカ一は成熟ペプチドの N 末端に安定して結合している。なお、リンカ一として構造式

( m ) で表される化合物を用いた場合、このリンカ一の s

H 基の保護基である P — メトキシベンジル基は、脱保護基試薬により除去され、ペプチド鎖末端に S H 基が露出することとなる。

次に、こうして得られた成熟べプチド鎖および未成熟ぺプチド鎖を含むペプチド混合物に対し、リンカ一の前記他端部の官能基と反応して安定な結合を形成する官能 S を有する化合物を固定化してなる固相を接触させる。例えば、該官能基が S H 基である場合、表面にョード脂肪族力ルボン酸誘導体あるいはブロム脂肪族カルボン酸誘導体、特に次の一般式

R

( ただし、式中 R は H または炭素数 1 ~ 6 のアルキル基、 n は 1 ~ 6 の整数である。）

で表されるョ一ド脂肪族カルボン酸誘導体、あるいは次の一般式

( ただし、式中 R は H または炭素数 1 ~ 6 のアルキル基、 n は 1 〜 6 の整数である。）で表されるブロム脂肪族カルボン酸誘導体が固定化されている固相、特に好ましくはョ一ド酢酸誘導体

I -CH ₂C00H

あるいはブロム酢酸誘導体

BrCH ₂C00H が固定化されている固相を用いる。

具体的には例えば、次の構造式を有する分子鎖

B r-(CH^C-NH-(CH₂ ---NH-

I II

R O

( ただし、式中 R は H または炭素数 1 ~ 6 のアルキル基、 n = l 〜 2、 m = 2 〜 6 である。）を結合させた固相を用い、中性付近の条件下に接触させれば良い。好ましくは p H = 7 〜 9 の範囲において、かつ目的とする反応を阻害しない不活性の緩衝液中で行われる。また更に好ましくは、ぺブチドの溶解性を向上させるために、例えば塩酸グァ；ジン、尿素などの変性剤が添加される。一例としては、緩衝液として、 0. 4 M リン酸緩衝液や、 0. 4 M 卜リス ( ヒドロキシメチル）ァミノメタン塩酸緩衝液（以下、トリス塩酸緩衝液と略す）が用いられ、変性剤として、 4 〜 7 M o l、好ましくは約 6 M o l 塩酸グァニジンや、 4 〜 8 Μ ο 1、好ましくは約 6 Μ ο 1 尿素が用いられる。勿論、これら以外の緩衝液や、変性剤も適宜使用可能である。

また、このような官能基を有する化合物が固定化される固相としては、固相担体が好ましく、特に親水性固相担体が好ましい。一例として、水系で使用可能なように適当な親水性固相担体を含浸させたキーゼルグール支持担体（固相担体ビーズ）が挙げられる。

この操作により、該固相に成熟べプチドのみ選択的に固定できる。一方、固相に結合しなつかった未成熟ペプチドや脱保護基に用いたスカベンジャー等は次に固相（固相担体）の洗浄操作を行うことにより簡単に除去することができる。最後に、リンカ一と成熟ペプチドとの結合を特異的に切断する条件、例えばリンカーが構造式（ III ) で表される化合物であるような場合には、アル力リ条件に曝せば、成熟ペプチドがリンカー結合固相より切断される。なお、このアルカリ処理を 5 % アンモニア溶液を用いて行った場合に、 5 % アンモニア溶液に溶けないペプチドは固相より切断されたときに沈殿物として反応用容器内に残るものもある。このアル力リ処理の後に 5 0 % 酢酸溶液で洗净すると沈殿物は溶出し効率よく回収できる。またこのように、アル力リ処理の後の固相洗浄操作に酢酸を； 1 いるとアンモニァが中和され、凍結乾燥で昇華させることができるために、最終的に得られるものは成熟ペプチドのみとなり、好ましい。

なお、第 2 図は、本発明のこのような合成ペプチド精製法の一実施態様による具体的な模式であり、この図において目的とされる成熟ペプチドは、 A — B — C — D — E — F 一 G で表わされるものであり、これより短い A — B — C、 A — B — C 一 D、 A — B — C 一 D — E、 A - B - C - D - E 一 F はいずれも未成熟ぺプチドを表わすものである。

第 2 図のステップ 1 は、固相法ペプチド合成の最終アミノ酸導入後において、固相（固相担体ビーズ）には、 N 末端のアミノ基を有する目的とする成熟ペプチドと、無水酢酸でのキヤッビングによってァセチル基修飾末端を有する未成熟ペプチド（不純物）との双方が結合しており、目的とする成熟ペプチドは多数の不純物中に混在した状態にある。この固相に上記したような本発明のリンカーを添加すると、リンカ一は成熟ペプチド A — B — C 一 D — E — F — G のみの末端に選択的に結合し、その後べプチド合成法の最終脱保護基処理を行うと、ステップ 2 に示されるように，成熟ペプチドと未成熟ペプチドとが固相より切断され、合わせて成熟べプチドに結合したリンカーの他末端に活性な官能基（ S H 基）が形成される。次に、ステップ 3 に示.されるようにこうして得られた成熟べプチド鎖および未成熟ペプチド鎖を含むペプチド混合物に対し、反応 ffl 容器に収容された本発明のリンカ一結合用固相担体を接触させる。この操作において、リンカー結合用固相担体には成熟ぺブチドのみがリンカーによって結合され、未成熟べプチドゃその他の試薬は系外に排出される。次いで、ステップ 4 において、リンカ一と成熟ペプチドとの結合を特異的に切断するアルカリ条件に反応用容器を曝し、成熟ペプチドをリンカー結合固相より切断し、反応用容器より流出させるものである。

( 実施例）

以下本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、以下に示される実施例はあくまで本発明の説明のために例示されたものにすぎないのであって、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

m 1 リンカーの ( A )

第 3 図に従い、リンカ一を合成した。

1 - 1—： _ t合物 I の合成

CH₂ -CH₂一 S— CH₂ -CH₂ -OH

化合物 I ： 2— N—ェチルフタルイミト * ， 2' —ハイト ' 口キシェチルスルフイト'

N — 2 — ブロモェチルフタルイミド（ 50. 8 g、 0.

2 m o 1 ) と、 3 — メルカブトエタノーノレ（ 14. 3 m l、 0. 2 m o 1 ) を、ジメチルフオルムアミド（ 4 0 0 m l ) に溶かし、氷冷下にジシクロへキシルァミン（ 39. 9 m 1、 0. 2 m o 1 ) を加え、室温にて 4 時間撹拌した。生成する塩（ジシクロへキシルァミンの臭化水素塩）を逋去した。塩を小量のジメチルフ才ルムアミドで洗浄し逋液と合せた。ジメチルフオルムアミドを滅圧留去した。残渣を酢酸ェチルに溶かし、分液ロートに移し、酢酸ェチル層を飽和食塩水で 3 度洗った。さらに酢酸ェチル層をマイヤーフラスコに移し、酢酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水琉酸ナトリウムを逋去し、酢酸ェチルを減圧留去した。そして白色の油状物 45. 9 g ( 収率 9 1 % ) を得た。

1 - 2 ：化合物 Π の合成

CH3 一 CH₂ -0-C-NH-CH₂ - CH₂ - S - CH₂一 Ci 一 OH

O

化合物 II ： 2N—（P -メトキシへ，ンシ' ルォキシカル *' ニル）アミノエチル， 2' -ハイト' Dキシェチスルフト ·

上記で得た化合物 I ( 43. 5 g、 0. 17 m o 1 ) をメタノール（ 2 5 0 m l ) に溶かし、飽水ヒドラジン（ 9. 3 m 1、 0. 18 m o 1 ) を加え 1 6 時間撹拌した。生成する結晶を逋去し、メタノールを滅圧留去した。残渣にァセトニトリルを加え結晶化した。メタノール Z ァセ卜ニトリルより再結晶し白色結晶 45. 9 g ( 収率 8 6 % ) を得た。次いで、これを水（ 1 0 0 m 1 ) と卜リエチルァミン ( 23. 6 m 1 ) の混液に溶かし、氷冷下ノラメトキシべンジルアジドホルメート（渡辺化学工業株式会社製）（ 3 4. 7 g、 0. 16 m o 1 ) のァセトニトリル（ 1 0 0 m

1 ) 溶液を加え、 1 0 時間撹拌した。水ーァセトニトリルを滅圧留去した。油状残渣を酢酸ェチルに溶かし、分液口一卜に移し、. 詐酸ェチルを 5 % クェン酸で 3 度、飽和食塩水で 3 度洗浄した。酢酸ェチル溶液をマイヤーフラスコに移し、酢酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリゥムで乾燥した。無水硫酸ナトリゥムを據去し、酢酸ェチルを滅圧留去した。残渣に n — へキサンを加えて、結晶化した。酢酸ェチル n — へキサンで再結晶化し、白色結晶 37. 12 g ( 収率

9 3 % ) を得た。

なお、得られた化合物 Π の分析値は以下の通りであつた。

R f , = 0. 74

融点 4 1 〜 41. 5 ^eC

C₁₃H₁₉N0₄Sに関する理論値：

C = 54. 72 ； II = 6. 71 ； N = 4. 91

実測値：

C = 54. 79 ； H = 6. 88 ； N = 4. 98

NMR (CDC 1₃ ) ： 52.08(br.s,lH),

2.73-2.76 ( 4H), 3.39 (q, J=6.1Hz, 2H),

3.73 (t, J=5.7Hz, 211), 3.80 (s, 3H),

5.04(s, 2H), 5.12(br.s,lH), 6.88, 7.30(ΑΑ' HB' pattern, Jortho =8.8).

F A B 質量分析： 286. 1 ( M + H+ ) ( C₁₃Hi₉N0 S ： 285. 1 に関して算出）

1 - 3 ：化合物 ΠΙ の合成

0

II

CH, 0~<Ζ—》一 CH₂ -0-C-NH-CH₂ 一 CH: S- CH₂ -CH₂一 Oil

II

o 0

ί匕合 ¾5 m ： N (p— [トキシへ * ンシ' ル才キシカルホ' ニル）アミノエチルスルフォ二ルェ夕ノール上記で得た化合物 II ( 18. 2 g、 6 5 m m o 1 ) を水

( 1 0 0 m l ) とメタノール（ 1 0 0 m l ) に溶かし、夕ングステン酸ナトリウム（ 6 5 m g ) を加え、撹拌しながら、過酸化水素水（ 16. 3m l、 1 1 4 m 1 / m o 1 ) を滴下した。なお、反応は発熱反応であるので、反応温度を 6 0 となるように制御した。 2 時間撹拌の後、過剰の過酸化水素水を分解するため、 5 % パラジウム炭素（ 0. 5 g ) を加え発泡が終了するまで撹拌した。 5 % パラジゥム / 炭素を逋去し、溶媒を滅圧留去し、油状残渣を酢酸ェチルに溶かし、分液ロートに移し、酢酸ェチル溶液を 5 % クェン酸で 3 度、 5 % 炭酸水素ナトリウム溶液で 1 度、さらに飽和食塩水で 3 度洗浄した。酢酸ェチル溶液をマイヤ一フラスコに移し、酢酸ェチル溶液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾去し、酢酸ェチルを滅圧留去した。そして油状残渣にジェチルエーテルを加 ·Π 4""α , -Ν -" ， ,v""-d)-s ： ΛΙ ii¾

m ^ ο> Μ ^ ^ : - τ

( Ff? 3¾ - η Μ Γί I '0Ρ£ ： BNS⁹0 ⁶ⁱH^eID )

'(8 ·8= ⁰""⁰Γ 'ma ked gg ,w)6Z 'L '88 '9

'(HI '^a¾TT q)9 S '(HZ *s)W 'S'(HZ 'S=fW

' (Ηε ) 08 ·ε ' (HZ ¾H6 '9=Γ ¾) ZL ·ε

'(ΗΖ ¾H6 's=r ·ε '(HZ -s=r ¾oz ¾

'(HT*s'jq)60'zs · '{ ^ε\ οαο) ΗΙΛΙΝ if = N ·' Z6 '2 = H ·' εθ '62 = 0

- m m

I = N ； SO *9 = H ' OZ '62 = 0

： S> «I IE 5· 4- K S⁹0N^6lH"0

9 9 〜 S 9 ？賴

z 2 *o = ^ιί a

。 c* 靳土 :i f J 1} ½ © ni ^ q> ¾ -i^ 9 ¾ 、i?

°^ M ¾ ( % r 8 * Kir ) s A -₉ r w ^ ¾^a ¾ M a. ^ - x -ir ^ x j / ^ x ¾| 48 。つ：^晋 ^ L€lO/l6df/IDd .0I90/Z6 OM S — （ p — メトキシベンジル）チォグリコール酸（ 1. 4 9 g、 7 m m o 1 ) と 1 ーヒドロキシスクシイミド（ 0. 8 1 g、 7 m m o 1 ) をテトラヒドロフラン（ 1 0 m l ) に溶かし、氷冷下に N, N ' — ジシクロへキシルカノレポジイミド（ 1. 59 g、 7. 7 m m o 1 ) を加え 5 時間撹拌

した。生成する N, N'— ジシクロへキシルウレァを滹取し、テトラ -ヒドロフランを滅圧留去した。残渣にイソプロビルアルコールを加えて結晶化し、さらにテトラヒドロフラン Zイソプロビルアルコールで再結晶し、白色結晶 1. 2 5 g ( 収率 5 8 % ) を得た。

なお、得られた化合物 IV の分析値は以下の通りであった。

R f 2 = 0. 8 6

融点 8 8 〜 8 9 で

C_MHi₅N0₅Sに関する理論値：

C = 54. 36 ； H = 4. 88 ； N = 4. 53 実測値：

C = 54. 07 ； H = 4. 85 ； N = 4. 48

F A B 質量分析： 332. 1 ( M + Na"¹ ) ( Ci₄Hi₅N0₅SNa ： 332. 1 に関して算出）

1 一 5 ：化合物 V の合成

0

II

CH₃ 0- -CH₂ -S-CH₂ -C-NH-CH₂ - CH₂ -S-CH₂ - CH₂ - OH

ヽ - i| II

0 0 t 合 ¾ V ： N[S—（p—；（トキシへ' ンシ' ル）チ才ク' リコリル]アミノエチルスルフォニルェ夕ノ -ル

上記化合物 ΠΙ ( 5. 0 g、 15. 8 m m o 1 ) をァニソ

ール（ 5 m l ) 存在下に、トリフルォロ酢酸（ 2 0 m l ) で氷冷下 6 0 分処理した。トリフルォロ酢酸を滅圧留去し、残渣にジェチルエーテルを加え油状残渣を得た。これを氷冷下にジメチルホルムアミド（ 5 0 m l ) に溶かし、トリェチルァミン（ 4. 5 m l ) 、 N — ヒドロキシベンゾトリァゾール（ 2. 42 g ) と化合物 IV ( 5. 86 g、 19.

0 m m o 1 ) を加え、室温で 1 2 時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを滅圧留去し、油状残渣を得た。この油状残渣を酢酸ェチルに溶かし、分液ロートに移し、酢酸ェチル溶液を 5 % クェン酸で 3 度、 5 % 炭酸水素ナトリウム溶液で 3 度、更に飽和食塩水で洗浄し、次いで舴酸ェチル溶液をマイヤーフラスコに移し、酢酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾去し、酢酸ェチルを減圧留去した。油状残渣にジェチルエーテルを加え、結晶化し、酢酸ェチルノジェチルエーテルで再結晶し、白色結晶 4. 31 g ( 収率 7 8 % ) を得た。

なお、得られた化合物 V の分析値は以下の通りであつた。

R f！ = 0. 6 1

融点 7 3 〜 7 5

Ci4H₂iN0₅S₂ に関する理論値：

C = 48. 40 ； H = 6. 09 ； N = 4. 03 C = 48. 40 ； H = 6. 09 ; N = 4. 03 実測値：

C = 48. 60 ； H = 6. 29 ; N = 4. 11 NMR (CDC 1₃ )： 62.29(br.¾lH),

a 13 (s, 2H), 3.31 -3.23 (m, 4H), 3.71 (s, 2H),

3.72 (q, J=6. OHz, 2H)， 3, 80 (s, 3H),

413(t, J=5.2Hz, 2H), a 86, 7.22(AA' BB' pattern, Jort o =8.7) 7.31(br. t like, 1H).

F A B 質量分析： 348. 1 ( M + H+ ) ( C4H21NO5S2 ： 34Ί 1 に関して算出）

1 - 6 ：化合物 VI ( リンカ一）の合成

0

ハ II ハ

CH, 0-^ -CH₂ -S-CH₂ -C-NH-CH2 -CII2 -S-CH₂ -CH₂ 一 O - C— 0 - 、〉一 NO:

0 0

ί匕 ¾J VI ： N_[S—（p—メ [·キシへ * ンシ ' ル）チォク * リコリル]アミノエチルスルフォ二ルェチル p—二ト ϋフエニルカル *♦ ネート化合物 V ( 4. 00 g、 11. 5 m in o 1 ) を無水ピリ

ジン（ 3 0 m l ) に溶かし、氷冷下にノ、' ラニトロフエニル

クロロフオルメート（ 2. 32 g、 11. 5 m m 0 1 ) を

加え 4 時問撹拌した。ピリジンを滅圧留去し、油状残渣に 1 規定塩酸（ 5 0 m l ) とジェチルェ一テルを加えて結晶チル Z ジェチルエーテルで再結晶し、白色結晶 4. 07 g ( 収率 6 9 % ) を得た。

なお、得られた化合物 VI ( リンカ一）の分析値は以下の通りであった。

R f₂ = 0. 3 7

融点 8 1 〜 8 2

C21H24 2O9S2 に関する理論値：

C = 49. 21 ； H = 4. 72 ； N = 5. 47

実測値：

C = 49. 30 ； H = 4. 72 ； N = 5. 25

NMR (CDC 1₃ )： 53.13 (s, 2H),

3.28 (t, J=6. OHz, 2H)， 3.47 (t, J=5.7Hz, 2H),

3.75 (q, J=6. OHz, 2H), 3.79 (s, 3H),

4.74(t,J=5.7Hz,2H),

6.84, 7.20 (ΑΑ' BB" pattern, Jortno =8.7)

7.25(111, 111),

7.40, 8.28 (ΑΑ' BB' pattern, Jortho =9.3).

F A B 質量分析： 513. 2 ( M + H⁺ )

( C₂₁H₂₄N₂0₉S₂ ： 5 12. 1 に関して算出）

実施例 2 リンカ一の合成（ B )

第 4 図に従い、別法によりリンカ一を合成した。

2 - 1 ：化合物 VII の合成 0

^ II

CH, 0-Q>-CH₂ O-C-NHCHa CH₂ B r ί匕 ^ VII ： N—（p—；！トキシへ♦ ンシ * ル才キシカルホ * ニル）アミノエチルフ * ロマイ Γ

2 — ブロモェチルアミン臭化水素塩（ 100. O g、 0. 4 9 m 0 1 ) をテトラヒドロフラン（ T H F ) 5 0 0 m l に溶解し、これに氷冷下ノヽ' ラメトキシベンジルアジドホルメート（ 111. 2 g、 0. 54 m 0 1 ) とトリエチルァ

ミン（ 148. 9 m l、 1. 07 m o l ) を加え、 1 0 時間撹拌した。生成する塩（トリヱチルァミンの臭化水素塩）を逋去した。更に、この塩を少量の T H F で洗浄し、涵液と合わせた。 T H F を滅圧留去した。残渣を醉酸ェチルに溶かし、分液ロートに移し、酢酸ェチル層を 5 % クェン酸で 3 度洗い、更に飽和食塩水で 3 度洗った。酢酸ェチル層をマイヤーフラスコに移し、酢酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾去し，酢酸ェチルを滅圧留去した。残渣に n — へキサンを加え、結晶化した。酢酸ェチル / n — へキサンより再結晶し、白色結晶 102. 5 g ( 収率 7 3 % ) を得た。なお、得られた化合物 VB の分析値は以下の通りであった。

R f₄ = 0. 3

融点 44. 5 ~ 45. 5

CnHi₄N0₃Br に関する理論値：

C = 45. 85 ； II = 4. 90 ； N = 4. 86 実測値： C = 45. 59 ； H = 4. 84 ; N = 4. 80

2 - 2 ：化合物 Π の合成

上記で得た化合物 VII ( 1 0 0 g, 0. 35 m o 1 ) と |3 — メルカブトエタノール（ 25. 0 m 1、 0. 35 m o 1 ) をジメチルフオルムアミド（ D M F ) 7 0 0 m 1 に溶かし、氷冷下にジシクロへキシルァミン（ 7 0 m l、 0. 35 m o 1 ) をく .わえ、室温にて 4 時間撹拌した。生成する塩 ( ジシクロへキシルァミンの臭化水素塩）を據去した。この塩を少量の D M F で洗浄し據液と合わせた。 D M F を減圧留去した。残渣を酢酸ェチルに溶かし、分液ロートに移し、酢酸ェチル層を 5 % クェン酸で 3 度洗い、さらに飽和食塩水で 3 度洗った。酢酸ェチル層をマイヤーフラスコに移し、舴酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリゥムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを ¾ 去し、酢酸ェチルを滅圧留去した。残渣に n —へキサンを加えて、結晶化した。さらに酢酸ェチル Z n — へキサンで再結晶化し、白色結晶 90. 5 g

( 収率 9 1 % ) を得た。なお、得られた化合物 II の融点は 4 1 ~ 41. 5でであった。

2 - 3 ：化合物 VI ( リンカ一）の合成

上記で得た化合物 Π を用いて、上記 1 一 3 と同様にして、化合物 m を合成し、次いで上記 1 一 5 と同様にして、化合物 V を合成し、さらに上記 1 一 6 と同様にして化合物 V】

( リンカ一）を合成した。

実施 ¾ 3 リンカ一の合成（ C ) 第 5 図に従い、リンカ一を合成した。

3 — 1 ：化合物 VM の合成

CH,

CHョ一 C一 0— C一 NHCH₂ CH₂ Br

I II CH₃ 0 ί匕合物 VI ： Ν—（tーフ♦ チルォキシカルホ，ニル）アミノエチルフ ' 口マイ Γ

ブロモェチルアミン臭化水素塩（ 1 O g、 4 9 m m o 1 ) を D M F l O O m l に溶かし、氷冷下、ジ一 t ーブチルジカルボネート（（ B o c ) ₂0 ) ( 11. 8 g、 5 4 m m o 1、 1. 1当量）とトリエチルァミン（ 10. 3 m l、 7

4 m m o 1、 1. 5当量）を加え室温にて 2 時間撹拌した。生成する塩（トリェチルァミンの臭化水素塩）を逋去し、この塩を D M F で洗浄し逋液と合わせた。 R f 2 = 0. 9 0

3 — 2 : 化合物 K の合成

CH,

CH₃ -C-O-C-NHCH2 CH₂ SCH₂ CH₂ OH

I II CH, 0 ィ匕 ^ !! ¾ Di ： 2N_ (t-フ* チルォキシカルホ * ニル）アミノエチル， 2' -Λイト * 口キシェチルスルフ '

3 — 1 で得た化合物 VI ( 4 9 m m o l ) の D M F 溶液 ( 逋液 + 洗浄液）に 0 — メルカブ卜エタノール（ 3. 5 m . 1 ) を加え、氷冷下にジシクロへキシルァミン（ 9. 8 in 1、 4 9 m m o l ) を加え室温にて 2 0 時間撹拌した。生成する塩（ジシクロへキシルァミンの臭化水素塩）を濾去し、この塩を D M F で洗浄し逋液と合わせた。 D M F を減圧留ました。残渣を酢酸ェチル溶液とし、 5 % クェン酸で 3 度洗い、さらに飽和食塩水で 3 度洗浄した。酢酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、さらに無水硫酸ナトリウムを據去した後、舴酸ェチルを減圧留去し、無色油状物として化合物 K を得た。

3 — 3 ：化物 X の合成

CH, 0

I II CH₃ -C-O-C-NH-CH2 CH₂ SCH₂ CH₂ OH

I II II CH₃ o 0

化合物 X ： fi (t-7*チル才キシカルホ'ニル）アミノエチルスルフ ίニルエタノール（ ¾J状物）

3 — 2 で得た化合物 K ( 4 9 m m o 1 ) をそのままメタノール（ 8 5 m 1 ) に溶かし、水（ 4 0 m 1 ) を加え、夕ングステン酸ナトリウム（ 4 9 m g ) を加え、撹拌しな力；ら、過酸化水素水（ 11. 3 πι 1 ) を滴下した。反応は発熱反応なので温度を 6 0 で以下に制御した。 1. 5時間攛拌後過剰の過酸化水素水を分解するために、 5 % パラジゥム Z炭素（ 0. 38 g ) を加え発泡が終了するまで撹拌した。 5 % パラジウム / 炭素を濾去後溶媒を滅圧留去し、汕状残渣を酢酸ェチル溶液とし、 5 % クェン酸で 3 回、 5 % 炭酸水素ナトリウムで 1 回、さらに飽和食塩水で 3 回洗つた。次いで酢酸ェチル溶液をマイヤーフラスコに移し、酢酸ェチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムを據去した後、酢酸ェチルを滅圧留去し、無色油状物として化合物 X 11. 79 g を得た b

3 — 4 : 化合物 XIの合成

0

HC 1 ·ΝΗ₂ CH₂ CH₂ S— CH₂ CH₂ OH

II

0 ί匕 ^ 1^ X1 = .ァミノェチルスルフォニルエタノール ' ]^ ¾

3 — 3 で得た化合物 X ( 4 9 m m o 1 ) に 4 N — H C 1 Z ジォキサン（ 4 0 m l ) を加え 3 0 分間攪拌処理した。生ずる結晶を ¾取し、エーテルで洗浄した。その後結晶を真空下乾燥した。なお得られる結晶（化合物 XI ) は 6. 6 g ( 3 5 m m o l ) 、収率は 7 1 % であった。

R f 5 = 0. 45

融点 2 5 5 で

C₄Hi2N0₃SCli₂ に関する理論値：

C = 25. 33 ； H = 6. 38 ； N = 7. 39 実測値：

C = 25. 24 ； H = 6. 50 ； N = 7. 43

3 — 5 : 化合物 V の合成上記工程で得られた化合物 XIを用いて、前述の 1 一 5 と同様の反応操作を行い化合物 V を合成した。

3 - 6 ：化合物 VI ( リンカ一）の合成上記で得た ί匕合物 V を用いて、上記 1 一 6 と同様にして化合物 VI ( リン .カー）を合成した。窭旆例 4 リンカ一結合用樹脂の合成

ョート' 酢酸樹脂の合成

ョード酔酸（ 7. 4 g, 4 0 m m o 1 ) の塩化メチレン溶液（ 5 0 m l ) にジシクロへキシルカルポジィミド（ 5 S, 0. 6eq) を加え氷冷下 3 0 分攪拌した。生ずる沈濺

( ジシクロへキシルゥレア）を濾去し、逋液をエチレンジアミンで処理を行い、末端にアミノエチル基が導入された PepSyn K resin ( ミリポア社製キーゼルグール系樹脂：ジメチルアクリルアミドービスァクロイルエチレンジアミンーァクリロイルザルコシンメチルエステル共重合体がキーゼルグール支持担体に保持されたもの）（ 2 0 g，アミノ基含量 0. 2 m m o l Z g ) に加え、カイザー [ Kaiser

] 試験が陰性になるまで緩やかに振盪した（ 2 時間）。次いで、樹脂をジメチルフオルムアミドと塩化メチレンでよく洗浄し、真空乾燥した。

実施例 5 合成ペプチドの精製（ 1 )

本発明に関わる合成ペプチドの精製法の有用性を検討するために、ペプチドとしてポリフエムシン Π を合成し、この精製を試みた。

まず、第 1 図に従い F m o c 固相合成法によりポリフエムシン Π を樹脂上にて合成し、さらにその精製をおこなつた。ポリフエムシン II は分子内に 2 個のジスノレフィド結合を有する C 末端がアミド化されたアミノ酸 1 8 残基力らなるペプチドである。なお、合成には分子内に存在するシスティン残基のチオール基はァセトアミドメチル（ A cm ) で保護したアミノ酸誘導体を用いた。

H - Arg- Arg -Trp - Cys ( Acm) -Phe- Ar g- Va l -

Cys ( Acm -Ty r - Ly s -G l y -Phe -Cy s ( Acm) -

Ty r- Arg -Lys -Cys k Acm) - Arg - N H 2

合成の最終段階で、固相樹脂（ 0. 2 m m o l ) に、上記実施例 1 において調製したリンカ一（ 5 1 2 m g、 5 当量）と N — ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（ 1 5 2 m g、 5 当量）を加え、ジメチルホルムアミド（ 1 0 m l ) 中にて 2 時間撹拌し、樹脂上に合成されたポリフヱムシンの N 末端側にリンカ一を導入した。次いで、固相樹脂（ 1 0 0 m g ) をエタンジチオール（ 0. 2 m l ) 、 m — クレゾ — ル（ 0. 5 m 1 ) 存在下、 1 M 卜リメチルシリルプロミド（ T M S B r ) — チオア二ソ一ル / トリフルォロ酢酸 ( T F A ) 系 [ N. F u j i i , A . Otaka, N. Sug i yama, M . Ha t a n 0 , and H . Y a j i m a , Ch em, Pharm . Bu l l . , 35 , 3880〗（ 1 0 m 1 ) にて、 0 で 2 時間脱保護基処理を行った。脱保護基反応後、 T M S B r および T F A を蒸発させ、そしてジェチルエーテルを加えてペプチドを粉末状とした。得られた粉末を 6 M 塩酸グァニジン含有 0. 4 M トリス塩酸緩衝液（ P H 7. 5 ) に溶解し、上記実施例 4 において得られたョ一ド酢酸樹脂 1 当量を充填した反応用容器に導入し、 2 時間循環させた。次いで、樹脂に対し 1 当量の 2 — メル力ブトエタノールを加えて 2 時間処理し、過剰のョード酢樹脂を 6 M塩酸グァニジン含有 0. 4 M トリス塩酸緩衝液 ( P H 7. 5 ) 、 5, 0 % 酢酸、および水でよく洗浄した。以上のようにして得られたペプチド結合樹脂を、 5 % アンモニァ溶液で 3 0 分間処理することにより、ぺプチドを樹脂より切断し、さらに 5 0 % 酢酸にて樹脂を洗浄し、洗液を切断するための試薬液に合わせた。得られた液体を凍結乾燥して、 .ペプチド粉末 14. 2 m g を得た。このべプチド粉末を高速液体クロマトグラフィー（ H P L C ) を用レ、て分析したところ、単一ビークを示すものであった（純度： > 9 9 % ) 。

固相法による合成直後の粗べプチドの II P L C におけるポリフエムシン Π の純度は約 6 9 % であり、メインピークの前にはショルダーピークも認められる。しかしながら、本発明に関わる精製法によって得られた精製ペプチドは単一ピークを有するものであった。また精製ペプチドはアミノ酸配列分析および質量分析 [ A c m -ボリフユムシン H ： 2 714. 1 ( M + H+ ) ] の結果，理論値と一致する値を

7J し /こ。 ( し 120 H, 85 N₄！ 0₂₄ S₄ に関して算出した。）卖施例 6 合成べプチ卜' の精製（ 2 )

次いで、本発明に関わる合成ぺブチドの精製法の有用性を、中程度の長さを有するペプチドであるヒトコレシストキニンの合成において試みた。

まず、実施例 5 の場合と同様に ^ 〗「 1 に従レ、 I'' in υ c [A] 相合成法により 3 3 残基のペプチドアミドであるヒ卜コレ相合成法により 3 3 残基のペプチドアミドであるヒトコレシストキニンを合成した。

H-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg- et-Ser- Ile— Val一 Lys一 Λ-sn一 teu一 G上 n_Asn一 Leu一 Asp一

Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp- Tyr-Met-Gly-Trp- et-Asp-Phe-NH₂

合成の最終段階で、固相樹脂（ 0. 2 m _{m 0} l ) に、上記実施例 1 において調製したリンカ一（ 5 1 2 m g、 5 当量）と N — ヒドロキシベンゾトリアゾール（ 1 5 2 m g、 5 当量）を加え、ジメチルホルムアミド（ 1 O m l ) 中にて 2 時間撹拌し、樹脂上に合成されたヒトコレシストキニンの N 末端にリンカ一を導入した。次いで、固相樹脂（ 1 O O m g ) をエタンジチオール（ 0. 2 m l ) 、 m — クレゾーノレ（ 0. 5m l ) 存在下、 1 M T M S B r — チオア二ソール Z トリフルォロ酢酸（ T F A ) 系（ 1 0 m l ) にて、 0 で 2 時間脱保護基処理を行った。脱保護基反応後、 T M S B r および T F A を蒸発させ、そしてジェチルエーテルを加えてべブチドを粉末状とした。得られた粉末を 6 M 塩酸グァニジン含有 0. 4 M トリス塩酸緩衝液（ p II 7. 5 ) に溶解し、上記実施例 4 において得られたョード酢酸樹脂 1 当量を充填した反応用容器に導入し、 2 間循環させた。次いで、樹脂に対し 1 当量の 2 — メルカプ卜ェタノ. ールを加えて 2 時間処理し、過剰のョード酢酸を不活性化した。 2 時間後反応用容器より溶液を滹去し、樹脂を 6 M 5 ) 、 5. 0 % 舴酸、および水でよく洗浄した。以上のようにして得られたペプチド結合樹脂を、 5 % アンモニア溶液で 3 0 分間処理することにより、樹脂よりペプチドを切断し、さらに 5 0 % 酢酸にて樹脂を洗浄し、洗液を切断するための試薬液に合わせた。得られた液体を凍結乾燥して、ぺブチド粉末 7. 9 m g を得た。このべプチド粉末を高速液体クロマトグラフィー（ H P L C ) を用いて分析したところ、ほぼ単一ピークを示すものであった（純度： 9 0 % 以上）。尚、固相法による合成直後の粗ペプチドの H P L C におけるビークより算出した非硫酸型コレシストキニンの純度は 2 9 % であった。本法によって精製された非硫酸型ヒトコレシストキニンの H P L C 保持時間は、 H P L C 精製法によるものと一致した。さらに得られた精製べプチドはアミノ酸配列分析および質量分析 [ 3865. 2 ( M

+ H+ ) ] の結果、理論値と一致する値を示した。（ d ₆ 7H₂₆₃N₅₁0₄₉S₃ に関して算出した。）

荬旆例 7 合成ペプチドの精製（ 3 )

さらに、本発明に関わる合成ペプチドの精製法の有用性を、中程度の長さを有する別のペプチドであるヒ卜成長ホルモン分泌因子の合成において試みた。

まず、実施例 5 の場合と同様に第 1 図に従い F m o c 固相合成法により 4 4 残基のペプチドアミドであるヒト成長ホルモン分泌因子を合成した。

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser - Tyr - Arg - tys - Val -し eu - Gly uln-Leu- Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln Asp-Ile-

Met- Ser-Arg- Gin - Gin - G 1 y - G 1 u - aer-Asn- Gl n- Glu-Arg- Gly-Ala- Ar g - A 1 a - Arg-Leu- NH₂

合成の最終段階で、固相樹脂（ 0. 2 m m o 1 ) に、上記実施例 1 において調製したリンカー（ 5 1 2 m g, 5 当量）と一.ヒド口キシべンゾトリァゾール ( 1 5 2 m g、 5 当量 ) を加え、ジメチルホルムアミド（ 1 0 m l ) 中にて 2 時間撹拌し、樹脂上に合成されたヒト成長ホルモン分泌因子の N 末端にリンカ一を導入した。次いで、固相樹脂 ( 1 0 0 m g ) をェタンジチォ一ル（ 0. 2 m l ) , πι ― クレゾール（ 0. 5 m l ) 存在下、 1 M T M S B r - チオア二ソ一ル T F A 系 ( 1 0 m 1 ) にて， 0 でで 2 時間脱保 n 基処理を行つた。脱保護基反応後、 T M S B r および T F A を蒸発させ、そしてジェチルエーテルを加えてべプチドを粉末状とした。得られた粉末を 6 M 塩酸グァニジン含有 0. 4 M トリス塩酸緩衝液（ P H 7. 5 ) に溶解し，上記実施例 4 において得られたョ一ド酢酸樹脂 1 当量を充填した反応用容器に導入し、 2 時間循環させた。次いで、樹脂に対し 1 当量の 2 — メルカプトェタノ一ルを加えて 2 時閭処理し、過剰のョ一ド酢酸をキヤツビングした < 2 時間後反応用容器より溶液を據去し樹脂を 6 M 塩酸グァニジン含有 0. 4 M トリス塩酸緩衝液 ( Π 7. 5 )、 5.

0 % 酢酸、および水でよく洗浄した。以上のようにして得られたペプチド結合樹脂を、 5 % アンモニア溶液で 3 0 分間処理することにより、ペプチドを樹脂より切断し、さらに 5 0 % 酢酸にて樹脂を洗浄し、洗液を切り出し液に合わせた。得られた液体を凍結乾燥して、ペプチド粉末 12. 6 m g を得た。このペプチド粉末を高速液体クロマトグラフィー（ H P L C ) を用いて分析したところ、ほぼ単一ピークを示すものであった（純度： 8 0 % 以上）。固相法による合成直後の粗ペプチドの H P L C におけるピークより算出したヒト成長ホルモン分泌因子の純度は 5 1 % であつた。本法によって精製されたヒト成長ホルモン分泌因子の H P L C 保持時間は、 H P L C 精製法によるものと一致した。さらに得られた精製ペプチドはアミノ酸配列分析および質量分析 [ 5037. 8 ( M + H+ ) ] の結果、理論値と一致する値を示した。（ C₂₁₅H₃₅₈N₇₂0₆₆Sに関して

算出した。）

なお、上記の実施例における分析に使用した機器、試薬等は以下のとおりである。

蒲相クロマトグラフィー

担体：シリカゲル G ( Kiesel -gel G, 西独メルク社製）溶媒系：

R f 1 ： CHC1₃ - eOH- H₂0 ( 8 : 3 : 1 ) の下層

R f₂ ： CHCl ₃ -MeOH ( 10 : 0. 5 )

R f 3 ： CHC1₃ - AcOH ( 19 : 1 )

R f 4 ： CHC 13 -Cyc 1 ohexan e ( 2 : 1 ) R f 5 ： n - BuOH - AcOH - Pyridine - H 2O ( 4 : 1 : 1 : 2)

核磁気共鳴スぺクトル

テトラメチルシランを内部標準とし、 Bruker AC- 300 スぺクトルメータ一（ブル力一社製）を用いた。

F A B 質量分析

Z A B S E マススペクトルメーター（ユージーアナリテイカル社製）を用いた。

ぺプチト' の純度検定

1 ) 高速液体クロマトグラフ（ H P L C )

高速液体クロマトグラフィ一モデル 6 0 0 E

( ミリボア社製）を用いた。

分析は w Bondasphere 5 C 1 8 カラム（ミリポア社製）を用い、 0. 1 % トリフルォロ酢酸を含む水一ァセトニトリル系により行なった。

2 ) ペプチドのアミノ酸 S列分析

ペプチドシーケンサ一モデル 4 3 1 A ( アプライドノイォシステムズ社製）及びプロテインシーケンサ一モデル 6 6 0 0 ( ミリポア社製）を用いた。モデルべプチドの合成

自動ペプチド合成機モデル 9 0 5 0 ( ミリポア社製）を ffl レゝ、 F m o c 固相合成法により合成した。

Claims

請求の範囲

1 . 固相法によるぺブチド合成において得られる末端基にアミノ基を有する目的とする成熟ぺブチドおよびェンドキャッビングされた目的以外の未成熟べプチドが混在する系から、末端に官能基を有するリンカーを用いて前記成熟べプチドを化学選択的に固相担体に固定化 · 分離することを特徴とする合成べプチドの精製法。

2 . a ) 固相法によるペプチド合成における最後のアミノ酸を導入した後、末端にアミノ基を有する目的とする成熟べプチドおよびェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟ぺブチドの双方が結合している固相に対し、

一端部に、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プロセスの後処理工程において酸性条件下で行われる脱保護基反応に安定でかつある他の条件で特異的に切断可能な結合をなす官能基を有し、さらに他端部に前記脱保護反応により活性な官能基を生成し得るリンカ一を添加して前記成熟べプチドを選択的に修飾し、

b ) 次いでべプチド合成プロセスにおける最終的な前記脱保護基反応を行い、これにより成熟ペプチドおよび未成熟ペプチドを固相より解離し、

c ) 前記最終的な脱保護基反応によって生成したリンカ一の前記他端部の官能基と反応して安定な結合を形成する官能基を有する化合物を固定化保持する別の固相を、前記 b ) 段階において得られたペプチド混合物と接触させて、該固相に成熟べプチドをリンカーを介して選択的に固定し、 d ) さらに、前記 c ) 段階において得られた成熟ぺブチドを固定した固相を、リンカ一と成熟ペプチドとの結合を特異的に切断する前記他の条件に曝し、成熟べプチドをリンカー結合固相より切断する

操作を含んでいることを特徴とする請求の範囲第 1 項に記載の合成べプチド精製方法。

3 . a ) 固相法によるペプチド合成における最後のアミノ酸を導入した後、末端にアミノ基を有する目的とする成熟べプチドおよびェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟ぺブチドの双方が結合している固相に対し、

一端部に、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プロセスにおいて酸性条件下で行われる脱保護基反応に安定でかつあるアルカリ性条件下で特異的に切断可能な結合をなす官能基を有し、さらに他端部に前記脱保護反応により S H 基を生成し得るリンカ一を添加して前記成熟べプチドを選択的に修飾し、

c ) 前記最終的な脱保護基反応によって生成したリンカ — の前記他端部の S H 基と反応して安定な結合を形成す.る化合物を固定化してなる固相に、前記）段階において得られたぺブチド混合物を接触させて、該固相に成熟べプチドをリンカ一を介して選択的に固定し、

d ) さらに、前記 c ) 段階において得られた成熟べプチドを固定した固相を、リンカ一と成熟ペプチドとの結合を特異的に切断するアル力リ性の条件下に曝し、成熟べプチドをリンカ一結合固相より切断する

操作を含んでいることを特徴とする請求の範囲第 1 項に記載の合成ぺブチド精製方法。

4. a ) 固相法によるペプチド合成における最後のアミノ酸を導入した後、末端にアミノ基を有する目的とする成熟ぺブチドおよびェンドキヤッビングされた目的以外の未成熟ぺブチドの双方が結合している固相に対し、

一端部に、前記成熟ペプチドの N 末端と、ペプチド合成プロセスにおいて酸性条件下で行われる脱保護基反応に安定でかつあるアル力リ性条件下で特異的に切断可能なゥレタン結合をなすアルコキシカルボネート結合を有し、さらに他端部に前記脱保護反応によりチオール基を生成し得るリンカーを添加して前記成熟べプチドを選択的に修飾し、 b ) 次いでべプチド合成プロセスにおける最終的な前記脱保護基反応を行い、これにより成熟ペプチドおよび未成熟べプチドを固相より切断すると共に、成熟べプチドに結合したリンカーの前記他端部側のチオール基の保護基をはずして，該リンカーの前記他端部にチオール基を生成さ.せ、 c ) 次に、ョード脂肪族力ルボン酸およびプロム脂肪族カルボン酸からなる群から選ばれたいずれかのものの誘導体が固定化されている固相担体に、前記 b ) 段階において得られたペプチド混合物を中性条件下で接触させ、脱ョードおよび脱ブロムのいずれかの反応を行って、安定な共有結合を形成して、該固相担体に成熟ペプチドをリンカ一を介して選択的に固定し、

d ) さらに、前記 c ) 段階において得られた成熟ぺブチドを固定し-た固相担体を、アルカリ性の条件下に曝し、成熟べプチドとリンカーとの結合部に 3 脱離反応を行わせ、成熟べプチドをリンカー結合固相担体より切断することにより目的とする成熟ぺブチド .を単離することを特徴とする請求の範囲第 1 項に記載の合成ぺブチド精製方法。

5. リンカ一が次の構造式（ ID )

0

II

X-NH- (CH₂ ) »一 S— CH₂— CH₂— 0— C一 Y (m)

II II

0 0

(ただし、式中、 nは 1〜 4の整数、 Xは

CH, -O- -CHa一 S— (CH₂ )„一 C一 Onは 1〜2)

II

0

CH CH₂ -S-CH₂—({ OCH.

CH₃一 C一 0— C一 NH— CH— CO— および I II CH₃ 0

CH₂ - S - CH₂ -^-0CH,

CH, -0-O-CH₂ -O-C-NH-CH-CO-

II

0

のいずれかであり、また Yは

-0- ~^Ν0: -0

OH ；および

F F 、

一 ο-^Λ- F のいずれかである。）

F =^F で表されるリンカ一を用いることを特徴とする請求の第 1 項ないし第 4 項のいずれかに記載の合成ペプチド精製方法。

6. 前記 c ) 段階において、一般式

I-(CH>-TrCOOH

R

( ただし、式中 R は H または炭素数 1 〜 6 のアルキル基、 n は 1 〜 6 の整数である。）で表されるョ一ド脂肪族カルボン酸および一般式

B r-^CH - COOH

I

R

( ただし、式中 R は H または炭素数 1 〜 6 のアルキル基、 n は 1 〜 6 の整数である。）で表されるブロム脂肪族カルボン酸からなる群から選ばれたいずれかのものの誘導体が固定化されている固相担体を用いるものである請求の範囲第 4 項に記載の合成べプチド精製方法。

7. 前記 c ) 段階において、一般式 I-(CH₂ -irCOOH

( ただし、式中、 n = 1 〜 6 である。）で表される ω — ョ - ド脂肪族カルボン酸および一般式

Br-(CH₂ COOH

( ただし、 -式中、 n = 1 〜 6 である。）で表される ω —ブロム脂肪族カルボン酸からなる群から選ばれたいずれかのものの誘導体が固定化されている固相担体を用いるものである請求の範囲第 4 項に記載の合成べプチド精製方法。

8. 前記 c ) 段階において、 I 一 C H₂C 0 0 H および B r 一 C H₂C 0 0 H のいずれかのものの誘導体が固定化されている固相担体を用いるものである請求の範囲第 4 項に記載の合成ペプチド精製方法。

9. 前記 c ) 段階において用いられる固相担体がその表面に次の構造式を有する分子鎖を結合させていることを特徴とする請求の範囲第 4 項に記載の合成べプチド精製方法。

I- CH)-₅-C-NH- CH₂ ^s-NH-

I II

R 0

( ただし、式中 n は 1 ~ 6、 m は 2 ~ 6、 R は H 及び炭素数 1 〜 6 のアルキル基のいずれかである。）

1 0. 前記 c ) 段階において用いられる固相担体がその表面に次の構造式を有する分子鏆を結合させていることを特徴とする請求の範囲第 4 項に記載の合成ペプチド精製方法 _c

B r-(CH)-0-C-NH-<CH₂ -ΗΓ-ΝΗ- I II

R 0

( ただし、式中 n は 1 ~ 6、 m は 2 〜 6、 R は H または炭素数 1 ~ 6 のアルキル基である。）

1 1. 前記. c ) 段階において用いられる固相担体がョード脂肪族カルボン酸およびブロム脂肪族カルボン酸からなる群から選ばれたいずれかのものの誘導体が固定化されている親水性表面を有する固相担体である請求の範囲第 4 項に記載の合成べプチド精製方法。

1 2. 前記 c ) 段階において用いられる固相担体がョード脂肪族カルボン酸およびブロム脂肪族カルボン酸からなる群から選ばれたいずれかのものの誘導体が固定化されている親水性樹脂を含浸させた水系で使用可能なキーゼルグール支持担体である請求の範囲第 4 項に記載の合成ペプチド精製方法。

1 3. 次の構造式（ III )

0

X-NH- (CH₂ ) „一 S— CH₂ — CH₂— 0— C一 Y (Π)

II II

0 0

(ただし、式中、 nは 1〜4の整数、 Xは

CH, -O- -CH2 -S- (CH₂ ) _n一 C一 (mは;!〜 2) ；

0

CH, CH₂ -S-CH₂ -<Q>-OCH,

CH。一 C— O— C一 NH— CH— CO— ；および

I II CH, 0 CH₃ -0-Q>-CH: 0-C-NH-

II

0

のいずれかであり、また Yは

-0- ^X>-N0₂ ；

；および

のいずれかである。）

で表されることを特徴とするリンカ

1 4. 次の構造式（ I )

0

II

X-NH- (CH₂ ) _n一 S— CH₂ -CH₂一 OH (I)

II

O

(ただし、式中 nは 1〜4の整数、 Xが Hのもの、およびその塩^、ならびに

CH₃

CH, -C-0-C- ；および

I II CH, 0

CII, 0- -CH₂ -0-C- のいずれかである。）

II

0 で表されることを特徴とするリンカ一合成中間体。

1 5. 次の構造式（ Π )

0

X-NH- (CH₂ ) o -S-CH₂ -CH₂ -OH (Π)

II

0

(ただし、式中、 η = 1〜4の整数、 Xは

CH, -0-{~\-CE₂ -S- (CH₂ ) _m -C- (mは 1〜2) ；

W II

0

CH, CH₂ -S-CH₂ -^-OCH, ；

CH,一 C一 0— C一 NH— CH— CO—

I II

CH, O

および

CH₂ -S-CH₂ -(~ -OCE- I CH, -O- -CH2 -O-C-NH-CH-CO- W II

o

のいずれかである。）

で表されることを特徴とするリンカ一合成中間体《

1 6. 次の構造式

0 0 0

fr^ II I III I III ^

CH, O-^-CHz SCH₂ C-NHCH₂ CH₂ SCH₂ CH₂ 0 - C - 0 - - -NO;

O

で表される N - [ S - ( p -メトキシベンジル）チォグリコリル ] アミノエチルスルフォニルェチル P —二トロフエ二ルカルボネー卜からなる請求の範囲第 1 3 項に記載のリン力一。

1 7. 次の構造式で表される新規化合物 N — （ p — メトキシベンジルォキシカルボニル）アミノエチルブ口マイド。

0

CH, 0-ζ -ΟΗ₂ 0-C-NHCH₂ CH₂ Br

1 8. 次の構造式で表される新規化合物 N — （ t 一ブチルォキシカルボニル）アミノエチルブ口マイド。

CH,

CH₃ -C-0-C-NHCH₂ CH₂ Br

I II CH, 0

1 9. 次の構造式で表される新規化合物 2 — （アミノエチルスルフォニル）エタノール（塩酸塩として確認）。

0

II

NH₂ CH₂ CH₂ S-CH₂ CH₂ OH

II

o

2 0. 次の構造式で表される新規化合物 2 — （アミノエチルスルフォニル）エタノール · 塩酸塩。

0

II

HC 1 · NH₂ CH₂ CH₂ S-CH₂ CH₂ OH

II

0

2 1. 表面に次の構造式を有する分子鎖を結合させたことを特徴とするリンカー結合用固相拒体。

I- CH)-^-C-NH-{CH₂ nr-NH- R 0 ( ただし、式中 n は；！〜 6、 m は 2 〜 6、 R は H または炭素数 1 〜 6 のアルキル基である。）

2 2 . 表面に次の構造式を有する分子鎖を結合させたことを特徴とするリンカー結合用固相担体。

( ただし、式中 n は 1 ~ 6、 m は 2 ~ 6、 R は H または炭素数 1 〜 6 のアルキル基である。）

2 3 . 前記分子鎖を結合させる固相担体が親水性を有する樹脂である請求の範囲第 2 1 項または第 2 2 項に記載のリンカー結合用固相担体。

2 4 . 前記分子鎖を結合させる固相担体が親水性樹脂を含浸された水系で使用可能なものである請求の範囲第 2 1 項または第 2 2 項に記載のリンカ一結合用固相担体。

2 5 . 前記分子鎖を結合させる固相担体が親水性樹脂を含浸された水系で使用可能なキーゼルグール支持担体である請求の範囲第 2 4 項に記載のリンカー結合用固相担体。