WO1993012807A1

WO1993012807A1 - Bone reinforcing factor, and food and drink containing said factor

Info

Publication number: WO1993012807A1
Application number: PCT/JP1992/001699
Authority: WO
Inventors: Yukihiro Takada; Naomichi Kobayashi; Masatoshi Yahiro
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Priority date: 1991-12-26
Filing date: 1992-12-25
Publication date: 1993-07-08
Also published as: NZ246211A; GR3026572T3; DE69224741T2; ATE163858T1; DE69224741D1; US5654019A; EP0573668B1; EP0573668A4; EP0573668A1; ES2115047T3; DK0573668T3

Description

明細書骨強化因子及び該因子舍有飲食品技術分野

本発明は、乳清由来の骨芽細胞増殖及び骨強化因子に関する。さらに、本発明は、このような因子を原料に加えてなる骨強化因子及び該因子含有骨強化食品等に関する。このようにして得られた飲食品等は、これを摂取した者の骨を強化し骨関節疾患、特に骨粗鬆症の予防あるいは治療に有用である , 背景技術

近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折及び腰痛等の各種骨疾患の患者が増加している。これらは、カルシウムの摂取不足、カルシウムの吸収能の低下、活性型ビタミン D ₃ 分泌の不足、ホルモンのアンバランス等によって生ずる力、その主な原因は次のように解明されている。

骨組織においては、たえず骨の生成と分解吸収が営まれている。若い時には骨生成と分解吸収のバランスがとれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが分解吸収に傾むく（アンカップリングと呼ぶ）。このアンカップリングが長年にわたって続くと骨組織がもろくなつて前記の疾患を生じる。従ってアンカツプリングを防ぐことかできれば骨粗鬆症、骨折、腰痛等を予防できると考えられている。

従来よりアンカップリングを防ぎ各種骨疾患の予防および治療の方法として 1 )食事によるカルシウムの補給、 2)軽い運動、 3)日光浴、 4)薬物療法、の 4種類が行われてきた。

食事によるカルシゥムの捕給にば炭酸力ルシゥム、乳酸力ルシゥム、燔酸カルシウム等のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻及び魚骨粉等の天然カルシゥム剤が使われている。しかし、これらのカルシウム塩の中には消化管内で不溶性の塩を形成し、充分体内に吸収されないものもある。

次に軽い運動についてはゲートボールや 30分程の散歩等が良いとされているが、体が弱ってくると軽い運動もやつかいなものである。まして寝たきり老人になるとほとんど運動ができなくなる。

日光浴についてはビタミン D ₃ の捕耠という点で良いとされているがこれだけでは不充分である。

最後の薬物療法には 1 α —ヒドロキシビタミン D ₃ 、カルシトニン製剤等が知られ、これらは、骨強化作用があるとされている。しかしこれらは、化学物質を有効成分とする医薬品そのものであって、食品素材として安全にしかも長期的にマイルドな条件で摂取して骨を強化できる物質ではない。

このように食品素材に長期的にマイルドに安全に使われる骨強化作用を有する物質についてその効力が確立されているものばまだ知られていない。発明の開示

従来、乳ば長期間多量に飲用しても安全であり、しかも骨強化作用があるとして知られている。本発明者らは、乳のこのような性質に着目し、乳、特に乳清に骨を強化する因子があるのでばないかと想定し、乳清蛋白中の骨強化因子の探索を続けてきた。すなわち、乳、特に乳清の蛋白質画分を分画し、その画分から骨を強化することのできる骨芽細胞増殖促進 · 骨強化画分をえようと試みた。その結果、乳清蛋白の水溶性画分から、逆浸透（ P 0 ) 膜または電気透析（ E D ) 等により乳清由来の塩を除いた蛋白及びべプチド混合物に骨を強化する作用があることを見いだした（特願平 2 - 309504号公報参照）。

本発明は、このような乳清蛋白の分画を続行し、さらに分画を行って物性値が明らかになった画分に骨芽細胞増殖促進 • 骨強化因子があることを見出し、本発明をなすに至ったものである。

従って、本発明の課題は、乳、特に乳清から骨強化作用を有する画分を分離抽出し、骨芽細胞増殖促進 · 骨強化因子を提供することにある。

さらに、本発明の課題は、このような因子を舍有させ、骨を強化し、骨関節疾患を予防あるいは治療することのできる飲食品、医薬及び飼料（以下、食品等という）を提供することにある。

本発明者らは、乳清蛋白の分画を前記のようにさらに試みたところ、次の画分に骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子が存在することを見出した。

すなわち、本発明は、次に示す骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子に関する。

乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を P H 2 〜 6の範囲、最終エタノール濃度 1 0 %以上で沈殺させることによつて得ることができ、分子量 5，000〜28 , 000ダルトン（ S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）である骨芽紺胞増殖活性及び骨強化活性因子。

乳清中に存在し、乳清またば乳清蛋白水溶液を PH 2 〜 6の範囲、最終ヱタノール濃度 10%以上で沈殺させ、その水溶性成分を採取することによって得ることができ、分子量 5, 000 〜28, 000ダルトン（ S D S —ポリアミドゲル電気泳動法による）である骨芽細胞増殖活性及び骨強化活性因子。

さらに、本発明ば、次のような骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子に関する。

乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させた水溶性面分を採取することによって得ることができ、分子量 5, 000〜 28, 000ダルトン（ S D.S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4〜 9の範囲にある骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子。

乳清中に存在し、乳清、乳清蛋白水溶液またばこれらを分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過された水溶性画分を 80°Cで 10分間加熱しても沈澱せずその上澄みを採取することによって得ることができ、分子量 5, 000〜28, 000 ダルトン（ S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4〜 9の範囲にある骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子。

乳清中に存在し、乳清、乳清蛋白水溶液またはこれらを分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過された水溶性画分を、 PH 1.5〜3.5 で食塩の最終濃度を 0.2M以上にして沈殺を生じさせ、この沈殺の水溶性画分を採取することによって得ることができ、分子量 5, 000〜 28, 000ダルトン ( S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4〜 9 の範囲にある骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子, 乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を 80てで 10分間加熱することによつて沈澱を生ずることなく上澄み中に存在し、この上澄み液を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過し透過させ、透過液を採取することによって得ることができ、分子量 5,000〜28, 000ダルトン（ S D S —ポリアクリルァミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4〜 9 の範囲にある骨芽細胞増殖促進および骨強化因子。

乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を PH1.5〜3.5 で食塩の最終濃度を 0.2M以上として沈澱を生じさせ、この沈殺の水溶性画分を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させることによって得ることのでき、分子量 5, 000〜28,000ダルトン（ S D S —ボリアクリルアミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4〜 9 の範囲にある骨芽細胞増殖促進および骨強化因子。

さらにまた、本発明は、このような骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子を舍有させてなる飲食品、医薬品及び飼料に関する。

本発明の骨芽細胞増殖 · 骨強化因子は、乳清または乳清蛋白水溶液にエタノールを加えて沈澱を生ぜしめ、この沈澱の水溶性成分を採取することにより得ることができる。

本発明におけるエタノール沈澱は PH 2〜 6、最終ヱタノ一ル濃度 10%以上で行うとよく、このようにすることによって分子量 5, 000〜28, 000の範囲の画分が得られる。さらにまた、本発明の骨芽細胞増殖促進および骨強化因子を製造するにば、乳清またば乳清蛋白の水溶液を 80 'Cで 10分間加熱させて生ずる沈殺を除き、得られる上清を分画分子量 30 : 000以上の限外濾過膜その他の膜で処理して透過する画分を採取する。あるいは、乳清または乳清蛋白質を酸性、特に pH 1 . 5〜3. 5 にしてさらに食塩の最終濃度を 0 . 2 M以上とすることによつて沈澱を生じさせ、この沈殺の水溶性画分を採取し、これを分画分子量 3万以上の限外濾過膜その他の膜で処理して透過する画分を採取する。または、乳清蛋白水溶液を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で処理して透過した画分を取り、これを加熱または食塩処理を行って採取する。得られる画分は、分子量 5，000〜28 , 000ダルトン（ S D S —ポリァクリルァミドゲル電気泳動法による）等電点 4〜 9 の画分となっている。

このような画分ば、後で実施例に示すように骨芽細胞増殖促進及び骨強化活性を有し、骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子ということができる。

さらに、本発明は、このようにして得られた骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子を含有せしめた食品、医薬及び飼料に関する。

本発明の骨芽細胞増殖及び骨強化因子の原料は乳が用いられる。

このようにな乳としては牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等の新鲜乳、粉乳、脱脂乳、還元乳等が挙げられる。そして、これらの乳から乳清（ホエー）を得、それから蛋白を採取した乳清蛋白を用いることが望ましい。乳清は、乳または脱脂乳に酸を加えるかまたは、レンネットを作用させて生じる凝固物を取り除いた透明な黄緑色の液体であって、チーズまたはカゼイン製造の副産物として通常得られている。また、乳清蛋白は、この乳清を限外濾過、逆浸透法、クロマトグラフィー、透析等によって処理することによって得られる蛋白で、このなかには、乳糖を除去し蛋白含有量を高めた乳清蛋白濃縮物も包含される。また蛋白はぺプチドであってもよい。また、蛋白を蛋白分解酵素で分解したものであってもよい。

本発明では、この乳清蛋白をエタノールで分画し、沈澱として得られる蛋白及びペプチドを使用する。このとき、エタノール最終濃度を 1 0 %以上とし、溶液の P Hが 2〜 6 であることが望ましい。

本発明の骨芽細胞^殖 · 骨強化因子について製造法を挙げて説明すると、まず乳清蛋白を水に溶解する。乳清蛋白としては、乳清蛋白濃縮物を用いることが好ましいし、またこれを酵素等で分解しペプチドとした状態であってもよい。また，蛋白を濃縮しない、乳清そのものであってもよい。この P Hは通常中性であるので、 P H 2〜 6 の酸性に調整し、これにエタノールを添加してェタノ一ルの最終濃度を 1 0 %以上、好適には 10〜60 %にして沈澱を生じさせる。本発明においては、この沈澱を用いることができるが、さらにこの沈澱に水を加えて得られる水溶性画分を用いるとさらに活性の高い骨芽細胞増殖因子及び骨強化因子を得ることができる。通常この水溶性画分は凍^乾燥して粉末とする。こ水溶性画分は、 S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると分子量 5 , 000 〜28, 000の範囲内に主要なバンドがみられた。

また、得られた沈澱画分をぺプシン、トリプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素で分解し、蛋白分解酵素分解物としても骨芽細胞増殖作用及び骨強化作用は存在する。

さらにまた、本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は- 前記の乳清またば乳清蛋白の水溶液を 80てで 10分間熱処理することによって生ずる沈殺を除き、上清中に舍有されているまた PH1.5〜3*5に調整して、さらに食塩の最終濃度を 0.2M 以上にすることによって沈殺を生じさせ、この沈殺の水溶性画分中にも舍有されている。

本発明者らば、この乳清及び乳清蛋白を熱処理し、その熱安定性を調べた。その結果 80て、 10分の処理でば、骨芽細胞増殖促進活性 · 骨強化活性は何等影響を受けることがなかつた。さらに 90'Cにおいて約 85%の骨芽細胞増殖促進が残存し、 95でにおいても約 70%の骨芽細胞増殖活性が残存した。この熱安定性の性質を用いることにより、乳清中の他の成分から骨芽細胞増殖活性 · 骨強化因子を分離することができる。すなわち、熱安定性の悪い成分ば熱処理を斤うことによって沈殺として除去できる。この熱処理時の PHは 3.5〜7.0が効率よく両者を分画できる PHである。

本発明における食塩処理は、 pH1.5〜pIi3.5で行うと有効である。食塩による分画は各 PHで沈殺形成に差があるが、 PH3.0 〜pH3.5の時食塩の最終濃度が 0.2M以上で沈澱する。

また、この食塩処理は、他のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニゥム塩、リン酸塩、 2価金属塩など'を用いることもできるし、この場合その塩類濃度及び PHば食塩の場合とば異なっていてもよい。

また、本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は、限外濾過においては分画分子量 3万以上の限外濾過膜を透過することが判った。通常この水溶性画分は、凍結乾燥して粉末にする。この水溶性画分は、 S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると分子量 5 , 000〜28 , 000の範囲内に主要なバンドがみられた。

また、得られた沈澱画分をペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素で限定分解し、蛋白分解酵素限定分解物としても骨芽細胞増殖および骨芽細胞増殖作用は残存する。

本発明では、このような骨芽細胞増殖促 '建 · 骨強化因子を食品等に舍有させることができる。

本発明の乳清蛋 0の骨芽細胞増殖促進 · 骨強化因子を舍有した食品等には、吸収性の良いカルシウム塩を添加することがが望ましい。このような吸収性のよいカルシウム塩には、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻あるいは牛乳由来のカルシウムまたはその塩、これらの含有物を例示することができる。

また、さらに本発明の乳清蛋白あるいは乳清蛋白のェタノ一ル分画物は、脱塩を行ってもよい。

従って、本発明の食品等は、乳清蛋白の分画物あるいはその脱塩画分、蛋白分解画分またはそれらに吸収性の良いカルシゥム塩を添加してなるもの等を舍有するものである。

本発明の骨芽細胞増殖促進 · 骨強化因子を含有せしめて得られる食品等の例を挙げると牛乳、ジュース、ゼリー、ノ、 ' ン、、スープ、ソーセージ、錠剤等があり、飼料にば飼料添加物、その他の飼料が、さらに医薬として、経口的に投与できる錠荊、顆粒荊、液剤等が挙げられる。

本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は、これを 100 〜500mg これらの飲食品等に添加舍有し、これを一日の摂取量とすることによって、骨を強化することができる。

また、本発明の骨芽細胞増殖促進および骨強化因子は、元来乳の成分であって、ラットによる動物試験でも急性毒性は認められなかった。図面な簡単な説明

第 1図は、実施例 3 の乳清蛋白及びべプチドのエタノール分画物の骨芽細胞増殖促進効果の結果を示したものである。通常の培地のみで骨芽細胞を培養したときの細胞增殖を 100 %としたときに、 10、 20、 40、 60 のエタノール濃度で乳清蛋白を分画したものを培地に添加したときの細胞増殖活性を ττ し。

第 2図ば、実施例 4の乳清蛋白及びべプチドのエタノ一ル分画物の骨強化作用を示したものである。ラット大腿骨の骨破断応力の測定結果を示した。

第 3図は、実施例 4の乳清蛋白及びべプチドのェタノ一ル分画物の骨強化作用を示したものである。ラット大腿骨の骨破断エネルギーの測定結果を示した。

第 4図は、実施例 13の骨芽細胞増殖促進効果を示す。

第 5図は、実施例 Uのコラーゲン合成促進作用を示す。第 6図は、実施例 15の骨粗鬆症モデルラットの骨破断力を K 3 。

第 7図は、実施例 16の骨粗鬆症モデルラットの骨破断エネルギ一を示す。発明を実施チるための最良の形態次に、本発明の乳清蛋白の製造法を実施例をあげて説明する。

実施例 1

乳清蛋白濃縮物からの乳清蛋白のエタノール分画物の調製乳清蛋白濃縮物を 15%の濃度になるように蒸留水に溶解しこの溶液 3 リットルに対してェタノールをそれぞれ 0.33、 0.75、 2、 4.5 リットル加えたものを作り、分画時のエタノールの最終濃度がそれぞれ 10、 20、 40、 60%となるようにした。その溶液を充分撹拌し、 4 'Cで 3 日間放置した。この溶液を 2,500 Gで 15分間遠心分離し、上清と沈殺に分画した。この沈澱画分に蒸留水を 500ml加えさらに 2,500 Gで 15分間遠心分離し水可溶性画分を得た。凍結乾燥し、乳清蛋白及びペプチドのエタノール分画物を含む粉末を得た。収量は分画時のエタノール濃度が、 10、 20、 40、 60%でそれぞれ 42、 23. Ί、 6 gであった。

この粉末を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画すると、分画時のエタノール濃度が 10〜 60%のものはどれも分子量 5,000〜28，000の範囲内に主要なバンドがみられた。実施例 2

未殺菌乳清からの乳清蛋白のヱタノ一ル分画物の調製未殺菌の乳清 20リットルに 6 N塩酸を加え、 pHを 4 に調整したものに、エタノール 80リットルを加え充分に撹拌した後- 4 'Cで 3 日間放置した。この溶 i を 2 , 500 Gで 15分間遠心分離し、上清と沈殺に分画した。この沈澱画分に蒸留水を 30リットル加えさらに 2, 500 Gで 15分間遠心分離し水可溶性画分を得た。この画分を R 0膜を用いて脱塩濃縮後、凍結乾燥し、乳清蛋白及びべプチドのェタノ一ル分画物を舍む粉末 42 gを得た。

この粉末を S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画すると、分子量 5 , 000〜28 , 000の範囲内に主要なバンドがみられた。

実施例 3

乳清蛋白及びペプチドのェタノ一ル分画物の骨芽細胞増殖促進効果

培養骨芽細胞様株（M C 3 T 3 — E 1 ) を 96穴の平底細胞培養プレートに撒き込み、 0. 3 %牛血清を含む or— M E M培地（Fl ow Labo l a tori es製）で培養した。培地 100 1 に対して、実施例 1 で得た粉末を 5 %の濃度に溶解した溶液を 10 l 添加し、 18時間培養した。その後、トリチウムでラベルしたチミジンを添加し、 2時間後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活性によって骨芽細胞の増殖活性を測定した。

試験結果を第 1図に示す。第 1図は、培地に乳清蛋白及びペプチドのエタノール分画物を加えなかったときの放射活性を 100 %としたときに、乳清蛋白及びべプチドのエタノール分画物を加えると何％の放射活性に相当するかによって細胞増殖活性を示している。分画時のエタノール濃度が 10〜 60% の間では、培地のみで培養したときに比べ、乳清蛋白及びべプチドのエタノ一ル分画物を添加すると細胞増殖活性が 200 〜 300%に増加していた。このことから、乳清蛋白エタノ一ル分画物には骨芽細胞増殖促進作用があることがわかった。実施例 4

乳清蛋白及びぺプチドのェタノ一ル分画物の骨強化作用試験動物に投与した飼料の組成を表一 1 に示す。

表一 1 試験に用いた飼料の組成（ g /100 g )

対照、シャム群乳清群蔗糖 49.3 49.3 カゼイン 20 18 コーンスターチ 15 15 セノレロース ' 5 5 トウモロコシ由 5 5 ビタミン混合（コリン舍む） 1.2 1.2 ミネラル混合 4.5 4.5 乳清蛋白ェタノ一ル分画物 2 実施例 2で得られた乳清蛋白エタノール分画物を表— 1 に示すようにカゼィンに置き換えて飼料に 2 %添加した。飼料中のカルシウムとリンの量はともにすべての群で飼料 100 g あたり 300mgとなるように調整し、カルシウム：リン比を 1 ： 1 とした。

動物は 6週令の S D系雌性ラットを用いた。骨粗鬆症モデルラットは、 1週間予備飼育した後に卵巣摘出手術を施し低カルシウム食で 1 ヶ月間飼育することにより作製した。その時、疑似手術を施し、卵巣を摘出しないシャムラットも 7匹作製した。 1試験群 7匹で試験を行った。

骨粗鬆症モデルラットを対照群と乳清蛋白ヱタノ一ル分画物を舍む飼料を投与した乳清群の 2群に分け、それぞれの被験飼料で 1 ヶ月間飼育した。

1 ヶ月後に各実験群のラットの大腿骨を摘出し、破断特性測定装置で骨強度を測定した。試験結果を第 2図及び第 3図に示す。第 2図に示したように大腿骨破断応力は対照群に比ベ乳清群で統計的に有意に高い値を示した。第 3図に示した骨破断エネルギーも乳清群で高い値を示した。このことから、乳清蛋白エタノ一ル分画物には骨強化作用があることがわかった。次に、本発明の実施例 2で得られた乳清蛋白エタノール分画物を舍有させた食品類について実施例を挙げて具体的に示す。

実施例 5

乳清蛋白エタノ一ル分画物入り飲料

混合異性化糖 15. 0 果汁 10. 0 クェン酸 0. 5 乳清蛋白エタク一ル分画物 0. 5 香料 0. 1 カルシウム 0. 1 水 73. 8 上記成分を混合し容器に充塡し、加熱殺菌して飲料を通常の製造法にて製造した。

実施例 6 ·

乳清萑白ェタノ一ル分画物入り錠剤

% 含水結晶ブドウ糖 73.5

乳清蛋白エタノ一ル分画物 20.0

カルシウム 5.0

シュガーエステル 1.0

香料 0.5 上記の成分を配合し、加圧成型して錠剤を通常の製造法にて製造した。

実施例 7

乳清タンパク濃縮物 15kgを 100リ 'ントルになるように溶解し、 PH4.5 に調整した後、 80°C 10分間蒸気にて加温した。これを、 5,000 x g、 10分間の遠心処理で沈澱を除去し、 80,リットルの溶液を得た。この 10リットルを凍結乾燥し、 530gの凍結乾燥粉末を得た（画分 A ) 。残りの 35リットルを PH3.0 にして、食塩濃度で 0.2Mにして生成する沈澱を 15,000 X g、 10分間の遠心により除去した。この上清に食塩濃度で 2.0M になるように調整し、生成する沈澱を 15,000 X g、 10分間の遠心により集めた。これを、 20リットルの蒸留水に懸濁させ, その 10リットルを逆浸透（ R 0 ) にて脱塩して凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末を得た（画分 B ) 。残りの 10リットルは分画分子量 10万の限外濾過（ U F ) 膜（ D D S社製）を用いて透過させ、透過液を分画分子量 3万の U F膜を透過させ、透過液を電気透圻により脱塩し、さらにこれを凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た（画分 C ) 。画分 Bおよび画分 Cの収量はそれぞれ、 1227 g、 540 gであった。

実施例 8

乳清タンパク濃縮物 7.5 kg を 50リットルになるように溶解し、 PH4.5 に調整した後、 80て、 10分間蒸気にて加温した。これを、分画分子量 50万の U F膜（ D D S钍製）を用いて透過させ、透過液 60リットルの半分を R 0膜により脱塩し凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た（画分 D ) 。残りの 30リットルを PH3.5に調整し食塩を最終濃度で 0.3Mにして 15,000 X _g、 10分間の遠心を行って生成する沈澱を除去した。この上清を食塩濃度が 2.0Mになるように調整し 15,000 X g、 10分間の遠心により沈殺を生ぜしめ、これを集め、凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た（画分 E ) 。画分 Dおよび画分 Eの収量はそれぞれ、 632 g、 235 gであった。

実施例 9

脱脂乳 200リットルに塩酸を加えて PH4.7 にしカゼインを沈殺させ、 5,000 X g、 20分間の遠心により乳清 185リットルを得た。これを、分画分子量 50万の U F膜（ D D S社製）で U F処理を行い、その透過液をさらに分画分子量 3万の ϋ F膜で U F処理を行うことにより脱塩とともに濃縮し、濃縮液を 6 リットル得た。この内 2 リツトルはそのまま凍結乾燥し（画分 F ) 、 2 リットルは、 ΡΗ6.3 にて 80 °C 10分間、加熱処理して 5, 000 X g、 10分間の遠心による上清を取りこれを凍結乾燥した（画分 G ) 。また残りの 2 リツトルは、 pHl.5 で食塩濃度が 3 Mになるように調整し生成する沈澱を 15, 000 X g、 10分間の遠心により集め、それを水に溶かした後電気当節により脱塩し凍結乾燥した（画分 H ) 。画分 F , H , G のそれぞれの収量は、それぞれ 340 g、 188 g . 202 gであつた。

実施例 1 0

乳情タンパク濃縮物 5.0kg を 50リツトルの水に溶解し、 PH を 3.5に調整し、最終食塩濃度が 3.0Mになるように調整した _c ここで沈澱する画分を 15, 000 X g、 10分間の遠心により回収し、これを 10リットルの水に溶解した。この 2 リットルを電気透折して凍結乾燥し（画分 I ) 、 8 リットルを PH4.5 に調整して 80'C 10分間の熱処理を行った。この内半分を 5,000 X g、 10分間の遠心により上清を取りこれを凍結乾燥した（画分 J ) 。また残りを分画分子量 50万の U F膜処理を行い、その透過液を逆浸透（ R O ) により脱塩して凍結乾燥した（画分 K ) 。画分 I , J , Kの収量は、それぞれ 430 g、 255g、 178 gであった。

実施例 1 1

乳清タンパク濃縮物 2.5k_g を 50リットルの水に溶解し、 PH を 3.0に調整し、最終食塩濃度が 3.0Mになるように調整した。ここで沈澱する画分を 15, 000 X g、 10分間の遠心により回収し、これを 10リットルの水に溶解した。これを分画分子量 50 万の U F膜処理を行い、その内半分の透過液を R 0により脱塩して凍結乾燥した（画分 L ) 。残りの半分は 80 10分間の熱処理を行い 5,000 X g、 10分間の遠心により上清を取りこれを凍結乾燥した（画分 M ) 。画分 L , Mの収量は、それぞれ 216 g、 175 gであった。

実施例 1 2

実施例 Ί ^11で得られた画分 A〜Mの凍結凍乾粉末を S D S -ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画すると、分子量 5,000〜28,000の範囲内に主要なバンドがみられた。

また、等電点電気泳動を行った所、等電点 4〜 9 に主要なバンドがみられた。

実施例 1 3

実施例 7〜11で得られた画分 A〜Mの骨芽細胞増殖促進効培養骨芽細胞様株（M C 3 T 3 — E 1 ) を 96穴の平底細胞培養プレートに撒き込み、 0.3 %牛血清を含む — M E M培地（Flow Labolatories製）で培養した。培地 100 1 に対して、実施例？〜 11で得られた画分 A〜Mを最終濃度で 5 μも /mK 50 iig Zmlになるように添加し、 18時間培養した。その後、トリチウムでラベルしたチミジンを添加し、 2時間後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活性によつて骨芽細胞の増殖活性を測定した。

試験結果を第 4図に示す。第 4図は、培地に実施例？〜 11 で得られた画分 A〜Mを加えなかったときの放射活性を 100 %としたときに、実施例 7〜11で得られた画分 A〜Mを加えると何％の放射活性に相当するかによって細胞増殖活性を示している。

画分 Aから Mを最終濃度で 50 g Zmlで作用させると、培地のみで培養した時に比べ、細胞増殖活性が 150%から 420 %まで増加していた。また、 5 U g m lで作用させても、細胞増殖活性がみられた。このことから、実施例 7 〜11で得られた画分 A〜Mには骨芽細胞増殖作用があることがわかった, また、培養骨芽細胞株 U M R 106 株においても同様な結果が得られた。

実施例 1 4

コラーゲン合成促進作用

骨芽細胞様株（ M C 3 T 3 — E 1 ) を、実施例 13で用いた培地に、実施例 7 〜11で得られた画分 A〜Mを最終濃度で 50 g Z m lになるように添加し、この培地で 37て、 3 日間培養し、合成されたコラーゲンの量を調べた。合成されたコラーゲンの量はハイドロキシプロリンを定量することにより求めた。ハイドロキシプロリンの定量は、細胞破砕液を 6 N—塩酸で含水し、 P —ジメチルァミノべンズアルデヒドを用いることにより行った。この結果を第 5図に示す。この結果、実施例 7 〜11で得られた画分 A〜Mを作用させると、培地のみで培養した時に比べてハイドロキシプロリン量が増加し、骨芽細胞のコラーゲン合成が促進されることが判明した。

実施例 1 5

骨強化作用 ' 実施例で得られた画分 C , E , Κ , Mを表— 2 に示すようにカゼインに置き換えて飼料に 2 %添加し、飼料を調製した。飼料中のカルシウムとリンの量はともにすべての群で飼料

100 gあたり 300mgとなるように調整し、カルシウム：リン比を 1 ： 1 とした。

動物は 6週齢の S D系雌性ラットを用いた。骨粗鬆症モデルラットは、 1週間予備飼育した後に卵巣摘出手術を施し低カルシウム食で 1 ヶ月間飼育することにより作製した。その時、擬似手術を施し、卵巣を摘出しないシャムラッ卜も 7匹作製した。 1試験群 7匹で試験を行った。

骨粗鬆症モデルラットを、それぞれの被験飼料で 1 ヶ月間飼育した。

1ヶ月後に各実験群のラットの大腿骨を摘出し、破断特性測定装置で骨強度を測定した。

表一 2 試験に用いた飼料の組成（gZlOOg) 対照シャム画分画分画分画分 i (con t) (Sham C E K M 蔗糖 49.3 49.3 49.3 49.3 49.3 49.3

20.0 20.0 18.0 18.0 18.0 18.0 n ノスター 15.0 15.0 15:0 15.0 15.0 15.0 も,! ·π -ス 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 卜ゥモ Π3シ由 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 tタミン混合物 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 (コサン舍む）

ミネラ混合物 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 乳清分画物

画分 C 2.0

E 2.0

K 2.0

M 2.0 試験結果を第 6図及び第 7図に示す。第 6図に示したように、大腿骨破断力は対照群（Com) に比べて画分 C , E , M群で統計的に有意に高い値を示した。第 7図で示した骨破断エネルギーも画分 C , E , Κ , M群で統計的に有意に高い値を示した。このことから、実施例で得られた画分 C , E , Κ, Mには骨強化作用があることがわかった。

次に本発明の実施例 7で得られた画分 Bを舍有させた食品類について実施例を挙げて具体的に示す。

実施例 1 6

飮料成分重量％

混合異性化糖 15.0

果汁 10.0

クェン酸 0.5

実施例による画分 0.5

香料 0.1

カノレシゥム 0.1

水 73.8 上記成分を混合し容器に充塡し、加熱殺菌して飲料を通常の製造法にて製造した。

実施例 1 7

錠剤成分重量％

含水結晶ブドウ糖 73.5

実施例による画分 20.0

カノレシゥム 5.0

シュガーエステノレ 1.0

香料 0.5 上記の成分を配合し、加圧成型して錠剤を通常の製造法にて製造した。産業上の利用可能性

本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子ならびにこれを含有させた食品類は、骨を強化する作用を有することから各種の骨関節疾患、特に骨粗鬆症の予防あるいは治療に有用である。

Claims

請求の範囲

1. 乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を PH 2 〜 6 の範囲、最終エタノール濃度 10 %以上で沈澱させることによって得ることができ、分子量 5, 000〜28, 000ダルトン

( S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）である骨芽細胞増殖活性及び骨強化活性因子。

. 乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を PH 2 〜 6 の範囲、最終ヱタノール濃度 10%以上で沈澱させ、その水溶性成分を採取することによって得ることができ、分子量

5 , 000〜 28 , 000ダルトン（ S D S —ポリアミドゲル電気泳動法による）である骨芽細胞増殖活性及び骨強化活性因子。 . 乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させた水溶性画分を採取することによって得る'ことができ、分子量 5, 000 〜 28 , 000ダルトン（ S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4 〜 9 の範囲にある骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子。

. 乳清中に存在し、乳清、乳清蛋白水溶液またはこれらを分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過された水溶性画分を 80'Cで 10分間加熱しても沈澱せずその上澄 . みを採取することによって得ることができ、分子量 5, 000 〜28, 000ダルトン（ S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4 〜 9 の範囲にある骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子。

. 乳清中に存在し、乳清、乳清蛋白水溶液またはこれらを分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過された水溶性画分を、 PH 1.5〜3.5 で食塩の最終濃度を 0.2M 以上にして沈籙を生じさせ、この沈毂の水溶性画分を採取することによって得ることができ、分画量 5, 000〜28，000 ダルトン（ S D S —ポリアクリルァミドゲル電気泳動法による）及び等電点 4〜 9の範囲にある骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子。

6 . 乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を 80°Cで 10 分間加熱することによって沈毅を生ずることなく上澄み中に存在し、この上澄み液を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過し透過させ、透過液を採取することによって得ることができ、分子量 5，000〜28, 000ダルトン（ S D S -ポリアクリルァミドゲル電気泳動法による）及び等電点〜 9の範囲にある骨芽細胞増殖促進および骨強化因子。

7. 乳清中に存在し、乳清または乳清蛋白水溶液を PH1.5〜 3.5 で食塩の最終濃度を 0.2M以上として沈澱を生じさせ、この沈鷇の水溶性画分を分画分子量 3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させることによって得ることのでき、分子量 5, 000〜28, 000ダルトン（ S D S —ポリアクリルァミドゲル電気泳動法による）および等電点 4〜 9の範囲にある骨芽細胞増殖促進および骨強化因子。

8. 請求の範囲 1 〜 Ίのいずれかに記載の骨芽細胞増殖促進および骨強化因子を舍有させてなる骨強化飲食品。

9 . 請求の範囲 1 〜 7のいずれかに記載の骨芽細胞増殖促進および骨強化园子を舍有させてなる骨疾患疾病予防及び治療剤。

. 請求の範囲 1 〜 7 のいずれかに記載の骨芽細胞増殖促進および骨強化因子を舍有させてなる骨強化飼料。