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WO1993017702A1 - Vaccin oral - Google Patents

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Publication number
WO1993017702A1
WO1993017702A1 PCT/JP1993/000264 JP9300264W WO9317702A1 WO 1993017702 A1 WO1993017702 A1 WO 1993017702A1 JP 9300264 W JP9300264 W JP 9300264W WO 9317702 A1 WO9317702 A1 WO 9317702A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipid
antigen
vaccine
oral administration
phosphatidylcholine
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/000264
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Seishi Tsuchiya
Yukihiko Aramaki
Toshifumi Hara
Hiroshi Kikuchi
Kiyoto Yachi
Tohru Ikeuchi
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to AU35758/93A priority Critical patent/AU3575893A/en
Priority to FI944052A priority patent/FI944052L/fi
Priority to EP93904375A priority patent/EP0640347A1/en
Priority to KR1019940703071A priority patent/KR950700083A/ko
Publication of WO1993017702A1 publication Critical patent/WO1993017702A1/ja
Priority to NO943251A priority patent/NO943251L/no

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    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • the present invention relates to an oral vaccine capable of efficiently producing antibodies after oral administration.
  • the oral vaccine of the present invention after oral administration to a living body, efficiently produces an antibody against the retained antigen, and can provide a protective effect against infection.
  • Oral vaccines have been studied using buffers, enteric-coated tablets, microparticles, nanoparticles, and adjuvants, but have not been successful yet (International Journal of Pharmaceutics, 75 »1 (1991), Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 16, 309 (1991)).
  • these reviews also introduce applications to oral pectin using ribosomes with orthodox membrane composition, but some increase in antibody titer was observed, but it is far from practical use. Is written.
  • An object of the present invention is to provide an oral pectin capable of efficiently producing an antibody against an antigen such as a retained microbial antigen or an attenuated microorganism after oral administration to a living body.
  • the present invention relates to a vaccine for oral administration which is a complex of an antigen and a lipid, and the complex comprises a glycolipid having mannose bound as a lipid and Z or phosphatidyl.
  • the antibody titer can also be increased by oral administration by containing the lipid, which is jirserin.
  • the complex can be classified into a case where a protein or glycoprotein serving as an antigen and a lipid are irregularly arranged by a hydrophobic bond and a Z or hydrogen bond, and a case where a lipid is difficult to form.
  • the lipid structure of the present invention is broad! ⁇ It should be interpreted in a meaningful manner.
  • the lipid has lipid and forms a membrane or the oil component and the water component form a membrane as a boundary.
  • the particles have a structure in which the polar groups of the amphiphile 1 are arranged toward the aqueous phase side of the interface, and specific examples include ribosomes, emulsions and water-soluble micelles.
  • the pectin of the present invention may optionally further contain an adjuvant substance.
  • antigens of microorganisms or attenuated microorganisms include influenza virus A, influenza virus B, influenza virus C, and rotavirus. , Cytomegalovirus, respiratory syncytial virus, adenovirus, AIDS virus (HIV), hepatitis C virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, ⁇ pox shingle virus, simple herpes virus types 1 and 2, ATL (adult ⁇ cell leukemia) ⁇ virus, coxsacki virus, enterovirus, sudden rash virus ( ⁇ V-6), measles virus, rubella virus, mumbus virus, polio virus, Japanese encephalitis virus, Rabies virus and other viruses, caries streptococci, cholera, Protein antigens of microorganisms such as Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, B.
  • HIV HIV
  • hepatitis C virus hepatitis A virus
  • hepatitis B virus ⁇ pox
  • a protein antigen of a microorganism In the case of fluenza virus, a single product or a mixture of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) can be exemplified as being retained in the oral vaccine of the present invention.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • antigens can be obtained from microorganisms by methods such as processing and purification, but can also be obtained by synthesis, and can also be produced by genetic engineering. Further, the antigen that can be retained by the oral vaccine of the present invention differs depending on the type of the lipid membrane structure. For example, there is no particular limitation on what the ribosome can hold, and examples thereof include water-soluble or fat-soluble microorganism antigens or attenuated microorganisms. In the case of emulsion, a fat-soluble antigen can be mentioned, and in the case of micelle, a poorly water-soluble antigen can be mentioned.
  • the phosphatidylserine according to the present invention includes phosphatidylserine derived from natural products such as soybean and egg yolk, hydrogenated phosphatidylserine obtained by hydrogenating these, and phosphatidylcholine derived from natural products such as soybean and egg yolk. Phosphatidylserine obtained by hydrogenation, hydrogenated phosphatidylserine obtained by hydrogenating these, and semi-synthesized or fully synthesized dimyristoylphosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylserine, distearoylphosphatidylserine, etc.
  • glycolipids to which mannose is bound include phosphatidylethanolamine derivatives having a mannose residue (Biocheimica et Biophysica Acta, 632 562 (1980)) and cholesterol derivatives (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4430 (1980)), dimannosyl diglyceride (Biochemical and Biophysical Research Communications, 110, 140 (1983)), mannobiose fatty acid esters and amides (JP-A-1-04088), phosphatidyl mannose, etc.
  • phosphatidylethanolamine derivatives having a mannose residue Biocheimica et Biophysica Acta, 632 562 (1980)
  • cholesterol derivatives Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4430 (1980)
  • dimannosyl diglyceride Biochemical and Biophysical Research Communications, 110, 140 (1983)
  • mannobiose fatty acid esters and amides JP-A-1-04088
  • mannan which is a polysaccharide
  • More specific compounds include 4-0- (6-0-eicosanoyl-yS-D-mannobiranosyl) -D-mannopyranose and N- (2-N'-cholesterylcarboxymethinole) canolebamil methylmannan Can be mentioned.
  • These lipids (phosphatidylserine) and glycolipids as ⁇ may be added alone or as a mixture to other lipoproteins mainly composed of phosphatidylcholines (lecithin), sphingomyelin, etc. These alone may form a lipid membrane structure.
  • the addition ratio of the present lipid, the phosphatidylserine used as a component in the construct and the glycolipid binding to mannose is not limited at all in the upper limit.
  • the lower limit is preferably 1% or more in terms of mole fraction based on the total lipid content, and it is desirable to add 5 to 50%.
  • phosphatidylcholines for example, phosphatidylcholine, hydrogenated phosphatidylcholine permanently added to phosphatidylcholine derived from natural products such as egg yolk, semi-synthetic or fully synthetic dimyristoyl phosphatidylcholine, semi-synthetic or Lipids such as fully synthesized dipalmitoyl phosphatidylcholine, semi-synthetic or fully synthetic distearoyl phosphatidylcholine, and sphingomyelin can be mentioned.
  • liposomes can be physically stabilized by adding a loading substance as another lipid.
  • a loading substance as another lipid.
  • charged lipids are dialkyl phosphate, diasylphosphatidic acid, stearylamine, phosphatidylglyceronole, phosphatidylinositol, phosphatidylethanol mononoramine or ionic surfactants (acidic or basic). it can.
  • sterols such as cholesterol may be added to increase the physical and biological stability of the ribosome.
  • an adjuvant substance may be further added in some cases.
  • adjuvant substances include, for example, (N-acetylmuramoyl) -L-aralanyl-D-isoglutamin (Muramildipeptide, MDP), which is the least effective substance of adjuvant substances in the cell wall of Mycobacterium tuberculosis, and derivatives thereof.
  • ribosomes can be used as the lipid membrane structure, and the liposome may be retained in the internal aqueous phase of the ribosome.
  • the addition amount of this muramyl dipeptide is not limited at all, and it can be added up to the saturation solubility in a 7-soluble solvent.
  • ribosome, emulsion, and misenore can be used as the lipid membrane structure.
  • the addition ratio to the total lipid component is not limited at all, but it is preferably 0.1% or more in terms of molar fraction, and it is preferable to add 1 to 30%.
  • the vaccine of the present invention is characterized in that it increases the antibody titer by oral administration and protects against infection, but the dose is 50 ⁇ g to 5 mg of influenza pectin per adult per person, usually 200 / g. To 2 mg. It is administered once, twice a week, twice twice a week, twice twice a week, or twice a month. It can also be applied to In addition, three, four, five, or six doses may be given at similar intervals. It is usually a single dose or two to four doses at monthly intervals. In the case of the hepatitis B vaccine, the dose is 20 / z g to 5 mg per adult, usually 50 // g to 2 mg. The usage can be considered in the same manner as the injection vaccine.
  • Vaccines against other antigens may be administered in the same amount to 20 times the amount of the vaccine for injection, and the dosage may be appropriately adjusted according to these.
  • the number may be appropriately increased or decreased depending on the immune responsiveness, age, etc. of the individual to whom the drug is administered.
  • phosphatidylcholine, phosphatidylserine, cholesterol monophosphate, and the like used in the present invention are biological components, they are considered to have low toxicity.
  • YM Rustmn et al. Have tested the acute toxicity of ribosomes prepared with egg yolk-derived phosphatidylcholine, phosphatidylserine and cholesterol, with a 50% lethal toxicity of 5.5 g / kg or more (Cancer Research 39, 1390-1395 ( 1979)).
  • a known method using an antigen of a microorganism or an attenuated microorganism itself, a substance such as lecithin and sphingomyelin, a glycolipid binding phosphatidylserine and Z or mannose, and, in some cases, an adjuvant substance, may be used.
  • a substance such as lecithin and sphingomyelin, a glycolipid binding phosphatidylserine and Z or mannose, and, in some cases, an adjuvant substance
  • an aqueous dispersion of liposomes is prepared according to the Annual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9, 467 (1980)).
  • Such a liposome may contain, as a stabilizer, sterols such as cholesterol, carbohydrates such as dialkyl phosphate, diacylphosphatidic acid, and stearylamine, and antioxidants such as natocopherol.
  • Microbial antigens or attenuated microorganisms themselves amphipathic substances such as lecithin and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween), oils such as oils, glycolipids that bind phosphatidylserine and / or mannose, depending on the case Further, using an adjuvant substance, an emulsion is prepared according to a known emulsion preparation method.
  • amphipathic substances such as lecithin and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween)
  • oils such as oils, glycolipids that bind phosphatidylserine and / or mannose, depending on the case
  • an adjuvant substance an emulsion is prepared according to a known emulsion preparation method.
  • Antimicrobial organisms or attenuated microbes themselves and surfactants such as polyoxetylene sorbitan fatty acid ester (Tween), fatty acid sodium, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc.
  • Aqueous solvent), a phosphatidinoreserin and / or a mannose-linked glycolipid, and optionally an adjuvant substance, and the aqueous micelle dispersion is prepared according to a known micelle preparation method. Prepare.
  • the oral vaccine of the present invention is capable of efficiently producing an antibody against a retained antigen after oral administration to a living body. Therefore, it has become possible to obtain oral pectin, which is a microbial antigen or attenuated microbe that has not been absorbed orally and could not produce the antibody.
  • the present invention was carried out by using bovine serum albumin (BSA), influenza virus antigen and hepatitis B virus antigen as a model of a microorganism protein antigen.
  • BSA bovine serum albumin
  • influenza virus antigen influenza virus antigen
  • hepatitis B virus antigen hepatitis B virus antigen
  • the present invention is not limited by the power described in the examples and the test examples.
  • an antigen protein is present by being released from the lipid membrane structure without being encapsulated in the lipid membrane structure. Depending on the method, it may be used after being removed by an operation such as ultracentrifugation or gel filtration, or may be used without being removed! ⁇ .
  • lipid dose is lOizmol and BSA
  • the amount will be 50iig (Example 1) to 400a (Example 4).
  • the prepared BSA-encapsulated liposome suspension or BSA-only aqueous solution as a control was used according to the schedule shown in Table 2, and BALB / c mice ( (Male, 7 weeks old) was orally administered 0.1 ml per dose (6 animals per group). Blood was collected by orbital blood sampling to measure antibody titers in blood and saliva.Saliva was anesthetized by intraperitoneally administering 0.1 mg ml of pentobarbital to mice at 0.2 mg / inl. After intraperitoneal administration of pilocarpine, a pastel pipette was introduced into the mouth and collected.
  • Test Example 2 3 SA administration: 50, 100. 400 g / 10 mice
  • the serum IgG, IgA and saliva IgA antibody titers were measured using the ELISA method described below.
  • the serum IgG and IgA antibody titers and the salivary IgA antibody titers when tested according to the schedule shown in Table 2 are shown in Tables 3-1 to 4 and Tables 4 to 3.
  • mice (dayl .2,3,4,5) blood g I g G3 ⁇ 4 body dish if in I g ⁇ &: 3 ⁇ 4
  • Test example 1 ⁇ Defeat 2 vs. Jeongjeong 2
  • Test Example 2 (eean ⁇ S..)
  • Tables 4-1 to 3 The results of Test Example 2 with five doses per week (Tables 4-1 to 3) were as follows. That is, in the control group, the BSA aqueous solution oral administration group, the serum IgG antibody titer tended to increase as in Test Example 1 and was not observed, and no difference was observed based on the administration method. On the other hand, in the ribosome oral administration group of Example, ⁇ *
  • the administration schedule showed a further tendency to increase the antibody titer h, indicating that the control BS
  • the antibody titer was clearly higher than that of the A aqueous solution group.
  • the serum IgA antibody titer did not change at all in the BSA aqueous solution group even when the dose was increased, as in Test Example 1, but the liposome-administered group showed a reliable antibody titer. The rise could be recognized.
  • the liposome-administered group clearly obtained a higher value than the BSA aqueous solution-administered group.
  • Test Example 2 Control ⁇ vs. Actual 3 ⁇ 4Example 1
  • BSA aqueous solution ribosome BSA aqueous solution ribosome day 1 1.0 i 0.0 1.0 ⁇ 0.0 1.0 ⁇ 0.0 1.0 ⁇ 0.0 day 36 1.0 r 0.0 8.4 ⁇ 2.7 1.0 ⁇ 0.0 1.5 t 0.5 day 46 1.7 ⁇ 0.3 8.0 ⁇ 0.0 1.0 ⁇ 0.0 3.2 ⁇ 1.4 day 3D 2.0 i 0.6 S.7 ⁇ 1.5 1.0 ⁇ 0.0 4.2 ⁇ 1.8
  • Test ⁇ 2 Control 4 vs. Jeongseon 4
  • Example 4 [Example 4] [Example 4] [Example 4] [Example 4] [Example 4] [Example 4] BSA aqueous ribosome BSA aqueous ribosome da 1 1.0 ⁇ 0.0 1.0 ⁇ 0.0 1.0 ⁇ 0.0 1.0 ⁇ 0.0 day 3D 1.7 ⁇ 0.6 9.3 ⁇ 2.5 1.0 ⁇ 0.0 4.0 ⁇ 2.0 da 46 2.2 ⁇ 0.9 9.7 ⁇ 2.3 1.0 0.0 5.0 t 3.2 day 3.0 ⁇ 1.2 9.9 ⁇ 1.7 1.0 ⁇ 0.0 ⁇ .7 ⁇ 2.3
  • influenza HA antigen see Table 5
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the dose of lipid is 10 ⁇ mol
  • the dose of HA antigen is (Example 5) to 80 ig (Example 8).
  • Test example Immunization method Bro administration day 3 ⁇ 4Blood day «1 solution detection
  • the serum IgG, IgA and secretory IgA antibody titers were measured in the same manner as BSA-encapsulated liposome-type lectin. It is recognized that it is excellent.
  • Distearoyl phosphatidylcholine (DSPC) (19.3 mg), cholesterol (Chol) (19.3 mg) and hydrogenated ⁇ Phosphatidylserine (HSPS) (18.2 mg) were dissolved by adding 50 ml of a mixture of form: methanol (9: 1 ratio) to the mixture. The solvent was distilled off while heating to 50 ° C using a reevaporator. Then, it was dried under vacuum for 2 hours to prepare a lipid film. To this was added 2 ml of antigen (see Table 7) suspended in phosphate buffered saline: ⁇ solution (PBS), and the mixture was stirred at 50 ° C for 10 minutes with a vortex mixer. This was heated to 50 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Control Example 421.6 ⁇ 206 These forms of oral pectin were stained by the negative staining method, and transmission electron microscopy was performed. It was confirmed that both Examples and Control Examples were in the form of ribosome.
  • hepatic vaccines using hepatic phosphatidylserine, dimyristoylphosphatidylserine, dimyristoylphosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylserine, distearoylphosphatidylserine, or bovine brain-derived phosphatidylserine as phosphatidylserine are also available. Can be prepared similarly.
  • a multilayer liposome was prepared in the same manner as in Example 9 using 2 ml of the zona virus inactivated antigen (2 mg / ml).
  • Distearoylphosphatidylcholine 32.Om cholesterol (19.3 mg) and dicetyl phosphate (5.5 m) were used as antigens in the same manner as in Example 9 using 2 ml of A / PR / 80I1N1) -derived infrenoleenza virus inactivated antigen (2 mg / nil). To prepare multilayer ribosomes.
  • the particle size of the oral vaccine obtained in Examples 12 and 13 was measured in the same manner as described above.
  • the weight average particle diameter soil standard deviation (thigh) was 443.7 ⁇ 208 (dish) in Example 12 and 450.7 ⁇ 211 (nm) in Example 13.
  • transmission electron microscopy was performed in the same manner, and it was confirmed that the cells had a liposome form.
  • an oral vaccine using a phosphatidylethanolamine derivative having a mannose residue, a cholesterol derivative having a mannose residue, dimannosyldiglyceride, or phosphatidizolemannose can be similarly prepared.
  • Multilayer liposome was produced in the same manner as in Example 9 using 20.0 mg of 7R-added large phosphatidizoleserine, 20.0 mg of distearoylphosphatidylcholine and 19.3 mg of cholesterol.
  • N-C2-N'-cholesteryl ruboxymethyl) rubamyl methinolemannan 10. Dissolve Om in 10 ml of PBS, add it to the above ribosome suspension, and keep the solution at 20 ° C. After stirring for 2 hours, an oral vaccine was obtained.
  • the S-average particle diameter standard deviation of the obtained oral vaccine was 476.9 ⁇ 206 (nm). It was also confirmed by transmission electron microscopy that the ribosome was in the form. confirmed.
  • the ribosome suspension containing the inactivated whole virus particles inactivated antigen (fixed with 0.05 formalin) obtained in Example 9 was subjected to BALB / cCr using a gastric tube for mice according to the schedule shown in Table 9.
  • Sic mice female, 7 weeks old
  • serum and intestinal lavage fluid were collected from each group of mice, and IgG and IgA antibody titers specific to those administered antigens were determined by ELISA. It was measured.
  • Antigen dose 400 Zl times Z mouse
  • the IgG and IgA antibody titers specific to the administered antigen in the serum and intestinal purified fluid were also measured using the ELISA assay kit (ELISAmate) of KPL (Kirlegaardk Perry Lab. Inc.). This was performed according to the method described in the protocol. As a result, production of IgA and IgG specific to the antigen in serum and production of IgA in intestinal washings were observed.
  • [ELISA method] add 2.5 1 g / ml of antigen dissolved in the coating buffer to each well of a 96-well microplate at 50 1 each, and let stand at room temperature for 1 hour to fix the antigen to the microplate. Discard the solution in each well, remove the solution completely by flicking the plate on a paper towel, add 100 ⁇ l of the blocking solution to each well, and allow to stand at room temperature for 5 minutes. After removing the solution in the wells, add 50 1 each of serum and intestinal lavage solution of 50 times each prepared from the mouse to each well, and allow to stand at room temperature for 1 hour. After removing the solution from the well, repeat washing 4 times with 200-300 ml of washing solution.
  • the antibody titer is calculated by calculating the absorbance at each dilution of a standard sample (sample with a known antibody titer) measured at the same time using the logit-log conversion formula shown in Equation 1. Plot the logarithmic value of, draw a standard line, and calculate the antibody titer of each sample based on the standard line.

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Description

経口ワクチン
技術分野
本発明は、 経口投与後効率的に抗体を産生せしめる経口ワクチンに関する。 本 発明の経口ワクチンは、 生体に経口投与後、 保持した抗原に対する抗体を効率的 に産生せしめ、 感染防御効果が得られるものである。
背景技術
現行のワクチンのほとんどは皮下に接種する注射剤であるが、 少頻度で起こる 副作用や投与時の疼痛が臨床上問題となっている。 これを改良するための様々な 投与方法の検討がなされてはいるが、 経口ワクチンは安全性と投与方法の便利さ から、 その棚開発が最も望まれている剤形である。
経口ワクチンの検討は、 従来より緩衝剤、 腸溶コーティング錠剤、 マイクロパ —ティクル、 ナノパーティクル、 アジュバント物質などを用いて行われてきたカ^ 未だ成功には至っていない（International Journal of Pharmaceutics, 75» 1 (1991)、 Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 16, 309 (1991) )。 ま た、 これら総説においては、 オーソドックスな膜組成のリボソームを用いた経口 ヮクチンへの応用例も紹介されてはいるが、 多少の抗体価の上昇は認められたも のの実用化にはほど遠いことが記されている。
いずれにしても、 従来技術においては、 経口投与後、 抗体を効率的に産生せし める手段はなかったといえる。
ホスファチジノレセリンで膜を修飾したリポソームを静脈注射した例は知られて おり （Cancer Research, 40, 4460 (1980))、 また、 マンノース誘導体またはマン ナン誘導体で膜を修飾したリボソームが肝臓や肺に集積性があるとの報告がある (Biochimica et Biophysica Acta 632, 562 (1980) 、 病態生理 6， 771 (1985))。 発明の開示
本発明は、 生体に経口投与後、 保持した微生物抗原もしくは弱毒化微生物等の 抗原に対する抗体を効率的に産生することができる経口ヮクチンを提供すること を目的とする。
本発明は、 抗原と脂質の複合体である経口投与用ワクチンに関する力、 この複 合体は、 脂質としてマンノースを結合している糖脂質および Zまたはホスファチ ジルセリンである憐脂質を含んでいることにより経口投与によっても抗体価を上 げることができる。
複合体は、抗原である蛋白質や糖蛋白質と脂質とが疎水結合および Zまたは水 素結合により不規則に配列した集合体である場合と脂質難造体である場合とに 分けることができる。
本発明の脂質 造体は広! ^、意味て澥釈すべきであり、 脂質を有し脂質が膜を 形成している場合または油成分と水成分が境界として膜を形成している場合があ り、 両親媒¾1旨質の極性基が界面の水相側に向かって配列した m 造を有する粒 子ということもでき、 具体的にはリボソーム、 ェマルジヨンあるいは水溶性ミセ ルが例示される。
' 本発明は、 この複合体が脂質としてマンノースを結合している糖脂質および/ またはホスファチジルセリンである燐脂質を含んでいることにより、 上記課題を 解決できるとの知見に基づいてなされたのである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のヮクチンは、 場合によっては更にァジュバント物質が添加されて 、て もよい。
ワクチンに使用する抗原はこの分野の研究者が良く理解しているものであるが、 例えば微生物の抗原もしくは弱毒化微生物としては、 ィンフルェンザウィルス A 型、 インフルエンザウイルス B型、 インフルエンザウイルス C型、 ロタウィルス、 サイトメガロウィルス、 R Sウィルス、 アデノウイルス、 エイズウイルス （H I V) 、 C型肝炎ウィルス、 A型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 τΚ痘帯状繊 ウィルス、単純へルぺスウィルス 1型 · 2型、 AT L (成人型 Τ細胞白血病） ゥ ィルス、 コクサツキ一ウィルス、 ェンテロウィルス、 突発性発疹ウィルス （ΗΗ V- 6 ) 、 麻疹ウィルス、 風疹ウィルス、 ムンブス （おたふくかぜ） ウィルス、 ポリオウイルス、 日本脳炎ウィルス、 狂犬病ウィルスなどのウィルス類、虫歯連 鎖球菌、 コレラ菌、 インフルエンザ菌、 肺炎球菌、百日咳菌、 ジフテリア菌、 破 傷風菌などの菌類、 クラミジァなどのリケッチア類、 マラリア病原虫などの原虫 類等の微生物の蛋白質抗原、 もしくはこれら微生物そのものの病原性を弱めた弱 毒化微生物等を挙げることができる。 なお、 微生物の蛋白質抗原としては、 イン フルェンザウィルスの場合には、 へマグルチニン （HA) ゃノイラミニダーゼ (NA) の単品もしくは混合物を、 本発明の経口ワクチンに保持させるものとし て例示することができる。
これらの抗原は、 微生物から加工、 精製する等の方法で得ることができるが、 合成によって得ることもでき、 さらに遺伝子工学的に製造することもできる。 また、 本発明の経口ワクチンが保持しうる抗原は、 脂質膜構造体の種類によつ ても異なる。 例えば、 リボソームが保持しうるものとしては特に制限がなく、 水 溶性あるいは脂溶性の微生物抗原もしくは弱毒化微生物等を挙げることができる。 またェマルジョンの場合には脂溶性の抗原を、 ミセルの場合には水難溶性の抗原 を保持可能なものとして挙げることができる。
本発明にかかわるホスファチジルセリンとしては、 大豆、 卵黄等の天然物に由 来するホスファチジルセリン、 これらを水素添加した水素添加ホスファチジルセ リン、 または、 大豆、 卵黄等の天然物に由来するホスファチジルコリンから半合 成により得られるホスファチジルセリン、 これらを水素添加した水素添加ホスフ ァチジルセリン、 さらに半合成もしくは全合成のジミリストィルホスファチジル セリン、 ジパルミ トイルホスファチジルセリン、 ジステアロイルホスファチジル セリン等が挙げられるカ^ 好ましくは水素添加ホスファチジルセリン、 ジパルミ トイルホスファチジルセリンおよびジステアロイルホスファチジルセリンである。 本発明にかかわるマンノースを結合している糖脂質としては、 マンノース残基 を有するホスファチジルエタノールアミンの誘導体 (Biocheimica et Biophysic a Acta, 632 562(1980) )やコレステロールの誘導体 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 77, 4430 (1980)) 、 ジマンノシルジグリセリ ド (Biochemical and Biophysical Research Communications, 110, 140 (1983) )、 マンノビオース脂肪酸エステル及 びアミ ド （特開平 1-104088号） 、 ホスファチジルマンノース等、 多糖であるマ ンナンに脂肪酸やコレステロールが部分的に置換された誘導体 （病態生理、 6, 771 (1985)) 等を挙げることができる。 さらに具体的な化合物としては、 4-0 - (6-0- エイコサノィル- yS-D- マンノビラノシル) -D -マンノピラノースおよび N- (2-N' -コレステリルカルボキシメチノレ） カノレバミルメチルマンナンを挙げること ができる。 これら^^としての憐脂質 （ホスファチジルセリン） および糖脂質は、 単品 もしくは混合物として、 ホスファチジルコリン類 （レシチン） 、 スフインゴミエ リン等の他の誠分を主体とした脂質難造体に添加すれば良いが、 これらのみ で脂質膜構造体を形成しても良い。
即ち、 ホスファチジルセリン類はこれ単独でもリボソームゃェマルジヨンを形 成することは可能であるし、 マンノースを結合している糖脂質 （マンノビオース 脂肪酸エステノ ァミ ド） はこれ単独でェマルジヨンゃミセルを形成することが 可能である。 したがって、 本発明においては、 本脂質 ,造体に 分として用 いられるホスファチジルセリン、 マンノースを結合している糖脂質の添加比率は 上限においては何ら限定されるものではない。下限については、 全脂質 分に 対しモル分率で 1 %以上とするのがよく、 5〜50%添加することが望ましい。 他の 分としては、 ホスファチジルコリン類 （レシチン） 、 例えば、 ホスフ ァチジルコリン、 や卵黄等の天然物由来のホスファチジルコリンに永素添加 した水素添加ホスファチジルコリン、 半合成もしくは全合成ジミリストイルホス ファチジルコリン、半合成もしくは全合成ジパルミ トイルホスファチジルコリン および半合成もしくは全合成ジステアロイルホスファチジルコリン等や、 スフィ ンゴミエリン等の脂質を挙げることができる。
また、他の脂質として荷 ¾!旨質を加えてリポソームの物理的安定化を図ること もできる。荷電脂質の例としては、 ジアルキルホスフェート、 ジァシルホスファ チジン酸、 ステアリルァミン、 ホスファチジルグリセローノレ、 ホスファチジルイ ノシトール、 ホスファチジルェタノ一ノレァミンまたはイオン性界面活性化剤 （酸 性または塩基性） を示すことができる。
さらに、 リボソームの物理的および生物学的安定を図るためにコレステロール 等のステロ一ル類を加えることもある。
本発明において、場合によっては更にアジュバント物質を添加することもでき る。 アジュバント物質としては、 例えば、 結核菌の細胞壁にあるアジュバント物 質の最少有効物質である（N-ァセチルムラモイル) -L-ァラニル -D-イソグルタミ ン （ムラミルジペプチド、 MD P) 並びにその誘導体、 例えば、 6-0-(2-テトラ デシルへキサデカノィル)- N-ァセチルムラモイル) -L-ァラニル -D-ィソグルタミ ン （B 30— MD P ) 、 6-0-(2- テトラデシルへキサデカノィル) -N-ァセチルムラ モイル) -L-ァラニル -D- グルタムアミ ド （B 30— MD Pアミ ド体） 、 Ν2-[ (Ν- Ύ セチルムラモイル) -L-ァラニル- D- イソグルタミニール： hl - ステアロイル- L - リジン （MD P— Lys [L18]) 等を挙げることができる。 τ溶性であるムラミルジ ペプチドの場合には、 脂質膜構造体としてはリボソームが適用でき、 リボソーム の内水相に保持させれば良い。 このムラミルジぺプチドの添加量は何ら限定され るものではなく、 7_Κ性溶媒への飽和溶解度まで添加可能である。 また脂溶性であ るムラミルジペプチド誘導体の場合には、 脂質膜構造体としてはリボソーム、 ェ マルジヨン、 ミセノレが適用できる。全脂質赚分に対する添加比率は何ら限定さ れるものではないが、 モル分率で 0. 1 %以上とするのがよく、 1〜30%添加する ことが好ましい。
本発明のワクチンは、 経口投与によつて抗体価をあげ感染を防御することに特 徵を有するが、'用量としては成人一人一回当りインフルエンザヮクチンで 50 β g 乃至 5mg、 通常は 200 /乃至 2mgである。 これを一回投与するか、 または一週間 間隔で 2回投与するか、 二週間間隔で 2回投与するか、 三週間間隔で' 2回投与す るか、 もしくは一か月間隔で 2回投与するように応用することもできる。 さらに、 同様な間隔で 3回投与、 4回投与、 5回投与、 6回投与することもある。通常は 単回投与または一か月間隔での 2〜4回投与である。 また、 B型肝炎ワクチンの 場合には用量としては成人一人一回当たり 20 /z g乃至 5mg通常は 50 // g乃至 2mg である。 用法としては注射用ワクチンと同様に考えることができる。 これ以外の 抗原に対するワクチンに関しても、 注射用のワクチンの同量から 20倍量で、 用法 もこれらに準じて適宜投与すれば良い。 もちろん、 投与される個人の免疫応答性 や年合等に応じて適宜増減する場合があつてもよい。
本発明で使用するホスファチジルコリン、 ホスファチジルセリンおよびコレス テロ一ノレ等は生体成分であることから毒性は低いと考えられる。 Y. M. Rustmnらが 卵黄由来のホスファチジルコリン、 ホスファチジルセリンおよびコレステロール で調製したリボソームの急性毒性を試験しているが、 50%致死毒性は 5. 5g/kg以 上である（Cancer Research 39， 1390〜1395 ( 1979) 参照） 。
次に本発明のヮクチンの製造法を説明する。 a ) リボソーム型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、 レシチン、 スフインゴミエリ ン等の 分物質と、 ホスファチジルセリン及び Zまたはマンノースを結合して いる糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用いて、 公知の方法 (例えば、 Annual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9， 467 (1980)) に従いリポソームの水分散液を調製する。 かかるリポソ一ムには安定化剤として コレステロール等のステロール類、 ジアルキルホスフェート、 ジァシルホスファ チジン酸、 ステアリルァミン等の荷 ¾1旨質及びな―トコフエロール等の酸化防止 剤を含ませても良い。
b) ェマルジヨン型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、 レシチン、 ポリオキシェチレ ンソルビタン脂肪酸エステル (Tween)等の両親媒性物質と、 油等の油脂と、 ホスファチジルセリンおよび またはマンノースを結合している糖脂質と、場合 によっては更にアジュパ'ント物質とを用い、 公知のェマルジヨン調製方法に従つ てェマルジョンを調製する。
c) ミセル型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒ィ匕微生物そのものと、 ポリォキシェチレンソルビ夕 ン脂肪酸エステル (Tween) 、 脂肪酸ナトリウム、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ 油等のミセゾ 成界面活性物質 （ミセノ 成臨界濃度以上の濃度で水性溶媒に加 える） と、 ホスファチジノレセリンおよび/またはマンノースを結合している糖脂 質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用い、 公知のミセル調製方法に 従ってミセルの水分散液を調製する。
本発明の経口ワクチンは、 生体に経口投与後、 保持した抗原に対する抗体を効 率的に産生せしめるものである。 したがって、 従来経口では吸収されず、 その抗 体産生が不可能であつた微生物抗原もしくは弱毒化微生物の経口ヮクチンを可能 ならしめたのである。
実施例
本発明を、 微生物の蛋白質抗原のモデルとして牛血清アルブミン （B S A) 並 びにィンフルェンザウイルス抗原および B型肝炎ゥィルス抗原を用 、て実施例及 び試験例により説明する力、 本発明はこれによって限定されるものではない。 なお、 実施例において、 脂質膜構造体に封入されることなく、 脂質膜構造体と遊 離して抗原蛋白の存在する場合ある G、は別な形の複合体が存在することもある力、 必要に応じてこれを超遠心分離法、 ゲル濾過法等の操作により除去して用いても、 除去せずに用 、てもかまわな! ^、。
実施例 1〜4 ：牛血清アルブミン (BSA) を保持したリボソーム型経口ワクチン a) BSA封入リボソームの調製
膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン (DSPC)： τ素添加ホスファチ ジルセリン （H-PS) ：コレステロール（Choi) =1 :1 :2 (モル比） からなる脂 質 160mgに、 クロ口ホルム：メタノール =9:1混液を 20ml加えて溶解し、 ロータ リ一エバポレーターを用いて 37°Cで加温しながら溶媒を留去した。 更に真空下で 2時間乾燥し、 リピドフィルムを調製した。 これに生理食塩液に溶解したそれぞ れの濃度の B S A (表 1参照） を 4ml加え、 ボルテックスミキサ一で 50°C、 10分 間の撹拌を行い、 多重層リボソーム （MLV、 multilamellar vesicle)を調製した。 引きつづき、 遠心分離 (35， 000 xg、 4°C、 20分） を行い、 上清を除去し、 沈殺 物に生理:^液 4ml を加えて再懸濁した。 この遠心分雜操作を 3回繰り返し、 遊 離の BSAを除去した。 このように調製したリボソーム懸濁液を 0.1 / mのポリ カーボネート製メンブランフィルターを用いて 3リットルの生理:^液に対して 12時間透析を行い、 粒子径が 0.1 izm以下のリボソームを除去して、 最終的に 表 1右に示す B S A封入リポソーム型経口ワクチンとした。
[表.13 リポソ- -ム処方
S貧量 B S Α«度 最終リポソ一ム SS¾ («g) ( «s/nl ) H質涪度（V«ol/*!) B S A¾度（is/al)
1 ISO 1.5 20 100
2 160 3.0 20 200 '
D 160 7.5 20 400
λ 160 15.0 20 ' 800 最終リボソーム懸濁液： DSPC/H-PS/Chol=54.4 /51.2/54.4 (mg)
マウス 1匹あたり 1回 0.5ml投与するので、 脂質投与量は lOizmol 、 BSA投与 量は 50iig (実施例 1) 〜400 a (実施例 4) となる。
b)免疫試験
調製した B S A封入リポソーム懸濁液もしくは対照例としての B S A単独水溶 液 （BS A投与量をリボソーム群と一致させた） を表 2に示すスケジュールに従 い、 冒ゾンデを用いて BALB/cマウス （雄、 7週齢） に 1回あたり 0.1mlず つ経口投与した （1群 6匹） 。血中及び唾液中の抗体価を測定するために、 血液 は眼窩採血により採取し、 唾液は、 マウスに 12mg/inlのペン卜バルビタールを 0. lml腹腔内投与して麻酔し、 0.2mg/inlピロカルピンを腹腔内投与した後、 パスッ ールピペットを口内に揷入し採取した。
[表 2] 免疫スケジュール 例 免疫方法 轻ロ投夸日 探血日 垂 S 取 S
1 5 较投 4 day 1,2, 3, 4, 5 day 6.11,18.26
2 1遇! 3ご 5回投与 day 1,8.15,22,29 day 35,46,55 day 55 _
の B S A投与置： 50, 100, 200, 400j g / 1回/マウス
試験例 2の 3 SA投与置： 50, 100. 400 g/10/マウス
C )抗体删定
血清中の I gG、 I g A及び唾液中の I g A抗体価は下に示す EL I SA法を 用いて測定した。
[EL I SA法]
炭駿緩衝液 (pH 4)に溶鮮した 100/ g/mlの BSAをマイクロプレートの各ゥ エルに 50 1ずつ加え、 4 °Cで一夜放置し抗原である BSAをマイクロプレート に固定した後、 0.05%の Tween 20を含むリン酸緩衝液 (PBST) 100/ l/wellで 3回 '洗浄し余分な BS Aを除去する。 次に、 3%スキムミルクでブロッキングを行い、 P B S Tで 3回洗浄し余分なスキムミルクを除去した後、 マゥスから した血 清を P B S Tで倍倍希釈したものを 50/d/wellずつ加え、 25°Cで 2時間ィンキュ ベーシヨンする。 PBST 100 1/wellで 3回洗浄して血清を除去し、 500ng/ml の濃度の抗マウス抗体 I gG、 あるいは I g Aコンジユゲート ·ホースラディッ シュ ·パーォキシダーゼ 50; lを各ゥエルに加え、 5°Cで 2時間インキュベー シヨンする。 PBST 100 / l/well で 3回洗净し、 余分な抗マウス抗体を除 去し、 D.(U5 %過¾化水素を含む 2, 2' - アジノービス（3-ェチルベンズチアゾリ ン -6-スルホン駿） （500ng/mi)を 50 1/weii加え、 3TCで 20分間インキュベーシ ョン後、 マイクロプレートリーダ一で 405IUD における吸光度を測定する。抗体価 (antibody titer)は、 吸光度が血清では 0.2、 唾液では 0.1を越える最大の希 倍率を 2nとし、 l og22n で表す。
dノ ¾ ^杲
表 2に示すスケジュールで試験した時の血清中 I gG、 I gA抗体価並びに唾 液中の I g A抗体価を表 3— 1〜 4及び表 4一 1〜 3に示す。
試験例 1の 5日間連続投与の場合 （表 3— 1〜 4 )、 対照例の B S A水溶液経 口投与群では血清中 I gG抗体価は の上昇傾向カヾ認められたものの、 実施例 の経ロワクチン投与群の方が明らかにその抗体価の上昇は大きかった。 また血清 中 I gA抗体価については、 BSA7 溶液群では投与量を増加させても舍くその 変化が認められなかったが、 経ロワクチン投与群では確実な抗体価の上昇を認め ることができた。
[表 3 - 例 1 ：対 ^例' 1 vs . 実 ½锊 1
B S Aの ¾与 S- 50 /マゥス ( dayl .2,3 ,4,5) 血 ¾ I g G¾体偭 皿 if中 I g Α& :¾
倒 1 ] [英 S例 11 [対 [実 ¾ ¾l ] B S A水 リボソーム 83 水^¾ リボソーム o&y 1 1.0 ± 0.0 1.0 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 day D 1.1 ± 0.6 3.1 0.7 未 Si定 未劍定 day 11 1.3 ± 0.4 3.3 1.3 1.0 ± 0.0 1.2 ± 0.2 day 18 2.0 ± 1.0 4.5 2.0 1.0 ÷ 0.0 2.0 ± 1.2 tky 26 1.7 ± 0.9 5.3 1.7 1.0 ± 0.0 2.5 ± i .5
(。《n ± S.D. ) [表 3— 2] ¾験例 1 ：对 ¾倒 2 vs. 実旌钶 2
B S Aの投与： £=100 g/マウス X 5 (dayl,2,3.4,5) 血 >丄 g &¾1体183 血¾中 I g ΑϊΛΐ?1Ε
[对菝例 2] [実 ¾ 2 ] [対 ^ 2] [実 g例 2 ] B S Α水溶 ¾ リボソーム B S A水瑢涪 リボソーム
1 1.0 + 0. .0 1.0 ± 0.0 1.0 t 0 • 0 1.0 ± 0. .0 day 6 1.7 + 0 .4 2.2 ± 0.4 未測定 未測定 day 11 1.3 0 .3 4.2 ± Γ.8 1.0 ± 0 .0 1.0 ± 0 .0 day 18 1.5 + 0 • 4 5.9 ± 2.1 1.0 ± 0 .0 1.1 ± 0 .1 day 26 3.2 0 .8 6.9 ± 2.5 1:0 t 0 .0 3.5 ÷ 1 .1
(nein ± S.D.)
[表 3— 3] 例 1 ：対 伢 3 vs. 実 钶3
B S Aの投与 S= 200<ug/マウス X5 (dayl.2,3.4,5) 血清中 I g G$i体価 血清中 I SA抗体僙
[封^例 3] [実旌例 3 ] [封親^ 3 ] [実 ¾倒 3] B S A水 液 リボソーム B S A水溶液 リボソーム day 1 1.0 + 0.0 1.0 + 0.0 1.0 ± 0 .0 1.0士 0, .0 day ο 1.0 + 0.0 3.0 + 0.0 未測定 未瀏定 day 11 1.5 0.8 . 5.0 + 1.2 1.0 ± 0 .0 1.5 ± 0. .5 dzy 18 2.7 + 1.8 7.5 + 0.8 1.0 ± 0 .0 3.3 ± 0, .8 day 26 3.0 + 0.5 8.0 + 1.2 1.0 ± 0 .0 3.7 ± 1. .6
S.D.)
[表 3— 4] ¾¾例 1 ：対 S例 4 vs. 実旌例 4
B S Aの投与置 =400 g/マウス X (dayl,2.3,4,5) 血 if中 I g G¾体価 皿洧中 I g Α¾体佰
-〔対 4] [実旄倒 4] [对菝例 4 ] 〔実 ½锊 4 ] 33 水笞¾ リボソーム BSA水箨铉 リボソーム day 1 1 .0 + 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0. .0 1.0 ± 0 .0 day 6 1 .5 0.5 3.3 ± 0. 未測定 未芻定 day 11 1. .5 + 0.5 5.0 ± 2.5 1.0 ± 0. .0 1.1 ± 0. .2 day 18 2 .0 + 1.7 6.5 ± 2.4 1.0 ± 0. .0 2.9 ± 1. . day 25 2. ,δ 1.5 6.5 i 2.0 1.0 ± 0； •0 3.2 ± 1.
(eean ± S. .) 試験例 2の 1週間ごと 5回投与の場合 （表 4— 1〜 3 ) の結果は以下の通りで あった。即ち、 対照例の BS A水溶液経口投与群では、 血清中 I gG抗体価は試 験例 1と同様の の上昇傾向しカヽ認められず、 投与方法に基づく差も特に認め られなかった。 これに対して、 実施例のリボソーム経口投与群では、 試験例 2の < *
投与スケジュールの方が更にその抗体価力 h昇する傾向力認められ、 対照の B S
n
A水溶液群と比較して明らかに抗体価力稿かった。 また血清中 I gA抗体価につ いては、 BS A水溶液群では、 試験例 1と同様、 投与量を増加させても全くその 変化が認められなかったが、 リポソーム投与群では確実な抗体価の上昇を認める ことができた。 唾液中 I gA抗体価についても、 B S A水溶液投与群に比べ、 明 らカ、にリポソーム投与群の方が高い価が得られた。
[表 4一 1 ]試験例 2 ：対照^ vs. 実 ¾例 1
B S Aの投与 fi = 0 p. g/マウス X (dayl.8,15,22,29) 血清中 I g G抗佑価 血清中 I g A¾倖価
[対照例 1 ] [実 ¾例 1 ] [対照例 1 ] [実 ]
B S A水溶液 リボソーム B S A水溶液 リボソーム day 1 1.0 i 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 day 36 1.0 r 0.0 8.4 ± 2.7 1.0 ± 0.0 1.5 t 0.5 day 46 1.7 ± 0.3 8.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 3.2 ± 1.4 day 3D 2.0 i 0.6 S.7 ± 1.5 1.0 ± 0.0 4.2 ± 1.8
(aean ： i S.D.)
I g A抗体価
[対照例 1 ] [実 ¾例 1 ]
B S A水箨液 リボ、ノーム
0.2 ± 0.4 0.9 ± 0.7 (mean ± S.D.) [表 4一 2 試 ¾例 2 ：对照例 2 vs. 実 ¾例 2
B S Aの投与 S= l O OjLi g/マウス X5 (dayl, 8,15, 22,29) 血清^ I g G钪侓値 血清中 I g A¾体偭
[対 ^洌 2] [実 ¾例 2] [対照例 2] [実 ¾倒 2 ] B S A水溶液 リボソーム B S A水溶 リボソーム day 1 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 i 0.0 1 .0 4* 0 .0 day 3b 1.0 ± 0.0 5.0 ± 2:9 1.0 ± 0.0 1 .9 1 .7 day 4D 1.0 ± 0.0 8.8 ± 1.6 1.0 ± 0.0 3 .2 1 .8 day DO 2.7 i 0.8 7.8 ± 3.2 1.0 ± 0.0 4 .4 + 2 .1
(eeati ± S .D,
^液中 I g A¾t体価
[対 例 1 ] [実旌例 1 ]
寸
3 S A水溶液 リポソー 2厶
day 3D 0.S ± 0.8 1.3 ± 2.1 (sean ί - S.D.)
[表 4一 3 ] 試験^ 2 ：対照例 4 vs. 実旌例 4
B S Aの投与量 =4 O Oii g/マウス X (dayl.8.15.22.29) 皿淸中 I g G抗体偌 血清中 I g A¾倖値
[対 ¾例 4] [実旌^ 4】 [対 例 4 ] [実 ¾钶 4] B S A水箨¾ リボソーム B S A水溶液 リボソーム da 1 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 day 3D 1.7 ± 0.6 9.3 ± 2.5 1.0 ± 0.0 4.0 ± 2.0 da 46 2.2 ± 0.9 9.7 ± 2.3 1.0 ± 0.0 5.0 t 3.2 day 3.0 ± 1.2 9.9 ± 1.7 1.0 ± 0.0 δ.7 ± 2.3
( mean S.D.) 睡¾中 I g A抗体偭
i i m4 ]
B SA水箨 s リボソーム
day DO 0.1 ± 0.0 1.5 ± 0.8 (ae π ± S.D.) 以上から、 モデル抗原として牛血清アルブミン （BSA) を用いて製造された 本発明のワクチンは、 経口投与することにより、 生体に対して効率的に抗体を産 生せしめることが明らかとなつた。
実施例 5〜8 ：
a) インフルェンザ H A抗原封入リポソ一ム型経ロワクチンの調製
膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン (DSPC) : τ素添加ホスファチ ジルセリン (Η- PS)：コレステロール (Chol)=l : 1 : 2 (モル比） からなる脂質 160mgに、 クロ口ホルム：メタノール = 9 ： 1混液を 20ml加えて溶解し、 ロータ リ一エバポレーターを用いて 37°Cで加温しながら溶媒を留去する。 更に真空下で 2時間乾燥し、 リピドフィルムを調製する。 これにリン酸緩衝化生理食塩液 （P BS、 pH 7.4) に分散したそれぞれの濃度のインフルエンザ HA抗原 （表 5参照） を 4ml加え、 ボルテックスミキサーで 10分間の撹拌を行い、 多重層リボソーム (MLV、 multilamellar vesicle)を調製する。最終的には、 これらを PBSにより 3.5倍希釈して、 表 5右に示すインフルエンザ HA抗原封入リボソーム型経ロワ クチンとする。
[表 5 ] リポソーム処方 実 ¾例 詣質 i HA¾度 終リポソ —ム 液 "Τ
(yg/.l) 1) HA¾度（ 1) つ 180 70 20 20
6 160 140 20 40
7 ISO 280 20 80
8 150 560 - 20 160 最終リボソーム懸濁液： DSPC/H-PS/Chol=54.4/51.2/54.4 (mg)
マウス 1匹あたり 1回 0.5ml投与するので、 脂質投与量は lO^mol 、 HA抗原 投与量は (実施例 5) 〜80i g (実施例 8) となる。
b) 免疫試験
調製したインフルェンザ H A抗原入リポソ一ム懸濁液もしくは対照例としての HA抗原単独の PBS液 （HA抗原投与量をリボソーム群と一致させる） を表 6 に示すスケジュールに従い、 胃ゾンデ用いて BALB/cマウス （雄、 7週齢に 1回あたり 0.5mlずつ経口投与する （1群 6匹） 。 血中及び唾液中の抗体価を測 定するために、 血液は眼窩採血により採取し、 唾液は、 マウスに 12mg/lのペント バルピタールを 0.1ml 内投与して麻酔し、 0.2mg/mlピロカルピンを腹腔内投 与した後、 パスツールピぺットを口内に揷入し採取する。
[表 6 ] 免疫スケジュール
試験例 免疫方法 轻ロ投与日 ¾血日 «1液探取 B
― 3 — 1通! §ごと 5回投与 day 1,8.15,22,23 _ day 36,46,55 _day 55 _
試験例 3の HA抗原投与量： 10、20、40、80 回/マウス
c)抗体価測定
血清中の I g G、 I g A及び分泌型の I g A抗体価の測定は、 B S A封入リポ ソ一厶型ヮクチンの場合と同様に行 H A抗原封入リポソ一ムの抗体価の上昇 か'優れていることが認められる。
実施例ト 11 ：
a) インフルエンザウイルス抗原または B型肝炎ゥィルス抗原封入リボソーム 型経口ワクチンの調製
ジステアロイルホスファチジルコリン (DSPC)19.3mg、 コレステロール (Chol)19. 3mgおよび水素添加 ^ホスファチジルセリン (HSPS) 18.2mgにクロ口ホルム： メタノール混液 (9:1 體比） を 50ml加えて溶解し、 ロー夕リーエバポレーター を用いて 50°Cに加温しながら溶媒を留去した。次いで真空下で 2時間乾燥しリピ ドフイルムを調製した。 これにリン酸緩衝化生理:^液 (PBS) に懸濁した抗 原 （表 7参照） を 2ml加え、 ボルテックスミキサーで 50° (：、 10分間撹拌した。 こ れを 50°Cに加温しつつ、 孔径 0.6 /のポリカーボネート製メンブランフィルター で 2回加温濾過し、 多重層リボソームを調製した。 表一 7 実施例 9 インフルエンザウイルス不活化抗原 A/PR/8(H1N1 )株 2mg/m 実施例 1 0 インフノレェンザウィルス H A抗原 A/PR/8(H1N1 )株 2mg/ml 実施例 1 1 B型肝炎ゥィルス抗原 酵母 （遺伝子組換） 0. 4mg/ml 得られたリボソーム型経口ワクチンの粒子径を準弾性光散乱法 （ダイナミック 光散乱計 DLS- 700 、 大塚電子株式会社製） により測定した。結果を表 8に示す。 抗原蛋白の不在下で調製したリボソームを対照例とした。 表一 8 重量平均粒子径士標準偏差 (nm)
実施例 9 408. 2 ± 198
実施例 1 0 482. 5 土 213
実施例 1 1 443. 1 ± 201
対照例 421. 6 ± 206 これらの経口ヮクチンの形態をネガティブ染色法により染色し、 透過型電子顕 微鏡観察を行つた。 実施例と対照例ともリボソームとしての形態をしていること を確認した。
ホスファチジルセリンとして、 7素添加卵黄ホスファチジゾレセリン、 ジミ リス トイルホスファチジルセリン、 ジミ リストイルホスファチジルセリン、 ジパルミ トイルホスファチジルセリン、 ジステアロイルホスファチジルセリンもしくは牛 脳由来のホスファチジルセリンを用 、た経ロワクチンも同様に調製できる。
実施例 1 2 ：
4-0-( 6-0- エイコサノィル- ^ -D- マンノビラノシル) -D-マンノピラノース 6. 4mg、 ジステアロイルホスファチジルコリン 32. Omg、 コレステロール 19. 3 mg、ジセチルホスフエ一ト 5. 5mgを、 抗原として A/PR/8(H1N1 )由来のィンフルェ ンザウィルス不活化抗原 (2mg/ml)を 2ml用いて実施例 9と同様にして多重層リポ ソームを調製した。
実施例 1 3 ： 分にマンナン誘導体を含有する経口ヮクチンの調製
ジステアロイルホスファチジルコリン 32. Om コレステロール 19.3mgおよびジ セチルリン酸 5.5m を、 抗原として A/PR/80I1N1)由来のインフノレェンザウィルス 不活化抗原 (2mg/nil)を 2ml用いて実施例 9と同様にして多重層リボソームを調製 した。
P B S 10mlに N-(2- N' -コレステリルカゾレボキシァミノメチル) カルボキシメチ ルマンナン lO. Omgを溶解し、 これを上記のリボソーム懸濁液に加え、 液温を 20 °Cに保ちながら 2時間攪拌し、 皿分にマンナン誘導体を含有するリポソーム型 経口ワクチンを得た。
実施例 1 2および 1 3で得た経口ワクチンの粒子径を前記と同様にして測定し た。重量平均粒子径土標準偏差 (腿)は実施例 1 2が 443. 7 ±208 (皿)実施例 1 3 が 450. 7 ±211 (nm)であった。 また、 透過型電子顕微鏡観察を同様に行ってリポ ソームとしての形態を取っていることを確認した。
マンノース誘導体として、 マンノース残基を有するホスファチジルェ夕ノール ァミンの誘導体、 マンノース残基を有するコレステロールの誘導体、 ジマンノシ ルジグリセリ ド、 ホスファチジゾレマンノースを用いる経口ワクチンも同様に調製 できる。
実施例 1 ：膜成分にマンノース誘導体またはマンナン誘導体およびホスファチ ジルセリンを含有する経口ヮクチンの調製
7R素添加大 ホスファチジゾレセリン 20. 0mg、 ジステアロイルホスファチジルコ リン 20. Omおよびコレステロール 19.3mgを用いて実施例 9と同様にして多重層リ ポソームを製した。
N-C2-N' -コレステリル力ルボキシメチル） 力ルバミルメチノレマンナン 10. Omを P B S 10 mlに溶解し、 これを上記のリボソーム懸濁液中に添加し、 液温を 20°C に保ちながら、 2時間撹拌し経口ワクチンを得た。
得た経口ワクチンの S»平均粒子径士標準偏差は 476. 9 ±206 (nm)であった。 また、透過型電子顕微 察によりリボソームとしての形態を取っていることを 確認した。
実施例 1 5 ：アジュバント物質を添加した経口ワクチンの調製
(6-0-(2 -テトラデシルへキサデカノィル) ァセチルムラモイル) -L-ァラニル -D- グル夕ミン lOmg 、 τΚ素添加大豆ホスファチジルセリン 20. 0mg、 ジステア口 ィルホスファチジルコリン 20. Omおよびコレステロール 19. 3mgを実施例 9と同様 に処理し多重層リボソームを調製した。 重量平均粒子径士標準偏差は 461. 2 土 210 (nm)であった。 また、 透過型電子顕微鏡観察によりリボソームとしての形態 を取っていることを確認した。
アジュバント物質として、 （6-0- (2-テトラデシルへキサデカノィル) -N-ァセチ ルムラモイル) -L-ァラニル- D- グルタムアミ ドおよび N2- [N-ァセチルムラモイル） -L- ァラニル -D- イソグルタミニール] -N6- ステアロイル -L- リジンを用いて同 様に経口ヮクチンを調製できる。
b) 免疫試験
実施例 9で得たインフノレエンザウィルス不活化抗原（inactivated whole virus particles.0. 05 ホルマリンで固定） 入りリボソーム懸濁液を表 9に示すスケジ ユールに従い、 マウス用胃ゾンデを用いて BALB/cCr Sicマウス （雌、 7週齢） に 1回あたり 0. 2ml ずつ経口投与した （1群 5匹） 。免疫投与開始 3週後 （21また は 22日） に各群のマウスから血清および腸管洗浄液を採取し、 それらの投与した 抗原に特異的な I g Gおよび I g A抗体価を E L I S Aを用いて測定した。
血清および腸管洗浄液の調製は以下の手順、 手法を用いた。
エーテル麻酔下、 マウスの腋下静脈を切断し採血した。 得た血液は 3000rpmで 10 分間遠心して血清分離し、 抗体測定に供した。採血後、 同一マウスを開腹し、 腸 を摘出し、 回腸と盲腸の結合部で腸を切断した。 胃、 十二指腸結合部から 25針付 き注射筒（10ml 用） でサンプリング液 (ELISAmate: K P L社の Diluent/Bloking Solution) 5ml をゆっくり注入し、 回腸末端部から出てくる腸管洗浄液をシヤー レに受けた。 その洗浄液を 2000rpmで 10分間遠心後、 上清を抗体測定に供した。 各サンプルは測定時まで- 20 °Cに保存した。 表 9 免疫スケジュール 試験例 免疫方法 経口投与日 採材日
1 5日間連続投与 day 0, 1， 2， 3， 4 day 21
2 4日ごと 5回投与 day 0,4， 8， 12， 16 day 21
3 5日間連続投与後、 day 0， 1， 2， 3， 4， 8, 12， 16 day 21
4日ごとに 3回投与
抗原投与量： 400 Zl回 Zマウス
c)抗体価測定
血清中および腸管诜浄液の、 投与した抗原に特異的な I gGおよび I gA抗体 価測定は、 KPL社（Kirlegaard k Perry Lab. Inc. )の EL I S A測定用キット (ELISAmate)も用い、 そのプロトコールに記載してある方法に準じておこなった。 その結果、血清中に抗原に特異的な Ig A、 Ig Gの産生が、 腸管洗净液中に Ig Aの産生が認められた。
[ELISA法] ' コ一ティング緩衝液に溶解した 2.5 ^g/mlの抗原を 96穴マイクロプレートの各 ゥエルに 50 1ずつ加え、 室温で 1時間静置し、 抗原をマイクロプレートに固定 する。各ゥエルの液を捨て、 ペーパータオル上でプレートを良くはたいて完全に 液を除去した後、 ブロッキング液 100 \ずつを各ゥエルに加え、 室温で 5分間 静置する。 ゥエルの液を除去後、 マウスから調製した、 血清および腸管洗净液の 2倍段階鎌液各 50 1ずつを各ゥエルに加え、 室温で 1時間静置する。 ゥエル の液を除去後、洗净液 200-300 ΐ で 4回洗浄を繰り返す。 ゥエルの液を除去 後、 ペルォキシダーゼ標識抗マウス I gG (r)抗体あるいはペルォキシダーゼ 標識抗マウス I gA (α)抗体の 200倍職液、 50^1ずつを各ゥエルに加え、 室温で 1時間静置する。 ゥエルの液を除去し、 200〜300 \ の洗净液で 4回洗 浄後、浼浄液でゥエルを満たし、 室温でさらに 5分間静置する。 ゥエルの液を除 去後、 ペルォキシダーゼ基質溶液 50 ^1ずつを各ゥエルに加え、 室温で 20分静置 後、 ペルォキシダーゼ反応停止液 50 / lずつを各ゥエルに加えて反応を停止し、 プレートミキサーで撹拌する。 各ゥエルの 405ηιηにおける吸光度を ELISA READER (Multi.skan PLUS: Titertek社） で測定する。抗体価は、 同時に測定する標準サ ンプル （抗体価が既知のサンプル） の各希釈での吸光度を式 1に示す logit- log 変換式で Yを求め、 縦軸に logit Yを横軸に抗体価の対数値をプロッ卜し、 標準 直線を引き、 その標準直線を基に、 各サンプルの抗体価を算出する。
1 0 g i t - 1 o g変換
Y=a+bX Y=logit y = log(y/(l-y) : y=(0Dx-0Db)/(0Dm-0Db)
X=log2x ： x=抗体価
ODx 各希釈（ 各抗体価） における吸光度値
ODm 最大吸光度値
ODb ブランクの吸光度値

Claims

請求の範囲
1. 抗原と脂質からなる複合体であって、 脂質としてマンノースを結合している 糖脂質および/またはホスファチジルセリンである憐脂質を含んでいることを 特徴とする経口投与用ワクチン。
2. 複合体が脂質騰造体である請求項 1の経口投与用ワクチン。
3. 脂質 E f造体がリポソームである請求項 2の経口投与用ワクチン。
4. 脂質腿造体がエマルジョンである請求項 2の経口投与用ワクチン。
5. 脂質騰造体がミセルである請求項 2の経口投与用ワクチン。
6. マンノースを結合している糖脂質が、 4-0-(6-0 -エイコサノィル- j3-D- マ ンノピラノシル) -D-マンノビラノースまたは Ν-(2-Ν' -コレステリルカルボキシ メチゾレ） 力ノレバミルメチゾレマンナンである請求項 1乃至請求項 5のいずれか 1 項記載の経口投与用ワクチン。
7. 分としてマンノースを結合している糖脂質および Ζまたはホスファチジ ルセリンである燐脂質のほかに更に他の脂質を含有することを特徴とする請求 項 1の経口投与用ワクチン。
8. 分としてマンノースを結合して ヽる糖脂質および Ζまたはホスファチジ ルセリンである燐脂質のほかに更に他の脂質として 由来もしくは卵黄由来 のホスファチジルコリン、 水素'添加ホスファチジルコリン、 ジミリストイルホ スファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリンまたはジステア口 ィルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリン類および Ζまたは荷電 脂質類およ またはスフィンゴミエリン類を含有する請求項 1の経口投与用 ワクチン。
9. m -としてマンノースを結合している糖脂質および zまたはホスファチジ ルセリンである憐脂質のほかに更に他の脂質として荷電脂質を含有する請求項 1の経口投与用ワクチン
10. 荷電脂質がジアルキルホスフェート、 ジァシルホスファチジン酸、 ステアリ ゾレアミン、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイノシトール、 ホス ファチジルエタノールァミンまたはイオン性界面活性化剤である請求項 9の経 口投与用ワクチン。
11. 脂質が大豆由来ホスファチジルコリン、 卵黄由来ホスファチジルコリン、 水 素添加ホスファチジルコリン、 ジステアロイルホスファチジルコリンもしくは ジパルミ トイルホスファチジルコリン、 およびホスファチジルセリン、 場合に よっては更にコレステロールである請求項 1乃至請求項 5のいずれか 1項記載 の経口投与用ワクチン。
12. 抗原が微生物の抗原もしくは弱毒化微生物である請求項 1の経口投与用ヮク チン。
13. 抗原がインフルエンザウイルス抗原、 A型肝炎ウィルス抗原、 B型肝炎ウイ ルス抗原または C型肝炎ウィルス抗原である請求項 1の経口投与用ワクチン。
14. 抗原がィンフルェンザへマグルチニンである請求項 1の経口投与用ワクチン。
15. 抗原と脂質のほかにアジュバント物質が添加された請求項 1の経口投与用ヮ クチン。
16. アジュバント物質がムラミルジペプチド （MD P ) の誘導体である請求項 1 5の経口投与用ワクチン。
17. アジュバント物質が (N- ァセチルムラモイル)- L-ァラニル -D- イソグルタミ ン、 6-0-(2- テトラデシルへキサデカノィル) ァセチルムラモイル) -L-ァラ ニル -D- イソグルタミン、 6-0-(2- テトラデシルへキサデカノィル) -N-ァセチ ルムラモイル) -L-ァラニル -D- グルタムアミ ドまたは N2- [ (N- ァセチルムラモ ィル) -L-ァラニル- D- イソグルタミニール] -N6- ステアロイル- L- リジンであ る請求項 1 6の経口投与用ワクチン。
18. 抗原と脂質からなる複合体であって、 脂質としてマンノースを結合している 糖脂質および/またはホスファチジルセ.リンである燐脂質を含んでいる経口投 与用ヮクチンを経口投与し、 投与された個体の免疫性を上げる方法。
19. 複合体が脂質膜構造体である請求項 1 8の方法。
20. 脂質膜構造体がリボソームである請求項 1 8の方法。
21. 脂質膜構造体がェマルジヨンである請求項 1 8の方法。
22. 脂質膜構造体がミセルである請求項 1 8の方法。
23. マンノースを結合している糖 S旨質が、 4-0-(6-0- エイコサノィル- ^ -D- マ ンノピラノシル) -D-マンノビラノースまたは N - (2-N' -コレステリルカルボキシ メチル） カノレバミルメチルマンナンである請求項 1 8乃至請求項 2 2のいずれ か 1項記載の方法
24. 分としてマンノースを結合している糖脂質および/またはホスファチジ ルセリンである燐脂質のほかに更に他の脂質を含有する脂質膜構造体である請 求項 1 8の方法。
25. 他の脂質が:^由来ホスファチジルコリン、 卵黄由来のホスファチジルコリ ン、 水素添加ホスファチジルコリン、 ジミリストイルホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコ リンであるホスファチジルコリン類および Zまたは荷 SI旨質類および/または スフィンゴミエリン類である請求項 2 4の方法。
26. 分としてマンノースを結合している糖脂質および/またはホスファチジ ルセリンである燐脂質のほかに更に他の脂質として荷 SI旨質を含有する脂質膜 構造体である請求項 2 4の方法。
27. 荷 ma旨質がジアルキルホスフェート、 ジァシルホスファチジン酸、 ステアリ ノレァミン、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイノシトール、 ホス ファチジルエタノールァミンまたはイオン性界面活性化剤である請求項 2 6の 方法。
28. 脂質が:^!:由来ホスファチジルコリン、 卵黄由来ホスファチジルコリン、 水 素'添加ホスファチジルコリン、 ジステアロイルホスファチジルコリンもしくは ジパルミ トイルホスファチジルコリン、 およびホスファチジルセリン、場合に よっては更にコレステロ一ノレである請求項 1 8の方法。
29. 抗原が微生物の抗原もしくは弱毒化微生物である請求項 1 8の方法。
30. 抗原がインフノレェンザウィルス抗原、 A型肝炎ウィルス抗原、 B型肝炎ウイ ルス抗原または C型肝炎ゥィルス抗原である請求項 1 8の方法。
31. 抗原がインフルエンザへマグルチニンである請求項 1 8の方法。
32. 抗原と脂質のほかにアジュバント物質が添加されている請求項 1 8の方法。
33. アジュバント物質がムラミルジペプチド （MD P ) の誘導体である請求項
3 2の方法。
34. 抗原と脂質の他にアジュバント物質として (N- ァセチルムラモイル) -いァラ ニル -D- イソグルタミン、 6-0-(2- テトラデシルへキサデカノィル) -N-ァセチ ルムラモイル) -L-ァラニル -D- イソグルタミン、 6-0-(2- テトラデシルへキサ デカノィル) -N-ァセチルムラモイル)- L-ァラニル -D- グルタムアミ ドまたは N2 -[(N- ァセチルムラモイル) -L-ァラニル -D- イソグルタミニール]- N6- ステア ロイル- L- リジンが添加されている請求項 1 8の方法。
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