WO1994021671A1 - Adipocyte differentiation inhibitor peptide and adipocyte differentiation inhibitor containing said peptide as active ingredient - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a novel peptide for inhibiting fat cell differentiation, a fat cell differentiation inhibitor containing the peptide as an active ingredient, a food for specified health use having a fat differentiation inhibiting function (a so-called functional food), and a fat cell.
- the present invention relates to a feed having a differentiation inhibiting function.
- the present invention relates to a food for specified health use (so-called functional food) having a fat differentiation inhibitory function and a feed having a fat cell differentiation inhibitory function, including a protein hydrolyzate containing the adipocyte differentiation inhibitory peptide.
- functional food a fat differentiation inhibitory function
- a feed having a fat cell differentiation inhibitory function including a protein hydrolyzate containing the adipocyte differentiation inhibitory peptide.
- the present invention makes it possible to prevent or treat obesity in humans or animals and associated circulatory diseases such as hypertension and arteriosclerosis. In addition, meat quality in livestock and farmed fish can be improved. Background art
- dietary restriction eg, fiber
- administration of various pharmaceuticals are performed.
- dextran sulfate which enhances lipoprotein lipase activity in blood
- nicomol which suppresses lipid absorption
- clofibrate and bravastatin which are lipid metabolism improvers are currently used.
- the oligopeptide-containing substance disclosed in the above-mentioned application publication is a mixture of degraded products of proteins, and is a true active ingredient, that is, an amino acid sequence of a peptide as an active ingredient. Was not disclosed.
- the present invention was obtained by separating the peptide as the active ingredient, analyzing the amino acid sequence, providing an adipocyte differentiation inhibitor containing the peptide as an active ingredient, and obtained from the specific protein.
- An object of the present invention is to provide an adipocyte differentiation inhibitor containing an oligopeptide-containing substance as an active ingredient. Disclosure of the invention
- the present invention has the following matters as its gist.
- a peptide having an adipocyte differentiation inhibitory activity wherein the amino acid sequence is VaporTyr-Pro or VaporThr-Leu.
- a fat cell differentiation inhibitor comprising the peptide of (1) as an active ingredient.
- a food for specified health use having an adipocyte differentiation inhibitory function, comprising the peptide having the adipocyte differentiation inhibitory ability described in (1) above as an active ingredient.
- a fat characterized by containing, as an active ingredient, a protein hydrolyzate characterized by containing 0.1% by weight or more of the peptide having the ability to inhibit adipocyte differentiation described in (1) above.
- a feed comprising a protein hydrolyzate characterized by containing 0.1% by weight or more of the peptide having an adipocyte differentiation inhibitory ability described in (1).
- the peptides of the present invention can be separated and purified from naturally occurring proteins. Further, it can be directly chemically synthesized by a generally known method. Furthermore, it is also possible to prepare a peptide of the present invention by preparing a gene having a nucleotide sequence corresponding to the above-mentioned peptide sequence, incorporating the gene into an appropriate expression vector, and expressing the gene in an appropriate host. it can
- A The means for separating and purifying from proteins existing in nature will be described below.
- animal proteins such as fish meat protein, fish meal, globin, etc .
- vegetable proteins such as wheat gluten, soybean casein, etc. can be widely used.
- globin proteins such as hemoglobin and myoglobin are particularly preferable in that they can strongly exert the desired effect of inhibiting adipocyte differentiation.
- the kind of the animal which is a source of the globin protein is not particularly limited, and blood such as pest, septa, hidge, human, and poma can be widely used.
- hydrolytic enzyme for example, one or two or more of acidic protease, neutral protease, and alkaline protease can be used.
- the globin protein-containing material is dispersed in water to a solid content of 5 to 30% by weight.
- the pH is adjusted to the optimal pH of the protease with acid or alkali, and the protease is added at once or sequentially, at a temperature of 20 to 70 ° C for 3 to 48 hours.
- the hydrolysis reaction can be performed by reacting the enzyme.
- the obtained protein hydrolyzate is dried, or an appropriate amount of a bulking agent such as carboxymethylcellulose or dextrin is added to the protein hydrolyzate and dried and solidified to suppress adipocyte differentiation.
- a protein hydrolyzate having an effect can be obtained (hereinafter, referred to as the hydrolyzate of the present invention).
- the decomposition product of the present invention contains at least 0.1% by weight of the above-mentioned peptide of the present invention, Vatyr-Pro- and / or Va1-Thr-Leu.
- the protein hydrolyzate of the present invention that has been subjected to the enzyme treatment is purified.
- a commonly known purification step can be employed.
- a fraction containing a desired peptide can be purified by appropriately combining an ion exchange resin method, an ultrafiltration method, a reverse phase chromatography method, and the like.
- the operation by the ion exchange resin method or the ultrafiltration method is not always essential, but it is preferable to incorporate it into the separation and purification step from the viewpoint of improving the degree of separation and purification.
- Separation and purification can be achieved by combining the operations in reversed-phase chromatography under acidic conditions and reverse-phase chromatography under neutral conditions.
- the amount of protein in the fraction can be measured by a generally known protein quantification method, for example, a ninhydrin method.
- amino acid sequence of the fractions thus selected is identified by a generally known method, whereby the amino acid sequence of the peptides of the present invention, Vapor Tyr-Pro and Vapor Thr-Leu, is identified. You can confirm its existence.
- the peptide of the present invention derived from the fraction thus separated can be used as an active ingredient of the fat differentiation inhibitor of the present invention.
- fraction thus separated can be directly used as an active ingredient of the adipocyte differentiation inhibitor of the present invention.
- the peptide of the present invention can be chemically synthesized by a generally known peptide synthesis method.
- a generally known peptide synthesis method For example, azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method , DCC method, active ester method, carboymidazole method, redox method, DCC-additive method (HOMB, HOBt, HOSu) method (“The Peptide”, Vol. 1 (1966 ), Schreder & Luhke, Academic Press, New York, USA; or “Peptide Synthesis” by Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd. (1975), etc.).
- an amino acid having a side chain functional group for example, thiocyanine synthreonine, protects the side chain functional group.
- a generally known protecting group for example, a benzyloxycarbonyl group (Cbz-), a butbutoxycarbonyl group (Boc-), a benzyl group (Bz-) or the like can be used. it can.
- the protecting group can be deprotected by a generally known method in the synthesis step of the peptide of the present invention.
- An adipocyte differentiation inhibitor can be prepared using the peptide of the present invention as an active ingredient.
- the carrier of the differentiation inhibitor examples include fillers, fillers, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants and the like which are generally used for preparing a preparation according to the use form. Excipients or diluents can be used.
- the formulation composition is not particularly limited as long as it effectively contains the peptide of the present invention and the like, and may be, for example, a solid preparation such as a tablet, a powder, a granule, and a pill.
- injection forms such as solutions, suspensions, and emulsions can be used. It can also be a dried product which can be made into a liquid form by adding a suitable carrier before use. All of these can be prepared according to a conventional method.
- the dose of the adipocyte differentiation inhibitor obtained in this manner is appropriately selected according to the method of administration of the preparation, the mode of administration, the condition of the patient to be administered, and the like.
- the present invention is prepared in the form of a preparation containing about 0.001 to 80% by weight of the peptide of the present invention, and the amount of the peptide of the present invention contained in the preparation is about 1 mg to 100 mg per adult per day. It is preferable to administer the drug within the range described below. The administration need not necessarily be performed once a day, but may be divided into three to four times a day.
- compositions in the above various forms can be administered in an appropriate route according to the form,
- a pharmaceutical preparation in a solid form can be administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration or the like, and oral administration or the like.
- a food for specified health use can be prepared using the peptide of the present invention or the degradation product of the present invention (hereinafter referred to as the peptide of the present invention) as an active ingredient. Further, the peptide or the decomposed product can be used as a food additive for general foods.
- the type of the above food is not particularly limited, and it can be applied to milk, pudding, curry, bean sprouts, stew, meat sauce, ham, cake, chocolate, and the like.
- milk is preferred in that it can facilitate the ingestion of the peptide of the present invention or the like, which is difficult for a child to directly ingest in terms of taste. Further, it is preferable to add the peptide of the present invention or the like to foods that naturally promote obesity, such as cakes and chocolates, in that obesity due to ingestion of the food can be prevented.
- the total amount of E in the food is appropriately selected according to the type of food, the purpose of addition, the effect expected by ingestion of the food, and the like.
- peptide of the present invention In general, it is preferable to include the peptide of the present invention and the like in the above-mentioned foods to such an extent that 0.1 to 4 mg of the peptide of the present invention per meal can be ingested.
- a feed capable of inhibiting adipocyte differentiation can be prepared.
- the peptide of the present invention is not limited to feed for livestock such as cattle, pigs and chickens and feed for cultured fish such as Thailand and yellowtail.
- the amount of the peptide of the present invention and the like in the feed is appropriately selected depending on the kind of the feed, the effect expected from ingestion of the feed, and the like.
- Example 1 Search for a protein hydrolyzate having an inhibitory action on adipocyte differentiation Globin and wheat gluten were compared as protein sources that could contain the adipocyte differentiation inhibitory peptides.
- the experiments were performed using high-fat obesity and high-sugar obesity mice as dietary obesity models.
- high-fat obesity a 50% fat diet containing 50% w / w of lard per feed was added for 2 weeks, and for high-carbohydrate obesity, 3 ( ⁇ / sucrose solution was added to drinking water in addition to the normal diet.
- the high-fat obesity test group consisted of a 50% fat diet, 4% globin digest, 8% globin digest, 2% globin digest + 2% gluten digest, The diet supplemented with 4% globin hydrolyzate and 4% gluten hydrolyzate was allowed free intake, while the high-carbohydrate obesity test group was allowed to freely ingest 30% sucrose solution while eating globin in the normal diet.
- the diet was supplemented with 2% protein hydrolyzate, 4% globin protein hydrolyzate, 1% globin protein hydrolyzate + 1% gluten hydrolyzate, 2% globin protein hydrolyzate + 2% gluten hydrolyzate. It is shown in Table 1.
- the epididymal adipose tissue weight in the 50% fat control group was increased by about 200%, compared to the normal diet control group, and the number of tissue cells was 50% 50.
- cell volume had increased by 28%.
- globin proteolyses tended to suppress the increase in the number of adipocytes more strongly than wheat gluten hydrolyzate.
- the protein source is not particularly limited, it can be said that globin protein is preferable.
- Table 1 Effect of proteolysate on adipocyte increase Treatment Cell number 'Cell volume 2 Tissue weight 3 Body weight 4 Normal diet 17 7.5 0.89 22.8
- the chromatography was carried out under the following conditions.
- reaction solution was heated at 80 ° C. for 30 minutes to stop the reaction. Then, an aqueous suspension of calcium hydroxide was added to adjust the pH to 6.5, and 10 kg of diatomaceous earth was added. The obtained filtrate was spray-dried to obtain 23 kg of powder.
- peptides of the present invention are shown in the following Examples, 1. ion exchange, 2. ultrafiltration, 3. separation by reversed-phase column chromatography under acidic conditions, 4. separation by reverse-phase chromatography under neutral conditions. I got it through the procedure.
- Table 2 shows the recovery rates when these operations were used.
- the protein content was measured by the ninhydri method.
- Table 2 Recovery rate of adipocyte differentiation inhibitory peptide from globin protein digest Fraction Protein weight (g) Yield (3 ⁇ 4)
- Quantitative method Globin protein digest 13.7 100 Nin tf phosphorus method after acid hydrolysis Ion exchange + Ultrafiltration 4.24 30.9 Same as above
- a 10 w / v% aqueous solution of globin protein hydrolyzate is added to a weakly acidic cation exchange resin (Amberlite IRC50, Organo Corporation, H + type), and the mixture is stirred for 1 hour to be adsorbed. Obtained. 2.
- the unadsorbed fraction obtained by the ion-exchange treatment was analyzed using a stirring type ultrafiltration device (Advantech Co., Ltd., UHP 90K) and an ultrafiltration membrane (Advantech Co., Ltd., UII1, fractionation). Ultrafiltration was performed according to a molecular weight of 1000) to collect a filtrate.
- Acetonitrile aqueous solution with a linear concentration gradient from 0% to 25% acetonitrile concentration, with an acetonitrile concentration of 0.5% / min.
- the peptide fraction having the activity of inhibiting adipocyte differentiation in the globin protein hydrolyzate obtained in Example 2 was quantified according to the method for purifying an effective peptide shown in Example 3. Acid hydrolysis
- the sample after hydrolysis was adjusted to pH 5.0 with sodium hydroxide, and reacted with ninhydrin reagent containing 0.2M citrate buffer (PH5.0) at 100 ° C for 15 minutes.
- the absorbance at 57 Onm was measured.
- a leucine aqueous solution (0.75, 150, 225, 300 nmoles / ml) as a standard solution was subjected to a ninhydrin reaction, and a calibration curve was obtained from the obtained absorbance to calculate the amount of amino group equivalent to leucine in the sample. did.
- Elution solvent Amino acid mobile phase kit (Na type) manufactured by Shimadzu Corporation
- Reaction solution 1 Analytical kit 0PA reagent manufactured by Shimadzu Corporation
- Amino acid mixed standard solution 18-component H-type (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted 25-fold with 0.2M citrate buffer (PH2.20) and injected 10/1 (each amino acid 1 nmo 1 esZ 10 1) Sample solution
- each amino acid was dissolved in 0.2 M citrate buffer (pH 2.20) so that the content of each amino acid was about 100 nmolseZml, and 10 ⁇ 1 of a 0.45; am filter filtrate was injected.
- the identification of the amino acid and the calculation of the peak area were analyzed using a chromatopack C-R4A (manufactured by Shimadzu Corporation).
- the amount of amino acid was calculated from the area ratio with the standard solution.
- the amino acid composition was calculated from the ratio of the amount of each amino acid to the total amount of the obtained amino acids.
- H-Vatro Thr-Leu-OH was synthesized using a SAM2 peptide synthesizer (Biosearch) according to the protocol of the same device. That is, 2 g of an acyloxymethyl resin bound to the third protected amino acid Boc-Leu-OH (0.3 lg / lg) was set in the reaction vessel of the above peptide synthesizer, and 45 v / v% The Boc group was removed by contact with a deblocking solution containing trifluoroacetic acid (TFA), 2.5 v / v% anisol, and 5 2.5 v / v% methylene chloride (DCM) for 20 minutes.
- TFA trifluoroacetic acid
- DCM 2.5 v / v% anisol
- DCM 2.5 v / v% methylene chloride
- Boc-Vat 0H was force-pulped according to the same process.
- an octadecyl silica (0DS) column (Cosmosil 5C, 8 , 250 ⁇ 20 mm: manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) is used to absorb 0.1% TFA.
- a linear concentration gradient (20-70% / 50 min, 10 ml / min).
- the target peptide was eluted at a concentration of about 50% of acetonitrile.
- Example 2 (1) 1 g of the globin protein-containing material obtained in Example 2 was added to 100 g of infant milk powder to prepare milk powder having an ability to inhibit adipocyte differentiation.
- Example 2 (2) (1) 5 g of the globin protein-containing material obtained in Example 2 was added to 100 g of chocolate to prepare a chocolate having the ability to inhibit adipocyte differentiation.
- Example 2 10% by weight of the globin protein-containing substance obtained in Example 2 was added to the premix containing vitamins and minerals at a rate of 10% by weight, and the H-Va- Thr-Leu synthesized in Example 5 was used.
- -OH at a ratio of 1% by weight and adding each of the premixes to a commercial fish feed at a ratio of 10% to produce a fish feed with the ability to inhibit adipocyte differentiation.
- Swiss mouse-derived 3T3-L1 cells were seeded on a cell culture dish at a cell density of about 3 ⁇ 10 4 cells / ml.
- the cell surface was washed with phosphate buffered saline (PBS), and GD and fraction ⁇ were reduced to 0, 2, 4, 8 ng / m 1 and 0, 20, 40, respectively.
- a medium containing 80 wg / m1 was added and cultured for 2 days. Thereafter, the cell surface was washed with PBS, and the adipocyte differentiation-inducing substance (dexamethasone; 0.25 wM, 1-methyl-3-isoptylxanthine; 0.5 mM, insulin; 10 B / ml) ) was added, and the cells were cultured for 2 days.
- the adipocyte differentiation-inducing substance (dexamethasone; 0.25 wM, 1-methyl-3-isoptylxanthine; 0.5 mM, insulin; 10 B / ml) ) was added, and the cells were cultured for 2 days.
- the medium containing the differentiation-inducing substance was removed, the cell surface was washed with PBS in the same manner, a medium supplemented with 10 g / ml of insulin was added, and the cells were cultured for about one week.
- fraction A The effect of fraction A on preadipocytes was determined by measuring glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity (GPDH) as a marker enzyme in the cells in a conventional manner.
- GPDH glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity
- 3T3-L1 cells derived from Swiss mice cell culture was performed in the same manner as in the above (1), and the GPDH activity was measured. However, GD and fraction A were added together with the medium containing 10 g / ral of insulin after removing the medium containing the differentiation-inducing substance.
- H-Vat Thr-Leu-0H and H-Vat Tyr-Pro-0H showed significant concentration-dependent suppression of GPDH activity before and after induction of differentiation. Thus, this component was shown to be effective in suppressing adipocyte differentiation.
- Table 4 Inhibitory effects of adipose differentiation inhibitory peptides (chemically synthesized products) on preadipocytes
- Test Example 3 Effect of fat differentiation inhibitory peptide (chemically synthesized product) (in vivo) Two types of adipocyte differentiation inhibitory peptides which are the peptides of the present invention synthesized by the method shown in Example 5 The effects of Thr-Leu and Vapor Tyr-Pro on adipocyte addition in vivo were examined. The test method was the same as in Test Example 1 using globin proteolysate.
- both types of adipocyte differentiation-suppressing peptides reduced the number of cells in the subcutaneous adipose tissue, the epididymal adipose tissue and the retroperitoneal wall adipose tissue by adding a small amount of 20 PPm.
- the results almost corresponded to the in vitro test results using mouse 3T3-L1 cells.
- Table 5 Increase in mouse adipose tissue cell count
- Adipocyte count (mean soil standard error, DNA / g / adipose tissue)
- the fat content is 10% by adding cocoa, and a feed rat (Wistar male) having twice the fat content of a normal diet is fed freely for 4 weeks.
- the number of cells in the epididymal adipose tissue is 138 x 10 becomes 6 co, it was increased 22% to 113 X 10 6 U and Hi ⁇ normal feed intake group (Table 6).
- mice were then fed a 50% fat diet and examined for adipose tissue weight and cell number. The results are shown in Table 7.
- the number of adipose tissue cells shown in Table 7 is a value including adipocytes, preadipocytes, fibroblasts, vascular cells, etc., so cells in subcutaneous adipose tissue are adipocytes, preadipocytes, stromal cells (Stroma).
- the peptide of the present invention was administered to male and female ICR mice at a dose of 10 g / Kg body weight while changing the administration ratio of Vapor Tyr-Pro and Vapor Thr-Leu (0: 1, 1: 1, 1: 0). (Maximum possible dose) Each was administered orally, but no deaths occurred.
- FIG. 1 is a diagram showing a gel-like mouth chromatogram of a globin proteolysate
- FIG. 2 is a diagram showing a reverse phase (acidic) chromatogram in Example 3
- FIG. FIG. 3 is a view showing a reversed-phase (neutral) chromatogram in the above.
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Description
明 細 書 脂肪細胞分化抑制べプチ ド及び当該べプチ ドを有効成分とする脂肪細胞分化抑制 剤 技術分野
本発明は、 新規の脂肪細胞分化抑制ペプチ ド、 並びに当該ペプチ ドを有効成分 とする脂肪細胞分化抑制剤、 脂肪分化抑制機能を有する特定保健用食品 （いわゆ る機能性食品） 、 及び脂肪細胞分化抑制機能を有する飼料に関する。 さらには前 記脂肪細胞分化抑制べプチ ドを含む蛋白分解物を含む、 脂肪分化抑制機能を有す る特定保健用食品 （いわゆる機能性食品） 及び脂肪細胞分化抑制機能を有する飼 料に関する。 本発明により、 人若しく は動物の肥満及びそれに伴う高血圧症や動 脈硬化症等の循環器系疾患の予防や治療が可能になる。 さ らには、 家畜や養殖魚 における肉質の改善が可能になる。 背景技術
脂肪や糖質を過剰に摂取すると肥満 ·高脂血症が惹起され、 さ らには高血圧症 や動脈硬化症に進展するといわれている。 そ こで現在、 脂肪や糖質の吸収を抑制 し、 脂肪の蓄積を減少せしめることが強く要望されている。
—方、 幼児期における栄養摂取過多によっては脂肪細胞数が増加し、 潜在的な 肥満症といえる状態になる。 このことから、 特に幼児期における脂肪細胞数の增 加を抑えることは小児期、 ひいては成人期における肥満症およびその合併症とも いえる循環器系疾患の予防に直結するものと報告されている。
かかる肥満 · 高脂血症の治療には、 食事制限やダイエツ ト食 （例えば、 フアイ バー） の摂取が、 さ らには各種の医薬品の投与が行われている。 当該医薬品と し ては、 血中リポ蛋白リパーゼ活性を高めるデキス トラン硫酸、 脂質吸収を抑制す るニコモール、 脂質代謝改善剤であるクロフィ ブラー 卜やブラバスタチン等が現 在用いられている。
しかし、 食事制限はそれをする者にとって苦痛であり、 また上記医薬品の投与 による副作用の惹起も懸念される。
一方、 家畜や養殖魚に対しては、 現在、 成長の促進を企図して濃厚飼料が与え られている。 その結果と してこれらの家畜や養殖魚中における脂肪含有率が過剰 になり、 脂肪摂取過多の原因となる上に、 さ らに味覚の点でも消費者の嗜好に合 わなく なってきている。
最近では、 本発明者の一人が加わって開発したォリ ゴぺプチ ド含有物について の出願がされ （国際公開番号 W089/06970 公報） 、 さらに当該類似技術について 特開平 2 - 154693号公報に記載されている。
これらの公報には、 ある種のォリ ゴぺプチ ドが脂質代謝改善効果を有すること が明らかにされている。
上記の出願公報において開示されたォリ ゴぺプチ ド含有物は、 その組成が蛋白 の分解物の混合物であり、 真の有効成分、 すなわち有効成分と してのペプチ ドの ァ ミ ノ酸配列は明らかにされていない。
このことは、 当該ペプチ ド含有物は医薬品と して応用するには純度が低い。 ま た、 食品に配合した場合に食品中のぺプチ ドと区別して定量することが困難にな り、 品質管理上の問題がある。
そこで、 当該ペプチ ド含有物の真の有効成分、 すなわち有効成分と してのぺプ チ ドを探索するのが課題となっている。
すなわち本発明は、 上記有効成分と してのペプチ ドの分離、 及びア ミ ノ酸配列 の解析、 当該ペプチ ドを有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤の提供、 及び特定蛋 白から得られたオリ ゴぺプチ ド含有物を有効成分と して含有する脂肪細胞分化抑 制剤の提供を課題とするものである。 発明の開示
本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、 以下の発明により上記 課題が解決され得ることを見出した。
すなわち、 本発明は以下の事項をその要旨とするものである。
( 1 )ア ミ ノ酸配列が Va卜 Ty r - P r o 又は Va卜 Th r - L e u である、 脂肪細胞分化抑制能 を有するぺプチ ド。
( 2 )前記（1 ) に記載したぺプチ ドを有効成分と して含むことを特徴とする脂肪細 胞分化抑制剤。
(3)前記（1) に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するぺプチ ドを有効成分と して 含有することを特徴とする、 脂肪細胞分化抑制機能を付与した特定保健用食品。
(4)前記（1) に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するぺプチ ドを配合してなる脂 肪細胞分化抑制能を付与した飼料。
(5)前記（1) に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するペプチ ドを 0.1 重量％以上 含有することを特徴とする蛋白分解物を有効成分と して含有することを特徴とす る、 脂肪細胞分化抑制機能を付与した特定保健用食品。
(6)前記（1) に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するペプチ ドを 0.1 重量％以上 含有することを特徴とする蛋白分解物を配合してなる飼料。
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明ペプチ ドである、 Val-Tyr- Pro と Val- Thr-Leu は、 自然界に存在する蛋 白質から分離精製することが可能である。 また、 これを直接通常公知の方法によ り化学合成することが可能である。 さらに上記べプチ ド配列に対応した塩基配列 を有する遺伝子を調製してこれを適切な発現べクターに組み込んで、 当該遺伝子 を適切な宿主中で発現させることにより本発明ペプチ ドを調製することもできる
A . 以下に、 自然界に存在する蛋白質から分離精製する手段について説明する。 原材料は、 魚肉蛋白、 魚粉、 グロビン等の動物性蛋白質 ； 小麦グルテン、 大豆 カゼィ ン等の植物性蛋白質等を広く用いることができる。
これらの蛋白質の中でも、 ヘモグロビンやミオグロビン等のグロビン蛋白は、 脂肪細胞分化抑制能という所期の効果を強く奏し得るという点において特に好ま しい。
なお、 かかるグロビン蛋白の提供源である動物の種類は特に限定されず、 ゥシ 、 プタ、 ヒッジ、 ヒ ト、 ゥマ等の血液を広く用いることができる。
次に上記の蛋白質を加水分解することが必要である。 当該加水分解に関する操 作等は、 前出の国際公開番号 W089/06970公報記載の方法に従う。 また用いる加 水分解酵素と しては、 例えば酸性プロテア一ゼ、 中性プロテアーゼ、 又はアル力 リ性プロテアーゼの 1種若しく は 2種以上を用いることができる。
こ こに、 グロビンの蛋白を加水分解する際の条件等について述べる。
まず、 グロビン蛋白含有物を固形分と して水に 5 ~30重量％になるように分散
させ、 酸若し く はアルカ リ によってプロテア一ゼの至適 pHに調整し、 プロテア一 ゼを一度に若しく は逐次的に添加して、 20〜70°Cの温度で 3 ~ 48時間、 当該酵素 を反応させて加水分解反応を行う こ とができ る。
次に、 得られた蛋白分解物を乾燥して、 又は当該蛋白分解物にカルボキシメチ ルセルロースあるいはデキス 卜 リ ン等の増量剤を適量加えて、 乾燥 · 固化するこ とにより、 脂肪細胞分化抑制効果を有する蛋白分解物を得ることができる （以下 、 本発明分解物と記載する。 ）
かかる本発明分解物は、 上記本発明ペプチ ドである Va卜 Ty r-Pro 及び 又は Va 1 -Thr -Leu を最低でも 0. 1 重量％含有する。
次にここで酵素処理を行った本発明蛋白分解物の精製を行う。 かかる精製工程 は通常公知の精製工程を採用することができる。
すなわち、 イオ ン交換樹脂法、 限外濾過法、 逆相ク ロマ ト グラ フ ィ ー法等を適 宜組み合わせて、 所望のペプチ ドを包含するフラ ク シ ョ ンを精製することができ る。
なお上記分離手段において、 イオン交換樹脂法や限外濾過法による操作は必ず しも必須のものではないが、 分離 ·精製度を向上させ得るという観点から分離 . 精製工程に組み入れるのが好ま しい。
酸性下における逆相クロマ トグラフィ 一と中性下における逆相クロマ 卜グラフ ィ一における操作を組み合わせるこ とによつて分離 ·精製が可能である。 また、 フラクシ ョ ン中の蛋白量は通常公知の蛋白定量法、 例えばニンヒ ドリ ン法等によ つて測定することが可能である。
そして、 このようにして選別したフラ ク シ ョ ンのアミ ノ酸配列は、 通常公知の 方法により同定することによって、 本発明ペプチ ドである Va卜 Ty r - Pro と Va卜 Th r-Leu の存在を確認することができる。
このよう に分離したフラ ク シ ョ ンに由来する本発明ペプチ ドを本発明脂肪分化 抑制剤の有効成分と して用いることができる。
また、 さらにこのようにして分離されたフラクシ ョンを、 直接本発明脂肪細胞 分化抑制剤の有効成分と して用いることもできる。
さらに本発明ペプチ ドは、 通常公知のぺプチ ド合成法によって化学合成するこ とができる。 例えば、 アジ ド法、 酸クロライ ド法、 酸無水物法、 混合酸無水物法
、 DCC法、 活性エステル法、 カルボイ ミ ダゾ—ル法、 酸化還元法、 DCC-アデイデ イ ブ（HOMB, HOBt, HOSu)法（ 「ザ ペプチ ド（The Pept i de) 」 第 1巻 （ 1966年）， Sc hreder&Luhke 著， Academic Press, New York, USA； あるいは 「ぺプチ ド合成」 泉 谷ら著， 丸善株式会社 （ 1975年） 等） 等のペプチ ド合成法を例示することができ る。
なお上記のぺプチ ド合成法においては、 固相合成法又は液相合成法のいずれで も行うことができる。
また上記ペプチ ド合成法においては、 側鎖官能基を有するアミ ノ酸、 例えばチ 口シンゃスレオニンは、 当該側鎖官能基を保護しておくのが好ま しい。 これに用 いられる保護基と しては、 通常公知の保護基、 例えばべンジルォキシカルボニル 基（Cbz -)、 卜ブトキシカルボニル基（Boc -)、 ベンジル基（Bz-) 等を用いることが できる。
なお、 当該保護基は通常公知の方法で、 本発明ペプチ ドの合成工程において脱 保護を行う ことができる。
B. 本発明ペプチ ドを有効成分と して、 脂肪細胞分化抑制剤を調製することがで さる。
当該分化抑制剤の担体と しては、 使用形態に応じた製剤を調製するのに通常慣 用される充«剤、 增量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤等の賦形剤ない しは希釈剤をいずれも使用できる。 製剤組成形態は、 これが本発明ペプチ ド等を 効果的に含有する形態であれば特に限定はなく、 例えば錠剤、 粉末剤、 顆粒剤、 丸剤等の固剤であってもよい。 また、 液剤、 懸濁剤、 乳剤等の注射剤形態とする こともできる。 また、 これは使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る 乾燥品とすることもできる。 これらはいずれも常法に従い調製できる。
かく して得られる脂肪細胞分化抑制剤の投与量は、 当該製剤の投与方法、 投与 形態、 投与する患者の症状等に応じて適宜選択される。
一般には、 本発明ペプチ ドを約 0.001 ~80重量％程度を含有する製剤形態に調 製して、 当該製剤に含有される本発明べプチ ド量が一日成人一人当り、 約 lmg ~ lOOmg 程度となる範囲で投与するのが好ま しい。 なお、 当該投与は必ずしも一日 一回である必要はなく一日 3〜 4回に分割して投与することも可能である。
上記各種形態の医薬製剤は、 その形態に応じた適切な投与経路、 例えば注射剤
形態においては、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内、 腹腔内投与等により、 固剤形態 の医薬製剤は、 経口投与等により投与され得る。
C . 本発明ペプチ ドまたは本発明分解物 （以下、 本発明ペプチ ド等と記載する。 ) を有効成分と して、 特定保健用食品 （いわゆる機能性食品） を調製することが できる。 また、 当該ペプチ ドまたは分解物を一般食品の食品添加物と して用いる こともできる。
上記食品の種類と しては特に限定されず、 ミルク、 プリ ン、 カ レー、 ハヤシ、 シチュー、 ミ ー ト ソース、 ハム、 ケーキ、 チ ョ コ レー ト等に適用する こ とが可能 である。
特に、 ミルクは、 小児が直接摂取することが味覚の点で困難である本発明ぺプ チ ド等の摂取を容易にし得るという点において好ま しい。 また、 本発明ペプチ ド 等をケーキ、 チ ョコ レー ト等の本来的に肥満を助長する食品に添加することは、 当該食品の摂取による肥満を予防し得るという点において好ま しい。
本発明ペプチ ド等の上記食品中における E合量は、 食品の種類、 添加する目的 、 当該食品の摂取によつて期待する効果等に応じて適宜選択される。
一般には、 本発明ペプチ ド換算で一食当たり 0. lmg 〜4mg 程度の摂取が可能な 程度に、 本発明べプチ ド等を上記食品中に含有させるのが好ま しい。
D . 本発明ペプチ ド等を飼料に配合することによって、 脂肪細胞分化抑制能を有 する飼料を調製することができる。
本発明ペプチ ド等は、 牛、 豚、 鶏等の家畜用飼料であると、 タイ、 ハマチ等の 養殖魚用飼料であるとを問わない。
本発明ペプチ ド等の飼料中への配合量は、 飼料の種類、 当該飼料の摂取によつ て期待する効果等に応じて適宜選択される。
一般には、 飼料中に本発明ペプチ ド換算で 0. 1 〜4 重量％の割合で配合するの が好ま しい。 実 施 例
以下に実施例等を記載して本発明をさ らに具体的に説明する。 ただし本発明の 技術的範囲が本実施例によつて限定されるものではない。
〔実施例 1 〕 脂肪細胞分化抑制作用を有する蛋白分解物の探索
脂肪細胞分化抑制べプチ ドを含有し得る蛋白質源と してグロビンと小麦グルテ ンについて比較した。 実験は食餌性肥満モデルと しての高脂肪性肥満および高糖 質性肥満マウスを用いて行った。 高脂肪性肥満はラー ドを飼料あたり 50w/w%加え た 50 %脂肪食を 2週間、 高糖質性肥満は通常食に加えて飲料水と しての 3(^/ 蔗 糖液を 5週間、 自由摂取させて作成した。 高脂肪性肥満試験群には、 50 %脂肪食 にグロビン蛋白分解物 4 %、 グロビン蛋白分解物 8 %、 グロビン蛋白分解物 2 % +グルテン分解物 2 %、 グロビン蛋白分解物 4 % +グルテン分解物 4 %を添加し た飼料につき自由摂取させた。 一方、 高糖質性肥満試験群には、 30 %蔗糖液を自 由摂取させながら、 通常食にグロビン蛋白分解物 2 %、 グロビン蛋白分解物 4 % 、 グロビン蛋白分解物 1 % +グルテン分解物 1 %、 グロビン蛋白分解物 2 % +グ ルテン分解物 2 %を添加した飼料を摂取させた。 結果は表 1 に示した。
高脂肪性肥満試験では、 50%脂肪対照群では、 通常食対照群と比較して副睾丸 周囲脂肪組織重量は 190 %と約 2倍に増加しており、 その際組織細胞数は 50 %增 加、 細胞容積は 28 %増加していた。 このよう な脂肪組織重量や細胞数の増加、 細 胞容積の拡大がグロビン蛋白分解物のみの添加群において顕著に抑制されており 、 蛋白消化物の半分を小麦グルテン分解物で置き換えた場合より特に細胞数の減 少が強いものであった。
同様に、 高糖質性肥満においても、 グロビン蛋白分解物は脂肪細胞数の増加を 抑制する作用が小麦グルテン酵素分解物より強い傾向を示した。
これらのことから、 脂肪細胞分化抑制作用はグロビン蛋白分解物において大で あることが分り、 さ らに脂肪細胞分化抑制べプチ ドの含有量も多いことが推測さ れた。
すなわち、 蛋白源と しては特に限定されないが、 グロビン蛋白が好ま しいとい える。
表 1 脂肪細胞増加に及ぼす蛋白分解物の影響 処 理 細胞数' 細胞容積2 組織重量3 体重增加4 通常食 17 7. 5 0. 89 22. 8
50%脂肪食 25 9. 6 1. 70 25. 0
+ 4%グロ 1：ノ B m w 16 9. 4 1. 08 22. 3
+ 8%グ αビン蛋白分解物 15 9. 9 1. 05 22. 3
+ ビン蛋白分解物 + 2¾グルテン分解物 20 8. 1 1. 11 20. 2
+ 4¾グ11ビン蛋白分解物 + 45 ^ルテン分解物 19 8. 5 1. 14 21. 7 通常食 15 9. 5 0. 98 18. 0
50%蔗糖液 20 12. 9 1. 82 27. 6
+ 2W'i3ビン蛋白分解物 14 9. 4 1. 46 21. 9
+ ビン蛋白分解物 16 9. 9 1. 28 21. 7
+ 1%グ aビン蛋白分解物 + 1 %グルテン分解物 19 8. 1 1. 44 20. 8
+ 2 ビン蛋白分解物 + 2%グルテン分解物 19 8. 5 1. 37 23. 6
1 X 106コ z脂肪組織
2 ： 脂肪 mg/ u g DNA
3 ： 副睾丸周囲脂肪組織重量 （g)
4 ： 体重増加量 （g〉
〔実施例 2〕 グロビン蛋白分解物の製造
以下にゥシ赤血球を用いた製法の詳細を示す。 なお、 分子量分布はゲル濾過ク 口マ トグラフィ 一法を用いて調べた （第 1図） 。
なお、 当該クロマ 卜グラフィ 一は以下の条件で実施した。
装置 ： 高速液体クロマ トグラフ （ （株） 島津製作所， LC- 6A型）
カラム ： P o l yHYDRDXYETHYL A, 5 m， 9. 4 x 200mm, Po l y LC I nc製 溶出溶媒 ： 50ιηΜギ酸
流速 ： 0. 5m l /分
検出 ： 紫外吸収 （221nm)
新鮮なゥシ赤血球 100kgに水 2501 を加えて充分溶血させ、 リ ン酸を加えて PH を 2.8 に調整した後、 ァスペルギルス ' 二ガーの酸性プロテア一ゼ 2.6 X 107単 位を添加し、 50 、 3時間反応させた。
反応後、 反応液を 80°Cで 30分間加熱して反応を停止させた後、 水酸化カルシゥ ムの水懸濁液を加えて PHを 6.5 に調整し、 珪藻土 10kgを加え、 フィ ルタープレス を用いて濾過し、 得られた濾液を噴霧乾燥して 23kgの粉末を得た。
〔実施例 3〕 脂肪細胞分化抑制ペプチ ドの分画精製法
本発明ペプチ ドは下記の実施例に示す、 1 . イオン交換、 2 . 限外濾過、 3. 酸性下における逆相カラムクロマ トグラフィ ーによる分離、 4 . 中性下における 逆相クロマ トグラフィ ーによる分離という手順をおつて得た。
これらの操作を用いた際の回収率は表 2に示した。 なお、 蛋白量はニンヒ ドリ 法によって測定した。 表 2 脂肪細胞分化抑制べプチ ドのグロビン蛋白分解物からの回収率 画 分 蛋白重量（g〉 収率（¾〉 定 量 法 グロビン蛋白分解物 13.7 100 酸加水分解後ニン tfリン法 イオン 交換 +限外濾過 4.24 30.9 同上
逆相 （酸性） tnトグラフ 0.039 0.28 酸加水分解後了^酸分析 逆相 （中性） αマトグラフィ-
① Va卜 Thr-Leu (画分 B ) 0.009 0.06 同上
② Va卜 Tyr- Pro (画分 C ) 0.006 0.04 同上
1. ィォン交換
グロビン蛋白分解物 10w/v%水溶液を、 弱酸性陽イオン交換樹脂 （アンバーライ ト IRC50,オルガノ （株） ， H+ 型 ）に加え、 1時間攪拌して吸着させた後、 未吸 着画分を得た。
2. 限外濾過
イオン交換処理により得られた未吸着画分について、 攪拌型限外濾過装置 （ァ ドバンテッ ク （株） 製， UHP 90K) 、 限外濾過膜 （ア ドバンテック （株） 製， UII 1 , 分画分子量 1000) により限外濾過を行い濾液を採取した。
3. 逆相 （酸性） クロマ トグラフィ （第 2図）
装置 ： 高速液体クロマ トグラフ （ （株） 島津製作所， LC-10A 型）
カラム ： SuperPac Pep-S， 15 m- 22.5 x 250mm, フ アルマシア （株） 製 溶出溶媒 ： 0.1 % ト リ フルォロ酢酸を含有するァセ トニ ト リル水溶液、 ァセ ト 二 卜 リル濃度 2 %から 35%まで直線的濃度勾配、 ァセ トニ ト リル濃 度は 1 % 分で変化させる。
流速 ： 5 ml/分
温度 ： 40°C
検出 ： 220nm
分取時間 （画分 A) : 39.9分〜 40.4分
4. 逆相 （中性） クロマ トグラフィ （第 3図）
装置 ： 高速液体クロマ トグラフ （ （株） 島津製作所， LC- 10A型）
カラム ： SuperPac Pep-S, 15 u m, 22.5 x 250mm, フ ァゾレマシア （株） 製 溶出溶媒 ： 20mM酢酸ァンモニゥム緩衝液 （PH6.5)を含有する
ァセ トニ ト リル水溶液、 ァセ トニ ト リル濃度 0 %~25%まで直線的 濃度勾配、 ァセ トニ ト リル濃度 0.5 % /分で変化させる。
流速 ： 5 ml/分
温度 ： 40°C
検出 ： 紫外吸収 （220請）
分取時間 ： ①画分 B 41.7分〜 43.2分 （Va卜 Thr-Leu)
②画分 C 45.8分〜 51,0分 （Va卜 Tyr-Pro)
〔実施例 4〕 脂肪細胞分化抑制ペプチ ドの定量
実施例 2で得られたグロビン蛋白分解物中の脂肪細胞分化抑制活性を有するぺ プチ ド画分の定量を実施例 3に示した有効べプチ ドの精製法に準じて行った。 酸加水分解
蛋白量 3 ~ 5 mgに対して、 最終濃度 6 N 塩酸 1 mlを試験管に入れ、 ニンヒ ドリ
ン法の場合は常圧下、 アミ ノ酸分析の場合は減圧下にて封管し、 110°C. 22時間 加熱した。
ニン ヒ ド リ ン法
加水分解後の検体を水酸化ナ ト リ ウムにより PH5.0 に調整し、 0.2Mクェン酸緩 衝液 （PH5.0)を含有したニンヒ ドリ ン試薬を用いて 100°C、 15分間反応させ、 57 Onm における吸光度を測定した。 別に、 標準溶液と していロイシン水溶液 （0.75 , 150, 225, 300nmoles/ml) についてニンヒ ドリ ン反応を行い、 得られた吸光度 から検量線を求め、 検体のいロイシン相当ア ミ ノ基量を算出した。
ぺプチ ドマップ （第 3図）
装置 ： 高速液体クロマ 卜グラフ （ （株） 島津製作所， LC- 6A型） カラム ： Shim-pack ISC-07/S1504 Na, 7 w m， 4. Ox 150mm, (株） 島津製作 所製
溶出溶媒 ： 島津製作所 （株〉 製ァミ ノ酸移動相キ ト （Na型）
流速 ： 0.3 ml/分
温度 ： 55°C
反応液 1 ： 島津製作所 （株） 製分析キッ ト 0PA 試薬
， 検出 ： 蛍光吸収 （Ex 348nm, Em 450nm)
標準溶液
ア ミ ノ酸混合標準液 18成分 H型 （和光純薬工業 （株） ） を 0.2Mクェン酸緩衝液 (PH2.20) により 25倍希釈後、 10/ 1 注入した （各ア ミ ノ酸 1 nmo 1 esZ 10 1 ) 検体溶液
酸加水分解後、 溶液をロータ リ一エバポレーターにより濃縮乾固し、 さらに弒 圧下 12時間以上乾燥させ、 完全に塩酸を除去した。 次に、 各アミ ノ酸含量が 100 nmolseZml程度となるよう 0.2Mクェン酸緩衝液 （pH2.20) に溶解し、 0.45;am フ ィ ルター濾液を 10^ 1 注入した。 アミ ノ酸の同定とピーク面積算出をクロマ トパ ック C-R4A( (株） 島津製作所製） により解析した。 ァミ ノ酸量の算出は、 標準溶 液との面積比により求めた。 アミ ノ酸組成は、 得られたアミ ノ酸含量の合計に対 する各アミ ノ酸量の比率により算出した。
結果は、 収率と して上記表 2に記載した。
〔実施例 5〕 化学合成による H- Val-Thr-Leu-OHの調製
SAM2ペプチ ド合成装置（Biosearch社製） により、 同装置のプロ 卜コールに従つ て H-Va卜 Thr- Leu-OHを合成した。 すなわち、 lgあたり 0.3随 ol の 3 番目の保護ァ ミ ノ酸 Boc-Leu-OHを結合したァシルォキシメチル樹脂 2gを上記べプチ ド合成装置 の反応容器にセッ ト し、 45v/v% ト リフルォロ酢酸（TFA), 2.5v/v%ァニソ一ル， 5 2.5v/v%塩化メチレン（DCM) を含むデブロック液と 20分間接触させて、 Boc基を 除いた。 DCM による洗浄の後、 10v/v%ジイソプロピルエチレンア ミ ンを含む DC M によつて樹脂を中和し、 これをさ らに DCM により洗浄した。 その後、 4. Ommol の Boc-Thr-OH及びジイソプロピルカルポジイ ミ ド（ それぞれ理論当量の 6.7 倍） を含む 20mlの DCM とジメチルホルムア ミ ド（DMF) の混合液中で 2 時間室温にて反 応せしめた。 かかる後、 DMF と DCM で順次洗浄して、 Boc-Thr(Bz)-Leu-PAM 樹脂 を得た。
次に同様の工程に従い、 Boc- Va卜 0Hを力 ップリ ングした。
上記のようにカ ツプリ ングした保護べプチ ド樹脂を 10v/v%ァニソ一ルを含む 無水フッ化水素中で 1 時間 · 0 °Cにて反応させた後、 フ ッ化水素を留去してエー テルによる洗浄を行った。 得られたペプチ ド及び樹脂の混合物から、 50%酢酸に てべプチ ドを抽出し、 凍結乾燥によって約 250mg の粗べプチ ドを得た。
当該粗べプチ ドを 0.1 %TFA に溶解した後、 ォクタデシルシリカ（0DS) カラム (Cosmosil 5C,8, 250 X 20mm: ナカライテスク社製） により、 0.1 %の TFA を含む ァセ トニ ト リ ルの直線的濃度勾配（20 ~70%/50 分， 10ml/分） にて展開した。 目 的とするペプチ ドは、 ァセ トニ ト リ ルの濃度約 50%にて溶出された。
〔実施例 6〕 本発明ペプチ ド等を含む食品の調製
(1) ① 100gの小児用粉ミルクに実施例 2で得たグロビン蛋白含有物を 1 g 添加 して、 脂肪細胞分化抑制能を有する粉ミルクを調製した。
② 100gの小児用粉ミルクに実施例 5で合成した H- Va卜 Thr-Leu-0Hを 0. lg添 加して、 脂肪細胞分化抑制能を有する粉ミ ルクを調製した。
(2) ① 100gのチ ョコ レー トに実施例 2で得たグロビン蛋白含有物を 5 g 添加し て、 脂肪細胞分化抑制能を有するチョコレー 卜を調製した。
② 100gのチ ョコ レー トに実施例 5 と同様の方法で合成した H- Va卜 Tyr- Pro- 0Hを 0.5g添加して、 脂肪細胞分化抑制能を有するチ ョコレー 卜を調製した。
〔実施例 7〕 本発明ペプチ ド等を含む飼料の調製
ビタ ミ ン、 ミ ネラル等が配合されたプレミ ックスに 10重量％の割合で実施例 2 で得たグロビン蛋白含有物を 10重量％、 並びに実施例 5で合成した H-Va卜 Thr- Le u-OHを 1重量％の割合でそれぞれ別個に配合して、 それぞれの当該プレミ ク ッス を市販の養魚用飼料に 10%の割合で添加して、 脂肪細胞分化抑制能を有する養魚 用飼料を調製した。
〔試験例 1〕 グロビン蛋白分解物 （GD) および GDから逆相 HPLCで分取した画分 A (第 2図） の脂肪前駆細胞に対する効果（in vitro)
(1) 分化誘導前処理
スイスマウス由来 3T3-L1細胞を細胞培養用ディ ッシュに約 3 X 104 cells/mlの 細胞密度で播種した。 培地はダルべッコ改変ィ一グル培地（DMEM)にゥシ胎児血清 を 10%添加したものを用い、 培養は全て 37°C,5%C02 -95 % Μτ の環境下で行つ た。
細胞の単層形成後、 細胞表面をリ ン酸緩衝生理食塩液 （PBS)にて洗浄し、 GD及 び画分 Αをそれぞれ 0,2, 4, 8ng/m 1および 0， 20, 40， 80 w g/m 1 割合で含む培地を加 え、 2 日間培養した。 その後、 細胞表面を PBS にて洗浄し、 脂肪細胞分化誘導物 質（ デキサメ サゾン； 0.25 w M, 1-メ チル -3-イ ソプチルキサンチン； 0.5mM, イ ン ス リ ン； 10 B/ml) を添加した培地を加え、 2 日間培養を行った。
その後、 分化誘導物質を含む培地を除去し、 同様に PBS にて細胞表面を洗浄し 、 イ ンスリ ン 10 g/mlを添加した培地を加え、 約 1 週間培養した。
画分 Aの脂肪前駆細胞に対する効果は、 細胞中のマーカ一酵素と して、 グリセ ロール- 3-リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ活性（GPDH)を常法通り測定することによって 判定した。
(2) 分化誘導後処理
スイスマウス由来 3T3- L1細胞を用い、 前記（1) と同様の方法で細胞培養後、 GP DH活性を測定した。 ただし、 GDおよび画分 Aにはイ ンス リ ン 10 g/ralを含む培地 と共に、 分化誘導物質を含む培地の除去後に添加した。
以上の結果は、 表 3 に示すごと く、 GDおよび画分 Aには、 分化誘導前後の処理 で、 濃度に依存した顕著な GPDH活性の抑制作用が認められ、 これらの成分が脂肪 細胞の分化抑制に効果的であることが示された。
表 3 GDおよび画分 Aの脂肪細胞分化に対する効果（in vi tro)
〔試験例 2〕 脂肪分化抑制ペプチ ド （化学合成品） の脂肪前駆細胞に対する分化 抑制効果（in vitro)
化学合成した H-Va卜 Thr-Leu-OHおよび実施例 5 と同様の方法で得られた H-Va卜 Tyr-Pro-OHのスィスマウス由来 3T3-L1細胞に対する効果を、 実施例 5の方法に従 つて調べた。 培地中の各ペプチ ドの濃度は、 いずれも 0, 0.2, 0.4，及び 0.8 u g/ml と した。
結果は表 4 に示すごと く、 H- Va卜 Thr-Leu-0Hおよび H- Va卜 Tyr- Pro- 0Hは分化誘 導前後の処理で、 濃度に依存した顕著な GPDH活性の抑制作用が認められ、 当該成 分が脂肪細胞の分化抑制に効果的であることが示された。
表 4 脂肪分化抑制ペプチ ド （化学合成品） の脂肪前駆細胞に対する分化抑 制効果
*① ： H-Va卜 Thr-Leu- 0H、 *② ： H-Va卜 Tyr- Pro-OH
〔試験例 3〕 脂肪分化抑制ペプチ ド （化学合成品） の効果 （in vivo) 実施例 5に示した方法によって合成した本発明べプチ ドである 2種の脂肪細胞 分化抑制べプチ ド Va卜 Thr-Leu および Va卜 Tyr- Pro にっき in vivo 脂肪細胞增加 に及ぼす効果を検討した。 試験方法はグロビン蛋白分解物を用いた試験例 1 と同 様に行った。
その結果、 表 5 に示すごとく、 2種の脂肪細胞分化抑制ペプチ ドはいずれも 20 PPm という少量添加によって皮下脂肪組織、 副睾丸周囲脂肪組織、 後腹膜壁周囲 脂肪組織の細胞数を減少させ、 マウス 3T3-L1細胞を用いた in vitro試験成績とほ ぼ対応する結果が得られた。
表 5 マウス脂肪組織細胞数の増加に対する
脂肪細胞分化抑制べプチ ド合成品の影響 処 置 皮下脂肪 副睾丸周囲 後腹膜壁周囲 通常食 99* 68 20
50%脂肪食 228 124 41
20ppm 102 88 23
+ Val-Tyr-Pro 20ppm 125 102 27
* 脂肪細胞数 （平均土標準誤差、 DNA / g/脂肪組織）
〔試験例 4〕 グロビン蛋白分解物の脂肪細胞分化に及ぼす効果（in vivo) 本発明べプチ ドを必要量含有するグロビン蛋白分解物の脂肪組織中の脂肪細胞 数に対する効果について in vivo 試験で検討した。
ココア添加によって脂肪含量を 10%と し、 通常食の 2倍量の脂肪含量を有する 飼料ラッ ト （Wistar系雄性） 4週間自由摂取させると、 副睾丸周囲脂肪組織の細 胞数は 138 X 106コとなり、 通常飼料摂取群の 113 X 106コと比詨して 22%増加 していた （表 6 ) 。 この時、 10%脂肪添加飼料にグロビン蛋白分解物を 1 w/rt添 加しておく と、 脂肪細胞数は 119X 10βに増加が抑制されており、 通常食摂取ラ ッ 卜と同程度に抑えられることが示された。 この結果は、 後腹膜壁周囲脂肪組織 においても同様であり、 グロビン蛋白分解物や小麦グルテン分解物が脂肪摂取過 多による脂肪細胞数の増加を抑えることを示唆している。
表 6 ラ ッ ト脂肪細胞増加に及ぼす蛋白分解物の影響 処 置 脂肪細胞数' 細胞容積2 組織重量3 副睾丸周囲脂肪
通常食 113 6. 6 5. 3
10 %脂肪 130 9. 6 8. 7
+蛋白分解物 119 10. 4 8. 6 後腹膜壁周囲脂肪
通常食 77 7. 2 3. 9
10 %脂肪 97 9. 4 6. 4
+蛋白分解物 79 11. 5 6. 4
1 ： 106個/ 脂肪組織
2 ： 脂肪 mg/ gD NA
3 ： 組織重量（g )
次いで、 マウスに 50 %脂肪食を摂取させて脂肪組織重量および細胞数について 調べた。 結果は表 7に示した。
50 %脂肪食摂取によっていずれの脂肪組織も通常食摂取時の 2倍以上に増加し 、 対応して組織中の細胞数も増加していた。 しかし、 グロビン蛋白分解物を 2 ~ 12w/rt配合しておく と、 用量依存的に重量増加および細胞数増加が抑えられてい た。
表 7 脂肪組織增加に対するグロビン蛋白分解物の影響 処 置 皮下脂肪 副睾丸周囲 後腹膜壁周囲 通常食 1.16土.14' 0.83±.07 0.22±.03
105± 132 79± 13 17±3
50%脂肪食 3.68±.53 2.07±.24 0.54±.06
213±26 134± 15 34土 5
+ 2 'nビン蛋白分解物 2.77土.17 1.72±.09 0, 42±.02
143士 6" 106± 5 29士 1
+ 4¾グ πビン蛋白分解物 2.74±· 27 1.66±· 22 0.45±.02
133± 14·· 98土 12 34 ± 4
+ 8%グ Dビン蛋白分解物 2.41土.18* 1.37±· 08·· 0.40±.06··
131土 8" 95土 9" 27土 3
+ 12%グ nビン蛋白分解物 1.96土.10·· 1.24±.11" 0.36±.03"
103士 6·'· 75±12** 22土 2·
+ クレンブテロール 2ppm 1.49±.22'" 0.97土.11**· 0.28±.04···
96土 8*** 79土 7'.' 18土 2·'
1 ： 上段、 脂肪組織重量 （平均土標準誤差， g)
2 : 下段、 脂肪細胞数 （平均士標準誤差， DNA g/脂肪組織）
有意差 ： * pく 10%, ** p< 5 %, **t p< 1 %
表 7に示した脂肪組織の細胞数は脂肪細胞、 脂肪前駆細胞、 線維芽細胞、 血管 細胞等を含めた値であるので、 皮下脂肪組織中の細胞を脂肪細胞、 脂肪前駆細胞 、 間質細胞 （ス トローマ） に分けて詳細に調べた。
結果は表 8 に示すよ う に、 特にス トローマと して表されている間質細胞群中の 線維芽細胞から脂肪前駆細胞へ分化が抑えられることが判明した。
表 8 グロビン蛋白分解物の脂肪組織細胞分布に及ぼす影響 処 置 ス トロ一マ 脂肪前駆細胞 脂肪細胞 通常食 61 17 27
50%脂肪食 61 76 76
+ 2%グ Dビン蛋白分解物 37 58 47
+ 4«'πビン蛋白分解物 43 48 42
+ 8«'πビン蛋白分解物 48 37 47
+12 πビン蛋白分解物 41 24 38
+ クレンブテロ一ル 2ppm 36 30 30 これらの結果は、 グロビン蛋白分解物が線維芽細胞の脂肪前駆細胞や脂肪細胞 など脂肪貯蔵細胞への分化を抑制し、 脂肪細胞分化抑制べプチ ドのみならずグロ ビン蛋白分解物と してもこのような効果によって肥満症の予防 ·治療やそれに伴 う循環器系疾患の予防 ·治療に有用性があることを示唆している。
〔試験例 5〕 本発明べプチ ドの安全性試験
雌雄の ICR 系マウスに本発明べプチ ドを、 Va卜 Tyr-Pro と Va卜 Thr-Leu の投与 割合を変更しつつ（0:1, 1:1, 1:0) 、 10g/Kg体重以上 （投与可能最大量） それぞれ 経口投与を行ったが死亡例はなかった。 図面の簡単な説明
第 1図は、 グロビン蛋白分解物のゲルク口マ トグラムを示す図であり、 第 2図 は、 実施例 3における逆相 （酸性） クロマ トグラムを示す図であり、 第 3図は、 実施例 3における逆相 （中性） クロマ トグラムを示す図である。 産業上の利用可能性
本発明により、 新規の脂肪細胞分化抑制ペプチ ド、 並びに当該ペプチ ドを有効 成分とする脂肪細胞分化抑制剤、 脂肪分化抑制機能を有する特定保健用食品 （い
わゆる機能性食品） 、 及び脂肪細胞分化抑制機能を有する飼料が提供される。 さ らには前記脂肪細胞分化抑制べプチ ドを含む蛋白分解物を含む、 脂肪分化抑制機 能を有する特定保健用食品及び脂肪細胞分化抑制機能を有する飼料が提供される 。 本発明により、 人若しく は動物の肥満及びそれに伴う高血圧症や動脈硬化症等 の循環器系疾患の予防や治療が可能になる。 さらには、 家畜や養殖魚における肉 質の改善が可能になる。
Claims
1 . アミ ノ酸配列が Va卜 Tyr- Pro 又は Va卜 Thr-Leu である、 脂肪細胞分化抑制能 を有するぺプチ ド。
2. 請求の範囲 1 に記載したぺプチ ドを有効成分と して含むことを特徴とする脂 肪細胞分化抑制剤。
3. 請求の範囲 1 に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するぺプチ ドを有効成分と して含有することを特徴とする、 脂肪細胞分化抑制機能を付与した特定保健用食
4. 請求の範囲 1 に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するぺプチ ドを配合してな る脂肪細胞分化抑制能を付与した飼料。
5. 請求の範囲 1 に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するぺプチ ドを 0.1 重量％ 以上含有することを特徴とする蛋白分解物を有効成分と して含有するこ とを特徴 とする、 脂肪細胞分化抑制機能を付与した特定保健用食品。
6. 請求の範囲 1 に記載した脂肪細胞分化抑制能を有するぺプチ ドを 0.1 重量％ 以上含有することを特徴とする蛋白分解物を配合してなる飼料。
Priority Applications (9)
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