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WO1996000585A1 - Conjugues d'analogues de diphosphates ou triphosphates - Google Patents

Conjugues d'analogues de diphosphates ou triphosphates Download PDF

Info

Publication number
WO1996000585A1
WO1996000585A1 PCT/FR1995/000872 FR9500872W WO9600585A1 WO 1996000585 A1 WO1996000585 A1 WO 1996000585A1 FR 9500872 W FR9500872 W FR 9500872W WO 9600585 A1 WO9600585 A1 WO 9600585A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
triphosphate
formula
nucleoside
diphosphate
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/000872
Other languages
English (en)
Inventor
Christophe Creminon
Jacques Grassi
Philippe Pradelles
Charles Mioskowski
Luc Lebeau
Mourad Saady
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique, Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Publication of WO1996000585A1 publication Critical patent/WO1996000585A1/fr

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid

Definitions

  • the invention relates to conjugated compounds formed from a diphosphate or triphosphate analog and from a molecule chosen from antigenic carriers and enzymes.
  • conjugated compounds in which the analogs are analogs of diphosphates or triphosphates of nucleosides which are of great interest in biology, such as adenosine diphosphate (ADP) and adenosine triphosphate (ATP) .
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • living cells capture, store, and transport energy in chemical form, essentially in the form of adenosine triphosphate (ATP). ATP can transmit its energy to certain other molecules and thus release its terminal phosphate group; the energy-rich ATP molecule then becomes adenosine diphosphate
  • ADP phosphate group to become 1 ATP again thanks to a supply of solar energy in photosynthetic cells, or chemical energy in animal cells.
  • ATP is the main connecting link between two major sets of enzyme-catalyzed reactions in cells.
  • One of these sets conserves chemical energy from the environment by causing phosphorylation of energy-poor ADP, energy-rich ATP.
  • the other set uses the energy of ATP to biosynthesize cellular components from simple precursors, to do mechanical work. necessary for contraction and locomotion, or to perform osmotic work of membrane transport.
  • These sets of enzyme catalyzed reactions are almost identical in all living species.
  • ATP or ADP can be used in many techniques, for example to immobilize, orient or transport molecules of biological interest.
  • these techniques are limited due to the low chemical stability of ATP and ADP (hydrolysis of phosphoric anhydride bonds). It would therefore be of great interest to have analogs of ATP or ADP, which are not hydrolysable to fulfill these functions.
  • diphosphates and triphosphates of interest are the diphosphates and triphosphates of anti-viral nucleoside agents such as 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT), dideoxyinosine (ddl), dideoxycytidine (ddC) and 2 ', 3' -dehydro-3'-deoxy-thymidine (d_] T), which are anti-HIV drugs.
  • anti-viral nucleoside agents such as 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT), dideoxyinosine (ddl), dideoxycytidine (ddC) and 2 ', 3' -dehydro-3'-deoxy-thymidine (d_] T), which are anti-HIV drugs.
  • anti-viral nucleoside agents such as 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT), dideoxyinosine (ddl), dideoxycy
  • conjugate compounds obtained by coupling diphosphates or triphosphates analogs of anti-viral nucleoside agents with biological molecules would be of great interest for carrying out immunological assays of the phosphorylated metabolites of these anti-viral agents in subject patients. to treatment with such agents.
  • One of the major problems encountered during therapeutic treatment of AIDS is the extreme variability of response from one patient to another, this being further complicated by the appearance of phenomena of resistance to drugs.
  • one of the primary objectives identified during the last Berlin meeting on AIDS (9 th International AIDS Conference, Berlin, 7-11 June 1993) is good to quantify in patients the active metabolites of the various antiviral drugs administered.
  • nucleoside molecules For almost all of these nucleoside molecules, the mechanism of action involves phosphorylation of nucleotide 5'-triphosphate under the action of cellular kinases.
  • AZT for example, penetrates the cell membrane and under the effect of kinases undergoes phosphorylations which makes it active to selectively inhibit HIV reverse transcriptase while also being incorporated at the 3 'end of the strands of viral DNA in the process of growth, thus playing a role of chain terminator.
  • viral strains that have become resistant to AZT have also recently been isolated. This has led to the marketing of other drugs such as ddl or ddC whose mode of action is very similar to that of AZT.
  • nucleosides have also been shown to be potent inhibitors of HIV replication. All these compounds act according to the same mechanism as AZT, that is to say inhibition of reverse transcriptase in the form of nucleotide triphosphates produced by the action of cellular kinases. Their activity is therefore related to their phosphorylation speed and their affinity for reverse transcriptase, but also to their possible catabolism (under the action of phosphorylases, phosphatases, deaidases ). Given this, it is clear that from one patient to another, there will be great variability in the response to antivirals. Thus the possibility of rapidly and effectively measuring the concentrations of phosphorylated metabolites in each treated individual should allow a better dosage adjustment and more effective therapeutic monitoring.
  • HPLC techniques are the most used. They have the advantage of allowing a quantitative assay of phosphorylated metabolites of AZT. However, they are limited in terms of sensitivity ( ⁇ lng / ml) (large blood test to have a sufficient number of cells) and they require the use of extraction methods (problems linked to plasma interference).
  • the immuno-analytical techniques are more sensitive ( ⁇ 0, lng / ml), simpler to implement, but those described so far do not make it possible to discriminate AZT from phosphorylated metabolites for reasons related to the strategy for obtaining the antibodies necessary for the assay.
  • - sensitive to avoid too large a test portion and to minimize non-specific interference by dilution
  • - specific to be able to specifically dose AZT and its phosphorylated metabolites, particularly 5'-triphosphate
  • the present invention specifically relates to conjugated compounds of analogs of diphosphates and triphosphates of nucleosides coupled to antigenic carriers, which allow precisely obtaining antibodies specific for the metabolites of these anti-viral agents.
  • These compounds must have the double characteristic of: - have stable phosphate bonds (di or tri),
  • It also relates to conjugated compounds of analogs of diphosphates or triphosphates of nucleosides coupled to enzymes, which can be used as markers in enzymo-immunological assays of these metabolites.
  • the conjugate compound of a diphosphate or triphosphate analog and of a molecule chosen from antigenic carriers and enzymes in which the analog corresponds to the formula:
  • n 0 or 1
  • R 2 , R3 and R ⁇ which may be the same or different, represent a hydrogen atom, NH4, a quaternary ammonium ion or an ion of formula M + ⁇ v with M representing a metal and v being the state of valence of this metal, and
  • R - R ⁇ is a group derived from a nucleoside, and in which the analog is coupled to said molecule, either via the group R ⁇ derived from nucleoside, either through one of the groups R 1 , R 2 , R-3 and R 4 , provided that X 1 does not represent CH2 when n is equal to 0.
  • this conjugate compound of a diphosphates or triphosphates analog corresponding to formula (I) given above is very advantageous, because the replacement of the POP polyphosphate chain of the natural diphosphate or triphosphate by a PX 1 chain -? or P-xi-PX 2 - ?, leads to a stable, non-hydrolyzable compound.
  • the analog is a triphosphate analog, n being equal to 1 in the above formula.
  • nucleoside derivatives such as antiviral agents
  • their ultimate mode of action is the blocking of the transcription and replication mechanisms by insertion of the therapeutic agent , metabolized to triphosphate by different cellular kinases, in the DNA or RNA chain (Aids, the unanswered questions, Science 1993, 260, 1253-1293).
  • the 3 ′ position of the sugar, deprived of its hydroxyl group does not allow the anchoring of another nucleotide and the therapeutic agent thus plays a role of "chain terminator". Consequently, it is absolutely obvious that the most interesting metabolite to be assayed is the nucleotide triphosphate which constitutes the biologically active species.
  • the analog can also be a diphosphate analogue
  • n 0 and X represents NR or a halomethylene group.
  • the analogs of formula (I) it is possible to induce the synthesis of anti-triphosphate antibodies of anti-viral agent, for example of anti-AZT-5 '-triphosphate antibodies using this chemical analog where the polyphosphate chain is stabilized and whose chemical and conformational structure mimics that of the natural triphosphate chain so that the antibodies produced using this stable analog recognize with high affinity AZT-5 '-triphosphate .
  • the conjugated compound is an immunogen intended for the production of antibodies.
  • the molecule coupled to the nucleoside diphosphate or triphosphate analog is an antigenic carrier.
  • the coupling is carried out by means of a spacer arm grafted on the pyrimidine or purine base of the nucleoside, which comprises at its other end a group capable of reacting with the antigenic carrier, for example an H2 group.
  • spacer arm on the nucleoside can be carried out either on an exocyclic H2 group in the case where the base of the nucleoside comprises such a group, or on a nitrogen atom present in the base cycle. It can also be carried out on sugar or on the phosphorus chain.
  • the spacer arm is generally a saturated hydrocarbon chain.
  • other spacers can be used, for example a polyoxyethyene (CH2-CH2-O) n or a polyol - (CHOH) n .
  • the coupling can also be carried out directly on the nucleoside by means of a spacer fixed on the sugar part of the nucleoside.
  • the group capable of reacting with the antigenic carrier is an NH2 group, but it is also possible to use other groups capable of reacting with the antigenic carrier, for example a COOH, maleimide, thil, aniline group.
  • the conjugated compound comprising a diphosphate or triphosphate analog coupled to an antigenic carrier can correspond to the following formula:
  • R 7 is a bivalent group derived from a nucleoside
  • n is equal to 0 or 1
  • X 1 and X 2 have the meanings given above
  • p is equal to 0 or is an integer ranging from 1 to 6 and Z is an antigenic carrier.
  • R 7 - (CH2) p - H- can answer the following formulas:
  • R5 is derived from a nucleoside antiviral agent such as those of formulas:
  • the antigenic carriers capable of being coupled to the nucleoside diphosphate or triphosphate analog to form the conjugated compound serving as an munogen can be of different types. Proteins such as bovine albumin, ovalbumin, polylysine and ⁇ -lactoglobulin can be used in particular, for example 12
  • the conjugate compound is an enzymatic label.
  • the molecule coupled to the nucleoside diphosphate or triphosphate analog is an enzyme.
  • the enzymes that can be used are those that have interesting properties (sensitivity, detection threshold) for immunoassays.
  • o can cite peroxidases,, phosphatases and ⁇
  • acetylcholinesterases such as acetylcholinesterase from Electrophorus electricus.
  • This coupling can also be carried out by means of suitable reagents on an NH2 group of the nucleoside of the diphosphate or triphosphate analog.
  • suitable reagents on an NH2 group of the nucleoside of the diphosphate or triphosphate analog.
  • nucleoside diphosphates and triphosphates used in the invention can be prepared by reaction of a diphosphate or triphosphate of formula:
  • X ⁇ , X 2 and n have the meanings given above, and R ⁇ is a hydrocarbon group, with a nucleoside derivative whose reactive functions are protected by appropriate groups except for the primary alcohol function of the sugar part of the nucleoside.
  • the analog is prepared by a double Arbuzov reaction between a mixed phosphite and an aryl or alkyl bis- (halomethylene) phosphinate.
  • the starting materials used in this reaction can be prepared by conventional methods.
  • bis- (halomethylene) phosphinate can be prepared according to the methods described by Ivanov et al in Zh. Obshch. Khim., 1967 37 (8), p.
  • the mixed phosphite can be prepared by successive reactions of different alcohols R 8 OH, R 9 OH on PCI3 in the presence of a base.
  • the Arbuzov reaction is carried out at a temperature of 140 ° C., under low pressure, for example under 4 mm of mercury.
  • the reaction medium is further subjected to violent stirring to continuously remove the halide formed R ⁇ X.
  • triphosphates of formula (III) in which X 1 and X 2 represent the group NR ⁇ with the two R ⁇ together forming a hydrocarbon chain as defined above can be prepared by a process which comprises the following steps: a) reacting a chlorophosphate of formula:
  • the diamine used as the starting material in this reaction can be synthesized by conventional methods such as those described by Carpino in J. Org. Chem., 1986, 51, p. 4768-4779.
  • the first reaction corresponds to a diphosphorylation of the diamine and this reaction can be carried out in the presence of two equivalents of triethylamine.
  • This reaction is very rapid and allows the diphosphoramide to be obtained with a high yield.
  • the diphosphoramide is then cyclized with a dichlorophosphite in the presence of triethylamine and 4-dimethylaminopyridine, in an appropriate organic solvent such as tetrahydrofuran.
  • the oxidation of the cyclized product can then be carried out with 4-chloroperoxybenzoic acid.
  • the diphosphate analog used in this process can be prepared from the corresponding imidodiphosphate in which Cl is replaced by OH, by reaction with hydrochloric acid.
  • diphosphates of formula (III) in which X ⁇ is a methylene group can be prepared by a process which consists in reacting a chlorophosphate of formula:
  • the diphosphates of formula (III) in which X 1 is the group NH can be prepared by a process which consists in reacting the compound of formula:
  • the precursor pentachloride can be prepared by the method described by Emsley et al in J. Chem. Soc. A., 1971, p. 2873.
  • reaction scheme for the preparation of a non-hydrolyzable analogue of ATP provided with a spacer arm for coupling with an antigenic carrier or an enzyme is described below.
  • the coupling between the triphosphate analog and the modified nucleoside is carried out by activation of the alcohol in position 5 'on the sugar to form the
  • nucleoside triphosphate 20 nucleoside triphosphate.
  • the chlorine on the base of the nucleoside is then displaced by nucleophilic substitution with a diamine precursor.
  • the final molecule is obtained by catalytic hydrogenation.
  • the triphosphate analog is produced by activation of the primary sugar alcohol which then reacts with the triphosphate analog.
  • the final deprotection is carried out as previously by catalytic hydrogenation.
  • the nucleoside is prepared in two stages from a thymidine derivative described in the literature.
  • the coupling with the triphosphate analog is carried out as above.
  • the final deprotection is carried out with triethyl silyl bromide (TMSBr) followed by passage through basic medium.
  • TMSBr triethyl silyl bromide
  • nucleosides To couple these diphosphates or triphosphates analogs of nucleosides with an enzyme or an antigenic carrier, conventional techniques of coupling by covalent bond are used between a reactive group carried by the nucleoside and a reactive group carried by the enzyme or antigenic carrier such as lysyl, tyrosyl, histidyl, tryptophanyl or glutamyl groups.
  • the reactive groups of the nucleoside can be constituted by acid, amino, phenol, hydroxyl or ketone functions.
  • Coupling reactions can be carried out using reagents such as carbodiimides, gluraraldehyde, benzidine, mixed anhydrides, activated hapten esters and para-aminophenyl acetic acid.
  • the conjugate compounds of the invention can be used either as immunogens or as enzyme markers.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of antibodies specific for a nucleoside diphosphate or triphosphate of formula:
  • n 0 or 1 and R ⁇ represents a nucleoside derivative, which consists
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , X 1 and X 2 have the meanings given above for the formula (I), and n and R 5 have the meanings given above for the formula (V ), coupled to an antigenic carrier, and
  • nucleoside diphosphates or triphosphates analogs starting from the conjugate compound described above, by the technique of Kohler and Milstein.
  • the invention also relates to a method for the immunological determination of a nucleoside diphosphate or triphosphate of formula:
  • R ⁇ > is an identical or different nucleoside derivative R ', has the meaning given for the formula (V), and R 1 , R 2 , R 4 , -'- and X 2 have the meanings given for the formula (I), p limited sites of an antibody specific for said analog, then determining the amount of conjugated compound attached to the antibody.
  • This assay method can be applied to the adenosine triphosphate (ATP) assay or to the assay of a metabolite of an anti-viral nucleoside ag such as anti-HIV drugs such as A
  • the attached figure is a diagram illustrating the result of immunoassays carried out in accordance with the invention, that is to say the variation of the B / BO ratio in which B represents the enzymatic activity linked to the antibody in the presence of a substance to be assayed, and B0 represents the enzymatic activity linked to the antibody in the absence of 24
  • substance to be dosed depending on the concentration (in pmol / ml) of substance to be dosed.
  • H5 f 3.42 (m, 2H, Ha); 2.77 (m, 2H, Hd); 2.26-1.96 (m, 4H, He, Hf); 1.58 (m, 4H, Hb, Hc).
  • the efficiency of the coupling is evaluated after filtration through a G25 column, by measuring the absorbance in the ultraviolet. These measurements showed that approximately 12 molecules of compound No. 12 were fixed by molecules of KLH (for an assumed molecular mass of 100,000 kDa).
  • Example 9 Preparation of anti-compound antibody No. 12
  • three 2.5 kg white Bouscat rabbits are used, which are treated as follows.
  • An emulsion is prepared by mixing 1 ml of the immunogen solution, ie 2.5 mg of the conjugate compound No. 12-KLH of Example 8, with 1 ml of distilled water and 2 ml of complete Freund's adjuvant . To the day 45
  • each rabbit receives an injection of 1 ml of the above-mentioned emulsion intradermally, on the back at 50 points.
  • Example 10 Preparation of a compound conjugate No. 12-acetyl cholinesterase from Electrophorus Electricus.
  • the coupling between compound No. 12 and the acetylcholinesterase (AChE) of Electrophorus electricus (form G4) is obtained by means of a heterobifunctional reagent N-succinimidyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (CMCC).
  • CMCC N-succinimidyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • This method involves the reaction of a thiol group (previously introduced into compound No. 12) at the level of the primary amine function) with maleimide groups introduced on the surface of AChE by treatments with SMCC.
  • AChE-SMCC Preparation of AChE-SMCC: at this stage, the active succinimidyl-ester function of the SMCC reacts with the primary amine functions of the enzyme.
  • AChE is first treated with an excess of N-ethyl-maleimide so as to block all the thiol functions possibly present on the surface of the enzyme.
  • the reaction with the SMCC is carried out in a 0.1M phosphate buffer, pH 7.4.
  • thiols are measured by reaction of 150 ⁇ l of DTNB 10 ⁇ 3 M with 50 ⁇ l of thiol-containing compound No. 12. At this stage, the concentration of thiol groups is 4.4. 10 ⁇ . 11.5 ⁇ l of thiol-containing compound No. 5 (5 nmol) are then added to 350 ⁇ l of a G4-SMCC solution (0.5 nmol). After 3 hours of reaction at 30 ° C, the conjugate is purified by filtration on a 0.5 m Biogel column and stored at -20 ° C until use.
  • Example 11 Enzyme-immunological determination of adenosine triphosphate (ATP) of formula:
  • micro-titration plates are used, the wells of which are coated with a mouse anti-rabbit IgG monoclonal antibody.
  • 50 ⁇ l of a diluted antiserum solution obtained in Example 9 50 ⁇ l of the conjugate obtained in Example 10 at a concentration of 1 unit / ml, and 50 ⁇ l of a solution are introduced into each of the wells Compound No. 12 or ATP standard.
  • the plates are washed with a 48
  • Curve 1 relates to compound No. 12 and curve 2 relates to ATP.
  • Example 13 Determination of A-tetra-P of formula: 49
  • Example 14 Determination of adenosine monophosphate AMP of formula:
  • Adenosine 5'-monophosphate The same procedure is followed as in Example 11 to carry out this assay using the same antiserum and the same enzymatic conjugate.
  • Example 11 The same procedure is followed as in Example 11 for determining the adenosine, the dideoxy-ATP and the azido-ATP of formula:
  • the recognition of the antibodies involves both the phosphate chain and the sugar, which guarantees the absence of cross-reaction with the natural nucleotides and nucleosides, in the case of the assay of phosphorylated metabolites of antiviral agents such as AZT .
  • the acetamide obtained is stirred for 24 hours at room temperature and in a sealed tube, in 3 ml of methanol saturated with ammonia. The solvent is evaporated off and the residue is purified by chromatography on reverse phase silica (RP 18) (acetonitrile / water: 100/0 to 0/100). 32 mg of a hygroscopic white solid are obtained which corresponds to the ammonium salt of the desired compound (yield: 76%).
  • Example 19 Preparation of a compound conjugate of compound No. 14 with keyhole limpet hemocyanin (KLH).
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • An emulsion is prepared by mixing 1 ml of the immunogen solution, ie 4 mg of the conjugate compound No. 14-KLH of Example 19, with 1 ml of distilled water and 2 ml of complete Freund's adjuvant.
  • each rabbit receives an injection of 1 ml of the abovementioned emulsion by the intradermal route, on the back at 50 points.
  • Example 21 Preparation of a compound conjugate No. 14-acetyl cholinesterase from Electrophorus Electricus.
  • SMCC cyclohexane-1-carboxylate
  • the lyophilisate of compound No. 14-SATA is taken up in 0.8 ml of 0.1M phosphate buffer pH 6 before adding 200 ⁇ l of 1M hydroxylamine. After 10 minutes of reaction at room temperature, the thiols are measured by reaction of 100 ⁇ l of 10 " 3M DTNB with 100 ⁇ l of thiol-containing compound No. 14. At this stage, the concentration of thiol groups is 1.3 ⁇ 10 ⁇ 3 M. 1.9 ⁇ l of thiol-containing compound No. 14 (5 nmol) are then added to 175 ⁇ l of a G4-SMCC solution (0.25 nmol). After 3 hours of reaction at 30 ° C., the conjugate is purified by filtration on a 0.5 m Biogel column and stored at -20 ° C until use.
  • Example No. 22 Preparation of a compound conjugate of compound No. 15 with keyhole limpet hemocyanin (KLH).
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • An emulsion is prepared by mixing 1 ml of the immunogen solution, ie 4 mg of the conjugate compound No. 15-KLH of Example 22, with 1 ml of distilled water and 2 ml of complete Freund's adjuvant.
  • each rabbit receives an injection of 1 ml of the abovementioned emulsion by the intradermal route, on the back at 50 points.
  • Example 24 Preparation of a compound conjugate No. 14-acetyl cholinesterase from Electrophorus Electricus.
  • SMCC N-succinimidyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • reaction product (compound No. 15-SATA) is purified on a cartridge of Seppak C18. The methanolic eluate is lyophilized and stored at -20 ° C until use.
  • the lyophilisate of compound No. 15-SATA is taken up in 0.8 ml of 0.1M phosphate buffer pH 6 before adding 200 ⁇ l of 1M hydroxylamine. After 10 minutes of reaction at room temperature, the thiols are measured by reaction of 100 ⁇ l of DTNB 10 ⁇ 3 M with 100 ⁇ l of thiol-containing compound No. 15. At this stage, the concentration of thiol groups is 9.10 -4 M. Then add 2.8 ⁇ l of thiol-containing compound No. 14 (5 nmol) to 175 ⁇ l of a G4-SMCC solution (0.25 nmol) . After 3 hours of 62
  • the conjugate is purified by filtration through a 0.5 m Biogel column and stored at -20 ° C until use.

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Abstract

L'invention concerne des conjugués d'analogues de diphosphates ou triphosphates avec des enzymes ou des porteurs antigéniques et un dosage immunologique utilisant de tels conjugués. Dans ces conjugués, l'analogue de diphosphate ou triphosphate répond à la formule (I) dans laquelle n est égal à 0 ou à 1, X1 et X2 qui peuvent être CH¿2?, CHF, CF2, CC12, CHC1 ou NR?6, R1, R2, R3 et R4¿ représentent un atome d'hydrogène, NH¿4?+, un ion ammonium quaternaire ou M+1/v, et R5 est un groupe dérivé d'un nucléoside, et il est couplé à l'enzyme ou au porteur antigénique, soit par l'intermédiaire du groupe R5 dérivé de nucléoside, soit par l'intermédiaire de l'un des R?1, R2, R3 et R4¿. De tels composés conjugués sont utilisables pour le dosage de métabolites phosphorylés d'agents anti-viraux tels que l'AZT.

Description

Conjugues d'analogues de dlphosphates ou trlphosphates
L'invention a pour objet des composés conjugués formés d'un analogue de diphosphate ou de triphosphate et d'une molécule choisie parmi les porteurs antigéniques et les enzymes.
De façon plus précise, elle concerne des composés conjugués dans lesquels les analogues sont des analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléosides qui sont d'un grand intérêt en biologie, tels que l'adénosine diphosphate (ADP) et l'adénosine triphosphate (ATP) . En effet, les cellules vivantes captent, stockent, et transportent de l'énergie sous forme chimique, essentiellement sous forme d'adénosine triphosphate (ATP) . L'ATP peut transmettre son énergie à certaines autres molécules et libérer ainsi son groupement phosphate terminal ; la molécule d'ATP riche en énergie devient alors de l'adénosine diphosphate
(ADP) dont l'énergie a diminué, mais qui peut regagner un groupe phosphate pour redevenir de 1 'ATP grâce à un apport d'énergie solaire dans les cellules photosynthétiques, ou d'énergie chimique dans les cellules animales.
L'ATP est le principal chaînon de connexion entre deux grands ensembles de réactions catalysées par des enzymes dans les cellules. L'un de ces ensembles conserve l'énergie chimique provenant de l'environnement en provoquant la phosphorylation d'ADP pauvre en énergie, en ATP riche en énergie. L'autre ensemble utilise l'énergie de l'ATP pour effectuer la biosynthèse des composants cellulaires à partir de précurseurs simples, pour faire un travail mécanique nécessaire à la contraction et la locomotion, ou pour effectuer un travail osmotique de transport membranaire. Ces ensembles de réactions catalysées par des enzymes sont pratiquement identiques chez toutes les espèces vivantes.
Aussi, on peut faire appel à l'ATP ou à l'ADP dans de nombreuses techniques, par exemple pour immobiliser, orienter ou transporter des molécules ayant un intérêt biologique. Cependant, ces techniques sont limitées en raison de la faible stabilité chimique de l'ATP et de l'ADP (hydrolyse des liaisons anhydride phosphorique) . Il serait donc d'un grand intérêt de disposer d'analogues de l'ATP ou de l'ADP, non hydrolysables pour remplir ces fonctions.
D'autres analogues de diphosphates et triphosphates intéressants sont les diphosphates et triphosphates d'agents anti-viraux nucleosidiques tels que le 3'-azido-3'-désoxythymidine (AZT) , le didésoxyinosine (ddl), le didésoxycytidine (ddC) et le 2', 3 '-déshydro-3'-désoxy-thymidine (d_]T) , qui sont des médicaments anti-VIH.
En effet, des composés conjugués obtenus en couplant des analogues de diphosphates ou triphosphates d'agents anti-viraux nucleosidiques avec des molécules biologiques seraient d'un grand intérêt pour réaliser des dosages immunologiques des metabolites phosphorylés de ces agents anti-viraux chez des patients soumis à un traitement par de tels agents. Un des problèmes majeurs rencontrés lors des traitements thérapeutiques du SIDA est l'extrême variabilité de réponse d'un patient à l'autre, ceci étant encore compliqué par l'apparition de phénomènes de résistance aux médicaments. Ainsi, l'un des objectifs primordiaux dégagés lors de la dernière réunion de Berlin sur le SIDA (9thInternational AIDS Conférence, Berlin, 7-11 Juin 1993) est bien de quantifier chez les malades les metabolites actifs des différents antiviraux administrés. Pour presque toutes ces molécules nucleosidiques, le mécanisme d'action fait intervenir la phosphorylation en nucléotides 5'-triphosphate sous l'action de kinases cellulaires. L'AZT, par exemple, pénétre la membrane cellulaire et sous l'effet de kinases subit des phosphorylations qui le rend actif pour inhiber sélectivement la transcriptase inverse du VIH tout en étant également incorporé à l'extrémité 3' des brins d'ADN viraux en cours de croissance, jouant ainsi un rôle de terminateur de chaîne. Mis à part des problèmes d'effets secondaires, on a également récemment isolé des souches virales devenues résistantes à l'AZT. Ceci a conduit à la mise sur le marché d'autres médicaments comme la ddl ou la ddC dont le mode d'action est très similaire de celui de l'AZT. Un grand nombre d'autres nucléosides modifiés se sont également révélés être des inhibiteurs puissants de la réplication du VIH. Tous ces composés agissent selon le même mécanisme que l'AZT, c'est-à-dire inhibition de la transcriptase inverse sous forme de nucléotides triphosphates produits par l'action des kinases cellulaires. Leur activité est donc en relation avec leur vitesse de phosphorylation et avec leur affinité pour la transcriptase inverse, mais également avec leur éventuel catabolisme (sous l'action de phosphorylases, phosphatases, désa idases... ) . Compte tenu de cela, il est clair que d'un patient à l'autre, on va observer une grande variabilité dans la réponse aux antiviraux. Ainsi la possibilité de mesurer de façon rapide et efficace chez chaque individu traité les concentrations des metabolites phosphorylés devrait permettre un meilleur ajustement de la posologie et un suivi thérapeutique plus efficace.
A ce jour, un certain nombre de dosages quantitatifs de l'AZT ou d'autres antiviraux nucléositiques ont été publiés. Les plus nombreux reposent sur la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (G. Molema et coll. - J. Chromatogra. (1992), 579, 107-114). Des dosages radio-immunologiques (RIA) ont été décrits (S. Tedepalli et R. Quinn dans Clin. Chem. (1989), 35, 1187) et des trousses de dosage RIA ont été commercialisées ("The Immunoassay Kit Directory" Vol. 1; part 4 (1992), E. Nays ith, éd. Kluwer Académie Publishers, Lankaster, UK.) ainsi que d'autres techniques d'immunoanalyse basées sur l'utilisation de marqueurs non radioactifs comme la FPIA (Essai immunologique à polarisation de fluorescence) (G.G. Granich et coll. - Anti icrob. Agents Chemother. (1989) 33, 1275-1279 ou l'ELISA (Essai d*immunoabsorbant lié à une enzyme). (S. Tedepally, R. Quinn - J. Acq. Imm. Def. Syndr. (1990) 3, 19-27). Enfin, une technique microbiologique a été décrite (H. Etesse-Carsenti et coll. - AIDS (1990) 4, 265).
Les techniques HPLC sont les plus utilisées. Elles ont l'avantage de permettre un dosage quantitatif des metabolites phosphorylés de l'AZT. Cependant, elles sont limitées en terme de sensibilité (~lng/ml) (prise de sang importante pour avoir un nombre de cellules suffisant) et elles nécessitent l'utilisation de procédés d'extraction (problèmes liés aux interférences plasmatiques) . Les techniques immuno-analytiques sont plus sensibles (~0, lng/ml) , plus simples à mettre en oeuvre, mais celles décrites jusqu'à présent ne permettent pas de discriminer l'AZT des metabolites phosphorylés pour des raisons liées à la stratégie d'obtention des anticorps nécessaires au dosage.
Les recherches ont donc été poursuivies pour mettre au point un procédé de dosage de metabolites d'agents anti-viraux, répondant aux exigences suivantes :
- sensible (pour éviter une prise d'essai trop importante et minimiser par dilution les interférences non spécifiques) , - spécifique (pouvoir doser spécifiquement l'AZT et ses metabolites phosphorylés particulièrement le 5'-triphosphate,
- simple (pouvoir éviter des étapes de purification, être adapté aux dosages en grande série, pouvoir effectuer le transfert de technologie sans difficulté) , et
- peu coûteux (à l'exception de l'investissement pour développer les outils de la méthode, il doit nécessiter par la suite un équipement simple et peu coûteux) .
Dans cette optique, les techniques immuno-analytiques sont et restent sans ambiguité les plus appropriées. Elles n'ont pas jusqu'à présent donné satisfaction pour le dosage des metabolites phosphorylés car les immuno-analystes se sont trouvés devant la difficulté d'obtenir des anticorps spécifiques de ces metabolites. En effet, l'AZT-5'-triphosphate de formule :
Figure imgf000008_0001
qui sera pris comme exemple, appartient à la catégorie des haptènes.
Il est nécessaire de coupler de façon covalente la molécule sur un porteur antigénique (la sérum albumine bovine par exemple) et d'administrer le conjugué à un animal (lapin ou souris, par exemple) pour déclencher une réponse immunitaire susceptible d'induire la synthèse d'anticorps spécifiques de l'haptène. Si l'on veut diriger la spécificité vers la chaîne triphosphate, il sera nécessaire de coupler à l'albumine une autre partie de la molécule afin de présenter au système immunitaire l'épitope voulu
(ensemble chaîne triphosphate + sucre) . Les liaisons anhydrides d'acide P-O-P impliquées dans la chaîne triphosphate étant particulièrement instables, il est tout à fait aléatoire (compte tenu du temps de demi-vie trop court de ce composé), d'espérer induire une réponse immunitaire contre une molécule de ce type non transformée.
La présente invention a précisément pour objet des composés conjugués d'analogues de diphosphates et de triphosphates de nucléosides couplés à des porteurs antigéniques, qui permettent justement l'obtention d'anticorps spécifiques des metabolites de ces agents anti-viraux. Ces composés doivent avoir la double particularité de : - posséder des liaisons phosphate (di ou tri) stables,
- mimer le mieux possible les liaisons phosphate naturelles de façon que les anticorps induits reconnaissent les nucléotides naturels.
Elle concerne également des composés conjugués d'analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléosides couplés à des enzymes, qui sont utilisables comme marqueurs dans des dosages enzymo-immunologiques de ces metabolites.
Selon l'invention, le composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou de triphosphate et d'une molécule choisie parmi les porteurs antigéniques et les enzymes, dans lequel l'analogue répond à la formule :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle n est égal à 0 ou à 1,
- X1 et X2 qui peuvent être identiques ou différents, représentent CH2, CHF, CF2,CCl2, CHC1 ou NR6 avec R6 étant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, aryle ou aralkyle, les deux R^ pouvant être identiques ou différents lorsque n=l ou pouvant former ensemble une chaîne hydrocarbonée comportant un noyau phényle,
- Ri, R2, R3 et R^ qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, NH4 , un ion ammonium quaternaire ou un ion de formule M+^ v avec M représentant un métal et v étant l'état de valence de ce métal, et
- R^ est un groupe dérivé d'un nucléoside, et dans lequel l'analogue est couplé à ladite molécule, soit par l'intermédiaire du groupe R^ dérivé de nucléoside, soit par l'intermédiaire de l'un des groupes R1, R2, R-3 et R4 , à condition que X1 ne représente pas CH2 lorsque n est égal à 0.
L'utilisation dans ce composé conjugué d'un analogue de diphosphates ou de triphosphates répondant à la formule (I) donnée ci-dessus, est très intéressante, car le remplacement de la chaîne polyphosphate P-O-P du diphosphate ou triphosphate naturel par une chaîne P-X1-? ou P-xi-P-X2-?, conduit à un composé stable non hydrolysable. De préférence selon l'invention, l'analogue est un analogue de triphosphate, n étant égal à 1 dans la formule précitée.
En effet, dans le cas des dérivés de nucléoside tels que les agents antiviraux, il a été clairement mis en évidence par différents auteurs que leur ultime mode d'action est le blocage des mécanismes de transcription et de replication par insertion de l'agent thérapeutique, métabolisé en triphosphate par différentes kinases cellulaires, dans la chaîne d'ADN ou d'ARN (Aids, the unanswered questions, Science 1993, 260, 1253-1293) . En effet, la position 3' du sucre, privée de son groupement hydroxyle, ne permet pas l'ancrage d'un autre nucléotide et l'agent thérapeutique joue ainsi un rôle de "terminateur" de chaîne. Par conséquent, il est absolument évident que le métabolite le plus intéressant à doser est le nucléotide triphosphate qui constitue l'espèce active du point de vue biologique. L'analogue peut aussi être un analogue de diphosphate,
1 6 dans lequel conformément à l'invention n=0 et X représente NR ou un groupe halométhylène.
En effet, bien que le groupe CH2 puisse mimer l'atome d'oxygène d'un pont pyrophosphate en conférant à l'édifice moléculaire qui le contient (un nucléotide par exemple) une très bonne résistance à l'hydrolyse enzymatique, une telle modification de la structure peut modifier de façon drastique les propriétés biologiques de la molécule en question (J. Biol. Chem. 1983, 258, 9536-9543. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, j} , 2370-2373. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5544-5545. Adv. Enzymol. 1975, 43 1-56. Chem. Rev. 1977, 77, 349-367. Chem. Ind. (London) 1981, 134-138). Cette altération des propriétés biologiques est le plus souvent associée à une différence d'acidité entre les acides phosphoriques (contenus dans les substances naturelles) et les acides phosphoriques et phosphiniques (contenus dans les analogues) ou à des différences de géométrie du motif, la longueur de la liaison phosphore-carbone étant légèrement différente de celle de la liaison phosphore- oxygène. Il est donc essentiel de pouvoir être en mesure de moduler les pKa des nalogues, d'une part, et leur géométrie intime, d'autre part. Ceci peut être réalisé en échangeant le (s) groupe (s) CH2 par les groupes halométhylènes ou aminés, conformément à l'invention.
Ainsi, avec les analogues de formule (I) il est possible d'induire la synthèse d'anticorps anti-triphosphate d'agent anti-viral, par exemple d'anticorps anti-AZT-5 '-triphosphate à l'aide de cet analogue chimique où la chaîne polyphosphate est stabilisée et dont la structure chimique et conformationnelle mime celle de la chaîne triphosphate naturelle de telle façon que les anticorps produits à l'aide de cet analogue stable reconnaissent avec une forte affinité l'AZT-5' -triphosphate. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le composé conjugué est un immunogène destiné à la production d'anticorps. Dans ce cas, la molécule couplée à l'analogue de diphosphate ou de triphosphate de nucléoside est un porteur antigénique. Généralement, le couplage est effectué par l'intermédiaire d'un bras espaceur greffé sur la base pyrimidinique ou purique du nucléoside, qui comporte à son autre extrémité un groupe susceptible de réagir avec le porteur antigénique, par exemple un groupe H2 • Le greffage du bras espaceur sur le nucléoside peut être effectué soit sur un groupe H2 exocyclique dans le cas où la base du nucléoside comprend un tel groupe, soit sur un atome d'azote présent dans le cycle de la base. Il peut également être effectué sur le sucre ou sur la chaîne phosphorée. lu
Le bras espaceur est généralement une chaîne hydrocarbonée saturée. Toutefois, on peut utiliser d'autres espaceurs, par exemple un polyoxyéthyoène ( CH2-CH2-O )n ou un polyol -(CH0H)n.
Dans certains cas, on peut aussi réaliser le couplage directement sur le nucléoside par l'intermédiaire d'un espaceur fixé sur la partie sucre du nucléoside.
Dans tous les cas, le groupe susceptible de réagir avec le porteur antigénique est un groupe NH2, mais on peut aussi utiliser d'autres groupes susceptibles de réagir avec le porteur antigénique, par exemple un groupe COOH, maléimide, thil, aniline
Lorsque le groupe susceptible de réagir avec le porteur antigénique est un groupe NH2, le composé conjugué comportant un analogue de diphosphate ou triphosphate couplé à un porteur antigénique peut répondre à la formule suivante :
Figure imgf000012_0001
dans laquelle R7 est un groupe bivalent dérivé d'un nucléoside, n est égal à 0 ou à 1, X1 et X2 ont les significations données ci-dessus, p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 6 et Z est un porteur antigénique.
A titre d'exemple, R7- (CH2)p- H- peut répondre aux formules suivantes :
Figure imgf000013_0001
De préférence, dans l ' analogue de formule ( I ) , R5 est dérivé d ' un agent antiviral nucléosidique tel que ceux de formules :
Figure imgf000013_0002
Les porteurs antigéniques susceptibles d'être couplés à l'analogue de diphosphate ou de triphosphate de nucléoside pour former le composé conjugué servant d'i munogène, peuvent être de différents types. On peut utiliser en particulier des protéines telles que l'albumine bovine, ovalbumine, polylysine et β-lactoglobuline, , par exemple 12
1 'hémocyanine de Patelle (keyhole lympet hae ocyanin, KLH) .
Selon un second mode de réalisation d l'invention, le composé conjugué est un marqueu enzymatique. Dans ce cas, la molécule couplée l'analogue de diphosphate ou de triphosphate d nucléoside est une enzyme.
Les enzymes utilisables sont celles qu présentent des propriétés intéressantes (sensibilité, seuil de détection) pour les dosages immunologiques .
A titre d'exemples de telles enzymes, o peut citer les peroxydases, , les phosphatases et β
-galactosidase, en particulier les acétylcholinestérases telles que 1 ' acétylcholinestérase d'Electrophorus electricus.
Ce couplage peut être réalisé également par l'intermédiaire de réactifs appropriés sur un groupe NH2 du nucléoside de l'analogue de diphosphate ou de triphosphate. A titre d'exemple d'un tel conjugué, on peut citer le conjugué de l'analogue de triphosphate de formule :
Figure imgf000014_0001
couplé à une acétylcholinestérase . Les analogues de diphosphates et triphosphates de nucléosides utilisés dans l'invention peuvent être préparés par réaction d'un diphosphate ou triphosphate de formule :
Figure imgf000015_0001
dans laquelle X^, X2 et n ont les significations données ci-dessus, et R^ est un groupe hydrocarboné, avec un dérivé de nucléoside dont les fonctions réactives sont protégées par des groupes appropriés sauf pour la fonction alcool primaire de la partie sucre du nucléoside.
Les diphosphates ou triphosphates de formule III :
Figure imgf000015_0002
avec n=l et X1=X2=CH2 peuvent être préparés par réaction d'un bis- (halométhylène) phophinate de formule : O
Figure imgf000016_0001
dans laquelle X est un atome d'halogène, avec un phosphite mixte de formule :
Figure imgf000016_0002
dans laquelle R^ est un groupe hydrocarboné et R^ est un groupe benzyle ou allyle pour obtenir un composé de formule (III) avec X1 = X2 = CH2 et n = 1
Dans ce procédé, l'analogue est préparé par une double réaction d'Arbuzov entre un phosphite mixte et un bis- (halométhylène)phosphinate d'aryle ou d'alkyle. Les produits de départ utilisés dans cette réaction peuvent être préparés par des procédés classiques.
Ainsi, le bis- (halométhylène)phosphinate peut être préparé selon les méthodes décrites par Ivanov et al dans Zh. Obshch. Khim., 1967 37(8), p.
1856-1862, et par Frank et al dans Can. J. Chem., 1966,
44, p. 2593-2596. Le phosphite mixte peut être préparé par réactions successives de différents alcools R8OH, R9OH sur PCI3 en présence d'une base.
Généralement, la réaction d'Arbuzov est réalisée à une température de 140°C, sous basses pression, par exemple sous 4mm de mercure. De préférence, on soumet de plus le milieu réactionnel à une agitation violente pour éliminer en continu l'halogénure formé R^X.
Les triphosphates de formule (III) dans laquelle X1 et X2 représentent le groupe NR^ avec les deux R^ formant ensemble une chaîne hydrocarbonée telle que définie précédemment, peuvent être préparés par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) faire réagir un chlorophosphate de formule :
Figure imgf000017_0001
avec une diamine de formule : H2N-R10-NH2 dans lesquelles R8 est un groupe hydrocarboné, et R10 est la chaîne hydrocarbonée formée par les 2R6, pour former un bis-phosphoramide de formule :
O o
10 8
R8O- P NH —R —NH P—OR
1 Ό ORs 0 *P b) cycliser le bis phosphoramide ainsi obtenu sur un dichlorophosphite de formule :
Cl2P-OR8 dans laquelle R8 est un groupe hydrocarboné, et c) oxyder le produit cyclisé ainsi obtenu.
La diamine utilisée comme produit de départ dans cette réaction peut être synthétisée par des procédés classiques tels que ceux décrits par Carpino dans J. Org. Chem., 1986, 51, p. 4768-4779.
Dans ce procédé, la première réaction correspond à une diphosphorylation de la diamine et cette réaction peut être effectuée en présence de deux équivalents de triéthylamine. Cette réaction est très rapide et elle permet d'obtenir le diphosphoramide avec un rendement élevé. On cyclise ensuite le diphosphoramide avec un dichlorophosphite en présence de triéthylamine et de 4-diméthylaminopyridine, dans un solvant organique approprié tel que le tétrahydrofurane.
L'oxydation du produit cyclisé peut être effectuée ensuite avec l'acide 4-chloroperoxybenzoïque.
Après cette réaction, on obtient un analogue de triphosphate de formule (I) dans laquelle X]_ et X2 sont des groupes NR^ et R1, R2, R^ R4 et R5 sont des groupes benzyle.
Pour préparer un analogue de triphosphate de formule (III) dans laquelle X1 et X2 sont respectivement les groupes CH2 et NR^, on peut utiliser un procédé qui consiste à faire réagir un méhyl phosphonate de formule :
O
OF? P CH,
1 o
W 17
avec un analogue de diphosphate de formule :
Cl N -ORc
OR 8 OR£ pour former le composé de formule :
Figure imgf000019_0001
L'analogue de diphosphate utilisé dans ce procédé peut être préparé à partir de 1'imidodiphosphate correspondant dans lequel Cl est remplacé par OH, par réaction avec de l'acide chlorhydrique.
Les diphosphates de formule (III) dans laquelle X^ est un groupe méthylène peuvent être préparés par un procédé qui consiste à faire réagir un chlorophosphate de formule :
Figure imgf000019_0002
avec un de formule
Figure imgf000019_0003
Les diphosphates de formule (III) dans laquelle X1 est le groupe NH peuvent être préparés par un procédé qui consiste à faire réagir le composé de formule :
0
CI3 P : N Cl
Cl avec un composé de formule R8OH pour former le composé de formule :
Figure imgf000020_0001
Le pentachlorure précurseur peut être préparé par la méthode décrite par Emsley et al dans J. Chem. Soc. A., 1971, p. 2873.
Dans le cas des diphosphates de formule (III) dans lesquels X représente le groupe NR^, on peut préparer ceux-ci par réaction d'un composé de formule :
O R6 O
Cl—P —N -Cl
Cl Cl avec un alcool de formule R8OH.
A titre d'exemples, on décrit ci-après le schéma réactionnel de préparation d'un analogue non hydrolysable de l'ATP muni d'un bras espaceur en vue de son couplage avec un porteur antigénique ou une enzyme.
Figure imgf000021_0001
Le couplage entre l'analogue de triphosphate et le nucléoside modifié est réalisé par activation de l'alcool en position 5' sur le sucre pour former le
20 triphosphate de nucléoside. Le chlore sur la base du nucléoside est ensuite déplacé par substitution nucleophile avec un précurseur de diamine. La molécule finale est obtenue par hydrogénation catalytique.
Dans le cas où l'on veut préparer un
25 analogue non hydrolysable de l'AMT triphosphate, on peut suivre le schéma réactionnel suivant :
30
35 2 U
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
Le couplage entre le nucléoside et
25 l'analogue de triphosphate est réalisé par activation de l'alcool primaire du sucre qui réagit ensuite avec l'analogue de triphosphate.
La déprotection finale est réalisée comme précédem¬ ment par hydrogénation catalytique.
30
Dans le cas où l'on veut préparer un analogue non hydrolysable de l'AZT triphosphate, on peut utiliser le schéma réactionnel suivant :
•35 20-1
Figure imgf000023_0001
30 21
Dans ce cas, le nucléoside est préparé en deux étapes à partir d'un dérivé de la thymidine décrit dans la littérature. Le couplage avec l'analogue de triphosphate est réalisé comme précédemment. La déprotection finale est réalisée avec le bromure de tri éthyl silyle (TMSBr) suivie d'un passage en milieu basique.
Pour réaliser le couplage de ces analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléosides avec une enzyme ou un porteur antigénique, on utilise les techniques classiques de couplage par liaison covalente entre un groupe réactif porté par le nucléoside et un groupe réactif porté par l'enzyme ou le porteur antigénique tel que les groupes lysyle, tyrosyle, histidyle, tryptophanyle ou glutamyle. Les groupes réactifs du nucléoside peuvent être constitués par des fonctions acide, aminé, phénol, hydroxyle ou cétone. Les réactions de couplage peuvent être réalisées au moyen de réactifs tels que les carbodiimides, le gluraraldéhyde, la benzidine, les anhydrides mixtes, les esters d'haptène activés et l'acide para-aminophényl acétique.
Les composés conjugués de l'invention, peuvent être utilisés soit comme immunogènes, soit comme marqueurs enzymatiques.
Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps spécifiques d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule :
Figure imgf000024_0001
22
dans laquelle n=0 ou 1 et R^ représente un dérivé de nucléoside, qui consiste
- à injecter à un mammifère un composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule :
Figure imgf000025_0001
dans laquelle R1, R2, R3, R4, X1 et X2 ont les significations données ci-dessus pour la formule (I), et n et R5 ont les significations données ci-dessus pour la formule (V) , couplé à un porteur antigénique, et
- à prélever ensuite du sang du mammifère immunisé pour isoler les anticorps produits.
Elle concerne également un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux d'analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléoside en partant du composé conjugué décrit ci-dessus, par la technique de Kohler et Milstein. L'invention concerne encore un procédé de dosage immunologique d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule :
Figure imgf000025_0002
23
dans laquelle n=0 ou 1 et R' 5 représente un dérivé de nucléoside, qui consiste à effectuer une réaction de compétition entre le diphosphate ou triphosphate de formule (V) à doser et un composé conjugué d ' une enzyme et d ' un analogue de diphosphate ou de triphosphate de formule :
Figure imgf000026_0001
dans laquelle R~> est un dérivé de nucléoside identique ou différent R' , n a la signification donnée pour la formule (V), et R1, R2, R4, -'- et X2 ont les significations données pour la formule (I), p des sites limités d'un anticorps spécifique dudit analogue, e déterminer ensuite la quantité de composé conjugué fixée 1 'anticorps. Ce procédé de dosage peut s'appliquer au dosage l'adénosine triphosphate (ATP) ou au dosage d'un métabolite d'un ag anti-viral nucléosidique tel que les médicaments anti-VIH comme l'A
Dans ce dernier cas, on peut utiliser pour le dosage conjugué d'un analogue de diphosphate ou triphosphate d'AMT ou d'AZ D'autres caractéristiques et avantages de l'invent apparaîtront mieux à la lecture des. exemples suivants donnés b entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence à la fig unique annexée.
La figurel annexée est un diagramme illustrant le résultat de dosages immunologiques effectués conformément à l'invention, c'est-à-dire la variation du rapport B/BO dans lequel B représente l'activité enzymatique liée à l'anticorps en présence d'une substance à doser, et B0 représente l'activité enzymatique liée à l'anticorps en l'absence de 24
substance à doser, en fonction de la concentration ( en pmol/ml ) de substance à doser .
Exemple 1 : Préparation du (dibenzyl phosphonométhyl )
(benzyl hydrogénophosphono-méthyl ) phosphinate de benzyle (composé n° 1 ) .
Figure imgf000027_0001
C30H33O8P3 PM: 614,50
a) Préparation du tribenzyl phosphite
(composé n° 2) de formule :
Figure imgf000027_0002
A une solution de 25ml (286,5 mmol, 1 éq.) de trichlorure de phosphore dans 1,5 litre d'éther anhydre, refroidie à -78°C, on ajoute goutte à goutte en dix minutes 123,8 ml ( 888,3 mmol, 3,1 éq.) de 25
triéthylamine anhydre. On traite ensuite le milieu réactionnel goutte à goutte avec 92,95 g (859,6 mmol, 3 éq.) d'alcool benzylique dissous dans 300 ml d'éther. Au bout de 2 heures, on réchauffe la solution à température ambiante et on agite sous argon pendant 8 heures. On filtre le précipité formé, on évapore le solvant sous vide, et on chromatographie le résidu sur colonne de silice (Ether éthylique/hexane/triétyl- amine: 40/60/1) ; on obtient ainsi 90 g d'une huile incolore (rdt:89%) .
Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes : CCM
Rf = 0,5(Et2O/hexane/Et3N : 50/50/1) . RMN1?! : (CDC13) 200 MHz δ (ppm) : 7,37 (m, 15H, protons aromatiques); 4,94 (d,
3JH-P=8 Hz, 6H, Ha) .
RMN13C: (CDCI3) 50 MHz δ(ppm) : 138,21 (3Cb) ; 128,37 (6Cd) ; 127, 67 (3Ce) ; 127,49 (6CC) ; 64,47 (d, 2J-C-P=11,1 Hz, 3Ca) .
RMN31P: (CDCl3/H3Pθ4)81,015 MHz δ (ppm) :20,17(s) . IR (pur film) cm-1 3088;3063;3031;2940;2874; 1606; 1497; 1454;
1375;1211;994;787. b) Préparation de bis (chlorométhylène) chlorophospinate (composé n° 3) de formule: formule B p 108
Figure imgf000028_0001
C2H4CI3OP PM:181,39 26
On dissout 25 g (284,1 mmol, léq.) de NaH2P02 et 17,05 g (568,3 mmol, environ 2éq. dépolymérises) de paraformaldehyde dans 140 ml d'eau distillée. On ajoute 50 ml d'acide chlorhydrique concentré et on porte le mélange au reflux pendant 44 heures. Après distillation de l'eau puis filtration des sels, on reprend le filtrat avec 50 ml d'acétone et on filtre à nouveau les sels formés. On concentre le filtrat, puis on le reprend avec 3 fois 100 ml de benzène, ce qui donne, après evaporation sous vide, un sirop jaune. On dissout le résidu dans 100 ml de benzène, puis on porte au reflux, tandis que sont ajoutés goutte à goutte pendant 3 heures 72,53 ml
(994,4 mmol, 3,5éq) de chlorure de thionyle (gros dégagement gazeux) . Après cela, on laisse le milieu réactionnel au reflux encore 12 heures. Après evaporation sous vide du solvant, on obtient une huile qui est purifiée par distillation sous vide pour donner 44,4 g de bis (chlorométhylène) chlorophosphinate sous la forme d'une huile incolore (rendement de 86 %) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes : Teb=85-88°C (lmmHg) . RMN1!!: (CDC13)200 MHz δ(ppm) :4,09 (partie AB, syst.ABX,
Figure imgf000029_0001
JBX=7,5Hz, vA=4,13, vB=4,03, 4H) . RMN13C: (CDC13) 50MHz δ (ppm) : 36, 99 (d, 1 c-P=88, 5Hz, 2C) . RMN31p: (CDCI3/H3PO4) 81, 015MHz δ (ppm) : 49, 3 (s) . IR(pur, film) cm-1:
3020; 2998; 2942; 2870; 1490; 1384; 1258; 1200; 1120; 990. 27
c) Préparation du bis (chloro- méthylène)phosphinate de benzyle (composé n° 4) de formule :
Figure imgf000030_0001
C9H11CI2O2P PM: 253,06
A 20g (110,3mmol, léq.) de bis (chlorométhylène) chlorophosphinate (composé n° 2) dissous dans 400ml d'éther anhydre à 0°C, on ajoute 16,9ml (121,3mmol, l,léq.) de triéthylamine anhydre. On ajoute ensuite en 15min, 13,11g (121, 3mmol, 1,1 éq.) d'alcool benzylique dans 50ml d'éther anhydre. Au bout d'une heure à 0°C, on réchauffe la solution à la température ambiante et on agite pendant une heure. On filtre le précipité formé, on évapore le filtrat sous vide et on le chromatographie (acétate d'éthyle/hexane : de 60/40 à 100/0); on obtient ainsi 24,6g d'une huile incolore (rendement 88%) . Les caractéristiques du composé nc 4 sont les suivantes : CCM:
Rf=0,5 (Et20) . RMN lH: (CDCI3) 200 MHz δ (ppm) : 7,45-7,37 (m, 5H, protons aromatiques); 5,19 (d, 3JH_P=9,3 Hz, 2H, Ha) ; 3,66 (partie AB, syst. ABX,
Figure imgf000030_0002
Hz, vA=3,72, vB=3,60, 4H, Hf) . RMN13C: (CDCI3) 50MHz 28
δ(ppm) :134,93(d, 3Jc_P=5,lHz, lCb) ;
128,63(lCe); 128,40(2Cd); 127,97(2Cc);
67,73(d,2Jc_P=6,5Hz, ICa) ; 32,63(d, 1JC_P=104, 7Hz, 2Cf) . RMN31P: (CDCI3/H3PO4) 81., 015MHz
Ô(ppm) : 41, 25 (s) . IR(CH2CL2)c -1:
3091; 3050; 3000; 2950; 2895; 1498; 1456; 1393; 1262; 1200; 1110; 1007; 847. d) Préparation du bis (dibenzylphosphono- méthyl)phosphinate de benzyle (composé n° 5) de formule :
Figure imgf000031_0001
C37H39O8P3 PM: 704,63
A 8g (31,61 mmol, éq. du bis (chloromethylène)phosphinate de benzyle obtenu en a), on ajoute 44,5 g (126,4 mmol, 4 éq.)du tribenzyl phosphite obtenu en b) . On chauffe le mélange sous vide, à 140°C, sous 4 mm de mercure. Et on le soumet à une agitation violente afin d'éliminer en continu le chlorure de benzyle. Après 10 heures d'agitation, on chromatographie le mélange réactionnel sur une colonne de silice (Et20/acétate d'Ethyle/Ethanol.de 100/0/0 à 0/80/20) ; on obtient ainsi 15,8 g du composé n° 4 sous la forme d'une huile incolore (rendement de 71%) . 29
Les caractéristiques du composé N°4 sont les suivantes :
CCM:
Rf=0,4 (AcOEt) . RMN1H: (CDC13)200 MHz δ(ppm) : 7,32-7,28 (m, 25H, protons aromatiques); 5,13-4,95 (m, 3JH-p=8,5 Hz, 10 H, Ha et Haι); 2,84 (dd, 2JH-pβ=20,3 Hz, 2JH-Pα=18,2 Hz, 4Hf ) .
RM 13C: (CDC13) 50 MHz δ(ppm) : 135,77-135,57 (m, 3JC-P=7,5 Hz,
4Cb' et ÎC^ ; 128,75-127,53 (80^, 2Cd>, 8CC, 2Ccι,
4Ce, lCe.) ; 67,95 et 67,72 (2d, 2JC-P=6,2 Hz, 4Ca) ; 66,79 (d, 2JC-P=6,5 Hz, lCa ; 28,65 (dd, 1JC-P=130 Hz,
1 C-P=87,5 Hz, 2Cf) .
RMN31P: (CDC13/H3P04) 121,4 MHz δ(ppm):38,47 (t, 2Jpα-Pβ=4'5 Hz' Pα)et 20,90 (d, 2J _Pβ=4,5 Hz,2Pβ)
SM: (IC/NH3) m/z : 721, 8 (MNH4+) .
IR (pur, film) cm-1
3088; 3063; 3033; 2954; 2894; 1497;.1468; 1380; 1250; 1182; 998.
e) Préparation du (dibenzyl phosphonométhyl) (benzyl hydrogénophosphono-méthyl) phosphinate de benzyle (composé n" 1) .
A 0,796 g de 1, 4-diazabicyclo[2,2,2]octane
(DABCO) (7,09 mmol, léq) , on ajoute 5 g du composé n° 4
(7,09 mmol, léq) en solution dans 70 ml de toluène anhydre. On porte le mélange réactionnel au reflux 30
pendant 2 heures. On réduit la solution sous vide et on dissout le sel obtenu dans 100 ml d'un mélange eau/méthanol (30/70) . A la solution précédente, on ajoute une résine échangeuse d'ions chargée en ions H30+(Dowex 50X8) puis on agite pendant 12 heures. On récupère la résine par filtration, on concentre le filtrat et on le reprend 3 fois par 100 ml de toluène. On obtient ainsi 4,18 g du composé n° 12 sous la forme d'une huile jaune qui peut être utilisée sans aucune purification (rendement de 96 %) .
Les caractéristiques du composé n° 1 sont les suivantes RMN^-H : (DMSO d6)200MHz: δ(ppm) :7,37-7,31 (m, 20H, protons aromatiques); 5, 07 (d, 3JH_p=7,2 Hz, 2H, H benzyliques); 4,97(d,3JH_P=7,4Hz, 6H, H benzyliques); 2,77(t,2JH_P=20,lHz, 4H, Hf) . RMN13C: (CD3OD) 50MHz δ(ppm) :137, 82-137,38 (2Cb, lCb', lCb") ;129, 60-128, 85(4Cd, 2Cd', 2Cd", 2Ce, ICe', ICe", 4Cc, 2Cc', 2Cc"); 69,45(d,
2JC_P=5,7Hz)-68,75(d,2JC_P=5,7Hz) 68,33 (d, 2JC_P=6, 3Hz) (2Ca, ICa* et lCa"); 29,62(dd, xJC_P=87, 1Hz et 1Jc_P=130,6Hz,2Cf) . RMN31P: (CDC13/H3P04) 81, 015MHz δ(ppm) :41,21(d,2Jp_P=4,7 Hz, Pα) et
18,59(d,2JP_p=5,08 Hz, Pβ et Pβ').
SM: (IC/NH3) m/z:631,9(MNH +) ; 524,2 (M-Bn+H+) • IR(pur, film)cm-l:
3064-2300; 1693; 1610; 1498; 1455; 1382; 1215; 997; 854; 734.
Exemple 2 : Préparation de la 6-chloro-2' ,3'-O- benzylidène (5'-hydroxy)purine-9H (composé n" 6) de formule : 31
Figure imgf000034_0001
C17H15C1N404 PM: 374,78
a) Préparation de 2' , 3'-O-benzylidène inosine (composé n 7)
Figure imgf000034_0002
Ci7Hι6N405 PM: 356,34
On ajoute 20 g (74,5 mmol, 1 éq.) d'inosine à 56,7 g (372,5 mmol, 5 éq.) de benzaldéhyde diméthylacétal en solution dans 400 ml d'acétonitrile anhydre et on refroidit à 0°C. On traite le mélange goutte à goutte .avec 13,9 ml (149 mmol, 2éq.) d'oxychlorure de phosphore fraîchement distillé. Après 1 heure à 0°C, on agite le milieu pendant encore 2 heures à la température ambiante ; la solution devient jaune et limpide puis se trouble. On verse ensuite le 32
mélange réactionnel très lentement sur un mélange d'eau saturée en NaHC3/glace et on l'agite pendant environ 3/4 d'heure. Un précipité blanc apparaît, on le filtre, puis on lave à l'eau et à l'éther. Après séchage sous vide, on obtient 23,9 g de 2 ' , 3'-0-benzylidène inosine (rendement de 90 %) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes : CCM: Rf=0,3(CH2Cl2/EtOH:90/10)
F°=254-255°C RM ^-H (CD3OD) 200MHz δ(ppm) :8,33(s,lH,H8), 8, 08 (s, 1H,H2) ;7, 54-7, 6 (m, 5H, protons aromatiques) 6,26 (d, 3JH1._H2'=3Hz, 1H, Hλ 1 ) ; 6, 01 (s, 1H, Ha) 5,40(dd,3JH2'-H'l=3Hz, 3JH2 - -H3 <=5Hz, 1H, H2 • )
Figure imgf000035_0001
4, 60 (m, 3JH4._H3ι=2,5Hz, 1H, H4. ) ; 3,75 (m, 2H, H5. ) . RMN13C: (DMSO-d6) 50MHz δ(ppm) : 156,42(1C6); 147,75(104) ;
146,02(1C2) ; 138,81 (1C8) 136,12(lCb) ; 129,71 (ICe) ; 128,37 (2Cd) ; 126,82(2Cc) 124,42(1C5); 106,58(lCa) ; 89,55(10!') ; 86,53(1C4.) 84,44 (1C2> ) , 82, 61 (1C3. ) ; 61,46(lC5ι ) . IR(KBr)cm_1:
3392; 3048; 2876; 1700; 1589; 1550; 1508; 1419; 1214; 1098; 974. b) Préparation de 2, 3 ' -O-benzy- lidène (5'-acétyl) inosine (composé n° 8) de formule : 33
Figure imgf000036_0001
C19H18N O6 PM: 398,37
On ajoute à 24 g (67,35 mol, léq.) de la 2,3'-0-benzylidène inosine obtenue précédemment, dissous dans 500 ml d'acétonitrile anhydre, 11,26 ml (80,82 mmol, 1,2 éq.) de triéthylamine anhydre, 7 ml (74,09 mmol, 1,1 éq.) d'anhydride acétique et 822 mg (6,74 mmol, 0,1 éq.) de 4-diméthyl-aminopyridine (DMAP) , et on agite pendant 2 heures à la température ambiante. On évapore le solvant pour obtenir une huile. On précipite ensuite le produit en utilisant le mélange éther diéthylique/CH2Cl2:90/10. On filtre le précipité, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide. On obtient ainsi 23,34 g de
2' ,3'-0-benzylidène(5'-acétyl) inosine sous la forme d'un solide pulvérulent blanc (rendement de 87 %) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes : CCM:Rf=0,5(CH2Cl2/EtOH:90/10) . F°=170-171°C RMN1H: (CDCI3)200MHz δ(ppm) :8,27(s,lH,H8); 7, 95(s, 1H,H2) ; 7, 60-7, 43 (m,5H, protons aromatiques); 6,27(d,3JH1._H2'=1 /9Hz, 1H, Hx. ) ; 6,21(s, lH,Ha); 34
5,54
Figure imgf000037_0001
3JH2 < -H3 ' =6, 5Hz, IH,
H2>) ;5,13(dd,3JH3'-H4'= , Hz, 3JH3 ι _H2 ' = 6, 5Hz; IH,
H31) ; 4,67 (partie X d'un ABX, IH, H . ) ; 4,33 (partie AB syst.ABX, Jaj-,=ll,9Hz, JAχ=4,3Hz, JBχ=6, 1Hz, vA=4,39, vB=4,28,2H, H51); 2, 02 (s, 3H; Hg) . RMN13C: (DMSO-d6) 50MHz δ(ppm) :169,87(lCf); 156,46(1C6) ;
147,65(1C ) 146,02(1C2) 139,02(1C8) 135,88 (lCb) ; 129,78(lCe) 128,37(2Cd) 126,85(2Cc) 124,42 (1C5) ; 106, 85(lCa) 89,09(10!!) 84,34 (IC4.) 83, 64 (1C2- ) , 81,99(1C3.) 63,56(1C5.) ; 20,32(lCg) .
IR(CH2Cl2)cm-l:
3370; 3066; 2990; 2900; 1745; 1689; 1588;
1547; 1513; 1460; 1374; 1229; 1093; 977. c) Préparation de la
6-chloro-2 ' , 3 '-O-benzylidène (5'-acétyl)purine-9H (composé n° y) de formule :
Figure imgf000037_0002
C19H17CLN4O5 PM: 416,82
On ajoute 20 g (50,20 mmol, léq.) de la 2 ', 3 ' -O-benzylidène (5 ' -acétyl) inosine à un mélange de 150 ml d' oxychlorure de phosphore et de 6,37 ml (50,20 mmol, léq.) de N, N' -diméthylaniline . On chauffe préalablement un bain d'huile à 120°C. On agite le 35
mélange vigoureusement, on le porte pendant 1 minute et 30 secondes au reflux, puis on le refroidit à 0°C et on distille immédiatement sous vide d'une trompe à eau 100 ml d'oxychlorure de phosphore. La solution restante est versée très lentement sur un mélange d'eau saturée en NaHC03/glace, et agitée pendant environ 30 minutes. On extrait la solution aqueuse avec du chlorure de méthylène. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium, on la réduit sous vide et on la purifie par chromatographie sur colonne de silice (éther éthylique/hexane : de 80/20 à 100/0) ; on obtient ainsi 16,11 g de la 6-chloro-2', 3'-O-benzylidène (5'-acétyl)purine-9H (rendement de 77 %) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes :
CCM: Rf=0,5(Et2θ) . RMN^-H: (CDC13)200 MHz δ(ppm) :8,78 (s, IH, H8); 8,26(s, IH, H2) 7, 56-7, 39(m, 5H, protons aromatiques) 6,32
Figure imgf000038_0001
IH, H2. ) ; 6,06(s, IH, Ha) 5,64(dd, 3JH2'_Hl'=2,lHz, 3JH2._H3.=6, 5Hz, IH, H2- )
Figure imgf000038_0002
4,70 (partie X d'un ABX, IH, H41 ) ; 4,30 (partie AB syst.ABX,JAB=20Hz,Jχ=4,4Hz, JBX=6Hz, vA=4,37, vB=4,25, 2H, H51); 1,97 (s, 3H; Hg) . RMN13C: {CDCI3) 50MHz δ(ppm) :1.69,94(lCf) ; 152,00(1C6); 151,54(1C2 ou IC4); 150,82 (1C2 ou IC4); 144,23(1C8); 135,36(lCb) 131,41(1C5). 129,95(lCe); 128,46(2Cd); 126,54(2Cc) 108,01(lCa); 90,85(lCι.); 8 ,60(104. et 1C2• ) 82,30(1C3); 63,52 (IC51 ) ; 20,37(lCg). d) Préparation de la
6-chloro-2' , 3'-O-benzylidène (5'-hydroxy) purine-9H
(composé n° 6) . 36
On dissout 8 g (19,19 mmol) de la 6-chloro-2',3'-O-benzylidène(5'-acétyl) purine-9H obtenue précédemment dans 140 ml d'une solution de méthanol saturée en ammoniaque, et on agite le mélange pendant 2 heures à la température ambiante. On réduit la solution sous vide et on la purifie directement par chromatographie (éther éthylique/hexane : de 60/40 à 100/0); on obtient ainsi 5,89 g de la 6-chloro-2' ,3'-O-benzylidène(5'-hydroxy) purine-9H sous la forme d'un solide blanc (rendement de 82 %) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes :
CCM:
Rf=0,4(Et2O) .
F°=190-191°C.
RMN^-H: (CDC13)200 MHz δ(ppm):8,79 (s, IH, H8) ; 8,22 (s, IH, H2) ;
7,60-7,46(m, 5H, protons aromatiques) ;6, 12 (d, Jhl'-H2I=4, 6Hz, IH, Hi.) ; 6,09(s, IH, Ha) ; 5,36(dd, 3JH2 ' -Hl '=4 6Hz> 3jH2 ' -H3 , = 6' 2Hz' 1H' H2<) ; 5,23(dd, 3JH3.-.H2' = 6,2Hz, 3JH3. _H .=1, 3 Hz, IH, H3.) ; 5,09(dd, 3JHf_H5.=2, 7Hz, 3JHf_H5.=9, 8Hz, IH, Hf ) ; 4,73 (m, IH, H ι ) ; 3, 93 (m, 2H, H5.) . RMN13C: (DMSO-d6) 50MHz δ(ppm) :151,58(1C6) ; 151,29(1C2 ou IC4)
149,29(1C2 ou IC4); 145,74(1C8); 136,03(lCb)
131,38(1C5); 129, 66 (ICe); 128,31(2Cd); 126,77(2Cc) 106,38 (ICa); 90,32(10!.); 87,13(104-); 84,29(1C2') 82,59(1C3') ; 61,33(1C5.) . SM: (IC/HN3) m/z:375(MH+) . IR(KBr) cm-1 :
3400; 3069; 2926; 2876; 1593; 1565; 1493; 1434; 1406; 1339; 1201; 1111; 1072. 37
Exemple Préparation de
6-chloro-2 ' , 3 ' -O-benzylidène 5 ' [ tétrabenzyl-α, β : ι
-diméthylène triphosphate] purine-9H (composé n° 10 ) .
Figure imgf000040_0001
1
C47H46CLN4OHP3 PM: 971,27
A une solution de 1,19 g (1,93 mmol, léq.) du composé n° 1, 726 mg (1,93 mmol, 1 éq.) de 6-chloro-2' , 3 ' -O-benzylidène (5' -hydroxy) purine-9H (composé n° 6) et 1,27 g (4,82 mmol, 2,5 éq.) de triphénylphosphine dissous dans 30 ml de THF anhydre, on ajoute goutte à goutte 759 μl (4,82 mmol, 2,5 éq.) d' azodicarboxylate d'éthyle à la température ambiante. Après 1 heure, on évapore le solvant sous pression réduite et on chromatographie le résidu sur colonne de silice (éther éthylique/acétate d' éthyle/éthanol : de 100/0/0 à 0/90/10); on obtient ainsi 1,32 g du composé n° 10 sous la forme d'une poudre blanche (rendement de 70 %) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes : CCM : 38
Rf=0, 5 (AcOEt/EtOH: 5/5) . F°=49-50°C RMN^H: (CDCI3) 200MHz, mélange de diastéréoisomères : δ(ppm) : 8, 75-8, 46 (m, 2H, H8 et H2) ; 7, 61-7, 2 (m, 25H,protons aromatiques); 6,41-6,27 (4d, 3JH1._H2'=2,6Hz, IH, Hl ' ) ; 6,01-5,94 (6s, IH, Hf) ; 5,58-5,52 (m, IH, H2' ) ; 5, 40-5, 33 (m, IH, H3. ) ; 5,30-4,85 (m,8H, Ha, Ha' et Ha"); 4, 60 (m, IH, H4 ' ) ; 4, 38-4, 04 (m, 2H, H5' ) ; 2, 95-2, 55 (m, 4H, Hk et Hk') . RMN13C: (CDCI3) 50MHz, mélange de diastéréoisomères: δ(ppm) :151,58 (1C6); 151,15-150,96 (1C2 et 1C4); 144, 44-144, 35(1C8) ;135, 66-135, 18(2Cb,lCb', lCb" et lCg) ; 132,08-131,39(105);
129,88-129,87 (2Ce, ICe', ICe" et lCj ), 128, 52-127, 92 (4Cd, 2Cd', 2Cd", 4Cc, 2Cc', 2Cc", 2Ch et 2Cj ) ; 107, 92 (lCf) ; 90, 70-90, 58 (ICI') ;90,23-90,22 (1C4 * ) ;
85, 05-84, 44 (1C2');82, 05-81, 78 (1C3') ; 68, 41-61, 83 (2Ca, ICa', ICa" et 1C5'); 30, 76-25, 70 (lCk et lCk') .
Figure imgf000041_0001
IR(CCl4)cm_1:
3088; 3063; 3033; 2954; 2894; 1593; 1505; 1468; 1380; 1250; 1108; 1074. 39
Exemple 4 : Préparation de la N6 - ( 4 -azidobutyl ) -2 ' , 3 ' -0- benzylidène-5 ' - ( tétrabenzyl-α,β:β,γ-diméthylène triphosphate ) adénosine (composé n° l l ) de formule :
C51H5
Figure imgf000042_0001
A une solution de 0,59g (0,61mmol, léq.) du composé n°10 dans 20ml de méthanol anhydre on ajoute 0,20g (l,74mmol, 2,8éq.) de 4-azido-l-butylamine, à température ambiante. Le mélange réactionnel est agité 36h, puis il est réduit sous vide et le résidu est chromatographie sur silice (acétate d' éthyle/éthanol : 100/0 à 90/10) . On obtient ainsi 0,51g du composé n°ll sous la forme d'un solide vitreux (rendement de 80%) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes :
CCM : Rf = 0,7 (acétate d'éthyle/éthanol : 90/10) . RMN1H (CDC13) 200 MHz mélange de diastéréoisomères : d (ppm) 8,36-7,95 (m, 2H, H8, H2) ; 7,41-7,26 (m, 25H, protons1 aromatiques) ; 6,31-5,92 (m, 3H, NH, Hl ' , Hf) ; 5,53 (m, IH, H2 ' ) ; 5,12-4,86 (m, 8H, Ha, Ha', Ha") ; 4,58 (m, IH, H3'); 4,37-3,92 (m, 3H, H4 ' , H5'); 3,62 (m, 2H, Ho); 3,25 (m, 2H, Hl) ; 2,95-2,65 (m, 4H, Hk, Hk' ) ; 1, 66 (m, 4H, Hm, Hn) .
IR (CHC13) cm-1 : 3291, 2942, 2096, 1619, 1458, 1251, 998, 828. 40
Exemple 5 : Préparation de la N6 - (4-aminobutyl) -5'- (α.β .γ-diméthylène triphosphate) adénosine (composé n°12) de formule :
Figure imgf000043_0001
C16H29N6O11P3 PM : 574
A une solution de 76mg (72,5μmol, léq. ) du composé n°ll dans 3ml d'un mélange éthanol/eau : 9/1 on ajoute 76mg de Pd/C à 10% et 460mg (7,2 mmol, lOOéq.) de formate d'ammonium. Le mélange est porté à reflux pendant 2h avec addition, par portions, de 3ml d'eau supplémentaire dans le milieu. Le mélange est filtré sur papier puis on provoque la précipitation du produit par addition d'éthanol. On centrifuge, le surnageant est écarté et le culot est redissous dans 2ml d'eau, puis lyophilisé. On obtient ainsi 34mg du composé n°12 sous forme d'une poudre blanche hygroscopique (rendement de 82%) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes :
RMNiH (D20) 200 MHz : δ (ppm) 8,07 (s, IH, H2 ou H8) ;
7,78 (s, IH, H2 ou H8) ; 5, 92 (d, 3JHι '-H2 '=4 , 6Hz, Hl ' ) ; 4,50 (m, IH, H2 ' ) ; 4,34 (m, IH, H3' ) ; 3,98 (m, 2H, 41
H5f); 3,42 (m, 2H, Ha); 2,77 (m, 2H, Hd) ; 2,26-1,96 (m, 4H, He, Hf); 1,58 (m, 4H, Hb, Hc) .
Exemple 6 : Préparation de la 3'-déoxy-3'-azido-5'- (tétrabenzyl-α,β:β,γ-diméthylène triphosphate) thymidine (composé n° 13) de formule : .
Figure imgf000044_0001
C40H43N5OHP3 PM : 862
A une solution de 165mg (0, 62mmol, léq.) d'AZT dans 5ml de toluène anhydre on ajoute 380mg
(0, 62mmol, léq.) du composé n°l. La solution est évaporée à sec, reprise avec 5ml de toluène anhydre, puis réévaporée à sec. Le résidu est dissous dans 2,5ml de THF anhydre et on ajoute 0,5ml (2,53mmol, 4, léq.) d'azodicarboxylate de diisopropyle. A cette solution, 42
on ajoute lentement au goutte à goutte 648mg (2,47mmol, 4éq.) de triphénylphosphine dissous dans 2ml de THF anhydre. L'addition est réalisée en lh et la solution est encore agitée 3h à température ambiante. Le solvant est évaporé sous vide et on chromatographie le résidu sur colonne de silice (acétate d'éthyle/éthanol : 100/0 à 85/15) . On obtient ainsi 172mg d'un solide vitreux (rendement de 32%) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes :
CCM : Rf = 0,2 (acétate d'éthyle).
RMN1H (CDC13) 200 MHz, mélange de diastéréoisomères : δ (ppm) 7,30 (m, 21H, protons aromatiques, Ha); 6,22- 6,01 (m, IH, Hl1); 5,11-4,94 (m, 9H, Ha', Ha", Ha"', H3'); 4,44-3,85 (m, 3H, H4* , H5'); 3,20-2,65 (m, 4H, Hc, Hd) ; 2,40-2,18 (m, 2H, H2* ) ; 2,07 (s, 3H, Hb) .
43
Exemple 7 : Préparation de la 3'-déoxy-3'-amino-5'- (α,β:β,γ-diméthylène triphosphate) thymidine (composé n" 14) de formule :
Figure imgf000046_0001
Cl2H22 30ϋP3 PM : 477
A une solution de 82mg (95,lμmol, léq.) du composé n°100 dans 10ml d'ethanol on ajoute 3ml de THF et 69mg de Pd/C à 10%. Le mélange est soigneusement purgé à l'hydrogène et agité à température ambiante pendant l,5h, sous une pression de 1 atmosphère d'hydrogène. On ajoute ensuite 5ml d'eau et on réduit de moitié le mélange sous vide. On purge le milieu à l'hydrogène et on agite encore 2h sous une pression de 1 atmosphère d'hydrogène. Le mélange est ensuite filtré sur papier. Le filtrat est lavé 2 fois avec 10ml d'acétate d'éthyle et la phase aqueuse est ensuite lyophilisée. On obtient ainsi 29mg d'un solide blanc hygroscopique (rendement de 64%) .
Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes 44
RMNiH (D2O) 200 MHz : δ (ppm) 7,47 (s, IH, Ha); 6,02
(m, IH, Hl1); 4,62 (m, IH, H3» ) ; 4,19 (m, IH, H4') ;
4,01 (m, 2H, H5'); 2,65-2,25 (m, 6H, Hc, Hd, H2' ) ; 1,69
(s, 3H, Hb) . Exemple 8 : Préparation d'un composé conjugué du composé n° 12 avec l'hémocyanine de patelle (KLH) .
On réalise le couplage entre le composé nc 12 et l'hémocyanine de patelle (KLH) par l'intermédiaire du glutaraldéhyde qui réagit simultanément avec les fonctions aminés primaires portées par le composé n° 12 et la protéine (résidus lysines) .
Pratiquement :
A 2 ml d'une solution de KLH (Keyhole Lympet Haemocyanin) à 5 mg/ml dans du tampon phosphate
10~1M pH 7,4, on rajoute successivement 2 ml d'une solution du composé n° 12 à 1,05 mg/ml dans le même tampon puis 16 μl d'une solution de glutaraldéhyde à
25 %. Après 2 heures de réaction à température ambiante, la préparation est fractionnée en 4 volumes de 1 ml et conservée à -20°C jusqu'à l'utilisation.
On évalue l'efficacité du couplage après filtration sur colonne de G25, en mesurant l'absorbance dans l'ultraviolet. Ces mesures ont montré qu'environ 12 molécules du composé n° 12 ont été fixées par molécules de KLH (pour une masse moléculaire supposée de 100 000 kDa) .
Exemple 9 : Préparation d'anticorps anti-composé n° 12 On utilise pour cette préparation trois lapins de race Blanc de Bouscat de 2,5 kg que l'on traite de la façon suivante.
On prépare une émulsion en mélangeant 1 ml de la solution d'immunogène, soit 2,5 mg du conjugué composé n° 12-KLH de l'exemple 8, avec 1 ml d'eau distillée et 2 ml d'adjuvant complet de Freund. Au jour 45
J0, chaque lapin reçoit une injection de 1ml de l'émulsion précitée par voie intradermique, sur le dos en 50 points. Au jour J=42, on effectue un premier rappel dans les mêmes conditions que l'immunisation, puis les lapins sont saignés une fois par semaine à partir du Jour J=49.
Deux rappels sont effectués à deux mois d'intervalle, dans les mêmes conditions.
On récupère ainsi dans le sérum du sang recueilli des anticorps spécifiques du composé n° 12.
Exemple 10 : Préparation d'un conjugué composé n° 12-acétyl cholinestérase d'Electrophorus Electricus. Le couplage entre le composé n° 12 et 1'acétylcholinestérase (AChE) d'Electrophorus electricus (forme G4) est obtenu par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel le N-succinimidyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) . Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol (préalablement introduit dans le composé n°12) au niveau de la fonction aminé primaire) avec des groupements maléimide introduits à la surface de l'AChE par traitements avec le SMCC. a) Préparation de l'AChE-SMCC : à cette étape, la fonction succinimidyl-ester active du SMCC réagit avec les fonctions aminé primaire de l'enzyme. L'AChE est d'abord traitée avec un excès de N-éthyl-maléimide de façon à bloquer toutes les fonctions thiol éventuellement présentes à la surface de l'enzyme. La réaction avec le SMCC est réalisée dans un tampon phosphate 0,1M pH 7,4. Le SMCC dissous dans du diméthyl formamide anhydre est ajouté à la solution d'enzyme dans un rapport moléculaire SMCC/AChE=300. Pratiquement : 46
50 μl d'une solution à 12,5 mg/ml de N-éthyl maléimide dans du tampon phosphate 0,1M pH 7,4 sont ajoutés à 564 μl d'une solution d'AChE (8,8 mg/ml) dans le même tampon. Après 30 minutes de réaction à 30CC, on ajoute 50 μl d'une solution de SMCC (31,2 mg/ml) dans le diméthyl formamide anhydre. Après 30 minutes de réaction à 30°C, l'AChE-SMCC est purifié par filtration sur colonne de Biogel A 1,5 m. L'AChE-SMCC est conservée à -80°C jusqu'à l'utilisation. b) Thiolation du composé n° 12 : le composé n° 12 est thiolé par réaction avec l'ester de l'acide S-acétyl-thioglycolique et du N-hydroxysuccinimide (SATA) . A cette étape, la fonction succinimidyl-ester active du SATA réagit avec la fonction aminé primaire du composé n° 12. A 500 μl d'une solution à 2 mg/ml du composé n° 12 en tampon borate 0,1M pH 9 sont ajoutés 50 μl d'une solution de SATA à 75 mg/ml dans le diméthyl formamide anhydre. Après 30 minutes de réaction à 30°C, le produit de la réaction (composé n° 12-SATA) est purifié sur une cartouche de Seppak Cl8. L'éluat méthanolique est lyophilisé et conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation. c) Couplage entre le composé n° 12 thiolé et l'AChE-SMCC : le lyophilisât du composé n° 12-SATA est redissous dans un tampon phosphate 0, IM pH 6 puis traité à l'hydroxylamine pour débloquer la fonction thioester du SATA. Les fonctions thiols libérées sont mesurées après réaction avec l'acide 5-5'-dithiobis-nitrobenzoïque (DTNB, méthode d'Ellman) . Le couplage entre le composé n° 12 thiolé et l'AChE-SMCC est obtenu en mélangeant les deux réactifs dans un rapport thiol/AChE de 10. Pratiquement :
Le lyophilisât du composé n° 12-SATA est repris dans 1,6 ml de tampon phosphate 0, IM pH 6 avant 47
ajout de 400 μl d'hydroxylamine IM. Après 10 minutes de réaction à température ambiante, on mesure les thiols par réaction de 150 μl de DTNB 10~3 M avec 50 μl du composé n° 12 thiolé. A cette étape, la concentration en groupements thiols est de 4,4 . 10~ . On ajoute ensuite 11,5 μl du composé n° 12 thiolé (5 nmol) à 350 μl d'une solution de G4-SMCC (0,5 nmol). Après 3 heures de réaction à 30°C, le conjugué est purifié par filtration sur colonne de Biogel A 0,5 m et conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation.
Exemple 11 : Dosage enzymo-immunologique de l'adénosine triphosphate (ATP) de formule :
Figure imgf000050_0001
Adénosine 5'-triphosphate
Pour ce dosage, on utilise des plaques de micro-titration dont les puits sont revêtus d'un anticorps monoclonal de souris anti-IgG de lapin. On introduit dans chacun des puits 50 μl d'une solution diluée d'anti-sérum obtenu dans l'Exemple 9, 50 μl du conjugué obtenu dans l'Exemple 10 à une concentration de 1 unité/ml, et 50μl d'une solution étalon du composé n° 12 ou de l'ATP. Après une nuit de réaction immunologique à +4°C, on lave les plaques avec un 48
tampon phosphate, contenant 0,05 % de Tween 20, puis on ajoute 200 μl de réactif d'Ell an utilisé comme substrat. Après une heure de réaction enzymatique, on mesure l'absorbance de chacun des puits, à 414 n .
Les résultats obtenus sont représentés par les courbes 1 et 2 de la figure 1.
La courbe 1 se rapporte au composé n° 12 et la courbe 2 se rapporte à l'ATP.
Ces courbes illustrent les variations de B/B0 (en %) en fonction de la dose (en pmol/ml) de composé n° 12 ou d'ATP dosé. Les deux courbes sont très proches et confirment ainsi que l'on peut doser l'ATP en utilisant l'anticorps dirigé contre l'analogue de l'ATP (composé n° 12) et le conjugué enzymatique produit également à partir de cet analogue de l'ATP. Exemple 12 : Dosage de l'adénosine 5'diphosphate (ADP)
Adénosine 5'-diphosphate
Figure imgf000051_0001
On suit' le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour effectuer ce dosage. Les résultats obtenus sont illustrés par la courbe 3 de la figure. Au vu de cette courbe, on remarque qu'on peut également doser l'ADP avec l'anti-sérum et le conjugué enzymatique, mais la sensibilité est moins bonne. Exemple 13 : Dosage du A-tétra-P de formule : 49
Figure imgf000052_0001
Adénosine 5'-tέtraphosphate On suit le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour effectuer ce dosage en utilisant le même anti-sérum et le même conjugué enzymatique. Les résultats obtenus sont illustrés par la courbe 4 de la figure.
Exemple 14 : Dosage de l'adénosine monophosphate AMP de formule :
Figure imgf000052_0002
Adénosine 5'-monophosphate On suit le même mode opératoire que dans l ' Exemple 11 pour effectuer ce dosage en utilisant le même antisérum et le même conjugué enzymatique . Les 50
résultats obtenus sont illustrés par la courbe 5 de la figure.
Exemples 15 à 17
On suit le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour doser l'adénosine, le didésoxy-ATP et l'azido-ATP de formule :
Figure imgf000053_0001
Didéoxy ATP
Figure imgf000053_0002
Azido-ATP 51
en utilisant dans chaque cas l'anti-sérum et le conjugé enzymatique des exemples 7 et 8. Les résultats obtenus sont illustrés par les courbes 6 (adénosine) , 7 (didésoxy-ATP) et 8 (azido-ATP) de la figure.
On remarque que ces courbes ne permettent pas de réaliser un dosage satisfaisant, l'affinité de ces nucléotides pour l'anti-sérum n'étant pas suffisante.
De même, on a constaté que l'adénine ou l'AMP cyclique de formule :
Figure imgf000054_0001
Adénosine 3'-5'-cycϋc monophosphate ne donnait pas lieu à une réaction avec l' anti-sérum à des doses supérieures à 10 000 pmol/ml. Les résultats des dosages des exemples 9 à
15 montrent qu'il est possible de réaliser un dosage fiable d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside, en utilisant des anticorps dirigés contre un analogue de ce diphosphate ou triphosphate de nucléoside, ainsi qu'un conjugué enzymatique préparé à partir de cet analogue.
De plus, on remarque que de tels anticorps ne reconnaissent pas les nucléotides azidés, les didésoxy nucléotides et les bases seules. 52
Ainsi, la reconnaissance des anticorps implique à la fois la chaîne phosphate et le sucre, ce qui garantit l'absence de réaction croisée avec les nucléotides et nucléosides naturels, dans le cas du dosage des metabolites phosphorylés d'agents antiviraux tels que l'AZT.
Exemple 18 : Préparation de la 3'-déoxy-3'-azido-5'- (g, β:β,γ-diméthylène triphosphate) N-l-[5-(2,2,2- trifluoro-acétylamino)-pentyl] thymidine(composé n°15) de formule :
Figure imgf000055_0001
a) Préparation de la 3'-déoxy-3'-azido-5'- p-méthoxybenzyloxy- N-l-[5-(2,2,2-trifluoro- acétylamino)-pentyl] thymidine (composé n°16) de formule :
Figure imgf000055_0002
A un mélange de 3'-déoxy-3'-azido-5'-p- méthoxybenzyloxy thymidine (2,33 g, 5,82 mmol, 1,0 éq.), de diisopropyl azodicarboxylate (2,86 ml, 53
14,54 mmol, 2,5 éq.) et de 5-(2,2,2-trifluoro- acétylamino)-1-pentanol (1,62 g, 8,15 mmol, 1,4 éq.) dans 10 ml de THF anhydre, on ajoute de la triphényl phosphine (3,81 g, 14,54 mmol, 2,5 éq.) en solution dans 10 ml de THF, goutte à goutte, à température ambiante, en 10 min. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est chromatographie sur silice (diéthyl éther/hexane : 25/75 à 100/0). On obtient 3,21 g d'un solide blanc (rendement : 94%) .
Les caractéristiques du composé 16 sont les suivantes :
CCM : Rf=0,45(Et2O)
RMN1H(CDC13)200 MHz : δ (ppm) 7,99 (d, J=3,4 Hz, 2H) ;
7,21 (s, IH) ; 6,94 (d, 0=3,4 Hz, 2H) ; 6,78 (m, IH) ;
6,19 (t, J=6,3 Hz, IH) ; 4,59 (qd, J=6,2 Hz, J=l,7 Hz,
2H) ; 4,39-4,30 (m, IH) ; 4,21 (q, J=2,0 Hz, IH) ;
3,96-3,89 (m, 2H) ; 3,87 (s, 3H) ; 3,36 (q, J=3,2 Hz, 2H) ; 2,61-2,28 (m, 2H) ; 1,79-1,59 (m, 7H) ; 1,42-1,35
(m, 2H) .
IR(CHCl3)cm_1 : 3320,1; 2916,0; 2105,2; 1713,1; 1639,2;
1469,1; 1258,8; 1168,2.
b) Préparation de la 3'-déoxy-3'-azido- N-
1-5- (2,2,2-trifluoro-acétylamino)-pentyl] thymidine
(composé n°17) de formule :
Figure imgf000056_0001
N3 54
Le composé n°16 obtenu en a) (3,21 g 5,51 mmol, 1,0 éq.) est agité à température ambiante avec du carbonate de potassium (0,46 g, 3,30 mmol, 0,6 éq.) dans 40 ml de méthanol. La réaction est suivie en CCM. Au bout de 80 min, le solvant est évaporé, le résidu est repris dans 50 ml de chloroforme et est lavé avec une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique est séchée, évaporée et le résidu est chromatographie sur silice (Et20) . On obtient 1,90 g d'un solide viteux (rendement : 77%) .
Les caractéristiques du composé n°17 sont les suivantes :
CCM:Rf=0,45(Et2O) .
RMNXH (CDC13) 200 MHz : δ (ppm) 7,49 (s, IH) ; 7,25 (m, IH) ; 6,08 (t, J=6, 4 Hz, IH) ; 4,37 (m, IH) ; 3,95- 3,75 (m, 5H) ; 3,35-3,27 (m, 3H) ; 2,52(2,24 (m, 2H) ; 1,87 (s, 3H) ; 1,70-1,59 (m, 4H) ; 1,40-1,32 (m, 2H) . SM(IC/CH4) m/z : 449 (MH+) .
IR(CHCl3)cm-1 : 3435,7; 3315,7; 3096,3; 2941,8; 2105,1; 1704,4; 1634,5; 1471,4; 1185,1.
c) Préparation de la 3'-déoxy-3'-azido-5'- (tétrabenzyl-α,β:β,γ-diméthylène triphosphate)-3N-1-[5- (2,2,2-trifluoro-acétylamino)-pentyl]thymidine (composé n°18) de formule :
Figure imgf000057_0001
55
Le composé n°17 précédent (lOOmg, 0,223 mmol, 1,0 éq.), de l'acide tétrabenzyl-α,β:β,γ di éthylène triphosphorique (165 mg, 0,268 mmol, 1,2 éq.) et du diéthyl azodicarboxylate (175μl, 1,11 mmol, 5,0 éq.) sont mis en suspension dans 2ml de THF anhydre. Une solution de triphényl phosphine (292 mg, 1,11 mmol, 5,0 éq., dans 5 ml de THF) est ajoutée goutte à goutte à température ambiante. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est chromatographie (AcOEt/EtOH:100/0 à 85/15) pour donner 151 mg d'un solide amorphe (rendement: 65%) .
Les caractéristique du composé 18 sont les suivantes :
CCM:Rf=0,8(AcOEt/EtOH:9/l)
RM^H(CDCL3)200 Mhz, mélange de diastéréomères : δ (ppm) 7,41-7,26 (m, 21H) ; 6,80 (m, IH) ; 6,14 (m, IH) ; 5,16- 4,91 (m, 8H) ; 4,32-4,16 (m, 4H) ; 3,96-3,90 (m, 2H) ; 3,35 (q, J=6,lHz; 2H) ; 2,92-2,64 (m, 4H) ; 2,36-2,26 (m, 2H) ; 1,91-1,80 (m, 3H) ; 1,69-1,65 (m, 4H) ; 1,38-1,22 (m, 2H) . IR(CHCl3)cm_1: 3236,5; 3060,3; 2931,0; 2108,3; 1713,4; 1637,0; 1249,1; 1178,6; 998,5.
d) Préparation du composé n°15
Le composé 18 précédent (67mg, 63,9 μmol,
1,0 éq.) en solution dans 3ml de dichlorométhane anhydre est traité goutte à goutte avec TMSBr (42 μl,
320μmol, 5,0 éq.) à température ambiante. Après 6h, le milieu réactionnel est décomposé par addition d'une solution d'ammoniaque à 5% (300μl) . Le mélange est évaporé à sec et le résidu est purifié par CCM (plaques HPTLC RP18 F 254s, acétonitrile/eau : 7/3) . 56
L'acétamide obtenu est agité pendant 24h à température ambiante et en tube scellé, dans 3ml de méthanol saturé en ammoniac. Le solvant est évaporé et le résidu est purifié par chromatographie sur silice phase inverse (RP 18) (acétonitrile/eau : 100/0 à 0/100) . On obtient 32mg d'un solide blanc hygroscopique qui correspond au sel d'ammonium du composé recherché (rendement : 76%) .
Les caractéristiques du composé 15 sont les suivantes :
CCM:Rf=0,45(Et2O) .
RMî^H) (D20) 200 Mhz, mélange de diastéréomères : δ
(ppm) 7,55 et 7,49 (2s, IH) ; 6,08 (m, IH) ; 4,61-4,36 (m, 2H) ; 4,05-3,72 (m, 4H) ; 2,79 (t, J=7,8 Hz, 2H) ;
2,34-2,03 (m, 6H) ; 1,50 et 1,47 (2s, 3H) ; 1,55-1,38 (m,
4H) ; 1,25-1,13 (m, 2H) .
IR(KBr)cm_1: 3214,0 (large); 2109,3; 1702,1; 1637,5;
1472,9; 1185,6; 1055,0.
Exemple 19 : Préparation d'un composé conjugué du composé n°14 avec l'hémocyanine de patelle (KLH).
Le couplage entre le composé n°14 et l'hémocyanine de patelle est obtenu par l'intermédiaire du glutaraldéhyde comme dans l'exemple n°8.
A 5 ml d'une solution de KLH (Keyhole Lympet Haemocyanin) à 4 mg/ml dans du tampon phosphate 10~1M pH 7,4, on rajoute successivement 2,8 mg du composé n" 14 " puis 26 μl d'une solution de glutaraldéhyde à 25 %. Après 2 heures de réaction à température ambiante, la préparation est fractionnée en 5 volumes de 1 ml et conservée à -20°C jusqu'à l'utilisation. 57
On évalue l'efficacité du couplage après filtration sur colonne de G25, en mesurant l'absorbance dans l'ultraviolet. Ces mesures ont montré qu'environ 11 molécules du composé n° 14 ont "été fixées par molécules de KLH (pour une masse moléculaire supposée de 100 000 kDa) .
Exemple 20 : Préparation d'anticorps anti-composé n° 14
On utilise pour cette préparation trois lapins de race Blanc de Bouscat de 2,5 kg que l'on traite de la façon suivante.
On prépare une émulsion en mélangeant 1 ml de la solution d'immunogène, soit 4 mg du conjugué composé n° 14-KLH de l'exemple 19, avec 1 ml d'eau distillée et 2 ml d'adjuvant complet de Freund. Au jour J0, chaque lapin reçoit une injection de 1ml de 1'émulsion précitée par voie intradermique, sur le dos en 50 points. Au jour J=42, on effectue un premier rappel dans les mêmes conditions que l'immunisation, puis les lapins sont saignés une fois par semaine à partir du Jour J=49.
Deux rappels sont effectués à deux mois d'intervalle, dans les mêmes conditions. On récupère ainsi dans le sérum du sang recueilli des anticorps spécifiques du composé n° 14.
Exemple 21 : Préparation d'un conjugué composé n° 14-acétyl cholinestérase d'Electrophorus Electricus.
Le couplage entre le composé n° 14 et 1'acétylcholinestérase (AChE) d'Electrophorus electricus (forme G4) est obtenu par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel le N-succinimidyl-4- (maleimidomethyl) 58
cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) . Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol (préalablement introduit dans le composé n°14) au niveau de la fonction amine primaire) avec des groupements maléimide introduits à la surface de l'AChE par traitements avec le SMCC comme décrit dans l'exemple n°10.
a) La préparation de l'AChE-SMCC est la même que celle décrite dans l'exemple n°10.
Pratiquement : b) Thiolation du composé n° 14 : le composé n° 14 est thiolé par réaction avec l'ester de l'acide S-acétyl-thioglycolique et du N-hydroxysuccinimide (SATA) . A cette étape, la fonction succinimidyl-ester active du SATA réagit avec la fonction amine primaire du composé n° 14. A 300 μl d'une solution à 1,6 mg/ml du composé n° 14 en tampon borate 0,1M pH 9 sont ajoutés 38 μl d'une solution de SATA à 115 mg/ml dans le diméthyl formamide anhydre. Après 30 minutes de réaction à 30°C, le produit de la réaction (composé n° 14-SATA) est purifié sur une cartouche de Seppak C18. L'éluat méthanolique est lyophilisé et conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation. c) Couplage entre le composé n° 14 thiolé et l'AChE-SMCC : le lyophilisât du composé n° 14-SATA est redissous dans un tampon phosphate 0,1M pH 6 puis traité à l'hydroxylamine pour débloquer la fonction thioester du SATA. Les fonctions thiols libérées sont mesurées après réaction avec l'acide 5-5'-dithiobis-nitrobenzoïque (DTNB, méthode d'Ellman) . Le couplage entre le composé n° 14 thiolé et l'AChE-SMCC est obtenu en mélangeant les deux réactifs dans un rapport thiol/AChE de 10. Pratiquement : 59
Le lyophilisât du composé n° 14-SATA est repris dans 0,8 ml de tampon phosphate 0,1M pH 6 avant ajout de 200 μl d'hydroxylamine IM. Après 10 minutes de réaction à température ambiante, on mesure les thiols par réaction de 100 μl de DTNB 10"3 M avec 100 μl du composé n° 14 thiolé. A cette étape, la concentration en groupements thiols est de 1,3 x 10~3M. On ajoute ensuite 1,9 μl du composé n° 14 thiolé (5 nmol) à 175 μl d'une solution de G4-SMCC (0,25 nmol). Après 3 heures de réaction à 30°C, le conjugué est purifié par filtration sur colonne de Biogel A 0,5 m et conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation.
Exemple n°22 : Préparation d'un composé conjugué du composé n°15 avec l'hémocyanine de patelle (KLH).
Le couplage entre le composé n°15 et l'hémocyanine de patelle est obtenu par l'intermédiaire du glutaradéhyde comme dans l'exemple n°8 et l'exemple n°19.
A 3,5 ml d'une solution de KLH (Keyhole Lympet Haemocyanin) à 4 mg/ml dans du tampon phosphate 10-1M pH 7,4, on rajoute successivement 4,3 mg du composé n° 15 puis 26 μl d'une solution de glutaraldéhyde à 25 %. Après 2 heures de réaction à température ambiante, la préparation est fractionnée en 5 volumes de 1 ml et conservée à -20°C jusqu'à l'utilisation.
On évalue l'efficacité du couplage après filtration sur colonne de G25, en mesurant l'absorbance dans l'ultraviolet. Ces mesures ont montré qu'environ 13 molécules du composé n° 15 ont été fixées par molécules de KLH (pour une masse moléculaire supposée de 100 000 kDa) . 60
Exemple 23 : Préparation d'anticorps anti-composé n° 14
On utilise pour cette préparation trois lapins de race Blanc de Bouscat de 2,5 kg que l'on traite de la façon suivante.
On prépare une émulsion en mélangeant 1 ml de la solution d'immunogène, soit 4 mg du conjugué composé n° 15-KLH de l'exemple 22, avec 1 ml d'eau distillée et 2 ml d'adjuvant complet de Freund. Au jour J0, chaque lapin reçoit une injection de 1ml de 1'émulsion précitée par voie intradermique, sur le dos en 50 points. Au jour J=42, on effectue un premier rappel dans les mêmes conditions que l'immunisation, puis les lapins sont saignés une fois par semaine à partir du Jour J=49.
Deux rappels sont effectués à deux mois d'intervalle, dans les mêmes conditions.
On récupère ainsi dans le sérum du sang recueilli des anticorps spécifiques du composé n° 15.
Exemple 24 : Préparation d'un conjugué composé n" 14-acétyl cholinestérase d'Electrophorus Electricus.
Le couplage entre le composé n° 15 et 1'acétylcholinestérase (AChE) d'Electrophorus electricus (forme G4) est obtenu par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel le
N-succinimidyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) . Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol (préalablement introduit dans le composé n°15) au niveau de la fonction amine primaire) avec des groupements maléimide introduits à la surface de l'AChE par traitements avec le SMCC comme décrit dans l'exemple n°10. 61
a) La préparation de l'AChE-SMCC est la même que celle décrite dans l'exemple n°10. b) Thiolation du composé n° 15 : le composé n° 15 est thiolé par réaction avec l'ester de l'acide S-acétyl-thioglycolique et du N-hydroxysuccinimide (SATA) . A cette étape, la fonction succinimidyl-ester active du SATA réagit avec la fonction amine primaire du composé n° 14. A 300 μl d'une solution à 2,2 mg/ml du composé n° 15 en tampon borate 0,1M pH 9 sont ajoutés 38 μl d'une solution de SATA à 115 mg/ml dans le diméthyl formamide anhydre. Après 30 minutes de réaction à 30°C, le produit de la réaction (composé n° 15-SATA) est purifié sur une cartouche de Seppak C18. L'éluat méthanolique est lyophilisé et conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation. c) Couplage entre le composé n° 15 thiolé et l'AChE-SMCC : le lyophilisât du composé n° 15-SATA est redissous dans un tampon phosphate 0,1M pH 6 puis traité à l'hydroxylamine pour débloquer la fonction thioester du SATA. Les fonctions thiols libérées sont mesurées après réaction avec l'acide 5-5'-dithiobis-nitrobenzoïque (DTNB, méthode d'Ellman) . Le couplage entre le composé n° 15 thiolé et l'AChE-SMCC est obtenu en mélangeant les deux réactifs dans un rapport thiol/AChE de 10. Pratiquement :
Le lyophilisât du composé n° 15-SATA est repris dans 0,8 ml de tampon phosphate 0,1M pH 6 avant ajout de 200 μl d'hydroxylamine IM. Après 10 minutes de réaction à température ambiante, on mesure les thiols par réaction de 100 μl de DTNB 10~3 M avec 100 μl du composé n° 15 thiolé. A cette étape, la concentration en groupements thiols est de 9.10-4M. On ajoute ensuite 2,8 μl du composé n° 14 thiolé (5 nmol) à 175 μl d'une solution de G4-SMCC (0,25 nmol) . Après 3 heures de 62
réaction à 30°C, le conjugué est purifié par filtration sur colonne de Biogel A 0,5 m et conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation.

Claims

63
REVENDICATIONS 1. Composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou de triphosphate et d'une molécule choisie parmi les porteurs antigéniques et les enzymes, dans
Figure imgf000066_0001
dans laquelle n est égal à 0 ou à 1,
- χl et X2 qui peuvent être identiques ou différents, représentent CH2, CHF, CF2,CC12, CHCl ou NR6 avec R6 étant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, aryle ou aralkyle, les deux R^ pouvant être identiques ou différents lorsque n=l ou pouvant former ensemble une chaîne hydrocarbonée comportant un noyau phényle,
- R1, R2, R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, NH4", un ion ammonium quaternaire ou un ion de formule M+ /v avec M représentant un métal et v étant l'état de valence de ce métal, et
- R5 est un groupe dérivé d'un nucléoside, et dans lequel l'analogue est couplé à ladite molécule, soit par l'intermédiaire du groupe R^ dérivé de nucléoside, soit par l'intermédiaire de l'un des groupes R-'-, R2, R3 et R^ à condition que XI ne représente pas CH2 lorsque n est égal à 0.
2. Composé conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 1.
3. Composé conjugué selon la revendicatiion 1 ou 2, caractérisé en ce que R^ est dérivé d'un agent antiviral nucléosidique. 64
4. Composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R^ répond à l'une des formules suivantes :
Figure imgf000067_0001
AZT AMT ddl ddC d4T
Figure imgf000067_0002
5. Composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite molécule est un porteur antigénique.
6. Composé conjugué selon la revendication 5, caractérisé en ce que le porteur antigénique est l'hémocyanine de patelle. 7. Composé conjugué selon la revendication
5 ou 6, caractérisé en ce que le couplage de l'analogue de diphosphate ou triphosphate avec le porteur antigénique est réalisé au moyen d'un bras espaceur formé d'une chaîne hydrocarbonée saturée, terminée par 65
un groupe NH2, greffée sur la base purique ou pyrimidinique de R^.
8. Composé conjugué selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le couplage de l'analogue de diphosphate ou triphosphate avec le porteur antigénique est réalisé au moyen d'un bras espaceur en polyoxyéthylène (CH2-CH2~0)n ou polylol
Figure imgf000068_0001
Composé conjugué répondant à la
OR7—(CH 2y P—NH—Z (D)
Figure imgf000068_0002
dans laquelle n, X* et X2 ont les significations données dans la revendication 1, R7 est un groupe bivalent dérivé' 'un nucléoside, p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 6, et Z est un porteur antigénique.
10. Composé conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que R7(CH2)pNH répond à l'une des formules suivantes
Figure imgf000068_0003
Figure imgf000068_0004
NH- 66
11. Composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite molécule est une enzyme.
12. Composé conjugué selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite enzyme est une acétylcholinestérase.
13. Composé conjugué de l'analogue de triphosphate de formule :
Figure imgf000069_0001
et d' acétylcholinestérase d'Electrophorus electricus.
14. Procédé de préparation d'anticorps spécifiques d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule :
Figure imgf000069_0002
67
dans laquelle n=0 ou 1 et R représente un dérivé de nucléoside, qui consiste
-à injecter à un mammifère un composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule :
Figure imgf000070_0001
dans laquelle R1, R2, R3, R4, X1 et X2 ont les significations données dans la revendication 1), et n et R5 ont les significations données ci-dessus pour la formule (V) , couplé à un porteur antigénique, et
- à prélever ensuite le sang du mammifère immunisé pour isoler les anticorps produits.
15. Procédé de dosage immunologique d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule :
Figure imgf000070_0002
68
dans laquelle n=0 ou 1 et R'5 représente un dérivé de nucléoside, caractérisé en ce que l'on effectue une réaction de compétition entre le diphosphate ou triphosphate de formule (V) à doser et un composé conjugué d'une enzyme et d'un analogue de diphosphate ou triphosphate de formule :
Figure imgf000071_0001
dans laquelle R5 est un dérivé de nucléoside identique ou différent de R'5, n a la signification donnée ci- dessus, et R1, R2, R3, R4, X1 et X2 ont les significations données dans la revendication 1, pour des sites limités d'un anticorps spécifique dudit analogue, et en ce que l'on détermine la quantité de composé conjugué fixée sur l'anticorps. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le diphosphate ou triphosphate à doser est l'adénosine triphosphate (ATP) ou un métabolite d'un agent antiviral nucléosique.
17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent antiviral est le 3'- azido-3'-désoxythymidine (AZT) .
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