WO1998009990A1

WO1998009990A1 - Antigenes fongiques et processus de fabrication

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Publication number: WO1998009990A1
Application number: PCT/JP1997/003041
Authority: WO
Inventors: Kazutoh Takesako; Shigetoshi Mizutani; Masahiro Endo; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 1998-03-12
Also published as: WO1998009990A8; US6333164B1; CA2264496C; AU4032797A; US20060068448A1; US20020058293A1; KR20000068430A; CA2639051A1; EP0970966A4; EP0970966A1; TWI232222B; DE69738525T2; JP4118340B2; DE69738525D1; CA2264496A1; KR100524245B1; US7491511B2; EP0970966B1; JP2005323598A; AU725733B2

Description

明細書真菌抗原及びその製造方法技術分野

本発明は、細胞壁を有する病原性微生物である真菌による感染症、アレルギー疾患の予防又は治療、及び真菌による疾患の診断に有効な真菌抗原及びその製造方法に関する。背景技術

真菌は、ヒト、動物を始めとする脊椎動物に感染して種々の疾病を引き起こすことが知られている。例えば、ヒトの皮膚、口腔等に表在性真菌症を起こし、内臓、脳等に全身性真菌症を起こし、ぺット、家畜等の動物に対しても同様の感染症を起こす。このうち、ヒトに感染して、全身性真菌症を起こす原因真菌の主なものとしては、カンジダ属（カンジダアルビカンス（Candida albicans) 他）、クリプトコッカス属（クリプトコッカスネオフォルマンス（Cryptococcus n eoformans ) 他）、ァスペルギルス厲（ァスペルギルスフミガタス（Aspergi l lus fumigatus他））、カリニ肺炎菌（ニューモシスチスカリニ（Pneumocyst is carini i ) ) 等が知られ、表在性真菌症では、皮膚、口腔、膣等に感染するカンジダ属、手足の皮膚に感染する白癣菌（トリコフィトンメンタグ口フィテス (Trichophyton mentagrophytes ) 、トリコフィ卜ンノレブノレム (Trichophyt on rubrum ) 他）等が主なものと考えられている。

家畜等に感染症を起こす真菌としては皮庸糸状菌（Dermophytes ) が多く、上記のトリコフィトン（トリコフィトンベルコーサム（Trichophyton verrucosu m 他））の他に、ミクロスボルム（ミクロスポルム力ニス（Microsporum cani s ) 、ミクロスポルムジブセゥム（Microsporum gypseum ) 他）が知られている。生活環境中にはこれら以外にも多様な真菌が存在し、ヒト、動物に感染を引き起こすと考えられている。さらに、近年、広範囲抗生物質の多用、免疫抑制剤の使用、免疫抑制作用を持った制癌剤の使用等により、これらの薬剤の投与を受けている患者は免疫的易感染宿主（immunocompromised host) となり、健常人では病原性の低い真菌による日和見感染が増大している。また、 AIDS患者においては、口腔カンジダ症が繰り返し発生する他、各種真菌症が併発する。また、血管内カテーテル留置、特に経中心高カロリー輸液法（IVH ) による治療を受けている患者では、カテーテルに起因して真菌、特にカンジダによる感染症が起こる。一方、喘息、アトピー性皮) t炎、アレルギー性募炎をはじめとするアレルギー性疾患が急激に増大しつつあるが、この中で真菌を原因とするァレルギ一性疾患も非常に多い。

アレルギー性疾患の多くは、その疾患の原因抗原に感作されることにより、血清及び組織において、アレルゲンである抗原に特異的な I g E抗体（レアギン抗体）が産生され、該 I g E抗体が肥満細胞及び好塩基球のレセプ夕一に結合する。再びその抗原に暴露されると、細胞に結合した I g Eと抗原とが細胞表面上で架橋し、 I g E —抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これらの生理学的効果はケミカルメディエイターであるヒスタミン、セロトニン、へパリン、好酸球遊送因子又は各種ロイコトリエン等の放出を介して現れる。それらの効果は抗原が体内に入る経路及び肥満細胞又は好塩基球上に I g Eが沈着するパターンに依存して全身的又は局所的性質であり得る。

全身的症状はアナフィラキシーショックが含まれ、血管内での抗原に対する I g E—好塩基球応答が起こる。その結果、主として平滑筋の収縮と毛細管の拡張が起こり、発疹、暱吐、下痢、呼吸困難等の症状が現れ、激しい場合は死に至る。また、局所的症状は一般に抗原が体内に入った位置の上皮表面に起こり、発赤や丘疹として現れる。局所的症状が小気管支の平滑筋の収縮の場合、気管支喘息として現れる。

アレルギー性疾患を引き起こす原因菌としては、ぺニシリウム属（Penici l l iu m ) 、カンジダ属（Candida ) 、ァスペルギルス属（Aspergi l lus ) 、アルタナリア属（AUernaria) 、クラドスポリゥ厶厲（Cladosporium) 、マラセチア厲（ Malassezia) 、ボトリチス厲（Botrytis) 、ムーコル属（Mucor ) 、リゾブス属 (Rhizopus) 、ォ一レオバシジゥム厲（Aureobasidium ) 、フザリウム厲（Fusa rium) 、トリコデルマ属（Trichoderma ) 、ヘルミンソスボリゥム厲（Helminth osporium) 、ノィロスボラ属 (Neurospora) 、ヮレミァ属（Wal lemia) 、ロドトルラ属（Rhodotorula ) 、トリコフィトン厲（Trichophyton) が知られている。真菌感染症に対する治療法としては、抗真菌剤による治療が一般的であり、表在性真菌症に対しては多くの薬剤が開発されおり、また、全身性感染症に対しても幾つかの優れた薬剤が開発されている。しかし、その効果は有効性、毒性、副作用などの面から不十分である。例えば、古くから使用されてきたアンホテリシン B は重篤な腎障害を始めとする種々の副作用が起こる。また、フルコナゾ一ルを始めとする各種のァゾ一ル系抗真菌剤が開発されたが、作用が静菌的であり、感染症が再発することが多い、また多用により耐性菌が出現し始めている。耐性菌が出現すると、現在実用化されている抗真菌剤の多くが類似の作用メ力ニズムを有しているため交差耐性となり、大きな問題となる可能性がある。表在性真菌症の場合でも、各種治療薬が開発されているが、長期の治療期間を要する、又再発を繰り返すなど、どれも十分とはいえず、さらに優れた薬剤の開発が望まれている。さらに、爪白癣のように外用剤だけの治療では不十分であるため、グリセオフルビン等の内服薬を必要とする表在性真菌症もある。この際、長期にわたる投与が必要となり、薬剤による種々の副作用が生じる。また、表在性真菌症や、 AIDSにおける口腔カンジダ症のように、操り返し感染が発生するため、有効な抗真菌剤が開発されても費用の面で大きな問題がある。このように抗真菌剤による治療はいろいろの問題がある。生体には本来これらの外来からの侵入物である微生物と戦う感染防御力がある。この力を利用したものがワクチンである。病原性細菌に対してはワクチンによる感染予防が実施されており、古くから使用されかなりの効果を挙げている。細菌感染症に対するこれらのワクチンは、弱毒菌（結核菌）、死菌（コレラ菌）、トキソイド（ジフテリア菌、破傷風菌）、細胞表面の莢膜多糖体等の精製抗原（百日咳菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌）を抗原として使用している。ワクチンは病原菌の抗原性分子に対する抗体、及び細胞性免疫により感染防御力を宿主に与えている。抗体は病原菌により分泌される毒性物質の中和、病原菌の細胞表面分子に結合して宿主細胞への侵入を防ぐ役割を果たすと考えられる。細胞性免疫では、 CD4 +細胞、 CD8 +T細胞が中心的役割を果たし、その病原菌の抗原性分子を認識し、病原菌に特異的な防御反応を活性化している。これらの病原菌の有する抗原性分子である免疫原性物質が単離同定され、これらの免疫原を感作抗原（ワクチン）として用いている研究もいくつかある。この場合、上記のように細胞表面分子である莢膜多糖体が免疫原としてよく使用されている。真菌は環境中に非常に多くの数、種類が存在しており、脊椎動物はほとんど全てこれらの真菌に感作されている。また、生体に常在している真菌も多い。従つて、脊椎動物では一股にこれらの真菌に対する種々の生体防御免疫反応が用意されている。真菌感染に対して重要な働きをしている免疫反応には、活性化されたマクロファージゃ多形核白血球（PMN ) が食菌作用や殺菌作用を示し、主役として働いているが、抗体や細胞性免疫が寄与していることも知られている。真菌は、その細胞表面にマンナン、グルカン、キチン等の多糖を主成分とする細胞壁を有しており、真菌紬胞によってはその含量が全細胞の 3 0 %近くを占める場合がある [Kl is. R. U. et al. , Yeast. Vol. 10, 851-869(1994) ] 。これらの細胞壁成分の中でマンナンが最も抗原性が高い。マンナンは細胞表層に存在する多糖であり、この多糖部分に対する抗体が多量に作られる。ザィモザン（Zymosan ) を始めとする真菌細胞壁グルカンも種々の生理活性を有しており、非特異的な免疫増強作用を有することが知られている。真菌の細胞表面のマンナンを始めとする細胞壁成分が、感染においても細胞の生体への接着分子として重要な働きをしていると考えられている。

そして、クリブトコッカスのガラクトキシロマンナン [Devi, S. J. N, et al. , In feet. I讓 un. . Vol.59, 3700-3707, (1991) ]やカンジダアルビカンスの接着因子であるホスホマンノプロテイン (W 95 /31998号公報）がワクチンとして、またこれらの抗原性分子に対する抗体が感染防御活性を有することが報告されている。カンジダの生菌、死菌による感染防御免疫の誘導に関しても多くの報告 [Seg al. E. et al. Cri tical Reviews in Microbiology Vol. 14 229-271 (1987) ] がある。この場合も細胞表面分子である細胞壁成分に対する生体防御免疫反応が主として機能していると考えられてきた。

その他真菌に対するワクチンとしては、リボソームワクチン [Segal, E. . Hand book of Appl ied Mycology, Volume 2： Immunizat ions against fungal di seases in man and animals. , Humans, animals and insects. ] が、カンジダアルビカンス、トリコフィトンを始めとする真菌による感染症に対して試験され、実験動物、さらに一部ヒト、家畜に対する効果も検討されている。また、最近では、エノラーゼゃストレスタンパク質 HSP90 (特表平 4-502257号公報）が感染防御活性を誘導できることが報告されている。

しかし、上記の抗原性分子はいずれもまだ十分な有効性を確認されているとは言えない。また、多様性の高い哺乳類に対して、単一の抗原性分子を用いた治療により十分な有効性を得られるかは疑問である。

一方、アレルギー性疾患の治療法としては、抗ヒスタミン薬、ステロイド性抗炎症薬、メディエイ夕一遊離抑制薬などが使用されている。しかし、抗ヒスタミン薬は、倦怠感、眠気、めまい等、ステロイド剤は、副腎萎縮、機能不全、胃潰癟など様々な副作用の危険性があり、メディエイ夕一遊雜抑制剤も、問題となるアレルギー性疾患以外に関与しているメディエイ夕一の作用をも抑制する危険性がある。この点において、抗原診断により特定されたアレルゲンとの暴露の機会を減らす予防法、及び Z又はこれらの原因ァレルゲンを用いた減感作療法が優れた治療法とされている。

従って、アレルギー疾患に対しては、まず原因となっている抗原を同定する診断が必要であり、そのためにまず 100種を超える市販のアレルゲンエキス、時には自製のものについて、疑わしい抗原エキスを皮内テストにより試験している。可能性の高い抗原が見つかると、血淸中の I g E抗体価の測定、誘発テスト、又は全血ゃリンバ球を用いたヒス夕ミン遊離試験により抗原を特定することができる。

ヒトにアレルギー症状を惹起させるアレルゲンとしては、天然に存在する多くのものが知られているが、市販の食品などのアレルゲンエキスは天然のアレルゲンを原料とした粗抽出物である。従って、当然多くの物質の集合体であり、また複数の抗原が含有されている。近年になって、分雠精製技術及びアレルゲン活性評価法が進展した結果、多くの食品アレルゲンから、アレルゲンの本体である抗原性タンパク質が単離同定されてきた。

また、環境中に存在するアレルゲンであるダニ、スギ花粉、ネコの毛などからもそれぞれより主要なアレルゲンとして Der p USmi th. W. A. et al. Cl in. Exp. Al lergy, Vol. 24, 220-228(1994) ] 、 Cry j I tSone, T. et al. Biochem. Biophys. Res. Co鯽 un. . Vol. 199, 619-625(1994)]、 Fel d I [Morgenstern. J. P. et al. Proc. Natl . Acad. Sci. USA, Vol. 88, 9690-9694(1991) ] と命名された抗原性タンパク質が単離されている。更に、それらのアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子も単雔され、遺伝子工学的手法により純粋なアレルゲンタンパク質を大量に調製することが可能になっている。

一方、真菌のアレルゲンを単離する努力もなされている。真菌細胞内に存在するタンパク質から、例えばカンジダ'アルビカンスよりアルコールデヒドロゲナ —ゼ (Can a I ) [Shen, H. D. et al. , Cl in. Exp. Al lergy, Vol. 21, 675-681 (1991) ] エノラーゼ [ Ishiguro. A. et al.， Infect. I圆 un.， Vol. 60, 1550-1557(1992) ] や、ァスペルギルス ·フミガタスよりリボトキシン（Asp f la) [Mosor. M. et al. , J • I讓 unol. , Vol. 149, 454-460(1992) ]等の抗原性タンパク質が単離同定され、これらのいくつかがアレルゲンとして作用することが知られている。

しかし、カンジダ、ァスペルギルスを含めて一般的に真菌アレルゲンの場合、単一の主要アレルゲンといえるものが抗原性夕ンパク質として存在する場合は少なく、複数の抗原性タンパク質が存在し [Stewart, G. A. et aL . Cl in. Exp. Al ler gy, Vol. 26. 1020-1044(1996) ] 、個人によって異なる抗原、また、各個人が複数の抗原をアレルゲンとして認識し反応している。即ち、例えば同じカンジダァレルギ一といつても、各個人の反応する抗原は異なる場合が多く、しかも各個人が複数のカンジダ由来抗原に反応していることが知られている。

現在市販されている診断用又は治療用アレルゲンエキスは、単なる抽出物や、ほとんど精製されてなく、さらに含有成分についても管理されていないものが殆どである。真菌アレルゲンエキスとしては、カンジダ、ァスペルギルス、アルタナリア、クラドスボリゥム、マラセチア、ぺニシリウムなどがある。しかしこれらの製造法は、前記のような食品や環境中の天然アレルゲン由来のアレルゲンェキスと異なる。つまり、原因真菌の培養細胞自体ではなく、各々の属に厲する代表的菌株を、ある限定した栄養源を含む人工培地で長期培養して得られる、副次産物とも言える培養液中の菌体外分泌物を原料とする。従って、本製造法により得られる抗原は、自己細胞の消化物や細胞外分泌物であり、マンナン、グルカンを始めとする細胞壁多糖が主成分と考えられるが、これらの抗原の含量及び他の抗原性タンパク質の種類も明らかになっていない。さらに、製造者間で品質が異なるため、使用に際しては充分な注意が必要である。

市販の真菌アレルゲンエキスにも多く含まれる細胞壁多糖、特にマンナンは、一部のァレルギ一患者において主要なァレルゲンとして働く一方、健常人でも細胞壁多糖に対する IgG 、 IgM を多量に持っている。さらに、マンナン自身、特に中性マンナンは、マウスに対する致死的作用といった毒性を有していることも知られている [日本医真菌誌第 36巻， 203-208. (1995)] 。また細胞壁グルカンも炎症を引き起こす等の病理学的作用を有することが知られている [Kogan. G. et al. Biomedical and Biotechnological Advaneds in Industrial Polysaccarides.2 51-258(1989) ] 。

従って、抗原であるマンナンを始めとする細胞壁成分や真菌細胞自身をヮクチンとして利用する際には過敏症を引き起こすなどの危険性がある。また、アレルギ一性疾患の減感作治癍等においても、必ずしも細胞壁成分が主要なアレルゲンとして働いているわけではないので、細胞壁成分を含有するアレルゲン組成物を用いる場合、その抗原性が危惧され、人に投与する際は慎重になる必要がある。この点において、現在市販の真菌アレルゲンエキスは全く不満足なものである。さらに、有効な抗原が、十分量含有されている診断用及び Z又は治療用の医薬組成物は知られていない。

上記のように、真菌症の増大に伴い、さらに現在使用されている抗真菌剤の副作用、耐性菌の出現、医療費の問題等から、有効性の高い、さらに安全性の高い、新たな真菌症の治療薬の開発が強く望まれている。抗真菌剤に比べてワクチンは多くの利点を有しており、これらの真菌による感染症に対するワクチンを見レ、出すことができれば、これらの感染症に感染することに伴う苦痛や衰弱を防止することができるだけでなく、これらの感染症の治療を目的とする薬剤の投与量を明確に減少させることもできる。さらに、この様に薬剤の使用を回避することにより、抗菌剤の過剰投与による病原性微生物に対する選択圧が減少し、耐性菌の出現を減少させることができる。しかし、現在のところそのような有効性の高いワクチンは発見されていない。また、単独の抗原で感作するよりも、複数の抗原で感作する方が耐性、有効性という点でより優れた感染防御を誘導することができると期待される。

—方、アレルギー疾患の増大に伴い、治療用或いは診断用アレルゲンエキスとして数多く市販されているが、有効成分は明らかになつていないものが多い。真菌に関しても、真菌細胞のどの部分に由来する成分であるかも明らかになつていないが、製法上、その主要成分は紬胞壁由来多糖体であり、明らかに細胞内由来の抗原成分が少なく、抗原成分に非常に偏りがあると考えられる。従って、市販の真菌アレルゲンエキス、及び同様な方法で得られる抗原エキスでは十分な治療及び診断は実施できないと考えられ、従来のアレルゲンエキスに含有される成分とは異なる、しかも、その成分の含量が異なるアレルゲンエキスは高い有効性を発揮することが期待される。また、アレルギー性疾患に有効とされる減感作療法の現状は、抗原液を週 1〜2回、少量ずつ皮内に投与し 3〜4力月かけて増量し、維持量に挙げ、更に 1〜 3年投与し続ける必要がある。従って、増量が容易及び/又は投与量を上げることが可能である抗原組成物の使用は、優れた治療効果をより容易に得られることが期待できる。また、ヒトを始めとする哺乳類は一般的に多様であり、たとえ一種類の真菌に感染又はアレルギー状態になったとしても、抗原として認識されるものは異なる可能性が高い。従って多様な抗原成分を十分量含有する抗原が望ましい。

さらに、原因抗原を特定することは、有効な治療法を選択する為の診断上重要であり、その抗原を用いた減感作治療などの有効性の高い、さらに安全性の高い治療も可能となる。従って未知の抗原を特定することは、これらの点から好ましい。

したがって本発明の目的は、このような真菌を原因とする疾患に対して有効で、より安全な生物学的製剤、例えば、ワクチン組成物、減感作治療用組成物、又は診断用組成物として使用することのできる真菌抗原を提供することにある。さらに本発明の目的は、かかる真菌抗原の製造方法、該真菌抗原をコードする核酸を提供することにある。発明の開示本発明者らは、従来主として抗原性分子として研究されてきた真菌の細胞壁成分に、生体に対し好ましくない免疫反応を引き起こすものがあるため、真菌細胞より細胞壁を取り除き、得られるプロトプラストを原料として細胞壁成分以外の抗原性、ワクチン及び/又はアレルゲンとして活性を有する物質を探索した。その結果、感染症を引き起こす真菌由来のプロトプラストより得られる細胞膜タンパク質や細胞小器官膜タンパク質を含有する不溶性画分が、意外にも強い抗原性を有しており、更に、実質的に細胞壁成分を含んでいないにも関わらずワクチンとして生の細胞と比べ同等以上の活性を有していることを明らかにした。また、この不溶性画分より界面活性剤等の可溶化剤を用レ、て得られる可溶化画分も強レ、抗原性を有しており、さらにワクチンとしても強い活性を有していることを明らかにした。

ざらに、本発明品は数種の抗原の混合物として得られるため、特定の抗原成分単独投与よりも幅広い免疫応答が期待でき、実際従来検討されていた抗原成分のいずれよりも強いヮクチン活性を有していることを明らかにした。更に該抗原はリンパ球を始めとする免疫担当細胞を刺激して細胞より I F N— 7等のサイトカィンを放出させる活性を有していることを明らかにした。なおサイトカインを放出する細胞として、例えば Tリンパ球、ナチュラルキラー（NK) 細胞等が挙げられる。一方、アレルギー性疾患の原因真菌由来のプロトプラストより得られる不溶性画分が、強い抗原性を有しており、さらに、アレルゲンとして十分な活性を有していることを明らかにした。また、この不溶性画分より界面活性剤等の可溶化剤を用いて得られる可溶化画分も強い抗原性を有しており、アレルゲンとしても十分な活性を有していることを明らかにした。また、疾患の原因真菌由来のプロトプラストより得られる不溶性画分及び/又は不溶性画分より得られる可溶化画分が、診断用の抗原として十分な活性を有していることを明らかにした。さらにこの画分より、従来解明されていなかった抗原性を有するタンパク質を単離することに成功し、本発明を完成させた。即ち、本発明の要旨は、

〔 1〕細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分であることを特徵とする真菌抗原、

〔2〕細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞が、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフエロブラストである前記〔1 ) 記載の真菌抗原、

C 3〕不溶性画分が、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる前記〔 1〕又は〔2〕記載の真菌抗原、

〔 4〕不溶性画分が、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる成分を約 1 0 0 0 0 0 X gの条件下で遠心分離処理に付して得られる沈殿画分である前記（1〕又は〔2〕記載の真菌抗原、

〔 5〕不溶性画分が細胞小器官を含有する前記〔 1〕〜〔 4〕いずれか記載の真菌抗原、

〔6〕細胞小器官がミトコンドリア、核、ライソソーム、及び液胞からなる群より選ばれる 1種以上のものである前記〔5〕記載の真菌抗原、

〔 7〕不溶性画分が細胞膜夕ンパク質及び又は細胞小器官の膜夕ンパク質を含有する前記〔 1〕〜（6〕いずれか記載の真菌抗原、

〔8〕前記（1〕〜〔7〕いずれか記載の不溶性画分より分別抽出される可溶化画分である真菌抗原、

〔 9〕可溶化面分が可溶性タンパク質である前記〔 8〕記載の真菌抗原、

〔1 0〕界面活性剤を含有する緩衝液により分別抽出される前記〔8〕又は〔 9〕記載の真菌抗原、

( 1 1〕前記〔8；) 〜〔1 0〕いずれか記載の真菌抗原であって、糖群特異的吸着体に対して結合性を有する真菌抗原、 U 2〕糖群特異的吸着体がコンカナパリン A固定化体である前記〔 1 1〕記載の真菌抗原、

〔 1 3〕前記〔8〕〜〔 1 0〕いずれか記載の真菌抗原であって、糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない真菌抗原、

〔1 4〕糖群特異的吸着体がコンカナパリン A固定化体である前記〔1 3〕記載の真菌抗原、

〔 1 5〕真菌細胞が、カンジダ厲 (Candida ) 、ァスペルギルス厲（Aspergil lus ) 、クリブトコッカス厲（Cryptococcus) 、ムーコル属（Mucor ) 、リゾブス属（Rhizopus) 、アブシジァ厲（Absidia ) 、ノカルジァ厲（Nocardia) 、ヒストプラズマ厲（Histoplasma ) 、ブラストミセス属（Blastomyces ) 、コクシジォイデス厲（Coccidioides) 、トリコフイトン厲（Trichophyton) 、ミクロスボル厶属（Microsporum ) 、ェビダーモフィトン厲 (Epidermophyton) 、スボロトリックス属（Sporothrix) 、黒色真菌（Dematiaceous fungi) 、マラセチア属

( alassezia) 、ニューモシスチス属（Pneumocystis) 、ぺニシリウム厲（Peni cillium ) 、アルタナリア厲 (Alternaria) 、クラドスポリゥム厲（Cladospori um) 、ボトリチス厲 (Botrytis) 、ォ一レオバシジゥム厲（Aureobasidium ) 、フザリウム属（Fusarium) 、トリコデルマ属（Trichoderma ) 、ヘルミンソスボリウム属（Heltninthosporium) 、ノィロスボラ属（Neurospora) 、ヮレミァ属（ Walleroia) 及びロドトルラ属（Rhodotorula ) に属する真菌からなる群より選ばれる 1種類以上の真菌より得られる前記〔1〕〜（ 1 4〕いずれか記載の真菌抗原、

(1 6〕真菌細胞が、カンジダアルビカンスの少なくとも一菌株の細胞である前記〔1〕〜（： 1 5〕いずれか記載の真菌抗原、

〔 1 7〕真菌細胞が、ァスペルギルスフミガタスの少なくとも一菌株の細胞である、前記（1〕〜〔1 5〕いずれか記載の真菌抗原、

〔1 8〕真菌細胞が、クリプトコッカスネオフォルマンスの少なくともー菌株の細胞である、前記〔 1〕〜〔1 5〕いずれか記載の真菌抗原、

〔1 9〕真菌細胞が、トリコフィトン) i、ミクロスボルム属、又はェビダ一モフィトン属に厲する皮膚糸状菌の一菌株の細胞である、前記〔 1〕〜〔 1 5〕いずれか記載の真菌抗原、

〔2 0〕カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 1に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（S D S - P A G E、還元条件下）が約 6 5 , 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、

〔2 1〕ワクチン活性又はアレルゲン活性を有する、配列表の配列番号： 5に示すァミノ酸配列の全部又はその一部を含むぺプチドからなる真菌抗原、

〔2 2〕配列表の配列番号： 5に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも 1つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するべプチドからなる真菌抗原、

〔2 3〕前記（2 0〕〜（2 2〕いずれか記載の真菌抗原をコードする核酸、

〔2 4〕配列表の配列番号： 7に示す塩基配列の全部又はその一部を有する、前記〔2 3〕記載の核酸、

〔2 5〕前記〔2 3〕又は〔2 4〕記載の核酸にハイブリダィズ可能な、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するぺプチドをコ一ドする核酸、

〔2 6〕カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 2に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（S D S— P A G E、還元条件下）が約 2 5 , 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、

〔2 7〕ワクチン活性又はアレルゲン活性を有する、配列表の配列番号： 6に示すァミノ酸配列の全部又はその一部を含むぺプチドからなる真菌抗原、〔2 8〕配列表の配列番号： 6に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基の欠失、付加、揷入又は置換の少なくとも 1つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するべプチドからなる真菌抗原、

〔2 9〕前記〔2 6：) 〜〔2 8〕いずれか記載の真菌抗原をコードする核酸、

〔3 0〕配列表の配列番号： 8に示す塩基配列の全部又はその一部を有する、前記〔2 9〕記載の核酸、

〔3 1〕前記〔 2 9〕又は〔 3 0〕に記載の核酸にハイブリダィズ可能な、ヮクチン活性又はアレルゲン活性を有するぺプチドをコ一ドする核酸、

(3 2〕カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 3に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（SDS - PAGE、還元条件下）が約 3 0, 0 0 0である抗原性夕ンパク質からなる真菌抗原、

〔3 3〕カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 4に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（SDS - PAGE、還元条件下）が約 6 2, 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原、

〔34〕（ 1 ) 真菌の生細胞を得る工程、

(2) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、

(3) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌紬胞をバーストさせる工程、及び

(4) 不溶性画分を得る工程、

の各工程を含むことを特徴とする、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分である真菌抗原の製造方法、

(3 5〕（ 1 ) 真菌の生細胞を得る工程、 ( 2 ) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、

( 3 ) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、

( 4 ) 不溶性画分を得る工程、

( 5 ) 不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程、

の各工程を含むことを特徴とする、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分を分別抽出して得られる、可溶化画分である真菌抗原の製造方法、

〔3 6〕さらに、得られる可溶化画分を糖群特異的吸着体を用いて精製するェ程を設ける前記（3 5〕記載の製造方法、

〔3 7〕可溶化画分が可溶性タンパク質を含有する前記〔3 5〕又は〔3 6〕記載の製造方法、

〔3 8〕不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程が、界面活性剤を含有する緩衝液を用いて不溶性画分を可溶化する工程を含む前記〔3 5〕〜〔3 7〕いずれか記載の製造方法、

〔3 9〕糖群特異的吸着体がコンカナパリン A固定化体である前記〔3 6〕〜〔3 8〕いずれか記載の製造方法、

〔4 0〕細胞壁溶解酵素処理及び/又は物理的処理により、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る前記〔3 4〕〜〔3 9〕いずれか記載の製造方法、

( 4 1〕細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞が、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフエロプラストである前記〔3 4〕〜〔4 0〕いずれか記載の製造方法、

( 4 2〕細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる成分を約 1 0 0 0 0 0 X gの条件下で遠心分離処理に付して不溶性画分を得る前記〔34；) 〜（4 1〕いずれか記載の製造方法

〔4 3〕前記〔1〕〜〔22〕、〔2 6：) 〜〔28〕、〔3 2〕〜〔33) レ、ずれか記載の真菌抗原、又は前記〔34；) 〜（4 2〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有する生物学的製剤、

〔4 4〕前記〔1〕〜〔22〕、〔2 6；) 〜〔2 8〕、〔3 2：) 〜〔3 3〕レヽずれか記載の真菌抗原、又は前記〔34〕〜〔4 2〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有する医薬組成物、

(4 5〕前記〔1〕〜（： 22〕、〔2 6〕〜〔28〕、〔32〕〜〔3 3〕レ、ずれか記載の真菌抗原、又は前記〔34〕〜〔4 2〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徵とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有するヮクチン組成物、

(4 6〕前記（4 5〕記載のワクチン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法、

〔4 7〕ワクチン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりヮクチン組成物の製造に使用した真菌及び/又はその近縁菌の増殖を抑制し、該真菌及び/又はその近緣菌に起因する疾病を予防または治療する前記〔4 6〕記載の方法、

〔4 8〕前記 U：) 〜（22〕、（2 6：) 〜〔28〕、〔32〕〜〔3 3〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔34：！〜〔4 2〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とするサイトカイン放出剤、

〔4 9〕前記〔1：) 〜〔22〕、〔2 6〕〜（： 2 8〕、〔3 2〕〜！: 3 3〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔34〕〜〔4 2〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対するァレルギー性疾患を予防し又は治療効果を有するァレルゲン組成物、〔5 0〕前記〔4 9〕記載のアレルゲン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法、

〔5 1〕アレルゲン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりアレルゲン組成物の製造に使用した真菌及び Z又はその近縁菌に起因するァレルギ一性疾患を予防または治療する前記〔5 0〕記載の方法、

〔5 2〕前記〔1〕〜（： 2 2〕、〔2 6；!〜（2 8〕、〔3 2：) 〜〔3 3〕いずれか記載の真菌抗原、又は前記〔3 4〕〜〔4 2〕いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、該真菌による疾患の診断用組成物、

〔5 3〕前記〔5 2〕記載の診断用組成物を使用することを含む、真菌による脊椎動物の疾患を診断する方法、に関するものである。図面の簡単な説明

第 1図は、カンジダアルビカンス T I MM 1 7 6 8紬胞（酵母型）の細胞壁除去前後の形想を示す図である。微分干渉顕微鏡（ニコン社製）を用い、倍率はいずれも 1 0 0 0倍である。 Aは細胞壁除去前の細胞であり、 Bは細胞壁除去後の細胞である。

第 2図は、ァスペルギルスフミガタス細胞の細胞壁除去前後の形態を示す図である。微分干渉顕微鏡（ニコン社製）を用い、倍率はいずれも 4 0 0倍である。 Aは細胞壁除去前の細胞であり、 Bは細胞壁除去後の細胞である。

第 3図は、マウスの抗カンジダ血清（レーン 1 ) 、ゥサギの抗カンジダ血淸（レーン 2 ) 、及び健常ヒト血清（レーン 3 ) に含まれる、カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-し SP由来のタンパク質に対する抗体の存在を示す図である。

第 4図は、マウスの抗ァスペルギルス血清に含まれる、ァスペルギルスフミガタス不溶性画分 Af-LSP 由来のタンパク質（レーン 1 ) 及びクリブトコッカスネオホルマンス不溶性面分 Crn-LSP由来のタンパク質（レーン 2 ) に対する抗体の存在を示す図である。

第 5図は、マウスの抗カンジダ血清に含まれる、カンジダアルビカンス不溶性面分 Ca-LSP由来のタンパク質（レーン 1 ) 、クリプトコッカスネオホルマンス不溶性画分 Crn-LSP由来のタンパク質（レーン 2 ) 及びァスペルギルスフミガタス不溶性画分 Af-LSP 由来のタンパク質（レーン 3 ) に対する抗体の存在を示す図である。

第 6図は、マウスの抗カンジダ血清に含まれる、酵母型カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-し SP由来のタンパク質（レーン 1 ) 及び菌糸型カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSP- M由来のタンパク質（レーン 2 ) に対する抗体の存在を示す図である。

第 7図は、菌糸型カンジダアルビカンス細胞の細胞壁除去前後の形態を示す図である。微分干渉顕微銃（ニコン社製）を用い、倍率はいずれも 4 0 0倍である。 Aは紬胞壁除去前の細胞であり、 Bは細胞壁除去後の細胞である。

第 8図は、ヒト末梢血リンバ球（P B M C ) を含む R P M I - 1 6 4 0培地に Ca - LSP抗原液を添加し、培養開始後 7日目のヒト I F N - 7產生量を示す図であ。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を説明する。

本発明の真菌抗原は、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌钿胞より得られる不溶性画分であることを特徴とするものである。かかる真菌抗原は、例えば生物学的製剤として使用される。本発明の真菌抗原は、感染症の原因真菌又はアレルギー性疾患の原因真菌より得られるものであり、感染症の原因真菌に由来するものは、脊椎動物に獲得自動免疫を誘導しうるものであるため、特にワクチン組成物として好適に使用できる。一方、アレルギ —性疾患の原因真菌に由来するものは、脊椎動物の減感作に利用することができ、アレルギー性疾患の予防及び治療に好適に使用できる。さらに、かかる真菌抗原は、真菌による疾患の診断に好適に使用できる。

1 . 真菌細胞について

本発明で使用される真菌としては、ヒト、動物を始めとする脊椎動物に病原性を有する真菌又はその真菌と近縁のものであれば特に限定はない。例えば、カンジダ属（Candida ) 、ァスペルギルス厲 (Aspergi l lus ) 、クリプトコッカス厲 (Cryptococcus) 、ムーコル厲（Mucor ) 、リゾプス厲 (Rhizopus) 、アブシジァ厲 (Absidia ) 、ノカルジァ厲（Nocardia) 、ヒストプラズマ厲（Histoplasm a ) 、ブラストミセス属（Blastomyces ) 、コクシジォイデス属（Coccidioides ) トリコフイトン属（Trichophyton) 、ミクロスボル厶厲 ( icrosporum )、ェビダーモフィトン厲（Bpidermophyton) 、スボロトリックス厲 (Sporothrix) 、黒色真菌 (Dematiaceous fungi) 、マラセチア厲 (Malassezia) 、ニューモシスチス厲（Pneumocystis) 、ぺニシリウム属（Penici l l ium ) 、アルタナリア属 (Alternaria) 、クラドスボリゥム属（Cladosporium) 、ボトリチス属（Botryt is) 、オーレォバシジゥム属（Aureobasidium ) 、フザリウム属（Fusarium) 、トリコデルマ属（Trichoderma ) 、へルミンソスボリゥ厶属（Helminthosporium ) 、ノィロスボラ厲（Neurospora) 、ヮレミァ厲（Wal lemia) 、及びロドトルラ属（Rhodotorula ) に属する真菌からなる群より選ばれる 1種類以上の真菌が挙げられる。

本発明における脊椎動物の真菌感染症としては、ヒトの場合、カンジダ症、ァスペルギルス症、クリブトコッカス症、ム一コル症、放線菌症、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症、各種皮膚真菌症、癜風、カリニ肺炎等が挙げられる。したがって、本発明において、ワクチン組成物に用いられる真菌は、かかる真菌感染症の原因菌であることが有用性の観点から好ましい。

具体的には、カンジダ症原因菌であるカンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス（ C. tropicalis) 、カンジダグラブラタ（Candida glabrata ) 等；ァスペルギルス症原因菌であるアルペルギルスフミガタス、ァスペルギルスフラブス（Aspergi 1 lus flavus ) 等；クリプトコッカス症原因菌であるクリブトコッカスネオフォルマンス等；ムーコル症原因菌であるムーコルエスピー（Mucor sp. ) 、アブシジァエスピー（Absidia sp. ) 、リブブスエスピー（Rhizopus sp. ) ：放線菌症原因菌であるノカルジァァステロイデス（No cardia asteroides ) 等；その他内臓に真菌感染症を起こす原因菌であるトリコスボロンクタネゥム（Trichosporon cutaneum ) 、ロドトルラグルチニス（ Rhodotorula glutinis) 、ゲォトリクムカンジズム（Geotrichum candidum ) 、ニューモシステイスカリニ（Pneumocystis carini i) 、コクシジォイデスイミチス（Coccidioides i臟 i tis) 、パラコクシジォイデスブラシリエンシス (Paracoccidioides brasi liensis ) 、ヒストプラズマ力プスラツム（Histop lasma capsulatum) 、プラス卜ミセスデゾレマチチデイス ( Blastomyces derma ti tidis ) 等；皮虜糸状菌（デルマトフィテス（Dermatophytes ) ) であるトリコフイトン厲（トリコフィトンメン夕グロフィテス（Tricophyton mentagroph ytes ) 、トリコフィトンルブルム（Tricophyton rubrum ) トリコフイトンベルコーサム（Tricophyton verrucosum ) ) 、ミクロスボルム属（ミクロスボルム力ニス（Microsporura canis ) 、ミクロスボルムジブセゥム（Micr osporum gypseum ) ) 、ェビダーモフィトンエスピー（Epidermophyton sp. ) ；黒色真菌（デマチアセウスフンギ（Dematiaceous fungi) ) であるフィァ口フオラエスピー（Phialophora sp. ) . クラドスボリゥムエスピー（Clados porium sp. ) ；癜風菌であるマラセチアファーファー（Malassezia furfur ) ；その他皮 It真菌症原因菌としてはスボロトリックスシヱンキ（Sporothrix s chencki i) 、フォンセカエアペドロソィ（Fonsecaea pedrosoi) 等が挙げられる。

使用される菌株としては、治療または予防しょうとする真菌症の原因菌と近縁のものであれば特に限定されないが、病原性（例えばマウスに対する致死毒性）を有する菌株が望ましい。使用される菌株の代表例としては、カンジダ症に対しては、例えば、カンジダアルビカンス ATCC 10231、 TI 1768、 TIMM 0239 ；ァスペルギルス症に対しては、ァスペルギルスフミガタス ATCC 28212, ATCC 42202, TIMM 1776 ; クリプトコッカス症に対してはクリプトコッカスネオフォルマンス ATCC 24067、 TIMM 0354 、夾膜欠損したクリブトコッカスネオフォルマンス TIMM0357が举げられる。

また細胞よりのサイトカイン放出を目的として使用される場合、真菌抗原としては健常人においても免疫感作を受けている常在真菌由来であることが好ましく、特にカンジダアルビカンス由来の抗原が好ましい。

一方、アレルギー反応の抑制に使用される場合、本発明のアレルゲン組成物に含有される真菌抗原の調製に用いられる真菌は、ヒトに対しアレルギー症状を惹起する原因菌であることが有用性の観点から好ましい。

具体的には、カンジダ厲真菌であるカンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、カンジダグラブラタ、カンジダボイディニイ（Candida boidini i ) 等；ァスペルギルス属真菌であるァスペルギルスフミガタス、ァスペルギルスレストリクッス（Aspergil lus restrictus) 、ァスペルギルスヴェルシコラ（Aspergi l lus versicolor) 等：トリコフイトン厲真菌であるトリコフィトンメン夕グロフィテス（Trichophyton mentagrophytes ) ；マラセチア厲真菌であるマラセチアファーファー；ムーコル属真菌であるム一コルラセモサス（ ucor racemosus ) ；リゾブス属真菌であるリゾプスオリザェ（Rhizopus ory zae ) ：ぺニシリウム属真菌であるぺニシリウムノタタム（Penici ll ium nota turn ) ；アルタナリア属真菌であるアルタナリアアルタナタ（Al ternaria al t ernata) 、アルタナリアキクチアナ（Al ternaria kikuchiana ：) ; クラドスボリウム厲真菌であるクラドスボリゥムクラドスボリオイデス（Cladosporium c ladosporioides) 、クラドスボリゥムカリオニイ（Cladosporium carioni i ) ；ボトリチス厲真菌であるボトリチスシネラ（Botrytis cinerea) ；ォ一レオバシジゥム厲真菌であるオーレォバシジゥムプルランス（Aureobasidium pul l ulans ) ；フザリウム属真菌であるフザリウムォキシスボルム（Fusarium oxy sporum) ；トリコデルマ厲真菌であるトリコデルマヴィリダェ（Trichoderma viridae ) ；ヘルミンツスボリウム厲真菌であるへルミンソスポリゥムマイジス（Helminthosporium maydis ) ；ノィロスボラ属真菌であるノィロスボラクラサ（Neurospora crassa ) ；ヮレミァ厲真菌であるヮレミアセビ（Wal lemia sebi ) ；口ドトルラ属真菌である口ドトルラグルチニス（Rhodotorula glut inis) 等が挙げられる。

使用される菌株としては、治療または予防しょうとするアレルギー症の原因菌と近縁のものであれば特に限定されない。代表例としては、カンジダ抗原を調製するためには、カンジダ属真菌、例えばカンジダアルビカンス ATCC 10231 、同 TIMM 1768 、カンジダボイディニイ ATCC 18810；ァスペルギルス抗原を調製するためは、ァスペルギルス属真菌、例えばァスペルギルスフミガタス ATC C 28212 、同 TIMM 1776 、ァスペルギルスレストリクス ATCC 16912 ；アルタナリア抗原を調製するためは、アルタナリア厲真菌、例えばアルタナリアアルタナ IF0 31188；マラセチア抗原を調製するためは、マラセチア属真菌、例えばマラセチアファーファー ATCC 14521 、同 ΠΜ 2782 が挙げられる。

本発明において、真菌を原因とする疾患の診断に使用される真菌抗原の場合、用いられる真菌は、疾患の原因となる上記の真菌が好ましい。

2 . 真菌抗原について

本明細害において、「細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞」における「細胞壁を実質的に除去した真菌細胞」とは、該真菌細胞のプロトプラストないしはプロトプラスト様のものをいう。また、 Γ 細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞」とは、スフエロブラストないしはスフエロプラスト様のものをいう。即ち、細胞壁を実質的に除去した真菌細胞の典型的なものは、該真菌細胞のプロトプラストであり、細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞の典型的なものは該真菌細胞のスフヱロブラストである。したがって、「細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分」とは、不溶性画分が該真菌細胞のプロトブラスト又はスフエロブラスト等より得られるものであることを意味する。

また、「細胞壁の少なくとも一部を除去」するとは、細胞壁構成成分である、例えばマンナン、グルカンを、細胞壁としての機能である形態の維持、低張液に対する浸透圧耐性を失わせる程度に除去することであり、同時に細胞壁成分に起因した副作用が少なくとも生じない程度に細胞壁を除去することをいう。本発明においては、真菌紬胞は細胞壁を実質的に除去したものを用いることが好ましいが、生体に投与した場合、細胞壁由来の成分が生体に対し悪影響、例えば過敏症、致死作用を示さなければ、細胞壁成分が一部残存したものを用いても良い。不溶性画分は、具体的には細胞膜、細胞小器官（ミトコンドリア、核、ライソソーム、液泡等）、および細胞小器官膜といった、比較的大きい細胞内構造体と共に、細胞膜に結合したタンパク質や細胞小器官の膜に結合したタンパク質を含有する。なお、本発明における不溶性画分は、上記の成分を全て含有する必要はなく、少なくとも一成分を含有するものであれば良い。

さらに、この不溶性画分には、リン脂質や糖脂質をはじめとする脂質、糖質、核酸等が含有されていてもよい。さらに、細胞壁の一部が残存している真菌細胞を用いた場合、本発明の真菌抗原を生体に投与した際、細胞壁由来の成分が量的に又は質的に生体に対し悪影響、例えば過敏症、致死作用を示さなければ、細胞壁由来の成分を含有していても良い。これら細胞壁由来抗原成分の混入量は、例えば、後述の実施例で示すように細胞壁成分に対する抗血清を用いた凝集反応に対する、阻害活性の測定等により定量することができる。

かかる本発明における不溶性画分は、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を例えばバース卜することにより得ることができる。さらには、上記のようにバーストして得られる成分を約 1 0 0 0 0 0 X gの条件下で遠心分離処理に付して得られる沈殿画分を不溶性画分として用いることもできる。

さらに、本発明の真菌抗原は、本発明における不溶性画分より分別抽出される可溶化面分であっても良い。該可溶化画分には主として抗原性のある可溶性タンパク質が含有されている。その他、糖質、脂質も含有されていてもよい。可溶化画分は、例えば、精製工程において據過滅菌を実施することができ、熱や有機溶媒による滅菌操作に対し不安定な抗原成分を、可溶化工程により活性を維持した状態で調製することが可能になる。かかる可溶化画分は、可溶化剤を含有する緩衝液、例えば界面活性剤を含有する緩衝液を用いて分別抽出することにより得ることができる。

さらに、本発明の真菌抗原は、目的に応じた分離精製手段により不溶性画分又は可溶化画分をさらに精製した画分であっても良い。例えば、カンジダアルビカンス TIMM1768 を原材料として得られる可溶化画分を、糖群特異的吸着体を用いて得られる、該吸着体に対して結合性を有する分子を含有する画分も、本発明の真菌抗原として使用することができる。糖群特異的吸着体としては、例えば、コンカナパリン A (ConA) 固定化体が挙げられる。 ConAは、 α— D—マンノピラノース、 α— D—グルコビラノース、及びこれらに立体的に類似した糖残基を含む分子と結合するため、 ConA固定化樹脂により、可溶化画分に含まれる成分を、各成分に含有される糖残基の違いにより、いくつかの画分にさらに分離することができる。例えば、カンジダアルビカンス TI M1768可溶化画分より分離される、 ConA結合性の面分（ConA結合性糖残基を有するタンパク質含量の高い画分）は、マウスに投与した場合、充分な感染防御活性を示す。

一方、糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない分子よりなる画分にも各種の本発明の真菌抗原が存在する。即ち、本発明の真菌抗原としては、更に上記の様にして得られる糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない分子よりなる画分も含むものであり、さらにこの画分を精製して得られる画分であってもよい。例えば、カンジダアルビカンス ΠΜΜΠ68由来の ConA非結合画分を、更にイオン交換クロマトグラフィー等に付すことにより、配列表の配列番号： 1に示す部分ァミノ酸配列を有し、分子量（SDS— PAGE、還元条件下）約 65, 000を示す抗原性タンパク質、配列表の配列番号： 2に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（SDS - PAGE、還元条件下）約 25, 000を示す抗原性タンパク質、配列表の配列番号： 3に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（SDS— P AGE. 還元条件下）約 30, 00 0を示す抗原性タンパク質、配列表の配列番号： 4に示す部分アミノ酸配列を有し、分子量（SDS— PAGE、還元条件下 ) 約 62, 0 00を示す抗原性タンパク質を含有する精製画分が得られる。精製面分或いは単離された抗原性タンパク質は本発明の真菌抗原として用いられるものであり、真菌を原因とする疾患の治療、診断に有用である。特に単離された抗原性夕ンパク質は、診断における原因抗原の同定等の面で有用である。

これらの抗原性タンパク質は、カンジダアルビカンスに由来するものであり、カンジダアルビカンスによる感染症に対するワクチン活性、又はカンジダアルビカンスによるァレルギー症状の予防 ·治療に有用なァレルゲン活性を有する。本明細書において、ワクチン活性とは本発明の真菌抗原を用いて常法により調製されたワクチンがワクチンとして有効な薬理作用を発揮することを意味し、アレルゲン活性とは、アレルギー患者の血淸を用いた、 RAST法等による本発明の真菌抗原に対する I gE抗体価測定試験において、異常高値を示すこと、又は本発明の真菌抗原を用いた皮膚テストにおいて陽性反応を示す作用を有することを意味する。

さらに、本発明は、前記のような単離された抗原性タンパク質と免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物をも本発明の真菌抗原として包含する。例えば、各種カンジダアルビカンス、更にカンジダアルビカンス以外のカンジダ厲真菌の機能的同等物も本発明に含まれる。即ち、上記 4種の抗原性タンパク質のうち、分子量約 6 5 , 0 0 0の抗原性タンパク質はサッカロマイセスセレピシェ

(Saccharomyces cerevisiae) のミトコンドリァ局在ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（D L D H) と、分子量約 2 5 , 0 0 0の抗原性タンパク質はサッカロマイセスセレピシェのミトコンドリア局在スーパーオキサイドジスムダーゼ

( S O D) と、分子量約 3 0 , 0 0 0の抗原性タンパク質はサッカロマイセスセレピシェのシトレートシンターゼ（c rate synthase) と、分子量約 6 2 , 0 0 0の抗原性タンパク質はサッカロマイセスセレピシェの液胞型ァミノぺプチダーゼ I (vacuolar aminopeptidase I ) とホモロジ一を有するが、ワクチン活性及び/又はアレルゲン活性等の免疫学的性質が同等の抗原も本発明に包含される。

ここで、免疫学的に同等の性質を有する機能的同等物とは、 1又は 2以上のァミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加されたタンパク質であって、ワクチン活性及び/又はァレルゲン活性等の免疫学的性質が同等のものをいう。

また、単離された抗原性タンパク質を基に、抗原性断片を作成することもできる。抗原性断片を作製するには、例えば、単離された抗原性タンパク質を原料として、リシルエンドべプチダーゼ、トリブシン等のプロテアーゼによる酵素消化、臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗原性を有する断片を夕ンパク質の精製において既知の方法により単離精製することにより得ることができる。更に、抗原性断片の化学構造に関する情報を基に、ペプチド合成技術を利用して化学合成による製造も可能である。本発明の抗原性断片には、哺乳類、特にヒトにおける免疫応答、例えば最小量の I g Eの刺激、 I g Eの結合、〗 g G 及び I g M抗体の生産の誘起、又は增¾などの T細胞応答及びノ又はリンホカイン分泌及び又は T細胞アナージー誘導などを引き起こす作用を有する、真菌由来の抗原性夕ンパク質の断片が含まれる。

抗原性断片の抗原性は、ヒトのボランティアへの皮膚試験、皮内試験の他、 R A S T, E L I S A、又はヒスタミン遊離などの試験管内試験においても評価することができる。

なお、真菌抗原の安定性の強化及び又は所望の反応性の強化、すなわち治療目的からすれば、個体防御免疫能の誘導強化や、アレルギー反応を減弱化または酵素活性を消失させるのに、また診断目的からすれば、抗原と抗体の特異的結合の強化を行うために、抗原性タンパク質或いは抗原性断片を改変し、誘導体化したり、ボリエチレングリコール（PEG)法 [Wie et al. Int. Arch. Al lergy Appl. Immunol. , Vol. 64. 84-99, (1981) ] を用いて P E Gと結合させることができる。タンパク質の改変には、ピリジルェチル化、還元、アルキル化、ァシル化、適当な担体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、又は塩酸グァニジン処理も含まれる。

—方、単離された抗原性タンパク質の部分アミノ酸配列の情報をもとに、 P C R等により該抗原をコ一ドする核酸を単雜することができる。以下にその一例について述べる。

まず目的抗原性タンパク質を発現している細胞より c D N Aライブラリーを作成する。次に該抗原性タンパク質を発現している細胞のゲノム DNAを铸型とし、抗原性夕ンパク質の部分ァミノ酸配列をコードすると推定される核酸塩基配列を基に設計された増幅用プライマーとなるオリゴヌクレオチド及び該ォリゴヌクレオチドと増幅用ブライマー対を形成しうる適当なォリゴヌクレオチドを用い P C Rを行う。該 P C Rにより得られた DN A断片をプローブとしたハイプリダイゼーシヨンにより c DNAライブラリーから目的とする抗原性タンパク質をコ一ドする D NAを選択することが出来る。例えば、配列表の配列番号： 1に記載したアミノ酸配列情報、カンジダアルビカンス T I MM 1 7 6 8の c DNAライブラリー及びカンジダアルビカンス T I MM 1 7 6 8のゲノム DNAを用いた上記方法により配列表の配列番号： 5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、配列表の配列番号： 7に示す塩基配列を有する DN Aを単離することが出来る。

また目的抗原性タンパク質を発現している細胞の R N A及び抗原性タンパク質の部分アミノ酸配列をコードすると推定される核酸塩基配列を基に設計された增幅用ブライマー等を用いた R T - P C Rによっても該抗原性タンパク質をコードする核酸を単雜することが出来る。例えば、配列表の配列番号： 2に記載したァミノ酸配列情報及びカンジダアルビカンス T I MM 1 7 6 8の R N Aを用いた上記方法により配列表の配列番号： 6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、配列表の配列番号： 8の塩基配列を有する D N Aを単離することができる。

なお、本発明において配列表の配列番号： 5に記載のアミノ酸配列を有する夕ンパク質からなる真菌抗原をコードする核酸は配列表の配列番号： 7に示す塩基配列を有する核酸に特に限定されない。同様に配列表の配列番号： 6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる真菌抗原をコードする核酸も、配列表の配列番号： 8に示す塩基配列を有する核酸に特に限定されない。即ち ¾伝子上でァミノ酸を指定するコドン（3つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに 1 〜 6種類ずつが存在することが知られている。したがってあるアミノ酸配列をコードする核酸はそのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。核酸は自然界において决して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるァミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じァミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたといえる。したがってある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコ一ドする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じァミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。たとえば遗伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の DN A上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている（たとえば特公平 7— 1 0 2 1 4 6号）。このように特定のァミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作成可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。

更に本発明における真菌抗原をコードする核酸には、配列表の配列番号： 5又は 6の塩基配列の全部又はその一部からなる核酸にハイブリダイズ可能で、該核酸にコードされるぺブチドが本発明の真菌抗原と同等のヮクチン活性又はァレルゲン活性を有する核酸も包含される。ハイプリダイズ可能とは以下の条件が例示される。

すなわち、 DNAを固定したメンブレンを 0. 5%SDS、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（BSA) 、 0. 1 %ボリビニルピロリドン、 0. 1 %フイコール 4 00、 0. 0 1 %変性サケ精子 DNAを含む 6 xSSC ( 1 XSSCは 0. 1 5 M Na C 0. 0 1 5Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0を示す）中で、 5 O'Cにて 1 2〜20時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーシヨン終了後、 0. 5%SDSを含む 2 XSSC中、 37°Cでの洗浄から始めて、 SSC濃度は 0. 1倍までの範囲で、また、温度は 50°Cまでの範囲で変化させ、固定された DNA由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、ブローブの検出を行う。

上記核酸を利用すれば、遺伝子工学的手法により大腸菌、酵母、カビ、哺乳類細胞等において組み換え夕ンパク質として抗原性夕ンパク質を製造することが出来る。また該核酸の一部を用いることにより、該抗原性タンパク質の抗原性断片を遺伝子工学的手法により製造することが出来る。

上記遺伝情報が得られれば、当然、抗原性タンパク質の機能的同等物を、抗原性タンパク質をコードする核酸の特定部位の突然変異誘発を用い、既知の方法により抗原性タンパク質の構造を改変し、得ることができる。例えば、タンパク質をコードする核酸の 1又は 2以上の塩基の置換、挿入、欠失又は付加によってァミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は付加を起こすことができる。具体的には、配列表の配列番号： 5あるいは配列番号： 6に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基の欠失、付加、揷入又は置換の少なくとも 1つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するペプチドからなる真菌抗原は、本発明の抗原性タンパク質の変異体であり機能的同等物の一例として本発明の範囲内である。さらに、生物活性を保持したままの変異体を選択することも可能である。

なお本発明の真菌抗原をコードする核酸には、本発明における抗原性夕ンパク質の抗原性断片や前記のような抗原性タンパク質の変異体をコ一ドする核酸も包含される。

該変異体の作製方法としては、ギャップド 'デュブレックス法 [Wi lfried. K. e t aし Nuclei c Acids Research, Vol. 12, 24, 9441-9456(1984) ] 、デレーンヨン法 [Celeste. Y. P. et al. , Gene, Vol. 33, 103-119, 1985)、 P C R法（Gene, Vol. 10

2, 67 - 70, (1991) ]、ゥラシル D N A法 [Thomas, A. K. et al. , Methods in Enzymol ogy. Vol. 4, 367-382(1987) ] やカセット変異法 [ James, A. W. et aし Gene, Vol. 34, 315-323(1985) ]等が知られている。

本発明の真菌抗原（実施例 1における Ca-LSP) の毒性は低く、 2 0 m g / k g をマウスの静脈内に投与しても、全く異常は認められないものである。

3 . 真菌抗原の製造方法

細胞壁を実質的に除去した、又は紬胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分である真菌抗原を製造する方法としては、例えば、

( 1 ) 真菌の生細胞を得る工程、 ( 2 ) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程、

( 3 ) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバ一ストさせる工程、

( 4 ) 不溶性画分を得る工程、

といつた工程を含む製造方法が挙げられる。

工程（ 1 )

工程（ 1 ) は、真菌の生細胞を得る工程である。より具体的には、真菌を生育に適した培地で培養し、新鲜な真菌の生細胞を得る工程である。

まず、真菌の培養は、各々に適した炭素源、窒素源、その他の栄養源を含む栄養培地で、生育可能な温度、条件で実施すればよい。通常、真菌の培養に用いられる栄養培地としては、サブロー培地、ポテトデキストロ一ス培地、ッァペックドックス培地、麦芽培地、イーストニトロゲンベース 'グルコース合成培地等が広く用いられる。必要に応じて、血清や血清アルブミンを添加してもよい。また、癜風菌のようにォリーブオイル等を添加した培地が生育に適している真菌もある。培養温度は、〜 45°C位が一般的であるが、真菌によっては、培養温度により形態が変化する（二形性真菌と言われるものが多い）ものもあり、適宜選択する必要がある。例えば、カンジダアルビカンスの場合、 25〜37'Cが好適に使用される培養温度であるが、 30^eC前後では通常の培地では酵母状の生育をするが、 37で付近では菌糸状の生育をしやすい。二形性の真菌では、細胞壁構成成分、膜夕ンパク質を含む細胞内タンパク質等の夕ンパク質成分も変化するため、目的に応じて培養条件を変えてもよい。真菌は、通常の培養条件では凝集したり菌塊を形成し不均一な細胞懸濁液になるものが多く、この場合、次工程で紬胞壁溶解酵素等を充分に作用させることができない。そこで、なるべく均一な細胞懸濁液を得るために、培養方法を工夫してもよい。例えば、ァスペルギルスフミガタスの場合、 0 . 5〜1 Mの N a C 1を培地に添加する等、塩濃度を高めることで解消される。また、真菌としては上記に記載の真菌が举げられる。

工程（2 )

工程（2 ) は、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る工程である。細胞壁の除去の程度は少なくとも浸透圧に感受性を示す程度であれば良いが、更にプロトブラストの形態になるまで細胞壁を除去するのが好ましい。よって、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞としては、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフエロブラストが好ましい。

細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得るには、例えば、真菌細胞に細胞壁溶解酵素を作用させたり、真菌細胞を物理的に処理することにより達成できる。また、細胞壁溶解酵素処理と物理的処理とは併用しても良い。

細胞壁溶解酵素としては種々のものが知られているカ、市販の製品としてはザィモリエ一ス（生化学工業社製）、リチカーゼ（シグマ社製）、ャタラーゼ（大関一宝酒造社製）、キチナーゼ（宝酒造社製）、トリコデルマライジングェンザィム（ノボ—シグマ社製）、カタツムリ腸管消化酵素 /3—グルクロニダ一ゼ（シグマ社製）、ラミナリアーゼ（シグマ社製）等がある。これらの酵素は、各種の細胞壁多糖（キチン、 /8 1. 3-グルカン、マンナン、ガラクトマンナン、キシログルカン等）の溶解酵素よりなり、さらにプロテアーゼも含有しているものが多い。

真菌細胞の細胞壁を溶解し、浸透圧に感受性の裸の細胞、例えばプロトプラストを調製するためには、まず、培養により得られた新鲜な細胞を洗浄後、 0. 8〜 1. 5Mのソルビトールやマンニトール、 N a C 1を含有する高張緩衝液中に懸濁する。これに必要量の細胞壁溶解酵素を、酵素に適した温度、緩衝液、 p Hでl 0 分間〜数時間作用させ、細胞壁を除去する。この際、プロテアーゼを作用させることにより細胞壁をよりきれいに除去することができる場合もある。真菌によつてはプロテアーゼを作用させる必要がない場合もあり、その際は PMSF、ぺブス夕チン等のプロテアーゼインヒビターを加えてもよい。

また、物理的処理方法としては、例えば 2 . 5 Mのショ糖溶液のような高張緩衝液中で目的菌体を懸濁することにより原形質分離を起こさせ、ナイフで細胞壁を切り取る方法がある。

工程（3 )

工程（3 ) は、工程（2 ) で得られる、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程である。細胞をバーストさせる方法として、例えば、超音波処理、フレンチブレスによる処理の他、浸透圧差を利用した低張液処理がある。低張液処理でバーストさせるには、まず細胞を高張液で充分洗浄した後、低張液、即ち生理食塩水またはイオン強度が低い緩衝液（例えば、カンジダアルビカンス¹ Π Μ 1768 の場合、生理食塩水 ) に懸濁することにより実施できる。使用される緩衝液としては、例えば、 p H 5〜8のリン酸緩衝液、クェン酸緩衝液等が挙げられる。細胞小器官をなるベく傷つけずに回収しょうとする場合、イオン強度を適当に選択すればよい。例えば、ミトコンドリアを菌体内と同様の機能を有する状態で調製しょうとする場合、例えば、 0 . 5〜0 . 6 Mのソルビトールゃ 0 . 2 5 Mのショ糖を含有する緩衝液中で超音波やヮーリングブレンダーゃフレンチプレス等で処理することにより、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した細胞をバ一ストさせ、ミトコンドリアを菌体内と同様の機能を有する状態のまま得ることができる。

工程（4 )

工程（4 ) は、不溶性画分を得る工程である。

工程（3 ) で得られる、バーストして得られる成分を、遠心分雜又はろ過することにより沈殿や残存物を得、このものを不溶性画分とする。バーストして得られる成分は必要に応じて超音波又はガラスビーズによりさらに細かく破砕してもよい。

不溶性画分を得るための遠心分離の条件としては特に限定されるものではない力く、好ましくは約 1 0 0 0 0 0 X g以下、より好ましくは 1 0 0 0 0 X g以下であり、遠心分離の時間は好ましくは 1 0分間〜 3時間である。

1 0 0 0 0 x g以下の遠心分離で沈殿として回収されるものとしては細胞膜及びミトコンドリア、核、ライソソーム、液泡等の細胞小器官がある。また、細胞膜夕ンパク質や細胞小器官膜タンパク質は、膜に結合した状態で沈殿として得ら

1 0 0 0 0 0 x gで 1時間程度遠心分離すると、リボソームも沈殿として回収される力、これも含有していてもよい。また、遠心分離の条件を変化させ、各々の細胞小器官をある程度分離することもできる、例えば、 1 0 0 O X g程度の遠心分離で核を分離することもできる。また、ショ糖等を用いた密度勾配遠心分離により上記の細胞小器官を分雠精製することもできる。ろ過により不溶性画分を回収したり、粒子の大きさによりある程度分別することも可能である。

このようにして得られる不溶性画分は、真菌細胞のプロトプラスト又はスフェロブラスト等の、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞から得られるものであるため、不溶性画分中に混入し得る細胞壁成分の量は少ないものである。例えば、本発明の不溶性画分中の細胞壁成分の量は、細胞壁成分を抗原とする、抗原抗体反応を利用することにより定鱼することができる。より具体的には、後述の実施例で示すように例えば真菌細胞として力ンジダアルビカンス TIMM 1768 を用いる場合、抗カンジダ血淸である因子血清 No. l (ャトロン製）を用いて不溶性画分中の血清型 Aマンナンを定量することができる。このようにして測定される血淸型 Aマンナンの量は、検出限界値（0. 5m g/raL) 以下であるのが好ましい。

上記のようにして得られる不溶性面分は、エタノール、イソプロパノール、フェノール、ァセトニトリル等の有機溶媒による洗浄及び殺菌処理、または加熱処理による殺菌処理をすることもできる。

本発明における不溶性画分は、上記のようにして得ることができる。また、本発明においては、かかる不溶性画分を分別抽出して得られる可溶化画分も真菌抗原である。可溶化画分は、例えば以下のような工程を含む製造方法により得ることができる。

( 1 ) 真菌の生細胞を得る工程、

(2)細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌紬胞を得る工程、

(3)細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、

(4)不溶性画分を得る工程、

(5)不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程。

本発明においては、さらに所望により工程（6) として可溶化画分は、目的に応じ通常の分離精製手段により分離精製してもよい。

上記の工程のうち、工程（1)〜工程（4) は、不溶性面分の製造方法と同じである。但し、本製造工程で使用する不溶性面分中の細胞壁成分は、臨床的に使用できる程度まで除去されていることが好ましいが、必ずしも不溶性画分そのものを真菌抗原として用いる場合の除去の程度と同等である必要はない。というのは、真菌細胞の細胞壁にはグルカン、キチン等が多く含まれており、これらの中には、例えば、界面活性剤により可溶化されない成分もあり、これらの成分は次の可溶化画分を得る工程で除去することができるからである。以下、工程（5) および工程（6) について説明する。

工程（5)

工程（5) は、不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程である。分別抽出には一般に使用される可溶化方法を用いることができる。可溶化剤としては、例えば、 NaC l、 KC 1等の塩、 EDTA等のキレート剤、ブ夕ノール等の有機溶媒や、尿素等のタンパク質変性剤を溶解した緩衝液等を用いることができるが、可溶化成分の安定性、及び抽出効率の面から界面活性剤を含有した緩衝液を用いることが好ましい。また充分な抽出効果が得られない場合、上記の有機溶媒やタンパク質変性剤を併用しても良い。一般的には、工程（4) にて得られる不溶性画分を、適当な界面活性剤等の可溶化剤を含有する緩衝液で一定時間懸濁後、遠心分雠処理や濂過により不溶性成分を除去することにより可溶化画分を得ることができる。したがって、本明細害において可溶化画分には、不溶性画分に付随する水溶性成分、例えば細胞小器官内水溶性成分等、及び Z又は可溶化処理にて可溶化される成分、例えば細胞膜タンパク質、脂質等が含有される。また、臨床的に使用可能な界面活性剤を使用すれば、かかる界面活性剤を除去することなく、該可溶化画分をそのまま真菌抗原として用いることができる。

本発明で使用する不溶性画分に含まれる膜タンパク質等の可溶化に用いる界面活性剤としては、ォクチルチオグルコシド、 Lubrol PX. Triton X-100,Nonidet P -40等が好ましい。また臨床的に使用可能な界面活性剤としてはイオン性（陰ィオン性、陽イオン性、両性）界面活性剤（例えばアルキルスルホネート、塩化べンザルコニゥム等）及び非イオン性界面活性剤（例えばボリォキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシェチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル類、ボリォキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ボリエチレングリコール脂肪酸エステル類、ボリォキシエチレンアルキルフェニルエーテル類等）が含まれる。本発明で使用する界面活性剤としては、非ィオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、例えば N I KKOL HC0— 40、 HC0— 50、 HC0- 60 (日光ケミカルズ社製）、ュニオックス HC— 4 0、 HC- 50、 HC- 6 0 (日本油脂社製）などが挙げられる。

ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類としては、例えば N I KKO L GO - 430、 GO - 440、 GO— 460、 GL - 1、 A t 1 o X 1 0 45 A、 1 1 96、 G— 1045、 G— 1441 (花王アトラス社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル類としては、 TWEE N 20, TWEEN 40、 TWEEN 60, TWEEN 80、 EMAS OL 1 1 30 EMASOL 31 30. N I KKOL TL一 1 0 1 0、 T P- 1 0、 TS— 1 0などが挙げられる。ボリォキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類としては、例えば N I KKOL TMGS- 1 5、 TMGS— 5などが挙げられる。ボリエチレングリコール脂肪酸エステル類としては、例えば NI KKOL MYL- 1 1 0、 MYS- 1 0などが挙げられる。ポリオキシェチレンアルキルフヱニルエーテル類としては、 N I KKOL NP— 1 0、 EMUL GEN 8 1 0などが挙げられる。

なお、抗原性維持等の面で、可溶性成分に対し最適な種類の界面活性剤及び瘼度を選択するのは当然である。一股に、界面活性剤の濃度は、界面活性剤を水性溶媒に溶解したときにミセルを形成する濃度、即ち、臨界ミセル濃度（以下、 C MCと略記する）以上であれば有効である。さらに CMC以上または CMCの 1 0倍までの濃度で好適に用いられ、特に CMCから CMCの 5倍までの濃度で可溶化を実施すると好適に作用する。緩街液としては、リン酸緩衝液、トリス一塩酸緩衝液が挙げられる。

可溶化は、通常約 4 Cの低温で 1時間〜一晩放置または撹拌することにより行われる。この際、プロテア一ゼインヒビタ一を添加してもよい。可溶性化画分は、例えば、可溶化処理液を約 1 00000 X gで 1時間程度の遠心分離処理した上清、又は據過処理による據液として得られる。また該上清や該濂液を可溶化剤を含まなレ、緩衝液や臨床的に使用可能な界面活性剤を含有する緩衝液に対して透析することにより、可溶化に用いた可溶化剤を除去することもできる。可溶性化画分は、エタノール、イソプロパノール、フエノール、ァセトニトリル等の有機溶媒による洗浄及び殺菌処理、または加熱処理による殺菌処理をすることもできる。また、可溶化画分を、可溶化剤を含まない緩衝液に対して透析した場合、脂質を始めとする疎水性成分の一部は沈澱として得られる。本明細書においては、かかる沈澱成分及び溶液成分のレ、ずれも可溶化画分の範瞜である。

さらに、本発明においては、工程（6 ) として所望により可溶化画分は、目的に応じ通常の分雜精製手段、例えば、含有成分の親和性、荷電状態、分子量、疎水性等の違いによる分雠精製手段を用い、さらに精製しても良い。例えば、糖群特異的吸着体を用い、糖タンパク質に含有される糖残基の違いで分画して精製することができる。糖群特異的吸着体としては、例えば、 ConA固定化体が挙げられる。特に、 ConA結合性糖残基（C一 3、 C一 4、 C— 6のヒドロキシル基が未置換の、ひ— D—グルコース残基及びひ一 D—マンノース残基）を有する成分、例えば、真菌に多い ConA結合性マンノース残基に富む糖タンパク質等の分離には、 ConA結合樹脂が好適に使用される。精製には、目的に応じた緩衝液を用いることが望ましく、界面活性剤、有機溶媒等を添加しても良い。更に、イオン交換樹脂、ゲル滤過担体を用い精製度を上げても良い。

また、本発明においては、前記のような本発明の真菌抗原をコードする核酸を用いて一股的な遺伝子工学的手法により容易に本発明の真菌抗原を製造することができる。

4 . 生物学的製剤について

本発明の生物学的製剤は、上記に記載の真菌抗原を有効成分として含有するものである。生物学的製剤とは、ワクチン又はこれに類似する製剤であって、感染性疾病の病原微生物に由来して、疾病又は障害の診断、予防若しくは治療に使用される製剤であり、本発明においては真菌を原材料とする。その他、本発明の抗原を利用して得られる治療血清等も含む。なかでも、多種類の真菌タンパク質を含有している本発明の真菌抗原は、脊椎動物に獲得自動免疫を誘導しうるものであり、特にワクチン組成物として好適に使用できる。即ち、本発明の、脊椎動物の真菌感染症に対し感染防御又は治療効果を有するヮクチン組成物は、上記の真菌抗原を有効成分として含有するものである。本発明の生物学的製剤やワクチン組成物の有効成分として含有される真菌抗原は、例えば上記の製造方法により得ることができる。なお、本明細害において、ワクチン組成物を単にワクチンという場合がある。

本発明の真菌抗原をワクチン組成物として使用する際には、より強い体液性及び zまたは細胞性免疫を得るために、該真菌抗原を下記のようなアジュバントを含む懸濁液又は溶液として製剤化し投与することが好ましい。アジュバントは普通、抗原と共に投与されるが、抗原投与の前または後に与えてもよい。哺乳類のワクチン接種に適当なアジュバントとしては、フロイント（Freund' s) の完全または不完全アジュバント；水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル；リゾレシチン、ジメチルォク夕デシルアンモニゥムブロミド、リゾレシチン等の界面活性剤；硫酸デキストラン、ボリ 1C等のポリア二オン；ムラミルジペプチド、タフトシン等のペプチド； Ribi社製のモノフォスフオリルリピド A ( P L ) ； CytRx 社製の Ti terMax ; コレラトキシンの Bサブュニットがあるが、これらには限定されない。抗原はまたリボソームまたは他のマイクロキヤリア一に取り込ませて投与することができる。当然、いくつかの異なる真菌の抗原を混合して用いることも可能である。それによつて、複数の真菌感染症に対する防御免疫を誘導することもできる。本発明のワクチン組成物は、フルコナブール、アンホテリシン B等の抗真菌剤や 3—ラクタム系抗生物質を始めとする各種の抗細菌性抗菌剤と併用してもよい。特に、抗真菌剤とは相加的又は相乗的に働き有効性を発揮する。

脊椎動物は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ヒト及びヒト以外の哺乳類であり、これらは抗原と反応して抗体を産生する。その結果、全脊椎動物がワクチン類と反応することができる。ワクチンは一般にヒトまたは家畜動物などの哺乳類に適用するが、上記の性質を有すれば、例えば魚類などの営利目的に飼育された脊椎動物も本発明の対象に含まれる。

投与方法としては、経口、経粘膜（真、膣等）、経皮（皮下または皮内）的に、または静脈内に投与すればよい。代表的な初回投与量は、タンパク質量として

0 . 0 0 l〜5 m g Z k g体重であるが、必要とする予防又は治療の程度に応じて、投与量を增加したり、投与回数を増大させればよい。

本発明の真菌抗原である、不溶性画分又はそれに由来する可溶化画分を投与すると、強い細胞性免疫及び Z又は体液性免疫を誘導することができ、これにより真菌感染を防御又は治療することができる。防御又は治療の対象となる真菌のみならず、他の真菌に対しても不十分であるが防御効果、治療効果を誘導することができる。これは、真菌相互の抗原の共通性、及び/又は免疫系が活性化されることにより、スーパーォキサイドア二オンや、一酸化窒素、各種サイトカインが遊離され、これらが幅広い抗微生物活性を有しているからと考えられる。

また、本発明は、 1 ) 上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有する医薬組成物、 2 ) 上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有するヮクチン組成物、 3 ) 該ワクチン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法、及び 4 ) ワクチン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりワクチン組成物の製造に使用した真菌及び Z又はその近縁菌の増殖を抑制し、該真菌に起因する疾病を予防または治療する、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法、を提供する。

本発明の真菌抗原は生物学的製剤として、上記ワクチン組成物のほか、サイトカイン放出剤、アレルギー性疾患の減感作治療等に使用可能なアレルゲン組成物として用いることができる。さらに、皮膚反応による感染の経験の有無、スクラツチテストによるアレルギー性疾患、等の診断を行う為の生体内診断及び/又は実験室診断に用いることができる。実験室診断に用いる製剤には、例えばマイクロタイタ一試薬、ラテックス凝集試薬、免疫比濁試薬、酵素免疫試薬等の免疫学的診断薬も含む。

本発明のサイト力イン放出剤を、個体に対し使用する際には、凍結乾燥粉末若しくは適当な塩溶液や懸濁液、又は上記アジュバントを含む懸濁液又は溶液の形で用いることが出来る。また該サイトカイン放出剤は放出されたサイトカインが有効である疾患の治療剤として用いることも出来る。例えば、放出されたサイト力インが I F N— 7である場合、該サイト力イン放出剤は痛や細菌感染症、ァレルギ一の治療剤として用いることが出来る。

投与方法としては、経皮（皮下又は皮内）、肺吸入、経粘膜（募、眼、膣など ) 、経口、舌下、又は静脈内に投与すればよい。例えば、癌の治療を目的とした場合、代表的な投与量は、ヒトの場合 0 . 0 2 // g〜l m gZk gZ回であるが、対象となる疾患及び目的に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。

本発明のァレルゲン組成物をァレルギー性疾患の予防や治療の目的で患者に投与する際には、適当な塩溶液や懸濁液の形で用いることができ、ボリエチレングリコールやフエノールを添加してもよい。更に上記のような、哺乳類のワクチン製剤化に使用されるアジュバントを含む懸濁液又は溶液として投与することもできる。アジュバントは、普通、抗原と共に投与されるが、抗原投与の前または後に与えてもよい。抗原はまたリボソームまたは他のマイクロキヤリア一に取り込ませて投与することができる。当然、不溶性画分又はその可溶化面分、更にいくつかの異なる真菌の同様の面分と混合して用いることもでき、また市販の真菌ァレルゲンエキス、ハウスダスト、スギなどの各種アレルゲンエキス、及び Z又は精製アレルゲンと混合して用いることも可能である。それによつて、複数のァレルゲンに感受性のアレルギー性患者に、複数のアレルゲンに対する減感作免疫を誘導することができる。投与方法としては、経皮（皮下または皮内）、肺吸入、経粘膜（暴、眼、膣等 ) 、経口、舌下、又は静脈内に投与すればよい。代表的な投与量は、治療を目的とする場合、投与ルートにより異なり、例えば 0 . 2 n g〜0 . l m g/k g/ 回であるが、必要とする予防や治療の程度に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。

また、本発明は、 1 ) 上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対するァレルギ一性疾患を予防し又は治療効果を有するアレルゲン組成物、 2 ) アレルゲン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法、及び 3 ) アレルゲン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりアレルゲン組成物の製造に使用した真菌及び又はその近縁菌に起因するアレルギー性疾患を予防または治療する、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法を提供する。

本発明の真菌抗原を、生体内診断の目的で個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、麻や眼の粘膜試験で使用する際は、凍結乾燥粉末、若くは適当な塩溶液や懸濁液の形で用いることができ、ボリエチレングリコールゃフヱノールを添加してもよい。パッチテストには、白色ワセリンを基剤としてラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を添加したものに上記抗原成分を溶解したものを使用することができる。

また本発明の真菌抗原は、実験室診断、例えば、抗原抗体反応である凝集反応、沈降反応、中和反応、標識抗体法等を用いた診断法、ヒスタミン遊離試験、リンパ球幼若化試験、白血球遊走阻止試験等にも使用することができる。例えば、【gE抗体価測定用の抗原として使用する際には、ペーパーディスク、セルローススポンジ、マイクロブレート等の固相体に上記抗原成分を固定化して使用することができる。

また、本発明は、 1 ) 上記に記載の真菌抗原、又は上記に記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徵とする、真菌による疾患の診断用組成物

、 2) 該組成物を使用することを含む、真菌による脊椎動物の疾患の診断方法、を提供する。

本発明の対象となる脊椎動物は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ヒト及びヒト以外の哺乳類であり、これらは抗原と反応して抗体を産生する。その結果、全脊椎動物が抗原と反応することができる。本発明の真菌抗原は、一般にヒトまたは家畜動物などの哺乳類に適用するが、上記の性質を有すれば、例えば魚類などの営利目的に飼育された脊椎動物も本発明の対象に含まれる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例 1 (カンジダアルビカンス紬胞の細胞分面および不溶性画分の調製）

1 ) プロトブラスト細胞の調製：カンジダアルビカンス TIMM 1768 のサブ口一寒天斜面培養物の一白金耳分を YPD培地（yeast extract 1重量、ボリべブトン 2重量、グルコース 2重量）を入れた試験管に植菌した。 30^eCで 24時間振とう培養後、培養液の一部を、三角フラスコに入れた YPD培地に植菌し、 35てで一晩振とう培養した。得られた培養液から、 2,000 xg、 10分間の遠心分雜処理により細胞を集めた。なお、得られた細胞は酵母型であった。細胞を滅菌水で 1回洗浄後、 SSB溶液（0.8 M ソルビトール入り 50 mM リン酸緩衝液 pH 7 .5) で 1回洗浄した。細胞を再度適当量の S SB溶液に懸濁後、該 S SB溶液の 1 8容量の 1 0 OmM £0丁八含有338溶液、及び適当量の 2—メルカブトエタノールを加え、緩やかに振とうした。統いて、この懸溷液に、終濃度 0,3 mg/mLとなるようにザィモリエース 20T (生化学工業社製）を加え、 35。Cで 1時間緩やかに振とうした。さらに、終濃度 lmg/mL となるようにトリコデルマ 'ライジングェンザィム（シグマ社製）を加え、 35でで 1時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液を 2，000 xg、 10分間の遠心分離処理に付し、プロトプラスト紬胞を集めた。この細胞を S S B溶液で十分に洗浄し、紬胞分面に供した。

2 ) プロトプラスト細胞からの钿胞分画および抗原液の調製：上記の様にして得られたプロトプラスト細胞に、約 4 X 1 0 ⁹ cel l/m Lとなるよう滅菌生理食塩水を加え、十分携拌した後、氷上に 10分間静置した。プロトプラスト細胞がバ一ストしたことを確認後、 10, 000 x g、 30分間遠心し、得られた沈殿を不溶性画分（以下、 Ca-LSPという）とした。遠心上淸をさらに 100, 000 X g、 60分間遠心し、得られた沈殿をリボソーム画分（以下、 HSP という）、そして遠心上淸を可溶性画分（以下、 HSS という。この面分に HSP90 およびエノラ一ゼが含まれていた）とした。 Ca-LSPを再度生理食塩水に懸溷後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、 5分間処理し殺菌することにより、膜タンパク質等を含有する LSP抗原液を調製した。 HSP についても、適当なタンパク質濃度になるように生理食塩水に懸濁し、抗原液とした。 HSS についてもタンパク質濃度を測定し、適当量を抗原として使用した。 2 Lの培養液より得られた細胞を上記のように処理して得られた Ca -LSP抗原液のタンパク質濃度は 2. 3 mg/mL であった（タンパク質量は BSA を標準としてビシンコニン酸（BCA ) 試薬により定量した）。

3 ) 真菌細胞の細胞壁除去の程度の確認：細胞壁の除去の程度は、顕微鏡下の細胞形態観察、細胞を生理食塩水中でバーストさせた後の生菌数、及び血清因子を用いた凝集反応の阻害による相対的定量法により確認した。例えば、カンジダアルビカンス、ァスペルギルスフミガタスの細胞の場合、上記の方法により細胞壁が除去されると、顕著な形態の変化を起こした（第 1図、第 2図）。また、上記の方法で作製したプロトプラスト紬胞を生理食塩水中でバーストさせたところ、含有される生菌の比率は 1 %未満であった。また、作製した Ca-LSP抗原液を 100 l とり、 YPD寒天培地上に広げ、 30^eCで 4日間培養したが、カンジダアルビカンス細胞のコロニーの出現は見られず、 Ca-し SP抗原液には生菌は存在しなかった。 HSP抗原液、 HSS抗原液からもコロニーの出現は見られなかった。

—方、抗カンジダ血淸である因子血清 No. 1 (ャトロン製）はカンジダアルビカンス TIMM 1768 (血淸型 A) を凝集させるが、この凝集に対する阻害活性を指標に、不溶性画分に含有される細胞壁成分の残存量を、構成成分である钿胞壁マンナンの量として定量した。細胞壁マンナン含量の比較対照として、市販のカンジダアレルゲンエキスであるアレルゲンスクラッチエキス「トリイ」カンジダ（鳥居薬品社製）を用いた。

陽性コントロールとして、小林らの方法 [Kobayashi, H. et aし Arch. Bioch era. Biophys. Vol.272, 364-375, (1989) ]により、カンジダアルビカンス J - 1 0 1 2株（血淸型 A) より精製した血淸型 Aマンナンの各種濃度の溶液を用いた。その結果、市販のカンジダアレルゲンエキス（タンパク質濃度約 0. 4 mg/ml ) 中には、 4. 5 rag/ml の血清型 Aカンジダアルビカンス細胞壁マンナン（以下、「血清型 Aマンナン」と略す。）が含有されていたが、 Ca- LSP (タンパク質濃度約 2. 3 mg/mL ) では凝集阻害は起こらず、本発明の抗原成分中の血淸型 Aマンナンの含有量は、本法による検出限界値の 0. 5mg/raL以下であることが明らかとなつた。即ち、本発明の真菌抗原は、タンパク質量が多く、細胞壁マンナン量は前記の方法では検出限界値以下であることから従来のアレルゲンエキスと明らかに異なることが示された。

得られた Ca-LSP抗原液について中性糖、脂質、核酸含量を測定すると共に、一部をとり凍結乾燥後抨量した。その結果、上記の例の Ca-LSP抗原液 10m Lには、凍結乾燥残さとして約 130 nig (タンパク質 23 Dig、中性糖 2 n 、脂質 8 oig 、 NaCl 計算値 90 mg、その他として核酸、水分が少量）が含まれていた。実施例 2 (ァスベルギルスフミガタス不溶性画分の調製）

1 ) ァスペルギルスフミガタス不溶性画分（Af-LSP) の調製一 1 ：ァスペルギルスフミガタス TIMM 1776 のサブローデキストロース寒天斜面培養物に 0. 1 重量％ツイ一ン 80を含む生理食塩水を加え胞子懸灞液を作製した。この懸濁液の一部を、三角フラスコに入れたポテトデキストロース培地（ディフコ社製）に植菌し、 30°Cで一晚振とう培養した。得られた培養液をガラスフィルターでろ過し菌体を集めた。菌体を 0.8 NaClを含む 10 mM リン酸緩衝液（pH6.0 ) に懸濁後、終濃度 10 mg/mLとなるようにャタラーゼ（宝酒造社製）を加え、 30^eCで 4 時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液をガラスフィルタ一でろ過し、ブロトブラスト細胞を集めた。

この細胞を 0. 8M Na C 1で 2回洗浄後、得られたプロトプラスト細胞に 1 xiO⁸ cell/mL となるよう滅菌生理食塩水を加え、バーストさせた。 10.000X g、 30分間の遠心により、不溶性画分を回収した。この不溶性画分を再度生理食塩水に懸 ¾後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、 5分間処理し滅菌し、ァスペルギルスフミガタス不溶性画分 Af- LSP抗原液 1 (タンパク質濃度約 0.9 mg/mL) とした。

2) ァスペルギルスフミガタス不溶性画分（Af-LSP) の調製一 2 ：上記の 1 ) と同様にして作製した胞子懸濁液の一部を、三角フラスコに入れた 0. 8M Na C 1を含むポテトデキストロース培地（ディフコ社製）に植菌し、 30てで一晚振とう培養した。培養液の濁度は 1 ) と同等であった。得られた培養液をガラスフィルターでろ過し菌体を集めた。菌体を 0.8 M NaClを含む 10 οιΜ りん酸緩衝液（PH6.0 ) に懸濁後、ャ夕ラ一ゼ（終濃度 10 mg/mL) 、トリコデルマライジングェンザィム（終澳度 3mg/mL) 、及びザィモリエース 20 T (終澳度

1 mg/mL ) を加え、 30'Cで 2時間緩やかに振とうした。細胞懸濁液をガラスフィルターでろ過し、濂液よりプロトプラスト細胞を集め細胞数を計測したところ、

1 ) で得られた同一培養液量当たりプロトプラスト数の約 2倍であった。従って、本培養方法により、プロトプラスト細胞収率が上がることが明らかとなった。この細胞を 0.8M NaCl で 2回洗浄後、得られたプロトプラスト細胞を、上記 1 ) と同様に処理し、ァスペルギルスフミガタス不溶性画分 Af-LSP抗原液 2とした実施例 3 (クリブトコッカスネオホルマンス不溶性面分（Crn-LSP ) の調製）クリプトコッカスネオホルマンス TIMM 0354 のサブローデキストロース寒天斜面培養物の一白金耳分を三角フラスコに入れた Y P D培地に植菌し、 30でで一晚振とう培養した。得られた培養液から遠心により細胞を集め、細胞を滅菌水で 1回洗浄後、 1 M ソルビトール、 100 mM EDTA 入り 100 m クェン酸緩衝液（pH 5 . 8) に懸濁し、終濃度 5 mg/mLとなるようにトリコデルマ ·ライジングェンザィムを加え、 37°Cで 1時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液を、 2, 000 x g、 10分間の遠心にかけ、プロトプラスト細胞を集めた。この細胞を上記の高張緩衝液で洗浄後、 1 x i0⁸ ceU/raLとなるよう滅菌生理食塩水を加え、プロトプラスト細胞を懸濁し、バーストさせた。 10, 000 x g、 30分間の遠心により、不溶性画分を回収した。この不溶性画分を再度生理食塩水に懸溷後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、 5分間処理し滅菌し、その後、 10. 000 x g、 30分間の遠心により、不溶性画分を回収した。この不溶性画分をクリプトコッカスネオホルマンス不溶性画分 Crn-LSP抗原液（タンパク質濃度 2. 9 mg/mL) とした。実施例 4 (カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSPからの可溶化画分の調製）実施例 1で得られた Ca-LSP抗原液（タンパク質濃度 2. 3 mg/mL ) 100 mLに、 10 0 mMォクチルチオグルコシドを含む 40 m ピストリス緩衝液（pH 6. 5) を 100 mL 加えた。 4 'Cで一晚搆拌後、 100, 000 x g、 1時間遠心し、上清として 50m ォクチルチオダルコシドによる可溶化画分（Ca-LSP- S) の溶液 200齓を得た（タンパク質膿度 0. 4 mg/mL ) 。この溶液のうち 100 mLを限外ろ過（分画分子量 10, 000) で濃縮後、りん酸緩衝生理食塩水に対して透析し、ォクチルチオグルコシドを除去した。さらにボアサイズ 0. 22 // mのメンブランフィルターでろ過し、界面活性剤を除去した可溶化画分（Ca-LSP-SD ) の溶液 20 mL (タンパク質濃度 1. 3 mg/m L ) を得た。実施例 5 (カンジダアルビカンス可溶化画分（Ca- LSP-S) の ConAカラムによる分画）

実施例 4で得られた、 Ca-LSP-Sの残り lOOmL を限外ろ過により澳縮（タンパク濃度 3mg/mL) 後、ォクチルグルコシドの終濃度が 20mMになるように、 1 . 5倍量の 20mMピストリス緩衝液（PH6.5 ) を加えた。得られた溶液に、終濃度が 0.25M になるように N a C lを、さらに、終囊度が lm になるように CaCl ₂ 及び MnCl ₂ を添加した。次に、このものを緩衝液 A (20m ピストリス、 20mMォクチルチオグルコシド、 0. 25M NaCK ImM CaCh、 ImM MnC (pH6. 5) ) で予め平衡化した Co nA sepharose4B (Pharmacia-LKB ) のカラムに供した。緩街液 Aで非吸着成分を洗浄し、得られた通過画分及び、洗浄画分を合わせ、 ConAカラム非吸着画分とした。次に、 0. 25Mのメチルー D—グルコースを含む緩衝液 Aにより ConAカラム吸着成分を溶出し、これを ConAカラム溶出面分とした。得られた ConAカラム非吸着画分、及び ConAカラム溶出画分を限外濾過（分画分子量 10000 ) で濃縮し得られた濃縮液をそれぞれ、 Ca- ConA-Pass及び Ca-ConA-Elute とした。実施例 6 (ワクチン製剤の調製）

1 ) 油中水系（不完全フロイントアジュバント）製剤の調製

上記の、不溶性画分である各種 LSP (Ca-LSP等）由来、 LSP 由来の界面活性剤除去可溶化面分 (Ca-LSP - SD 等）、及び ConAカラム溶出画分 (Ca-ConA-Elute ) の抗原液の必要量をとり、等容量の不完全フロイントアジュバント（以下、 IFA と略す）（ディフコ社製）と十分に混合し、油中水系のワクチン製剤とした。

2 ) ァラム製剤の調製

上記の、不溶性画分である上記の各種 LSP 、又は LSP 由来の界面活性剤除去可溶化画分（Ca-LSP-SD等）の抗原液の必要量をとり、攪拌しながら等量のァラム (ピアス社製）を滴下し、すべてを添加後、さらに 30分間擾拌し、ワクチン製剤とした。実施例 7 (カンジダアルビカンス由来の不溶性画分 Ca-LSPと、 HSP、 HSS 各抗原液のワクチン活性の比較および生菌ワクチンとの比較）

1 ) Ca-し SP、 HSP、 HSS 各抗原液のワクチン活性の比較：実施例 1で得られた Ca-LSP、 HSP、 HSS各抗原液を、タンパク質濃度として 400 u mLとなるように生理食塩水で希釈した。実施例 6に従い、希釈液に等量の I F Aを加えワクチン製剤とし、 C57BL/6 マウス（6週齢、雌、一群当たり 5匹）に一匹当たり 0. 1 raLずつ皮下接種により免疫した。また、抗原液の代わりに生理食塩水を用いた群を対照とした。一週間後、再度同量を皮下接種した。即ち、一匹当たりの投与量はいずれの抗原も 20/ g タンパク質 Z回となる。二回目の免疫の一週間後、全ての免疫マウスに、サブ口一 ·デキストロース液体培地で培養して得られたカンジダアルビカンス TIMM 1768钿胞を 2.5 x lO⁶ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 30日間生死を観察した。

結果を表 1に示す。不溶性画分の Ca-LSPはリボソーム画分（HSP ) や可溶性画分（HSS ) より強いワクチン活性を示した。

表 1

2 ) カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSPと生菌ワクチンとのワクチン活性の比較： Ca - LSPの投与量が 0.2 g タンパク質相当ノ回、 2 fi タンパク質相当/回、 20 g タンパク質相当ノ回となるように、 Ca-し SP抗原液の濃度を調製後、実施例 6に従いワクチン製剤とし、実施例 7— 1 ) と同様に C57BL/6 マウス（ 1群当たり 5匹）に一週間隔で 2回皮下接種により免疫した。また、カンジダアルビカンス ΠΜΜ 1768をサブロー，デキストロース培地でー晚振とう培養し、細胞を遠心で回収、生理食塩水で洗浄し、得られた細胞を 1 X 10⁶ 、 1 10⁷ 、 1 X 10⁸ 個 ZmLとなるように生理食塩水に懸濁した。各々の懸濁液に等量の IFA を加え混合後、マウスに一匹当たり 0. 1 齓ずつ皮下接種により免疫した。一週間後、上記と同様に調製した生菌カンジダ細胞を同量ずつ皮下接種した。即ち、一匹当たりの投与量は 5 10⁴ 、 5 X 10⁶ 、 5 X 10⁶ 個/回となる。対照として、生理食塩水と等量の IFA を混合したものを一週間隔で 2回皮下接種により投与した。二回目の免疫の一週間後、全ての免疫マウスに、サブ口一 'デキストロース培地で培養して得られたカンジダアルビカンス TIMM 1768細胞を 2. 5 10⁵ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 30日間生死を観察した。

結果を表 2に示す。 Ca-し SPは、投与量が 2 g タンパク質相当/回でも強い感染防御活性を示し、生菌免疫より優れた感染防御作用を示した。表 2

* ：〃 gタンパク質相当実施例 8 (カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSP由来の界面活性剤除去可溶化画分の感染防御活性）

実施例 4で調製した Ca-LSP由来の界面活性剤除去可溶化画分（Ca-LSP-SD ) の投与量が 20 g タンパク質相当 Z回となるように希釈後、実施例 6に従いワクチン製剤とし、実施例 7— 1 ) と同様に C57BL/6マウス（ 1群当たり 5匹）に 1週間隔で 2回皮下免疫した。対照として、カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca - L SPの IFA との製剤、及び生理食塩水と IFA との混合物で同様に免疫した。免疫後 1週目に、カンジダアルビカンス T1MM 1768細胞を 2.5 X 10⁶ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 30日間生死を観察した。結果は表 3のとおりである。し SP可溶化画分も不溶性画分である LSP と同等の感染防御活性を示した。表 3

実施例 9 (カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSP由来 Ca-ConA-Elute の感染防御活性）

実施例 5で得られた、 ConA結合性マンノース含有糖タンバク質含量の高い画分である Ca-ConA-Elute を、タンパク質濃度として 4 g /raLとなるように生理食塩水で希釈した。実施例 6に従い、希釈液に等量の I F Aを加えワクチン製剤とし、実施例 7— 1 ) と同様に C57BL/6 マウス（6週齢、雌、一群当たり 5匹）に投与し、カンジダアルビカンス¹ ΠΜ 1768感染に対する防御作用を確認した。結果を表 4に示す。 Ca-ConA-Elute は、投与量が 0 . タンパク質相当/回で充分な感染防御活性を示した。表 4

実施例 1 0 (各種マウスカンジダ症全身感染モデルでのカンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSPのワクチン作用）

1 ) ワクチン接種マウスの免疫低下状態での感染防御：実施例 1で調製した Ca - LSPの投与量が 20 g タンパク質相当/回となるように希釈後、実施例 6に従いワクチン製剤とし、実施例 7— 1 ) と同様に C57BL/6 マウス（ 1群当たり 5匹）に 1週間隔で 2回皮下免疫した。対照として、生理食塩水と IFA との混合物で同様に免疫した。 2回目の免疫後、 3日目に免疫マウスにサイクロフォスフアミドを 200 fflgZkg腹腔内に投与し、免疫抑制伏態にした。その 4日後に、カンジダァルビカンス TIMM 1768細胞を 5 X 10⁴ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 30日間生死を観察した。結果は表 5のとおりである。サイクロフォスフアミドにより免疫能を低下させても、 Ca-LSP免疫群では十分な感染防御作用を有していた。表 5

2 ) Ca-LSPのワクチン作用の持続：実施例 1で調製した Ca- LSPの投与量が 20〃 gタンパク質相当/回となるように希釈後、実施例 6に従レ、ワクチン製剤とし、実施例 7— 1 ) と同様に C57BL/6 マウス（ 1群当たり 5匹）に 1週間隔で 2回皮下免疫した。 2回目の免疫後、 3 4日目にカンジダアルビカンス TIMM 1768紬胞を 1 X 10⁵ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 12日目に屠殺、無菌的に両肾を摘出し、 6 m Lの生理食塩水を加え、ホモゲナイザーを用いてホモジヱネートを得た。これを生理食塩水で希釈後（X I, X 10. X 100 ) 、希釈液の 1 0 0 1をサブロー ·デキストロ一ス寒天培地上に広げ、 30でで 1日間培養し、出現するコロニー数を測定した。結果を表 6に示す。この結果より明らかなように、 Ca- LSP による免疫により、免疫後 34日目でも感染防御免疫は働いており、腎菌数は減少した。表 6

* ： 5匹それぞれの両腎ホモジヱネート（6 m L ) 中の菌数

* * ：屠殺前に死亡実施例 1 1 (カンジダアルビカンス TIMM 0239による感染）

実施例 1で調製した Ca-LSPの投与量が 20 u % タンパク質相当回となるように希釈後、実施例 6に従いワクチン製剤とし、実施例 7— 1 ) と同様に C57BL/6 マウス（ 1群当たり 5匹）に 1週間隔で 2回皮下免疫した。また、 Ca-LSPの代わりに生理食塩水を用いたものを対照とした。免疫後 1週間目に、免疫した抗原の由来するカンジダアルビカンス TIMM 1768と異なるカンジダアルビカンス T【MM 0239 細胞を 5 X 10⁶ 、 1 X 10⁶ 個ずつマウス（各群 5匹）に静脈内感染させた。感染後、 30日間生死を観察した。結果は表 7のとおりである。この結果より力ンジダアルビカンスの一菌株由来のし SP で免疫すれば、他のカンジダアルビ力ンス株に対しても感染防御免疫が誘導されることが明らかである。

感染細胞数投与群平均生存日数 30曰後生存数

(個）土標準偏差 /使用マウス数

生理食塩水 8.6±8.7 0/5

X

5 XIO⁶ Ca-LSP >30.0±0.0 5/5

1 χιο^β 生理食塩水 2.0±0.7 0/5

1 χιο« Ca-LSP >24.0±9.2 2/5

実施例 1 2 (カンジダアルビカンス生細胞で免疫されたマウスの Ca-し SPに対する特異的遅延型過敏症（DTH )反応）

実施例 7— 2) と同じ方法で 5 X10⁴、 5 X10⁵ 、 5 X10⁶ 個の生菌で C57BL/ 6マウス（各群 5匹）を 1週間隔で 2回皮下免疫した。また、 Ca-LSPの IFA との製剤を 0.2、 2、 20 zg タンパク質相当 Z回となるように C57BL/6マウス（各群 5匹）に 1週間隔で 2回皮下免疫した。免疫後 6日目に 200 %タンパク質相当 /mしの Ca- LSP抗原液を各マウスのフットパッド（foot pad) に皮下投与した。 24時間後にフットバッドの腫れを測定した。

結果を表 8に示す。この結果より、生菌で感作されたマウス個体内で、 Ca- LSP を抗原として認識する DTH反応が誘導されている、即ち感染防御免疫が成立しているマウス個体では、 Ca- LSPに対する細胞性免疫が成立していることが明らかとなった。また、 Ca-し SPで免疫したマウスにおいては Ca-LSPに対する強い紬胞性免疫が誘導されていた。表 8

* ： t gタンパク質相当実施例 1 3 (カンジダアルビカンス細胞で免疫されたマウスの脾臓リンパ球のカンジダアルビカンス Ca-し SPに対する特異的增殖）

実施例 7— 2) と同じ方法で 5 Χ10^β 個の生菌で免疫した BALB/cマウスより、最終免疫後 1 5日目に脾臓を取り出し、 RPMI-1640培地中でホモゲナイズし細胞懸濁液とした。これに RP!iU- 1640培地を加え洗浄遠心後、細胞を 10%牛胎児血清

(FCS ) 添加した RPMI-1640培地に再懸濁した。この細胞懸濁液をナイロンウールカラムに入れ、 37でで 1時間培養後、 10%FCS添加 RPMl-1640培地で溶出し、 T細胞リツチな画分を得た。遠心で細胞を集め、 10%添加 RPMI-1640培地に 1 x 10⁷ 個しとなるように懸濁した。適当に希釈した Ca-LSP抗原液を 100 1 ずつ 96ウェルマイク口プレートに分注後、細胞懸濁液を 100 u\ ずつ加え、 37^eC、 5 %C0₂ 条件下で培養、 2日後に、 ³H—チミジン（0.5 zCiZゥェル）を加えた。 1 8時間培養後、細胞を回収し、細胞への ³ H—チミジン取り込み量を測定した。

結果を表 9に示す。免疫マウス由来の脾紬胞は Ca-LSPに対して濃度依存的な増殖を示した < 表 9

* S ] = 〔Ca- LSP添加時の³ H-チミジン取込み量 (cpra) 〕 /

〔Ca-LSP無添加時の³ H-チミジン取込み量 (cpm) 〕

* * ： gタンパク質相当実施例 1 4 (カンジダアルビカンス生菌で免疫または感作された哺乳動物血中のカンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSP由来のタンパク質に対する抗体）

1 ) カンジダアルビカンス生菌で免疫されたマウス血中の Ca-LSP由来のタンパク質に対する抗体：実施例 7— 2 ) と同じ方法で 5 X 10⁶ 個の生菌で免疫した BALB/cマウスより抗カンジダ血清を調製した。次に、 Ca- LSPに SDS 電気泳動用サンプルバッファーを加え、沸騰水浴下 3分間処理後、遠心し、上清を 12. 5%SDS- PAGEにかけた。電気泳動後、 PVDF膜にブロッテイング、ブロックエースでー晚ブロッキング、その後、 50倍希釈抗血清を反応させ、そして、二次抗体としてラット抗マウス IgG 抗体を用いて抗原性タンパク質を検出したところ、第 3図（レーン 1 ) に示すように、免疫され、感染防御免疫が成立しているマウス血清中には、 Ca-LSPに含まれるいくつかのタンパク質に対する IgG 抗体が誘導されていることが明らかとなった。なお、分子量 6 5 , 0 0 0付近に検出されるタンパク質は、実施例 1 5に示すタンパク質である。 2 ) ゥサギの抗カンジダ血清に含まれる Ca-LSPに対する抗体：市販のゥサギ抗カンジダ血淸（大日本製薬より購入）を一次抗体として、また、ャギ抗ゥサギ I g G抗体を二次抗体として用いて、実施例 1 4 - 1 ) と同様に Ca-LSPに含まれるタンパク質を SDS-PAGEで分雠、 PVDF膜にブロッテイング、ゥヱスタンプロッティング法により抗原性タンパク質を検出したところ、第 3図（レーン 2 ) に示すように、ゥサギ抗カンジダ血淸中には、 Ca-LSPに含まれるいくつかのタンパク質に対する抗体が誘導されていることが明らかとなった。即ち、ゥサギにおいても、 Ca-LSPに含まれる成分が抗原として作用することが明らかとなった。 65kD付近に検出されるタンパク質は、上記と同様に実施例 1 5に示すタンパク質である。

3 ) ヒト血中の Ca-LSPに対する抗体：カンジダアルビカンスはヒトの常在菌であり、殆どのヒトがカンジダアルビカンス細胞に感作されていることが知られている。そこで、健常人血中に Ca-LSP由来のタンパク質に対する抗体が存在するか否かを調べるために、健常ヒト血清を一次抗体として、ャギ抗ヒト I g G抗体を二次抗体として用い、実施例 1 4一 1 ) と同様に Ca-LSP由来のタンパク質についてゥヱスタンプロッティング法により抗原性タンパク質を検出した。その結果、第 3図（レーン 3 ) に示すように、健常ヒト血淸中には、 Ca-LSPに含まれるいくつかのタンパク質に対する I g G抗体が検出され、ヒトにおいても、 Ca-LSP に含有されるタンパク質は抗原として作用することが明らかとなった。実施例 1 5 (カンジダアルビカンス可溶化画分（Ca-LSP-S) からの抗原性タパク質の精製）

1 ) タンパク質の単離：実施例 5で得られた Ca-ConA-Passを、予め緩衝液 B ( 20mMビストリス、 20m ォクチルチオグルコシド、 Ira CaC 、 lmM MnC (pH6. 5 ) ) で平衡化させた MonoQ カラム（Pharmacia-LKB 社製）に供し、緩衝液 Bによる洗浄後、 0— 0 . 8 M N a C 1の直線勾配をもつ緩衝液 Bによる溶出を行つた。得られた面分について実施例 1 4一 1 ) と同一条件でィ厶ノブロッティングを行い、いくつかのマウス抗カンジダ血清に対して陽性を示す夕ンパク質を含む画分を集め、緩衝液 Bによる透析を行った。

得られた透析液を、緩衝液 Bで予め平衡化させたハイドロキシアパタイト（三井東圧社製）に供し、緩衝液 Bによる洗浄後、 0— 0. 5M Na C lの直線勾配をもつ緩衝液 Bによる溶出を行った。溶出画分について、再度実施例 1 4一 1 ) と同一条件でィムノブ□ッティングを行い、マウス抗カンジダ血清と強く反応する分子量（SDS— PAGE、還元条件下）約 6 5, 0 0 0のタンパク質、及び抗カンジダ血清と弱く反応する分子量（SDS— PAGE、還元条件下）約 2 5, 0 0 0のタンパク質を単離した。

得られた 2種のタンパク質の N末端アミノ酸配列を、 L一 5 0 0型高速アミノ酸分析計（日立製作所社製）を用い決定したところ、各々配列表の配列番号： 1 及び配列表の配列番号： 2に示すアミノ酸配列を有すると予想された。得られたァミノ酸配列情報について、既知タンパク質とホモロジ一検索を行ったところ、分子量（SDS— PAGE、還元条件下）約 6 5, 0 0 0のタンパク質はサッカロマイセスセレピシェのミトコンドリア局在ジヒドロリポアミドデヒドロゲナ —ゼ（DLDH) と、分子量（SDS - PAGE、還元条件下）約 25, 0 0 0 のタンパク質はサッカロマイセスセレピシェのミトコンドリア局在ス一バーオキサイドデスム夕一ゼ（SOD) とホモロジ一を有し、何れもミトコンドリア由来のタンパク質であると推定された。

また、一方、 Ca-ConA-Passの MonoQ カラムによる分画により得られた画分について、実施例 1 3と同様の方法で免疫マウス脾臓リンパ球に対する増殖誘導活性を測定すると共に、 SDS— PAGEによるタンパク質の分雜及び銀染色による分析を行った。 Ca-ConA-Passの MonoQ カラムによる分画における 0. 1 2M N a C 1付近に溶出された面分を集め、再度 MonoQ カラムにかけ、 0— 0. 2 4M

Na C 1の直線膿度勾配を持つ緩衝液 Bにより溶出を行った。得られた溶出画分から分子量（SDS— PAGE、還元条件下）約 30 0 0 0のタンパク質を単離することができた。

同様に、 Ca-ConA-Passの MonoQ カラムによる分画により、 0. 64M NaC 1付近に溶出された面分についても、再度 MonoQ カラムにかけ、 0. 24— 0. 8 Na C 1の直線濃度勾配を持つ緩衝液 Bにより溶出を行った。得られた溶出画分から分子量（SDS— PAGE、還元条件下）約 62, 000のタンパク質を単離することができた。これらのタンパク質は、実施例 1 4一 1 ) 記載のマウス抗カンジダ血清との反応性は非常に低いが、実施例 1 3と同様の方法で調製した生菌免疫マウス脾臓リンバ球に対しては、最終タンパク質濃度 5 /gZmL で明らかな ³H—チミジンの取込みを促進し、増殖誘導活性を有することが明らかとなつた。

得られた 2種のタンパク質の N末端アミノ酸配列を、 L一 500型高速アミノ酸分析計（日立製作所社製）を用い決定したところ、各々配列表の配列番号： 3 及び配列表の配列番号： 4に示すアミノ酸配列を有すると予想された。得られたァミノ酸配列情報について、既知タンパク質とホモロジ一検索を行ったところ、分子量約 30, 00 0のタンパク質はサッカロマイセスセレピシェのシトレ一トシン夕一ゼ（citrate synthase)と、分子量約 62, 000のタンパク質はサッカロマイセスセレピシェの液胞型ァミノぺプチダーゼ I (vacuolar aminopepti dase I) とホモロジ一を有することが分かった。

2) 単離したタンパク質の抗原性試験：実施例 1 3と同様の方法により、上記単離された 4種のタンパク質（分子量約 65, 000のタンパク質、分子量約 2 5, 000のタンパク質、分子量約 30000のタンパク質及び分子量約 62, 0 00のタンパク質）について生菌免疫マウス由来の脾接リンパ球細胞への ³H 一チミジン取り込み量を測定した。その結果、 1アツセィ当たり 5 ig/mlのタンパク質量で、何れのタンパク質も増 ¾誘導活性を示した。

更に、実施例 1 2と同様の方法により、生菌免疫マウスのフットバッドに皮下投与し DTH反応を誘導するか試験した。上記 4種の抗原性タンパク質について試験を行った結果、 5 g/回の投与で何れのタンパク質も有意にフットパッドの腫れを検出した。

以上の結果より、単離された 4種のタンパク質は、何れも感染防御免疫の成立した個体に認識されるタンパク質であることが明らかとなった。実施例 1 6 (カンジダアルビカンス不溶性分画 Ca-LSPで免疫されたマウス由来の脾細胞の移入による感染防御能の獲得）

実施例 7— 1 ) と同様に Ca-LSPの IFA との製剤を BALB/cマウス（ 1群 5匹）に 0. 1 raLずつ 1週間隔で 2回皮下免疫した。投与量は 20 g タンパク質相当ノ回である。対照として、生理食塩水と IFA との混合物で同様に免疫した。 2回目の免疫後 1週目に、 5匹の免疫したマウスより脾臓を摘出し、 RPMI-1640培地中でホモゲナイズし細胞懸濁液（約 8 X 10⁷ 個 Z0.5 DiL) とし、この 0. 5 mLを B. -17 I scidマウス（各群 5匹）に移入した。 1日後、カンジダアルビカンス TIMM 1768細胞を各マウスに 5 X 10⁴ 個ずつ静脈内感染させた。さらに対照として、正常な（脾臓細胞を移入していない） C. B. -17/ scid マウス（5匹）に同数のカンジダアルビカンス TIMM 1768細胞を静脈内感染させた。感染後、 5日目に屠殺、無菌的に両腎を摘出し、 6 mLの生理食塩水を加えてホモゲナイズし、ホモジネートを得た。これを生理食塩水で希釈後（X I, X 10, X 100 ) 、希釈液の 100 をサブロー ·デキストロース寒天培地上に広げ、 30^eCで 1 日間培養し、出現するコロニー数を測定した。結果を表 1 0に示した。

表 1 0

* ： 5匹それぞれの両腎ホモジェネート（6mL) 中の菌数

Ca-LSP免疫マゥス由来の脾紬胞を移入することにより、正常のマゥスに比べ有意に（p < 0. 0 5) g菌数は減少した。即ち、 Ca-LSPにより免疫されたマウスの脾細胞による養子免疫が可能であることが明らかとなつた。実施例 1 7 (ァスペルギルスフミガタス不溶性画分 Af-LSPのワクチン活性）実施例 2— 1 ) で調製した M-LSP抗原液 1を用い、実施例 6に従いワクチン製剤を調製し、 C57BL/6 マウスに 2 、 20 tg タンパク質相当 Z回、 1週間隔で 2回皮下免疫した。対照として、生理食塩水と IFA との混合物で同様に免疫した。免疫後、 8日目にァスペルギルスフミガ夕ス TIMM 1776 の胞子を 2 X10⁶ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 3 0日間生死を観察した。

結果は表 1 1のとおりである。 20 / gタンパク質相当 Z回、 2回の投与で明らかな感染防御効果が見られ、 2 gタンパク質相当/回でも有意な延命が見られた。即ち、 Af-LSPもワクチンとして有用である可能性が示された。表 1 1

* ： gタンパク質相当実施例 1 8 (ァスペルギルスフミガタス生細胞を投与したマウス血中のァスぺルギルスフミガタス不溶性画分 Af-LSP由来のタンパク質に対する抗体）

ァスペルギルスフミガタス TIMM 1776の胞子懸濁液（1 x lO⁸ 個 ZfflL) を等量の完全フロイントアジュバントと混合し、この 0. 1 mLを 1週間隔で 2回 BALB/c マウスに皮下免疫した。免疫後、 1週間目に採血し、抗ァスペルギルス血清を得た。

実施例 2— 1 ) で調製した M-LSP抗原液 1を SDS-PAGEで分雔後、 PVDF膜にプロッティングし、抗ァスペルギルス血涛を一次抗体として、ゥサギ抗マウス I g G 抗体を二次抗体として用いて、実施例 1 4一 1 ) と同様にウエスタンプロッティングにより抗原性タンパク質を検出したところ、第 4図（レーン 1 ) に示すように Af-LSP中のタンパク質に対する抗体が含まれていた。すなわち、ァスペルギルス感染において、 Af- LSPに含有されているタンパク質は、生体に抗原として認識される。従って、実施例 1 7に示したように、 Af-LSPに対する免疫を誘導しておくことにより特異的な防御効果を期待できると思われる。実施例 1 9 (真菌由来の不溶性画分間の交差反応性）

1 ) 抗カンジダ血淸または抗ァスペルギルス血清の他の種類の真菌由来のタンパク質に対する交差反応性： Af-LSP抗原液 1、 Crn-LSP を SDS-PAGEで分離後、 PV DF膜にブロッテイングし、抗カンジダ血淸（実施例 1 4一 1 ) ) を一次抗体として、ゥサギ抗マウス I g G抗体を二次抗体として用いて、実施例 1 4— 1 ) と同様にウエスタンプロッティングにより抗原性タンパク質を検出したところ、抗カンジダ血清は第 5図に示すように Crn-LSP 由来の夕ンパク質に対して交差反応性を示した（レーン 2 ) 。また、ァスペルギルス由来の Af-LSPに対しても弱い交差反応性が認められた（レーン 3 ) 。なお、レーン 1は、不溶性画分として Ca-LSP を用いた例である。

また、 Crn-LSP を SDS- PAGEで分離後、 PVDF膜にブロッテイングし、抗ァスペルギルス血清（実施例 1 8 ) を一次抗体として、ゥサギ抗マウス I g G抗体を二次抗体として用いて、実施例 1 4一 1 ) と同様にウェスタンプロッティングにより抗原性タンパク質を検出したところ、抗ァスペルギルス血清は、クリプトコッカス由来の Crn-LSP 中に含まれるタンパク質に対しても弱いながら交差反応した（第 4図、レーン 2 )。

2 ) 特異的な細胞性免疫の誘導および Ca-LSP免疫マウスにおける M-LSPに対する細胞性免疫： Ca-LSP、 Af-し SP抗原液 1それぞれの IFA との製剤を、 C57BL/6マウスに 0 . 2 g タンパク質相当/回、 2 / g タンパク質相当 Z回、 2 0 8 夕ンバク質相当ノ回、 1週間隔で 2回皮下免疫した。対照として、生理食塩水と IF A との混合物で同様に免疫した。免疫後、 6日目に Af-LSPを 20 g タンパク質相当ノ 50 // 1 ずつ各マウス（各群 5匹）のフットパッドに皮下投与した。 24時間後にフットパッドの腫れを測定した。結果を表 1 2に示す。 Af-LSP免疫群で腫れが大きいことから、 Af-LSPにかなり選択性を有する DTH反応が誘導されていることが明らかとなった。一方、 Ca-LSP 20 ^ g タンパク質相当免疫群においても Af - L SPに対しても有意な DTH反応が生じており、交差反応する細胞性免疫が誘導されていることが明らかとなった。即ち、異なる真菌間で交差反応するタンパク質が存在することが示された。従って、一種の LSP を用いて異なる真菌による感染を防御できると思われる（実施例 2 0参照）。表 1 2

* ： gタンパク質相当実施例 2 0 (カンジダアルビカンス不溶性画分 Ca-LSPのマウスァスペルギルス症感染モデルでのヮクチン効果）

Ca-LSPの IFA との製剤を C57BL/6マウスに 20 g タンパク質相当 Z回、 1週間隔で 2回皮下免疫した。対照として、生理食塩水と IFA との混合物で同様に免疫した。免疫後、 8日目にァスペルギルスフミガタス ΠΜΜ 1776 の胞子を 2 x lO ⁶ 個ずつ静脈内感染させた。感染後、 30日間生死を観察した。結果は表 1 3のとおりである。 Ca-LSPで免疫することによりァスペルギルス感染に対する感染防御免疫も誘導することができることが明らかとなった。

表 1 3

実施例 2 1 (菌糸型カンジダアルビカンス細胞の調製及び菌糸型細胞由来の不溶性画分 Ca- LSP-Mの調製）

実施例 1と同様に、カンジダアルビカンス TI M 1768 を YPD培地で 30でで 24 時間振とう培養して得られた培養液の一部を、三角フラスコに入れた FCS10 %添加 RPMI -1640培地に植菌し、 37^eCで 4時間振とう培養し、菌糸型カンジダアルビカンス細胞を得た。培養液をガラスフィルターでろ過し紬胞を回収後、 SSB溶液で洗浄、再度 SSB溶液に懸濁した。その後、実施例 1と同様にザィモリエース、トリコデルマ ·ライジングェンザィムで処理した。菌糸状細胞とプロトプラスト細胞を分離するために、得られた懸濁液をガラスフィルターでろ過し、ろ液を回収した。得られたろ液を 1, 000 x g、 5分間遠心し、プロトプラスト紬胞を集めた。この細胞を SSB溶液で洗浄後、滅菌生理食塩水を加え、十分擬拌した後、氷上に 10分間静置した。プロトプラスト細胞がバーストしたことを確認後、 10. 0 OO x g、 30分間遠心し、得られた沈殿を菌糸型紬胞由来の不溶性画分（以下、 Ca - LSP-Mという）とした。

Ca - LSP-Mは生理食塩水に懸濁後、超音波処理、さらに沸騰水浴下、 5分間処理して殺菌し、培養菌体液 1 0 O m Lより膜タンパク質等を含有する Ca- LSP- M抗原液 2 m Lを得た（タンパク質濃度 1. 2 mg/mL ) 。 Ca-LSP-M及び対照として Ca-LSP

(いずれもタンパク質量として約 4 g ) を SDS-PAGEで分離後、 PVDF膜にブロッティングし、抗カンジダ血淸（実施例 1 4一 1 ) ) を一次抗体として、ラット抗マウス I g G抗体を二次抗体として用いて、実施例 1 4一 1 ) と同様にウェス夕ンブロッテイングにより抗原性タンパク質を検出した。その結果、第 6図（レーン 2 ) に示すように、抗カンジダ血淸中には Ca-LSP-Mに含まれるいくつかのタンパク質に対する IgG抗体が誘導されており、第 3図のレーン 1の酵母型細胞の Ca -LSPとは異なるバンドも存在した（第 6図のレーン 1 ) 。さらに、抗体量も多いと思われた。なお、本実施例で用いた菌糸型カンジダアルビカンス細胞の細胞壁除去処理前後の、細胞の形態の変化を第 7図に示す。実施例 2 2 (ヒト皮膚反応による診断）

実施例 1で得られた Ca-LSP の生理食塩水溶液（タンパク質濃度 2. 3mg /mL) を生理食塩水でタンパク質濃度 1. 0mg/mLになるように希釈後、さらに 100 倍、 10 00倍に希釈した。皮膚反応は、各希釈液を 20 1 ずつパッチスター（鳥居薬品製 ) に浸み込ませたものを、ボランティア 4人の腕皮霜面に 2日間貼付後、パッチスターを剝がしてから 1時間後の皮膚の状態を、紅斑や丘疹の有無により診断した。判定は、国際接触皮膚炎症研究グループ（ I C D R G ) の基準に従い行った。 4人のうちアレルギー体質の 2人に明らかな紅斑が見られ、 1人もわずかな紅斑が見られた。従って、本発明の真菌抗原が、個体の D T H反応を利用した診断に有効であることが明らかとなつた。実施例 2 3 (ヒト血漿中 igE抗体価の測定）

臭化シアンによるペーパーディスクの活性化、及び抗原（実施例 4で得られた Ca-LSP-Sを、タンパク質濃度として 1 0 Ο /i gZm Lに希釈した溶液）のべーパ一ディスクへのカップリングは、宮本らの方法 [Miyamoto et al. Al lergy, Vol.2 2, 584-594(1973) ]を参考に実施した。ヒト血漿中 IgE抗体価の測定は、ポリスチレンチューブに抗原をカツプリングさせた上記ペーパーディスク 1枚とヒト血淸 5 0 しを加えて、室温で 3時間放置した。次いで、 0. 2 %のツイーン 2 0を含む生理食塩水でペーパーディスクを 3回洗浄後、 RAST-RIAキット（Pharmacia社製）の ¹²⁶ I摞識抗ヒト igE抗体 50 uL を加えて室温で 1 6時間放置した。上記洗浄液で再度 3回洗浄後、ガンマカウンターで放射能を測定した。同時に RAST-RiAキッ卜の対照試薬で作成した標準曲線から IgE抗体価を算出した。ァレルギー患者のうち、市販の診断用アレルゲン皮内エキス（鳥居薬品社製）の皮フテストで陽性の 24人について、 Ca-LSP-Sに対する IgE抗体価を測定したところ、 1 5人が陽性であった（0. 35PRU/mL以上を陽性とした。）。従って、ァレルギー患者において、 Ca-LSP-Sに対する陽性率は高く、不溶性画分からなる本発明の真菌抗原が IgB抗体検出に有効であることが明らかとなった。実施例 24 (〇3— 3?にょるヒト末梢血リンパ球（PBMC) からのサイト力イン産生）

P BMCは健常人から成分採血により採血を行い、白血球画分を集めさらに以下の分離方法に従って調製した。すなわち、採血液を RPM I - 1 64 0培地で約 2倍希釈後、フイコール一バック（Ficoll-Paque) 分離液（フアルマシア社製 ) 上に重層し、 500 xgで 20分間室温で遠心した。中間層の PBMCをピぺットで回収、洗浄して 90%牛眙児血清（FCS、インターゲン社製）と 1 0%ジメチルスルホキシド（シグマ社製）からなる保存液に懸濁した状態で液体窒素中に保存した。 Ca— LSPによる PBMC処理は以下のように行った。

上記保存 PBMC検体を融解後、ヒト AB血淸（ァーバインサイエンス社製）を終濃度 5% (v/v) となるように添加した RPM 1 - 1 64 0培地に懸濁し、 1. 5 X 1 0⁶ 個 Zm 1となるように希釈し 24穴マイクロブレートに 1ゥヱルあたり 1 m 1分注した。次に実施例 1で得られた Ca-LSP の生理食塩水溶液（タンパク質濃度 2.3mg /mL) を、添加置が 5 gタンパク質相当ウヱルになるよう生理食塩水で希釈した C a— LSP抗原液を 1ゥルあたり 50 n 1加え、 37^eC、 5%C0₂ 条件下で培養した。培養開始後 7日目に培養上清を分取し、 I FN— 7量をヒト I FN— 7 EL I SAキット（Ame r s h am L I F E SC I ENCE社製）を使用して測定した。測定は製造元のプロトコールに従い実施した。なおキットの検出限界値は、 0. 002 ngZmlである。

7日目の I FN— 7の量を第 8図に示す。ヒト PBMCは Ca— LSPに対して反応し I FN— τを産生した。なお 1 5検体の I FN— 7産生量は 1. 435 ± 1. 21 0 (平均土 SD) n gZm 1の範囲に分布した。

対照として C a— LSP抗原液の代わりに生理食塩水 50 1 Zゥヱルを加えて同様にして I FN— τの量を測定した。該ゥヱルにおける I の検出量はキットの検出限界値以下であった。実施例 25 (真菌アレルギー皮内反応診断試薬および診断用滴定試薬の調製）実施例 1で調製された Ca-LSP抗原液を乾燥させて粉末状で採取して、真菌ァレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及び真菌アレルギー診断用滴定試薬として用いる。皮内反応診断試薬には 0.5 %フエノールを添加した 0.9 %生理食塩水を溶媒とし、タンパク質濃度で Img/mLとし、これの 1 000倍希釈液を調製して用いる。また、真菌アレルギー診断用滴定試薬には、タンパク質濃度として Img/mLの濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これをヒスタミン遊離滴定用試薬の原液としてその希釈液を用いる。実施例 26 (減感作治療用抗原製剤の調製）

実施例 1で調製された Ca-LSP抗原液を乾燥させて粉末状で採取して、真菌ァレルギー疾患に対する滅慼作治療剤として用いる。アレルゲン活性成分を 1 m g / mlの濃度で 0.5 フヱノールを添加した 0.9 %生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液とする。実施例 27 (カンジダアルビカンス抗原性タンパク質をコードする核酸の単離） 1)分子量約 65, 000のタンパク質をコードする DN Aの単離：実施例 1 5 ― 1 ) で単離した分子量約 65.000のタンパク質（以下、 65Kタンパク質と称す）をコードする核酸を単離するため、始めにカンジダアルビカンス T I MM1 7 6 8株の c DN Aライブラリーを作製した。

まず菌体より全 RNAを抽出、精製するため、上記の菌を 20 Om l YPD培地で 35°Cで培養後、 2000 xg、 5分間の遠心分離処理により細胞を回収し、一度蒸留水で洗浄した。得られた細胞を液体窒素により急速凍結し、乳鉢により凍結細胞を粉末状に破砕した。この細胞粉末より、 RNAェクストラクシヨンキット（RNA extraction kit, フアルマシア社製）を用いて全 RNAを回収、精製した。この全 RN Aからォリゴテックス— d T 30くスーパー〉（oligotex-dT 30, 宝酒造社製）を用いて、ボリ（A) + RN Aを調製した。次に夕カラ cD NA合成キット（宝酒造社製）を用いて、ボリ（A) + RNA 5 gから cDN Aを合成した。合成された cDNAをラムダファージベクター； ISCREEN-1 (ノバジェン社製）と連結した後、ファージメーカ一システム、ファージパックェクストラクト（ノヴァジェン社製）によりインビトロパッケージングを行い c DN Aライブラリ一を構築した。

実施例 1 5— 1 ) のァミノ酸配列解析により 65 kタンパク質はサッカロマイセスセレピシェの DLDHのホモログと推定された。そこで他種生物の DLD Hにおいて、高度に保存されたアミノ酸配列をコ一ドすると推定される塩基配列に相補的な塩基配列を有するォリゴヌクレオチド D L 2と配列表の配列番号 1のァミノ酸配列の一部をコードすると推定される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド DL 1を合成、精製し PC R用のブライマーとした。 DL 1の塩基配列を配列表の配列番号： 9に、 DL 2の塩基配列を配列表の配列番号 .' 1 0に示す。 P CRの铸型とするため、カンジダアルビカンス T I MM 1 7 68株からゲノム DNAを P. フィリップセン（P. Philippsen)らの方法 [メッツズインェンザィモロジ一（Methods in Enzymology), 第 1 94巻、第 1 6 9〜 1 75頁（ 1 9 9 1 ) ] により抽出、精製した。精製したゲノム DNAを铸型として DL 1と DL 2をプライマーとして用いた PC Rを行った。 PCRの反応条件は 94てにて 1分、 55°Cにて 1. 5分、 72°Cにて 2分の温度シフトを 30サイクルおこなった。その結果、約 1 kbpの大きさの DNAが増幅してきた。この DNAを pUC l 1 8ベクタ一（宝酒造社製）にクローニングした後、 DNA塩基配列を決定したところ、該増幅 DNAの塩基配列は配列表の配列番号： 1 3に示す通りであり、該塩基配列がコードすると予想されるァミノ酸配列は 65 kタンパク質の N末端より決められたァミノ酸配列と一致した。従って得られた増幅 D N A断片は 65 kタンパク質をコードする DNAの一部分であることが明らかとなった次に、 65 kタンパク質をコードする c DNA全長を得るため、上記増幅 DN A断片をプローブとして用いて、 c DNAライブラリ一のスクリ一二ングを行つた。前記のようにして得られた cDNAライブラリ一を宿主大腸菌 ER 1 647 株に接種し、トップァガロース（0. 7%ァガロースを含む LB培地）と混合後、 LBプレート上に重層し、 37^eC—夜培養することにより、プラークを形成させた。生じたプラークをナイロンメンブレン（Hybond— N、アマシャム社製）へ移し、プラークハイプリダイゼーシヨンを行った。上記の PCR断片 1 k bをランダムプライマ一 DNAラベリングキット（宝酒造社製）と [a — ³²P] dCTPで標識しハイブリダィゼーシヨンのプローブとして用いた。 1. 6 X 1 0⁵ 個のプラークをスクリーニングした結果、多数のファージクローンがプロ一ブとハイブリダィズした。このなかから、シグナルの強い 28個のクローンについて、さらに解析した。すなわち、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングにより、これらのファージから c DN Aを含む領域を自動的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、 c DNAの長さ及び制限酵素切断による DNAバンドのパターンを比較し、 65 kタンパク質遺伝子を含むと考えられる cDNAを選び、塩基配列を決定した。その DNA塩基配列を配列表の配列番号： 7に示す通りであり、この塩基配列より 65 kタンパク質は配列表の配列番号： 5に示したァミノ酸配列を有するタンパク質であることが推定された。

2)分子量約 25, 000の抗原性タンパク質をコ一ドする DN Aの単離：実施例 1 5— 1) で単離した分子量約 25, 000のタンパク質（以下、 25Kタンパク質と称す）をコードする核酸を単離するため、先ず配列表の配列番号 2のアミノ酸配列の一部をコードすると推定されるオリゴヌクレオチド SO 1と SO 2を合成、精製し PC R用のプライマーとした。配列表の配列番号 1 1に SO 1の塩基配列を、配列表の配列番号： 1 2に SO 2の塩基配列を示す。次に 1) において精製されたポリ（A) + RNA0. 5 gを用いて TaKaRa RNA LA PCR k i t (AMV) Ve r. 1. 1 (宝酒造社製）を使用し、 R T— P CRを行った。すなわち、 o l i go (dT) 20—M4 ad ap t o rプライマ一を用いて、ポリ（A) + RNA0. 5 gから、 AMV逆転写酵素の反応（

45°C、 30分間）により c DN Aを合成した。この cDNAを铸型とし、 SO 1と Ml 3M4プライマー（宝酒造社製）をプライマ一として、 94 にて0. 5分、 55 °Cにて 2分、 72 °Cにて 2分の温度シフトを 35サイクルの条件で、 PCR反応をおこなった。さらに、上記 PC R反応液を铸型として、 2回目の P CR反応（n e s t e d PCR反応）を行った。この反応では、ブライマーとして、 S02と Ml 3M4プライマーを用いた。 PCRの結果、約 70 Obpの大きさの DNAが増幅してきた。この DNAを pUC 1 1 8ベクタ一にクロ一二ングした後、 DNA塩基配列を決定した。その DNA塩基配列を配列表の配列番号： 8に示す。該塩基配列にコードされると予想されるアミノ酸配列は配列表の配列番号： 6に示す通りであり、その N末端部分は 25 kタンパク質より決められたァミノ酸配列と一致した。この PCR断片は SODとホモロジ一を有する 2

5 kタンパク質をコードする DN Aであることが明らかとなった。産業上の利用可能性本発明の真菌抗原は、真菌を原因とする、感染症に対して有効性の高いワクチン、アレルギー性疾患の減感作治療用組成物、サイトカイン放出剤、疾患の診断薬などの生物学的製剤として利用できる。すなわち、本発明の真菌抗原は、ワクチン効果で比較した場合、生菌免疫と同等の効果を示し、従来の真菌抗原に比べかなり優れている。また本発明の真菌抗原は安全性の面でも、生菌を含まない、毒性が低い他、細胞壁成分の含量が低いため、ワクチンや減感作洽療用製剤に利用した場合、マンナン、グルカン等の細胞壁成分による副作用を抑え、個体に有利な免疫反応を強化することができる。また、アレルギー性疾患の検査においても、高感度である。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 50

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列の特徴： 33、 44、 4 9 不明のアミノ酸

配列：

Ala Ser Thr Lys Lys Tyr Asp Val Val Val lie Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15

Gly Gly Tyr Val Ala Ala lie Lys Ala Ala Gin Leu Gly Leu Asn

20 25 30

Thr Ala Xaa He Glu Lys Arg Gly Ala Leu Gly Gly Thr Xaa Leu

35 40 45

Asn Val Gly Xaa lie

50 配列番号： 2

配列の長さ： 30

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列の特徴： 26、 29、 30 不明のァミノ酸

配列： Lys Tyr Ser Leu Pro Glu Leu Asp Tyr Glu Phe Ser Ala Thr Glu 1 5 10 15

Pro Tyr l ie Ser Gly Gin l ie Asn Glu [ le Xaa Tyr Thr Xaa Xaa

20 25 30 配列番号： 3

配列の長さ： 3 1

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Ala Ser Ala Glu Pro Thr Leu Lys Gin Arg Leu Glu Glu l ie Leu 1 5 10 15

Pro Ala Lys Ala Glu Glu Val Lys Gin Phe Lys Lys Glu Hi s Gly

20 25 30

Lys 配列番号： 4

配列の長さ： 3 0

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Lys Phe Thr Asp Asp Tyr Tyr Ser Lys l ie Ala Asp Asp Tyr He 1 5 10 15

Glu Phe Thr Tyr Lys Asn Pro Thr [ le Tyr His Val Val Asn Phe

20 25 30 配列番号： 5

配列の長さ： 4 9 1

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Leu Arg Ser Phe Lys Ser i le Pro Ala Asn Gly Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gin Phe Val Arg Tyr Ala Ser Thr Lys Lys Tyr Asp Val Val Val

20 25 30

He Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Val Ala Ala He Lys Ala Ala

35 40 45

Gin Leu Gly Leu Asn Thr Ala Cys l ie Glu Lys Arg Gly Ala Leu

50 55 60

Gly Gly Thr Cys Leu Asn Val Gly Cys He Pro Ser Lys Ser Leu

65 70 75 Leu Asn Asn Ser His Leu Leu His Gin l ie Gin His Glu Ala Lys

80 85 90 Glu Arg Gly He Ser l ie Gin Gly Glu Val Gly Val Asp Phe Pro

95 100 105 Lys Leu Met Ala Ala Lys Glu Lys Ala Val Lys Gin Leu Thr Gly 110 115 120

Gly l ie Glu Met Leu Phe Lys Lys Asn Lys Val Asp Tyr Leu Lys

125 130 135

Gly Ala Gly Ser Phe Val Asn Glu Lys Thr Val Lys Val Thr Pro

140 145 150 l ie Asp Gly Ser Glu Ala Gin Glu Val Glu Ala Asp His l ie He

155 160 165

Val Ala Thr Gly Ser Glu Pro Thr Pro Phe Pro Gly l ie Glu He

170 175 180

Asp Glu Glu Arg He Val Thr Ser Thr Gly l ie Leu Ser Leu Lys

185 190 195

Glu Val Pro Glu Arg Leu Ala l ie He Gly Gly Gly l ie He Gly

200 205 210

Leu Glu Met Ala Ser Val Tyr Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Thr

215 220 225

Val l ie Glu Phe Gin Asn Ala l ie Gly Ala Gly Met Asp Ala Glu

230 235 240

Val Ala lys Gin Ser Gin Lys Leu Leu Ala Lys Gin Gly Leu Asp

245 250 255

Phe Lys Leu Gly Thr Lys Val Val Lys Gly Glu Arg Asp Gly Glu

260 265 270

Val Val Lys l ie Glu Val Glu Asp Val Lys Ser Gly Lys Lys Ser

275 280 285

Asp Leu Glu Ala Asp Val Leu Leu Val Ala He Gly Arg Arg Pro

290 295 300

Phe Thr Glu Gly Leu Asn Phe Glu Ala l ie Gly Leu Glu Lys Asp 8 L

06t 98^

9Md usv 911 o^jd s人 Ί dsy ^Md JM1 ¾IV naq ¾iv 08^ OLf

BIV nio sAi 9Md B】V nio S n»1 ^JLU OJJ S IH ¾IV S IH s J 99^ 09 99^

8JV J3S an dsv niO ^JlU s ¾IV人 13 nio "91 ¾IV naq A ogt' o

¾IV niO BIV 9U nio ^10 ¾IV usy OJJ 9 an 311 SIH ΐ^Λ

9S^ OSt' ^

lO Π9ΐ ι¾Λ 3JV UI9 JM1 nio ¾iv dsy ¾IV 911 9Md sAl \n

02 S 0

ΧίΟ dsv ^Jm dsv usv JM1 δλ ¾iv 3JV usy ¾IV 3Π 3Md

00V 96S

o d 3Md sxq λΐ9 ι¾Λ sXq JXJ, sXq θπ 。 UIQ nio sAq naq ui

068 S88 088

niO nio usv 3 Ι¾Λ 丄 ¾ιν 1¾Λ niO。 SIH J¾ J

9AS 08 998

ΙΒΛ Jas 0Jd 311 usv «IV usv 1¾Λ SIH 人 13 SIH AIO s sAi

098 998 098

911 J "ID BIV BIV ¾iV 9Π Aio nio ¾iy s SIR ¾

S S Ot^S 9δδ

Π9ΐ o』d Ai99qd J¾ ΙΒΛ dsy λΙΟ θΙΙ Ι^Λ 3^JV ^Il SIH dsy

088 92δ 028

S!H sXq jqj, sAq 9リ d iqj) dsy dsy 91] 9Π na 3jy AlO sAq usy

SIS 018 90S

\ Q£0IL6d£lL3d 06660/86 OAV 配列番号： 6

配列の長さ： 1 88

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Ala Thr Glu Pro Tyr He Thr Gly Gin Met Asn Glu lie His Tyr

1 5 10 15

Thr Lys His His Gin Thr Tyr Val Asn Asn Leu Asn Ala Ser e

20 25 30

Glu Gin Ala Val Glu Ala Lys Ser Lys Gly Glu Val Lys Lys Leu

35 40 45

Val Ala Leu Gin Lys Ala He Asn Phe Asn Gly Gly Gly Tyr Leu

50 55 60

Asn His Cys Leu Trp Trp Lys Asn Leu Ala Pro Val Ser His Gly

65 70 75

Gly Gly Gin Pro Pro Ser Glu Asp Ser Lys Leu Gly Lys Gin lie

80 85 90

Val Lys Gin Phe Gly Ser Leu ASP Lys Leu He Glu He Thr Asn

95 100 105

Gly Lys Leu Ala Gly He Gin Gly Ser Gly Trp Ala Phe lie Val

110 115 120

Lys Asn Lys Ala Asn Gly Asp Thr He Asp Val lie Thr Thr Ala

125 130 135

Asn Gin Asp Thr Val Thr Asp Leu Asn Leu Val Pro Leu lie Ala 140 145 150 l ie Asp Ala Trp Lys His Ala Tyr Tyr Leu Gin Tyr Gin Asn Val

155 160 165

Lys Ala Asp Tyr Phe Lys Asn Leu Trp His Val l ie Asn Trp Lys

170 175 180

Glu Ala Glu Arg Arg Phe Glu Phe

185 配列番号： 7

配列の長さ： 1 7 5 0

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

CTCAGAGAGA CCGGACTAAA GATTCTATAA ATATTCTTTC TTTCTGTTCA CATTATATAT 60 TCTTCTCAAC AAATGTTAAG ATCATTCAAA TCTATTCCAG CCAATGGAAA ATTGGCCCAG 120 TTTGTTAGAT ATGCATCAAC CAAGAAATAC GACGTTGTTG TCATTGGTGG TGGACCAGGT 180 GGGTACGTTG CTGCCATCAA GGCCGCTCAA TTAGGATTAA ACACTGCCTG TATTGAAAAA 240 AGAGGTGCAT TGGGTGGTAC TTGTTTGAAT GTTGGTTGTA TCCCATCCAA ATCTTTATTG 300 AACAACTCCC ATTTATTACA CCAAATCCAA CACGAAGCCA AAGAAAGAGG TATTTCCATC 360 CAAGGTGAAG TTGGCGTTGA TTTTCCAAAA TTGATGGCTG CCAAGGAAAA AGCCGTCAAA 420 CAATTGACCG GTGGTATTGA AATGTTGTTC AAAAAGAACA AGGTTGACTA CTTGAAAGGA 480 GCCGGTTCTT TTGTTAACGA AAAAACCGTC AAAGTCACTC CAATTGACCG CAGCCAAGCA 540 CAAGAAGTTG AAGCCGACCA CATCATCGTT GCTACTGGGT CTGAACCAAC TCCATTCCCA 600 GGTATTGAAA TAGATGAAGA AAGAATTGTC ACTTCTACTG GTATTTTATC ATTGAAAGAA 660 ΐ 8

mom m - mowm \ z L ■ ^^

8 ： ^m^

09AI VVVVVVVVVV 0 I VVVVVOllll VlllVlVlVl VDVOVVIVVI VVV3VDV1VV VIVDVIVIOI VDVOIVVOVO 0891 VV1V1V330V 0131V11VV0 13V1VVV131 VllOOVVlll 11V3131301 111010V011 0291 1111110V11 IVOlllVVlV VVVIOVIVVV 10VVVV01VV 10V3VV3V1V 0991 V913VIV913 VVVV11113V V31VVD09VV 1V011130V3 0091113913 0VV00VV311 00SI 133VV0131V 1113VV301V 0I301V0131 V3VVOVV0I1 1V0V0VV033 V331130100 0 I IVIVVOVIIO 3001110910 0VV013011V 01VVV0109V 001VVV3310 011V11V3V0 08CI 0101000110 lOVOVVVOOO VVV03301V0 100I1V011V VVOIOOinO OIVOIDVOVO 0ZZ\ 01V0VV3DVV VV139V0V30 13VV03011V 311V00011V VVIOOVIOVV V3V1VVV31V 092 ΐ OOOVVDVVOV VVOllVVDVV 0VV03VVV11 1001100013 30110VV0V0 33V313V1V1 0021 01V1101311 3331V3VV13 OIVXOVVVIO 1V01003V01 00VVV0VV31 V0V1VV0130 O U 10010031V1 03VV0VV0VV 01309VV3V3 33001101V1 33103311V3 VOIOIVOOOO 0801 IIVIIOVOVO XV3V33V01V 3VVVI3V0VV 011VV33VO0 VOllVllVOl XV0VV090VV 0201 3VV1V0VVV0 VOVlllOOll VOOOVVOUl 3VVO11100V V013V111V0 OVOVV3V100 096 I1V0301100 110113101V 0330VV0113 0V0131VVVV VV190031VV VOIOIVOVVO 006 IIOVVOOIVO VV010019VV 01091V0V0V VV0190VVV1 101100VVV0 V109V11VVV o onovoom OOVVOVVVOO OOllVllVVV VVOIOIVVOV VVIOOUOVV OIOOIVOOIV 02L 1003391301 IVIOOOVVOV 3311VV031V 11013V310V VV13130001 1V0VV003V1 QZL 1100011300 IVVVOOlllO 011V31V100 V00109UV0 IVOOOVXIVO VVV0V33V10

IW)eO/ ,6df/XDd 06660/86 OAV 配列：

CCCACTGAAC CGTACATCAC AGGACAAATG AACGAAATTC ACTACACTAA ACATCACCAA 60 ACTTATGTTA ACAACCTTAA TGCTTCAATT GAACAAGCCG TTGAAGCCAA ATCTAAAGGT 120 GAAGTTAAAA AATTGGTTGC CTTACAAAAA GCCATCAATT TCAACGGTGG TGGTTACCTC 180 AATCATTGTT TGTGGTGGAA AAACTTGGCT CCTGTCTCTC ACGGTGGTGG TCAACCACCA 240 AGTGAAGATT CCAAATTAGG TAAACAAATC GTCAAACAAT TTGGTTCTTT GGATAAATTG 300 ATTGAAATCA CCAATGGCAA ATTGGCTGGT ATTCAAGGTT CTGGATGGGC TTTTATTGTT 360 AAAAACAAAG CCAATGGTGA TACTATTGAT GTCATCACCA CTGCTAACCA AGATACTGTT 420 ACTGATCTAA ACTTGGTTCC ATTGATTGCT ATTGATGCTT GGAAACATGC TTATTATTTG 480 CAATACCAAA ATGTTAAAGC TGATTACTTC AAGAACCTTT GGCATGTTAT CAACTGGAAG 540 GAAGCTGAAA GAAGATTTGA ATTTTAAGTT ACTGGACAAA AGTCAAGTAC ATATTTAAAT 600 CCAATATTAG AAAATAAAAG AGTTACTTCC GATAGTGCTG ATTTTGTTTA ATATTTCCCC 660 ATTGTATATA AGTATATATG CAAGAATATA TTCCTGATTG TGATGTAAAA AAAAAAAAAA 720 A 721 配列番号： 9

配列の長さ： 2 3

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖伏

配列の種類：他の種類（合成 DNA)

配列の特徴： 3 (イノシン）、 9 (イノシン）、 1 2 (イノシン）、 1 5 (イノシン）

配列：

GGNTAYGTNG CNGCNATHAA RGC 23 配列番号： 1 0

配列の長さ： 2 3

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の種類（合成 DNA)

配列の特徵： 6 (イノシン）、 1 5 (イノシン）、 1 8 (イノシン）配列：

TCYTCNGCYT TRTGNGCNAR CAT 23 配列番号 1 1

配列の長さ： 3 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の種類（合成 D NA)

配列：

AARTAYWSNY TNCCNGARYT NGAYTAYGAR TT 32 配列番号 1 2

配列の長さ： 2 6

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の種類（合成 D NA)

配列： GCNACNGARC CNTAYATHWS NGGNCA 26 配列番号： 1 3

配列の長さ： 9 4 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

GGGTACGTGG CGGCGATCAA GGCCGCTCAA TTAGGATTAA ACACTGCCTG TATTGAAAAA 60 AGAGGTGCAT TGGGTGGTAC TTGTTTGAAT GTTGGTTGTA TCCCATCCAA ATCTTTATTG 120 AACAACTCCC ATTTATTACA CCAAATCCAA CACGAAGCCA AAGAAAGAGG CATTTCTATC 180

CAAGGTGAAG TTGGCGTTGA TTTTCCAAAA TTGATGGCTG CCAAGGAAAA AGCCGTCAAA 240

CAATTGACCG GTGGTATTGA AATGTTGTTC AAAAAGAACA AGGTTGACTA CTTGAAAGGA 300

GCCGGTTCTT TTGTTAACGA AAAAACCGTC AAAGTCACTC CAATTGACGG CAGCGAAGCA 360

CAAGAAGTTG AAGCCGACCA CATCATCGTT GCTACTGGGT CTGAACCAAC TCCATTCCCA 420

GGTATTGAAA TAGATGAAGA AAGAATTGTC ACTTCTACTG GTATTTTATC ATTGAAAGAA 480

GTACCAGAAA GATTAGCCAT CATTGGTGGA AGTATCATTG GTTTGGAAAT GGCTTCCGTT 540

TACGCAAGAT TGGGCTCTAA AGTCACTGTT ATCGAATTCC AGAACGCTAT TGGTGCCGGT 600

ATGGATGCTG AAGTTGCTAA ACAATCTCAA AAATTATTGG CCAAACAAGG TTTGGACTTC 660

AAATTAGGTA CAAAGGTTGT TAAAGGTGAA AGAGATGGTG AAGTGGTCAA GATCGAAGTT 720

GAAGATGTCA AATCCGGTAA AAAATCTGAC CTTGAAGCCG ATGTCTTGTT GGTTGCCATT 780

CGTAGAAGAC CATTTACTGA AGGTTTGAAC TTTGAAGCCA TTGGTTTAGA GAAAGATAAC 840

AAGGGAAGAT TGATTATTGA CGACCAATTC AAGACTAAAC ATGACCACAT CAGAGTTATT 900

GGGGATGTCA CATTCGGTCC TATGCTCGCC CACAAAGCCG AAGA 944

Claims

請求の範囲

1 . 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分であることを特徴とする真菌抗原。

2 . 細胞壁を実質的に除去した、又は紬胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞が、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフロブラストである請求項 1記載の真菌抗原。

3 . 不溶性画分が、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌紬胞をバーストして得られる請求項 1又は 2記載の真菌抗原。

4 . 不溶性画分が、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌紬胞をバーストして得られる成分を約 1 0 0 0 0 0 X gの条件下で遠心分離処理に付して得られる沈殿画分である請求項 1又は 2記載の真菌抗原

5 . 不溶性画分が細胞小器官を含有する請求項 1〜4いずれか記載の真菌抗原

6 . 細胞小器官がミトコンドリア、核、ライソソ一厶、及び液胞からなる群より選ばれる 1種以上のものである請求項 5記載の真菌抗原。

7 . 不溶性画分が細胞膜夕ンパク質及び Z又は細胞小器官の膜夕ンパク質を含有する請求項 1〜6いずれか記載の真菌抗原。

8 . 請求項 1〜 7いずれか記載の不溶性画分より分別抽出される可溶化画分である真菌 ί几原。

9 . 可溶化画分が可溶性夕ンパク質である請求項 8記載の真菌抗原。

1 0 . 界面活性剤を含有する緩衝液により分別抽出される請求項 8又は 9記載の真菌抗原。

1 1 . 請求項 8〜1 0いずれか記載の真菌抗原であって、糖群特異的吸着体に対して結合性を有する真菌抗原。

1 2 . 糖群特異的吸着体がコンカナバリン Α固定化体である請求項 1 1記載の真菌抗原。

1 3 . 請求項 8〜1 0いずれか記載の真菌抗原であって、糖群特異的吸着体に対して結合性を有しない真菌抗原。

1 4 . 糖群特異的吸着体がコンカナバリン A固定化体である請求項 1 3記載の真于亢原。

1 5 . 真菌細胞が、カンジダ属（Candida ) 、ァスペルギルス厲（Aspergi l lu s ) 、クリプトコッカス属（Cryptococcus) 、ム一コル属（Mucor ) 、リゾプス属（Rhizopus) 、アブシジァ属（Absidia ) 、ノカルジァ属（Nocardia) 、ヒストブラズマ厲 (Histoplasma ) 、ブラストミセス属 (Blastomyces ) 、コクシジオイデス属（Coccidioides) 、トリコフイトン属（Trichophyton) 、ミクロスボルム属（Microsporum ) 、ェビダ一モフィトン属（Epidermophyton) 、スボロトリックス厲（Sporothrix) 、黒色真菌（Demat iaceous fungi) 、マラセチア厲（ Malassezia) 、ニューモシスチス属（Pneumocyst is) 、ぺニシリウム属（Penici I l ium ) 、アルタナリア属（Al ternaria) 、クラドスボリゥム属（Cladospori画 ) 、ボトリチス属（Botryt is) 、オーレォバシジゥム属（Aureobasidium ) 、フザリウム属（Fusarium) 、トリコデルマ属（Trichoderma ) 、へルミンソスボリゥム属（Helminthosporium) 、ノィロスポラ属（Neurospora) 、ヮレミァ属（Wa Hernia) 及びロドトルラ属（Rhodotorula ) に属する真菌からなる群より選ばれる 1種類以上の真菌より得られる請求項 1〜1 4いずれか記載の真菌抗原。

1 6 . 真菌細胞が、カンジダアルビカンスの少なくとも一菌株の細胞である請求項 1〜 1 5いずれか記載の真菌抗原。

1 7. 真菌細胞が、ァスペルギルスフミガタスの少なくとも一菌株の細胞である、請求項 1〜1 5いずれか記載の真菌抗原。

1 8 . 真菌細胞が、クリブトコッカスネオフォルマンスの少なくとも一菌株の細胞である、請求項 1〜1 5いずれか記載の真菌抗原。

1 9 . 真菌細胞が、トリコフィトン属、ミクロスボル厶属、又はェビダーモフィトン属に厲する皮膚糸状菌のー菌株の細胞である、請求項 1〜1 5いずれか記載の真菌抗原。

2 0 . カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 1に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（S D S— P A G E、還元条件下）が約 6 5 , 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。

2 1 . ワクチン活性又はアレルゲン活性を有する、配列表の配列番号： 5に示すァミノ酸配列の全部又はその一部を含むぺプチドからなる真菌抗原。

2 2 . 配列表の配列番号： 5に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるァミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも 1つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するぺプチドからなる真菌抗原。

2 3 . 請求項 2 0〜2 2いずれか 1項記載の真菌抗原をコードする核酸。

2 4 . 配列表の配列番号： 7に示す塩基配列の全部又はその一部を有する、請求項 2 3記載の核酸。

2 5 . 請求項 2 3又は 2 4記載の核酸にハイブリダイズ可能な、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するぺプチドをコ一ドする核酸。

2 6 . カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 2に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（S D S - P A G E、還元条件下）が約 2 5 , 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。

2 7 . ワクチン活性又はアレルゲン活性を有する、配列表の配列番号： 6に示すァミノ酸配列の全部又はその一部を含むぺプチドからなる真菌抗原。

2 8 . 配列表の配列番号： 6に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなるァミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも 1つを生じさせ、かつ、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するぺプチドからなる真菌抗原。

2 9. 請求項 2 6〜 2 8いずれか 1項記載の真菌抗原をコードする核酸。

3 0. 配列表の配列番号： 8に示す塩基配列の全部又はその一部を有する、請求項 2 9記載の核酸。

3 1. 請求項 2 9又は 3 0に記載の核酸にハイブリダイズ可能な、ワクチン活性又はアレルゲン活性を有するぺプチドをコ一ドする核酸。

3 2. カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 3に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（SDS - PAGE、還元条件下）が約 3 0, 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。

3 3. カンジダアルビカンスに由来するワクチン活性又はアレルゲン活性を有する抗原性タンパク質であって、配列表の配列番号： 4に示す部分アミノ酸配列を有し、かつ分子量（SDS— PAGE、還元条件下）が約 6 2, 0 0 0である抗原性タンパク質からなる真菌抗原。

34. ( 1 ) 真菌の生細胞を得る工程、

(2) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌紬胞を得る工程、

( 3) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌紬胞をバーストさせる工程、及び (4) 不溶性画分を得る工程、

の各工程を含むことを特徴とする、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分である真菌抗原の製造方法。

35. ( 1 ) 真菌の生紬胞を得る工程、

(3) 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストさせる工程、

(4) 不溶性画分を得る工程、

(5) 不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程、

の各工程を含むことを特徵とする、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞より得られる不溶性画分を分別抽出して得られる、可溶化画分である真菌抗原の製造方法。

36. さらに、得られる可溶化画分を糖群特異的吸着体を用いて精製する工程を設ける請求項 35記載の製造方法。

37. 可溶化画分が可溶性タンパク質を含有する請求項 35又は 36記載の製造方法。

38. 不溶性画分より可溶化画分を分別抽出する工程が、界面活性剤を含有する緩衝液を用いて不溶性画分を可溶化する工程を含む請求項 35〜37いずれか記載の製造方法。

39. 糖群特異的吸着体がコンカナパリン A固定化体である請求項 36〜38 いずれか記載の製造方法。

4 0 . 細胞壁溶解酵素処理及び Z又は物理的処理により、細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞を得る請求項 3 4〜3 9いずれか記載の製造方法。

4 1 . 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞が、該真菌細胞のプロトプラスト又はスフエロブラストである請求項 3 4 〜4 0いずれか記載の製造方法。

4 2 . 細胞壁を実質的に除去した、又は細胞壁の少なくとも一部を除去した真菌細胞をバーストして得られる成分を約 1 0 0 0 0 0 X gの条件下で遠心分離処理に付して不溶性画分を得る請求項 3 4〜4 1いずれか記載の製造方法。

4 3 . 請求項 1〜2 2、 2 6〜2 8、 3 2〜 3 3いずれか記載の真菌抗原、又は請求項 3 4〜4 2いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有する生物学的製剤。

4 4 . 請求項 1〜2 2、 2 6〜2 8、 3 2〜 3 3いずれか記載の真菌抗原、又は請求項 3 4〜4 2いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有する医薬組成物。

4 5 . 請求項 1〜2 2、 2 6〜2 8、 3 2〜3 3いずれか記載の真菌抗原、又は請求項 3 4〜4 2いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対する感染防御免疫を誘導し又は治療効果を有するワクチン組成物。

4 6 . 請求項 4 5記載のワクチン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物の免疫応答を刺激する方法。

4 7 . ワクチン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりヮクチン組成物の製造に使用した真菌及び Z又はその近縁菌の増殖を抑制し、該真菌及び又はその近縁菌に起因する疾病を予防または治療する請求項 4 6記載の方法。

4 8 . 請求項 1〜2 2、 2 6〜2 8、 3 2〜 3 3いずれか記載の真菌抗原、又は請求項 3 4〜4 2いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とするサイトカイン放出剤。

4 9 . 請求項 1〜2 2、 2 6〜2 8、 3 2〜 3 3いずれか記載の真菌抗原、又は請求項 3 4〜4 2いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、個体に投与して真菌に対するァレルギ一性疾患を予防し又は治療効果を有するアレルゲン組成物。

5 0 . 請求項 4 9記載のアレルゲン組成物を投与することを含む、真菌に対する脊椎動物のアレルギー反応を抑制する方法。

5 1 . アレルゲン組成物の投与対象となる脊椎動物において、該免疫応答によりアレルゲン組成物の製造に使用した真菌及び/又はその近縁菌に起因するァレルギー性疾患を予防または治療する請求項 5 0記載の方法。

5 2 . 請求項 1〜2 2、 2 6〜2 8、 3 2〜 3 3いずれか記載の真菌抗原、又は請求項 3 4〜4 2いずれか記載の製造方法で製造される真菌抗原を含有することを特徴とする、該真菌による疾患の診断用組成物。

5 3 . 請求項 5 2記載の診断用組成物を使用することを含む、真菌による脊椎動物の疾患を診断する方法。