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WO1998010070A1 - IMMUNOGLOBULINE HUMANISEE REAGISSANT SPECIFIQUEMENT AVEC UN LIGAND Fas OU L'UN DE SES FRAGMENTS ACTIFS ET REGION D'INDUCTION D'APOPTOSE PRENANT NAISSANCE DANS UN LIGAND Fas - Google Patents

IMMUNOGLOBULINE HUMANISEE REAGISSANT SPECIFIQUEMENT AVEC UN LIGAND Fas OU L'UN DE SES FRAGMENTS ACTIFS ET REGION D'INDUCTION D'APOPTOSE PRENANT NAISSANCE DANS UN LIGAND Fas Download PDF

Info

Publication number
WO1998010070A1
WO1998010070A1 PCT/JP1997/002983 JP9702983W WO9810070A1 WO 1998010070 A1 WO1998010070 A1 WO 1998010070A1 JP 9702983 W JP9702983 W JP 9702983W WO 9810070 A1 WO9810070 A1 WO 9810070A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fas ligand
immunoglobulin
fas
amino acid
antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/002983
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ko Okumura
Motomi Nakata
Hirofumi Higuchi
Yoshitaka Ushio
Hiroaki Maeda
Yasuyuki Eda
Original Assignee
Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Electric Industries, Ltd. filed Critical Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority to US09/254,180 priority Critical patent/US6777540B1/en
Priority to AU40307/97A priority patent/AU725329B2/en
Priority to CA002264968A priority patent/CA2264968A1/en
Priority to EP97937807A priority patent/EP0957166A4/en
Publication of WO1998010070A1 publication Critical patent/WO1998010070A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • Humanized immunoglobulin or its active fragment that specifically reacts with the Fs ligand and apoptosis-inducing region derived from the Fs ligand
  • the present invention relates to a novel humanized immunoglobulin and, in addition, to a region on a Fas ligand which is important for suppressing apoptosis induced by a Fas-Fas ligand interaction in a Fas-expressing cell.
  • F the as relates humanized immune globulin or active fragment specifically reactive with ligand, the immunoglobulin and regions, F the as antigen and F the as apoptosis force s induced by physiological responses ligand It is useful in clinical applications for causative diseases, for example, elucidation of the Fas system in cell death, immunotherapy and diagnosis, detection of Fas ligand, or related industrial fields.
  • Multicellular organisms carefully control cell growth and death to maintain their homeostasis. During the ontogeny process, many cell forces are removed by cell death. Also, in adults, the cells that make up an organ maintain their functions while always maintaining a balance between proliferation and death. Such cell death is a predetermined death and is called “programmed cell death”, which is distinguished from accidental cell death caused by physical and chemical factors. (Raff, M.C, Nature, vol.356, p.397—400,1992) o The processes of these two cell deaths are different. In other words, it is thought that program cell death is caused by the process of apoptosis, whereas accidental cell death kills cells through the process of necrosis (necrosis) (Kerr (Kerr, JF), Brit. JC ancer.vol. 26, p. 239-257, 1 972) o
  • the Fas antigen is a cell surface protein that mediates programmed cell death (apoptosis), and its cDNA has also been cloned (Nagata et al., Cell, vol. 66, p. 223-243, 1999). ). From the structure of the obtained cDNA, it was found that the human F a ss antigen is a transmembrane protein consisting of 319 amino acid residues and has one transmembrane portion. The extracellular portion of the F ss antigen is composed of 157 amino acid residues and has a structure rich in cysteine residues. The mouse Fas antigen is composed of 306 amino acids and shows 49.3% homology with the human Fas antigen.
  • Fas antigen is a cell surface protein belonging to the NGFZTNF receptor family. Much of this protein belonging to the family of all, the force since it has the re-ligand in vivo to F as antigen had been expected this and force the ligand is present in the living body?, 1 993 years, A rat Fas ligand molecule was identified by Dr. Shigeichi Nagata's group (Nagata et al., Cell, vol. 75, p.
  • the Fas ligand is a protein consisting of 278 amino acids and having a molecular weight of 31 and 138, and is a glycoprotein with four sites of N-glycoside linkage sites.
  • soluble Fas ligand molecules have been shown to induce apoptosis in target cells that express the Fas antigen on the cell surface (Nagata et al., J. Exp. Med., Vol. 179). , p. 873—879, 1 994).
  • the Fas antigen transmits a signal of “death” to the cell, but inactivation of apoptosis-mediated proteins such as the Fas antigen and the Fas ligand causes abnormalities in the cell. It has been suggested that it causes proliferation, while its abnormal activation activates certain inflammatory reactions.
  • mice with a 1 pr (lymphoproliferation) mutation that exhibits autoimmune disease-like symptoms have been found to have mutations in the Fas gene, but also exhibit autoimmune disease-like symptoms. It has been reported that mice with g 1 d (generalized lymphoproliferative disease) mutations have mutations in the Fas ligand itself (Nagata et al., Cell, vol. 76, p. 969-979, 1994).
  • Fas antigen and Fas ligand may cause various diseases.
  • the tat protein derived from HIV the AIDS-causing virus, promotes the expression of Fas ligand and causes apoptosis in T cells expressing the Fas antigen through the interaction of Fas-Fas ligand.
  • Fas-Fas ligand the Fas antigen
  • expression of Fas was observed in HIV-infected T cells. (Kobayashi et al., Proc.
  • Fas expression was observed in viral hepatitis (Hiramatsu et al., Hepatology, vol. 19, p. 1 354- 1359, 1994), it has been reported that expression of Fas is observed in systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA) in diabetes and autoimmune diseases. It can be inferred that it is caused by the Fas ligand that reacts with the as antigen.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • RA rheumatoid arthritis
  • the present inventors have invented and filed a patent application for a mouse monoclonal antibody capable of specifically reacting with a Fas ligand and suppressing (inhibiting) the physiological reaction between Fas and a Fas ligand (Patent Application 1995). No. 303492).
  • the monoclonal antibody can bind to the Fas ligand more strongly than the binding between the Fas and the Fas ligand, it inhibits the physiological reaction of the Fas-Fas ligand even in vivo. was thought to be possible.
  • a monoclonal antibody having such high activity is desirable from the viewpoint of clinical application.
  • a non-human immunoglobulin such as the mouse monoclonal antibody described above, when administered to humans, has the following disadvantages. It has the disadvantages described. In other words, non-human immunoglobulin has a relatively short half-life in the human body, and is administered more frequently than human antibody to maintain a constant blood concentration. Is required. It should be further noted that non-human immunoglobulin contains an amino acid sequence capable of exhibiting antigenicity when administered to humans. Therefore, in the case of frequent administrations, the immune response induced by the administration not only eliminates immunoglobulins to be administered later, but may also cause anaphylactic shock as an extreme result. is there.
  • a complementarity-determining region (hereinafter referred to as CDR) in the variable region (V region) that directly binds to the antigen )
  • CDR complementarity-determining region
  • mouse Fas ligands are TNF ⁇ and TNF /? (Referred to as TNF) to form a trimer structure and exert biological activity in the same manner as above, and a mouse Fas ligand trimer model was created, and the TNF trimer structure and TNF and TNF receptor With reference to the interaction region, the interaction region between the monomers of the mouse Fas ligand and the interaction region between the mouse Fas ligand and the Fas antigen are inferred. However, no proof has been made of this inference.
  • Fas In order to suppress (or inhibit) apoptosis caused by the physiological response of the Fas ligand, any region of the Fas ligand or Fas must be targeted. It remains unclear what to do.
  • the main reason why the activity of humanized immunoglobulin is lower than that of the original mouse immunoglobulin is that the three-dimensional structure of the framework region of the mouse immunoglobulin, which serves as the CDR, and the human immunoglobulin, which serves as the acceptor, is reduced. It is considered that the difference in structure causes a structural change in the transplanted CDR, resulting in a decrease in antigen binding. In order to avoid such a decrease in activity, an improved method of humanization by CDR transplantation is required.
  • the monoclonal antibody specifically reacting with the Fas ligand contained in the invention of the 1995 Patent Application No. 3303492 suppresses (or inhibits) the physiological reaction between the Fas and the Fas ligand. Antibodies with useful activity. However, since the antibody is a mouse immunoglobulin, clinical application to humans is practically impossible from the viewpoints of safety (induction of antigenicity) and efficacy (reduction of half-life). . Disclosure of the invention
  • a primary object of the present invention is to provide a humanized immunoglobulin or an active fragment thereof which specifically reacts with a Fas ligand. It is intended to provide a humanized immunoglobulin capable of suppressing (or inhibiting) a physiological reaction with the immunoglobulin.
  • the interaction region between human Fas and Fas ligand has not been clarified, and modeling of the Fas-Fas ligand complex—the crystal structure analysis etc. has not been performed.
  • the region for effectively suppressing (or inhibiting) apoptosis caused by the physiological response of the Fas ligand has not been determined.
  • Another object of the present invention is to investigate the reactivity of a plurality of anti-Fas ligand monoclonal antibodies having a high apoptosis-suppressing activity and a plurality of Fs ligand (mutated Fas ligand) molecules into which amino acid substitutions have been introduced.
  • Fs ligand mutated Fas ligand
  • FIG. 1 is a diagram showing the nucleic acid and amino acid sequences of the heavy chain variable region of the NOK2 antibody.
  • the underlined region shows the primer used for cloning.
  • FIG. 2 is a diagram showing the nucleic acid and amino acid sequences of the light chain variable region of the NOK2 antibody.
  • the underlined region shows the primer used for cloning.
  • FIG. 3 shows the heavy chain expression plasmid (a) and chimera of chimeric NOK2 antibody.
  • FIG. 4 is a view showing a light chain protein (b) of the N ⁇ K2 antibody.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of examining the recognition of a chimeric NO K2 antibody for a Fs ligand by ELISA.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequences of the heavy chain variable regions (RNOK2VHver11 and RNOK2VHver12) of the NOK2 antibody, SGI antibody, and humanized N0K2 (RNOK2) immunoglobulin.
  • Figure 6 shows the NOK2 antibody, the REI antibody, and the light chain variable region of huVL19 and huVL31 of human-derived immunoglobulin and RNOK2 immunoglobulin.
  • Figure 7 shows the NO K2 antibody, the RE I antibody, and the light chain variable regions of human immunoglobulins huVL19 and huVL31 and RNOK2 immunoglobulin.
  • Figure 8 shows the RNOK 2 immunoglobulin heavy chain variable region (RNOK 2
  • FIG. 4 is a view showing that primers used for preparing genes of VH Ver 11 and RNOK 2 VH ver 12) anneal to the heavy chain variable region of type II RC25 immunoglobulin.
  • Figure 9 shows the heavy chain variable region of RN0K2 immunoglobulin (RNOK2
  • FIG. 3 is a view showing that primers used for preparing genes of VH Ver 11 and RNOK2 VH ver 12) anneal to the heavy chain variable region of type II RC25 immunoglobulin.
  • Figure 10 shows that the primers used to generate the gene for the light chain variable region of RNOK2 immunoglobulin (RNOK2 VLver 1) anneal to the type II NOK2 antibody light chain. It is.
  • Figure 11 shows how the primers used to generate the gene for the light chain variable region of RNOK2 immunoglobulin (RNOK2 VL Ver 1) anneal to the type II NOK2 antibody light chain.
  • FIG. 11 shows how the primers used to generate the gene for the light chain variable region of RNOK2 immunoglobulin (RNOK2 VL Ver 1) anneal to the type II NOK2 antibody light chain.
  • FIG. 12 shows the primers used to generate the genes for the light chain variable regions of RNOK2 immunoglobulin (RNOK2 VL Ver21, RNOK2 VLver 22, RNOK2VL ver 23 and RNOK2 VL ver 24).
  • FIG. 3 is a diagram showing that ⁇ is annealed to the type II NOK2 antibody light chain.
  • Figure 13 shows the primers used to generate the genes for the light chain variable regions of RNOK2 immunoglobulin (RNOK2 VL Ver 21, RNOK 2 VL ver 22, RNOK2 VL ver 23 and RNOK2 VL ver 24).
  • FIG. 2 is a diagram showing a manner in which a mer anneals to a gun-shaped NO K2 antibody light chain.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of an ELISA test for the recognition of each RNOK2 immunoglobulin for a Fs ligand.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of examining the inhibitory activity of each RNOK2 immunoglobulin and mouse NOK2 immunoglobulin on apoptosis that occurs through the Fs ligand and Fas.
  • FIG. 16 is a diagram showing a part of the nucleic acid sequence (upper row) and the amino acid sequence (lower row) of the Fs ligand.
  • the amino acid numbers are according to the literature of Nagata et al. (Nagata et al., Int. Immunology, vol. 6, p. 1567-574, 1999).
  • FIG. 17 shows a part of the results of an ELISA test for the recognition of anti-FLAG antibodies for expressed native and mutant Fas ligands. It is.
  • FIG. 18 is a diagram showing a part of the results obtained by examining the recognition of an anti-Fas ligand antibody (NOK1 antibody) for the expressed native Fs ligand and mutant Fs ligand by ELISA.
  • NOK1 antibody anti-Fas ligand antibody
  • FIG. 19 is a diagram showing the relative recognition ability of each NOK antibody and humanized N0K2 antibody for each mutant Fas ligand.
  • N. D. means not implemented (Not Done).
  • FIG. 20 is a diagram showing the relative recognition ability of each NOK antibody and humanized NOK2 antibody for each mutant Fas ligand. N.D. means not implemented (Not Done).
  • FIG. 21 is a diagram showing the alignment between the amino acid sequence of the Fs ligand and the amino acid sequence of TNFa and TNF.
  • the top row shows the amino acid sequence of the extracellular region of human Fas ligand, which is shown in the literature of Nagata et al. (Nagata et al., Int. Immunology, vol.6, p.1567-1574, 1994).
  • the eye shows the amino acid sequence of the modeled region
  • the third row shows the amino acid sequence of TNF ⁇ (1 TNF)
  • the bottom row shows the amino acid sequence of TNF /? (1 TNR).
  • FIG. 22 shows the amino acids recognized by the NOK1 antibody on two of the Fs ligand trimers by circles. Gray circles indicate amino acids present on the same side, and white circles indicate other amino acids.
  • FIG. 23 shows the amino acids recognized by the NOK2 antibody and the humanized NOK2 antibody on two molecules of the Fas ligand trimer by circles. Gray circles indicate amino acids present on the same side, and white circles indicate other amino acids. The wavy circles indicate amino acids specifically recognized by the humanized NOK2 antibody.
  • Figure 24 shows that the N0K3 antibody was detected on two of the Fas ligand trimers. Amino acids to be identified are indicated by circles. Gray circles indicate amino acids present on the same side, and white circles indicate other amino acids.
  • FIG. 25 is a diagram showing the alignment of the VH region of the NOK2 antibody and the VH region of the 1F0R antibody.
  • the constant region added downstream of the VH region is that of the 1 FOR antibody.
  • FIG. 26 is a diagram showing the alignment of the VL region of the NOK2 antibody and the VL region of the 1TET antibody.
  • the constant region added downstream of the VL region is that of the 1 TET antibody.
  • FIG. 27 shows the amino acids recognized by each NOK antibody and humanized NOK2 antibody, indicated on two molecules of the Fs ligand trimer, by circles. Gray circles indicate amino acids present on the same side, and white circles indicate other amino acids.
  • the circle surrounding the amino acid indicated by the gray circle is a circle with a radius of about 17 angstroms, which is almost the same size as the CDR region of the antibody.
  • FIGS. 29 to 31 are diagrams showing Van der Waals contact models of two molecules of the Fs ligand trimer (shown in white and dark colors, respectively).
  • the recognition amino acid of the N0K1 antibody is shown
  • FIG. 30 the recognition amino acid of the NOK2 antibody and the humanized N0K2 antibody is shown
  • FIG. 31 the recognition amino acid of the N0K3 antibody is shown. Each is indicated by diagonal lines.
  • FIG. 32 and FIG. 33 are schematic views from the side of the recognition region of the NOK2 antibody in the Fas ligand trimer.
  • the upper model is The lower model of the Gand trimer is the Fab portion of the NOK2 antibody, and the middle portion is the complementarity determining region (CDR) of the NOK2 antibody.
  • the CDR of the NOK2 antibody in FIG. 33 has almost the same size as a circle with a radius of about 17 angstroms.
  • Fig. 34 shows a van der Waals contact model similar to Figs. 29-31. The amino acids within the radius of approximately 17 Angstroms shown in Fig. 33 and having an exposed surface of at least 15 square Angstroms are shown. Is shown with diagonal lines.
  • the above-mentioned FR amino acid selected using computer modeling based on such information and the receptor human anti-human antibody together with CDR is used.
  • transplanting the antibody into the body we succeeded in producing a humanized antibody with an activity equal to or higher than that of the original mouse antibody.
  • QUANTAZCHARMm or Mo de 1 er both Morekyu error Simulations (Molecular Simulations Inc.) Co., Ltd.) is possible for the force s interest such as.
  • FR amino acids that contribute to the maintenance of CDR construction are selected.
  • amino acids that directly or indirectly form hydrogen bonds or energy contacts with CDR amino acids are selected by using a calculation program installed in the above software.
  • Amino acids to be transplanted with the CDR are selected from these.
  • amino acids not found in human antibodies that are expected to elicit antigenicity in human organisms In the event that a sequence is generated, it shall not be transplanted.
  • each variable region amino acid in a mouse antibody to that in a human antibody is determined by the classification of Kabat et al. (Sequence 'ob' Proteins .ob 'Immunological Interest. (Sequence of Proteins of Immunological Interest) Fourth Edition, No., 'Brick Health Service, NIH, Washington, DC, 1998. It has become a standard in this field.
  • the present invention has been reached which can provide a humanized immunoglobulin having an activity equal to or higher than that of the original mouse antibody.
  • Fas-Fas ligand complex In addition, the interaction region between human Fas and Fas ligand has not been clarified, and modeling of the Fas-Fas ligand complex and crystal structure analysis have not been performed. It is unclear which region of the Fas ligand or Fas antigen is effective to suppress (or inhibit) apoptosis caused by the physiological response of the Fas ligand.
  • Fas ligand mutant Fas ligand
  • N ⁇ ⁇ K 1 which is a hybridoma described in Japanese Patent Application No. 303492/1995.
  • N0K2, NOK 3 Anti-Fas ligand monoclonal antibodies (hereinafter simply referred to as ⁇ 1, N0K2, NOK3 and NOK4 immunoglobulins (antibodies), respectively) produced by NOK4 and NOK4, respectively.
  • Deposited at the Institute 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan
  • NOK antibodies are sometimes collectively referred to as NOK antibodies.
  • the Fas ligand (hereinafter also referred to as FasL) is a ligand of the Fas antigen which is a cell surface protein that mediates programmed cell death (apoptosis).
  • FasL the Fas ligand
  • mouse Fas ligands have been identified.
  • Fs ligands a wide range of Fs ligands is targeted, and among these, Fs ligands of human and mouse species are particularly preferred. That is, the present invention preferably provides a humanized immunoglobulin which specifically reacts with a ligand of human Fas3 ⁇ 4 and a ligand of mouse Fas3 ⁇ 4, and an active fragment thereof.
  • immunoglobulin refers to a protein consisting of one or more polypeptides that are substantially encoded by an immunoglobulin gene.
  • the immunoglobulin genes of the present invention include katsuno, ', lambda, alpha, gamma, and del. Includes T, Ibushi and Myu constant region genes and myriad immunoglobulin variable region genes.
  • immunoglobulin also includes an active fragment.
  • An active fragment refers to a fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity.
  • chimeric antibody refers to a gene obtained by constructing a light chain gene and a heavy chain gene from immunoglobulin gene fragments belonging to different species, typically by genetic engineering.
  • the variable (V) region gene fragment from mouse monochrome one monoclonal antibody may be linked human constant (C) region fragment, for example, 7 1 or 7 4.
  • C human constant
  • a typical therapeutic chimeric antibody is a hybrid protein consisting of V or antigen binding domain from mouse antibody and C or effector domain from human immunoglobulin. is there.
  • framework region refers to the relatively conserved (ie, other than CDR) immunoglobulin light and heavy chain variable regions among various immunoglobulins in a single species.
  • a "human framework region” is one that is substantially identical (about 85% or more) to the framework regions of naturally occurring human immunoglobulin or to the consensus sequence of some such immunoglobulins. This is the framework area.
  • the term "humanized immunoglobulin” refers to an immunoglobulin containing at least one CDR from a human framework, non-human immunoglobulin, and the constant region present therein is a human immunoglobulin.
  • globulin constant region that is, at least about 85 to 90%, preferably at least 9% of the amino acid sequence constituting the protein. 5% identical.
  • all parts of the humanized immunoglobulin, except possibly the CDRs, are substantially identical to corresponding parts of one or more natural human immunoglobulin sequences.
  • Humanized immunoglobulins have at least three potential advantages over mouse antibodies for therapeutic use in humans.
  • the effector moiety is human, it may interact better with other parts of the human immune system (eg, due to complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Efficient target cell destruction).
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the human immune system does not recognize the framework or C region of humanized immunoglobulin as foreign, and therefore unwanted antibody responses to the immunoglobulin may be entirely foreign mouse antibodies or partially foreign. Less than for some chimeric antibodies.
  • Humanized immunoglobulins have half-lives that are closer to the half-life of naturally occurring human antibodies and are expected to provide smaller or less frequent doses compared to mouse antibodies.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention is not particularly limited as long as it specifically reacts with the Fas ligand, but may be capable of inhibiting (suppressing) the physiological reaction between the Fas ligand and Fas. Particularly preferred.
  • An immunoglobulin that inhibits a physiological reaction as referred to herein is a cell that expresses a Fas ligand or a Fas ligand that has become a soluble form (hereinafter referred to as sFs ligand or soluble Fas ligand).
  • the Fas ligand May bind to cells expressing Fas To give a signal to kill cells expressing Fas by apoptosis, and specifically binds to the binding site of the Fas ligand that binds to Fas, and the Fas ligand cannot bind to Fas
  • an immunoglobulin that can function as That is, if there is an immunoglobulin that inhibits the physiological reaction between the Fas ligand and Fas, the cells expressing the Fas ligand or the cells expressing the Fas ligand by the sFas ligand are killed. It cannot be done.
  • the immunoglobulin at this time is more preferably an immunoglobulin having a stronger binding force than the binding force between the Fas ligand and Fas.
  • Fas-Ig a chimeric molecule in which Fas and IgG Fc are bound
  • This Fas-Ig can bind to the Fas ligand with the same binding force as the binding force between the Fas ligand and Fas in the living body. Therefore, if the binding between the Fas ligand and Fas can be inhibited at a lower concentration than the immunoglobulin, Fas, or Fas-Ig chimeric molecule against Fas ligant, in practice, various in vivo The action by the Fas ligand can be effectively inhibited.
  • the humanized immunoglobulin specifically reacting with the human Fas ligand of the present invention includes, for example, the invention of Patent Application No. 303492 in 1995, and Accession No. FERM BP-5050 (Hypridoroma N0K2) deposited on March 20 and humanized as a donor antibody, NOK2 antibody produced from NOK2 antibody, RNOK201, RNOK202 and RNOK203 (Hereinafter, humanized NOK2 antibodies are referred to as humanized NOK2 antibodies, humanized NOK2 immunoglobulins, RNOK2 antibodies, or RNOK2 immunoglobulins. Sometimes) .
  • a step of humanizing the NOK2 antibody will be outlined below, but the humanized immunoglobulin specifically reacting with the Fas ligand is not particularly limited thereto. Absent.
  • V variable
  • the V region gene can be cloned by ordinary genetic engineering techniques.
  • a V region gene can be obtained from the chromosomal DNA of the cell according to a conventional method (see, for example, T. Maniatis, "Molecular Cloning 7", Cold Spring Harbor 'Laboratory 1, 19982).
  • CDNA is synthesized by the method of cloning, or cDNA is synthesized by the conventional method using the mRNA of the cell as a material (for example, DNA Cloning vol. 1, IRL Press, 1985, edited by DM Glover).
  • the V region of NOK2 antibody is inherited from the hybridoma producing NOK2 antibody.
  • the nucleotide and amino acid sequences can be determined (see FIGS. 1 and 2).
  • the chimeric NOK2 antibody gene can be prepared by ligating the thus isolated V region gene fragment upstream of the human immunoglobulin constant region.
  • ELISA confirmed that the chimeric NOK2 antibody bound to the Fas ligand molecule in a concentration-dependent manner.
  • the immunoglobulin variable region gene cloned by the present inventors showed anti-Fas ligand activity. It is confirmed that it is responsible (see Figure 4).
  • Winter et al. Reported on mouse immunoglobulin reslicing (Winter et al., Nature, vol. 332, p. 323-327, 1988) and Chiyosha et al. In reports (Chiyoshi et al., J.
  • CDRs are located near CDRs (primary sequences or tertiary structures).
  • FR amino acids amino acids in the framework (hereinafter also referred to as FR) region which contributes to the maintenance of deprivation and, consequently, the activity of immunoglobulin is shown.
  • amino acids in the FR region that are suggested to contribute to the maintenance of the three-dimensional structure of the CDR and thus to the activity of immunoglobulin are also transplanted together with the CDR.
  • the FR amino acids to be transplanted were calculated from the results of computer modeling of the N0K2 antibody, CDR amino acids), or those that have been suggested to interact directly or indirectly.
  • the three-dimensional structure of the NOK2 antibody can be estimated by modeling using software QUANTAZCHARMm or Mode 1 er (both manufactured by Molecular 'Simulations Inc.) running on silicon graphics.
  • QUANTAZCHARMm or Mode 1 er both manufactured by Molecular 'Simulations Inc.
  • VH H chain variable region
  • VL L chain variable region registered in the Brookhaven Protein Data Bank
  • 1 FOR VH and PDB ID: 1 TET VL are used as the 3D structure ⁇ , and the molecular design software
  • QUANTAZCHARMm or Moder according to the instructions for use, but is not limited to this type II antibody variable region, but can be used for antibodies with homology to other NOK2 antibody variable regions. If the next structure data is available, it can be implemented using it. Also, the molecular design software is not limited to QUANT AZCHARMm or Mode 1 er, but any other molecular design software that can handle general proteins can be implemented.
  • the amino acid group (Group 1) in the FR region that makes energy contact with the CDRs of the H chain and L chain of the N0K2 antibody is selected using the built-in program, and the energy is further assigned to them.
  • Energy contacts include so-called electrostatic interactions and van der Waalska.
  • the amino acid to be grafted on the FR of the variable region of human immunoglobulin together with the CDR amino acid is selected from the first group and the second group.
  • an information retrieval software developed at the National Center for Biotechnology Information (NCB I).
  • NCB I National Center for Biotechnology Information
  • the amino acid sequences of the CDRs of the NO K2 antibody are as follows: heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, in the sequence listing, and light chain CDR1, CDR2, and CDR 3 is described in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 in the sequence listing, respectively. Note that the definition of the ranges of FR and CDR in the present invention all conforms to the classification of Kabat et al.
  • the human immunoglobulin variable region amino acid sequence to be transplanted has high homology to the variable region amino acid sequence of mouse immunoglobulin to be humanized.
  • the amino acid sequence of the framework region of the acceptor human immunoglobulin has a homology of at least 60% or more empirically with the amino acid sequence of the framework region of the donor antibody (mouse immunoglobulin). It is desired.
  • the database is A human immunoglobulin with a high homology is selected and used for a mouse immunoglobulin to be transformed into a mouse type.
  • the CDR of the NOK2 antibody can be transplanted into the variable region of human immunoglobulin.
  • the CDR of the VH region (heavy chain variable region) of the NOK2 antibody was converted to the SGI (SEQ ID NO: 7: MRC Collaborative Center), a VH region having the FR (framework) region of human subgroup II. (Donated by Dr. Bendick of MRC Collaborative Center)
  • CDR of VL region (light chain variable region) of NOK2 antibody is based on the previously reported human ⁇ FR region of chain. Cloned from REI (W. Palm et al., Physiol. Chem., Vol. 356, p. 167, 1975), which is a VL region, and a cD c library derived from normal human peripheral blood lymphocytes.
  • VL region (huVL-19: SEQ ID NO: 8 and huVL-31: SEQ ID NO: 9) having the FR region of the chain is transplanted.
  • the actual amino acid transplantation is a humanized anti-HIV immunoglobulin for VH.
  • VH gene of RC25 antibody (patent international publication W094 / 20632)
  • VL is carried out at the gene level by PCR mutagenesis using the VL gene of chimeric N ⁇ K2 obtained as described above for type I and introducing mutations by PCR.
  • the genes coding for the H chain and L chain of the typified NOK2 antibody were prepared by combining two types of H chain and 5 types of L chain so that 10 types of humanized NOK2 antibodies could be prepared by combining them.
  • Kinds were made.
  • the immunoglobulins of the present invention can be readily produced by a variety of recombinant DNA techniques, and include transfected cells, preferably immortalized eukaryotic cells. For example, it may be ultimately expressed in myeloma or hybridoma cells.
  • Humanization license A polynucleotide comprising a first sequence encoding an epidermal globulin framework region and a second set of sequences encoding a desired immunoglobulin complementarity-determining region may be synthesized or with appropriate cDNA and genomic DNA. It is prepared by combining fragments.
  • the genes encoding the H chain and L chain for humanized antibody construction prepared as described above are expressed in a host after operably linking the sequences to expression control sequences.
  • These expression vectors are typically replicable in the host as episomes or as an integral part of the host chromosome DNA.
  • the expression vector contains a selectable marker, such as tetracycline resistance, G418 resistance, mycophenolic acid resistance, or HSV-tk, and allows the detection of cells transformed with the desired DNA sequence. I do.
  • E. coli is one prokaryotic host particularly useful for cloning the DNA sequences of the present invention.
  • Bacillus such as Bacillus subtilis and other Enterobacteriaceae, such as Salmonella, Serratia, and various Pseudomonas species are used as microbial hosts.
  • Bacillus subtilis and other Enterobacteriaceae such as Salmonella, Serratia, and various Pseudomonas species are used as microbial hosts.
  • prokaryotic hosts one can also construct expression vectors, which typically contain expression control sequences compatible with the host cell.
  • any number of easy preparative one scan promoter system Toributofan (trp) promoter one system, / 5-lactamase promoter one system or be present promoter system force s from scan phage Yo
  • the promoter optionally has an ribosome binding site sequence and the like, together with an operator sequence, to regulate expression and to initiate and complete transcription and translation.
  • -Other microorganisms such as yeast as eukaryotic hosts
  • Saccharomyces has expression control sequences, such as 3-phosphoglycerate It is a preferred host with a promoter containing a kinase or other glycolytic enzyme and an appropriate vector having an origin of replication, terminal sequences and the desired analogs.
  • Insect cell cultures can also be used to produce the humanized immunoglobulins of the invention, typically using a baculovirus-based expression system.
  • the humanized immunoglobulin can be converted to the humanized form according to the method reported by Zu Petlitz et al. (ZuPutlitz. J. et al., BioZ Technology, vol. 8, p. 65 1-654, 199 0). It can also be produced by expressing a polynucleotide sequence encoding a humanized immunoglobulin.
  • mammalian cell cultures are also suitably used to express and produce the humanized immunoglobulins of the invention.
  • a number of host cell lines capable of secreting complete immunoglobulin have been developed in the art, including CHO cell lines, various COS cell lines, He1a cells, Preferably, myeloma cell lines and the like, or transformed B cells or hybridomas are exemplified.
  • Expression vectors for these cells contain expression control sequences, such as an origin of replication, a promoter, an enhancer, and necessary processing information sites such as a ribosome binding site, an RNA splicing site, a polyadenylation site, and a transcription terminator sequence.
  • Preferred expression control sequences are enhancers and promoters derived from immunoglobulin genes, SV40, adenovirus, paciperoma virus, cytomegalovirus, chicken / actin gene, and the like.
  • the genes encoding the H chain and L chain of the humanized N0K2 antibody constructed as described above are each a human immunoglobulin constant region gene (H chain: C , L chain: C, enhancer derived from cytomegalovirus, promoter of chicken / actin gene, promoter
  • the vector is ligated to an expression vector containing a splicer acceptor site of the glycine gene and a gene (H chain: neor, L chain: dhfr) as a drug resistance matrix, and the vector is used as a host cell.
  • the cells are transferred into host cells by well-known methods with modifications depending on the type of the cells. For example, calcium chloride transfection is usually used for prokaryotic cells, while transduction or electroporation with calcium phosphate treatment, lipofection, biolistics, virus, etc. is performed on other cells. Used.
  • the complete immunoglobulins of the invention can be prepared according to standard methods in the art. Purified. The method includes ammonium sulfate precipitation, various ion exchange chromatography, affinity column chromatography, and the like.
  • substantially pure immunoglobulin of at least about 90-95% homogeneity is preferred, and 98-99% or more homogeneity is preferred.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention is capable of causing apoptosis induced by soluble Fas ligand on Fas-expressing cells when the immunoglobulin concentration is in a range of 0.06 g / m 1 (effective effective temperature) or more. It can be suppressed with an apoptosis suppression rate of 90% or more.
  • the apoptosis suppression rate is defined as a soluble Fas ligand prepared from the culture supernatant of a cell transfected with a Fas ligand as a single effector molecule, while a cell transfected with a Fas gene as a target cell.
  • the two cells are reacted in a 96-well plate in a 1001 reaction system, and the viability of the target cells after 16 hours is measured using a viable cell number detection reagent. In a damage response test, it means the survival rate of target cells when immunoglobulin is added.
  • the apoptosis-inhibiting activity of the humanized immunoglobulin of the present invention is higher than when the same concentration of the mouse immunoglobulin, which is the original donor antibody, is used.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention was considered. Clearly, this is a rare success.
  • the activity of the humanized immunoglobulin of the present invention for suppressing abotosis is higher than that of the Fas-Ig chimeric molecule.
  • a mouse antibody serving as a donor antibody for producing the humanized antibody of the present invention has an antibody concentration of 0.01 to 8 g / m1 ( (Effective concentration) at a higher concentration than the Fas-Ig chimera molecule at the same concentration.
  • a humanized immunoglobulin of Honki Akira having activity equal to or higher than that of the mouse antibody was 0.01 to 8 g /
  • an antibody concentration (effective concentration) of ml it is apparent that the antibody has an apoptosis inhibitory activity equal to or higher than that of the Fas-Ig chimeric molecule.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention is useful not only for immunochemical research but also for immunotherapy and diagnosis. To achieve the above object, it is not always necessary to use the entire immunoglobulin molecule, as long as they have the activity, can be used a part of the molecule, in some cases even better force? Preferred that. This is easily understood by those skilled in the art. Accordingly, the present invention also includes active fragments of anti-Fas ligand immunoglobulin. Antibodies are homogeneous immunoglobulins that recognize specific antigenic substances.
  • the active fragment refers to a fragment of immunoglobulin having antigen-antibody reaction activity, and specifically includes F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv, and recombinant Fv form.
  • the F (ab ') 2 fragment is one of the fragments obtained by digesting immunoglobulin IgG with pepsin.
  • IgG is digested with pepsin near pH 4.0, it is cleaved at the hinge of the H chain to generate a fragment having a molecular weight of about 100,000. This cleavage occurs C-terminal to the disulfide bond between the heavy chains. Since this fragment has two antigen-binding sites, it can bind to an antigen and cause a sedimentation reaction or an agglutination reaction.
  • F ab 'fragment is F
  • the Fab fragment (antigen-binding fragment) is one of the fragments obtained by papain digestion of IgG. Papain digestion of IgG in the presence of cysteine The H chain is cleaved N-terminal to the disulfide bond between the H chains in the dipart to generate two Fabs and one Fc (crystallizable fragment).
  • the Fab fragment is a fragment having a molecular weight of about 45,000 in which an Fd fragment (VH domain + CH1 domain) corresponding to about half of the N-terminal side of the H chain and a L chain are disulfide bonded.
  • the Fab fragment has one antigen-binding site.
  • An Fv fragment is an antigen-binding fragment comprising an H-chain variable region (VH) and an L-chain variable region (VL) linked by a non-coupling bond.
  • Recombinant Fvs are prepared by sequencing DNA from hybridomas that produce immunoglobulins, determining the nucleotide sequences encoding VH and LH, and then incorporating these DNA fragments into vectors.
  • VL-linker-VH can be obtained by producing a monovalent antibody active fragment having the structure of VH. In IgG, Fab or F (ab ') 2, VH and LH are connected by an S--S bond.
  • a linker is inserted between VH and LH. The same three-dimensional structure as in the state of S—S bond is obtained. This fragment is sometimes referred to simply as FV, and is also called sc Fv (—main chain Fv).
  • the recombinant Fv can also be expressed by a microorganism such as Escherichia coli or bacteriophage.
  • active fragments can be used as a new complex by binding to a substance such as albumin or polyethylene glycol if necessary.
  • a substance such as albumin or polyethylene glycol
  • Such composites are most likely to exhibit their effects in vivo without being decomposed for a long time.
  • Methods for adding substances such as albumin and polyethylene glycol to the active fragment are described, for example, in Antibodies, A. Lab. Laboratory Manual), Cold Spring Hubber and Laboratory, 1988.
  • a bivalent reactive reagent such as SPDP (manufactured by Pharmacia) allows the active fragment to be easily bound to albumin or the like.
  • the immunoglobulins of the invention and their pharmaceutical compositions are particularly useful for parenteral administration, i.e., subcutaneous, intramuscular or intravenous administration, and are usually dissolved in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier.
  • an acceptable carrier preferably an aqueous carrier.
  • aqueous carriers for example, water, buffers, phosphate buffered saline (PBS), 0.4% saline, 0.3% glycine, human albumin solutions and the like can be used. These solutions are sterile and generally free of particulate matter.
  • PBS phosphate buffered saline
  • glycine 0.3% glycine
  • human albumin solutions and the like
  • the composition may, if desired, be pharmaceutically acceptable auxiliary substances, such as pH adjusting and buffering agents, for example sodium phosphate, sodium chloride, sodium chloride, potassium chloride, chloride, in order to approximate physiological conditions. It may include calcium and sodium citrate.
  • concentration of immunoglobulin in these preparations can be varied over a wide range, ie from about 1% to 20% by weight, mainly based on the volume, viscosity etc., according to the particular mode of administration chosen. Selected.
  • the immunoglobulins of the invention may be frozen or lyophilized for storage, if necessary, and reconstituted in a suitable lysate prior to use.
  • Fas ligands By using a plurality of mutant Fas ligands in which an amino acid substitution is introduced into a part of the amino acid sequence of the Fas ligand, it is possible to identify a recognition region on the Fas ligand to which an anti-Fas ligand antibody binds. .
  • NOK antibody and humanized NOK2 antibody widely bind to the amino acid sequence contained in the region from Arg at position 198 to Met at position 238 of Fas ligand. Indicated.
  • NOKl, NOK2, and NOK4 antibodies the results of mapping of the recognition region using synthetic peptides also show that the N0K1, N0K2, and NOK4 antibodies recognize and bind the antigen in the above-described region of the Fas ligand. It was once again suggested that chromosome contains an amino acid that plays an important role.
  • the above-mentioned NOK antibody is a monoclonal antibody obtained by immunizing mice with Fas ligand-expressing cells (described in the specification of Japanese Patent Application No. 303492, detailed description of the invention, and Example 1).
  • the above-mentioned NOK antibody and humanized NOK2 antibody are antibodies having a strong inhibitory activity on apoptosis induced by Fas-expressing cells through the interaction of Fas-Fas ligand (Hirano et al. Patent Application No. 303492, Detailed Description of the Invention, Example 1 and 2 and described in the present patent application, specification, detailed description of the invention, and Example 4).
  • the NOK antibody is the first anti-Fas ligand monoclonal antibody with high apoptosis-suppressing activity obtained by immunizing a natively formed Fas ligand.
  • the amino acid sequences of CDRs (complementarity determining regions) of these monoclonal antibodies are different from each other, and the classes and subclasses of the antibodies are also different, that is, they are completely independent antibodies.
  • these completely distinct antibody recognition regions are located in a wide region formed by the amino acid sequence from the 198th Arg to the 238th Met amino acid sequence of the Fas ligand. It can be concluded that an anti-Fas ligand antibody having a high apoptosis-inhibiting activity generally recognizes the amino acid contained in the above region as a recognition region.
  • the above-mentioned region is a region existing in the Fs ligand molecule and capable of eliciting an anti-Fas ligand antibody having high apoptosis inhibitory activity.
  • the above region is important for the Fas ligand to exhibit apoptosis-inducing activity, suggesting that a substance that can recognize and bind to this region can exhibit apoptosis-inhibitory activity. .
  • F as ligand molecule monomer of modeling one Bun proteinase fin data bank (Brookhaven Protein Data Bank) to Brook has been registered in (PDB), F homology to as ligand force s high TNF a (PDB ID : 1 TNF) and TNF /? (PDB ID: 1 TNR) Type III can be performed using the molecular design software, Model 1er (Molecular Simulations), according to the instruction manual.
  • the Fs ligand trimer model was generated using the molecular design software QUANTA, CHAR Mm (Molecular Simulations) and TNF.
  • the above-mentioned Fas ligand monomer model can be constructed by superimposing (superimposing) each of the TNF monomer segments on the atomic coordinates of PDB ID: 1 TNF, which is a trimer of TNF.
  • TNF is also a type II protein. And /? Were used, but are not limited to TNF ⁇ and TNF as long as they are one of the TNF families.
  • each of the above-mentioned antibodies formed a Fas ligand trimer force . It has been revealed that it binds to a wide range of domains spanning two molecules of the Fas ligand that appears for the first time. In the context of the relationship between Fa ligands and anti-Fas ligand antibodies, such findings are novel and unprecedented.
  • the antigen-binding region of an antibody is a region consisting of six sites called CDRs (complementarity determining regions).
  • CDRs complementarity determining regions
  • the size of the region varies depending on the antigen to which it binds, but is approximately 700 for normal large protein antigens.
  • Square Angstrom Supervised by Takehiko Sasazuki Osamu, Immunobiology, Nankodo, pp. 128, 1995
  • Square Angstrom Supervised by Takehiko Sasazuki Osamu, Immunobiology, Nankodo, pp. 128, 1995
  • Square Angstrom Supervised by Takehiko Sasazuki Osamu, Immunobiology, Nankodo, pp. 128, 1995
  • Square Angstrom Supervised by Takehiko Sasazuki Osamu, Immunobiology, Nankodo, pp. 128, 1995
  • Square Angstrom Supervised by Takehiko Sasazuki Osamu, Immunobiology,
  • the Fas ligand molecule is normally present on the cell surface as a transmembrane protein of about 40 kD, but its extracellular domain can be processed to exist as a free molecule of about 27 kD. .
  • the ability of the Fs ligand monomer to form a Fs ligand trimer through trimolecular association ? It is said that you can do it.
  • antigens and antibodies are in full surface-to-face contact with each other using the CDR regions fully (supervised by Takehiko Sasazuki, Immunobiology, Nankodo, p. 128, 1 995).
  • the region related to the suppression of apoptosis activity on the Fas ligand trimer revealed by the present invention can be expressed as a surface.
  • the surface is not on a straight line.
  • the surface of the antigen present in the Fas ligand trimer model can be calculated.
  • the amino acids required to define such a plane can be set as three amino acids arbitrarily selected from the amino acids recognized by each antibody.
  • One of the two Fas ligand molecules is number 200 G1n, and the other is a number 203 Asn and a number 220 Gln on the other Fas ligand molecule.
  • the plane defined by the combination of the coordinates of the carbon (Co) atom at the a-position of each of these amino acids can cover the area plane composed of the recognition amino acid of each antibody.
  • the surface that comes into contact with the actual antibody or the surface where the atoms of the antibody pass toward the Fas ligand trimer The each C.
  • the length of the side chain of the amino acid residue and a more general van der Waals contact cut-off (Cu toff) value of about 4.1 angstroms It is considered that the surface is structured as follows.
  • the size of the CDR region of the anti-Fas ligand antibody makes it possible to identify the amino acids that constitute the region associated with suppression of apoptosis activity on the Fs ligand trimer. is there.
  • the size of the CDR region of the anti-Fas ligand antibody is considered to be not significantly different from that of a general antibody from the length of the amino acid sequence of its variable region.
  • the above-described three-dimensional structural model of the N0K2 antibody was used as a representative of the anti-Fas ligand antibody. Since the number of amino acids in the region is not significantly different between each N0K antibody and humanized N0K2 antibody, either antibody may be used.
  • the measurement of the size of the CDR region is not limited to these antibodies.
  • a trimer amino acid can interact with the amino acid in the CDR region of the anti-Fas ligand antibody.
  • Anti Amino acids capable of interacting with the CDR region amino acids of the Fas ligand antibody are all potential amino acids within this circle and exposed on the Fas ligand trimer, s , 15 sq. Angstroms It is desirable to select it as the surface amino acid of the Fas ligand trimer having the exposed surface area of the above amino acid residues.
  • the preferred amino acids are the 153 Ser, 166 Tyr, 168 Ile, 198 Arg, 199 Gly, and 200 of one of the two adjacent Fas ligand molecules.
  • Examples include the amino acids 262 Ser, 263 Glu, 264 and 6 !, and 265 Ser. That is, interacting with the amino acids contained in these regions on the Fas ligand trimer is important for a protein, a peptide, and preferably an antibody or the like having a high apoptosis inhibitory activity. .
  • the substance exhibiting the apoptosis-suppressing activity of the present invention includes, in addition to the humanized immunoglobulin which specifically reacts with the Fas ligand, the domain, region or region thereof important for the apoptosis-suppressing activity on the aforementioned Fas ligand.
  • any substance capable of specifically recognizing and reacting with amino acids It may be.
  • a substance that recognizes and binds to a specific amino acid on a protein molecule, such as immunoglobulin is preferable.
  • a receptor derived from immunoglobulin or a fragment thereof, or an improved receptor capable of recognizing the above-mentioned regions is preferred.
  • Preferable substances include variants, enzymes that recognize and react with specific amino acids, and the like. Since these protein substances can be produced by genetic recombination technology, they can also be defined as recombinant proteins.
  • synthetic peptides based on amino acid sequences derived from such proteinaceous substances, and peptide libraries having random sequences such as phage display systems are important for apoptosis-inhibitory activity on Fas ligand.
  • a peptide with an entirely new sequence obtained by screening based on the recognition ability of a domain, region or its amino acid as an index, and a synthetic peptide not found in nature based on those peptides
  • the identified peptide-like substances are also candidates for recognition substances.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention which has an activity of specifically reacting with a Fas ligand and suppressing the physiological response, is a therapeutic agent for those diseases.
  • GVHD bone marrow transplantation
  • SLE fulminant hepatitis
  • RA autoimmune diseases
  • the region required for scavenging the apoptosis-inducing activity on the Fas ligand revealed by the present invention is also highly important as a region for inducing an anti-Fas ligand antibody having a high apoptosis-suppressing activity. .
  • This finding provides important information for designing various other apoptosis-inhibiting molecules. In other words, based on the above findings, it is possible to specifically react against the amino acids contained in the above region. In response, recombinant proteins and peptides that suppress apoptosis can be produced and applied to new therapeutic agents or clinical diagnostic agents.
  • a cDNA prepared from human killer T cells expressing a Fas ligand by a conventional method was type II, reported by Nagata et al. (Nagata et al., Cell, vol.75, p.1169—1178) PCR was performed using primers prepared based on the method described in US Pat.
  • the amplified gene is ligated to the expression vector BCMGSNeo (Ichi Karasuyama, Genetic Handbook for Experimental Medicine, Yodosha, p. 297-299, 19992) using the restriction enzyme cleavage site added to the primer.
  • BCMGSNeo Ichi Karasuyama, Genetic Handbook for Experimental Medicine, Yodosha, p. 297-299, 19992
  • a Fas ligand expression plasmid was prepared.
  • the expression plasmid, F the as ligand expressing CO S cells force?
  • the immunoglobulin present in the culture supernatant obtained by culturing each clone is screened by measuring the apoptosis inhibitory activity described below, and reacts specifically with the Fas ligand.
  • Hypri-doma producing monoclonal antibody NOK2 (Hypri-doma NO K 2 with accession number FERM BP-5045, deposited at the National Institute of Bioscience and Biotechnology).
  • the mouse immunoglobulin variable (V) region gene was isolated as follows. First, total RNA was extracted from NOK2-producing hybridoma cells using the RNA extraction reagent Isogen (trade name) manufactured by Futsubone Gene. The method followed the protocol attached to the kit. The hybridoma producing NOK2 antibody is the same as FERM BP-5045 deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Next, a STRATAGENE polystyrene was extracted from the extracted total RNA.
  • a messenger RNA (mRNA) was prepared using a quick mRNA isolation (POLY (A) QUIK mRNA I SOLATI ON) kit (trade name). The method followed the protocol attached to the kit. Subsequently, the mRNA was converted into a single-strand cDNA using the First Strand cDNA Synthesis Kit (trade name) manufactured by Pharmasia Biotech. . The primer uses the oligo (dT) primer attached to the kit, and the method is as follows. Followinged the protocol. The single-strand cDNA obtained in this manner was type III, and the nucleic acid base sequences of the V region and J region (sequence of proteins-proteins.
  • PCR was performed using a kit manufactured by Perkin Elmer Co., Ltd. according to the attached protocol. PCR conditions were performed at 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes for 35 cycles. After PCR, the obtained DNA fragment was cloned into pCRII vector (trade name) manufactured by Invitrogen. The method followed the attached protocol.
  • a mouse-human chimeric antibody was prepared to confirm whether the isolated N0K2 antibody V region gene was indeed a gene encoding the V region responsible for anti-Fas ligand activity.
  • expression vectors containing the chicken actin gene promoter and the heron /?-Globin gene splicing receptor sequence and the cytomegalovirus-derived enhancer yuichi pCAG— / using c and p C AG- 7 1.
  • Patent application WO 94/20632 discloses a human immunoglobulin derived from RHC25 plasmid, which is a light chain expression plasmid, of RC25 which is a humanized anti-HIV neutralizing monoclonal antibody.
  • RHC25 plasmid which is a light chain expression plasmid, of RC25 which is a humanized anti-HIV neutralizing monoclonal antibody.
  • Linkage between the Enhansa of tomegalovirus (CMV) and the promoter of the chicken / 3 -actin gene and the spliced receptor of the / 3 / globin gene of the egret by conventional genetic engineering techniques. so That.
  • CMV tomegalovirus
  • the promoter of the chicken / 3 -actin gene and the spliced receptor of the / 3 / globin gene of the egret by conventional genetic engineering techniques. so That.
  • One-globin gene of the vector one plasmid H ind III site force s human A BamHI site is added upstream of the immunoglobulin
  • pCAG-71 is a human immunoglobulin derived from HCMV-VH 0.5 /?-1 plasmid described in the literature (Maeda et al., Hum. Antibod. Hybridoraas, vol. 2, p124-134, 1991). 1 constant region gene and polyadenylation site, neor gene and SV40 promoter as selection markers in eukaryotic cells derived from pAd.RE. neoplasm described in JP-A-2-5890.
  • the HindIII site has a BamHI site added upstream of the human immunoglobuliner 1 constant region gene.
  • plasmid DNAs CNOK2H and CNOK2L described above were purified from CHO-DG44 cells (Chasin, LA, et al., Et al. Genet., Vol. 12, p. 555-566, 1986). The method basically followed the protocol attached to the Lipfect ACE. Briefly, first, 1 ⁇ g of both plasmid DNAs prepared using a kit manufactured by QIAGEN was linearized with a restriction enzyme ⁇ VuI, and mixed with Lip0fect ACE.
  • the transformed cells thus obtained were subcultured and expanded in the above-mentioned medium, and when they reached confluence in a 75 cm2 culture flask (manufactured by CORNING), 20 ml of AS The medium was switched to F medium (trade name) (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.), and cultured under conditions of 37T :, 5% C% 2 for 7 days, and the supernatant was recovered.
  • F medium trade name
  • the plate was washed three times with 0.01M PBS containing Tween 20. Subsequently, PBS containing 1% BSA was added in a 100/1 well and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After washing again with 0.01 M PBS containing 0.05% Tween 20 three times, the above-mentioned culture supernatant concentrate was added at 5 O1 / Pell, and incubated at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the plate was washed three times with 0.05 M Tween 20 containing 0.05% Tween 20, and an HRP-labeled anti-human Ig—C ⁇ antibody of a secondary antibody (Southern's Biotechnology Associato (Southern)
  • RC25 antibody As a standard human IgG, a purified product (purity 98%) of RC25 antibody (patent international publication WO94 / 20632) which is an anti-HIV neutralizing monoclonal antibody having the same Fc and CK as the chimeric NOK2 antibody % Or more).
  • the method from the isolation of the Fas ligand gene to the production of the cells expressing the Fas ligand and the preparation of the soluble Fas ligand molecule is the same as the method described in Japanese Patent Application No. 303492, 1995.
  • the outline is described below.
  • cDNA was prepared from human killer T cells expressing human Fas ligand based on mRNA extracted by a conventional method.
  • the primers (5, side) described in Nagata et al. (Osada et al., Int. Immunol., Vol. 6, No. 10, p. 1567-154, 194) are described.
  • PCR was performed using the above cDNA as a type II, and human F The as-ligand gene was obtained.
  • This human Fas ligand gene was transferred to the expression vector BCMGSNeo (Ichi Karasuyama, Handbook of Genetic Engineering, Yodosha, p.29-29) at the Xh0I site and the N0tI site. 9, 1992) to obtain a human Fas ligand expression plasmid (human MG ligand BCMG SNeo).
  • this plasmid was amplified and recovered in Escherichia coli by a conventional method, and then subjected to the DEAE-dextran method (Experimental Medicine Separate Biomanual Series 4, Gene Transfer and Expression Analysis, Yodosha, p. 16- 22, 1994), and introduced into COS cells (ATCC CRL 1.650) to obtain COS cells expressing Fas ligand.
  • the Fas ligand-expressing C0S cells were cultured in a 10% FCS-DME medium, and the Fas ligand molecules released in the culture supernatant were subjected to the patent application No. 0334992 in 1995.
  • the solution was sterilized by filtration through a 45 ⁇ m filter, and this was used as a soluble Fas ligand molecule. Purification of the Fas ligand was confirmed by SDS-PAGE as the detection of a single band. The concentration of the Fas ligand was determined based on the absorbance at a wavelength of 280 nm.
  • PBS containing 1% BSA was added at 1001 nowell, and incubated at 37 ° C for 2 hours. Again, after washing three times with 0.01 MPBS containing 0.05% Tween 20, the above-described culture supernatant concentrate (prepared with 114) was added at 50 1 / Pel, and incubated at 37 for 2 hours. After that, the plate was washed three times with 0.01M PBS containing 0.05% Tween 20, and HRP-labeled anti-human Ig-C ⁇ antibody (manufactured by Sothan Biotechnology Inc.) as a secondary antibody was added to 0.1% PBS. A 5000-fold dilution with PBS containing 1% BSA was added at 50 1 / well.
  • CDRs complementarity determining regions; SEQ ID NOs: 1 to 6
  • SEQ ID NOs: 1 to 6 complementarity determining regions
  • the method followed the method for producing humanized immunoglobulin (JP-A-4-11095).
  • the CDR of the VH region of NOK2 antibody is transplanted to SGI (donated by Dr. Bendick of the MRC Collaborative Center in the UK), a VH region with the FR (framework) region of human subgroup II. did.
  • the CDR of the VL region of the NOK2 antibody is based on the previously reported REI, a VL region having the FR region of the human ⁇ chain (Pammu et al., Physiol. Chem., Vol. 356, p. 167, 1975). ), And cloned from a cDNA library derived from a normal human peripheral blood lymphocyte, and transplanted into VL regions (huVL-19 and huVL-31) having the FR region of the chain.
  • a putative three-dimensional structure of the NOK2 antibody was constructed by computer modeling. Specifically, a homologous search with the Brookhaven Protein Data Bank (PDB) was performed based on the amino acid sequences of the variable regions of the N0K2 antibody heavy and light chains, and ⁇ The heavy chain variable region (PDB ID: 1 FOR) and the positive chain variable region (PDB ID: 1 TET) of the antibody to be the template were selected. Next, the software QUANT AZ that runs on silicon graphics
  • Modeling was performed using CHARMm (Molecular 'Simulations').
  • the modeling process consists of 1) copying the amino acid sequence of the N0K2 antibody to the atomic coordinates of the type III variable region amino acid, and 2) calculating the energy minimization (maximum gradient). Oblique method), 3) Cooling from 300 K to 0 K in 2,400 steps, 4) Energy minimization calculation (maximum gradient method), 5) Heating from 0 0 to 300 7, in 7,500 steps 6) 30,000 steps (equivalent to 30 ps) of equilibrium; and 7) 20,000 steps (equivalent to 20 ps) of simulation.
  • CHARMm Molecular 'Simulations'
  • the amino acid group (Group 1) in the FR region that makes energy contact with the CDRs of the ⁇ chain and the L chain is selected, and the energy contact is made to them.
  • Amino acids in the FR region (Group 2) were selected.
  • the energy contact here includes so-called electrostatic interaction and van der Waals force.
  • the initial settings of the above program were adopted.
  • the FR amino acids selected in four or more species are referred to as CDR amino acids as FR amino acids that contribute to the maintenance of the CDR steric structure.
  • RNAOK 2 VH erll SEQ ID NO: 18
  • RNOK 2 VH Ver 12 SEQ ID NO: 19
  • humanized VL hu VL—19 and hu VL-DNA obtained from the RNOK 2 VL verl (SEQ ID NO: 20)
  • cDNA library were transplanted into the REI of the human immunoglobulin VL region. as porting to 3 0, stomach a certain amino acids in the FR 1 made a 2 amino acid mosquitoes four different types of variator one Deployment (RNOK 2 VL V er 2 1 :?
  • Figs. The NOK2 antibody and the human immunoglobulin to be transplanted and the VH and VL amino acid sequences of the respective humanized NOK2 antibodies to be constructed are shown in Figs. Ami Uppercase letters in the noic acid sequence are common to the N0K2 antibody and the transplanted human antibody, and lowercase letters are different amino acids. The amino acids boxed are FR amino acids selected by the method described in the previous section, and are to be transplanted into human immunoglobulin together with CDR amino acids.
  • the actual amino acid transplantation was performed by obtaining the VH gene of the RC25 antibody (patented international patent application WO 94 20632), which is a humanized anti-HIV immunoglobulin, for VH into type II and VL as described above.
  • the chimeric NOK2 VL gene was used for type I, and the mutation was introduced at the gene level by PCR mutagenesis to introduce mutations by PCR.
  • a gene encoding the amino acid sequence of the antibody has been constructed.
  • FIGS. 8 to 13 show that the synthetic primers used for PCR mutagenesis anneal to the respective type I VH and VL regions.
  • PCR was carried out using a kit manufactured by Perkin and Elma Inc. according to the attached protocol. The PCR conditions were 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 cycles of 2 minutes for 30 cycles.
  • plasmid RHC25 Japanese Patent Publication No. WO 94/20632 obtained by cloning the heavy chain gene of humanized C25 immunoglobulin is designated as ⁇ , and the primer pAGF ( Amplify the 5 'side of the VH gene using SEQ ID NO: 25) and primer # 01 (SEQ ID NO: 26), and use # 02 (SEQ ID NO: 27) or # 03 (SEQ ID NO: 28) and # 04 (SEQ ID NO: 29) was used to amplify the 3 'side of the VH gene
  • the 5 'side of the VL gene was amplified using primers # 05 (SEQ ID NO: 30) and # 06 (SEQ ID NO: 31) using the VL of the chimeric NO K2 as type III, and the # 07 (sequence) No. 32) and # 08 (SEQ ID NO: 33) were used to amplify the intermediate portion, and # 09 (SEQ ID NO: 34) and # 10 (SEQ ID NO: 35) were used to amplify the 3'-side.
  • the three amplified gene fragments obtained here were mixed in equal amounts to form a ⁇ , and PCR was performed using # 05 and # 10.
  • the amplified gene fragment obtained in this way is ligated to the humanized NOK2 antibody VL gene RNOK2 VL by ligating it at the ApaI site in the Leader region gene upstream of the human immunoglobulin SGI VH gene. Ver 1 was prepared.
  • VL VL
  • primers # 11 SEQ ID NO: 36
  • # 12 SEQ ID NO: 37
  • Primer # 11 contains variants in the nucleic acid sequence to create variants of RNOK2 VL Ver 21, 22, 23 and 24.
  • the amplified gene fragment obtained in this manner is ligated to the humanized NOK2 antibody VL gene RN0K2 VL V by ligating at the ApaI site in the Leader region gene upstream of the VH gene of human immunoglobulin SGI. er 21, 22, 23 and 24 were prepared.
  • Each of these humanized VH and VL region fragments was designated as Hindlll and BamHI restriction.
  • each of the above humanized NOK2 immunoglobulin gene expression plasmids was prepared in the same manner as in the preparation of chimeric antibodies (see Example 1).
  • DNA was introduced into CHO-DG44 cells. The method was performed using Lip0fECT ACE as in the case of the chimeric antibody.
  • RNOK20K RNOK202 and RNOK203 described later were expressed by a combination of RNOK2 VHv erl 1 and RNOK2VLv erl, RNOK2 VH ver 11 and RNOK2 VL ver 2 RN ⁇ K2VHv erll and RNOK2 VL ver 22, respectively.
  • RNOK2 antibodies are hereinafter collectively referred to as RNOK2 antibodies or RNOK2 immunoglobulins.
  • the supernatant obtained by culturing the transformed cells ELISA using anti-human IgGa1 and anti-human IgG / c was performed in the same manner as for the quantification of the melanoantibody.As a result, it was confirmed that human immunoglobulin was produced in the culture supernatant. Was.
  • RNOK2 immunoglobulin-producing transformed cells obtained as described in Example 2 were first placed in a 75 cm2 culture flask (manufactured by Corning Incorporated) in ImM G418 ( in Gibco BRL) and nucleotide-free for -MEM medium containing 10% dialyzed fetal bovine serum (Gibco BRL) (Gibco BRL) under the condition of 37 ° C, 5% C_ ⁇ 2 And cultured until confluent.
  • a soluble Fast ligand molecule was prepared by the same method as described in Example 16).
  • the purified RNOK2 immunoglobulin prepared by the method described in Example 3 was diluted with 10% FC SRPM I 1640 medium to prepare the following 12 concentrations of immunoglobulin solutions.
  • the immunoglobulin concentrations were 4 gZml 2 ⁇ g / m 1, 1 ⁇ g / m 1 ⁇ 0. ⁇ g / m 1, 0.25 g / ml, 0.125 ⁇ g / m 1, 0.06 2 5 ⁇ g / m 1, 0.0 3 1 2 5 ⁇ g / m 1, 0.01 5 6 3 ⁇ g / m 1, 0.0 0 7 8 1 3 ⁇ g / m 1, 0.03 9 06 / m 1, 0. 0 19 5 3 2 / / 1111 were prepared in 100 1 each. Since these immunoglobulins will eventually contain 1/4 volume of 251 in a 1001 reaction system, the final effective concentration will be one-fourth of the above portability o
  • Hypri-Doma NO K2 (hybridoma with accession number FERM BP-5045 deposited with the National Institute of Bioscience and Biotechnology) Propagated.
  • 3 ⁇ 107 cells were prepared on a scale in which 30 ml of a culture solution was placed in a 75 cm 2 flask (manufactured by Falcon) and cell culture was performed. Specifically, start of culture at a concentration of 2 X 1 05 or Roh m 1, the cells were harvested when it comes to 1 X 1 0 6 or m 1.
  • the recovered hybridoma was suspended in 1.5 ml of PBS and administered intraperitoneally to nude mice at 0.5 ml (equivalent to 1 ⁇ 107 cells). After breeding for 10 days, ascites collected in the abdominal cavity was collected. The recovered ascites was 6.7 ml / animal. Of these, 10 ml was used for purification.
  • Purification was started by salting out ammonium sulfate with 10 ml (equivalent) of saturated ammonium sulfate added dropwise and mixed with ascites. After stirring at 4 ° C for 2 hours, centrifugation was performed at 10,000 g for 15 minutes. After discarding the supernatant, the precipitate was dissolved in 5 ml of PBS. After that, dialysis was performed overnight with PBS 3 liters. Subsequently, after collecting the dialyzed sample, only the protein G-adsorbed IgG was purified using an FPLC system using a protein G column (manufactured by Pharmacia). The sample was further dialyzed overnight with PBS. The next day, the protein concentration was quantified and the purity was assayed.
  • Protein quantification was measured using a BioRad protein quantification reagent. The method followed the protocol attached to the reagent. Purified immunological group Robbulin was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions and stained with CBB. As a result, no presence of contaminating proteins was confirmed except for the bands considered to be heavy and light chains, respectively.
  • WR19L cells into which the human Fast gene had been introduced were used as target cells.
  • the human Fas gene was introduced into WR19L cells (ATC CTIB52) according to a conventional method. Specifically, Okumura et al.'S literature (Okumura et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, No. 11, p4930-49934, 1994) It was prepared for reference. The obtained Fass-WR19L cells were cultured and adjusted to 2 x 105 cells / 1111 in a 10% FCS-RPMI medium.
  • the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 544 nm and a measurement wavelength of 590 nm using a fluorescence microplate reader (Fluoroskan II (trade name); manufactured by Titertek). This fluorescence intensity reflects the number of viable cells in each well.
  • the target Fas-WR without soluble Fas ligand, RN ⁇ K2 immunoglobulin, and mouse N ⁇ K2 immunoglobulin was not included.
  • the concentrations of humanized NO NO2 immunoglobulins were all above 0.06 g / ml (effective concentration).
  • the apoptosis inhibition rate was 90% or more in the range.
  • all of the humanized immunoglobulins of the present invention could suppress the apoptosis-inducing activity of soluble Fas ligand on Fas-expressing cells.
  • the humanized immunoglobulin of the present invention has an activity equal to or higher than that of the original mask NOK2 immunoglobulin in the entire concentration range tested. .
  • mouse NOK2 immunoglobulin was prepared at an antibody concentration of 0.01 to 8 g / m1 (effective strain) as described in Japanese Patent Application No. 303492/1995. It is known that the apoptotic activity is significantly higher than that of the Fas-Ig chimeric molecule at the same concentration. Therefore, it is clear that the humanized immunoglobulin of the present invention has a stronger affinity for Fas ligand than mouse Fas-Ig and is more effective.
  • humanized immunoglobulins of the present invention will preferentially bind to the Fas ligand and bind to the Fas. Suggests binding to the ligand. From this, it can be easily inferred that the humanized immunoglobulin of the present invention can sufficiently suppress the physiological reaction between F s and F s ligand in vivo.
  • HindIII of the pCAG-expressing vector lacking the / chain constant region gene of the pCAG- / c expression vector described in Example 1-3 was used.
  • a gene in the variable region of the light chain containing the leader sequence of the C25 antibody (described in Patent Publication WO94 / 20632) is cut out at the BamHI site with the above restriction enzyme.
  • This plasmid is introduced into Escherichia coli in a conventional manner, and a small-scale plasmid preparation method (Cold Spring Harbor Laboratories) is prepared from cells obtained by culturing the transformed Escherichia coli.
  • Fas ligands in which these amino acid substitutions have been introduced are collectively referred to as mutant Fas ligands.
  • each of the mutant Fas ligands is obtained by substituting the first Tyr in the underlined part of FIG. 16 with A1a and calling it B1 (hereinafter referred to as B2, B3,. ), But a total of 45 types up to B45 in which the last A1a underlined was replaced with G1y were prepared.
  • Fas ligand gene cloned into the expression vector (human Fas ligand-BCMGSNeo) described in section 1-6) of Example 1-6 was designated as type I, and the EP-02 primer sequence (sequence) was used as the sense primer. No .: 38) and PCR using the antisense primer EP-03 primer (SEQ ID NO: 39), and a Fas ligand with no amino acid substitution introduced (to avoid confusion) Then, a Fas ligand into which no amino acid substitution was introduced is referred to as a native Fas ligand).
  • TAKARA Ex Taq (trade name) (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), prepare a reaction solution according to the attached document, and perform amplification for 30 cycles at 95 ° C for 1 minute, 601 minutes, and 72 ° C for 2 minutes. Done.
  • This fragment was ligated to the pCAG expression vector described in Section 5-1) to produce a native Fas ligand expression vector.
  • the EP-02 primer contains the KpnI site for linking to the pCAG expression vector described in the previous section, the gene sequence of the rest of the leader sequence of the C25 antibody, and the following.
  • a gene sequence encoding the FLAG sequence and a gene sequence encoding the 117th Ser from the N-terminal of the Fas ligand are included.
  • the FLAG sequence consists of 8 amino acids (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). By adding this sequence to the protein to be expressed, it is possible to confirm and quantify the expression of the target protein using an antibody against this sequence. In this experiment, the FLAG sequence was replaced by the third Phe from the N-terminal of the Fs ligand extracellular region.
  • the EP-03 primer is added with a gene sequence encoding the amino acid at and after the sixth Phe from the C-terminal of the Fs ligand, a stop codon, and a BamHI site for linking to an expression vector.
  • MF primer SEQ ID NO: 40
  • Mutant primers in which an A1a or G] y codon has been introduced at the amino acid substitution site (primers corresponding to mutant Fas ligands B1 to B45 are represented by SEQ ID NOs: 41 to 85, respectively) )
  • SEQ ID NOs: 41 to 85 SEQ ID NOs: 41 to 85, respectively
  • a primer complementary to each of the mutant primers described above (primers complementary to the primers of SEQ ID NOs: 41 to 85 are described in SEQ ID NOs: 86 to 130, respectively) was used as a sense primer.
  • the C-terminal side of each mutant Fas ligand was amplified using this and the EP-0.3 primer which is an antisense primer.
  • the above-mentioned mutant primers and their complementary primers were synthesized in order of 45 to produce 45 types of mutant Fas ligands from B1 to B45.
  • each mutant Fas ligand prepared by the above method was replaced with the above-mentioned native Fas ligand gene on the native Fas ligand expression vector at the Ec0NI-BamHI site, An expression plasmid for each mutant Fas ligand was prepared.
  • these plasmids expressing the Fas ligand are introduced into host cells and cultured, the FLAG sequence is inserted into the supernatant at the third Phe site from the N-terminal end of the extracellular region of the Fas ligand.
  • the secreted protein is secreted. 5-3) Expression of each mutant F a s ligand
  • each mutant Fas ligand constructed by the method described in the previous section is introduced into Escherichia coli by a conventional method, and the resulting transformant Escherichia coli is cultured.
  • Plasmid Mini Kit) Product name
  • Kiaje The above-mentioned expression plasmid was recovered and purified using the following method (QI AG EN). Subsequently, each purified expression plasmid was introduced into COS cells (ATCC CRL 1650) using Lipfect ACE (trade name) (manufactured by Gibco BRL) in the same manner as described in section 1_4). To obtain a culture supernatant containing the mutant Fas ligand. That is, 1 g of the above expression plasmid
  • a mixture with Lipofect ACE was added to COS cells, and cultured overnight at 37 under 5% CO 2 conditions. Then, 4 ml of ASF medium (trade name) (manufactured by Ajinomoto Co.) was added. , 37. C, 5% C0 cultured for 4 days in 2 of the conditions to recover the culture Youe supernatant.
  • the native Fas ligand expression plasmid was similarly introduced into COS cells to obtain a culture supernatant.
  • a pCAG vector not linked to a Fas ligand gene was introduced into COS cells by the same method as described above, and cultured in the same medium for the same period, and the culture supernatant was recovered.
  • the relative concentration of the mutant Fas ligand molecule contained in each culture supernatant was calculated by ELISA.
  • the specific method is as follows. First, the culture supernatant containing the above-mentioned native Fas ligand, each culture supernatant containing each mutant Fas ligand molecule, and the culture supernatant of the negative control were serially diluted with ASF medium in 7-fold serial dilutions. Thus, solutions having eight different concentrations were prepared.
  • each well was washed three times with 0.01 MPBS containing 0.05% Tween 20, and PBS containing 1% BSA was added in 100 1 dowels.
  • PBS containing 1% BSA was added in 100 1 dowels.
  • each well was washed three times with 0.01MPBS containing 0.05% Tween 20, and a 25 g / m1 anti-FLA GM2 mouse monoclonal antibody (trade name) (Kodak) was added at 501 / well to each of the 8 wells.
  • the relative amount of each mutant Fas ligand was determined based on the coloring intensity of the native Fas ligand. That is, first, from 0 D 4 5 0 value of each Ueru addition of native F the as ligands and mutant F the as ligands of each dilution magnification, 0 D 4 5 0 value of Uweru addition of the negative control of the same dilution ratio The specific color intensity of each gel was determined by calculating a value obtained by subtracting. In the following, when the relationship between the dilution ratio of the OD 4 5 0 value and each culture supernatant in the graph,
  • ⁇ _D 4 5 0 value indicates a linear decrease, and select the OD 4 5 0 value in the extent that any of the straight line shows the same slope, native dilution magnification when showing their values Calculated based on the above graph for the Fas ligand and each mutant Fas ligand.
  • the relative value of the dilution factor obtained for each mutant Fas ligand was calculated based on the dilution factor obtained for the native Fas ligand, and this relative value was used as the native Fas ligand.
  • the relative concentration of each mutant Fas ligand was used as the relative concentration. By performing this operation on each plate, the relative concentration of all mutant Fas ligands relative to the native Fas ligand was obtained.
  • the culture supernatant containing the mutant Fas ligand with the lowest relative concentration determined by the method in paragraph 5-4) was used as the new standard. It was diluted with the above-mentioned ASF medium to a certain degree. As a result, the concentration of the mutant Fas ligand or native Fas ligand contained therein was adjusted to be the same for all the solutions.
  • N ⁇ K1, NOK2 and NOK2 An anti-Fas ligand monoclonal antibody (hereinafter simply referred to as N ⁇ K1, NOK2 and NOK2, respectively) produced from each of the hybridomas NOK1, NOK2 and NOK3 described in WO 96/29350.
  • NOK3 immunoglobulins which are sometimes collectively referred to as N ⁇ K antibodies.
  • Hypri-Dorma NOK1, NOK2 and NOK3 are each 3X10 in RPMI 1640 medium containing 10% FCS. It grew to the number. 3 ⁇ 107 cells were prepared on a scale in which 30 ml of a culture solution was placed in a 75 cm 2 flask (manufactured by Falcon) and cell culture was performed. Specifically, start of culture at a concentration of 2 X 105 cells m 1, the cells were harvested when it comes to 1 X 1 0 6 or 1. The collected hybridoma was suspended in 1.5 ml of PBS and administered intraperitoneally to nude mice at 0.5 ml (equivalent to 1 ⁇ 107 cells).
  • NOK1 antibody and NOK2 antibody after collecting the dialyzed sample, use a protein G column (trade name) (Pharmasia) to purify only the protein G-adsorbed IgG using the FP LC system. did. The sample was further dialyzed overnight with PBS. The next day, protein concentration was quantified and purity was assayed.
  • NOK3 antibody after the dialysis sample is collected, gel filtration is performed with a FPLC system using a Superde X 200 column (trade name) (manufactured by Pharmasia) for gel filtration, and the void volume ( IgM eluted in the void volume)]]. Regarding this IgM, protein quantification and purity were examined.
  • the method followed the protocol attached to the reagent.
  • the purified immunoglobulin was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions and subjected to CBB staining. As a result, no presence of any contaminating proteins was confirmed except for the bands considered to be heavy and light chains, respectively.
  • 1 ⁇ 01: 1 antibody is 10 / m1
  • NOK2 antibody is 50 g / m1
  • 1 ⁇ ⁇ 1: 3 antibody is 0.1 g / ml
  • RNOK201 Using 3.57 / g / ml, 1.86 / gZml for RNOK 202, and 3.35 gZm1 for RNOK 203, dilute two-fold serially with PBS containing 1% BSA to prepare antibody solutions at eight different concentrations did.
  • the solution containing the native Fas ligand, the solution containing the mutant Fas ligand, and the solution of the negative control prepared in Section 5-5) were placed on a 96-well Maxi Soap plate (trade name) in a 50-well column. It was added with a well. The positional relationship of the added columns is the same as in 5-4). After overnight incubation in step 4, each well was washed three times with 0.01 MPBS containing ⁇ .05% Tween 20, and PBS containing 1% BSA was added at 100/1 / well. After incubation at 37 ° C for 1 hour, each well was washed three times with 0.01MPBS containing 0.05% Tween 20.
  • the NOK antibody and the humanized NOK2 antibody at the respective concentrations prepared by the method described in the preceding section were added at 50 ⁇ l / well to 8 columns. Subsequently, after incubation at 37 ° C for 2 hours, each well was washed three times with 0.01MPBS containing 0.05% Tween 20, and HRP-labeled anti-mouse Ig-C / antibody or HRP-labeled anti-human Ig- A C / 0 antibody (all manufactured by Southern Biotechnology ⁇ Associate (manufactured by Southern Biotechonlogy Associate)) diluted 500 fold with PBS containing 1% BSA was added at 500 1 / ⁇ .
  • the relative binding strength of the NOK antibody and the humanized NOK2 antibody to each mutant Fas ligand was examined. That is, first, in order determine the specific color intensity for each Uweru native F the as ligands and mutant F the as ligand from 0 D 45 0 value of each Ueru addition of a negative control in the N 0 K antibody of the same concentration to calculate the value obtained by subtracting the 450 value ⁇ _D of Ueru that was added.
  • Fig. 19 and Fig. 20 The relative binding powers of the NOK antibody and the humanized NOK2 antibody to each mutant Fs ligand calculated as described above are summarized in FIGS.
  • Fig. 19 and Fig. 20 the range from Arg of No. 198 to Mer of No. 238 from the X-terminal side of the Fas ligand (amino acid numbers are described by Nagata et al. (Nagata et al., Int. Immunology) , vol. 6, pl 567—1574, 1994)), the g: lower binding of NOK2 antibody was observed (especially, Arg of 198, G of 199).
  • a decrease in the binding is observed in the range from G1y at position 199 to G1n at position 237 (especially, Asn at position 199, Asn at position 203, and 205 Le u, 218 Tyr, 220 Gln, 221 Asp, 222 Leu, 227 Gly, 228 Lys and 237 G1n Remarkable decrease is observed).
  • the NO K3 antibody showed reduced binding in the range from G 1 y at position 199 to the met at position 238 (especially, G ly at position 199, G ln at position 200, G n at position 200, As n at position 203). , 205 Leu, 212 Tyr, 220 Gln, 221 Asp, 222 Leu, 228 No. 5, 230 Met, 237 Gin And a marked decrease is observed at the site of the MET No. 238).
  • the NOK antibody is a monoclonal antibody obtained by immunizing mice with Fas ligand-expressing cells (described in Example 1 of Japanese Patent Application No. 303492, 1995).
  • the NOK antibody and the humanized NOK2 antibody are antibodies having strong inhibitory activity against apoptosis induced in Fas-expressing cells through the interaction of Fas-Fas ligand ( Examples 1 and 2 of WO 96/29350 and Example 4 of the present invention).
  • the NOK antibody is the first anti-Fas ligand monoclonal antibody with high apoptosis-suppressing activity, obtained by immunizing with a native-structured Fas ligand.
  • the amino acid sequences of the CDRs (complementarity determining regions) of these monoclonal antibodies differ from one another, and the classes and subclasses of the antibodies also differ, that is, they are completely independent antibodies.
  • These completely different antibody recognition regions As described above, since it exists in a wide region formed by the amino acid sequence from the Arg at position 198 to the Met at position 238 of the Fas ligand, it has high anti-apoptotic activity. It can be said that an as-ligand antibody generally recognizes an amino acid contained in the above region as a recognition region.
  • the above-mentioned region is a major region existing in the Fas ligand molecule and capable of eliciting an anti-Fas ligand antibody having high apoptosis inhibitory activity. Furthermore, the above region is an important region for the Fas ligand to exhibit apoptosis-inducing activity, suggesting that a substance capable of recognizing and binding to this region can exhibit apoptosis-suppressing activity.
  • a 15-mer peptide from the N-terminus of the extracellular domain of the Fas ligand (G1n at position 103 from the N-terminus of the Fas ligand), a 15-mer peptide from No. 6 to No. 20, 1
  • a peptide library was prepared by synthesizing 34 types of 15-mer peptides by shifting the 5-mer and the 5-mer; (Registered trademark, Chiron) was used.)
  • the substrate solution having the following composition was dispensed into a new 96-well plate in a volume of 100 1-well, and the pins of the set-up were placed in each well of the plate, and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • the anti-Fas ligand antibodies produced by the hybridomas of NOK 1 and NOK4 recognize the LYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVY region of the Fs ligand, and the anti-Fas ligand antibodies produced by the hybridomas of NOK 2 are F As a result, it was recognized that the YPQDL VMMEGKMMS YCTTGQMWARS area of the recognition was recognized.
  • Fas ligand trimer was constructed by computer-based molecular modeling using TNF-type ⁇ , and apoptosis inhibition confirmed from the results of binding experiments between the anti-Fas ligand antibody and the mutant Fas ligand molecule. We decided to consider where the region important for activity would be located on the Fas ligand molecule.
  • PDB ID: 1 TNF is a data of the crystal structure of the trimer of TNF ⁇
  • PDB ID: 1 TNR is because the data of the crystal structure of the complex of TNF and TNF receptor one 55, than each, TNF beta Only data for monomers and TNF / 3 monomers were cited.
  • the conditions were set so that 10 models could be obtained, and modeling was performed.
  • the model after the energy minimization calculation, the probability density function (PDF: Probability Density Function) and the root mean square (RMS) value of all atoms are low. Selected as model.
  • a Fas ligand trimer was constructed based on the model of the Fas ligand monomer thus obtained.

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Description

明 細 書
F a sリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロブリンもしくはその 活性フラグメント並びに F a sリガンドに由来するアポト一シス誘導領域
本発明は、 新規なヒト型化免疫グロブリンに関し、 加えて、 F a s— F a sリガンド相互作用により F a s発現細胞に誘導されるアポトーシスを 抑制するために重要な F a sリガンド上の領域についての知見に関する。 詳 細には、 F a sリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロプリンまたは その活性フラグメントに関し、 当該免疫グロブリン及び領域は、 F a s抗原 と F a sリガンドの生理的反応により誘導されるアポトーシス力 s原因となる 疾患についての臨床的な応用、 例えば、 細胞死における F a sシステム等の 解明、 免疫治療や診断、 F a sリガンドの検出またはこれに関連した産業分 野において有用である。
¾ ^龍
多細胞生物は、 その恒常性を保っために細胞の増殖と死を巧妙にコント ロールしている。 個体発生の過程では多くの細胞力 s細胞死によつて除去され る。 また、 成体においても、 臓器を構成する細胞は常に増殖と死のバランス を保ちながらその機能を維持している。 このような細胞死は、 予め予定され た死であり 「プログラム細胞死 （programmed cell death) 」 と呼ばれ、 物 理的 ·化学的要因で引き起こされる不慮の細胞死 （accidental cell death )-と区別されている （Raff， M. C, Nature, vol.356, p.397— 40 0, 1 992) o これらの 2つの細胞死は、 その過程が異なっている。 すなわち、 プログラ ム細胞死はアポトーシスの過程によって起こるのに対し、 不慮の細胞死では ネクローシス （壊死） の過程を経て細胞が死滅すると考えられている （カー (Kerr, J. F.) 、 Brit. J. C ancer.vol. 26, p. 239一 257, 1 972 ) o
F a s抗原は、 プログラム細胞死 （アポトーシス） を媒介する細胞表面蛋 白質であり、 その c DNAもクロ一ニングされている （長田ら、 Cell, vol. 66, p. 223 - 243, 1 99 1) 。 得られた c D N Aの構造から、 ヒ ト F a s抗原はアミノ酸 3 1 9残基からなる細胞膜貫通型蛋白質であって 1 つの細胞膜貫通部分を有することが判明した。 F a s抗原の細胞外部分は、 アミノ酸 1 57残基から構成されシスティン残基に富む構造を有している。 また、 マウス F a s抗原はアミノ酸 306残基からなりヒト F a s抗原と 4 9.3%の相同性を示す。
F a s抗原における細胞外部分のシスティン残基に富む構造は、 神経成長 因子 （NGF: nerve growth factor) の低親和性レセプタ—や腫瘍壊死因 子 （TNF: tumor necrosis factor) のレセプターにも認められるよく保 存された構造であることが判明した。 これらの事実から、 F a s抗原が NGFZTNFレセプターフアミリーに属する細胞表層蛋白質であることが 明らかとなった。 このファミリ一に属する蛋白質の多くは、 生体内にそのリ ガンドを有しているので F a s抗原にも生体内にリガンドが存在しているこ と力予想されていた力 ?、 1 993年、 長田重一博士のグループによりラッ ト の F a sリガンドの分子が同定された （長田ら、 Cell, vol.75, p. 1 1 69— 1 178， 1 993) 。 続いて、 マウス及びヒ トの F a sリガンドの 分子が同グループにより同定された （長田ら、 Int. Immunol. , vol.6 No. 1 0， p. 1 567 - 1574, 1 994) 0
前記長田らの文献によれば、 F a sリガンドは 278個のアミノ酸からな る分子量 3 1 , 138の蛋白質であること、 また、 4力所の N—グリコシド 結合サイ トがあり、 糖蛋白質であること等が判明している （長田ら、 細胞ェ 学、 vol. 13 No. 8, p. 738— 744， 1994) 。 また、 可溶性 の F a sリガンド分子は F a s抗原を細胞表面に発現するターゲッ ト細胞に アポト一シスを誘導することが明らかにされている （長田ら、 J. Exp. Med. , vol.1 79, p. 873— 879, 1 994) 。
花渕らの報告によれば、 キラ一 T細胞による F a s抗原を介した標的細胞 破壊機構の解析の結果、 パ―フオリンを発現していない CD 4陽性 T細胞 (CTL) による標的細胞破壊には、 標的細胞上の F a s抗原を介したアポ ト一シス ' シグナルの伝達が関与している可能性が示され、 それによつて C D 4陽性 C T Lの細胞表面に F a sリガンドが存在していることが明らか になった （花渕ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, vol.91， No. 1 1， p. 4930-4934, 1 994 ) 0
このように、 F a s抗原は細胞に "死" というシグナルを伝えることが明 らかになつているが、 F a s抗原や F a sリガンドなどのアポトーシスを媒 介する蛋白質の不活性化が細胞の異常増殖を引き起こし、 一方、 その異常な 活'性化がある種の炎症反応を引き起こすことが示唆されている。
例えば、 自己免疫疾患様の症状を示す 1 p r (lymphoproliferation)変異 をもつマウスでは、 F a s遺伝子に変異が存在していることが見出されてい る一方で、 同じく自己免疫疾患様の症状を示す g 1 d (general ized lymphoproliferative disease)変異をもつマウスでは、 F a sリガンドその ものに変異が存在することが報告されている （長田ら、 Cell, vol.76, p. 969 - 979, 1994) 。
また最近の研究結果から、 F a s抗原と F a sリガンドの生理的反応が、 様々な疾患を引き起こす可能性が示唆されている。
例えば、 A I D Sの原因ウィルスである H I V由来の t a t蛋白が F a s リガン ドの発現を促進し、 F a s抗原を発現している T細胞に F a s - F a sリガンドの相互作用を介したアポトーシスを引き起こすことが報告さ れており （ウェスタンドロップ （Westerndrop, Μ·)ら、 Nature, vol.37 5， p. 497 - 500, 1 995) 、 実際に、 H I V感染 T細胞には F a sの発現が認められることも明らかとなっている （小林ら、 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, vol.87， p. 9620-9624, 1 99 0) 。 これらの報告などから、 F a s— F a sリガンドの相互作用により誘 導されるアポト一シスが、 A I D Sにおける CD 4陽性 T細胞の消失のメカ 二ズムの一つであることが示唆される。 さらに、 抗 F a s抗体 （J 0- 2) をマウスに腹腔投与した場合、 マウスは劇症肝炎を起こして死亡すること
(小笠原ら、 Nature, vol.364, p. 806— 809， 1 993 ) 、 ウイ ルス性肝炎では F a sの発現力 s認められること （平松ら、 Hepatology, vol. 1 9, p. 1 354 - 1359, 1 994) 、 糖尿病、 自己免疫疾患におい ても、 全身性エリテマト—デス （SLE) や慢性関節リウマチ （RA) では F a sの発現が認められるとの報告がなされており、 これら疾患は F a s抗 原に反応する F a sリガンドによって引き起こされているのではないかと推 察できる。
上述の背景のもと、 F a sと F a sリガンドの結合を抑制 （阻害） し、 そ の結果アポトーシスを抑制する活性を持つ物質が創出されることは、 上記の ような研究の更なる進展のためにも、 また、 特に将来における臨床応用によ る疾患の治療のためにも極めて意義深いものである。
本発明者らは、 F a sリガンドに特異的に反応し、 F a sと F a sリガン ドの生理的反応を抑制 （阻害） することができるマウスモノクローナル抗体 を発明し特許出願した（特許出願平成 7年第 303492号)。 また、 該モノ クロ一ナル抗体は、 F a sと F a sリガンドの結合よりも強く F a sリガン ドに結合することができることから、 生体内においても F a s— F a sリガ ンドの生理的反応を阻害し得ると考えられた。
しかしながら、 このような高い活性を持つモノクローナル抗体は臨床応用 の観点から望ましいことは言うまでもない力 不運にも、 例えば上記マウス モノクローナル抗体のような非ヒト免疫グロプリンは、 ヒトへ投与する場合 においては以下に述べるような欠点を有する。 すなわち、 非ヒト免疫グロブ リンはヒ卜の生体内では比較的短い半減期しか持たず、 一定の血中濃度を維 持するためにはヒ ト抗体を投与する場合に比して頻回の投与が必要となる。 また、 更に留意されるべきこととして、 非ヒト免疫グロブリンはヒ トに投与 された場合に抗原性を発揮し得るアミノ酸配列を含んでいる点がある。 この ため、 頻回の投与を行なう場合においては、 投与によって誘導された免疫応 答により、 後に投与する免疫グロブリンが排除されるのみならず、 極端な結 果としてはアナフィラキシー様ショックを引き起こす可能性がある。
上述の問題点を解決する試みとして、 いわゆるキメラ抗体 （ヒト免疫グロ プリンの定常領域にマウス免疫グロプリンの可変領域を連結した免疫グロブ リン） の作出が行なわれた例がある （ロブグリオ （LoBuglio) ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p. 4220-4224, 1 98 9) 。 上記報告で記載されている結果では、 キメラ抗体のヒトでの血中半減 期はマウス抗体の 6倍に延びたが、 それでも一般的なヒト免疫グロプリンと 比べると約 1/5程度であった。 また、 キメラ抗体を投与した 3人の患者の うちの 1人にキメラ抗体に対する免疫応答が観られた。 この反応は抗マウス 免疫グ口ブリンで吸収できたことから、 マウス免疫グロブリン由来の可変領 域に由来するものであると考えられた。
ヒト免疫グロプリンとのキメラ化を行なってもなお解決しない問題点を克 服するものとして、 可変領域 （V領域） 内にあって抗原と直接的に結合する 相補性決定領域 （以下、 CDRと呼称することがある） を、 遺伝子工学的な 手法を用いてヒト免疫グロブリン可変領域の C D Rに移植することによつ て、 キメラ抗体よりもよりヒト免疫グロプリンに近いヒト型化免疫グロプリ ンを構築する方法が、 ウィンター （Winter) らにより報告された （ウィン ターら、 Nature, vol. 32 1 , p. 522— 525， 1 986) 。
ベンディ ック (Bendig) の文献 (A Companion to Methods in
Enzymology, vol.8, p. 83— 93, 1995 ) に整理されているよう に、 これまでに上記のような方法に基づいて、 様々なヒト型化免疫グロプリ ンが作製されている。 し力 し、 多くのヒト型化免疫グロブリンは、 CDRの 供与体となるオリジナルのマウス免疫グロブリンと比べて活性の顕著な低下 を伴い、 マウス免疫グロブリンと同等の活性を維持しているものは少なく、 特に、 マウス免疫グロプリンよりも高い活性を持つヒト型化免疫グロプリン を作製できた例は極めて稀である。 また、 言うまでもなく本願発明の F a s リガンドに対するヒト型化免疫グロプリンの作製の報告はない。
最近の研究で、 マウス F a sリガンドの推定三次元構造モデルが報告され ている (マニエル (Manuel C. P.) ら、 Molecular Immunology, vol. 32
U 0) ， p.76 1 - 772, 1 996) 。 この報告において、 著者らは、 マウス F a sリガンドが TNF α及び TNF /? (以下、 両者を合わせて単に T N Fと呼称する） と同様に三量体構造を形成し生物学的な活性を発揮する と考え、 マウス F a s リガンド三量体モデルを作製し、 T N F三量体の構造 及び T N Fと T N Fレセプターの相互作用領域を参照しながら、 マウス F a s リガンドの単量体間の相互作用領域及びマウス F a s リガンドと F a s抗原との相互作用領域について推論している。 しかし、 この推論につ いての立証はなされていない。
一方、 ヒ ト F a s リガンドについては、 上記文献のような推定三次元構造 モデルの報告はなく、 F a s リガンド単量体間の相互作用部位及び F a s一 F a sリガンド間の相互作用部位が明らかにされた例はない。 現在のこのよ うな状況においては、 F a s— F a s リガンドの生理的反応により引き起こ されるアポトーシスを抑制 （もしくは阻害） するためには、 F a sリガンド あるいは F a sのどの領域をタ一ゲットにすれば良いか不明のままである。 オリジナルのマウス免疫グロプリンと比べて、 ヒト型化した免疫グロプリ ンの活性が低下する主な理由は、 C D Rの供与体となるマウス免疫グロプリ ンと受容体となるヒト免疫グロプリンのフレームワーク領域の立体構造の違 いにより、 移植された C D Rに構造的な変化が生じた結果、 抗原への結合性 が低下してしまうことによると考えられる。 このような活性の低下を避ける ためには、 C D R移植によるヒト型化の改良された方法が必要である。 平成 7年特許願第 3 0 3 4 9 2号の発明に含まれる F a s リガンドに特異 的に反応するモノクローナル抗体は、 F a sと F a sリガンドとの生理的反 応を抑制 （もしくは阻害） することができる有用な活性を持つ抗体である。 しかし、 該抗体はマウス免疫グロブリンであるために、 安全性 （抗原性の惹 起） 及び有効性 （半減期の短縮） の観点から、 ヒトに対する臨床的な応用は 現実的には不可能である。 発明の開示
本発明の主たる目的は、 F a sリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫 グロプリンまたはその活性フラグメントを提供することにあり、 とりわけ、 F a sリガンドに特異的に反応し、 F a sと F a sリガンドとの生理的反応 を抑制 （もしくは阻害） することができるヒト型化免疫グロブリンを提供す る とにある。
また、 ヒトの F a sと F a sリガンドの相互作用領域が明らかにされてお らず、 F a s— F a s リガンド複合体のモデリングゃ結晶構造解析なども行 われていない現在においては、 F a s— F a sリガンドの生理的反応により 引き起こされるアポトーシスを効果的に抑制 （もしくは阻害） するための領 域を確定することができていない。
本発明のもう一つの目的は、 高いアポトーシス抑制活性を持つ複数の抗 F a sリガンドモノクローナル抗体とアミノ酸置換を導入した複数の F a s リガンド （変異 F a sリガンド） 分子の反応性を検討し、 さらに、 ヒト F a sリガンド三量体の分子モデルを構築し、 上記実験により明らかになつ た領域がヒト F a sリガンド三量体上でどの様に分布するかを確認すること により、 アポト一シス抑制活性に関連した F a s リガンド上の領域を初めて 明らかにすることにある。
11面の簡 な .明
図 1は、 N O K 2抗体の重鎮可変領域の核酸及びアミノ酸配列を示す図で あり、 下線の領域はクローニングに使用したプライマ一を示す。
図 2は、 N O K 2抗体の軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を示す図で あり、 下線の領域はクロ一ニングに使用したプライマ一を示す。
図 3は、 キメラ N O K 2抗体の重鎖発現プラスミ ド （a ) 及びキメラ N〇K 2抗体の軽鎖癸現プラスミ ド （b) を示す図である。
図 4は、 キメラ NO K 2抗体の F a sリガンドに対する認識を EL I S A で調べた結果を示す図である。
図 5は、 NO K 2抗体、 SG I抗体及びヒト型化 N0K2 (RNOK2) 免疫グロプリンの重鎖可変領域 （RNOK2VHv e r l 1及び RNOK 2 VH V e r 12) のアミノ酸配列を示す図である。
図 6は、 NO K 2抗体、 RE I抗体、 ヒ ト由来免疫グロブリ ンの h uVL 1 9と h u VL 3 1及び RNOK 2免疫グロプリンの軽鎖可変領域
(RNOK2 VL V e r 1， RN0K2 VL v e r 2 1， RNOK 2 VL v e r 22, RNOK2 VL v e r 23及び尺1^01：2¥し e r 2 4) のアミノ酸配列を示す図である。
図 7は、 NO K 2抗体、 RE I抗体、 ヒ ト由来免疫グロブリンの h uVL 1 9と h u V L 3 1及び R N 0 K 2免疫グロプリンの軽鎖可変領域
(RNOK2 VL V e r 1 , RN0K2 VL v e r 2 1 , RNOK 2 VL v e r 22, RNOK2 VL v e r 23及び RNOK 2 VL v e r 2 4) のアミノ酸配列を示す図である。
図 8は、 RNOK 2免疫グロブリンの重鎖可変領域 （RNOK 2
VH V e r 1 1及び RNOK 2 VH v e r 12) の遣伝子を作製するために 使用したプライマーが铸型の RC 25免疫グロプリンの重鎖可変領域にァ ニールしている様子を示す図である。
図 9は、 RN0K2免疫グロブリンの重鎖可変領域 （RNOK2
VH V e r 1 1及び RNOK2VHv e r 12) の遣伝子を作製するために 使用したプライマーが铸型の RC 25免疫グロプリンの重鎖可変領域にァ ニールしている様子を示す図である。 図 1 0は、 R NO K 2免疫グロブリンの軽鎖可変領域 （RNOK2 VLv e r 1) の遺伝子を作製するために使用したプライマーが铸型の NOK 2抗体軽鎖にァニールしている様子を示す図である。
図 1 1は、 RNOK2免疫グロブリンの軽鎖可変領域 （RNOK2 VL V e r 1 ) の遣伝子を作製するために使用したプライマーが铸型の NO K 2抗体軽鎖にァニールしている様子を示す図である。
図 12は、 R NO K 2免疫グロブリンの軽鎖可変領域 （RNOK2 VL V e r 2 1 , RNOK2 VLv e r 22， RNOK2VL v e r 23及 び RNOK2 VL v e r 24) の遺伝子を作製するために使用したプライ マ一が铸型の N 0 K 2抗体軽鎖にァニールしている様子を示す図である。 図 1 3は、 R NO K 2免疫グロブリンの軽鎖可変領域 （RNOK2 VL V e r 2 1 , RNOK 2 VL v e r 22, RNOK2VL v e r 23及 び RNOK2 VL v e r 24) の遺伝子を作製するために使用したプライ マーが銃型の NO K 2抗体軽鎖にァニールしている様子を示す図である。 図 1 4は、 各 RNOK2免疫グロプリンの F a sリガンドに対する認識を EL I S Aで調べた結果を示す図である。
図 1 5は、 各 RNOK 2免疫グロブリン及びマウス NOK 2免疫グロプリ ンの、 F a sリガンドと F a sを介して起こるアポトーシスに対する抑制活 性を調べた結果を示す図である。
図 1 6は、 F a sリガンドの核酸配列 （上段） 及びァミノ酸配列 （下段） の一部を示す図である。 アミノ酸の番号は長田らの文献 （長田ら、 Int. Immunology, vol.6, p. 1 567— 1 574， 1 994 ) に従う。
-図 1 7は、 発現させたネイティブ F a sリガンド及び変異 F a sリガンド に対する抗 FLAG抗体の認識性を EL I S Aで調べた結果の一部を示す図 である。
図 18は、 発現させたネイティブ F a sリガンド及び変異 F a sリガンド に対する抗 F a sリガンド抗体 （NOK 1抗体） の認識性を EL I S Aで調 ベた結果の一部を示す図である。
図 1 9は、 各変異 F a sリガンドに対する各 NO K抗体及びヒト型化 N0K 2抗体の相対的認識力を示す図である。 なお、 N. D.は未実施 (No t D o n e) を意味する。
図 20は、 各変異 F a sリガンドに対する各 NO K抗体及びヒト型化 NO K 2抗体の相対的認識力を示す図である。 なお、 N.D.は未実施 (No t Do n e) を意味する。
図 2 1は、 F a sリガンドアミノ酸配列と TNF a及び TNF のァミノ 酸配列のァライメントを示す図である。 最上段は、 長田らの文献 （長田ら、 Int. Immunology, vol.6， p.1 567- 1 574, 1 994 ) に示されて いるヒト F a sリガンドの細胞外領域のアミノ酸配列、 二段目はモデリング を行なった領域のアミノ酸配列、 三段目は TNF αのアミノ酸配列 （1 TNF) 、 最下段は TNF /?のアミノ酸配列 （1 TNR) を示す。
図 22は、 F a sリガンド三量体のうちの二分子上の NO K 1抗体が認識 するアミノ酸を丸印で示す。 灰色丸印は同一側面上に存在するアミノ酸を、 白抜き丸印はそれ以外のアミノ酸を示す。
図 23は、 F a sリガンド三量体のうちの二分子上の、 NO K 2抗体及び ヒト型化 NO K 2抗体が認識するアミノ酸を丸印で示す。 灰色丸印は同一側 面上に存在するアミノ酸を、 白抜き丸印はそれ以外のアミノ酸を示す。 ま た、 波線の丸印はヒト型化 NO K 2抗体が特に認識するアミノ酸を示す。 図 24は、 F a sリガンド三量体のうちの二分子上の、 N 0 K 3抗体が認 識するアミノ酸を丸印で示す。 灰色丸印は同一側面上に存在するアミノ酸 を、 白抜き丸印はそれ以外のアミノ酸を示す。
図 25は、 NOK2抗体の VH領域と 1 F 0 R抗体の VH領域のァラィメ ントを示す図である。 VH領域の下流に付加されている定常領域は 1 FOR 抗体のものである。
図 26は、 NO K 2抗体の VL領域と 1 T E T抗体の V L領域のァラィメ ントを示す図である。 VL領域の下流に付加されている定常領域は 1 TET 抗体のものである。
図 27は、 F a sリガンド三量体のうちの二分子上に示された、 各 NOK 抗体及びヒト型化 NO K 2抗体が認識するアミノ酸を丸印で示す。 灰色丸印 は同一側面上に存在するアミノ酸を、 白抜き丸印はそれ以外のアミノ酸を示 す。 灰色丸印のアミノ酸を囲む円は、 抗体の CDR領域とほほ同じ大きさの 半径約 17オングストロームの円である。
図 28は、 図 27に示す半径約 17オングストロームの円内に含まれる全 てのアミノ酸のうちで、 F a sリガンドの表面に出ている （抗体などに認識 され得る） アミノ酸を丸印で示す。 各 NOK抗体及びヒト型化 NOK2抗体 が認識するアミノ酸を灰色丸印で示す。
図 29〜3 1は、 F a sリガンド三量体のうちの二分子 （それぞれ白色と 濃色で示される） のファンデルワールスコンタクトモデルを示す図である。 図 29では N 0 K 1抗体の認識ァミノ酸が、 図 30では NOK2抗体及びヒ ト型化 N 0 K 2抗体の認識ァミノ酸が、 図 31では N 0 K 3抗体の認識ァミ ノ酸がそれぞれ斜線で示されている。
図 32およぴ図 33は、 F a sリガンド三量体における N O K 2抗体の認 識領域の側部からの概観図である。 図 32において上部のモデルが F a sリ ガンド三量体、 下部のモデルが NO K 2抗体の F a b部分で、 その中間にあ る部分が NO K 2抗体の相補性決定領域 （CDR) である。 図 33の NOK 2抗体の CD Rは、 半径約 1 7オングストロームの円とほぼ同じサイズを有 している。
図 34は図 29〜31と同様のファンデルワールスコンタクトモデルを示 す図であり、 図 33に示す半径約役 17オングストロームの円の範囲内に あって、 15平方オングストローム以上の露出表面を持つアミノ酸が斜線で 示されている。
口月をま するための の
平成 7年特許願第 303492号の発明に含まれる F a sリガンドに特異 的に反応するマウスモノクローナル抗体の持つ有用性を現実化するために は、 F a sに特異的に反応することにより F a sと F a sリガンドとの生理 的 、を抑制 （阻害） するという特性を保持して、 かつヒ トの生体内で 性を持たないヒト免疫グロブリンへと改変する必要がある。 そのために適用 可能な方法としては、 例えばウインターらの報告 （ウインターら、 Nature, vol.32 1, p. 522 - 525, 1986) に記述されているように、 遺 伝子工学的手法を用いてマウス免疫グロプリンをヒト免疫グロプリンへと改 変する方法がある。 しかし、 前述の如く、 このような方法に従って作製され た多くのヒト型化抗体は、 CDRの供与体となるオリジナルのマウス抗体と 比べて活性の顕著な低下を伴っており、 高活性を維持したヒト型化抗体を作 製するためには、 CDR移^！によるヒト型化の改良された方法が必要であつ た。
過去に、 マウス免疫グロブリンのヒト型化に関するウインターらの報告 (ウインターら、 Nature, vol.332, p. 323— 327， 1988) や、 免疫グロブリン CDR領域の立 造解析に関するチヨシァ （Chothia ) らの報告 （チヨシァら、 J. Mol. Biol, vol.196, p. 901 -917 , 1987) などにおいて、 CDRの近傍 （一次配列上あるいは立体構造 上） にあって CDRの立体構造の維持、 延いては免疫グロブリ ンの活性維持 に寄与しているフレームワーク （FR) 領域のアミノ酸 （以下、 FRァミノ 酸ともいう） の存在が示されている。
本発明における F a sリガンドに特異的に反応するモノクローナル抗体の ヒト型化においては、 これらの情報に基づいて、 コンピュータモデリングを 利用して選ばれた上記のような FRアミノ酸を CDRとともに受容体ヒト抗 体へ移植することにより、 オリジナルのマウス抗体と同等以上の活性を持つ ヒ ト型化抗体を作製することに成功した。
CDRの立体構造の維持、 延いては抗体の活性維持に寄与している FR領 域中の重要ァミノ酸を推定するために、 まず抗体のコンピュータモデリング 力 われた。 コンピュータモデリングには、 例えばシリコングラフィックス (Silicongraphics) 上で起動する分子設計ソフトウエアである
QUANTAZCHARMmあるいは Mo d e 1 e r (いずれもモレキュ ラー · シミュレーションズ (Molecular Simulations Inc. ) 社製) など力 s利 用可能である。 このようなソフトウエアを利用して構築された抗体の三次元 構造データに基づいて、 CDRの立 造維持に寄与している FRアミノ酸 を選定する。 具体的には、 上記ソフ トウェアに搭載されている計算プログラ ムを利用して、 CDRアミノ酸と直接あるいは間接的に水素結合あるいはェ ネルギーコンタク トをしているアミノ酸を選定する。 CDRとともに移植す るアミノ酸はこれらの中から選定される。 ただし、 移植された結果、 ヒト生 体内で抗原性を惹起することが予想されるようなヒト抗体にはないァミノ酸 配列を生じる場合においては移植しないものとする。
マウス抗体の可変領域アミノ酸の各々がヒト抗体の可変領域アミノ酸のい ずれに相当するかは、 力バッ ト （Kabat) らの分類 （シークェンス 'ォブ ' プロテインズ . ォブ ' イミュノロジカル . インタレスト （Sequence of Proteins of Immunological Interest) 第 4版， ノ、'ブリ ック · ヘルス · サービス （Public Health Service) , N I H, ワシントン DC, 1 98 7) に従えば容易に判断でき、 該分類に従うことはこの分野では標準となつ ている。
上記のような手法により、 ヒト中で抗原性を惹起しない力 F a sリガン ドに特異的に反応し、 F a sと F a sリガンドとの生理的反応を抑制 （阻 害） することができ、 その活性がオリジナルのマウス抗体と同等以上である ヒト型化免疫グロプリンを提供し得る本発明に到達した。
また、 ヒトの F a sと F a sリガンドの相互作用領域が明らかにされてお らず、 F a s— F a sリガンド複合体のモデリングゃ結晶構造解析なども行 われていない現在においては、 F a s— F a sリガンドの生理的反応により 引き起こされるアポト一シスを抑制 （もしくは阻害） するためには、 F a s リガンドあるいは F a s抗原のどの領域をプロックすれば効果的であるか不 明である。
そこで、 アポトーシスを抑制 （もしくは阻害） するために重要な F a sリ ガンド上の領域を明らかにするために、 高いアポト一シス抑制活性を持つ複 数の抗 F a sリガンドモノクローナル抗体の認識する認識領域の解析を行 なった。 具体的には、 アミノ酸置換を導入した F a sリガンド （変異 F a s リガンド） 分子を複数作製し、 それらに対する、 平成 7年特許願第 3034 92号明細書に記載のハイプリ ドーマである N〇K 1、 N0K2、 NOK 3 及び NOK4の各々より産生される、 抗 F a sリガンドモノクローナル抗体 (以下、 各々単に ΝΟΚ1、 N0K2、 NOK3及び NOK4免疫グロプリ ン （抗体） と呼称することがある。 これらは、 工業技術院生命工学工業技術 研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に寄託されていて、 その受 託番号は、 各々 FERM BP- 5044, FERM BP— 5045、 FERM BP— 5046、 FERM BP— 5047である。 また、 これ らを総称して NOK抗体と呼ぶことがある。 ） 及び本発明のヒト型化免疫グ ロブリンの結合性を調べ、 ヒ ト F a sリガンド分子上の上記各抗体の認識領 域を同定することにより、 アポトーシスを抑制するために重要な領域を明ら かにした。
さらに、 ヒト F a sリガンド三量体モデルを構築し、 上記実験により明ら かになつた領域がヒト F a sリガンド三量体上でどの様に分布するかを確認 することにより、 アポトーシス抑制活性に関連した F a sリガンド上の領域 を初めて明らかにするに至った。
上記のように F a sリガンド （以下、 F a s Lともいう） は、 プログラム 細胞死 （アポトーシス） を媒介する細胞表面蛋白質である F a s抗原のリガ ンドであり、 現在までにヒ ト、 ラッ ト、 及びマウスの F a sリガンドが同定 されている。 本発明では、 広く F a sリガンドを対象とするが、 これらの中 でも、 特に、 種がヒ ト及びマウスの F a sリガンドが好ましい。 すなわち、 本発明は、 好ましくは、 ヒ ト F a s¾ のリガンド及びマウス F a s の リガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロプリン及びその活性フラグメ ントを提供する。
本明細書において、 「免疫グロブリン」 とは免疫グロブリン遺伝子によつ て実質的にコ一ドされる 1以上のポリペプチドからなる蛋白質をいう。 本発 明の免疫グロブリン遺伝子は、 カツノ、'、 ラムダ、 アルファ、 ガンマ、 デル タ、 ィブシ口ン及びミユー定常領域遣伝子並びにミリアド （myriad)免疫グ ロブリン可変領域遣伝子を含む。 また、 本発明においては、 免疫グロブリ ン は活性フラグメントをも包含するものである。 活性フラグメントとは、 抗原 抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、 具体的には、 F
( a b ' ) 2、 F a b ' 、 F a b , F v、 及び組換え F v体などを挙げるこ とができる。
本明細書において、 「キメラ抗体」 とは、 軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が、 典型的には遺伝子工学により、 異なった種に属する免疫グロプリン遣伝子断 片から構成されている遺伝子より得られる抗体である。 例えば、 マウスモノ クロ一ナル抗体からの遺伝子の可変 （V ) 領域断片は、 ヒト定常 （C ) 領域 断片、 例えば 7 1または 7 4と連結され得る。 従って、 他の哺乳動物種も採 用され得る力、 典型的な治療用キメラ抗体は、 マウス抗体からの Vもしくは 抗原結合ドメィン及びヒト免疫グロプリンからの Cまたはエフヱクタ一ドメ ィンからなるハイプリッド蛋白質である。
本明細書において、 「フレームワーク領域」 とは、 単一種中の種々の免疫 グロブリ ンの内で、 比較的保存されている（即ち、 C D R以外の）免疫グロブ リン軽鎖及び重鎖可変領域の部分を言う。 「ヒ トフレームワーク領域」 は、 自然に生じるヒト免疫グロプリンのフレームワーク領域とまたはいくつかの このような免疫グロブリンの共通配列と実質的に同一 （約 8 5 %またはそれ 以上） であるところのフレームワーク領域である。 また、 「ヒ ト型化免疫グ ロブリン」 は、 ヒトフレームワーク、 非ヒ ト免疫グロブリンからの少なくと も一つの C D Rを含む免疫グロプリンを意味し、 その中に存在する定常領域 は、 ヒ ト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である、 即ち蛋白質を構成 するアミノ酸配列の少なくとも約 8 5〜 9 0 %、 好ましくは少なくとも 9 5%同一である。 従って、 恐らく CDRを除く、 ヒト型化免疫グロブリンの 全ての部分は、 1以上の天然のヒト免疫グロプリン配列の対応する部分と実 質的に同一である。
ヒト型化免疫グロブリンは、 ヒトの治療用の用途のために、 マウス抗体に 較べ、 少なくとも 3つの潜在的な利点を有する。
(1) エフェクター部分がヒトであるので、 ヒト免疫系の他の部分とより 良好に相互作用し得る （例えば、 補体依存性細胞障害 （CDC) または抗体 依存性細胞障害 （ADCC) による、 より効率的な標的細胞の破壊） 。
(2) ヒト免疫系は、 ヒト型化免疫グロブリ ンのフレームワークまたは C 領域を異物として認識せず、 従って当該免疫グロプリンに対する好ましから ぬ抗体応答は、 全部が異物であるマウス抗体または一部分が異物であるキメ ラ抗体に対するものよりも少ない。
(3) ヒ トに注入されたマウス抗体は、 通常のヒ ト抗体の半減期よりも非 常に短い半減期を有すると報告されている （Shaw, DR ら、 J. Imranol., vol. 138, p. 4534-4538, 1 987) 。 一方、 ヒト型化免疫 グロブリンは、 自然に生じるヒト抗体の半減期により近い半減期を有し、 マ ウス抗体に比較して、 より小さいまたはより少ない頻度の投与量を与えるこ と力?期待される。 本発明のヒト型化免疫グロプリンは、 F a sリガンドに特異的に反応する ものであれば特に限定されないが、 F a sリガンドと F a sとの生理的反応 を阻害 （抑制） できるものであることが特に好ましい。 ここで言う生理的反 応を阻害する免疫グロプリンとは、 F a sリガンドを発現している細胞ある いは可溶型となった F a sリガンド （以下、 s F a sリガンドまたは可溶性 F a sリガンドと呼称することがある） が F a sを発現している細胞に結合 して、 F a sを発現している細胞をアポトーシスにより死滅させるシグナル を与える時に、 F a sと結合する F a sリガンドの結合部位に対し特異的に 結合し、 F a sリガンドが F a sと結合できなくなるように機能し得る免疫 グロブリンを指す。 すなわち、 F a sリガンドと F a sとの生理的反応を阻 害する免疫グロプリンが存在すれば、 F a sリガンドを発現している細胞あ るいは s F a sリガンドが F a sを発現している細胞を死滅させることがで きなくなる。 しかも、 この時の免疫グロブリンは F a sリガンドと F a sと の結合力よりも強い結合力を持つ免疫グロプリンであることがより好まし レ、。 具体的には、 F a sと I g Gの F cとを結合させたキメラ分子 （以下、 F a s - I gともいう） を指標に調べることができる。 この F a s - I g は、 生体内の F a sリガンドと F a sとの結合力と同じ結合力で F a sリガ ンドに結合することができる。 したがって、 F a sリガントに対する免疫グ ロブリ、ノ 、 F a s— I gキメラ分子よりも低濃度で F a sリガンドと F a sとの結合を阻害することができれば、 実際、 実用レベルでは生体内の 種々の F a sリガンドによる作用を有効に阻害することができる。
本発明のヒト F a sリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロプリン としては、 例えば、 平成 7年特許願第 303492号の発明に含まれ、 工業 技術院生命工学工業技術研究所に 1995年 3月 20日に寄託されている受 託番号 FERM BP— 5045 (ハイプリ ドーマ N 0 K 2 ) より産生され る NOK 2抗体を供与体抗体としてヒト型化した抗体、 RNOK201、 RNOK 202及び R NO K 203抗体を挙げることができる （以下、 NOK2抗体をヒト型化した抗体を、 ヒト型化 NOK2抗体、 ヒト型化 NO K 2免疫グロプリン、 R NO K 2抗体あるいは R NO K 2免疫グロプリ ンと呼称することがある） 。 ここでは、 便宜上好適な例として、 以下 NO K 2抗体をヒト型化する工程 を概説するが、 F a sリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロプリン であれば特にこれらに限定されるものではない。
遺伝子工学的手法を用いることによって NOK 2抗体をヒト免疫グロプリ ンのアミノ酸配列を有する分子に改変するためには、 まず、 NOK2抗体の 可変 （V) 領域遺伝子をクロ一ニングする必要がある。
V領域遺伝子は、 通常の遺伝子操作技術によりクロ—ニングすることがで きる。 例えば、 その細胞の染色体 DN Aから常法 （例えば、 マニアチス （T. Maniatis) 、 「モレキュラー · クロ一ニン 7 (Molucular Cloning 」 、 コールドスプリングハーバー ' ラボラトリ一、 1 982年参照） に従って V 領域遺伝子をクロ一ニングする方法、 あるいは、 その細胞の mRN Aを材料 として常法 （例えば、 グローバ一 （D. M. Glover) 編 " DNA Cloning vol. 1、 I RLプレス， 1 985) により c DNAを合成し V領域遺伝子 をクロ一ニングする方法がある。
いずれの方法も、 V領域遺伝子クロ—ニングの為のプローブとして、 すで に報告されているマウス免疫グロプリン遺伝子の核酸塩基配列 （例えばサカ ノ （Sakano) ら、 Nature, vol. 286, p. 676, 1 980 ) ；マック ス （E. E. Max) ら、 J. Biol. Chem. vol. 256, p. 51 16, 1 98 1) を参照して合成した DNAプローブ等を利用することができる。 また、 ポリメ レース連鎖反応 （PCR) を利用したクローニングも可能である
(オーランディ （R. Orlandi) ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86， p. 3883, 1 989) ； ヒューズ （W. D. Huse) ら、 Science, vol. 246, p. 1 275, 1 989) 。 これらに代表されるような方法 に従って、 NO K 2抗体産生ハイプリ ドーマより NO K 2抗体の V領域遺伝 子をクローニングし、 塩基及びアミノ酸配列を決定できる （図 1及び図 2参 照） 。
このようにして単離した V領域遣伝子断片を、 ヒト免疫グロプリン定常領 域の上流に連結させてキメラ NOK2抗体遺伝子を作製することができる。 当該キメラ NO K 2抗体が、 濃度依存的に F a sリガンド分子に結合するこ とが EL I S Aにより確認され、 この結果、 本発明者等がクローニングした 免疫グロプリン可変領域遺伝子が抗 F a sリガンド活性を担うものであるこ とが確認される （図 4参照） 。
V領域にあつて抗原と直接的に結合する相補性決定領域領域 （C D R ) を、 ウィンターらの方法 （ウインターら、 Nature, vol. 321, p. 52 2 - 525, 1 986) によりヒト免疫グロプリン可変領域の CD Rに移植 することによって、 キメラ抗体よりもよりヒト免疫グロブリンに近い、 ヒト 型化 NO K 2抗体遺伝子を作製し得る。 ところで、 過去に、 マウス免疫グロ プリンのリシエイピングに関するウインターらの報告 （ウインターら、 Nature, vol. 332， p. 323— 327， 1988 ) や、 免疫グロプリ ン CD R領域の立体構造解析に関するチヨシァらの報告 （チヨシァら、 J. ol.Biol, vol.1 96, p. 90 1— 91 7, 1 987) などにおいて、 CDRの近傍 （一次配列上あるいは立体構造上） にあって CDRの立^!奪造 の維持、 ひいては免疫グロプリンの活性維持に寄与しているフレームワーク (以下、 FRともいう） 領域のアミノ酸 （以下、 FRアミノ酸ともいう） の 存在が示されている。 これらの知見に基づき、 CDRの立体構造の維持ひい ては免疫グ口ブリンの活性維持に寄与していることが示唆される F R領域中 のアミノ酸も、 CDRと併せて移植する。 移植する FRアミノ酸は、 N0K 2抗体のコンピュータモデリングの結果から、 CDRのアミノ酸 （以下、 CDRアミノ酸ともいう） と直接あるいは間接的に相互作用していることが 示唆されたものの中から選出される。
すなわち、 まず、 シリコングラフィ ックス上で起動するソフトウェア QUANTAZCHARMmあるいは Mo d e 1 e r (いずれもモレキュ ラー ' シミュレーションズ社製） 等を用いたモデリングにより、 NOK2抗 体の三次元構造が推定できる。 例えば、 ブルックへーブン 'プロテイン - データバンク （Brookhaven Protein Data Bank) (PDB) に登録されてい る、 N0K2抗体 H鎖可変領域 （VH) 及び L鎖可変領域 （VL) と相同性 力 s高い PDB I D： 1 FORの VHと PDB I D : 1 TETの VLを三 次元構造の銬型として利用し、 分子設計ソフトウエアである前記
QUANTAZCHARMmあるいは Mo d e 1 e rを用いて、 その使用説 明書に従って行なうことができるが、 この鍩型抗体可変領域に限定されるも のではなくその他の NOK2抗体可変領域にホモロジ一のある抗体の高次構 造データが入手できれば、 それを用いても実施可能である。 また、 分子設計 ソフトウェアも QUANT AZCHARMmあるいは M o d e 1 e rに限定 されるものではなく、 その他の一般的なタンパク質を扱える分子設計ソフト ウェアであれば実施可能である。
次に、 搭載されているプログラムを用いて、 上記の NO K 2抗体の推定三 次元構造において H鎖及び L鎖の C D Rに水素結合している F R領域中のァ ミノ酸群 （第一群） を選出し、 更にそれらに水素結合している FR領域中の アミノ酸群 （第二群） を選出する。 同様に、 搭載されているプログラムを用 いて、 N0K 2抗体の H鎖及び L鎖の CD Rにエネルギーコンタク トしてい る FR領域中のアミノ酸群 （第一群） を選出し、 更にそれらにエネルギーコ ンタク トしている FR領域中のアミノ酸群 （第二群） を選出する。 ここでい うエネルギーコンタクトには、 いわゆる静電的相互作用及びファンデルヮー ルスカが含まれる。 CDRアミノ酸と併せてヒト免疫グロプリンの可変領域 の FRに移植するアミノ酸は上記第一群及び第二群の中から選ばれる。 ただ し、 それらの FRアミノ酸のうちで、 ヒト免疫グロブリン中の相当する部位 に移植した結果、 力バットらの分類 （シークェンス ，ォブ ' プロテインズ ' ォブ · イミュノロジカル ' インタレスト、 第 4版、 パブリック ·ヘルス · サービス、 N I H、 ワシントン DC, 1 987) や、 ナショナル ' セン ター ' フォー 'バイオテクノロジ一 · インフォメーション （National Center for Biotechnology Information： NCB I) で開発された情報検索 ソフトウェアであるアントレ （Entrez) (商標） などから引用できる、 ヒト 免疫グロブリンの可変領域ァミノ酸配列には存在しないような配列が生じる 場合については、 そのアミノ酸の移植は行わない。 これにより、 ヒト型化免 疫グロプリンをヒトに投与した場合において抗原性を発揮する可能性が可能 な限り低減される。 NO K 2抗体の CD Rのアミノ酸配列は、 重鎖 CDR 1、 CDR 2、 CDR 3が各々配列表の配列番号 1、 2、 3に記されてお り、 軽鎖 CDR 1、 CDR 2、 CDR 3が各々配列表の配列番号 4、 5、 6 に記されている。 なお、 本発明における FRと CDRの範囲の規定は全て、 上記のカバッ トらの分類に従う。
移植先のヒト免疫グロプリン可変領域アミノ酸配列は、 ヒト型化しようと するマウス免疫グロプリンの可変領域アミノ酸配列に相同性の高いものであ ることが望ましい。 好適な態様として、 受容体ヒト免疫グロブリンのフレー ムワーク領域のアミノ酸配列が、 供与体抗体 （マウス免疫グロブリン） のフ レームワーク領域のァミノ酸配列と経験的に少なくとも 60 %以上のホモ口 ジーを有することが望まれる。 常法として、 利用可能なデータベースからヒ ト型化しようとするマウス免疫グロプリンにホモロジ一の高いヒト免疫グロ プリンが選出されて使用される。 本発明の好ましい態様として NOK2抗 体の CDRをヒト免疫グロプリンの可変領域に移植することができる。 具体 的には、 NOK2抗体の VH領域 （重鎖可変領域） の CDRを、 ヒ トサブグ ループ I Iの FR (フレームワーク） 領域を持つ VH領域である S G I (配 列番号 7 ：英国 MR C コラボラティブ 'センタ一 （MRC Collaborative Centerのベンディック博士より分与されたもの） へ移植する。 NOK2抗 体の VL領域 （軽鎖可変領域） の CDRは、 過去に報告されているヒ ト 《鎖 の FR領域を持つ V L領域である R E I (パーム （W. Palm) ら、 Physiol. Chem.， vol. 356, p 167 , 1975) 、 及び正常人ヒト末梢血リンパ 球由来の c D Ν Αライブラリーからクローニングした/ 鎖の F R領域を持つ VL領域 （huVL— 19 :配列番号 8及び huVL— 31 :配列番号 9 ) に移植する。 実際的なアミノ酸移植は、 VHについてはヒ ト型化抗 H I V免 疫グロプリンである RC 25抗体 （特許国際公開 W094/20632号公 報） の VH遺伝子を銬型に、 VLについては前述のようにして得たキメラ N〇 K 2の V L遺伝子を铸型に使用し、 P C Rによつて変異を導入する PCR 突然変異誘発法により遺伝子レベルで行なわれる。 例えば、 ヒト型 化 NO K 2抗体の H鎖及び L鎖をコ—ドする遺伝子は、 それらの組み合わせ により 10種類のヒト型化 NOK 2抗体を作製し得るように、 H鎖について 2種類、 L鎖について 5種類が作製された。
本発明の、 結合性フラグメント及びそれらの他の誘導体を含む免疫グロブ リンは種々の組換え DNA技術により容易に製造されることができ、 トラン スフエクシヨンされた細胞、 好ましくは不死化された真核細胞、 例えば、 ミ エローマまたはハイプリ ドーマ細胞中で最終的に発現され得る。 ヒト型化免 疫グロプリンフレームワーク領域をコードする第一配列、 及び所望の免疫グ ロブリン相補性決定領域をコ一ドする第二配列セッ トを含むポリヌクレオチ ドが、 合成的にまたは適当な c D N Aとゲノム D N A断片を組み合わせるこ とによって調製される。
上述のごとく調製されたヒト型化抗体構築用の H鎖及び L鎖をコードする 遺伝子は、 配列を発現制御配列に作動可能に連結した後に、 宿主中で発現さ れる。 これらの発現ベクターは、 典型的には、 ェピソームとして或は宿主染 色体 D N Aの肝要な部分として宿生中で複製可能である。 通常、 発現べク ターは、 選択マーカ一、 例えばテトラサイクリン耐性、 G 4 1 8耐性、 ミコ フヱノール酸耐性または H S V— t k等を含み、 所望の D N A配列で形質転 換された細胞の検出を可能とする。
大腸菌は、 本発明の D N A配列をクローニングするために特に有用な一つ の原核生物宿主である。 他にも、 バチルス、 例えば枯草菌及び他の腸内細菌 科、 例えばサルモネラ、 セラチア及び種々のシユードモナス種等が微生物宿 主として使用される。 これらの原核生物宿主において、 また、 発現ベクター を構築することもでき、 該ベクターは、 典型的には、 宿主細胞と適合した発 現制御配列を含む。 さらに、 任意の数の種々の公知のプロモーター、 例え ば、 ラク ト一スプロモーター系、 トリブトファン （ t r p ) プロモータ一 系、 /5—ラクタマーゼプロモータ一系またはス ファージからのプロモーター 系力 s存在してもよレ、。 プロモーターは、 場合によりオペレータ一配列と共 に、 発現を調節し、 そして、 転写及び翻訳を開始し完成させるためのリボ ソーム結合部位配列等を有する。
-他の微生物、 例えば真核生物宿主として酵母もまた発現のために用いられ 得る。 サッカロミセスは、 発現制御配列、 例えば、 3—ホスホグリセレート キナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター及ぴ複製起点、 末端配列及 び所望の類似のものを有する適当なベクタ一を伴った好ましい宿主である。 昆虫細胞培養物もまた、 本発明のヒト型化免疫グロプリンを製造するため に用いられることができ、 代表的にはバキュロウィルスに基づいた発現系が 用いられる。 ヒト型化免疫グロブリンは、 ズ ' プトリッツらにより報告され た方法 （ZuPut l itz. J. ら、 BioZTechnology, vol. 8 , p . 6 5 1 - 6 5 4 , 1 9 9 0 ) に従って、 ヒト型化免疫グロブリンをコードするポリヌクレ ォチド配列を発現することにより製造することもできる。
上述の宿主に加えて、 哺乳動物細胞培養物もまた本発明のヒト型化免疫グ ロブリンを発現し、 製造するために好適に用いられる。 例えば、 その好まし い態様として、 完全な免疫グロプリンを分泌できる多くの宿主セルラインが 本技術分野で開発されており、 それらは、 C H Oセルライン、 種々の C O S セルライン、 H e 1 a細胞、 好ましくはミエローマセルライン等または形質 転換された B細胞またはハイプリ ドーマが例示される。 これらの細胞の発現 ベクタ一は、 発現制御配列、 例えば、 複製起点、 プロモータ一、 ェンハン サ一及び必要なプロセッシング情報部位例えばリボソ―ム結合部位、 R N A スプライシング部位、 ポリァデニル化部位及び転写ターミネ一ター配列を含 む。 好ましい発現制御配列は、 免疫グロブリン遺伝子、 S V 4 0、 アデノウ ィルス、 ゥシパピローマウィルス、 サイ トメガロウィルス、 ニヮトリの/?一 ァクチン遺伝子等由来のェンハンサー、 プロモーターである。
本発明における好適な態様として、 先述のごとく構築されたヒト型化 N 0 K 2抗体の H鎖及び L鎖をコードする遺伝子は、 各々ヒト免疫グロプリ ンの定常領域遺伝子 （H鎖： Cァ 1 , L鎖： C 、 サイ トメガロウィルス 由来のェンハンサー、 ニヮ トリの/?ーァクチン遺伝子のプロモータ一、 ゥサ ギの /?一グロビン遺伝子のスプライスァクセプターサイト及び薬剤耐性マ一 力一としての遺伝子 （H鎖： n e o r， L鎖： d h f r ) を含む発現べク ターに連結され、 当該ベクターは、 宿主細胞のタイプに応じて変更を加えた 良く知られた方法により宿主細胞中に移入される。 例えば、 塩化カルシウム トランスフヱクシヨンは、 通常、 原核生物細胞のために利用され、 一方、 リ ン酸カルシウム処理、 リポフエクシヨン、 ノ イオリスティックス、 ウィルス によるトランスダクションまたはエレクトロポレーションが他の細胞に対し て用いられる。
所望の免疫グロプリンがいつたん 現されれば、 本発明の完全な免疫グロ ブリン、 それらのダイマ一、 個々の軽鎖及び重鎖、 または免疫グロブリンの 他の形態は、 本技術分野の標準方法に従って精製される。 該方法は、 硫安沈 澱、 各種ィォン交換ク口マトグラフィ一及びァフィニティーカラムクロマト グラフィ一等を含む。
薬学的用途のためには、 少なくとも約 9 0〜 9 5 %の均質性の実質純粋な 免疫グロブリ ンが好ましく、 9 8〜 9 9 %あるいはそれ以上の均質性が好ま しい。
本発明のヒト型化免疫グロプリンは、 免疫グロプリン瀵度が 0 . 0 6 g /m 1 (実効澳度） 以上の範囲で可溶性 F a sリガンドが F a s発現細胞に 対して引き起こすアポト一シスを、 9 0 %以上のアポトーシス抑制率で抑制 することができる。 ここで、 アポトーシス抑制率とは、 F a sリガンドを遺 伝子導入した細胞の培養上清より調製される可溶性 F a s リガンドをェフエ クタ一分子とし、 一方、 F a sを遺伝子導入した細胞をターゲット細胞と し、 両者を 9 6ゥエルプレート中で 1 0 0 1の反応系で反応させ、 ター ゲット細胞の 1 6時間後の生存率を生細胞数検出試薬を用いて測定する細胞 障害反応試験において、 免疫グロブリンを添加したときのターゲッ ト細胞の 生存率を意味する。
ヒト型化免疫グロプリンカ ?、 前記 RNOK20 1、 RNOK202及び RNOK 203のいずれかである場合、 F a sリガンドを遺伝子導入した細 胞の培養上清中に含まれる可溶性 F a sリガンドをエフヱクタ一分子とし、 その希釈液 25 μ 1を用い、 一方、 F a sを遺伝子導入した細胞 （F a sZ WR 1 9 L) をターゲッ ト細胞とし、 該細胞の濃度 2 X 105 c e 1 1 s/ m 1液 50；/ 1を用レ そして、 前記免疫グロプリンを含むハイプリ ドーマ の培養上清 2 5 μ 1 を用い、 これらのすべてを混合した後、 37°Cで 1 7時 間反応させたとき、 ターゲッ ト細胞の生存率 （すなわち、 アポトーシス抑制 率） を 90%以上とすることができる。
また、 図 1 5に示されるように、 本発明のヒト型化免疫グロブリンのアポ ト—シス抑制活性は、 同濃度のオリジナル供与体抗体であるマウス免疫グロ プリンを用いた場合よりも高い。 これまでに報告されているヒト型化免疫グ ロブリンの作製においては、 オリジナルの非ヒト免疫グロプリンに比べて大 幅な活性低下を伴っていたことを鑑みれば、 本発明におけるヒト型化免疫グ ロブリンカ これまでにも稀な成功例であることは明白である。
また、 本発明のヒ ト型化免疫グロブリンのァボトーシスの抑制活性は、 F a s - I gキメラ分子よりも高いと言える。 なぜなら、 本発明のヒト型化 抗体を作製するうえでの供与体抗体であるマウス抗体は、 平成 7年特許願第 303492号に記載されたとおり、 0.0 1〜 8 g/m 1の抗体濃度 (実効濃度） において、 同濃度の F a s— I gキメラ分子に比べて、 高いァ ボト一シスの抑制活性を示すことが判っている。 従って、 そのマウス抗体以 上の活性を持つ本癸明のヒト型化免疫グロプリ、ノが、 0.01〜8 g/ m lの抗体濃度 （実効濃度） において、 F a s — I gキメラ分子と同等また はそれ以上のアポトーシス抑制活性を有することは明白である。
本発明のヒト型化免疫グロブリンは、 免疫化学的な研究のみならず、 免疫 治療や診断などに有用である。 このような目的を達成するには、 必ずしも免 疫グロブリン分子全体を用いる必要はなく、 活性を有する限り、 分子の一部 を用いることができ、 場合によってはその方力 ?好ましいこともある。 このこ とは、 当業者であれば容易に理解できることである。 したがって、 本発明 は、 抗 F a sリガンド免疫グロプリンの活性フラグメントをも包含するもの である。 抗体は、 特定の抗原物質を認識する均一な免疫グロブリンである。 活性フラグメントとは、 抗原抗体反応活性を有する免疫グロプリンのフラグ メントを意味し、 具体的には、 F ( a b ' ) 2、 F a b ' 、 F a b , F v、 及び組換え F v体などを挙げることができる。 F ( a b ' ) 2フラグメント は、 免疫グロブリン I g Gをペプシンを用いて消化することにより得られる フラグメントの 1つである。 I g Gを p H 4 . 0付近でペプシン消化する と、 H鎖のヒンジ部で切断されて、 分子量約 1 0万のフラグメントを生成す る。 この切断は、 H鎖間のジスルフイ ド結合よりも C末端側で起こる。 この フラグメントは、 抗原結合部位が 2個あるので、 抗原に結合して、 沈降反応 や凝集反応を起こすことがができる。 F a b ' フラグメントは、 F
( a b ' ) 2フラグメントを 2—メルカプトエタノールなどの試薬で還元し て、 モノョード酢酸でアルキル化すると、 H鎖間のジスルフィ ド結合 （S— S結合） が切断されて生じる分子量約 5万のフラグメントである。
F a bフラグメント （抗原結合性フラグメント （antigen- binding fragment) ) は、 I g Gをパパイン消化することにより得られるフラグメン トの 1つである。 I g Gをシスティンの存在下にパパイン消化すると、 ヒン ジ部の H鎖間のジスルフィ ド結合より N末端側の位置で H鎖を切断し、 2個 の F a bと 1個の F c (結晶形成フラグメント （crystal lizable fragment ) ) を生成する。 F a bフラグメントは、 H鎖の N末端側の約半分に相当す る F dフラグメント （VHドメイン + CH 1 ドメイン） と L鎖がジスルフィ ド結合した分子量約 45, 000のフラグメントである。 F a bフラグメン トは、 抗原結合部位を 1個有している。 Fvフラグメントは、 非共役結合で 結合した H鎖可変部 （VH) と L鎖可変部 （VL) からなる抗原結合可能な フラグメントである。
組換え Fv体は、 免疫グロブリンを産生するハイプリ ドーマから DN Aを シーケンスして、 VHと LHをコードする各塩基配列を決定し、 次いで、 こ れらの DN A断片をべクタ一に組み込んで、 VL—リンカー一 VHの構造を 有する一価の抗体活性フラグメントを産生させることにより得ることができ る。 I gG、 F a bまたは F (a b' ) 2では、 VHと LHは、 S— S結合 により結合している力、 組換え F V体フラグメントでは、 VHと LHとの間 にリンカ一を挿入して、 S— S結合している状態と同様の立体構造がとれる ようにしている。 このフラグメントは、 単に F Vと呼ばれることがあり、 ま た、 s c Fv (—本鎖 Fv) とも呼ばれている。 組換え Fv体は、 大腸菌等 の微生物ゃバクテリオファ一ジによって発現させることもできる。
これらの活性フラグメントは、 単独でも用いられる力 \ 必要に応じて、 ァ ルブミン、 ポリエチレングリコール等の物質と結合させ、 新たな複合物とし て用いることができる。 このような複合物は、 一般に、 生体内では、 長時間 分解されずにその効果を最大限まで発揮することが多い。 活性フラグメント に、 アルブミン、 ポリエチレングリコール等の物質を付加する方法は、 例え ば、 アンティボディ一ズ、 ァ ' ラボラトリー 'マニュアル （Antibodies, A. Laboratory Manual) ， コールドスプリングハ一バー · ラボラ トリ一、 1 9 88に記載されている。 一般的には、 S PDP (フアルマシア製） 等の 2価 反応性試薬を用いれば、 活性フラグメントをアルブミ ン等と容易に結合させ ることができる。
本発明の免疫グロブリン及びそれらの薬学的組成物は、 特に、 非経口投 与、 即ち、 皮下、 筋肉内または静脈内投与において有用であり、 通常、 許容 される担体、 好ましくは水性担体中に溶解される。 種々の水性担体、 例え ば、 水、 緩衝液、 リン酸塩緩衝生理食塩水 （PB S) 、 0.4%生理食塩 水、 0.3%グリシン、 ヒ トアルブミン溶液等力用いられ得る。 これらの溶 液は、 無菌であり、 そして一般的には微粒子物質が存在しない。 これらの組 成物は、 慣用の、 公知の滅菌方法により滅菌される。 組成物は、 生理学的条 件に近づけるために、 要求に応じて、 薬学的に許容できる補助物質、 例えば p H調節及び緩衝化剤、 例え ί 酸ナトリウム、 塩ィヒナトリウム、 塩化力リ ゥム、 塩化カルシウム及びクェン酸ナトリウム等を含み得る。 これらの製剤 中の免疫グロブリンの濃度は、 即ち約 1重量％から 20重量％の広範囲に変 化させることができ、 主として、 選択された投与の特定の様式に従って、 液 容量、 粘性等を基準として選択される。
本発明の免疫グロプリンは、 必要に応じて貯蔵のため凍結または凍結乾燥 され、 使用に先だって適当な溶解液中に再構成される。
F a sリガンドのアミノ酸配列の一部に、 アミノ酸置換を導入した複数の 変異 F a sリガンドを使用することにより、 抗 F a sリガンド抗体が結合す る F a sリガンド上の認識領域を同定することができる。 本発明では、 平成 7年特許願第 303492号に記載の、 N0K2免疫グロブリン （N0K2 抗体と呼称することもある） の認識領域と推察される領域、 すなわち、 F a sリガンドの N端より 207番目の L e uから 220番目の G 1 nまで (以下、 特にことわりがなければアミノ酸番号は長田らの文献 （長田ら、 Int. Immunology, vol.6, p l 567— 1 574, 1 994 ) に従う） の 14アミノ酸を含む 45アミノ酸の領域にアミノ酸の置換 （A 1 a以外のァ ミノ酸は A 1 aに置換し、 元々 A 1 aの部位は G 1 yに置換した） を一ヶ所 ずつ導入した、 45種類の変異 F a sリガンドを作製した。 次に、 これらの 変異 F a sリガンドについて、 上記出願に記載の F a s _F a sリガンドの 相互作用を介して起こるアポト一シスに対して高い抑制活性を持つ抗 F a s リガンド抗体 （N0K 1抗体、 NO K 2抗体、 NO K 3抗体、 NO K 4抗体 を示し、 以下これらを総称して NOK抗体と呼称することがある） 及び本発 明のヒト型化 N 0 K 2抗体との結合性を調べた。
その結果、 上記の NOK抗体及びヒト型化 NOK2抗体は、 F a sリガン ドの第 1 98番目の A r gから第 238番目の Me tまでの領域に含まれる アミノ酸配列に広く結合していることが示された。 また、 NOK l、 NOK 2及び NOK 4抗体に関しては、 合成べプチドを用いた認識領域のマツピン グの結果からも、 F a sリガンドの上記領域中に N0K 1、 N0K2及び NOK4抗体の抗原認識 ·結合に重要な役割を演ずるァミノ酸が含まれてい ることが改めて示唆された。
前述の NOK抗体は、 F a sリガンド発現細胞をマウスに免疫して得られ たモノクローナル抗体である （平成 7年特許願第 303492号の明細書、 発明の詳細な説明、 実施例 1に記載） 。 また、 上記 NOK抗体及びヒト型化 NOK 2抗体は、 F a s— F a sリガン ドの相互作用を介して F a s発現細 胞に誘導されるアポトーシスに対して強い抑制活性を有する抗体である （平 成 7年特許願第 303492号の明細書、 発明の詳細な説明、 実施例 1及び 2並びに本特許出願、 明細書、 発明の詳細な説明、 実施例 4に記載） 。 すな わち、 NOK抗体はネイティブな構造を持った F a sリガンドを免疫して得 られた高いアポトーシス抑制活性を持つ初めての抗 F a sリガンドモノク 口一ナル抗体である。 しかも、 これらのモノクローナル抗体の CDR (相補 性決定領域） のアミノ酸配列は各々で異なり、 抗体のクラス及びサブクラス も異なる、 すなわち全く独立な抗体である。
それら全く別々の抗体の認識領域が、 前述のように、 F a sリガンドの第 1 98番目の A r gから第 238番目の Me tまでのアミノ酸配列で形成さ れる広い領域に存在していることから、 高いアポトーシス抑制活性を持つ抗 F a sリガンド抗体は、 一般的に上記の領域に含まれるアミノ酸を認識領域 として認識していると結論することができる。 換言すれば、 上記の領域は F a sリガンド分子中に存在する、 高いアポトーシス抑制活性を有する抗 F a sリガンド抗体を惹起することができる領域なのである。 さらには、 上 記領域は F a sリガンドがアポトーシス誘導活性を発揮するために重要な領 域であり、 この領域を認識し結合できる物質はアポト一シス抑制活性を示す ことができることを示唆している。
前述の変異 F a sリガンド及び合成べプチドを用いた、 認識領域の解析で 得られた実験データを、 市販の分子設計ソフトウェアを用いて構築した F a sリガンド分子立体構造モデルに適応すれば、 上記の高いアポトーシス 抑制活性を持つ各抗体の結合領域の全貌を明らかにすることが可能である。
F a sリガンド分子モノマーのモデリングは、 ブルックへ一ブン · プロテ ィン · データバンク （Brookhaven Protein Data Bank) (PDB) に登録さ れている、 F a sリガンドに相同性力 s高い TNF a (PDB I D : 1 TNF) 及び TNF/? (PDB I D : 1 TNR) の X線結晶構造デ—夕を 铸型に、 分子設計ソフトウェアである Mo d e 1 e r (モレキュラー · シ ミュレーシヨンズ （Molecular Simulations) 社製） を用い、 その使用説明 書に従って行なうことができる。 F a sリガンド三量体モデルは分子設計ソ フトウェアである QUANTA, CHAR Mm (モレキュラー 'シミュレ一 ションズ （Molecular Simulations) 社製） を用いて、 TNF。の三量体で ある PDB I D： 1 TNFの原子座標に、 前述の F a sリガンドモノマー モデルを、 TNFモノマーの各々のセグメントに重ね合わせ （スーパ一イン ポーズ） て構築することができる。
本発明では、 分子設計ソフトウエアとして Mo d e 1 e r及び
QUANTA/CHARMm (共にモレキュラー ' シミュレーションズ （ Molecular Simulations) 社製） を用いた力 ?、 それに限定されるものではな く、 その他の一般的なタンパク質を扱うことのできる分子設計ソフトウエア であればどのメ一カーのソフトウェアでも可能である。 また、 铸型タンパク 質として TNF。及び/?を用いたが、 TNFファミリ一であればこの TNF α及び に限定されるものではない。
このようにして得られたモデル上に、 上述した各 NO Κ抗体及びヒト型化 N0K 2抗体が結合する領域を重ねた結果、 驚くべきことに、 上記各抗体が F a sリガンド三量体力 ?形成されて初めて出現する F a sリガンド 2分子に またがる広範囲な領域に結合していることが明らかになった。 Fa リガン ドと抗 F a sリガンド抗体の関係において、 このような知見はこれまでの報 告にない新規なものである。
一般的に、 抗体の抗原結合領域は CD R (相補性決定領域） と言われてい る 6箇所からなる領域で、 その広さは結合する抗原によっても異なるが通常 の大きなタンパク質抗原の場合約 700平方オングストローム （笹月健彦監 修、 免疫生物学、 南江堂、 1 28ページ、 1 995年） から約 900平方ォ ングス トローム （チューリ ップ （Tulip W. R. ) ら， J. Mol. Biol. , vol.
227, p. 1 22- 148, 1 992) と言われている。 F a sリガンド分 子は通常は約 40 kDの膜貫通型タンパク質として細胞表面に存在するが、 その細胞外ドメイン部分はプロセシングを受けることにより、 約 27 kDの 遊離型分子としても存在することができる。 さらに、 F a sリガンドモノ マーが三分子会合することにより、 F a sリガンド三量体を形成すること力？ できると言われている。 この程度の大きさのタンパク質になれば、 CDR領 域をフルに使って抗原と抗体はタンパク質同士の面と面で接触している （笹 月健彦監修、 免疫生物学、 南江堂、 128ページ、 1 995年） 。
従つて、 本発明により明らかになった F a sリガンド三量体上のアポト— シス活性抑制に関連した領域は、 面として表すこともできる。 一般的に面は 一直線上にない 3点 A (XA, YA， Z A) B (XB, YB, ZB) C
(XC, YC, ZC) で規定される平面として表示することができる。
F a sリガンド三量体モデルから得られる各抗体の認識アミノ酸の原子座標 データをこの式に当てはめれば、 F a sリガンド三量体モデルに存在する抗 原の面を計算することができる。 このような面を定義するために必要なァミ ノ酸は、 各抗体の認識アミノ酸の中から任意に選択された 3個のアミノ酸と して設定することができるが、 望ましい例として、 隣合う二つの F a sリガ ンド分子のうちの一方の 200番 G 1 n、 他方の F a sリガンド分子上の 2 03番 A s n、 220番 G l nが挙げられる。 これらの各ァミノ酸の a位の 炭素 （C o) 原子の座標の組合せによって規定される面は、 各抗体の認識ァ ミノ酸から構成される領域面をカバーすることができる。 実際の抗体と接触 する面または抗体の原子が F a sリガンド三量体に向かって通過してくる面 は、 各 C。原子の座標から F a sリガンド分子と反対側にアミノ酸残基の側 鎖の長さとさらに一般的なファンデルワールスコンタク トのカッ ト ' オフ (Cu t o f f ) 値である約 4. 1オングストローム離れた位置に構成され る面になると考えられる。
さらに、 抗 F a sリガンド抗体の CD R領域の大きさから、 F a sリガン ド三量体上のアポトーシス活性抑制に関連している領域を構成しているアミ ノ酸を明らかにすることが可能である。 抗 F a sリガンド抗体の CDR領域 の大きさは、 その可変領域のアミノ酸配列の長さから一般的な抗体のそれと 大きな違いはないと考えられる。 本発明では、 抗 F a sリガンド抗体の実際 の CD R領域の大きさを明らかにするために、 抗 F a sリガンド抗体の代表 として前述の N 0 K 2抗体の立体構造モデルを利用したが、 C D R領域のァ ミノ酸数は各 N0K抗体及びヒト型化 N0K2抗体で大きな違いはないの で、 いずれの抗体を用いてもかまわない。 さらに、 CDR領域の大きさを測 定するだけなら、 これらの抗体に限定されるものでもない。
NO K 2抗体の CD R領域を調べると、 半径約 1 7オングス トロームの円 とほぼ同じサイズを持っていることが明らかとなった。 この半径約 1 7オン グストロームの円と前述の F a sリガンド三量体モデル上の各抗体の認識ァ ミノ酸からなる領域とを比較した結果、 この半径約 1 7オングストロ一ムの 円の中に F a sリガンド三量体上の各 N〇K抗体及びヒト型化 NO K 2抗体 の認識領域ァミノ酸が全てカバーされていることが明らかとなった。 このこ とは、 高いアポトーシス抑制活性を持つ抗 F a sリガンド抗体力、 この円内 に示されたアミノ酸からなる領域を共通して認識しており、 逆にこの円の範 囲にある F a sリガンド三量体のアミノ酸であれば、 抗 F a sリガンド抗体 の C D R領域ァミノ酸と相互作用することができることを示している。 抗 F a sリガンド抗体の CDR領域アミノ酸と相互作用可能なアミノ酸は、 こ の円内にあって F a sリガンド三量体上に露出しているアミノ酸なら全てそ の候補となり得る力 s、 1 5平方オングストローム以上のアミノ酸残基の露出 表面積を持つ F a sリガンド三量体の表面ァミノ酸として選択することが望 ましい。 その望ましいアミノ酸として、 隣合う二つの F a sリガンド分子の うちの一方の分子の 1 53番 S e r、 166番 Ty r、 168番 I l e、 1 98番 A r g、 1 99番 G l y、 200番 G l n、 237番 G l n、 238 番 Me t、 24 1番 A r g、 242番 S e r、 269番 P h e、 270番 G l u、 27 1番01 ：、 272番 S e rの各アミノ酸、 他方の F a sリガ ンド分子の 1 57番 S e r、 1 58番 Me t、 1 59番 P r o、 1 6 1番 G l u、 178番 L y s、 1 79番 G l y、 203番 As n、 204番 As n、 205番 L e u、 206番 P r o、 208番 S e r、 2 1 0番 L y s、 2 12番 Ty r、 2 14番 A r g、 2 18番 Ty r、 2 1 9番 P r o. 220番 G l n、 22 1番 As p、 222番 L e u、 223番 V a 228番 L y s、 230番 Me t、 232番 Ty r、 256番 H i s, 258番 Ty r、 260番 As n、 262番 S e r、 263番 G l u、 264番し 6 !、 265番 S e rの各アミノ酸を挙げることができ る。 即ち、 F a sリガンド三量体上のこれらの領域に含まれるアミノ酸と相 互作用することが、 高いアポト一シス抑制活性をもつタンパク質、 ぺプチ ド、 望ましくは抗体もしくはその類似物にとって重要である。
本発明のアポトーシス抑制活性を発揮する物質とは、 F a sリガンドに特 異的に反応するヒト型化免疫グロプリンに加えて、 前述の F a sリガンド上 のアポトーシス抑制活性に重要なドメィン、 領域あるいはそのアミノ酸を特 異的に認識して反応することのできる物質であれば、 本質的にいかなる物質 であってもよレ ι。 特に免疫グロプリンのように蛋白質分子上の特定のァミノ 酸を認識し結合する物質が好ましく、 さらに、 免疫グロブリンに由来するフ ラグメントあるいはその類似物、 前述の領域を認識できるように改良したレ セプタ一改変体、 特定のアミノ酸を認識して反応する酵素類などが好ましい 物質として挙げられる。 それらの蛋白質物質は遺伝子組換え技術によって作 製することもできるので、 組換え蛋白質として定義することもできる。 ま た、 そのような蛋白性物質から由来したアミノ酸配列を基にした合成べプチ ドゃ、 ファージデイスプレイシステムなどのランダム配列を有するペプチド ライブラリーから F a sリガンド上のアポト一シス抑制活性に重要なドメィ ン、 領域あるいはそのァミノ酸に対する認識能を指標にスクリ一ニングする ことによって得られた全く新しい配列を持ったぺプチド、 さらにはそれらの ぺプチドを基にして自然界にない合成べプチドによって作製されたべプチド 様物質なども、 認識物質の候補として挙げられる。
前述の如く、 最近の研究により、 F a sと F a s リガンドの生理的反応が A I D S , 骨髄移植における移植片拒絶反応 （G V H D ) 、 劇症肝炎、 自己 免疫疾患 （S L E , R A) などの様々な疾患に関連していることが明らかに される中で、 F a sリガンドに特異的に反応し該生理的反応を抑制できる活 性を持つ本発明のヒト型化免疫グロプリンは、 それらの疾患の治療薬として 使用することができる。
また、 本願発明により明らかにされた F a s リガンド上のアポトーシス誘 導活性の癸揮に必要な領域は、 高いアポトーシス抑制活性を持つ抗 F a sリ ガンド抗体を惹起する領域としてもその重要性は高い。 この知見は、 他の 様々なアポト一シス抑制分子をデザィンする上で重要な情報を与える。 すな わち、 上記知見に基づけば上記領域に含まれるアミノ酸に対して特異的に反 応し、 アポトーシスを抑制する組換え蛋白、 ペプチドなどを作出し、 新たな 治療薬或いは臨床診断薬等に応用することができる。
以下、 本発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、 本発明は これらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例
本実施例に記載する NOK抗体は、 平成 7年特許願第 303492号の発 明に含まれるものであり、 これは全ての目的のために引用されることにより 全体として本明細書の一部となる。 その作製法は上記出願明細書に詳述され ている力'、 その概略は以下の通りである。
まず、 F a sリガンドを発現しているヒトキラ一 T細胞から常法により調 製した c DNAを铸型に、 長田らの報告 （長田ら、 Cell, vol.75, p. 1 169— 1 1 78, 1 993 ) に基づいて作製したプライマーを用いて P CRを行ない、 ヒ ト F a sリガンド遺伝子を増幅した。 増幅された遺伝子 はプライマーに付加されていた制限酵素切断部位を利用して、 発現ベクター BCMGSNe o (烏山一， 実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック， 羊土 社， p. 297— 299, 1 992 ) に連結して F a sリガンド発現プラス ミ ドカ作製された。 この発現プラスミ ドを、 常法の DE AE—デキス トラン 法により CO S細胞 （AT CC CRL 1 650) に導入して F a sリガン ド発現 CO S細胞力 ?作製された。 本 F a sリガンド発現 CO S細胞を、 MPL 1 p r/ 1 p rマウスの腹腔内に 1週間隔で 3回免疫し、 最終免疫 から 3日目に脾臓を摘出した。 摘出した脾臓から得た細胞は、 ポリエチレン グリコールを用いる常法により、 マウス由来の 8—ァザグァニン耐性細胞で ある P 3 X63Ag 8. 653 (ATCC CRL 1 580 ) と細胞融合さ れた。 このようにして得られたハイプリ ドーマを限界希釈法によりクロ一二 ングし、 各クローンを培養して得られた培養上清の中に存在する免疫グロブ リンについて、 後述するアポトーシス抑制活性の測定を行なうことによりス クリーニングして、 F a sリガンドに特異的に反応するモノクローナル抗体 NOK2を産生するハイプリ ドーマ （工業技術院生命工学工業技術研究所に 寄託されている受託番号 FERM BP- 5045のハイプリ ドーマ NO K 2) を得た。
同様にして、 NOKl、 NO K 3及び NO K 4抗体を得た。
実施例 1
(キメラ N0K2抗体 （CNOK2) の作製）
1 -1) NOK2抗体可変領域遺伝子の単離
マウス免疫グロプリン可変 （V) 領域遺伝子の単離については以下のよう に行なった。 まず、 NO K 2産生ハイプリ ドーマ細胞から二ツボンジーン社 製の RNA抽出試薬イソジェン （I SOGEN) (商品名） を使用して全 RNAを抽出した。 方法はキッ トに添付のプロトコ一ルに従った。 なお、 NO K 2抗体を産生するハイプリ ドーマは、 工業技術院生命工学工業技術研 究所に寄託されている FERM B P- 5045に同じものである。 次に、 抽出した全 RNAからストラテジーン （STRATAGENE) 社製のポリ
(A) クイック mRNAアイソレーション （POLY (A) QUIK mRNA I SOLATI ON) キッ ト （商品名） を用いてメッセンジャー RNA (mRNA) を調製した。 方法はキッ トに添付のプロトコールに従つ た。 続いて、 この mRNAを铸型にフアルマシア 'バイオテック （ Pharmasia Biotech) 社製の第一鎖 cDNA合成 （First Strand c DNA Synthesis) キッ ト （商品名） を用いて 1本鎖の c D N Aを合成した。 ブラ イマ一はキッ トに添付のオリゴ （dT) プライマーを使用し、 方法は添付の プロトコールに従った。 このようにして得た一本鎮 c DNAを铸型に、 力 バットらの分類した V領域と J領域の核酸塩基配列 （シークェンス ·ォブ - プロティンズ . ォブ ' イミュノロジカル ' インタレス ト、 第 4版、 パブリッ ク ·ヘルス ·サービス、 N I H, ワシントン DC、 1987) を基にして合 成した DN Aプライマ一 （重鎖ノ MHL4. 4プライマー ：配列番号 10、 MH J 124プライマー ：配列番号 1 1 ；軽鎖 ZMKL 2. 4プライマー ： 配列番号 12、 MK J 124プライマー ：配列番号 13 ) を用いてポリメ レース連鎖反応 （PCR) を行なった。 V領域プライマーと J領域プライ マーには各々 H i n d I I I と B amH Iサイ トが付加されている。
P CRはパーキン .エルマ一 （PER KIN E LMER) 社製のキットを 使用し、 添付されているプロトコールに従って行なった。 PCRの条件は、 94°C1分、 60°C2分、 72 °C 2分で 35サイクル行なった。 PCR後、 得られた DN A断片をインビトロジェン （Invitrogen) 社製の pCR I Iベ クタ一 （商品名） へクローニングした。 方法は添付のプロトコールに従つ た。
1 -2) マウス N0K2抗体 V領域遣伝子の塩基配列
パーキン · エルマ一社製のダイプライマーサイクルシークェンシング （ Dye Primer Cycle Sequencing) キッ ト （商品名） を用いてシーケンス反応 を行ない、 得られた反応産物をォートシーケンサにアプライして p CR I I に組み込まれた V領域遺伝子の塩基配列を決定した。 その結果得られた NO K 2抗体の重鎖の可変領域 （VH) 及び軽鎖の可変領域 （VL) の塩基 配列を図 1及び図 2に示す （VH :配列番号 14、 VL :配列番号 15) 。 また、 その核酸塩基配列から得られるアミノ酸配列 （VH :配列番号 16、 VL :配列番号 17) についても併せて図 1及び図 2に示す。 NO K 2抗体 の塩基配列はいずれも V領域遺伝子特有の再配列を起こしており、 しかも発 現可能なオープンリーディングフレーム （〇RF) をとっていること力確認 できた。
1 -3) キメラ NOK 2抗体発現遺伝子 （CNOK2H, CNOK2 L) の 構築
単離された N 0 K 2抗体 V領域遺伝子が本当に抗 F a sリガンド活性を担 う V領域をコ一ドする遣伝子であるかどうかを確認するために、 マウス—ヒ トキメラ抗体を作製した。 キメラ抗体の発現のためにニヮトリ 一ァクチン 遺伝子のプロモータ一とゥサギ /?—グロビン遺伝子のスプライシングァクセ プタ一配列及びサイ トメガロウィルス由来のェンハンサ一を持った発現べク 夕一 p C AG— /c及び p C AG-7 1を使用した。
Figure imgf000044_0001
特許国際公開 WO 94 /20632号公報に記載されて いるヒ ト型化抗 H I V中和モノクロ一ナル抗体である R C 25の、 軽鎖発現 プラスミ ドである RHC 25プラスミ ドに由来するヒト免疫グロプリンの κ 鎖定常領域遺伝子とポリアデニレーショ ン部位、 pSV2— d h f rプラス ミ ド （Lee, F. ら、 Nature, vol. 294, p.228-232, 1981 ) に由来する真核細胞中での選択マ一カーとしての d h f r遺伝子と S V40 プロモーターとポリアデニレーション部位、 及び特開平 3— 168087の 公報に記載の p C AGプラスミ ドに由来する原核細胞中での選択マーカーと しての Ampr遺伝子とサイ トメガロウィルス （CMV) のェンハンサ一と ニヮトリの /3—ァクチン遺伝子のプロモーター及びゥサギの/?一グロビン遺 伝子のスプライスァクセプタ一サイ トを、 通常の遺伝子工学的手法により連 結したものである。 また、 該ベクタ一プラスミ ドのゥサギ /?一グロビン遺伝 子のスプライスァクセプターサイ トの下流には H i n d I I Iサイ ト力 s、 ヒ ト免疫グロプリン/ 鎖定常領域遺伝子の上流には B amH Iサイ トが付加さ れている。
p C AG- 71は、 文献 （前田ら、 Hum. Antibod. Hybridoraas, vol. 2， p 124 - 134, 1991 ) に記載の H C M V— VH 0.5 /? - 1 プラスミ ドに由来するヒト免疫グロブリンのァ 1定常領域遺伝子とポリアデ 二レーション部位、 特開平 2— 5890の公報に記載の p A d . RE. n e oプラスミ ドに由来する真核細胞中での選択マ一カーとしての n e o r 遺伝子と SV40プロモータ一とポリアデニレーション部位、 及び特開平 3 - 168087の公報に記載の p C AGプラスミ ドに由来する原核細胞中で の選択マーカーとしての Amp r遺伝子とサイ トメガロウィルス （CMV) のェンハンサ一と二ヮ トリの/?—ァクチン遺伝子のプロモーター及びゥサギ の ーグロビン遺伝子のスブライスァクセプタ一サイ トを通常の遺伝子工学 的手法により連結したものである。 また、 該ベクタープラスミ ドのゥサギ /? 一グロビン遺伝子のスプライスァクセプタ一サイ トの下流には
H i n d I I Iサイ トが、 ヒ ト免疫グロプリンァ 1定常領域遺伝子の上流に は B amH Iサイ トが付加されている。
1 - 2) 項に記載したようにして調製した N 0 K 2抗体 V領域遺伝子を制 限酵素 H i n d I I Iと B amH I (いずれも宝酒造社製：以下、 特に断り のない限り制限酵素は宝酒造のものを使用した） で消化し、 重鎖の可変領域 (VH) 断片及び軽鎖の可変領域 （VL) 断片を各々 pCAG_ァ 1及び pCAG—/ cの H i n d i I I—B amHIサイ トに組み込んだ （各々 CNOK2H及びCNOK2 L；図 3) 。
1—4) キメラ NOK2抗体 (CNOK 2) の発現
キメラ N0K2抗体 (CNO 2) を産生する形質転換細胞を作製する為 に、 前述のプラスミ ド DNA CNOK2Hと CNOK2 Lをギブコ （Gibco BRL) 社製の L i p 0 f e c t ACE (商品名） を用いる方法により CHO— DG44細胞 （チェイシン （Chasin, L. A.) ら、 Somatic Cell. ol. Genet. , vol. 1 2， p. 555 - 566, 1 986) に導入した。 方 法は、 基本的には L i p 0 f e c t ACEに添付のプロトコールに従った。 以下簡潔に述べると、 まず、 キアジヱン （Q I AGEN) 社製のキッ トで調 製した両プラスミ ド DNA 1 μ gずつを制限酵素 Ρ V u Iで線状化し、 L i p 0 f e c t ACEとの混合物にして CH0— DG44細胞に導入し、 l mMのG4 1 8 (ギブコ BRL社製） 及び 10%の透析済牛胎児血清 (ギブコ BRL社製） を含むヌクレオチド非含有ひ一 MEM培地 （ギブコ BRL社製） で、 37°C、 5 %C〇 2の条件下で 2週間培養した。 この条件 下で増殖する細胞は、 CN0K2H及び CN0K2 Lプラスミ ド DNAで共 形質転換されたものである。 こうして得られた形質転換細胞を上記の培地で 継代、 拡張し、 75 c m2の培養フラスコ （コ一二ング （CORN I NG) 社製） 内でコンフルェントに達した時点で、 20m lの AS F培地 （商品 名） （味の素株式会社製） へ切り換え、 37T：、 5 %C〇 2の条件下で 7日 間培養した後、 上清を回収した。
1 -5) 培養上清の濃縮及びその中に含まれる CN0K2抗体の定量 回収した A S F培養上清をアミコン （Amicon) 社製のセントリコン— 1 0 (Centricon- 1 0) スピンカラム （商品名） を用いて 1 0倍に濃縮し た。 この濃縮した上清中に含まれるキメラ抗体の量を EL I S Aにより定量 した。 詳しくは、 まずインタ一メッ ド （InterMed) 社製の 96ウェルマキ シソープ （Maxisorp) プレート （商品名） に、 2 g/m 1の濃度のャギ 抗ヒト I g G (F c ) 抗体 （力ッペル （Cappei) 社製） を 50 1ノウェ ルで添加した。 4°Cで一晩インキュベーションした後、 0.05%
Twe e n 20含有 0.01M PB Sで 3回洗浄した。 続いて、 1%BSA 含有 P B Sを 1 00 / 1 ウエルで添加し、 37°Cで 3時間ィンキュベ一 シヨンした。 再び、 0.05%Twe e n 20含有 0.01M PBSで 3回 洗浄した後、 前述の培養上清濃縮液を 5 O 1/ゥエルで添加し、 37°Cで 1時間ィンキュベーシヨンした。 その後、 0.05%Twe e n 20含有 0. 0 1M P B Sで 3回洗浄し、 二次抗体の H R Pラベル抗ヒト I g— C κ抗 体 （サザーン 'バイオテクノロジー ·ァソシェ一ト （Southern
Biotechnology Associate) 社製） を 1 %B S A含有 F B Sで 5000倍に 希釈したものを 5 O 1 ウエルで添加した。 37でで 1時間インキュベー ションした後、 0.05 % T w e e n 20含有 0.01M PB Sで 5回洗浄 した。 最後に発色基質溶液 （0.5mM TMBZ+過酸化水素） を 5 O 1 ウエルで添加し、 適当な発色が得られたところで、 0.3N 硫酸を 50 1 Zゥヱルで添加して反応を停止させ、 その後マイクロプレートリーダ一 (モレキュラー ·デバイシズ （Molecular Devices) 社製） で波長 450 nmにおける吸光度を測定した。 同様の方法で、 濃度が既知の標準ヒト I gGを用いて検量線を作成し、 それをもとに RN0K2の濃度を算出し た。 檩準ヒト I gGとしては、 キメラ NO K 2抗体と同じ F c及び C Kを持 っ抗 H I V中和モノクローナル抗体である RC 25抗体 （特許国際公開 W0 94/20632号公報） の精製品 （純度 98 %以上） を用いた。
1 -6) 可溶性 F a sリガンド分子の調製
F a sリガンド遺伝子の単離から F a sリガンド発現細胞の作出及び可溶 性 Fa sリガンド分子の調製までの方法は、 平成 7年特許願第 303492 号明細書に記載の方法と同じである。 以下に概略を述べる。 まず、 ヒト F a sリガンドを発現しているヒトキラー T細胞から、 常法に より抽出した mRNAをもとに c DNAを調製した。 次に、 長田らの文献 (長田ら、 Int. Immunol. , vol. 6， N o. 1 0, p. 1 5 6 7— 1 5 7 4, 1 9 94) に記載のプライマー （5， 側プライマーには X h o Iサイ ト、 3， 側プライマーには N o t Iサイ ト力付加されている） を用いて、 先 の c DNAを銬型に P CRを行ない、 その増幅産物としてのヒト F a sリガ ンド遺伝子を得た。 このヒ ト F a s リガンド遣伝子を X h 0 Iサイト及び N 0 t Iサイ トで、 発現ベクター BCMG SN e o (烏山一， 遺伝子工学ハ ンドブック， 羊土社， p. 2 9 7— 2 9 9 , 1 9 9 2 ) に組み込んでヒ ト F a s リガンド発現プラスミ ド （ヒ ト F a s リガンド一 BCMG S N e o) を得た。 続いて、 このプラスミ ドを常法により大腸菌内で増幅して回収し、 DEAE—デキストラン法 （実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ 4， 遺 伝子導入と発現解析法， 羊土社， p. 1 6 - 2 2 , 1 9 94) により CO S 細胞 （ATCC CR L 1.6 5 0) に導入して F a s リガンド発現 CO S細 胞を得た。 次に、 この F a sリガンド発現 C 0 S細胞を 1 0 % F C S— DME培地で培養し、 その培養上清中に放出された F a s リガンド分子を、 平成 7年特許願第 3 0 34 9 2号明細書に記載の抗 F a s リガンド抗体であ る NOK 1抗体 （受託番号 F ERM B P— 5 04 4で規定されるハイプリ ドーマによって産生される抗体） を用いてァフィ二ティ精製した後、 0. 4 5 μ mのフィルターで濾過滅菌し、 これを可溶性 F a s リガンド分子とし た。 F a s リガンドが精製されていることは、 S D S— PAGEにより、 単 一のバンドか'検出されたことで確認した。 F a s リガン ドの濃度は、 波長 2 8 0 nmにおける吸光度を基に決定した。
1 - 7) CNOK 2抗体の可溶性 F a sリガンドへの結合性の確認 可溶性 F a sリガンドと抗ヒト I gGを用いた EL I SA法により、 港縮 上清中に存在するキメラ抗体の活性を測定した。 具体的には、 まずインタ一 メッ ド社製の 96ウェルマキシソーププレート （商品名） に、 1— 6) に記 載の方法で調製した 50 n gZm 1の濃度の可溶性 F a sリガンド溶液を 5 0 1 ウエルで添加した。 4ででー晚インキュベーションした後、 0.0 5%Twe e n 20含有 0.0 1M PB Sで 3回洗浄した。 続いて、 1 % B S A含有 PB Sを 1 00 1ノウエルで添加し、 37 で 2時間ィンキュ ベ一シヨンした。 再び、 0.05%Twe e n 20含有 0.0 1 M P B Sで 3回洗浄した後、 前述の培養上清濃縮液 （ 1一 4 ) で作製） を 50 1 / ゥエルで添加し、 37 で 2時間インキュベーションした。 その後、 0.0 5 % T w e e n 20含有 0.0 1M PB Sで 3回洗浄し、 二次抗体の HRP ラベル抗ヒト I g— C κ抗体 （サザ一ン 'バイオテクノロジー 'ァソシェ一 ト社製） を 0. 1 % B S A含有 P B Sで 5000倍に希釈したものを 50 1 /ゥエルで添加した。 37 °Cで 1時間インキュベーションした後、 0.0 5%Twe e n 20含有 0.0 1M PB Sで 5回洗浄した。 最後に発色基質 溶液 （0.5mM TMBZ+過酸化水素） を 5 O 1 /ゥヱルで添加し、 適 当な発色力 5得られたところで、 0.3N 硫酸を 50 1 /ゥエルで添加して 反応を停止させ、 その後マイクロブレートリ一ダ一 （モレキュラー 'デバィ シズ社製） で波長 450 nmにおける吸光度を測定した。 CNOK2H及び CNOK2 Lプラスミ ド DN Aの共形質転換による発現産物力 濃度依存的 に F a sリガンドと結合したことから、 上記の単離した NOK 2抗体 V領域 遺伝子が間違いなく抗 F a sリガンド活性を持った抗体の V領域をコードし ている遺伝子であることが確認された （図 4) 。
実施例 2 (ヒ ト型化 N0K2抗体 (RNOK2) の作製）
2— 1) PCR突然変異誘発法による NOK2抗体 V領域遺伝子の CDR移 植
クローニングした NOK2抗体の VH、 VL領域中の CDR (相補性決定 領域；配列表配列番号 1〜 6 ) を各々ヒ ト免疫グロブリンの VH、 VL領域 へ移植した。 方法は、 ヒト型化免疫グロブリン作製方法 （特開平 4一 14 1095号公報） に従った。 NO K 2抗体の VH領域の CD Rはヒトサブグ ループ I Iの FR (フレームワーク） 領域を持つ VH領域である S G I (英 国 MR C コラボラティブ ·センターのベンディック博士より分与されたも の） へ移植した。 NOK2抗体の VL領域の CDRは、 過去に報告されてい るヒト κ鎖の FR領域を持つ VL領域である RE I (パ一ムら、 Physiol. Chem. , vol. 356， p. 167, 1 975) 、 及び正常人ヒト末梢血リン パ球由来の c D N Aライブラリーからクローニングした/ 鎖の F R領域を持 つ VL領域 （h u VL— 1 9及び h uVL— 3 1) に移植した。
NO K 2抗体のヒト型化においては、 まず、 コンピュータモデリングによ り NO K 2抗体の推定 3次元構造を構築した。 具体的には、 N0K2抗体重 鎖及び軽鎖の可変領域ァミノ酸配列を基に、 ブルックへーブン · プロティ ン · データバンク （Brookhaven Protein Data Bank) (PDB) とのホモ口 ジー検索を行ない、 铸型となる抗体の重鎖可変領域 （PDB I D： 1 FOR) と輊鎖可変領域 （PDB I D : 1 TET) を選定した。 次に、 シ リコングラフィ ックス上で起動するソフ トウェア QUANT AZ
CHARMm (モレキュラー ' シミュレーションズ） を用いてモデリングを 行なった。 モデリングの工程は 1 ) 上記铸型可変領域ァミノ酸の原子座標に N0K2抗体のアミノ酸配列をコピー、 2) エネルギー極小化計算 （最大傾 斜法） 、 3) 温度 300 Kから 0 Kへ 2, 400ステップかけて冷却、 4) エネルギー極小化計算 （最大傾斜法） 、 5) 温度 0 Κから 300 Κへ 7, 5 00ステップかけて加熱、 6) 30， 000ステップ （30ピコ秒に相当） の平衡化、 7) 20, 000ステップ （20ピコ秒に相当） のシミュレ一 シヨン、 から成る。 次に、 上記のシミュレーションにおいて計算 1 00毎に 1つの構造を抽出し （合計 200構造） 、 これらを上記ソフトウェアに搭載 されているクラスタ解析プログラムを用いて 5つの群に分類した。 最終的 に、 上記 2) のエネルギー極小化計算の結果で得られた 1構造及び上記 5群 の各々の中で最少のエネルギーを持つもの合計 5構造を抽出し、 これら 6種 の構造を ΝΟΚ2抗体の推定 3次元構造とした。 次に、 同ソフ トウェアに搭 載されているプログラムを用いて、 上記 ΝΟΚ2抗体の推定三次元構造の 各々において Η鎖及び L鎖の C D Rに水素結合している F R領域中のァミノ 酸群 （第一群） を選出し、 更にそれらに水素結合している FR領域中のアミ ノ酸群 （第二群） を選出した。 同様に、 同ソフトウェアに搭載されているプ ログラムを用いて、 Η鎖及び L鎖の CDRにエネルギーコンタクトしている FR領域中のアミノ酸群 （第一群） を選出し、 更にそれらにエネルギーコン タクトしている FR領域中のアミノ酸群 （第二群） を選出した。 ここで言う エネルギーコンタク トには、 いわゆる静電的相互作用及びファンデルワール ス力が含まれる。 また、 上記水素結合アミノ酸の選定及びエネルギーコンタ クト計算のために必要なパラメータとしては、 上記プログラムの初期設定値 を採用した。 続いて、 水素結合で選ばれた第一群 ·第二群の FRアミノ酸 と、 エネルギーコンタク トで選ばれた第一群 ·第二群の FRアミノ酸のうち で、 上記 6種の推定構造のうち 4種以上において選ばれた F Rアミノ酸を、 CDRの立体構造維持に寄与している FRアミノ酸として CDRアミノ酸と 併せてヒト免疫グロブリンの可変領域の FRに移植することにした。 ただ し、 それらの FRアミノ酸のうちで、 ヒト免疫グロブリン中の相当する部位 に移植した結果、 力バッ トらの分類 （シークェンス ' ォブ ' プロテインズ - ォブ ' イミュノロジカル ' インタレスト、 第 4版、 パブリック ·ヘルス ' サービス、 N I H、 ワシントン DC、 1 9 8 7 ) や、 ナショナル ' セン ター ' フォー 'バイオテクノロジー . インフォメーション （N C B I ) で開 発された情報検索ソフトウェアであるアントレ （E n t r e z) (商標） な どから引用できる、 ヒト免疫グロプリンの可変領域アミノ酸配列には存在し ないような配列が生じる場合については、 そのアミノ酸の移植は行わないこ ととした。 これにより、 ヒト型化免疫グロブリンをヒ トに投与した場合にお いて抗原性を発揮する可能性が可能な限り低減される。
ヒト型化 VHについては、 FR 3中のアミノ酸が 2つ異なる 2種類のバリ エーシヨンを作つた （RNOK 2 VHv e r l l :配列番号 1 8及び RNOK 2 VH V e r 1 2 ：配列番号 1 9) 。 ヒト型化 VLについては、 ヒ ト免疫グロプリン V L領域の RE Iに移植するものとして、 RNOK 2 V L v e r l (配列番号 2 0) 、 c DN Aライブラリーから得た h u V L— 1 9及び h u VL- 3 0へ移植するものとして、 FR 1中の 1アミノ酸ある いは 2アミノ酸カ ?異なる 4種類のバリエ一ションを作った （RNOK 2 VL V e r 2 1 ：配列番号 2 1、 RNOK 2 VL v e r 2 2 :配列番号 2 2、 RNOK 2 VL v e r 2 3 :配列番号 2 3及び RNOK2 VL v e r 2 4 ：配列番号 2 4) 。 従って、 VLについては合計 5種類のバリエーション を作製した。
- NOK 2抗体と移植先のヒト免疫グロブリン及び構築される各々のヒト型 化 NOK 2抗体の VH及び VLアミノ酸配列を図 5及び図 6に示した。 アミ ノ酸配列中の大文字は N 0 K 2抗体と移植先のヒト抗体で共通の配列であ り、 小文字は両者で異なるアミノ酸である。 枠で囲んだアミノ酸は、 前項に 記載した方法により選択された FRアミノ酸であり、 CDRアミノ酸と併せ てヒト免疫グロプリンに移植するものである。
実際のアミノ酸移植は、 VHについてはヒト型化抗 H I V免疫グロプリン である RC 25抗体 （特許国際公開 WO 94 20632号公報） の VH遣 伝子を锛型に、 VLについては前述のようにして得たキメラ NO K 2の VL 遺伝子を铸型に使用し、 P C Rによつて変異を導入する P C R突然変異誘発 法により遺伝子レベルで行なわれ、 図 5、 図 6及び図 7に示すヒト型化 NOK 2抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子が構築された。 図 8〜図 1 3は PC R突然変異誘発に用いた合成プライマーが、 各々の铸型 VH、 VL 領域にァニーリングしているところを示したものである。
PCRはパーキン ■エルマ一社製のキッ トを使用し、 添付されているプロ トコールに従って行なった。 PCRの条件は、 95°C 1分、 60°C 1分、 7 2で 2分で 30サイクル行なつた。
VHの場合、 ヒト型化 C 25免疫グロプリンの重鎖遺伝子をクロ一ニング したプラスミ ド RHC 25 (特許国際公開 WO 94ノ20632号公報） を 铸型とし、 そのプロモータ一領域上のプライマ一 pAGF (配列番号： 2 5) 及びプライマ— # 01 (配列番号： 26) を用いて VH遺伝子の 5'側 を増幅し、 # 02 (配列番号： 27) あるいは # 03 (配列番号： 28) と # 04 (配列番号： 29) を用いて VH遺伝子の 3'側を増幅した
(RNOK2 VH V e r 1 1作製のためには # 02、 v e r 1 2作製のため には # 03を使用した） 。 次に、 ここで得られた 2つの増幅遺伝子断片を等 量混合して銬型とし、 pAGFブライマーと # 04を用いて P CRを行なつ た。 こうして得られた増幅遺伝子断片を、 ヒト型化 C 25抗体 （特許国際公 開 W094/20632号公報） VH遣伝子の Kp η Iサイ トでつないでヒ ト型化 NO K 2抗体 VH遣伝子の R NO K 2 VH v e r 1 1及び v e r 1 2 を作製した。
一方、 VLについてはキメラ NO K 2の VLを铸型にプライマー # 05 (配列番号： 30) と #06 (配列番号： 31) を用いて VL遺伝子の 5' 側を増幅し、 # 07 (配列番号： 32) と # 08 (配列番号： 33) を用い て中間部分を増幅し、 # 09 (配列番号： 34) と # 10 (配列番号： 3 5) を用いて 3'側を増幅した。 次に、 ここで得られた 3つの増幅遣伝子断 片を等量混合して錡型とし、 # 05と # 1 0を用いて PCRを行なった。 こ うして得られた増幅遺伝子断片を、 ヒト免疫グロプリン SG Iの VH遣伝子 上流の L e a d e r領域遺伝子中にある A p a Iサイ トで連結しヒト型化 NOK2抗体 VL遣伝子の RNOK2 VL V e r 1を作製した。
また、 VLの残り 4種類のバリエーションについては、 以下のようにして 作製した。 まず、 キメラ NO K 2の VLを铸型にプライマー # 1 1 (配列番 号： 36) と # 12 (配列番号： 37) を用いて PCRを行なった。 プライ マー # 1 1中には、 RNOK2 VL V e r 2 1， 22, 23及び 24のバリ エーションを作出するために、 核酸配列にバリーエーションが含まれてい る。 こうして得られた増幅遺伝子断片を、 ヒト免疫グロブリン SG Iの VH 遺伝子上流の L e a d e r領域遣伝子中にある A p a Iサイ トで連結しヒト 型化 NOK2抗体 VL遣伝子の RN0K 2 VL V e r 2 1 , 22, 23及び 24を作製した。
上記のようにして構築した各ヒト型化 V H及び V L領域遺伝子の塩基配列 を、 パーキン 'エルマ一社製のキッ ト及びォートシーケンサを用いて解析 し、 設計通りの配列を有しているクローンを選択した。
これらの各ヒト型化 VH及び VL領域断片を H i nd l l lと BamHI 制限
酵素で消化し、 キメラ抗体の作製 （実施例 1参照） と同様にして、 各々 p CAG-7 1 > pCAG— κの 111 11 (1 1 1 1ー：83111111サィ トに組み 込んだ。 このようにしてヒト型化 NOK2抗体遺伝子発現プラスミ ド （各々 RHNOK2, RLNOK2 :これらはヒト型化 V H及び V Lの各バージョ ンをクローニングした各プラスミ ドの総称である） を調製した。
2— 2) ヒト型化 NOK2 (RNOK2) 免疫グロブリンの発現
RNOK2免疫グロプリンを産生する形質転換細胞を作製するために、 キ メラ抗体の作製 （実施例 1参照） と同様にして前述の各ヒト型化 NO K 2免 疫グロブリン遺伝子発現プラスミ ド （RHNOK2.RLNOK2) DNA を CHO— DG44細胞に導入した。 方法は、 キメラ抗体の場合と同様に L i p 0 f e c t ACEを用いて行なった。
前述のように、 VHについては 2種類、 VLについては 5種類のヒト型化 可変領域遺伝子の発現プラスミ ドを作製したので、 それらの組み合わせで合 計 1 0種類のヒト型化 NO K 2免疫グロプリンを発現させた （後に記載する RNOK 20 K RNOK202及び RNOK203は、 各々 RNOK2 VHv e r l 1と RNOK2VLv e r l、 RNOK 2 VH v e r 1 1と RNOK2 VL v e r 2 RN〇K2VHv e r l lとRNOK2 VL v e r 22の組み合せで発現させたヒト型化 NO K 2抗体である。 以 下、 これらを総称して RNOK2抗体あるいは RNOK 2免疫グロプリンと 呼称することがある） 。
発現プラスミ ド導入後に、 形質転換細胞を培養して得た上清について、 キ メラ抗体の定量と同様にして、 抗ヒト I gGァ 1及び抗ヒト I gG/cを用い た EL I S Aを行なった結果、 その培養上清中にヒト免疫グロプリンが産生 されていることが確認された。
実施例 3
ヒト型化 NO K 2 (RNOK2) 免疫グロブリンの F a sリガンド結合活性 3— 1) 精製 R NO K 2免疫グロブリンの調製
実施例 2に記載したようにして作製した R N 0 K 2発現 C HO-DG 44 細胞を培養して得た培養上清を回収し、 その中に含まれる RNOK 2免疫グ ロブリンを精製した。 具体的には、 まず、 実施例 2に示したようにして得 た、 RNOK 2免疫グロプリンを産生する形質転換細胞を 75 c m2の培養 フラスコ （コ一ニング社製） 中で、 ImMの G418 (ギブコ BRL社 製） 及び 10%の透析済牛胎児血清 （ギブコ BRL社製） を含むヌクレオ チド非含有な—MEM培地 （ギブコ BRL社製） で、 37°C、 5%C〇 2 の条件下でコンフルェントになるまで培養した。 次に、 これを 225 cm2 の培養フラスコ （コ—ニング社製） 2本に拡張し、 再び同条件下でコンフル ェントになるまで培養した。 続いて、 この 2本を 225 c m2の培養フラス コ 8本に拡張して同条件下で培養し、 コンフルェントに達した時点で 65 m 1 フラスコの AS F培地 （商品名） （味の素株式会社製） へ置換し、 3 7 °C、 5 % C 02の条件下で 7日間培養した後、 合計約 500 mlの培養上 清を回収した。
上述のようにして得た培養上清から、 プロテイン Gカラム （フアルマシ ァ -バイオテック社製） と TPLCシステム （フアルマシア 'バイオテック 社製） を用いて、 プロテイン G吸着 I gGのみを精製した。 精製した免疫グ ロブリンの濃度は、 実施例 1に記載の EL I S A法により決定した。 また、 精製した免疫グロプリンについて還元条件下で S D S— PAGEを行ない CBB染色を行なった結果、 各々重鎖、 軽鎖と思われるバンド以外には、 特 に夾雑蛋白の存在は確認されなかった。
3 - 2) RNOK2の F a s リガンドへの結合活性
前項に記載したようにして調製した精製 R N 0 K免疫グロブリンのうち、 RNOK 2 0 1 , RNOK 2 0 2及び R NO K 2 03免疫グロプリンと F a sリガンドとの結合性を、 可溶性 F a sリガンドと抗ヒト I g Gを用い た EL I SA法 （実施例 1に記載） により調べた結果、 R NO K 2免疫グロ ブリンが澳度依存的に F a sリガンドと結合することが確認された （図 1 4)
実施例 4
R N 0 K 2免疫グロブリンのアポトーシス抑制活性の測定
4一 1 ) 可溶性 F a sリガンド分子の調製
実施例 1一 6 ) に記載した方法と同じ方法により可溶性 F a sリガンド分 子を調製した。
4 - 2) RNOK 2免疫グロブリン溶液の調製
実施例 3に記載した方法で調製した精製 RNOK2免疫グロプリンを、 1 0%FC S-R PM I 1 6 4 0培地にて希釈し、 以下の 1 2種類の濃度の免 疫グロブリ ン溶液を調製した。 免疫グロブリンの濃度は、 4 gZm l 2 μ g/m 1 , 1 μ g/m 1 ^ 0. μ g/m 1 , 0. 2 5 g/m l、 0. 1 2 5 μ g/m 1、 0. 0 6 2 5 ^ g/m 1 , 0. 0 3 1 2 5 ^ g/m 1 , 0. 0 1 5 6 3 ^ g/m 1 , 0. 0 0 7 8 1 3 ^ g/m 1 , 0. 0 0 3 9 0 6 /m 1 , 0. 0 0 1 9 5 3 2//1111のものを、 各々 1 0 0 1ずつ調製し た。 なお、 これらの免疫グロブリンは、 最終的には 100 1の反応系に 1 / 4容量の 25 1を入れるため、 最終的な実効濃度は上記港度の 1ノ4とな る o
4-3) 精製マウス NOK2免疫グロブリンの調製
ハイプリ ドーマ NO K 2 (工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され ている受託番号 FERM BP— 5045のハイブリ ドーマ） を各々 10 % FC S含有 R PM I 1 640培地で 3 X 1 07個まで増殖させた。 3 X 1 0 7個の細胞は、 75 cm2フラスコ （ファルコン社製） に 30m l培養液を 入れて細胞培養を行なうスケールで調製した。 具体的には、 2 X 1 05個ノ m 1の濃度で培養を始め、 1 X 1 06個 m 1になるとき細胞を回収した。 回収したハイブリ ド一マは、 1.5 m 1の P B Sに懸濁し、 ヌードマウス に対し、 0.5m l (1 X 1 07個相当分） 腹腔内投与した。 1 0日間の飼 育の後、 腹腔内にたまった腹水を回収した。 回収した腹水は、 6.7m l / 匹であった。 このうち、 1 0 m 1を用い精製を行なった。
精製は、 1 0m l (等量） の飽和硫酸アンモニゥムを滴下し、 腹水と混合 する硫安塩析から始めた。 4°Cにて 2時間撹拌後、 10， 000 gで 1 5分 間遠心分離を行なった。 上澄みを捨てた後、 沈殿したものを 5m 1の PB S にて溶解させた。 その後、 PBS 3リツ トルにて 1昼夜透析した。 続いて、 透析サンプルを回収後、 プロテイン Gカラム （フアルマシア社製） を用い て、 FPLCシステムにてプロテイン G吸着 I gGのみを精製した。 このサ ンプルをさらに P B Sにて透析を一昼夜行なった。 翌日に蛋白質濃度の定量 及び純度の検定を行なった。
蛋白質の定量は、 バイオラッ ド社製のタンパク質定量試薬を用いて測定し た。 方法は、 試薬に添付されているプロトコールに従った。 精製した免疫グ ロブリンについて還元条件下で SD S— PAGEを行ない CBB染色を行 なった結果、 各々重鎖、 軽鎖と思われるバンド以外には、 特に夾雑蛋白の存 在は確認されなかった。
このようにして調製した精製 N 0 K 2免疫グロブリンについて、 前項に記 載の R NO K 2免疫グロプリンの場合と同様にして 1 2種類の港度の免疫グ ロブリン溶液を調製した。
4 - 4 ) ターゲット細胞の調製
タ一ゲッ ト細胞には、 ヒト F a s遺伝子を導入した WR 1 9 L細胞を用い た。 WR 1 9 L細胞 （ATC C T I B 5 2) へのヒト F a s遺伝子の導入 は常法にしたがって行なった。 具体的には、 奥村らの文献 （奥村ら、 Pro Natl. Acad. Sci. U S A, vol. 9 1 , N o. 1 1 , p 4 9 3 0— 4 9 3 4 , 1 9 9 4) を参考にして作製した。 得られた F a s一 WR 1 9 L細胞 を培養し、 1 0%FC S— R PM I培地にて 2 x 1 05個/111 1に調製し た。
4 - 5) RNOK 2免疫グロプリンのアポト一シス抑制活性の測定
まず、 4— 1 ) 項に記載した方法で調製した可溶性 F a s リガンド分子を
1 0 6 FC S— DME培地で 1 8. 5 n g/ 1に希釈した。 9 6ゥエル平 底プレートを用い、 各ゥヱルにこの希釈液 2 5 1を入れた。 次いで、 4一
2) 項に記載した方法で調製した RNOK2免疫グロブリン溶液 （RN0K
2 0 1、 RN0K 2 0 2及び R NO K 2 0 3) 及び 4— 3) 項に記載した方 法で調製したマウス NOK 2免疫グロプリンの各々の濃度の溶液を 3ゥエル ずつに 2 5 1 /ゥエルの割合で加えた。 その後、 3 7 で 5 %C02のも とで 1時間インキュベーションした。 その後、 4一 4) 項に記載した方法で 調製したタ一ゲット細胞の F a s一 WR 1 9 L細胞懸濁液を 5 0 1ノウェ ルの割合で加え、 3 7でで 5 %C02のもとで 1 7時間ィンキュベーシヨン した。 次いで、 アラマ一 · ブルー （Alamer Blue) (コスモバイオ社より購 入） を 1 0 1 ウエルの割合で加えて、 更に 3 7でで5%(：〇2のもとで
4時間インキュベーションした。 その後、 蛍光マイクロプレートリーダー (フルォロスカン （Fluoroskan) I I (商品名） ； タイタ一テック （ Titertek) 社製） を用いて励起波長 54 4 nm、 測定波長 5 9 0 nmで蛍光 強度を測定した。 この蛍光強度は各ゥエル中の生細胞数を反映するものであ なお、 可溶性 F a sリガンドも RN〇K 2免疫グロプリンもマウス N〇K 2免疫グロプリンも入れずに、 ターゲッ トの F a s -WR 1 9 L細胞 5 0 μ 1 ウエルに対して 1 0%F C S— R PM I 1 6 4 0培地を 5 0 μ 1 Ζゥェ ル入れたものを 1 0 0%生存のコントロールとし、 可溶性 F a sリガンド 2 5 μ 1に、 1 0 %F C S— R ΡΜ I 1 6 4 0培地を 2 5 1及びターゲッ ト の F a s -WR 1 9 L細胞 5 0 μ 1 を加えたものをアポトーシスのコント ロールとした。 その結果を図 1 5に示した。
図 1 5から判るように、 ヒト型化 NO Κ 2免疫グロプリン （RN0K 2 0 1， RNOK 2 0 2及び RNOK 2 0 3 ) は、 いずれも濃度が 0. 06 g /m l (実効濃度） 以上の範囲で 9 0%以上のアポトーシス抑制率を示し た。 このことにより、 本発明のヒト型化免疫グロブリ ンの全てが可溶性 F a sリガンドが持つ F a s発現細胞に対するアポト一シス誘導活性を抑制 できることが実証された。 しかも、 特に注目すべきことに、 本発明のヒト型 化免疫グロブリンは、 試験を行なった全濃度範囲において、 オリジナルのマ ス NO K 2免疫グロプリンと比べて同等以上の活性を持つことがわかつ た。 また、 マウス N O K 2免疫グロプリンは、 平成 7年特許願第 3 0 3 4 9 2 号に記載されたとおり、 0 . 0 1〜 8 g /m 1の抗体濃度 （実効漉度） に おいて、 同濃度の F a s— I gキメラ分子に比べて、 著しく高いアポト一シ スの抑制活性を示すことがわかっている。 従って、 本発明のヒト型化免疫グ ロブリンがマウス F a s— I gよりも F a s リガンドに対するァフィ二 ティーが強く、 より有効であることは明白である。
また、 このことは、 生体内でも本発明のヒト型化免疫グロブリンのいずれ かが存在すれば、 F a sリガンドが F a sに結合するのに優先して、 これら のヒト型化免疫グロプリンが F a sリガンドに結合することを示唆してい る。 このことにより、 本発明のヒト型化免疫グロブリンが、 生体内において F a sと F a s リガンドの生理的反応を十分抑制できることが容易に推察で きる。
実施例 5
(ァミノ酸置換を導入した F a sリガンド （変異 F a sリガンド） の作製） 5— 1 ) F a s リガンド発現用べクターの構築
F a s リガンド発現べクタ一を構築するために、 まず、 実施例 1— 3 ) 項 に記載の p C A G— /c発現べクターの/ 鎖定常領域遺伝子を欠く p C A G発 現ベクターの H i n d I I I— B a mH Iサイ トに、 C 2 5抗体 （特許国際 公開 W O 9 4 / 2 0 6 3 2号公報に記載） のリーダ一配列を含む軽鎖可変領 域の遺伝子を上記制限酵素で切り出して連結した。 このプラスミ ドを常法に より大腸菌に導入し、 得られた形質転換大腸菌を培養して得た菌体より、 小 スケールプラスミ ド調製法 （コールド 'スプリング ·ハーバー . ラボラ ト リー （Cold Spring Harbor Lab. ) , モレキュラー ' クローニング （ Molucular Cloning) p . 1 . 2 5， 1 9 8 9 ) により、 上記プラスミ ドを回 i|又した。 続いて、 このプラスミ ドより、 リーダー配列中の Kp n Iサイ トと C 25軽鎖可変領域下流の B a mH Iサイ トで、 リーダー領域の一部と可変 領域遺伝子の全体を切除した。 これにより、 C 25抗体軽鎖由来のリーダー 配列を付加した p C A G発現ベクターが得られた。
5-2) PCR突然変異誘発法による変異 F a sリガンド遺伝子の作製及び それらの発現ブラスミ ドの構築
高いアポト一シス抑制活性を持つ免疫グロプリンが結合する F a sリガン ドのアミノ酸配列中の領域すなわち認識領域を調べるために、 図 16に示す F a sリガンドの細胞外領域のァミノ酸配列の下線部分の各々を一つずつ A 1 a或いは G 1 yに置換したものを作製した （F a sリガンドのアミノ酸 が A 1 aではない部分については A 1 aに、 元々 A l aの部分については G 1 yに置換したものを作製した） 。 以下、 これらのアミノ酸置換を導入し た F a sリガンドを総称して変異 F a sリガンドと呼称する。 更に、 各変異 F a sリガンドは、 図 16の下線部の最初の T y rを A 1 aに置換したもの を B 1と呼称し （以下、 順に B 2， B3, · ' ' といったように呼称す る） 、 下線部の最後の A 1 aを G 1 yに置換した B 45までの合計 4 5種類 を作製した。
まず、 実施例 1— 6 ) 項に記載の発現べクター （ヒト F a sリガンドー BCMG SN e o) にクロ一ニングされている F a sリガンド遺伝子を铸型 とし、 センスプライマーの EP— 02プライマ一 （配列番号： 38) と、 ァ ンチセンスプライマ一である EP— 03プライマ一 （配列番号： 39) を用 いて P CRを行ない、 アミノ酸の置換が導入されていない F a sリガンド 〈以下、 混同を避けるために、 アミノ酸の置換が導入されていない F a sリ ガンドをネイティブ F a sリガンドと呼称する） の遺伝子断片を得た。 PCRは TAKARA Ex T a q (商品名） （宝酒造社製） を使用し、 添 付文書に従って反応液を調製し、 95°C1分、 60 1分、 72 °C 2分で 3 0サイクルの増幅を行なった。 この断片を、 5— 1) 項に記載の pCAG発 現べクタ一に連結し、 ネイティブ F a sリガンド発現べクタ一を作製した。 EP- 02プライマーには、 前項に記載の p C AG発現べクタ一に連結する ための K p n Iサイ ト以下、 C 25抗体のリ一ダー配列の残りの部分の遺伝 子配列、 以下に述べる FLAG配列をコードする遺伝子配列及び F a sリガ ンドの N端から 1 1 7番目の S e rまでをコードする遺伝子配列が含まれて いる。
F L A G配列とは 8アミノ酸 (A s p-Ty r-Ly s-A s p-As p 一 As p— A s p— L y s) から成る。 発現させようとする蛋白にこの配列 を付加しておくことにより、 この配列に対する抗体を用いて、 目的蛋白の発 現の確認 .定量を行なうことができる。 本実験では FLAG配列は、 F a s リガンド細胞外領域の N端から 3番目の P h eの部分に置換されている。 E P- 03プライマーには、 F a sリガンドの C端から 6番目の P h e以降 のアミノ酸をコードする遺伝子配列、 停止コドン及び発現ベクターに連結す るための B amH Iサイトが付加されている。
変異 F a sリガンドをコ一ドする遺伝子は、 P CR突然変異誘発法により 作製した。 具体的には、 まず、 F a sリガンド細胞外領域の N端から 4番目 の H i sから 1 8番目の G 1 nまでに位置するセンスプライマ一である MF プライマ一 （配列番号： 40) と、 アミノ酸を置換する箇所に A 1 a或いは G】 yのコ ドンを導入した各々の変異プライマ一 （変異 F a sリガン B 1 〜B 45に対応するプライマ一は、 各々配列番号の 4 1〜85に記載） をァ ライマーに用いて各変異 F a sリガンド細胞外領域の N端側を 増幅した。 M Fブライマー配列中には E c o N Iサイ トが含まれている。 次 に、 上記の各々の変異プライマーに相補的なプライマ一 （配列番号 4 1〜8 5のプライマーに相補的なプライマ一は、 各々配列番号の 8 6〜 1 3 0に記 載） をセンスプライマーとし、 これとアンチセンスプライマーである E P— 0 3プライマーを用いて各変異 F a sリガンドの C端側を増幅した。 上記変 異ブライマー及びそれに相補的なプライマ一は、 B 1から B 4 5までの 4 5 種類の変異 F a sリガンドを作製するために 4 5種類ずつ合成された。 次 に、 上述のようにして得た変異 F a sリガンドについての N端側と C端側の 2つの増幅遺伝子断片を等量混合して铸型とし、 E P— 0 2及び E P— 0 3 プライマーを用いて再度 P C Rを行なった。 本 P C Rを各々の変異 F a sリ ガンドについて行なうことにより、 図 1 6に示した下線の部分にアミノ酸置 換を導入した、 B 1から B 4 5までの 4 5種類の変異 F a sリガンドの細胞 外領域をコードする遺伝子 （変異 F a s リガンド遺伝子） を得ることができ た。
以上の方法で作製した各変異 F a s リガンドの遺伝子断片を、 E c 0 N I — B a mH Iサイ トで上述のネイティブ F a sリガンド発現べクタ一上のネ ィティブ F a sリガンド遺伝子と置換し、 各変異 F a sリガン ドの発現ブラ スミ ドを作製した。 これらの F a sリガンド発現プラスミ ドを宿主細胞に導 入し培養すれば、 その上清中に、 F a s リガンド細胞外領域の N端から 3番 目の P h eの部分に F L A G配列が挿入されている蛋白が分泌される。 5 - 3 ) 各変異 F a sリガンドの発現
前項に記載した方法で構築した各変異 F a s リガンド発現プラスミ ドを常 法により大腸菌に導入し、 得られた形質転換大腸菌を培養して得た菌体よ り、 プラスミ ド . ミニ .キッ ト （Plasmid Mini Ki t) (商品名） （キアジェ ン （Q I AG EN) 社製） を用いて、 上記発現プラスミ ドを回収 '精製し た。 続いて、 各精製発現プラスミ ドを 1 _4) 項に記載の方法と同様にして L i p 0 f e c t ACE (商品名） （ギブコ BRL社製） を用いて COS 細胞 （ATCC CRL 1 650) に導入して培養し、 変異 F a sリガンド を含む培養上清を得た。 すなわち、 上記発現プラスミ ド 1 gと
L i p 0 f e c t ACEとの混合物を COS細胞に添加して、 37で、 5 % CO 2の条件下で一晩培養した後、 ASF培地 （商品名） （味の素株式会社 製） を 4m l添加し、 37。C、 5%C02の条件下で 4日間培養し、 その培 養上清を回収した。 また、 ネイティブ F a sリガンド発現プラスミ ドについ ても同様にして COS細胞へ導入し培養上清を得た。 なお、 陰性対照とし て、 F a sリガンド遺伝子が連結されていない p C AGベクターを上記と同 様の方法により COS細胞に導入し、 同じ培地で同じ期間培養した後、 培養 上清を回収した。
5-4) 培養上清中の変異 F a sリガンドの相対定量
前項に記載した方法で調製した、 ネイティブ F a sリガンドを含む培養上 清を標準溶液として、 各培養上清に含まれる変異 F a sリガンド分子の相対 濃度を EL I S A法により算出した。 具体的な方法は以下の通りである。 ま ず、 前述のネイティブ F a sリガンドを含む培養上清、 各変異 F a sリガン ド分子を含む各培養上清及び陰性対照の培養上清を、 A S F培地を用いて二 倍階段希釈で 7段階希釈して 8種類の濃度の溶液を調製した。 次に、 イン ターメッ ド （InterMed) 社製の 96ゥエル マキシソープ （Maxisorp) プ レート （商品名） の各縦 8ゥヱルに、 上記の各々の濃度の溶液を 5 1 / エルで添加した。 変異 F a sリガンドを含む培養上清は、 左から 3番目の 列から 1 0番目の列までの各縦 8列の各々の列に 8種類の変異 F a sリガン ドの各々の澳度の溶液を添加した。 プレートが複数になるため、 標準溶液で あるネイティブ F a sリガンドを含む各々の澳度の溶液を、 各ブレ—トの左 から 2番目の列の縦 8ゥヱルの各々に添加し、 各プレートに添加した変異 F a sリガンドの相対濃度を決めるための標準とした。 また、 非特異的な発 色の強度を調べるために、 陰性対照の上清の各々の濃度の溶液を左から 1 1 番目の列の縦 8ゥエルの各々に添加した。 プレー卜の両端の列は使用しない ことにした。
次に、 4 でー晚インキュベーションした後、 各ゥエルを 0.05% Twe e n 20含有 0.0 1 MP BSで 3回洗浄し、 1 %B SA含有 PB S を 100 1ダウエルで添加した。 37°Cで 1時間ィンキュベ一ションした 後、 各ゥエルを 0.05%Twe e n 20含有 0.01MPB Sで 3回洗诤 し、 25 g/m 1の濃度の抗 FLA GM 2マウスモノクローナル抗体 （商 品名） （コダック （Kodak) 社製） を、 縦 8ゥエルの各々に 50 1 /ゥェ ルで添加した。 37°Cで 2時間インキュベーションした後、 各ゥエルを 0. 05o/oTwe e n 20含有 0.01MPBSで 3回洗浄し、 H R Pラベル抗 マウス I g— C /c抗体 （サザ一ン ·バイオテクノロジ一 · ァソシエート （S outhern B iotechonlogy Associate) 社製） を 196 B S A含有 P B Sで 5 000倍に希釈したものを 50 1 /ゥエルで添加した。 続いて、 37でで 1時間インキュベーションした後、 各ゥエルを 0.050/oTwe e n 20含 有 0.0 1MFBSで 5回洗诤し、 発色基質溶液 （0.5mM TMBZ+過 酸化水素） を 50 / i /ゥヱルで添加し、 適当な発色が得られたところで 0 .3 Nの硫酸を 50 1 /ゥエルで添加して反応を停止させ、 マイクロブ レートリーダー (モレキュラー ' ディノくイシーズ (Molecular Devices) 社 製） を用いて波長 450 nmにおける各ゥヱルの吸光度を測定した。 ネィ ティブ F a sリガンドを含む培養上清及び各々の変異 F a sリガンド分子を 含む培養上清を添加したゥヱルにおいて、 抗 F L A G M 2抗体の濃度依存的 に発色が確認された。 また、 陰性対照の培養上清を入れたゥヱルについて は、 抗体濃度に依存した発色は確認されなかった。 その結果の一部を図 1 7 に示す。 従って、 ここで得られた発色強度 （O D 4 5 0値） は、 上記培養 上清中に含まれる F L A G配列が付加されたネィティブ F a sリガンド及び 各変異 F a sリガンドの量を反映するものであると考えられる。
そこで、 ネイティブ F a sリガンドについての発色強度を基準とし、 各々 の変異 F a sリガンドの相対量を決定した。 すなわち、 まず、 各々の希釈倍 率のネイティブ F a sリガンド及び変異 F a sリガンドを添加した各ゥエル の 0 D 4 5 0値から、 同じ希釈倍率の陰性対照を添加したゥヱルの 0 D 4 5 0 値を差し引いた値を算出して、 各ゥヱルの特異的な発色強度を求めた。 次 に、 その O D 4 5 0値と各培養上清の希釈倍率の関係をグラフにしたとき、
〇D 4 5 0値が直線的な減少を示し、 かつ、 いずれの直線も同じ傾きを示し た範囲内においてある O D 4 5 0値を選択し、 その値を示したときの希釈倍 率をネイティブ F a sリガンド及び各変異 F a sリガンドについて上記グラ フをもとに算出した。 最終的に、 ネイティブ F a sリガンドについて得られ た希釈倍率を基準としたときの、 各変異 F a sリガンドについて得られた希 釈倍率の相対値を算出し、 この相対値を、 ネイティブ F a sリガンドに対す る各変異 F a sリガンドの相対濃度とした。 この操作を各プレートについて 行うことにより、 ネイティブ F a sリガンドに対する全変異 F a sリガンド の相対濃度が得られた。
5 - 5 ) 5-4) 項の方法により決定した相対濃度が最も低かった変異 F a sリガ ンドを含む培養上清を新たな基準とし、 相対濃度がそれより高かったものに ついては、 基準のものと同一の澳度となるように前述の A S F培地で希釈し た。 これにより、 全ての溶液について、 それらの中に含まれる変異 F a sリ ガンド或いはネイティブ F a sリガンドの濃度が同一に調整された。
実施例 6
(抗 F a sリガンド抗体の認識領域の解析）
6 - 1 ) 各抗 F a sリガンドモノクローナル抗体溶液の調製
国際出願公開公報 WO 96 /29350に記載のハイプリ ドーマである NOK 1、 NO K 2及び NO K 3の各々より産生される、 抗 F a sリガンド モノクローナル抗体 （以下、 各々単に N〇K 1、 NOK2及び NOK3免疫 グロブリン （抗体） と呼称することがある。 また、 これらを総称して N〇K 抗体と呼ぶことがある。 ) を以下の方法により調製 '精製した。
まず、 ハイプリ ドーマ NO K 1、 NOK 2及び NOK 3を各々 1 0% FC S入り RPMI 1640培地で 3 X 1 0？個まで増殖させた。 3 X 1 0 7個の細胞は、 75 cm2フラスコ （ファルコン社製） に 30m l培養液を 入れて細胞培養を行なうスケールで調製した。 具体的には、 2 X 105個 m 1の濃度で培養を始め、 1 X 1 06個 1になるとき細胞を回収した。 回収したハイプリ ドーマは、 1.5m 1の PB Sに懸濁し、 ヌードマウス に対し、 0.5m l (1 X 1 07個相当分） 腹腔内投与した。 1 0〜： I 8日 間の飼育の後、 腹腔内にたまった腹水を回収した。 回収した腹水のうち、 1 0m l を用い精製した。 精製は、 各々 1 0m l (腹水と等量） の飽和硫酸ァ ンモニゥムを滴下し、 腹水と混合する硫安塩折から始めた。 4でにて 2時間 撹拌後、 10, 000 gで 1 5分間遠心分離を行なった。 上澄みを捨てた 後、 沈殿したものを 5m lの PBSにて溶解させた。 その後、 3リツ トルの PBSにて 1昼夜透析した。
NOK 1抗体、 NO K 2抗体については、 透析サンプルを回収後、 プロテ イン Gカラム （商品名） （フアルマシア （Pharmasia) 社製） を用いて、 FP L Cシステムにてプロテイン G吸着 I gGのみを精製した。 このサンプ ルをさらに P B Sにて透析を一昼夜行なつた。 翌日にタンパク質濃度の定量 及び純度の検定を行なった。 NO K 3抗体については、 透析サンプルを回収 後、 ゲル濾過用 S u p e r d e X 200カラム （商品名） （フアルマシア （ Pharmasia) 社製） を用いて、 F P L Cシステムにてゲル濾過を行ない、 空 隙容量 （void volume) に溶出される I gMを回]]又した。 この I gMについ ても、 タンパク質の定量及び純度の検討を行なった。
蛋白質の定量は、 タンパク質定量試薬 （バイオ ' ラッ ド （B I 0
RAD) 社製） を用いて測定した。 方法は、 試薬に添付されているプロト コールに従った。 精製した免疫グロプリンについて還元条件下で S D S— P AGEを行ない CBB染色を行なった結果、 各々重鎖、 軽鎖と思われるバ ンド以外には、 特に夾雑蛋白の存在は確認されなかった。
上述の方法で調製した各精製 NOK抗体及び実施例 3— 1 ) 項に記載の方 法で調製した三種類の精製ヒト型化 NO K 2抗体 （RNOK201、
RN0K 202及び RN0K 203 ) について、 1^01： 1抗体は 10 / m 1を、 NO K 2抗体は 50 g/m 1を、 1^〇1：3抗体は0. 1 g/ m lを、 RNOK201は 3.57/ g/m Iを、 RNOK 202は 1.86 / gZm lを、 RNOK 203は 3.35 gZm 1を原液として、 1% B S A含有 P B Sを用いて二倍階段希釈し 8種類の濃度の抗体溶液を調製し た。 6 -2) 変異 F a sリガンドを用いた各 NO K抗体の認識領域の同定 実施例 5— 5) 項に記載の方法で調製した、 変異 F a sリガンドのうちの 2- 9種類及びネイティブ F a sリガンドを含む溶液を用いて、 NOK抗体及 びヒト型化 NOK2抗体が結合する F a sリガンド上の認識領域を、 以下に 述べる EL I S A法により調べた。 本法では、 ネイティブ F a sリガンドに 対して N0K抗体或いはヒト型化 NO K 2抗体を反応させた時の発色強度 (OD45o値） を基準値として、 同濃度の NO K抗体或いはヒト型化
NO K 2抗体を同濃度の各変異 F a sリガンドに反応させた時の相対的な発 色強度を測定した。
まず、 5— 5) 項で調製したネイティブ F a sリガンドを含む溶液及び変 異 F a sリガンドを含む溶液及び陰性対照の溶液を、 96ゥヱル マキシ ソーププレート （商品名） の縦 8ゥエルに 50 1 Zゥエルで添加した。 添 加した列の位置関係は 5— 4) 項と同じである。 4でで一晩インキュベー ションした後、 各ゥエルを◦.05%Twe e n 20含有 0.0 1MPB Sで 3回洗浄し、 1 %B S A含有 PB Sを 100 / 1 /ゥエルで添加した。 3 7 °Cで 1時間インキュベーションした後、 各ゥエルを 0.05%Twe e n 20含有 0.0 1MPB Sで 3回洗浄した。 次に、 前項に記載の方法で調製 した各々の濃度の NO K抗体及びヒト型化 NO K 2抗体を、 縦 8ゥヱルに 5 0 μ 1ノゥエルで添加した。 続いて、 37°Cで 2時間インキュベーションし た後、 各ゥエルを 0.05%Twe e n 20含有 0.0 1MPB Sで 3回洗浄 し、 HRPラベル抗マウス I g— C /抗体あるいは HRPラベル抗ヒト I g -C /0抗体 （いずれも、 サザーン · バイオテクノロジー ■ ァソシエート （ Southern Biotechonlogy Associate) 社製） を 1 %B S A含有 P B Sで 50 00倍に希釈したものを 50 1 /ゥエルで添加した。 37°Cで 1時間イン キュベ一ションした後、 各ゥエルを 0.05%Twe e n 20含有 0.01 MP B Sで 3回洗浄し、 発色基質溶液 （0.5mM TMBZ+過酸化水 素） を 50 1 /ゥエルで添加し、 適当な発色が得られたところで 0.3N の硫酸を 5 O 1 Zゥヱルで添加して反応を停止させ、 マイクロプレート リーダ一 （モレキュラー 'ディバイシーズ （Molecular Devices) 社製） を 用いて波長 450 nmにおける各ゥエルの吸光度を測定した。 ネイティブ F a sリガンドを含む培養上清を添加したゥエルにおいて、 NOK抗体及び ヒト型化 NO K 2抗体の濃度依存的に発色が確認された。 また、 陰性対照の 溶液を入れたゥエルについては、 抗体濃度に依存した発色は見られなかつ た。 その結果の一部を図 1 8に示す。 従って、 ここで得られた発色強度 (OD 4 50値） は、 上記溶液中に含まれるネイティブ F a sリガンドに対 する N 0 K抗体及びヒト型化 N◦ K 2抗体の特異的な結合を反映していると 考えられる。
そこで、 ネイティブ F a sリガンドについての発色強度を基準とし、 各々 の変異 F a sリガンドに対する NO K抗体及びヒト型化 NO K 2抗体の相対 的な結合力を調べた。 すなわち、 まず、 各ゥヱルの特異的な発色強度を求め るために、 ネイティブ F a sリガンド及び変異 F a sリガンドを添加した各 ゥエルの 0 D 450値から、 陰性対照に同じ濃度の N 0 K抗体を添加した ゥエルの〇D 450値を差し引いた値を算出した。 次に、 その OD 450値と 各 N◦ K抗体及びヒト型化 N OK2抗体の濃度の関係をグラフにしたとき、 OD 4 50値が直線的な増加を示し、 つ、 すべての直線が同じ傾きを示し た範囲内において、 ある OD 4 50値を選択し、 その値を示したときの
N〇 K抗体及びヒ ト型化 N 0 K 2抗体濃度をネィティブ F a sリガンド及び 各変異 F a sリガンドについて上記グラフを基に算出した： 最終的には、 ネ ィティブ F a sリガンドについて得られた抗体濃度を基準としたときの、 各 変異 F a sリガンドについて得られた抗体 i'裊度の相対値を算出し、 その相対 値を、 各々の変異 F a sリガン ド:：対する NO K抗体及びヒト型化 NO K 2 抗体の相対的な結合力とした。
以上のようにして算出した、 各変異 F a sリガンドに対する NO K抗体及 びヒト型化 NO K 2抗体の相対的結合力を図 1 9及び図 20にまとめた。 図 1 9及び図 20からわかるよう：こ、 F a sリガン ドの X端側から 198 番の A r gから 238番の Me rの範囲 （アミノ酸番号は長田らの文献 （長 田ら、 Int. Immunology, vol. 6， p l 567— 1 574， 1 994 ) に従 う） では、 NO K 2抗体の結合性の g:下が観られた （特に、 1 98番の A r g、 1 99番の G l y、 205香の L e u、 220番の G l n、 22 1 番の A s p、 222番の L e u、 230番の Me t、 237番の G i n及び
238番の Me tの部位において顕著な ί氐下が観られる） ：
三種類のヒ ト型化 Ν 0 Κ 2抗体 （ R Ν 0 Κ 20 1、 R Ν◦ Κ 202及び R 0 Κ 203 ) は、 ほぼ同様の結ノ5、性パターンを示し、 1 98番の 1" 2 から 238番の Me tの範囲で結合性の低下が観られた （特に、 1 98番の A r g、 1 99番の G l y、 205香の L e u、 220番の G l n、 22 1 番の A s p、 222番の L e u、 228番の L y s、 230番の Me t、 2
37番の G 1 n及び 238番の Me tの部位において顕著な低下が観られ る） 。 一方、 NOK2の結合性パターンとは 1 98番の A r g、 228番の L y sおよび 230香の Me tの部位で異なっている力、 これらの差異はヒ ト-型化を行なったことに起因するものであると考えられる c このことから、 R N 0 K 2抗体のアポトーシス抑制活性が N 0K2抗体を上まわっている (実施例 4に記載） 原因は、 ヒト型化により上記部位の認識アミノ酸に対す る両者の結合の質および強度が変化し、 総合的に見て F a sリガンドへの結 合力が上昇したことにあると考えられる。
NO K 1抗体の場合は 1 99番の G 1 yから 237番の G 1 nの範囲で結 合性の低下が観られる （特に、 1 99番の01 、 203番の As n、 20 5番の L.e u、 21 8番の Ty r、 220番の G l n、 22 1番の A s p、 222番の L e u、 227番の G l y、 228番の L y s及び 237番の G 1 nの部位において顕著な低下が観られる） 。 NO K 3抗体は 1 99番の G 1 yから 238番の Me tの範囲で結合性の低下が観察された （特に、 1 99番の G l y、 200番の G l n、 203番の As n、 205番の L e u、 2 12番の Ty r、 220番の G l n、 22 1番の A s p、 222 番の L e u、 228番の乙 5、 230番の Me t、 237番の G i n及び 238番の Me tの部位において顕著な低下が観られる） 。
上記 N 0 K抗体は、 F a sリガンド発現細胞をマウスに免疫して得られた モノクローナル抗体である （平成 7年特許願第 303492号の実施例 1に 記載） 。 また、 上記 NO K抗体及びヒト型化 NO K 2抗体は、 F a s— F a sリガンドの相互作用を介して F a s発現細胞に誘導されるアポトーシ スに対して強い抑制活性を持つ抗体である （国際出願公開公報 WO 96/2 9350の実施例 1及び 2及び本願発明の実施例 4に記載） 。 すなわち、 NOK抗体はネイティブな構造を持った F a sリガンドを免疫して得られ た、 高いアポトーシス抑制活性を持つ初めての抗 F a sリガンドモノクロ一 ナル抗体である。 しかも、 これらのモノクローナル抗体の CD R (相補性決 定領域） のアミノ酸配列は各々で異なり、 抗体のクラス及びサブクラスも異 なる、 すなわち全く独立な抗体である。 それら全く別々の抗体の認識領域が 前述のように、 F a sリガンドの第 198番の A r gから第 238香の Me tまでのアミノ酸配列で形成される広い領域に存在していることから、 高いアポト—シス抑制活性を持つ抗 F a sリガンド抗体は、 一般的に上記の 領域に含まれるアミノ酸を認識領域として認識していると言うことができ る。 換言すれば、 上記の領域は F a sリガンド分子中に存在する、 高いアポ トーシス抑制活性を持つ抗 F a sリガンド抗体を惹起することができる主要 な領域なのである。 さらには、 上記領域は F a sリガンドがアポトーシス誘 導活性を発揮するために重要な領域であり、 この領域を認識し結合できる物 質はアポトーシス抑制活性を示すことができることを示唆している。
実施例 7
(合成べプチドを用いた N〇K 1、 NO K 2及び NO K 4抗体の認識領域の マッピング）
1. F a sリガンドの細胞外ドメィンの N末端 （F a sリガンドの N末端か ら 103番目の G 1 n) からの 1 5 m e rのペプチド、 6番から 20番まで の 1 5me rのペプチド、 1 1番から 25番の； I 5 m e r、 1 6番から 30 番までの 1 5 m e rと， 5 m e rずつずらしながら 1 5 m e rのべプチドを 34種類合成したペプチドライブラリーを作製した （ぺプセッ ト （登録商 標、 カイロン社製） を利用した） 。
2. ΝΟΚ 1、 N〇K 2及び NOK 4ハイプリ ドーマの培養上清を用いて、 下記の操作により F a sリガンド抗体が反応する F a sリガンドの部位を特 定した。
(1) 96ゥエルプレート （マキシソープ、 登録商標、 ヌンク社製） の各 ゥヱルをブロッキング液 （ブロックエース （大日本製薬社製） を蒸留水で 4 倍に希釈したもの） で満たし、 さらに、 このプレートの各ゥエルにぺプセッ トのピン （先端に合成されたペプチドが固定されている） を入れ、 ピンの先 端を室温で 2時間プロッキングした。
(2) ブロッキング終了後、 ぺプセットのピンを取り出し、 PB Sで洗浄し た。
(3) 新しい 96ゥエルプレートに NOK 1、 NO K 2及び NO K 4ハイブ リ ドーマの培養上清を 100 1ノウエル分注した。 コントロールには、 ぺ プセッ ト付属の抗体液を使用した （ぺブセットには陽性のコントロールのピ ンと陰性のコントロールのピン及びそれらに対する抗体液が用意されてい る） 。
(4) その後、 ぺブセッ トのピンを 3のプレートの各ゥエルに入れ、 室温で 2時間反応させた。
(5) (4) のプレートからぺプセッ トのピンを取り出し、 PBSが入った パッドに移し、 振盪洗浄を 1 0分間 3回行なった。
(6) 新しい 96ゥエルプレートに PB Sで 1 000倍に希釈した HRP (西洋ヮサビペルォキシダーゼ） 標識抗マウス I gG (カペル社製） を 1 0
0 μ 1ノゥエル分注し、 さらに、 ぺプセッ トのピンをこのプレートの各ゥェ ルに入れ、 室温で 2時間反応させた。
(7) 反応後、 ぺブセッ トのピンを取り出し、 PBSで 10分間 3回振盪洗 浄した。
(8) 新しい 96ゥエルプレ一トに下記組成の基質液を 100 1 ゥエル 分注し、 さらにぺプセッ トのピンを該プレートの各ゥエルに入れ、 室温で 2 0分間反応させた。
-基質液の組成：
OPD 0.4mg/m 1 , 30%H2O2 0.4〃 1 /m 1、 0. 1Mクェ ン酸リン酸緩衝液 （p H 5. 1 )
(9) プレートからぺプセッ トのピンを取り出した後、 21の1128〇4を各 ゥエルに 50 / 1添加して反応を停止した。
(10) このプレートの各ゥエルの液の吸光度をプレートリーダ一 （バイオ ラッ ド社製） で測定した。
(1 1) この結果、 NOK 1及び NOK4のハイブリ ド—マの培養上清につ いては、 L YFVYS KVYFRGQS C、
SKVYFRGQSCNNLPL及ぴRGQSCNNLPL SHKVY (F a sリガン ドの N末端から 1 88〜 202番目、 1 93〜 207番目、 1 98〜2 1 2番目） 、 NO K 2のハイプリ ドーマの培養上清については、 YPQDL VMMEGKMMS Y、 VMM E G KMM S Y C T T G Q及び KMMS YCTTGQMWAR S (F a sリガンドの N末端から 2 1 8〜 2 32番目、 223〜 237番目、 228〜 242番目） のぺプチドを固定し たピンを入れたゥェルで、 ピンに固定したぺプチドに結合した H R Pによる 酵素反応による色の変化がみられた。 すなわち、 NOK 1及び NOK4のハ ィプリ ドーマが産生する抗 F a sリガンド抗体は、 F a sリガン ドの LYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYの領域を認識し、 NOK 2のハイプリ ド一マが産生する抗 F a sリガンド抗体は、 F a sリガ ンドの YPQDL VMMEGKMMS YCTTGQMWAR Sの領域を認識 することがわ 、つた。
実施例 6に記載した変異 F a sリガンドを用いた各抗 F a sリガンド抗体 の認識領域の解析の結果に鑑みれば、 今回反応が観られた合成べプチドの配 列の大部分は、 上記結果で示された各抗 F a sリガンド抗体の認識領域に含 まれていることがわかる。 このことから、 上記領域が抗原認識 .結合に重要 な役割を演ずるアミノ酸を含んでいることが改めて示された。
実施例 8
(F a sリガンドのモデリ ング）
実施例 6で同定した抗 F a sリガンド抗体の結合領域が F a sリガンド上 のどこに位置するのかを確認する目的で F a sリガンドのモデリングを行 なった。 F a sリガンドは、 TNF α及び TNF と同じ TNFファミリー に属しており、 TNFと同様に三量体を形成していると考えられている （マ ニェノレ (Manuel C. P.) ら、 Molecular Immunology, vol. 32 、丄 0) ， p.76 1— 772， 1996) 。 そこで、 F a sリガンド三量体のモデル を TNFを錡型にコンピュータを用いた分子モデリング法により構築し、 抗 F a sリガンド抗体と変異 F a sリガンド分子の結合実験の結果から確認さ れたアポトーシス抑制活性に重要な領域が、 F a sリガンド分子上のどこに 位 Sするか検討することにした。
F a sリガンド三量体のモデリングを行なうにあたっては、 まず、 F a s リガンドモノマー （単量体） のモデリングを実行した。 具体的には、 F a s リガンドと相同性が高いことが知られている T N F α及び T N F /?の三次元 構造を铸型として利用し、 シリコングラフィックス上で起動するモデリング ソフトウエアである Mo d e 1 e r (モレキュラー ' シミュレーションズ （ Molecular Simulations Inc.) 社製） を利用して行なった。 まず、 Fa sリ ガンドの細胞外領域のアミノ酸配列と TNF α及び TNF のアミノ酸配列 を図 2 1に示すようにァライメントし、 Mo d e 1 e rに入力した。 また、 铸型としてはブルックへ一ブン■ プロテイン 'デ一タバンク （Brookhaven Protein Data Bank) (PDB) から TNFa (PDB I D： 1 TNF) 及び TNF/? (PDB I D : 1 TNR) の座標データを入力した。 PDB I D : 1 TNFは、 TNF αの三量体の結晶構造のデータであり、 PDB I D : 1 TNRは、 TNF と TNFレセプタ一 55の複合体の結晶構造 のデータであるので、 各々より、 TNF βモノマー及び TNF /3モノマーの データのみを引用した。 Mo d e 1 e rの使用説明書に従って 10個のモデ ルが得られるように条件を設定し、 モデリングを行なった。 その結果、 エネ ルギー最小化計算後のエネルギーと確率密度関数 （PDF: Probability Density Function) と全原子の平均二乗偏差の平方根 （RMS; Root Mean Square) 値の低いモデル N o . 3を F a sリガンドモデルとして選択した。 次に、 このようにして得られた F a sリガン ドモノマーのモデルを基に、 F a sリガンド三量体の構築を行なった。 具体的には、 シリコングラフィッ クス上で起動するソフ トウエアである QUANT A/CHARMm (モレ キュラー . シミュレーションズ (Molecular Simulations) 社製) ¾用レ、 て、 上記 TNF aの三量体である PDB I D ： 1 TNFの原子座標に、 前 述の F a sリガンドモノマーのモデルを、 TNFモノマーの各々のセグメン トに重ね合わせ （スーパーインポーズ） した後、 不良結合 （B a d
C o n t a c t) を修正し、 エネルギーの最少化計算を行なって、 F a sリ ガンド三量体モデルを構築した （三量体を形成するモノマーを、 それぞれ F a sリガンド A分子、 B分子、 C分子或いは Aセグメント、 Bセグメン ト、 Cセグメントと呼称する） 。 その原子座標データ （PDBフォーマツ ト） を表 1に示す。
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ATOM 4088 OXT LEU C 138 -7.329 61.259 -10.516 1.00 2.56
ATOM 4089 H LEU C 138 -6.232 58.672 -9.217 1.0020.00 END
表 1中のァミノ酸残基の後に記されている A, B及び Cは F a sリガンド トリマーのセグメントの区別である。 X, Y及び Zは、 それぞれ各原子の X， Y及び Z軸に対しての座標を示し、 OCCは 0 c c u p a n c y、 Bは 温度因子である。 このようにして構築した F a sリガンドモデル上で、 各 NOK抗体及びヒ ト型化 N 0 K 2抗体の認識領域がどの様な位置関係にあるか表すために、 表 1に示された原子座標データを基に、 QUANTA/CHARMmを用いて F a sリガンド三量体を各アミノ酸のひ位の炭素原子 （C«) のみで結んだ 線で表し、 実施例 6で同定された NOK 1、 NO K 2及ぴヒト型化 NO K 2 (RNOK20 1〜203) 、 N 0 K 3抗体の各々の認識領域アミノ酸のう ち、 F a sリガンド三量体の问一側面に位置する認識領域アミノ酸を灰色丸 印で、 それ以外の位置にあるアミノ酸を白抜きの丸印で表示した場合の図 を、 図 22から図 24に各々示した （図 23の NOK2及びヒト型化: NOK 2抗体の場合、 ヒト型 NOK 2抗体で特に認識するアミノ酸を破線の丸印で 示している） 。 この場合、 理解を容易にするために便宜上 3分子の F a sリ ガンドのうち手前側の 2分子 （表 1の B及び Cセグメント） のみを表示して おり、 さらに、 認識領域アミノ酸の番号は図 21のァライメントデータに示 した F a sリガンドモデルの番号に従っている。 また、 F a sリガンドの各 原子のファンデルワールスコンクク トモデルを QUANTA/CHARMm のレイ . トレース （R a y T r a c e) コマンドで表示し、 実施例 6で同 定された各 NO K抗体及びヒト型化 NO K 2抗体の認識領域アミノ酸を重ね て表示した。 ファンデルワールスコンタク トモデル上の NO K 1抗体の認識 領域は図 29、 NO K 2抗体及びヒト型化 NO K 2抗体の認識領域は図 3 0、 N 0 K 3抗体の認識領域は図 3 1の斜線部分の位置のアミノ酸になつ た。 これらの図 22から 24までと図 29から 3 1までは表現を変更してい るだけで、 基本的に同じ図である （同一モデルを同一の方向から見てい る） 。
これらの解析結果より、 特に注目すべきことに、 各 N0K抗体及びヒト型 化 NO K 2抗体が結合する認識領域は、 立 造から考えて 2分子の F a s リガンドにまたがつていることが判明した。 即ち、 各 NO K抗体及ぴヒト型 化 NO K 2抗体は F a sリガンド三量体が形成されたとき初めて出現する領 域を認識領域として認識していることが示された。 これら NOK抗体のよう に強いアポトーシス抑制活性を持つ抗体が F a sリガンドニ分子にまたがる 認識領域を認識していたことは、 これまでの報告にない新規な知見である。 従って、 F a sリガンド三量体上に 2分子にまたがって形成される領域を認 識し、 結合することが強いアポト—シス抑釗活性を発揮するためには重要で あると考えられる。
各 NO K抗体及ぴヒト型化 NO K 2抗体の認識する領域は図 22から 24 や図 29から 3 1に示されるように、 各抗体は、 互いに共通の認識アミノ酸 を、 例えば、 NOK 1〜3及びヒト型化 NOK 2抗体に共通： 199番 G l y、 205番 L e u、 220番 G l n、 221番 A s p、 222番 L e u、 237番 G i n、 NOK 1と 3抗体に共通： 203番 A s n、 NOK 1と 3及びヒト型化 NOK 2抗体に共通： 228番乙 5、 1^0 2 と 3及びヒト型化 NO K 2抗体に共通： 230番 Me t；、 238番 Me t (アミノ酸番号は長田らの文献 （長田ら、 Int. Immunology, vol.6, p i 567 - 1574, 1994) に従う） などを持っていることから、 ある領 域を共通して認識していることが推定される。
一方、 F a sリガンド三量体程度の大きさの蛋白分子であれば、 抗体の大 きさを考慮すると抗体^ 識する 領域は一種の面を構成していると考え られ、 抗体が認識した場合、 これらの認識アミノ酸から構成される抗原領域 面と抗体の認識領域面が、 面と面で接している状態になる。 前述の NOK 1 〜 3抗体及びヒト型化 N 0 K 2抗体の認識領域や共通領域も面として存在し ていると考えられる。 即ち、 F a sリガンド三量体分子上の抗体の認識領域 は蛋白分子上の面として定義することができ、 アポトーシス活性を強く抑制 する抗体は、 F a sリガンド三量体分子上のこれらの認識アミノ酸から構成 される面に対して侵入あるいは近づいてくる抗体である。
従って、 前述の F a sリガンド三量体分子上の各抗体の認識アミノ酸を面 の構成要素として検討することができる。 一般的に面は一直線上にない 3点 A (XA， Y A, Z A) B (XB, YB, ZB) C (XC, YC, Z C) で 規定される平面として表示することができる。 各抗体の認識アミノ酸の表 1 に示す原子座標データをこの式に当てはめ、 面を計算することができる。 こ のようにして、 各抗体の認識アミノ酸から 3個のアミノ酸を任意に選択し、 計算すれば、 抗体の認識する面を表すことができる。 例えば、 NOK3抗体 の認識ァミノ酸の中から、 表 1に示す F a sリガンド B分子上の 57番目 G 1 n、 F a sリガン ド C分子上の 60番目 A s n、 F a sリガンド C分子 上の 77番目 G 1 nを選択した場合、 その C。原子の座標データは各々 （2 0.209, 32.098, 0.872 ) ( 1 1.5 5 1 , 3 1.704, 1 5. 93 7 ) (- 8.76 5, 3 5. 50 1 , 一 9.840) となり、 これらのァ ミノ酸 C α原子の ]¾標によって規定される面算出することができる。 この F a sリガンド B分子上の 5 7番目 G 1 n、 F a sリガンド C分子上の 60 番目 A s n、 F a sリガンド C分子上の 77番目 G 1 n組合せによって規定 される面は、 NO K 3抗体の認識アミノ酸から構成される領域面をカバーす ることができる。 実際の抗体と接触または抗体の原子が F a sリガンド三量 体に向かって通過してくる面は、 各 C ff原子の座標から F a sリガンド分子 と反対側にァミノ酸残基の側鎖の長さの分とさらに一般的なファンデルヮ一 ルスコンタク トのカッ ト - オフ （c u t o f f ) 値である 4. 1オングス トロ一ム離れた所に構成される面になると考えられる。
実施例 9
(F a sリガンド上の NO K 2抗体認識領域の同定）
実施例 8で述べたように、 各 N 0 K抗体やヒト型化 N 0 K 2抗体がある共 通したアミノ酸を認識していることから、 アポトーシス活性を強く抑制する 抗体には、 共通したある認識領域が存在すると推定されている。 一方、 各 NOK抗体ゃヒト型化 NO K 2抗体はその可変領域のアミノ酸配列の長さか ら、 通常の抗体の可変領域とほとんど同じ大きさを有していると考えれる。 そこで、 F a sリガンド三量体上の各 NO K抗体ゃヒト型化 NO K 2抗体の 共通認識領域を同定するために、 それらの代表として NOK2抗体を F a s リガンドの場合と同様にモデリングし、 NOK2抗体の可変領域 （特に CDR領域） が F a sリガンド三量体上の認識アミノ酸より構成される領域 をカバーすることが可能である力、 カバーするとすれば現在示されている認 識アミノ酸以外にどのようなアミノ酸が認識アミノ酸の候補として考えられ るかについて検討した。
N〇K 2抗体の立体構造モデルとして、 ここでは、 Mo d e l e rを使つ て新たにモデリングした NO K 2抗体モデルを使用した。 初めに、 NOK2 抗体 H鎖可変領域 （VH) 及び L鎖可変領域 （VL) と相同性カ い PDB
I D ： 1 01^の¥11 (配列番号： 1 31) と PDB I D : 1 TETの VL (配列番号： 1 32) を三次元構造の銹型として利用した。 NOK2抗 体の VH及び VLアミノ酸配列と 1 01^の¥11及び1 TETの VLァミノ 酸配列を図 25と図 26に各々示すようにァライメントし、 Mo d e 1 e r に入力した。 Mo d e 1 e rの使用説明書に従って 5個のモデルが得られる ように条件を設定し、 モデリングを行った。 その結果、 エネルギー最小化計 算後のエネルギーと確率密度関数 （PDF; Probability Density Function ) と全原子の平均二乗偏差の平方根 （RMS; Root Mean Square) 値の低い モデル No. 5を NO K 2抗体可変領域モデルとして選択した。
NO 2抗体の可変領域内の抗原認識領域（ 6個の C D R：相補性決定領 域）の大きさを QUANTAZCHARMmのグラフィカル · シリンダー
(G r a p h i c a l C y l i n d e r) コマンドを^ fflして調べた。 そ の結果、 図 32と 33に示すように、 N 0 K 2抗体モデルの抗原認識領域は 半径約 17オングストロームの円とほぼ同じサイズを有していた （図 33で 半径約 17オングストロームの円内に: N0K 2抗体モデルの CDR領域アミ ノ酸がちょうど入っていることが示されている） 。 次に、 QUANTA/ CHARMm上で、 得られた半径約 17オングストロームの円を図 22〜2 4に示した F a sリガンド三量体上の認識領域アミノ酸から構成される面と その認識アミノ酸を各々カバーするように配置したところ、 得られた NOK 2抗体の可変領域内の抗原認識領域に相当する領域 （半径約 1 7オングス ト ロームの円〉 せ、 F a sリガンド三量体上の各 NO K抗体及びヒト型化 N 0 K 2抗体の認識領域アミノ酸を全てカバーできることがわかった （図 2 7) 。 従って、 反応性に差はあるものの、 各 NO K抗体やヒト型化 NO K 2 抗体は F a sリガンド三量体上のほぼ同じ領域を接触面としてカバ一してい ると考えられる。 このことは、 アポトーシス抑制活性の高い抗体が、 今回示 された領域を共通して認識していることを示している。
そこで、 この円の範囲で、 15平方オングストローム以上のアミノ酸残基 の露出表面積を持つ F a sリガンド三量体の表面アミノ酸を、 抗体の CDR 領域アミノ酸と相互作用可能なアミノ酸として選択したところ、 各々隣合う 二つの F a sリガンド分子のうちの一方の分子の 10番 S e r、 23番 Ty r、 25番 I l e、 55番 A r g、 56番 G l y、 57番 G I n、 94 番 G 1 n、 95番 Me t、 98番 Ar g、 99番 S e r、 126番 P h e、 127 G 1 u, 128#G 1 u, 129番 S e rの各アミノ酸、 他方の F a sリガンド分子の 14番 S e r、 1 5番 Me t：、 16¾=P r o、 18番 G l u、 35番 Ly s、 36番 G l y、 60番 As n、 61番 As n、 62 番 Le u、 63番 P r o、 65番 S e r、 67番 L y s、 69番 Ty r、 7 1番 A r g、 75番 Ty r、 76番 P r o、 77番 G l n、 78番 A s p、 79番 L e u、 80番 Va し 85番 L y s、 87番 Me t；、 89番 Ty r、 1 1 3番 H i s、 1 15番 Ty r、 1 17番 A s n、 1 19番 S e r、 120番 G l u、 121番 Le u、 122番 S e rの各アミノ酸 (アミノ酸の番号はいずれの分子も図 21のァライメントデータに示した F a sリガンドモデルの番号に従っている） が選ばれてきた。 これらのアミ ノ酸を図 28と図 34に示す。 図中のアミノ酸を大きく囲む円は上述の半径 約 17オングストロームの円であり、 今回選ばれたアミノ酸のうち、 各 N 0 K抗体とヒト型化 N O K 2抗体の認識領域ァミノ酸と重複するものを濃 色丸印で、 新たに抗体認識領域アミノ酸として選択されたアミノ酸を白抜き 丸印で表示している。
これらのアミノ酸番号を、 先述の長田らの文献 （長田ら、 Int.
Immunology, vol. 6, p l 567— 1 574， 1994) に従って表記し 直すと、 各々隣合う二つの F a sリガンド分子のうちの一方の分子の 1 53 番 S e r、 166番 Ty r、 168番 I l e、 198番 Ar g、 1 99番 G l y、 200番 G l n、 237番 G l n、 238番 Me t、 241番 A r g、 242番 S e r、 269番 Ph e、 270番 G l u、 271番 G 1 u、 272番 S c rの各アミノ酸、 他方の F a sリガンド分子の 1 57 番 S e r、 1 58番 Me t、 1 59番 F r o、 16 1番 G l u、 1 78番 L y s、 1 79番 G l y、 203番 A s n、 204番 A s n、 205番 L e u, 206番 P r o、 208番 S e r、 2 10番 L y s、 21 2番 T y r、 2 14番 A r g、 2 18番 Ty r、 2 19番 P r o、 220番 G i n, 22 1番 A s p、 222番 L e u、 223番 V a l、 228番 L y s、 230番 Me t、 232番 Ty r、 256番 H i s、 258番 T y r、 260番 A s n、 262番 S e r、 263番 G l u、 264番 L e u, 265番 S e rの各アミノ酸に相当する。
これらのアミノ酸の中に、 NOK 3抗体の認識アミノ酸はもとより、 各 NOK抗体ゃヒト型化 NO K 2抗体のようなアポトーシス活性を強く抑制す る抗体に共通する認識領域アミノ酸も含まれていると考えられる。 即ち、 F a sリガンド三量体上のこれらの領域に含まれるアミノ酸と相互作用する こと力？、 高いアポトーシス抑制活性をもつタンパク質、 ペプチド、 望ましく は抗体もしくはその類似物にとって重要であることを示している。
本発明は、 高いアポトーシス抑制活性を持つ抗 F a sリガンド抗体の F a sリガンド三量体上の認識領域を初めて明かにしたという点で重要であ るのみならず、 他の様々なアポトーシス活性抑制分子をデザインする上で重 要な情報を与えている。 すなわち、 本願発明に基づけば上記領域及びその領 域に含まれるアミノ酸 （実施例 6から 9に記載の領域及びアミノ酸） に対し て特異的に反応し、 アポトーシスを抑制するタンパク質、 ペプチド、 望まし くは抗体もしくはその類似物などを作出し、 新たな治療薬或いは臨床診断薬 等に応用することができる。
本発明により、 F a sリガンドに特異的に反応し、 F a s— F a sリガン ドを介した生理的反応を抑制する活性を有する、 A I DS、 骨髄移植におけ る移植片拒絶反応、 自己免疫疾患 （S LE、 RA) 、 糖尿病などの疾患の治 療薬として使用可能な、 以下の特長を有するヒト型化免疫グロプリンが提供 される。
(1 ) エフヱクタ一部分がヒトであるので、 ヒト免疫系の他の部分とより 良好に相互作用し得る （例えば、 補体依存性細胞障害 （CDC) または抗体 依存性細胞障害 （ADCC) による、 より効率的な標的細胞の破壊） 。
(2) ヒト免疫系は、 ヒト型化免疫グロブリンのフレームワークまたは C 領域を異物として認識せず、 従って当該免疫グロブリンに対する好ましから ぬ抗体応答は、 全部が異物であるマウス抗体または一部分が異物であるキメ ラ抗体に対するものよりも少ない。
(3) 自然に生じるヒ ト抗体の半減期により近い半減期を有し、 マウス抗 体に比較して、 より小さいまたはより少ない頻度の投与量を与えること力期 待される。
また、 F a sリガンド上のアポトーシス誘導活性の発揮に必要な領域が明 らカにされたことにより、 当該領域に含まれるァミノ酸に対して特異的に反 応し、 アポトーシスを抑制する組換え蛋白、 ペプチドなどを作出し、 新たな 治療薬或いは臨床診断薬等に応用することができる。
配 列 表 配列番号： 1
配列の長さ ： 5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物：マウス
配列
Asn i'yr Trp l ie Gly
1 5
配列番号： 2
配列の長さ ： 1 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物：マウス
配列
Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 1 5 10 15
Lys Gly
配列番号： 3 配列の長さ ： 1 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物：マウス
配列
Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Al a Met Asp Tyr
1 5 10
配列番号： 4
配列の長さ ： 1 6
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物：マウス
配列
Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu 1 5 10 15
Gly
配列番号： 5
配列の長さ ： 7
配列の型：ァ円ノ酸
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：ペプチド
起源
生物： マウス
配列
Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
配列番号： 6
配列の長さ ： 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物：マウス
配列
Phe Gin Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr
1 5
配列番号： 7
配列の長さ ： 1 2 1
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源：生物名 ： ヒト
配列
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser
20 25 30
Ser His Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr
50 55 60
Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Leu Asp Thr Ser
65 70 75
Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly
95 100 105
Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
Ser
配列番号： 8
配列の長さ ： 1 1 2
配列の型：アミノ酸
トポロジー：ヨシ鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物： ヒ ト
配列 Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 1 5 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val
20 25 30
Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75
Phe Thr Leu Lys l ie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
80 85 90
Tyr Tyr Cys Met Gin Gly Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gin
95 100 105
Gly Thr Lys Leu Glu l ie Lys
110
配列番号： 9
配列の長さ ： 1 1 2
配列の型：陰ミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物： ヒト
配列 Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu
20 25 30
Hi s Asn Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu l ie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75
Phe Thr Leu Lys l ie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp V l Gly Val
80 85 90
Tyr Tyr Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin
95 100 105
Gly Thr Lys Leu Glu l ie Lys
110
配列番号： 1 0
配列のヨキさ ： 3 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A)
配列
MGCTTGCCG CCACCATGGA ATGGAGCTGG GTCTTT 36 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A ) 配列
GGATCCACTC ACCTGAGGAG ACGGTGA 27 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 3 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A ) 配列
MGCTTCGCC ACCATGAAGT TGCCTGHAG GCTG 34 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A ) 配列
GGATCCACH ACGTTTTAn TCCAGCH 28 配列番号： 14
配列の長さ ： 357
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： c DNA t o mRNA
起源：
生物：マウス
配列の特徴：
特徴を決定した方法： E
配列
CAG GTC CAC CTG CAG CAG TCT GGA GCT GAG CTG GTA AGG CCT GGG 45 ACT TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT GCT GGA TAC ACC TTC ACT 90 AAC TAC TGG ATA GGT TGG GTA AAG CAG AGG CCT GGA CAT GGC θπ 135 GAG TGG Απ GGA TAT CTT TAC CCT GGA GGT CTT TAT ACT AAC TAC 180 AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC 225 TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC 270 TCT GCC ATC TAT TAC TGT GCA AGA TAC AGG GAT TAC GAC TAT GCT 315 ATG GAC TAC TGG GGT C GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 357 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 339
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ： 配列の種類： c DNA t o mRNA
起源：
生物：マウス
配列の特徴：
特徴を決定した方法： E
配列
GAT GTT GTT CTG ACC CM ACT CCA CTC TCT CTG CCT GTC AAT ATT 45 GGA GAT C GCC TCT ATC TCT TGC AAG TCT ACT AAG AGC CTT CTG 90 AAT AGT GAT GGA TTC ACT TAT HG GGC TGG TGC CTG CAG AAG CCA 135 GGC CAG TCT CCA CAG CTC CTA ATA TAT TIG QTT TCT AAT CGA TTT 180 TCT GGA GTT CCA GAC AGG TTC AGT GGT AGT GGG TCA GGG ACA GAT 225 TTC ACC CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA GTT 270 TAT TAT TGC TTC CAG AGT AAC TAT CTT CCT CTT ACG TTC GGA TCG 315 GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGT 339 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 1 1 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物：マウス
配列
Gin Val His Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Asn Tyr Trp lie Gly Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu
35 40 45
Glu Trp lie Gly Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr
50 55 60
Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
80 85 90
Ser Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala
95 100 105
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115
配列番号： 1 7
配列の長さ ： 1 1 3
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物：マウス
配列
Asp Val Val Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn lie 1 5 10 15 Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu
20 25 30
Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly Trp Cys Leu Gin Lys Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75
Phe Thr Leu Lys l ie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser
95 100 105 Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg
110
配列番号： 1 8
配列の長さ ： 1 1 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15 Ala Ser V l Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30 Asn Tyr Trp lie Gly Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu
35 40 45
Glu Trp l ie Gly Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr
50 55 60
Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala
95 100 105
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
配列番号： 1 9
配列の長さ ： 1 1 9
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30 Asn Tyr Trp He Gly Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu
35 40 45 Glu Trp l ie Gly Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr
50 55 60
Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser
65 70 75
Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala
95 100 105
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
配列番号： 2 0
配列の長さ ： 1 1 3
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15
Gly Asp Arg Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu
20 25 30
Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly Trp Cys Gin Gin Lys Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75
Phe Thr Leu Lys lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr
80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gin
95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
110
配列番号： 2 1
配列の長さ ： 1 1 3
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser l ie Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu
20 25 30
Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly Trp Cys Leu Gin Lys Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu l ie Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75 Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gin
95 100 105
Gly Thr Lys Leu Glu l ie Lys Arg
110
配列番号： 2 2
配列の長さ ： 1 1 3
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu
1 5 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu
20 25 30
Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly Trp Cys Leu Gin Lys Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu l ie Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75
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80 85 90 SOI 00 ΐ %
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V s an "10 "91 sAq jqx Λιο e86zo .6cir/ Da ο,οοι/ββθΛλ 配列番号： 25
配列の長さ ： 1 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA)
配列
GTGCTGGHG GTGCT 17
配列番号： 26
配列の長さ ： 95
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列
GTATAAAGAC CCCCGGGGTA AAGATAGCCA ATCCACTCGA GCCCTTGGCC TGGGGCCTGC 60 TTTACCCAAC CTATCCAGTA GmGTGAAG GTATA 95 配列番号： 27
配列の長さ ： 87
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列 TATCTTTACC CCGGGGGTCT mTACAAAC TATAACGAGA AGTTTAAGGG CAAGGCTACA 60 ATGACCGCAG ACACCTCTAC AAACACC 87 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 8 7
配列の型： 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A)
酉己列
TATCTTTACC CCGGGGGTCT TTATACAAAC TATAACGAGA AGTTTAAGGG CAAGGCTACA 60 CTGACCCTGG ACACCTCTAC AAACACC 87 配列番号： 2 9
配列の長さ ： 7 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A)
配列
ACAAGGGTAC CCTGTCCCCA ATAGTCCATA GCGTAGTCGT AATCCCTGTA COTGCGCAG 60 TAGTAGACTG CAGT 74 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 8 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A)
配列
GTCGGGCCCA CAGCGATGH GHATGACCC AAACTCCATC TTCTCTGTCT GCCAGTGTTG 60 GAGATCGAGC CTCTATCTCT TGCAAG 86 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 2 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A)
配列
GGCTTCTGCT GGCACCAGCC CAAATAAGT 29
配列番号： 3 2
配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A)
配列
GGCTGGTGCC AGCAGAAGCC AGGCCAGTCT 30
配列番号： 3 3
配列の長さ ： 3 8
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A )
配列
ATATCCTCAG GCTGCAGACT GCTGATCTTG AGGGTGAA 38
配列番号： 3 4
配列の長さ ： 5 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A )
配列
AGCAGTCTGC AGCCTGAGGA TATAGCTACT TAmHGCT TCCAGAGTAA C 51 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 5 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A )
配列
CTCGGATCCA CnACGTTTT ATTTCCACCT TGGTCCCCTG TCCGAACGTA AGAGGAAG 58 配列番号： 3 6
配列の長さ ： 8 6
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A)
配列
GTCGGGCCCA CAGCGATGH GTTATGACCC AAACTCCACT CTCTCTGCCT GTCACTCYTG 60 GASAGCCAGC CTCTATCTCT TGCAAG 86 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 1 0 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A)
配列
CTCGGATCCA C ACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTCCCCTG TCCGAACGTA AGAGGAAGAT 60 AGmCTCTG GAAGCAATAA TAAACTCCCA CATCCTCAGC 100 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 8 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A )
配列
TCTGGTACCT GTGGGCAGCT CGACTACAAG GACGACGATG ACAAGCACCT ACAGAAGGAG 60 CTAGCAGAAC TCCGAGAGTC T 81 配列番号： 39
配列の長さ ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA)
配列
GCCAAGCTTG GATCCTTAGA GCmTATAA GCCGAA 36
配列番号： 40
配列の長さ ： 45
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA)
配列
CACCTACAGA AGGAGCTAGC AGAACTCCGA GAGTCGACCA GCCAG 45 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列
GACCCCGG AAGGCTACH TGGAATA 27 配列番号： 4 2
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
AGAHGACCC CGGGCGTATA C1TTGGA 27 配列番号： 4 3
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
GHGCAAGAT TGACCCGCGA AGTATAC 27 配列番号： 4 4
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
GHGCAAGAT TGAGCCCGGA AGTATAC 27 配列番号： 45
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GnGHGCAA GATGCACCCC GGAAGTA 27 配列番号： 46
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CAGGTTG G CMGCTTGAC CCCGGAA 27 配列番号： 47
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GGGCAGGHG GGCAGA GACCCCG 27 配列番号： 48
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CAGGGGCAGG HGGCGCAAG A GACC 27 配列番号： 49
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GCTCAGGGGC AGGGCGHGC AAGAHG 27 配列番号： 50
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GTGGCTCAGG GGCGCGHGT TGCAAGA 27 配列番号： 5 1
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A) 配列
CTTGTGGCTC AGGGCCAGGT TGHGCA 27 配列番号： 5 2
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
GACCTTGTGG CTCGCGGGCA GGHGTT 27 配列番号： 5 3
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
GTAGACCTTG TGGGCCAGGG GCAGGTT 27 配列番号： 54
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （ブライマー DNA)
配列
CATGTAGACC GGCGCTCA GGGGCAG 27
配列番号： 55 — 配列の長さ ： 27
配刿の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列
CCTCATGTAG ACCGCGTGGC TCAGGGG 27
配列番号： 56
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列
GTTCCTCATG TAGGCOTGT GGCTCAG 27 配列番号： 5 7
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A) 配列
AGAGTTCCTC ATGGCGACCT TGTGGCT 27 配列番号： 5 8
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
CnAGAGTTC CTCGCGTAGA CCTTCTG 27 配列番号： 5 9
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
GGGATACTTA GAGTTCGCCA TGTAGAC 27 配列番号： 60
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GGGATACHA GAGGCCCTCA TGTAGAC 27 配列番号： 6 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CTGGGGATAC AGCGTTCC TCATGTA 27 配列番号： 62
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
ATCCTGGGGA TACGCAGAGT TCCTCAT 27 配列番号： 63
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CAGATCCTGG GGAGCCHAG AGTTCCT 27 配列番号： 64
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CACCAGATCC TGGGCATACT TAGAGH 27 配列番号： 65
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CATCACCAGA TCCGCGGGAT AOTAGA 27 配列番号： 6 6
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A) 配列
CATCATCACC AGAGCCTGGG GATACTT 27 配列番号： 6 7
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A) 配列
CTCCATCATC ACCGCATCCT GGGGATA 27 配列番号： 6 8
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
CCCCTCCATC ATCGCCAGAT CCTGGGG 27 配列番号： 69
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CTTCCCCTCC ATCGCCACCA GATCCTG 27 配列番号： 70
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CATCTTCCCC TCCGCCATCA CCAGATC 27 配列番号： 7 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CATCATCTTC CCCGCCATCA TCACCAG 27 配列番号： 72
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GCTCATCATC TTCGCCTCCA TCATCAC 27 配列番号： 73
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GTAGCTCATC ATCGCCCCCT CCATCAT 27 配列番号： 74
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GCAGTAGCTC ATCGCCTTCC CCTCCAT 27 配列番号： 75
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
AGTGCAGTAG CTCGCCATCT TCCCCTC 27 配列番号： 76
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
AGTAGTGCAG TAGGCCATCA TCTTCCC 27 配列番号： 77
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CCCAGTAGTG CAGGCGCTCA TCATCH 27 配列番号： 78
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CTGCCCAGTA GTGGCGTAGC TCATCAT 27 配列番号： 79
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CATCTGCCCA GTAGCGCAGT AGCTCAT 27 配列番号： 80
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CCACATCTGC CCAGCAGTGC AGTAGCT 27 配列番号： 8 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GGCCCACATC TGCGCAGTAG TGCAGTA 27 配列番号： 82
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GCGGGCCCAC ATCGCCCCAG TAGTGCA 27 配列番号： 83
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GCTGCGGGCC CACGCCTGCC CAGTAGT 27 配列番号： 84
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （ブライマー DNA) 配列
GCTGCGGGCC GCCATCTGCC CAGTAGT 27 配列番号： 85
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CAGGTAGCTG CTGCGGCCCC ACATCTG 27 配列番号： 86
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
TATTCCAMG TAGCCTTCCG GGGTCAA 27 配列番号： 87
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
TCCAAAGTAT ACGCCCGGGG TCAATCT 27 配列番号： 88
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GTATACTTCG CGGGTCAATC TQCkkC 27 配列番号： 89
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GTATACTTCC GGGCTCAATC HGCAAC 27 配列番号： 90
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列
TACTTCCGGG GTGCATCTTG CAACAAC 27
配列番号： 9 1 一 配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA)
配列
TTCCGGGGTC AAGCTTGCM CAACCTG 27
配列番号： 92
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA)
配列
CGGGGTCAAT CTGCCAACAA CCTGCCC 27 配列番号： 9 3
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A) 配列
GGTCMTCTT GCGCCAACCT GCCCCTG 27 配列番号： 9 4
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A) 配列
CAATCHGCA ACGCCCTGCC CCTGAGC 27 配列番号： 9 5
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A) 配列
TCHGCAACA ACGCGCCCCT GAGCCAC 27 配列番号： 96
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
TGCAACAACC TGGCCCTGAG CCACAAG 27 配列番号： 97
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
AACAACCTGC CCGCGAGCCA CAAGGTC 27 配列番号： 98
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
AACCTGCCCC TGGCCCACAA GGTCTAC 27 配列番号： 99
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CTGCCCCTGA GCGCCAAGGT CTACATG 27 配列番号： 1 00
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CCCCTGAGCC ACGCGGTCTA CATGAGG 27 配列番号： 1 0 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CTGAGCCACA AGGCCTACAT GAGGAAC 27 配列番号： 1 02
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
AGCCACAAGG TCGCCATGAG GAACTCT 27 配列番号： 1 03
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CACAAGGTCT ACGCGAGGAA CTCTAAG 27 配列番号： 1 04
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GTCTACATGG CGAACTCTAA GTATCCC 27 配列番号： 1 05
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GTCTACATGA GGGCCTCTAA GTATCCC 27 配列番号： 1 06
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー D N A ) 配列
TACATGAGGA ACGCTAAGTA TCCCCAG 27 配列番号： 1 07
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
ATGAGGAACT CTGCGTATCC CCAGGAT 27 配列番号： 108
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
AGGAACTCTA AGGCTCCCCA GGATCTG 27 配列番号： 1 09
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
AACTCTAAGT ATGCCCAGGA TCTGGTG 27 配列番号： 1 10
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
TCTAAGTATC CCGCGGATCT GGTGATG 27 配列番号： 1 1 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
AAGTATCCCC AGGCTCTGGT GATGATG 27 配列番号： 1 1 2
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
TATCCCCAGG ATGCGGTGAT GATGGAG 27 配列番号： 1 1 3
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CCCCAGGATC TGGCGATGAT GGAGGGG 27 配列番号： 1 14
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CAGGATCTGG TGGCGATGGA GGGGAAG 27 配列番号： 1 1 5
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GATCTGGTGA TGGCGGAGGG GAAGATG 27 配列番号： 1 16
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
CTGGTGATGA TGGCGGGGAA GATGATG 27 配列番号： 1 17
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
GTGATGATGG AGGCGAAGAT GATGAGC 27 配列番号： 1 18
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
ATGATGGAGG GGGCGATGAT GAGCTAC 27 配列番号： 1 1 9
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— D N A ) 配列
ATGGAGGGGA AGGCGATGAG CTACTGC 27 配列番号： 120
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GAGGGGAAGA TGGCGAGCTA CTGCACT 27 配列番号： 1 2 1
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
GGGAAGATGA TGGCCTACTG CACTACT 27 配列番号： 122
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
AAGATGATGA GCGCCTGCAC TACTGGG 27 配列番号： 1 23
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
ATGATGAGCT ACGCCACTAC TGGGCAG 27 配列番号： 1 24
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
ATGAGCTACT GCGCTACTGG GCAGATG 27 配列番号： 1 2 5
配列の長さ ： 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
AGCTACTGCA CTGCTGGGCA GATGTGG 27 配列番号： 1 26
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
TACTGCACTA CTGCGCAGAT GTGGGCC 27 配列番号： 1 27
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
TGCACTACTG GGGCGATGTG GGCCCGC 27 配列番号： 1 28
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
ACTACTGGGC AGGCGTGGGC CCGCAGC 27 配列番号： 129
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマー DNA) 配列
ACTACTGGGC AGATGGCGGC CCGCAGC 27 配列番号： 1 30
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （プライマ— DNA) 配列
CAGATGTGGG GCCGCAGCAG CTACCTG 27 配列番号： 13 1
配列の長さ ： 2 1 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物：マウス
配列 08 ΐ Sil OLl
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Ser Gin Thr lie Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
200 205 210
Lys Val Asp Lys Lys lie Glu Pro Arg
215
配列番号： 1 3 2
配列の長さ ： 2 1 6
配列の型：アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物：マウス
配列
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu ser Leu Pro Ί&1 ber Leu 1 5 10 15
Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser lie Val
20 25 30
His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro
35 40 45
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75 SI2
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . F a sリガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロブリンまたはそ の活性フラグメント。
2 . F a s リガンドと F a s抗原との生理的反応を抑制することができる 請求項 1に記載のヒト型化免疫グロブリンまたはその活性フラグメント。
3 . 前記 F a sリガンドと F a s抗原との生理的反応の抑制が、 F a sリ ガンド発現細胞が分泌する可溶性 F a sリガンドまたは F a sリガンド発現 細胞の表面に存在する F a s リガンドにより引き起こされる F a s抗原発現 細胞のアポト一シスの抑制である請求項 2に記載のヒト型化免疫グロプリ ン またはその活性フラグメント。
4 . 可溶性 F a s リガンドが F a s抗原発現細胞に対して引き起こすアポ トーシスを、 F a s リガンドを遣伝子導入した細胞の培養上清から調製され る実効濃度 4 · 6 n g /m 1 の可溶 a s リガンドをエフェクター分子と し、 一方、 F a s抗原を遺伝子導入した細胞をタ一ゲッ ト細胞とし、 両者を 9 6ゥエルプレート中で 1 0 0 1の反応系で反応させ、 ターゲッ ト細胞の 1 6時間後の生存率を生細胞数検出試薬を用いて測定する細胞障害反応試験 において、 免疫グロブリンを添加したときのターゲッ ト細胞の生存率として 定義されるアポトーシス抑制率を免疫グロプリン濃度が 0 . 0 6 μ g /m 1
(実効濃度） 以上の範囲で 9 0 %以上とすることができる、 請求項 2または 請求項 3に記載のヒト型化免疫グ口プリンまたはその活性フラグメント。
5 . オリジナルの供与体免疫グ口ブリンと同等もしくはそれ以上のァポ ト一シス抑制活性を有する請求項 2から請求項 4のいずれかに記載のヒ ト型 化免疫グ口ブリンまたはその活性フラグメン ト。
6. 0.0 1〜8 gZm 1の濃度 （実効濃度） におけるアポトーシスの 抑制活性がマウス F a s— I gキメラ分子よりも高い請求項 2から請求項 5 のいずれかに記載のヒト型化免疫グロプリンまたはその活性フラグメント。
7. 軽鎖 重鎖二量体よりなり、 前記軽鎖及び重鎖が相補性決定領域 (CDR) とヒト様フレームワーク領域を含んでなり、 前記 CDRが該ヒト 様フレームワーク領域とは異なる供与体免疫グロプリンに由来するものであ る、 請求項 1から請求項 6のいずれかに記載のヒト型化免疫グロプリンまた はその活性フラグメント。
8. 受容体ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域のァミノ酸配列が、 供与体免疫グロプリンのフレームワーク領域のァミノ酸配列と少なくとも 6 0 %以上のホモロジ一を有する請求項 7に記載のヒト型化免疫グロブリンま たはその活性フラグメント。
9. 軽鎖及び重鎖が相補性決定領域 （CDR) とヒト様フレームワーク領 域を含んでなり、 前記 CD Rが該ヒト様フレームワーク領域とは異なる供与 体免疫グロブリンに由来するヒト型化免疫グロブリンで、 かつ、 ヒト F a s リガンドに特異的に反応するヒト型化免疫グロプリンであって、 供与体免疫 グロプリンのフレームワーク領域の対応する位置に由来する少なくとも 1つ のアミノ酸を含み、 かつ、 該アミノ酸が、
( 1 ) 供与体免疫グロブリンの C D Rアミノ酸に直接あるいは間接的に水素 結合またはエネルギーコンタクトしているもので、 かつ、
(2) 受容体ヒト免疫グロプリンのフレームワークの対応する位置に置き換 えたとき、 ヒト免疫グロプリンの可変領域アミノ酸配列には存在しないよう な配列を生じない、 ものの中から選択されたものであることを特徴とする請 求項 7または請求項 8に記載のヒト型化免疫グロプリンまたはその活性フラ グメント。
1 0. 免疫グロブリン重鎖の CDR 1、 CDR 2及び CDR 3のアミノ酸 配列が、 各々配列番号 1、 配列番号 2及び配列番号 3に記載の配列であり、 免疫グロプリン軽鎖の CD R 1、 CDR 2及び CDR 3のアミノ酸配列が、 各々配列番号 4、 配列番号 5及び配列番号 6に記載の配列である、 請求項 1 力ら請求項 9のいずれかに記載のヒト型化免疫グロプリンまたはその活性フ ラグメント。
1 1. 供与体免疫グロプリンが受託番号 F E RM B P- 504 5で規定 されるハイプリ ドーマにより産生されるマウス NOK 2抗体である、 請求項 1から請求項 1 0のいずれかに記載のヒト型化免疫グロプリンまたはその活 性フラグメント。
1 2. 下記、 請求項 1 3から請求項 20のいずれかに記載の F a sリガン ド結合性物質の認識領域に結合する請求項 1から請求項 1 1のいずれかに記 載のヒ ト型化免疫グロプリンまたはその活性フラグメント。
1 3. F a sリガンドのアポトーシス誘導活性を発揮する能力に関与し、 該能力が、 （a) F a sリガンドの主要なアポトーシス誘導活性ドメインで ある力、、 （ b ) F a sリガンドの主要なアポトーシス誘導活性ドメインの一 ¾である力、、 あるいは （c) F a sリガンドの主要なアポトーシス誘導活性 ドメインもしくはその一部と等価であるアミノ酸配列に起因する F a sリガ ンド結合性物質の認識領域。
1 4. 前記 F a sリガンドの主要なアポトーシス誘導活性ドメィンカ s、
F a sリガンド分子の N末端から第 1 98番目の A r gから第 238番目の Me tまでのアミノ酸配列 （以下、 特にことわりがなければアミノ酸番号は 長田らの文献 （長田ら、 Int. Immunology, vol. 6, p 1 567 - 1 57 4， 1 994) に従う） に含まれるアミノ酸のうち少なくとも一つを含んで なるドメィンである請求項 13に記載の F a sリガンド結合性物質の認識領 域。
1 5. 前記 F a sリガンドの主要なアポト一シス誘導活性ドメイン力、 F a sリガンド分子の N末端から第 198番目の A r g、 第 1 99番目の G 1 y、 第 200番目の G l n、 第 203番目の As n、 第 205番目の L e u, 第 2 12番目の Ty r、 第 218番目の Ty r、 第 220番目の G 1 n、 第 221番目の A s p、 第 222番目の L e u、 第 227番目の G 1 y、 第 228番目の L y s、 第 230番目の Me t、 第 237番目の
G 1 n、 及び第 238番目の Me tのうちの少なくとも一つのアミノ酸を含 んでなるドメィンである請求項 1 3または請求項 14に記載の F a sリガン ド結合性物質の認識領域。
16. 前記 F a sリガンドの主要なアポト一シス誘導活性ドメイン中に、 ミノ酸配列を有するペプチドを含有する請求項 13から請求項 1 5のいずれ かに記載の F a sリガンド結合性物質の認識領域。
17. 前記 F a sリガンドの主要なアポトーシス誘導活性ドメイン中に、 下記で示される LYFVYSKVYFRGQSCNNLPL SHKVYのァ ミノ酸配列を有するペプチドを含有する請求項 1 3から請求項 15のいずれ かに記載の F a sリガンド結合性物質の認識領域。
18. F a sリガンドのアポトーシス誘導活性を発揮する能力に関与し、 該能力が F a sリガンド三量体が形成されたときに初めて出現し、 少なくと も二分子の接合した F a sリガンド表面にまたがる分子構造の一部を構成す るアミノ酸立体配置に起因する、 F a sリガンド結合性物質の認識領域。
19. 上記二分子の接合した F a sリガンド表面にまたがる分子構造の一 部を構成するアミノ酸立体配置が、 ヒト F a sリガンドを構成するアミノ酸 であって、 接合する二つのヒト F a sリガンド分子のうちの一方の分子の 1 53番 S e r、 166番 Ty r、 168番 I l e、 1 98番 A r g、 199 番 G l y、 200番 G i n、 237番 G i n、 238番 Me t、 24 1番 A r g、 242番 S e r、 269番 P h e、 270番 G l u、 27 1番 G l u、 272番 S e rの各アミノ酸、 他方の F a sリガンド分子の 1 57 番 S e r、 1 58番 Me t、 1 59番 P r o、 1 61番 G l u、 1 78番 L y s、 179番 G l y、 203番 As n、 204番 A s n、 205番 L e u、 206番 P r o、 208番 S e r、 2 1 0番 L y s、 2 1 2番 Ty r、 2 14番 A r g、 2 18番 Ty r、 2 1 9番 P r o、 220番 G l n、 22 1番 A s p、 222番 L e u、 223番 V a し 228番 L y s、 230番 Me t、 232番 Ty r、 256番 H i s、 258番 Ty r、 260番 A s n、 262番 S e r、 263番 G l u、 264番 L e u, 265番 S e rの各アミノ酸からなるアミノ酸立体配置である請求 項 18に記載の F a sリガンド結合性物質の認識領域。
20. アポト一シス抑制作用を有する抗体に対する 1種以上の抗原決定基 (ェピトープ） を含んでいる請求項 13から請求項 1 9のいずれかに記載の F a sリガンド結合性物質の認識領域。
21. 請求項 1 3から請求項 20のいずれかに記載の F a sリガンド結合 性物質の認識領域を認識し、 F a sリガンドと F a sの生理的反応を抑制し 得る免疫グロブリン、 免疫グロブリン類似物、 組換え蛋白質、 レセプター改 変体、 酵素及び合成ペプチドより選ばれる F a sリガンド結合性物質。
22. 二分子の接合した F a sリガンド表面にまたがる分子構造の一部を 構成するアミノ酸立体配置を形成するヒト F a sリガンドに由来のアミノ酸 であって、 接合する二つのヒト F a sリガンド分子のうちの一方の分子の 1 53番 S e r、 166番 Ty r、 168番 I l e、 1 98番 A r g、 1 99 番 G l y、 200番 G l n、 237番 G 1 n、 238番 Me t、 24 1番 A r g、 242番 S e r、 269番 P h e、 270番 G l u、 27 1番 G 1 u, 272番 S e rの各アミノ酸、 他方の F a sリガンド分子の 1 57 番 S e r、 1 58番 Me t：、 1 59番 P r o、 16 1番 G l u、 1 78番 L y s、 1 79番 G 1 y、 203番 As n、 204番 A s n、 205番 L e u, 206番 P r o、 208番 S e r、 2 1 0番 L y s、 2 1 2番 Ty r、 2 14番 A r g、 2 18番 Ty r、 2 1 9番 P r o、 220番 G l n、 22 1番 A s p、 222番 L e u、 223番 Va l、 228番 L y s、 230番 Me t、 232番 Ty r、 256番 H i s、 258番 Ty r、 260番 A s n、 262番 S e r、 263番 G l u、 264番 L e u、 265番 S e rの各アミノ酸の少なくとも一個を認識する請求項 2 1に記載の免疫グロブリン、 免疫グロブリン類似物、 組換え蛋白質、 レセプ ター改変体、 酵素及び合成ペプチドより選ばれる F a sリガンド結合性物 質。
23. 受託番号 FERM BP— 5044で規定されるハイプリ ドーマに より産生されるマウス NO K 1抗体、 受託番号 FERM BP— 5045で 規定されるハイブリ ドーマにより産生されるマウス NOK2抗体、 受託番号 FERM BP— 5046で規定されるハイプリ ド一マにより産生されるマ ウス NOK3抗体あるいはヒト型化 NOK 2抗体の、 ヒ ト F a sリガンド三 量体上の認識アミノ酸の中から任意に選択された 3個のアミノ酸の な位の炭 素 （C «) 原子の座標からなる 3点 A (XA, YA， Z A) 、 B (XB， YB, ZB) 、 C (XC, YC, ZC) で規定される平面であって、 各 C a 原子座標から F a sリガンド分子と反対側にアミノ酸残基の側鎖の長さに加 えて一般的なファンデルワールスコンタク トのカッ ト 'オフ （Cut off) 値である約 4. 1オングストロームだけ離れた位置に構成される面に対し て、 接触または F a sリガンド三量体に向かってその面を通過し得る、 請求 項 2 1に記載の免疫グロプリン、 免疫グロプリ ン類似物、 組換え蛋白質、 レ セプター改変体、 酵素及び合成べプチドょり選ばれる F a sリガンド結合性 物質。
24. 二分子の接合した F a sリガンド表面にまたがる分子構造の一部を 構成するアミノ酸立体配置を形成するヒト F a sリガンドに由来のアミノ酸 であって、 接合する二つのヒト F a sリガンド分子のうちの一方の分子の 1 53番 S e r、 1 66番 Ty r、 1 68番 I l e、 1 98番 A r g、 1 99 番 G l y、 200番 G i n、 237番 G i n、 238番 Me t、 24 1番 A r g、 242番 S e j：、 269番 P h e、 270番 G l u、 27 1番 G l u、 272番 S e rの各ァミノ酸、 他方の F a sリガンド分子の 1 57 番 S e r、 1 58番 Me t、 1 59番 P r o、 1 6 1番 G l u、 1 78番 L y s、 179番 G l y、 203番 As n、 204番 A s n、 205番 L e u, 206番 P r o、 208番 S e r、 2 1 0番 L y s、 2 1 2香 Ty r、 2 14番 A r g、 2 18番 Ty r、 2 1 9番 P r o、 220番 G i n, 22 1番 As p、 222番 L e u、 223番 V a し 228番 L y s、 230番 Me し 232番 Ty r、 256番 H i s、 258番 Ty r、 260番 A s n、 262番 S e r、 263番 G l u、 264番 L e u、 265番 S e rのアミノ酸のな位の炭素原子の座標からなる 3点 A . (XA， YA， Z A) 、 B (XB, YB, ZB) 、 C (XC, YC, ZC) で規定される平面であって、 各 原子座標から F a sリガンド分子と反対 側にァミノ酸残基の側鎖の長さに加えて一般的なファンデルワールスコンタ ク トのカッ ト 'オフ （Cut 0 ff) 値である約 4. 1オングストロームだけ離 れた位置に構成される面に対して、 接触または F a sリガンド三量体に向 かってその面を通過し得る、 請求項 2 1に記載の免疫グロブリン、 免疫グロ ブリン類似物、 組換え蛋白質、 レセプタ—改変体、 酵素及び合成ペプチドよ り選ばれる F a sリガンド結合性物質。
2 5. 二分子の接合した F a sリガンド表面にまたがる分子構造の一部を 構成するアミノ酸立体配置を形成するヒト F a sリガンドに由来のアミノ酸 であって、 接合する二つのヒト F a sリガンド分子のうちの一方の分子の 2 00番 G 1 n、 他方の F a sリガンド分子の 203番 A s n及び 2 20番 G 1 nの 3個のアミノ酸の。位の炭素原子の座標からなる 3点 A (X A, YA， Z A) 、 B (XB, YB, ZB) 、 C (XC， YC， ZC) で規定さ れる平面であって、 各 C ff原子座標から F a sリガンド分子と反対側にアミ ノ酸残基の側鎖の長さに加えて一般的なファンデルワールスコンタク トの カット ' オフ （Cut 0 ff) 値である約 4. 1オングス トロームだけ離れた位 置に構成される面に対して、 接触または F a sリガンド三量体に向かってそ の面を通過し得る、 請求項 24に記載の免疫グロブリン、 免疫グロブリン類 似物、 組換え蛋白質、 レセプター改変体、 酵素及び合成ペプチドより選ばれ る F a sリガンド結合性物質。
PCT/JP1997/002983 1996-09-02 1997-08-27 IMMUNOGLOBULINE HUMANISEE REAGISSANT SPECIFIQUEMENT AVEC UN LIGAND Fas OU L'UN DE SES FRAGMENTS ACTIFS ET REGION D'INDUCTION D'APOPTOSE PRENANT NAISSANCE DANS UN LIGAND Fas WO1998010070A1 (fr)

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